WO2017121964A1 - Method for rapidly detecting the sensitivity of microorganisms to drugs - Google Patents

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WO2017121964A1
WO2017121964A1 PCT/FR2017/050069 FR2017050069W WO2017121964A1 WO 2017121964 A1 WO2017121964 A1 WO 2017121964A1 FR 2017050069 W FR2017050069 W FR 2017050069W WO 2017121964 A1 WO2017121964 A1 WO 2017121964A1
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WO
WIPO (PCT)
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microorganism
particles
compound
container
antibiotic
Prior art date
Application number
PCT/FR2017/050069
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French (fr)
Inventor
Thierry Bernardi
Christian Provot
Original Assignee
Biofilm Control
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Publication date
Application filed by Biofilm Control filed Critical Biofilm Control
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the sensitivity of a microorganism to at least one compound and / or a physical agent.
  • the present invention also relates to the use of the method for rapidly determining the sensitivity of a microorganism to determine the minimum inhibitory concentration of a microorganism to at least one compound, for example an antibiotic, and / or a physical agent.
  • the present invention finds application in particular in the analytical fields, biological research, enzymology, in the pharmaceutical field, in the field of diagnosis and / or in the medical field and / or in the field of disinfection, for example surface .
  • references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
  • Antibiotic tests are tests to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic. This determination is generally carried out for pathogenic microorganisms.
  • the aim of the antibiogram is to determine the concentrations
  • MICs Minimal Inhibitors of a bacterial strain against various antibiotics.
  • WHO World Health Organization
  • the MIC is the lowest concentration of antibiotic capable of causing a complete inhibition of the growth of a given bacterium, appreciable to the naked eye, after a period given incubation. The determination of this value is not very precise but it is consecrated by use and it benefits from a large amount of information collected about it, for example as mentioned in the document "General technical conditions. Bulletin of the French Society of Microbiology, 1993, 8, 156-66 [1], and in the document Clinical Microbiological Infection 1996, 2, Suppl. 1 [2].
  • CA-SFM Antibiogram Committee
  • the CA-SFM protocols for the determination of the MIC in a liquid medium describe the conditions and media for their implementation.
  • the recommended medium is the medium of Mueller-Hinton, with or without supplementation.
  • this document describes the preparation of the inoculum: "Inoculum: from a culture of 18-24 hours on nonselective agar medium, prepare a suspension in Mueller-Hinton broth or in saline solution (0.9 % NaCl) equivalent to the standard McFarland 0.5 ( ⁇ 1 .10 S CFU / ml).
  • This suspension can also be prepared from a Mueller-Hinton broth culture obtained after incubation at 37 ° C in a shaking water bath for 3-5 h, and the density is adjusted to the 0.5 "McFarland standard. According to the same CA-SFM recommendations, the results are obtained in 18h, 24h up to 72h depending on the growth rate of the bacterial strains. This delay is the consequence of the definition of the MIC (Minimum Inhibitory Concentration): the lowest concentration of antibiotic capable of causing a complete inhibition of the growth of a given bacterium, appreciable to the naked eye, after a period of given incubation. This important delay is a handicap for the therapist.
  • the method described in the international application WO 2005/090944 is based on the measurement of mobility of magnetic microbeads in a culture well (a 96 well microplate well, for example) co-incubated with a biofilm-producing microorganism.
  • a biofilm When a biofilm has formed, the microbeads are trapped by said biofilm and are no longer mobile, compared to a well in which the biofilm did not form.
  • the method also makes it possible to determine the efficacy of an antibiotic, for example, to inhibit biofilm formation.
  • many strains of pathogenic bacteria such as Escherichia coli, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa [8] do not spontaneously form biofilm.
  • the method described in this document therefore does not determine the sensitivity of certain pathogenic or non-pathogenic microorganisms and can not therefore be used universally.
  • This method has several disadvantages, for example it requires many controlled washes decreasing its sensitivity. he also includes many steps of manipulation by the skilled person; performing at least two affinity reactions; the mandatory labeling of the second antibody with at least one sensitive and sophisticated marker, the use of a complex device and difficult to set to detect and quantify the signal emitted by the marker.
  • This method is therefore long, expensive, and requires complex instrumentation for its implementation.
  • the ELISA is used to quantify or semi-quantify an analyte / component supplied into a reaction mixture, usually in a microplate well. This method does not make it possible to measure changes in the quantity of an analyte with respect to the quantity, or its concentration, initial (e).
  • the present invention solves the problems and disadvantages of the state of the art by providing a method for determining the sensitivity of a microorganism to at least one compound and / or physical agent comprising the following steps:
  • the inventors are in fact the first to have surprisingly demonstrated that the method according to the invention makes it possible to determine simply and in a time of less than 8 hours the sensitivity of a microorganism to one or more active principle (s). , antibiotic (s) or physical agents.
  • active principle s. , antibiotic (s) or physical agents.
  • the inventors have surprisingly demonstrated that the capture of microorganisms by ligands adsorbed at the bottom of a container makes it possible, depending on the quantity of microorganisms, to immobilize the microparticles.
  • the inventors have also demonstrated that after incubation of the microorganisms in the containers, under growth conditions, the initial concentration of the microorganisms in the inoculum being lower than the known concentration likely to hinder the movement of the microparticles, it is possible to Observe particle blockage due to growth of microorganisms.
  • the inventors have surprisingly demonstrated that, thanks to the ligands on the surface of the internal walls of the container, more precisely at the bottom, the introduction of microorganisms into this container at a concentration which does not modify the mobility of the particles makes it possible after growth a blockage of the particles.
  • the inventors have surprisingly demonstrated that the process according to the invention, by the presence of ligands on the surface of the inner walls of the container, more precisely on the bottom, makes it possible to increase the sensitivity of determination of the sensitivity of the microorganism to at least one compound and / or physical agent.
  • the inventors have surprisingly demonstrated that in the absence of ligand on the internal surface of the container wall, more precisely at the bottom, the application of the magnetic field causes a grouping / aggregation of the particles whatever the conditions incubations of the microorganism that is to say in the presence or absence of a compound vis-à-vis which the microorganism is sensitive. Also, the inventors have surprisingly and unexpectedly demonstrated that the ligand attached to the surface of the inner walls of the container is necessary for the determination, according to the invention, of the sensitivity or resistance of the microorganism to a compound and / or agent physical.
  • the inventors have also demonstrated that the process of the invention makes it possible to obtain results in a much shorter time than those of known methods.
  • the time to obtain the results can vary substantially depending on the microorganism, for example depending on its generation time.
  • the generation time that is to say the doubling, in vitro, of microorganisms, especially those involved in human or animal pathologies, varies for example from 10 minutes for Vibrio cholerae, 20 minutes for Escherichia coli, 20 to 30 minutes for Salmonella typhimurium, 25 to 30 minutes for Staphylococcus aureus, 30 to 40 minutes for Pseudomonas aeruginosa, 2 hours for yeast Saccharomyces cerevisiae, and up to 20 hours for Mycobacterium tuberculosis, (Microbiochemistry and food, Alain Branger, Educagri Editions, 2012 [9]).
  • microbial growth may slow down, for example partial bacteriostasis, or stop completely.
  • a 2h incubation corresponds to 3 generation times, ie a multiplication of 2 3 , or a multiplying factor of 8.
  • 3 generation times correspond to 360 minutes, or 6 hours.
  • the inventors have demonstrated, for example in the case of a microorganism doubling in 40 minutes, starting from an inoculum 8 times smaller than the quantity of microorganisms blocking the particles, blockage of the particles was observed when they were subjected to a magnetic field after 2 hours of incubation.
  • the same microorganism was incubated under the same conditions, with different doses / concentrations of compounds, for example antibiotic (s), or any other growth inhibiting agent, the inventors have demonstrated that the container comprising the lowest concentration from which the particles are not blocked corresponds to the Minimal Inhibitory Concentration (MIC).
  • MIC Minimal Inhibitory Concentration
  • the inventors have demonstrated that the method of the invention makes it possible to determine the MIC of a compound vis-à-vis a microorganism, for example an antibiotic vis-à-vis a bacterium, in less than 6 hours.
  • the method according to the invention thus makes it possible to considerably shorten the time of obtaining the result, namely a reduction of 3 to 4 times of the time, compared with the conventional antibiogram, the result of which is linked to a measurement " the growth of a given bacterium, appreciable to the naked eye "according to the definition of CA-SFM is obtained after 18 or 24 hours.
  • the method according to the invention makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic or to one or more active principle (s) well before the methods known to those skilled in the art.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism before the person skilled in the art can appreciate with the naked eye a growth of the microorganism in the culture medium.
  • the method of the invention makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic or to an active ingredient in a time approximately three to four times lower than those of the state of the art, thus going from 18-24. at 4-6 hours for the determination time.
  • the method of the invention allows the determination of the MIC with the naked eye, for example without a particular reading device.
  • the method according to the invention allows the determination of the MIC with the naked eye which may correspond to the first concentration of compound, progressing in a series of reasons 2, in which it is observed with the naked eye a in motion of said magnetic or magnetizable particles by application of a magnetic or electric or electromagnetic field.
  • the inventors have surprisingly demonstrated that the method of the invention makes it possible to obtain a reliable and reproducible result with a similarity similar to that of the usual processes.
  • microorganism means any microorganism known to those skilled in the art. It may be, for example, bacteria, fungi, algae and / or protozoa.
  • bacteria chosen from the group, without being limited thereto, comprising Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia
  • fungus can be any fungus known to those skilled in the art, for example pathogenic or non-pathogenic fungi, for example fungi responsible for pathologies, for example in human health or not, environmental fungi, fungi chosen from group comprising yeasts, for example Candida and / or Cryptococcus, for example yeasts responsible for pathologies, for example in human health, for example candidiasis and / or cryptococcosis, and / or the group comprising molds, for example Aspergillus, for example mold responsible for pathology, for example in human health, for example aspergillosis and / or pulmonary mycosis.
  • yeasts for example Candida and / or Cryptococcus
  • yeasts responsible for pathologies for example in human health, for example candidiasis and / or cryptococcosis
  • molds for example Aspergillus, for example mold responsible for pathology, for example in human health, for example aspergillosis and / or pulmonary mycosis
  • the anaerobic culture conditions of the microorganism may be obtained by closing the open end of the culture reactor, for example with the aid of Parafilm (registered trademark), a plug etc. or by placing said reactor under conditions allowing the development of anaerobic bacteria.
  • It may be, for example, anaerobiosis jars, pouches generating an oxygen depleted atmosphere and enriched with carbon dioxide, anaerobic enclosures with a controlled atmosphere and / or any means known to those skilled in the art.
  • the microorganism may be introduced into a culture container at a concentration of from 1 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 8 CFU / ml (CFU: Colony-Forming Unit), for example from 1 ⁇ 10 7 to 8 ⁇ 10 7 CFU. / ml.
  • CFU Colony-Forming Unit
  • the quantity of microorganism may be from 2.10 5 to 4.10 7 CFU, for example from 2.10 6 to 1, 6.10 7 CFU.
  • concentration hindering the movement of the microparticles is meant the quantity of microorganisms, in the reaction volume added to the container on which the antibodies or ligands are present, the concentration (or quantity), preferably minimal, of microorganisms capable of to oppose the aggregation / grouping of particles in the center of the container by the application of the field.
  • concentration hindering the movement of the particles is of the order of 1 ⁇ 10 8 for staphylococci.
  • the concentration hindering the movement of the particles can be determined, for example, by a process comprising adding to a container on which the antibodies or ligands are present, varying amounts of microorganisms in a reaction medium containing the magnetic or magnetizable particles, incubation of said microorganisms in the container to allow the interaction of said microorganisms with the ligands present on the surface of the container, the application of a field capable of attracting the particles towards the center of the container to aggregate them, the measurement of the aggregation of said particles, the determination of the lowest concentration / amount of microorganism leading to a lack of aggregation of the particles. It may be for example the method described in Example 1.
  • the process may comprise, prior to step a), a prior step AO) for culturing the microorganism in order to obtain a microorganism in an exponential growth phase.
  • It may be for example the culture of said microorganism in a suitable culture medium.
  • the person skilled in the art on the basis of this general knowledge, will know, depending on the microorganism, how to choose the culture medium and the conditions adapted to obtain a microorganism in an exponential phase of growth.
  • the prior step AO for culturing the microorganism makes it possible to standardize the growth of the microorganisms and in particular to reduce the sensitivity determination time insofar as the microorganisms are in the exponential phase of growth.
  • culture container means any culture container known to those skilled in the art. It may be for example a culture reactor, wells, tubes or wells for example microdilution plates.
  • the culture container may be for example an enclosure with a closed end, of the tube type, well, etc. or an enclosure having two openings. It may also be a container comprising a closed end so as to form a flat bottom, a container with a closed end so as to form a hemispherical bottom, a container comprising two open ends.
  • said container may be configured to allow flow of the culture medium in a constant flow or in a discontinuous flow.
  • It may be for example microdilution plate type of plate defined for example by the American National Standards Institute and the Society for Biomolecular Screening ("microplates") carrying 96 wells, 384 and even 1536, or conversely 48 or 24 wells or any other number of wells.
  • It may be for example a culture container consisting of any material known to those skilled in the art. It may be for example plastic, for example polycarbonate, polypropylene, polystyrene, etc., glass, metal.
  • microplates polycarbonate or polypropylene flat-bottom, conical or round.
  • the container is made of polycarbonate or polypropylene, this makes it possible to prevent unwanted adhesion of the microorganism to the internal surfaces of the container.
  • polystyrene container for example any polystyrene known to those skilled in the art.
  • the fixing of the ligand of said microorganism can be improved.
  • the person skilled in the art by his general knowledge will be able to adapt / choose the polystyrene suitable for a better fixation of the ligand, for example according to these physicochemical properties, for example hydrophilic, hydrophobic.
  • the culture medium may be any culture medium known to those skilled in the art and / or commercially available in which at least one microorganism is likely to develop. It may be for example a natural or synthetic environment.
  • it may be a culture medium for bacterial growth, for example BHI (Brain Heart Infusion) medium, LB medium ("Lysogeny broth” also called “Luria Bertani”).
  • medium MH “Mueller-Hinton medium”
  • glucose broth for example the medium Sabouraudv
  • yeast culture medium for example the medium Sabouraudv
  • the term "ligand of the microorganism” is understood to mean any ligand known to those skilled in the art. It may be for example a ligand chosen from the group comprising antibodies, peptides, aptamers.
  • the antibodies can be any antibody known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or a mixture thereof. These may be, for example, commercially available antibodies, for example antibodies marketed by AbCam, Acris, Fitzgerald, GeneTex or ThermoFisher Scientific.
  • the peptides may be any peptide known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be for example peptides marketed by the company Clinisciences, Proteomic Solutions, Biomatik, Casio, Genscript.
  • aptamers can be any aptamer known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be for example aptamers marketed by the company Aptagen, IBA, Novaptech.
  • microorganism ligand may be a specific or non-specific ligand of the microorganism.
  • the nonspecific ligand may be any ligand known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be for example a ligand chosen from the group comprising Protein A, Protein G and Protein L.
  • the ligand of the microorganism can be attached to the surface of the inner walls of the container at a concentration of 0.1 to 20 ⁇ 9 / ⁇ , for example from 0.5 to 5 ⁇ 9 / ⁇ , for example equal to 6 ⁇ 9 / ⁇ .
  • the ligand of the microorganism may be attached to the surface of the inner walls of the container by any method and / or means known to those skilled in the art. It may be for example a passive adsorption, commonly called “coating”, for example comprising incubating the ligand in the culture container to adsorb said ligand to the walls of said container and then washing the container to remove unbound ligands. It may be for example a process using coupling polymers, for example polypropylene or polycarbonate, for example associated with silylsulfonyl azides.
  • the surface of the inner walls of the culture container may comprise one or more ligand (s) attached to their surface.
  • the method of attachment may comprise a first ligand binding step, for example a ligand selected from the group consisting of Protein A, Protein G, Protein L followed by a second binding step, for example ligand selected from the group comprising antibodies.
  • said at least two particles may be selected from the group consisting of an electrically charged particle, a magnetic particle, a particle coated with at least one magnetic layer, a magnetizable particle, a particle coated with a magnetizable layer, a mixture of two or more of these particles. In fact, it may be any particle for implementing the present invention.
  • the particles rest on a surface immersed in the culture medium.
  • Said particles are in stable position, that is to say at rest, in the absence of the magnetic field, or electromagnetic.
  • said particles may be particles of any form suitable for the implementation of the present invention, for example in the form of a ball, a puck, an asymmetric geometric shape, for example with a flat face, etc.
  • any suitable size of magnetic or magnetizable particles may be used.
  • the size may be chosen for example depending on the size of the microorganism, and / or the size of the medium containing the culture medium for carrying out the method of the invention and / or the microorganism.
  • the magnetic or magnetizable particle may have a size of, for example from 10 nm to ⁇ ⁇ , for example from 0.1 to ⁇ ⁇ .
  • the particles may be of identical or different sizes, the proportion between the particles of different sizes, relative to the microorganism in question, which can modify the sensitivity of the test.
  • the small particles may have a size, for example, from 10 nm to 1 ⁇ m, for example from 100 to 500 nm
  • the large particles may have a size, for example, from 1 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • 100 ⁇ for example from 1 ⁇ to 10 ⁇ , for example from 1 ⁇ to 5 ⁇ .
  • the respective size of the large and small particles is chosen so as to determine different stages of development.
  • the method of the invention can be implemented with a plurality of particles, for example from 2 to 10,000,000, from 1,000 to 10,000,000, from 1,000 to 1,000,000, from 10,000 to 10,000,000. 1,000,000, 100,000 to 1,000,000, 10,000 to 100,000, preferably 1,000 to 1,000,000 particles.
  • the particles can be illuminated, for example by means of a light source.
  • the illumination advantageously makes it possible to increase the contrast between the particles and the solution.
  • said at least two particles are preferably particles generating a detectable signal.
  • the detection of this signal will depend on the properties of the particles.
  • they may be fluorescent, FRET fluorescent, phosphorescent, radioactive, chemiluminescent, reflective or colored particles.
  • the fluorescence emitted by the particles can be detected, for example visually, and / or by any optical means known to those skilled in the art.
  • Said at least two particles may for example be illuminated to follow its movement by means of a light source, for example by a laser beam.
  • the fluorescence emitted by a first particle excited by a wavelength will itself excite the second molecule that will generally emit fluorescence. a wavelength very far from the first exciting wavelength, and after a time such that the background noise emission due to the first excitation is extinguished.
  • This transfer of the first type of particle to the second can only be done if the particles are very close and is proportional to the number of particles collected / aggregated.
  • these particles can be visualized, for example visually, by any optical means known to those skilled in the art.
  • the at least two particles are radioactive
  • these particles can be detected even through optically opaque liquids or culture media, as well as through optically opaque microdilution plates by any detection device.
  • radioactivity emitted known to those skilled in the art, especially the conventional method of revelation on autoradiographic film. It is then sufficient to press the sensitive film under the microdilution plate and then reveal the bottom image of said microdilution plate.
  • the detection of the particles can be formed by adding to the medium the chemical reagent allowing the emission of light energy by the particles.
  • the detection of this signal may be for example visual and / or by any means known to those skilled in the art in particular by the use of CCD camera ("Charge Coupled Device ”) sensitive to the wavelengths emitted, which scan (scan) the wells, the wells of the microdilution plate.
  • CCD camera Charge Coupled Device
  • the detection of the particles may be, for example, visual or by any optical means known to those skilled in the art.
  • said at least two particles may for example be illuminated, to follow their movements by means of a light source, for example by a laser beam.
  • the detection of the particle may for example be visual and / or by any means known to those skilled in the art for the detection of colored particles.
  • an image can be acquired by a scanner-type apparatus and then analyzed by an image analysis software allowing quantification of the particles. collected / aggregated at the center of the well.
  • the particles may advantageously be chosen from different colors depending on their size and / or according to their magnetic power.
  • an excitable particle for example a fluorescent particle in FRET.
  • the observation of can be carried out by any means known to those skilled in the art. It may be for example an optical device, for example a microscope, a camera, a document scanner, for example a perfection scanner V600 EPSON, a visual observation.
  • an optical device for example a microscope, a camera, a document scanner, for example a perfection scanner V600 EPSON, a visual observation.
  • the observation can make it possible to measure, for example the intensity, the contrast, the image variance, for example via any means known to those skilled in the art, for example software imaging, for example to measure, for example differences in contrast, intensity, for example corresponding to the particles, in areas of an image to another and thus to determine the differences of a observation to another.
  • particles emitting a signal for example colored particles, fluorescent, phosphorescent, luminescent, radioactive may allow, for example automated observation
  • the field for moving said at least two magnetizable particles can be a magnetic field, or an electric field, or an electromagnetic field.
  • Said magnetic field, or electric or electromagnetic field may be generated, for example by a magnet or a solenoid.
  • the magnet may be for example in the form of a bar, tip, piece, etc. or any form suitable for carrying out the present invention.
  • the field may, for example, be applied by any means known to those skilled in the art, for example by pulse, by gradual increase of the electric or electromagnetic field, by electric or electromagnetic field variations or by a combination of these applications.
  • a progressive increase of the magnetic field, or electric or electromagnetic field can be obtained, for example, by bringing a magnet or a solenoid in a rectilinear or sinusoidal trajectory, or in an oscillating movement with or without an amplitude of oscillation and / or a variable frequency. More complex field variations can be obtained, for example by rotation or by combinations of motions of a magnetized material in proximity to said at least two particles.
  • said magnetic, or electrical, or electromagnetic field may be generated by field generating means which may or may not be in motion.
  • the magnetic, electrical, or electromagnetic field must be able to grouping said particles on said immersed surface in the culture medium or on said surface of said culture medium.
  • “compound” means any compound, for example natural or obtained by synthesis or chemical hemi-synthesis, known to those skilled in the art capable of modifying the growth / development of microorganisms and / or capable of killing a microorganism . It may be for example a biocide, for example a disinfectant, a protection product, a product for the control of the so-called harmful and other species and / or any biocide included in the list according to the directive 98/8 / EC or Regulation (EU) No 528/2012, an antibiotic, an anti-fungal.
  • a biocide for example a disinfectant, a protection product, a product for the control of the so-called harmful and other species and / or any biocide included in the list according to the directive 98/8 / EC or Regulation (EU) No 528/2012, an antibiotic, an anti-fungal.
  • This may be, for example, an antibiotic chosen from the group comprising fusidic acid, aminoglycosides, beta-lactams, penicillins, beta-lactamase inhibitors, cephalosporins, carbapenems, monobactams, cycloserine.
  • daptomycin fosfomycin, lincosamides, macrolides and ketolides, mupirocine, nitroimidazoles, nitrofurans, oligosaccharides, oxazolidinones, polypeptides: bacitracin, glycopeptides, polymyxins and colistin, quinolones, rifamycins, sulfonamides and diaminopyridines, synergistines, tetracyclines, antifungals, or any mixture thereof.
  • an anti-fungal chosen from the group comprising Miconazole, Ketoconazole, Clotrimazole, Econazole, Bifonazole, Butoconazole, Fenticonazole, Nsoconazole, Oxiconazole, Sertaconazole, Sulconazole, Thiabendazole, Tioconazole, Fluconazole, Itraconazole, Nsavuconazole, Ravuconazole, Posaconazole, Voriconazole, Terbinafine, Amorolfine, Naftifine, Butenafine, Mycosubtiline or any mixture thereof.
  • the antibiotic and / or the anti-fungal may be in solution in the culture medium, or in dehydrated or freeze-dried form, and / or fixed on the surface immersed in said medium.
  • the usable binding means of the antibiotic and / or the anti-fungal are those known to those skilled in the art for the attachment of an antibiotic and / or an anti-fungal to a surface. These may be for example those commercially available, for example marketed by the company NUNC (Denmark), Corning (United States), and Greiner Bio-One (Austria).
  • one or more compounds may be introduced into the culture medium, for example one or more antibiotics.
  • the method according to the invention makes it possible to test different antibiotics and / or anti-fungal agents alone and / or to seek a combination or combination effect of antibiotics and / or anti-fungal agents in a commonly-used format. called "chessboard" (or checkerboard in English).
  • chessboard or checkerboard in English.
  • the implementation of the method of the invention with a mixture of antibiotics and / or anti-fungal (combination, combination) can advantageously allow to detect possible additive, synergistic and / or antagonistic effects.
  • additive effect is meant the addition of the actions of at least two antibiotics making it possible, for example, to find a combination of antibiotics having the same antibiotic effect as an antibiotic alone, but with lower concentrations.
  • synergistic effect is meant an improvement in the effectiveness of an antibiotic and / or antifungal by adding at least a second antibiotic and / or antifungal, this mixture of antibiotics and / or anti-fungal having an effect greater than the addition of the effect of each antibiotic and / or anti-fungal alone.
  • anti-fungal effect means the inhibition of the action of an antibiotic and / or an anti-fungal on the microorganism by the addition of at least a second antibiotic and / or anti-fungal.
  • This embodiment can make it possible to select combinations, combinations of antibiotics and / or anti-fungals ("co-drug") relevant for, for example, inhibiting the development of the microorganism.
  • the antibiotics and / or antifungals can also be introduced successively into the medium in order to identify additive, synergistic or antagonistic effects as described above.
  • the method according to the invention makes it possible to determine / detect and / or identify the sensitivity of microorganisms to compounds. Also, the method according to the invention advantageously makes it possible to identify a new biocide, for example a new antibiotic and / or antifungal. In addition, the method according to the invention may advantageously make it possible to determine the specificity of a compound, for example if it is an antibiotic and / or an antifungal.
  • the term "physical agent” means temperature, thermal radiation, pressure, radiation, or radiation. It may be for example any radiation known to those skilled in the art, for example corpuscular radiation, ripple radiation and / or electromagnetic radiation.
  • the method may comprise, prior to step a), the following steps:
  • A1) introducing into a culture container (a2) comprising a liquid culture medium suitable for the development of said microorganism, i. at least two magnetic or magnetizable particles ii. at least one microorganism for seeding said medium, and
  • step a2) maintaining the seeded culture medium and said at least two molecules under conditions allowing growth and / or growth of said microorganism, the medium obtained being the medium introduced into the container of step a).
  • the container (a2) and the container of step a) may be identical or different.
  • the container (a2) can for example be made of plastic, for example polycarbonate, polypropylene, polystyrene, glass, metal.
  • the container may be a microplate well made of polycarbonate and / or polypropylene with a flat, conical or round bottom.
  • the polycarbonate or polypropylene reduces the attachment of microorganisms to the surface of the inner walls of the container favoring its growth advantageously.
  • the culture container of step a) may advantageously be different from the container a2. It may be for example a polystyrene container as described above.
  • the maintenance of the seeded culture medium under conditions allowing a development and / or growth of said microorganism can be carried out for 30 minutes to 6 hours, for example from 1 to 5 hours, from 2 to 4 hours.
  • the culture medium is maintained under conditions allowing growth and / or growth of said microorganism for 2 to 5 hours.
  • the process may be carried out in a plurality of containers comprising on the surface of their internal walls a ligand of said microorganism each comprising:
  • the different containers comprising a different concentration of said compound and / or physical agent and / or a compound and / or physical agent different from one container to another.
  • the different containers may be grouped together on the same support, for example on a plate comprising from 1 to 384 wells, for example 6, 12, 24, 48, 96, etc.
  • the method may advantageously make it possible to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the planktonic growth, that is to say in the liquid phase, in the culture medium, of said microorganism.
  • MIC Minimum Inhibitory Concentration
  • the determination of the minimum concentration of the antibiotic inhibiting the growth of said microorganism can be achieved by successively or simultaneously implementing the method of the invention in identical conditions using a liquid culture medium suitable for the development of a microorganism, at least two magnetic or magnetizable particles, at least one microorganism and at least one compound in a concentration different from one embodiment to another.
  • Said antibiotic concentration can be established for example according to a geometric sequence of reason 1 ⁇ 2 from an initial concentration X, for example X, X / 2, X / 4, X / 8, etc., or any other sequence geometrically appropriate.
  • the first concentration that is to say the lowest concentration from which the particles are mobile, reflecting the activity of the antibiotic on the growth of bacteria, corresponds to the minimum inhibitory concentration (MIC).
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • This estimation of the mobility of the particles can be made simply visually, for example as for antibiograms in tubes, or advantageously following the analysis of the image by a suitable software, such as the software BFC Elements (trademark) developed by the company BioFilm Control.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to determine the minimum concentration of antibiotic from which the microorganism is sensitive to the antibiotic in its growth, that is to say the minimum concentration for which the, at least two, particles can be set in motion / aggregated by application of the field in one of said containers.
  • the method of the invention can also be implemented with a zero compound concentration, said embodiment constituting a growth control of the microorganism in the culture medium.
  • Another control may consist in validating the sterility of the medium in the presence of particles during the test period.
  • Another witness may be to validate that the antibiotic does not cause artifacts in the medium in the presence of particles.
  • the method of the invention may advantageously be carried out simultaneously in a plurality of containers.
  • a plurality of magnetic fields for example magnets
  • the magnets may for example be fixed on a support so as to allow a juxtaposition of each container in which the method of the invention is carried out with a magnet of the support.
  • the application of the magnetic field on said containers is independent of one container to another.
  • the magnetic field applied to said containers may be identical or different from one container to another, preferably identical.
  • the method of the invention therefore also advantageously makes it possible to determine the minimum inhibitory concentration of an antibiotic for bacterial growth for said microorganism by carrying out the process of the invention in the different containers in a single step on a single support. .
  • the method of the invention allows for example to follow the recommendations of the Committee of the Antibiogram of the French Society of Microbiology, relating to the general technical conditions for the dilution methods.
  • the method of the invention may, for example, be used for the implementation of an antibiogram of assistance with the prescription of the antibiotic (or antibiotics) effective (s) on a microorganism taken from a patient, by application of the method of the invention.
  • This microorganism can then be tested with different antibiotics, for example on a single analysis support, to optimize the treatment of this patient.
  • Application of the method to said microorganism makes it possible to verify that the microorganism is indeed sensitive to antibiotics at a concentration, for example equal to the MIC.
  • the method of the invention can also make it possible to follow in vitro the evolution of the MIC of a microorganism of a patient with respect to an antibiotic. This aspect is important for long-term treatments, or for immunocompromised patients prone to chronic infections with the same microorganism.
  • the method of the invention makes it possible to monitor the appearance of resistance to a treatment. The method then makes it possible to find other antibiotics more able to inhibit the growth of said microorganism.
  • the process of the invention by the application of the field and the aggregation or not of the particles makes it possible to obtain a rapid and visual result of the sensitivity or not of the microorganism to the compound and / or physical agent.
  • FIG. 1 shows that the blocking of the microbeads is proportional to the number of bacteria in the wells, at the time of magnetization, and makes it possible to determine the threshold at which the microbeads are blocked.
  • FIG. 1A is a photograph of a multiwell plate after application of the field, the points in the center of the wells corresponds to the grouping of the particles
  • FIG. 1B represents the diagram of the plate and the conditions for each well, namely the fixed ligand. : anti-E. coli (anti-coli) antibody or anti S. aureus (Ac anti S. aureus) as well as the starting concentrations of the bacteria for each container.
  • FIG. 1 shows that the blocking of the microbeads is proportional to the number of bacteria in the wells, at the time of magnetization, and makes it possible to determine the threshold at which the microbeads are blocked.
  • FIG. 1A is a photograph of a multiwell plate after application of the field, the points in the center of the wells corresponds to
  • 1C is a graph of the BFIs obtained as a function of the amounts of S. aureus bacteria deposited in containers (wells) on whose internal surfaces the anti-Staphylococcus aureus antibodies had been coated ("coated") at 6 ⁇ 9 / ⁇ for 2 conditions in replicates (Experiments 1 and 2).
  • Figure 2 is a photograph of multiwell plate after the implementation of the method. It corresponds to an example of determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of 3 antibiotics on strains of Staphylococcus aureus.
  • MIC Minimal Inhibitory Concentration
  • Example 1 Determination of the amount of bacteria needed to block the microbeads.
  • the microplate was then covered with 10 ⁇ of contrast liquid and placed 1 minute on a block carrying 96 mini-magnets arranged so that they are centered relative to the wells.
  • the microplate was then placed on a scanner, driven by the BFCE 3 software and an image was captured.
  • the image is then analyzed and a BFI (BioFilm Index) value as described in Chavant et al. [10] was calculated.
  • a value of 0 corresponds to a total blocking of the microbeads whereas a value of 20, or near, corresponds to a total mobility of the balls. All intermediate values are possible.
  • FIG. 1 B The plate plan was defined as described in Figure 1 B.
  • the plan details the 2 variables tested: the amount of bacteria deposited in the wells, as well as the concentration of anti-Staphylococcus aureus antibodies used for coating wells (coating).
  • Figure 1 A corresponds to the raw image obtained.
  • FIG. 1C corresponds to the graphical representation of the BFIs obtained as a function of the amounts of S. aureus bacteria deposited in containers (wells) of which on the internal surfaces of which the anti-Staphylococcus aureus antibodies had been coated at 6 ⁇ 9 / ⁇ , for 2 replicate conditions (1 and 2).
  • Example 2 antibiograms according to the method of the invention and comparison with the methods of the state of the art.
  • the Sensible (S) or Resistant (R) qualification of a strain is based on the relative position of the MIC determined with respect to the "breakpoint", a value taking into account different parameters.
  • a breakpoint value has been established by committees. This breakpoint value serves as a threshold: if the MIC of the strain tested is lower than the breakpoint, the bacteria is called Sensitive, ie a "low” dose of antibiotic is enough to inhibit its growth, if on the contrary the MIC of the strain is superior to the "breakpoint", the strain is to say Resistant.
  • this value is not unique but can spread over several concentrations.
  • the strain A929 is fosfomycin (S), erythromycin (S) and rifampicin (R).
  • Strain B198 is fosfomycin (R), erythromycin (R) and rifampicin (S).
  • Antibiotics (erythromycin, reference E1300000, fosfomycin, reference F0400000, rifampicin, reference R0700000) came from EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare, Council of Europe) and meet the criteria of the European Pharmacopoeia.
  • the bacteria were resuspended in a tube containing 2 ml of liquid Mueller-Hinton medium and left to grow with light agitation for 2 hours. This step aims to obtain bacteria exponential growth phase and standardize their growth during the 2 hours microplate, in the presence of antibiotics. This growth, in the presence of antibiotics, was carried out in polypropylene microplates, with a round bottom, of brand and reference Nunc 054309, this type of support being preferred to limit the adhesion of microorganisms at this stage.
  • Polystyrene microplates flat-bottom brand and Costar reference 3370, were coated with polyclonal rabbit antibodies, anti-staphylococcus aureus, according to the following method.
  • a polystyrene plate was previously coated ("coated") with anti-staphylococcus aureus antibodies (anti-Staphylococcus aureus rabbit, purified IgG fraction, Acris). To do this, the plate was incubated overnight at 4 ° C., with 200 ⁇ l / ⁇ l of a suspension of antibody at a concentration of 6 ⁇ g / ml in phosphate buffered saline (PBS). The plate was washed 2 times with the plate washer with PBS supplemented with 0.1% Tween-20 to remove the non-adsorbed antibodies on the polystyrene. After the last wash, the wells were left empty.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the starting inoculum of the staphylococci corresponds to a measurement of OD at 600 nm of 0.04, ie of the order of 4.10 7 bacteria / ml, or in quantity, 8.10 6 bacteria in the 200 ⁇ of reaction medium. Incubation at 37 ° C takes place for 2 hours.
  • microplates were then covered with 10 ⁇ of contrast liquid and placed 1 minute on a block carrying 96 mini-magnets arranged so that they are centered relative to the wells.
  • the microplates were then placed on a scanner, driven by the BFCE 3 software and an image was captured.
  • the letter S defines the strain as Sensible (CMI lower than the breakpoint EUCAST) while the letter R defines the strain as Resistant (CMI superior to the breakpoint EUCAST).
  • the plate scheme is as follows:
  • FIGS. 2A and 2B The results obtained after applying the magnetic field are shown in FIGS. 2A and 2B.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to obtain a reliable, consistent result, without implementation of a complex device.
  • the method according to the invention makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism to a compound and to determine its MIC in a time 3 to 4 times less than the known method, for example between 3 and 5 hours.
  • the process according to the invention by rapidly obtaining the sensitivity or the resistance of the microorganism to a molecule, for example an antibiotic, to quickly adapt and / or confirm the antibiotic treatment of a patient thereby providing a real advantage clinical, for example by gaining 24 hours in treatment and its eventual adaptation.
  • a molecule for example an antibiotic

Abstract

The present invention relates to a method for determining the sensitivity of a microorganism to at least one compound and/or physical agent. The present invention also relates to use of the method for rapidly determining the sensitivity of a microorganism in order to determine the minimum inhibitory concentration of a microorganism to at least one compound, for example an antibiotic and/or physical agent. The present invention is of use in particular in the fields of analysis, biological and enzymological research, pharmaceuticals, diagnostics and/or medicine and/or disinfection, for example surface disinfection.

Description

PROCEDE DE DETECTION RAPIDE DE SENSIBILITE DE MICROORGANISMES AUX DROGUES  METHOD FOR THE RAPID DETECTION OF SENSITIVITY OF DRUG MICROORGANISMS
Domaine technique Technical area
La présente invention se rapporte à un procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à au moins un composé et/ou à un agent physique.  The present invention relates to a method for determining the sensitivity of a microorganism to at least one compound and / or a physical agent.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation du procédé de détermination rapide de la sensibilité d'un microorganisme pour déterminer la concentration minimale inhibitrice d'un microorganisme à au moins un composé, par exemple un antibiotique, et/ou un agent physique.  The present invention also relates to the use of the method for rapidly determining the sensitivity of a microorganism to determine the minimum inhibitory concentration of a microorganism to at least one compound, for example an antibiotic, and / or a physical agent.
La présente invention trouve une application notamment dans les domaines analytiques, de la recherche biologique, enzymologique, dans le domaine pharmaceutique, dans le domaine du diagnostic et/ou dans le domaine médical et/ou dans le domaine de la désinfection, par exemple de surface.  The present invention finds application in particular in the analytical fields, biological research, enzymology, in the pharmaceutical field, in the field of diagnosis and / or in the medical field and / or in the field of disinfection, for example surface .
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.  In the description below, references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
Etat de la technique State of the art
Les antibiogrammes sont des tests permettant de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique. Cette détermination est en général réalisée pour des microorganismes pathogènes.  Antibiotic tests are tests to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic. This determination is generally carried out for pathogenic microorganisms.
L'antibiogramme a pour but de déterminer les Concentrations The aim of the antibiogram is to determine the concentrations
Minimales Inhibitrices (CMI) d'une souche bactérienne vis-à-vis de divers antibiotiques. Selon la définition de l'Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S.), la CMI est la plus faible concentration d'antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d'une bactérie donnée, appréciable à l'œil nu, après une période d'incubation donnée. La détermination de cette valeur est peu précise mais elle est consacrée par l'usage et elle bénéficie d'une masse importante d'informations recueillies à son sujet, par exemple tel que mentionné dans le document « Conditions techniques générales. Bulletin de la Société Française de Microbiologie, 1993, 8, 156-66 [1 ], et dans le document Clinical Microbiological Infection 1996, 2, Suppl. 1 [2]. Minimal Inhibitors (MICs) of a bacterial strain against various antibiotics. According to the definition of the World Health Organization (WHO), the MIC is the lowest concentration of antibiotic capable of causing a complete inhibition of the growth of a given bacterium, appreciable to the naked eye, after a period given incubation. The determination of this value is not very precise but it is consecrated by use and it benefits from a large amount of information collected about it, for example as mentioned in the document "General technical conditions. Bulletin of the French Society of Microbiology, 1993, 8, 156-66 [1], and in the document Clinical Microbiological Infection 1996, 2, Suppl. 1 [2].
A la suite des recommandations du Comité d'Experts de la Standardisation biologique de l'OMS (Recommandations du Comité d'Experts de la Standardisation biologique de l'OMS. Rapports techniques n ° 610, 1977 [3]), la Société Française de Microbiologie a créé un Comité de l'Antibiogramme (CA-SFM) chargé de déterminer les valeurs critiques qui délimitent les catégories cliniques (antérieurement désignées comme catégories thérapeutiques) et de proposer un guide pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Les valeurs critiques définies pour les concentrations et les diamètres des zones d'inhibition, ainsi que les recommandations spécifiques pour certaines espèces ou pour certains groupes d'antibiotiques sont publiées dans un communiqué annuel.  Following the recommendations of the WHO Expert Committee on Biological Standardization (Recommendations of the WHO Expert Committee on Biological Standardization, Technical Reports No. 610, 1977 [3]), the French Society of Biological Standardization Microbiology has created an Antibiogram Committee (CA-SFM) to determine critical values that delineate clinical categories (previously designated as therapeutic categories) and to provide a guide for determining the susceptibility of bacteria to antibiotics. The critical values defined for the concentrations and diameters of the zones of inhibition, as well as the specific recommendations for certain species or for certain groups of antibiotics are published in an annual communiqué.
Les méthodes et procédés connus pour réaliser un antibiogramme sont connus et résumés notamment dans les recommandations du Comité de l'Antibiogramme de Société Française de Microbiologie (Recommandations 2010. Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie [4]).  Methods and methods known to perform an antibiogram are known and summarized in particular in the recommendations of the Committee of the Antibiogram of French Society of Microbiology (2010 Recommendations. Committee of the Antibiogram of the French Society of Microbiology [4]).
En particulier les protocoles du CA-SFM pour la détermination de la CMI en milieu liquide décrivent les conditions et milieux pour leurs mises en œuvre. Selon les « conditions techniques générales pour les méthodes de dilution... » (Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie, Recommandations 2010, page 4, [4]) le milieu recommandé est le milieu de Mueller-Hinton, avec ou sans supplémentation. En particulier, ce document décrit la préparation de l'inoculum:« Inoculum : à partir d'une culture de 1 8-24 h sur milieu gélosé non sélectif, préparer une suspension en bouillon Mueller-Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCI) équivalente au standard McFarland 0,5 (~ 1 .10S UFC/ml). Cette suspension peut également être préparée à partir d'une culture en bouillon Mueller-Hinton obtenue après incubation à 37° C au bain-marie agité pendant 3 à 5 h, et dort la densité est ajustée au standard McFarland 0,5 ». Selon les mêmes recommandations du CA-SFM, les résultats sont obtenus en 18h, 24h jusqu'à 72h en fonction de la vitesse de croissance des souches bactériennes. Ce délai est la conséquence de la définition de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) : la plus faible concentration d'antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d'une bactérie donnée, appréciable à l'œil nu, après une période d'incubation donnée. Ce délai important est un handicap pour le thérapeute. In particular the CA-SFM protocols for the determination of the MIC in a liquid medium describe the conditions and media for their implementation. According to the "general technical conditions for dilution methods ..." (Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology, Recommendations 2010, page 4, [4]) the recommended medium is the medium of Mueller-Hinton, with or without supplementation. In particular, this document describes the preparation of the inoculum: "Inoculum: from a culture of 18-24 hours on nonselective agar medium, prepare a suspension in Mueller-Hinton broth or in saline solution (0.9 % NaCl) equivalent to the standard McFarland 0.5 (~ 1 .10 S CFU / ml). This suspension can also be prepared from a Mueller-Hinton broth culture obtained after incubation at 37 ° C in a shaking water bath for 3-5 h, and the density is adjusted to the 0.5 "McFarland standard. According to the same CA-SFM recommendations, the results are obtained in 18h, 24h up to 72h depending on the growth rate of the bacterial strains. This delay is the consequence of the definition of the MIC (Minimum Inhibitory Concentration): the lowest concentration of antibiotic capable of causing a complete inhibition of the growth of a given bacterium, appreciable to the naked eye, after a period of given incubation. This important delay is a handicap for the therapist.
Il existe donc un réel besoin dans l'état de la technique de trouver un procédé/moyen permettant de déterminer plus rapidement, par exemple en moins de 18 heures, la valeur de la CMI.  There is therefore a real need in the state of the art to find a method / means for determining more quickly, for example in less than 18 hours, the value of the MIC.
Il est fréquent, pour un patient présentant des signes cliniques pour lesquels une infection est suspectée, lors de son examen à JO par un médecin et/ou praticien, par exemple un lundi qu'à partir d'un prélèvement réalisé le jour même, entre 12 et 24 heures, voire une nuit soient nécessaires pour isoler la bactérie pathogène présente dans ledit prélèvement. Cet isolement est usuellement effectué, sur boite gélosée, de Pétri, selon le protocole décrit par le CA-SFM. Après cette phase d'isolement, un antibiogramme peut enfin être réalisé à partir d'une ou plusieurs colonies isolées prélevées à la surface de ladite gélose. Ainsi, le temps pour obtenir un résultat est d'au moins 18 heures voire jusqu'à 72 heures. Ces délais sont importants, beaucoup plus importants que la plupart des délais de rendus de résultats en Laboratoire d'Analyses Médicales.  It is common, for a patient presenting clinical signs for which an infection is suspected, during his examination in OJ by a doctor and / or practitioner, for example a Monday that from a sampled the same day, between 12 and 24 hours, or even a night are necessary to isolate the pathogenic bacteria present in said sample. This isolation is usually carried out on agar plate, Petri, according to the protocol described by the CA-SFM. After this isolation phase, an antibiogram may finally be carried out from one or more isolated colonies taken from the surface of said agar. Thus, the time to obtain a result is at least 18 hours or even up to 72 hours. These delays are important, much more important than most deadlines for results in the Laboratory of Medical Analysis.
En outre, pour déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique ou principe actif, l'homme du métier est incité à suivre les recommandations du Comité de l'antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM), en testant plusieurs dilutions de raison 2 autour de la valeur de concentration critique et en prévoyant aussi une à plusieurs mesure(s) témoin(s) sans antibiotique ou principe actif. La détermination de la CMI selon ces recommandations en appréciant la turbidité du milieu de culture à l'œil nu peut être réalisée après au moins 18 heures. Il existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé, notamment un antibiogramme simple à mettre en œuvre, rapide, permettant une détection précoce de la CMI. In addition, to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic or active principle, the skilled person is encouraged to follow the recommendations of the Committee of the antibiogram of the French Society of Microbiology (CA-SFM), by testing several reason 2 dilutions around the critical concentration value and also providing for one to several control measure (s) without antibiotic or active ingredient. The determination of the MIC according to these recommendations by appreciating the turbidity of the culture medium with the naked eye can be performed after at least 18 hours. There is therefore a real need to have a method, including an antibiogram simple to implement, fast, allowing early detection of the MIC.
Il existe également un réel besoin de disposer d'un procédé permettant de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique palliant les problèmes précités de l'art antérieur, notamment un procédé permettant l'obtention de résultat dans un délai inférieur à 18 heures.  There is also a real need for a method for determining the sensitivity of a microorganism to an antibiotic overcoming the aforementioned problems of the prior art, including a method for obtaining results in a period of less than 18 hours .
En outre, il existe un réel besoin pour l'homme du métier de disposer d'un procédé permettant d'obtenir des résultats rapides, par exemple disponibles en moins de 6 heures présentant des résultats similaires et conformes à ceux obtenus avec les procédés de l'art, notamment selon les recommandations du CA-SFM.  In addition, there is a real need for those skilled in the art to have a method for obtaining rapid results, for example available in less than 6 hours with similar results and consistent with those obtained with methods of the invention. art, especially according to the recommendations of the CA-SFM.
En particulier, il existe un réel besoin de trouver un procédé et/ou un moyen permettant d'obtenir un résultat fiable dans un délai de 6 heures, en particulier dans la mesure où ce résultat permettrait au thérapeute et/ou médecin de connaître le résultat de l'antibiogramme au maximum un jour après osculation/prélèvement (à J+1 ), par exemple dans la journée de mardi si l'admission/l'osculation/le prélèvement a été effectuée le lundi.  In particular, there is a real need to find a method and / or a means to obtain a reliable result within 6 hours, in particular to the extent that this result would allow the therapist and / or doctor to know the result of the antibiogram at most one day after osculation / sampling (at D + 1), for example in the day of Tuesday if the admission / osculation / sampling was carried out on Monday.
Cette obtention rapide du résultat permettra au médecin/thérapeute qui aura prescrit un traitement présomptif, probabilistique de pouvoir adapter/modifier le traitement en fonction du résultat de l'antibiogramme : par exemple si la bactérie pathogène isolée à partir du prélèvement est résistante à l'antibiotique prescrit et cela avec un jour d'avance par rapport aux procédés usuels.  This rapid obtaining of the result will allow the doctor / therapist who prescribes a presumptive, probabilistic treatment to be able to adapt / modify the treatment according to the result of the antibiogram: for example if the pathogenic bacterium isolated from the sample is resistant to the disease. antibiotic prescribed and that one day ahead of the usual processes.
Il existe dans l'état de la technique des procédés susceptibles d'accélérer la croissance bactérienne, par exemple via l'utilisation d'un milieu de culture particulier plus adapté à l'espèce bactérienne, par augmentation du taux de glucose, adaptation du taux d'oxygène, ou du taux de dioxyde de carbone etc. Toutefois, l'utilisation de ces procédés ne permet pas l'obtention d'un résultat, notamment un antibiogramme dans des temps inférieurs à 18 heures. Il existe dans l'état de la technique un procédé permettant de déterminer la sensibilité d'une souche bactérienne formant un biofilm à un agent tel qu'un antibiotique, ou à un anti-fongique dans le cas de champignons, par exemple le procédé décrit dans la demande internationale WO 2005/090944 [5]. Toutefois, le procédé décrit dans ce document ne permet pas de déterminer la sensibilité d'un microorganisme ne formant pas de biofilm. En effet, le procédé décrit dans la demande internationale WO 2005/090944 s'appuie sur la mesure de mobilité de microbilles magnétiques dans un puits de culture (un puits de microplaque 96 puits par exemple) co-incubée avec un microorganisme producteur de biofilm. Lorsqu'un biofilm s'est formé, les microbilles sont piégées par ledit biofilm et ne sont plus mobiles, comparativement à un puits dans lequel le biofilm ne s'est pas formé. Le procédé permet également de déterminer l'efficacité d'un antibiotique, par exemple, à inhiber la formation de biofilm. Or, de nombreuses souches de bactéries pathogènes telles que Escherichia coli, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa [8] ne forment pas spontanément du biofilm. Le procédé décrit dans ce document ne permet donc pas de déterminer la sensibilité de certains microorganismes pathogènes ou non et ne peut donc pas être utilisé universellement. There exist in the state of the art processes that can accelerate bacterial growth, for example via the use of a particular culture medium more adapted to the bacterial species, by increasing the glucose level, adapting the rate of growth. oxygen, or carbon dioxide etc. However, the use of these methods does not allow obtaining a result, including an antibiogram in times less than 18 hours. There exists in the state of the art a method for determining the sensitivity of a bacterial strain forming a biofilm to an agent such as an antibiotic, or an antifungal in the case of fungi, for example the method described in the international application WO 2005/090944 [5]. However, the process described in this document does not make it possible to determine the sensitivity of a non-biofilm forming microorganism. Indeed, the method described in the international application WO 2005/090944 is based on the measurement of mobility of magnetic microbeads in a culture well (a 96 well microplate well, for example) co-incubated with a biofilm-producing microorganism. When a biofilm has formed, the microbeads are trapped by said biofilm and are no longer mobile, compared to a well in which the biofilm did not form. The method also makes it possible to determine the efficacy of an antibiotic, for example, to inhibit biofilm formation. However, many strains of pathogenic bacteria such as Escherichia coli, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa [8] do not spontaneously form biofilm. The method described in this document therefore does not determine the sensitivity of certain pathogenic or non-pathogenic microorganisms and can not therefore be used universally.
Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de maîtriser le temps d'obtention du résultat d'un antibiogramme, réduire les coûts et de réduire le temps d'obtention des résultats d'antibiogramme.  There is therefore a real need to find a method to overcome these defects, disadvantages and obstacles of the prior art, in particular a method for controlling the time of obtaining the result of an antibiogram, reduce costs and reduce the time to obtain the antibiogram results.
En particulier, il existe un réel besoin de trouver un procédé et/ou dispositif permettant de réaliser fournir un résultat d'antibiogramme dans un temps inférieur à 6h.  In particular, there is a real need to find a method and / or device for achieving an antibiogram result in a time of less than 6 hours.
II existe également dans l'état de la technique des procédés utilisant des anticorps, par exemple les tests ELISA utilisés à des fins de diagnostic.  There are also in the state of the art methods using antibodies, for example ELISA tests used for diagnostic purposes.
Ce procédé présente plusieurs inconvénients, par exemple il nécessite nombreux lavages contrôlés diminuant sa sensibilité. Il comprend également de nombreuses étapes de manipulations par l'homme du métier; la réalisation d'au moins deux réactions d'affinités ; le marquage obligatoire du second anticorps avec, au moins un marqueur sensible et sophistiqué, l'utilisation d'un dispositif complexe et difficile à paramétrer pour détecter et quantifier le signal émis par le marqueur. Ce procédé est donc long, coûteux, et nécessite une instrumentation complexe pour sa mise en œuvre. En outre, le test ELISA est utilisé pour quantifier ou semi-quantifier un analyte/composant apporté dans un mélange réactionnel, généralement dans un puits de microplaque. Ce procédé ne permet pas de mesurer de évolution de la quantité d'un analyte par rapport à la quantité, ou sa concentration, initial(e). This method has several disadvantages, for example it requires many controlled washes decreasing its sensitivity. he also includes many steps of manipulation by the skilled person; performing at least two affinity reactions; the mandatory labeling of the second antibody with at least one sensitive and sophisticated marker, the use of a complex device and difficult to set to detect and quantify the signal emitted by the marker. This method is therefore long, expensive, and requires complex instrumentation for its implementation. In addition, the ELISA is used to quantify or semi-quantify an analyte / component supplied into a reaction mixture, usually in a microplate well. This method does not make it possible to measure changes in the quantity of an analyte with respect to the quantity, or its concentration, initial (e).
Il existe d'autres méthodes pour détecter une réaction d'affinité utilisant un anticorps, par exemple des techniques basées sur la résonnance de plasmon de surface (« plasmon surface résonance »), des balances piézo-électriques, voire une simple observation par microscope dans des cas particulier. Pour ce faire, l'anticorps est fixé sur un support adapté à la technique de détection, la substance est mise en contact pendant un temps donné avec l'anticorps fixé sur le support, puis la lecture est réalisée directement ou après un rinçage pour éliminer les substances n'ayant pas réagies par affinité avec les anticorps. Ces procédés utilisent notamment des phénomènes de diffraction, notamment sur des surfaces en or, qui nécessitent des dispositifs très complexe pour l'obtention des résultats. De plus ce procédés nécessite notamment la préparation des échantillons dans des conditions de pH et/ou de force ionique particulières qui peuvent être à l'origine de résultats faux positifs ou faux négatifs.  There are other methods for detecting an affinity reaction using an antibody, for example techniques based on surface plasmon resonance ("plasmon surface resonance"), piezoelectric scales or even a simple observation by microscope in special cases. To do this, the antibody is fixed on a support adapted to the detection technique, the substance is brought into contact for a given time with the antibody fixed on the support, then the reading is carried out directly or after rinsing to eliminate substances which have not reacted by affinity with the antibodies. These methods use in particular diffraction phenomena, especially on gold surfaces, which require very complex devices to obtain the results. In addition, this process requires, in particular, the preparation of the samples under particular pH and / or ionic strength conditions which may give rise to false positive or false negative results.
Toutes ces méthodes présentent de nombreux inconvénients, par exemple l'instrumentation/le dispositif nécessaire pour réaliser la lecture est sophistiqué et coûteux. En outre elles nécessitent des supports particuliers pour la fixation desdits anticorps. Par ailleurs, elles nécessitent un grand nombre d'étapes et sont dépendantes de la qualité et de la quantité d'anticorps fixés. De plus, elles ne sont pas adaptées à la mesure de l'évolution quantitative d'analytes, en particulier d'un microorganisme, dans le puits réactionnel. All of these methods have many disadvantages, for example the instrumentation / device needed to perform the reading is sophisticated and expensive. In addition, they require special supports for fixing said antibodies. Moreover, they require a large number of steps and are dependent on the quality and the amount of antibodies fixed. Moreover, they are not suitable for measuring the quantitative evolution of analytes, in particular of a microorganism, in the reaction well.
Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de maîtriser le temps d'obtention du résultat d'un antibiogramme, réduire les coûts et de réduire le temps d'obtention des résultats d'antibiogramme.  There is therefore a real need to find a method to overcome these defects, disadvantages and obstacles of the prior art, in particular a method for controlling the time of obtaining the result of an antibiogram, reduce costs and reduce the time to obtain the antibiogram results.
En outre, il existe donc un réel besoin de trouver un procédé simple permettant l'obtention des résultats d'antibiogramme, en particulier un procédé ne nécessitant pas de dispositifs complexes, ni d'étapes complexes de préparation des échantillons et/ou de supports pour la mise en œuvre et la réalisation de l'antibiogramme.  In addition, there is therefore a real need to find a simple method for obtaining antibiogram results, in particular a process that does not require complex devices, or complex steps for preparing samples and / or supports for the implementation and the realization of the antibiogram.
Description de l'invention Description of the invention
La présente invention permet de résoudre les problèmes et inconvénients de l'état de la technique en fournissant un procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à au moins un composé et/ou agent physique comprenant les étapes suivantes:  The present invention solves the problems and disadvantages of the state of the art by providing a method for determining the sensitivity of a microorganism to at least one compound and / or physical agent comprising the following steps:
a) introduire dans un contenant de culture comprenant à la surface de ces parois internes un ligand dudit microorganisme, un milieu de culture liquide de microorganismes comprenant  a) introducing into a culture container comprising on the surface of these internal walls a ligand of said microorganism, a liquid culture medium of microorganisms comprising
i. au moins deux particules magnétiques ou magnétisables ii. au moins un microorganisme, et  i. at least two magnetic or magnetizable particles ii. at least one microorganism, and
iii. au moins un composé et/ou un agent physique lesdites au moins deux particules magnétiques ou magnétisables reposant sur une surface immergée par le milieu de culture dans ledit contenant,  iii. at least one compound and / or a physical agent said at least two magnetic or magnetizable particles resting on a surface immersed by the culture medium in said container,
b) déterminer la sensibilité du microorganisme audit composé et/ou agent physique par application d'un champ magnétique et/ou électromagnétique capable d'agréger lesdites au moins deux particules magnétiques ou magnétisables, l'absence d'agrégation desdites au moins deux particules révélant l'insensibilité dudit microorganisme audit composé et/ou agent physique ou l'agrégation desdites particules révélant la sensibilité dudit microorganisme audit composé et/ou agent physique. b) determining the sensitivity of the microorganism to said compound and / or physical agent by applying a magnetic and / or electromagnetic field capable of aggregating said at least two magnetic or magnetizable particles, the absence of aggregation of said at least two particles revealing the insensitivity of said microorganism to said compound and / or physical agent or the aggregation of said particles revealing the sensitivity of said microorganism to said compound and / or physical agent.
Les inventeurs sont en effet les premiers à avoir démontré de manière surprenante que le procédé selon l'invention permet de déterminer simplement et dans un temps inférieur à 8 heures la sensibilité d'un microorganisme à un ou plusieurs principe(s) actif (s), antibiotique(s) ou agents physiques. The inventors are in fact the first to have surprisingly demonstrated that the method according to the invention makes it possible to determine simply and in a time of less than 8 hours the sensitivity of a microorganism to one or more active principle (s). , antibiotic (s) or physical agents.
En particulier, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la capture de microorganismes par des ligands adsorbés au fond d'un contenant permet en fonction de la quantité de microorganismes l'immobilisation des microparticules.  In particular, the inventors have surprisingly demonstrated that the capture of microorganisms by ligands adsorbed at the bottom of a container makes it possible, depending on the quantity of microorganisms, to immobilize the microparticles.
Les inventeurs ont également démontré qu'après incubation des microorganismes dans les contenants, dans des conditions de croissance, la concentration initiale des microorganismes dans l'inoculum étant inférieur à la concentration connue susceptible d'entraver le mouvement des microparticules, il est possible d'observer un blocage des particules dû à une croissance des microorganismes.  The inventors have also demonstrated that after incubation of the microorganisms in the containers, under growth conditions, the initial concentration of the microorganisms in the inoculum being lower than the known concentration likely to hinder the movement of the microparticles, it is possible to Observe particle blockage due to growth of microorganisms.
En d'autres termes, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que grâce aux ligands à la surface des parois internes du contenant, plus précisément au fond, l'introduction de microorganismes dans ce contenant à une concentration ne modifiant pas la mobilité des particules permet après croissance un blocage des particules.  In other words, the inventors have surprisingly demonstrated that, thanks to the ligands on the surface of the internal walls of the container, more precisely at the bottom, the introduction of microorganisms into this container at a concentration which does not modify the mobility of the particles makes it possible after growth a blockage of the particles.
En outre, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé selon l'invention, de par la présence de ligands à la surface des parois internes du contenant, plus précisément au fond, permet d'augmenter la sensibilité de détermination de la sensibilité du microorganisme à au moins un composé et/ou agent physique.  In addition, the inventors have surprisingly demonstrated that the process according to the invention, by the presence of ligands on the surface of the inner walls of the container, more precisely on the bottom, makes it possible to increase the sensitivity of determination of the sensitivity of the microorganism to at least one compound and / or physical agent.
De plus, les inventeurs ont démontré de manière surprenante qu'en l'absence de ligand sur la surface interne de la paroi du contenant, plus précisément au fond, l'application du champ magnétique provoque un regroupement/agrégation des particules quelques soient les conditions d'incubations du microorganisme c'est-à- dire en présence ou absence d'un composé vis-à-vis duquel le microorganisme est sensible. Aussi, les inventeurs ont démontré de manière surprenante et inattendue que le ligand fixé sur la surface des parois internes du contenant est nécessaire pour la détermination, selon l'invention, de la Sensibilité ou de la Résistance du microorganisme à un composé et/ou agent physique. In addition, the inventors have surprisingly demonstrated that in the absence of ligand on the internal surface of the container wall, more precisely at the bottom, the application of the magnetic field causes a grouping / aggregation of the particles whatever the conditions incubations of the microorganism that is to say in the presence or absence of a compound vis-à-vis which the microorganism is sensitive. Also, the inventors have surprisingly and unexpectedly demonstrated that the ligand attached to the surface of the inner walls of the container is necessary for the determination, according to the invention, of the sensitivity or resistance of the microorganism to a compound and / or agent physical.
Les inventeurs ont également démontré que le procédé de l'invention permet l'obtention de résultats dans un temps très inférieur à ceux des procédés connus. Le temps pour obtenir les résultats peut sensiblement varier en fonction du microorganisme, par exemple en fonction de son temps de génération. En particulier, le temps de génération, c'est-à-dire de doublement, in vitro, des microorganismes, notamment ceux impliqués dans des pathologies humaines ou animales, varie par exemple de 10 minutes pour Vibrio cholerae, 20 minutes pour Escherichia coli, de 20 à 30 minutes pour Salmonella typhimurium, de 25 à 30 minutes pour Staphylococcus aureus, de 30 à 40 minutes pour Pseudomonas aeruginosa, de 2h pour la levure Saccharomyces cerevisiae, et jusqu'à 20h pour Mycobacterium tuberculosis, (Microbiochimie et alimentation, Alain Branger, Educagri Editions, 2012 [9]). En présence d'un composé, par exemple un antibiotique, un biocide, ou d'une action physique la croissance microbienne pourra se ralentir, par exemple bactériostase partielle, ou s'arrêter totalement. Pour des microorganismes ayant un temps de doublement de 40 minutes, une incubation de 2h correspond à 3 temps de génération, soit une multiplication de 23, soit un facteur multiplicateur de 8. Pour un microorganisme présentant un temps de génération exceptionnellement long, par exemple de 120 minutes, 3 temps de génération correspondent à 360 minutes, soit 6h. The inventors have also demonstrated that the process of the invention makes it possible to obtain results in a much shorter time than those of known methods. The time to obtain the results can vary substantially depending on the microorganism, for example depending on its generation time. In particular, the generation time, that is to say the doubling, in vitro, of microorganisms, especially those involved in human or animal pathologies, varies for example from 10 minutes for Vibrio cholerae, 20 minutes for Escherichia coli, 20 to 30 minutes for Salmonella typhimurium, 25 to 30 minutes for Staphylococcus aureus, 30 to 40 minutes for Pseudomonas aeruginosa, 2 hours for yeast Saccharomyces cerevisiae, and up to 20 hours for Mycobacterium tuberculosis, (Microbiochemistry and food, Alain Branger, Educagri Editions, 2012 [9]). In the presence of a compound, for example an antibiotic, a biocide, or a physical action microbial growth may slow down, for example partial bacteriostasis, or stop completely. For microorganisms with a doubling time of 40 minutes, a 2h incubation corresponds to 3 generation times, ie a multiplication of 2 3 , or a multiplying factor of 8. For a microorganism having an exceptionally long generation time, for example 120 minutes, 3 generation times correspond to 360 minutes, or 6 hours.
Les inventeurs ont démontré, par exemple dans le cas d'un microorganisme doublant en 40 minutes, partant d'un inoculum 8 fois inférieur à la quantité de microorganismes bloquant les particules, un blocage des particules a été observé lorsqu'elles ont été soumises à un champ magnétique après 2h d'incubation. En parallèle, le même microorganisme a été incubé dans les mêmes conditions, avec différentes doses/concentrations de composés, par exemple d'antibiotique(s), ou tout autre agent inhibiteur de croissance, les inventeurs ont démontré que le récipient comprenant la concentration la plus faible à partir de laquelle les particules ne sont pas bloquées correspond à la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI). Avantageusement les inventeurs ont démontré que le procédé de l'invention permet de déterminer la CMI d'un composé vis-à-vis d'un microorganisme, par exemple d'un antibiotique vis-à-vis d'une bactérie, en moins de 6 heures. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet donc de raccourcir considérablement le temps d'obtention du résultat, à savoir une réduction de 3 à 4 fois du temps, par rapport à l'antibiogramme classique, dont le résultat est lié à une mesure « de la croissance d'une bactérie donnée, appréciable à l'œil nu » selon la définition du CA-SFM est obtenu après 18 ou 24h. The inventors have demonstrated, for example in the case of a microorganism doubling in 40 minutes, starting from an inoculum 8 times smaller than the quantity of microorganisms blocking the particles, blockage of the particles was observed when they were subjected to a magnetic field after 2 hours of incubation. In parallel, the same microorganism was incubated under the same conditions, with different doses / concentrations of compounds, for example antibiotic (s), or any other growth inhibiting agent, the inventors have demonstrated that the container comprising the lowest concentration from which the particles are not blocked corresponds to the Minimal Inhibitory Concentration (MIC). Advantageously, the inventors have demonstrated that the method of the invention makes it possible to determine the MIC of a compound vis-à-vis a microorganism, for example an antibiotic vis-à-vis a bacterium, in less than 6 hours. Advantageously, the method according to the invention thus makes it possible to considerably shorten the time of obtaining the result, namely a reduction of 3 to 4 times of the time, compared with the conventional antibiogram, the result of which is linked to a measurement " the growth of a given bacterium, appreciable to the naked eye "according to the definition of CA-SFM is obtained after 18 or 24 hours.
Ainsi, avantageusement, le procédé selon l'invention permet de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique ou à un ou plusieurs principe(s) actif(s) bien avant les procédés connus de l'homme du métier. En outre, le procédé selon l'invention permet avantageusement de déterminer la sensibilité d'un microorganisme avant que l'homme du métier ne puisse apprécier à l'œil nu une croissance du microorganisme dans le milieu de culture.  Thus, advantageously, the method according to the invention makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic or to one or more active principle (s) well before the methods known to those skilled in the art. In addition, the method according to the invention advantageously makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism before the person skilled in the art can appreciate with the naked eye a growth of the microorganism in the culture medium.
Avantageusement, le procédé de l'invention permet de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique ou à un principe actif dans un temps environ trois à quatre fois inférieur à ceux de l'état de la technique, passant ainsi de 18-24 à 4-6 heures pour le temps de détermination.  Advantageously, the method of the invention makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism to an antibiotic or to an active ingredient in a time approximately three to four times lower than those of the state of the art, thus going from 18-24. at 4-6 hours for the determination time.
En outre, avantageusement, le procédé de l'invention permet la détermination de la CMI à l'œil nu, par exemple sans dispositif particulier de lecture. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la détermination de la CMI à l'œil nu qui peut correspondre à la première concentration de composé, en progressant dans une série de raison 2, dans laquelle il est observé à l'œil nu une mise en mouvement desdites particules magnétiques ou magnétisables par application d'un champ magnétique ou électrique ou électromagnétique. En outre, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé de l'invention permet d'obtenir un résultat fiable et reproductible avec une spécificité similaire voir supérieure à celle des procédés usuels. In addition, advantageously, the method of the invention allows the determination of the MIC with the naked eye, for example without a particular reading device. Advantageously, the method according to the invention allows the determination of the MIC with the naked eye which may correspond to the first concentration of compound, progressing in a series of reasons 2, in which it is observed with the naked eye a in motion of said magnetic or magnetizable particles by application of a magnetic or electric or electromagnetic field. In addition, the inventors have surprisingly demonstrated that the method of the invention makes it possible to obtain a reliable and reproducible result with a similarity similar to that of the usual processes.
Dans la présente invention, on entend par « microorganisme » tout microorganisme connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple de bactéries, de champignons, d'algues et/ou de protozoaires.  In the present invention, the term "microorganism" means any microorganism known to those skilled in the art. It may be, for example, bacteria, fungi, algae and / or protozoa.
Il peut s'agir par exemple les bactéries choisi dans le groupe, sans être limité à celui-ci, comprenant Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae, Klebseilla rhinoscleromatis- klebsiella oxytoca Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia astéroïdes Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus férus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis et Yersinia pseudotuberculosis, etc. It may be for example the bacteria chosen from the group, without being limited thereto, comprising Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetanus, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae, Klebseilla rhinoscleromatis klebsiella oxytoca Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus Gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis, etc.
Il peut s'agir de tout champignon connu de l'homme du métier, par exemple de champignons pathogènes ou non pathogènes, par exemple de champignons responsables de pathologies, par exemple en santé humaine ou non, de champignons environnementaux, des champignons choisis dans le groupe comprenant les levures, par exemple Candida et/ou Cryptococcus, par exemple de levures responsables de pathologies, par exemple en santé humaine, par exemple de candidoses et/ou de cryptococcose, et/ou le groupe comprenant les moisissures, par exemple Aspergillus, par exemple de moisissures responsable de pathologie, par exemple en santé humaine, par exemple d'aspergillose et/ou mycose pulmonaire. Selon l'invention dans le cas d'utilisation de bactéries anaérobies, les conditions de culture anaérobie du microorganisme pourront êtres obtenues par obturation de l'extrémité ouverte du réacteur de culture par exemple à l'aide de Parafilm (marque déposée), d'un bouchon etc. ou en mettant ledit réacteur dans des conditions permettant le développement des bactéries anaérobies. Il peut s'agir par exemple de jarres d'anaérobiose, sachets générant une atmosphère appauvrie en oxygène et enrichie en dioxyde de carbone, enceintes anaérobies avec atmosphère contrôlée et/ou tout moyen connu de l'homme du métier adapté. It can be any fungus known to those skilled in the art, for example pathogenic or non-pathogenic fungi, for example fungi responsible for pathologies, for example in human health or not, environmental fungi, fungi chosen from group comprising yeasts, for example Candida and / or Cryptococcus, for example yeasts responsible for pathologies, for example in human health, for example candidiasis and / or cryptococcosis, and / or the group comprising molds, for example Aspergillus, for example mold responsible for pathology, for example in human health, for example aspergillosis and / or pulmonary mycosis. According to the invention, in the case of the use of anaerobic bacteria, the anaerobic culture conditions of the microorganism may be obtained by closing the open end of the culture reactor, for example with the aid of Parafilm (registered trademark), a plug etc. or by placing said reactor under conditions allowing the development of anaerobic bacteria. It may be, for example, anaerobiosis jars, pouches generating an oxygen depleted atmosphere and enriched with carbon dioxide, anaerobic enclosures with a controlled atmosphere and / or any means known to those skilled in the art.
Selon l'invention, le microorganisme peut être introduit dans un contenant de culture à une concentration comprise de 1 .106 à 2.108 CFU/ml (CFU : Colony-Forming Unit), par exemple de 1 .107 à 8.107 CFU/ml. Par exemple dans un volume de 200μΙ la quantité de microorganisme peut être comprise de 2.105 à 4.107 CFU par exemple de 2.106 à 1 ,6.107 CFU. According to the invention, the microorganism may be introduced into a culture container at a concentration of from 1 × 10 6 to 2 × 10 8 CFU / ml (CFU: Colony-Forming Unit), for example from 1 × 10 7 to 8 × 10 7 CFU. / ml. For example, in a volume of 200 microns the quantity of microorganism may be from 2.10 5 to 4.10 7 CFU, for example from 2.10 6 to 1, 6.10 7 CFU.
L'homme du métier, de part ces connaissances générales saure adapter la concentration dudit microorganisme, par exemple en fonction de sa taille, par exemple du nombre connu nécessaire pour bloquer les particules, et de sa vitesse de croissance et/ou de génération.  Those skilled in the art, from this general knowledge sure adapt the concentration of said microorganism, for example depending on its size, for example the known number necessary to block the particles, and its growth rate and / or generation.
Dans la présente par concentration entravant le mouvement des microparticules on entend la quantité de microorganismes, dans le volume réactionnel ajouté dans le contenant sur lequel sont présents les anticorps ou ligands, la concentration (ou quantité), préférentiellement minimale, de microorganismes capables de s'opposer à l'agrégation/regroupement des particules au centre du contenant par l'application du champ. Par exemple, pour les staphylocoques la quantité entravant le mouvement des particules est de l'ordre de 1 .108 pour des staphylocoques. La concentration entravant le mouvement des particules peut être déterminer, par exemple, via un procédé comprenant l'ajout dans un contenant sur lequel sont présents les anticorps ou ligands, des quantités variables de microorganismes dans un milieu réactionnel contenant les particules magnétiques ou magnétisables, l'incubation desdits microorganismes dans le contenant afin de permettre l'interaction desdits microorganismes avec les ligands présents sur la surface du contenant, l'application d'un champ capable d'attirer les particules vers le centre du contenant pour les agréger, la mesure de l'agrégation desdites particules, la détermination de la plus faible concentration / quantité de microorganisme ayant conduit à une absence d'agrégation des particules. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans l'exemple 1 . In the present invention, by concentration hindering the movement of the microparticles is meant the quantity of microorganisms, in the reaction volume added to the container on which the antibodies or ligands are present, the concentration (or quantity), preferably minimal, of microorganisms capable of to oppose the aggregation / grouping of particles in the center of the container by the application of the field. For example, for staphylococci the amount impeding the movement of the particles is of the order of 1 × 10 8 for staphylococci. The concentration hindering the movement of the particles can be determined, for example, by a process comprising adding to a container on which the antibodies or ligands are present, varying amounts of microorganisms in a reaction medium containing the magnetic or magnetizable particles, incubation of said microorganisms in the container to allow the interaction of said microorganisms with the ligands present on the surface of the container, the application of a field capable of attracting the particles towards the center of the container to aggregate them, the measurement of the aggregation of said particles, the determination of the lowest concentration / amount of microorganism leading to a lack of aggregation of the particles. It may be for example the method described in Example 1.
Selon l'invention le procédé peut comprendre préalablement à l'étape a) une étape AO) préalable de culture du microorganisme afin d'obtenir un microorganisme en phase exponentielle de croissance. Il peut s'agir par exemple de la culture dudit microorganisme dans un milieu de culture adapté. L'homme du métier, de part ces connaissances générales saura en fonction du microorganisme choisir le milieu de culture et les conditions adaptées afin d'obtenir un microorganisme en phase exponentielle de croissance.  According to the invention, the process may comprise, prior to step a), a prior step AO) for culturing the microorganism in order to obtain a microorganism in an exponential growth phase. It may be for example the culture of said microorganism in a suitable culture medium. The person skilled in the art, on the basis of this general knowledge, will know, depending on the microorganism, how to choose the culture medium and the conditions adapted to obtain a microorganism in an exponential phase of growth.
Avantageusement, l'étape préalable AO de culture du microorganisme permet de standardiser la croissance des microorganismes et notamment de réduire le temps de détermination de la sensibilité dans la mesure où les microorganismes sont en phase exponentielle de croissance.  Advantageously, the prior step AO for culturing the microorganism makes it possible to standardize the growth of the microorganisms and in particular to reduce the sensitivity determination time insofar as the microorganisms are in the exponential phase of growth.
Selon l'invention par « contenant de culture » on entend tout contenant de culture connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple un réacteur de culture, des cupules, des tubes ou des puits par exemple de plaques de microdilution.  According to the invention "culture container" means any culture container known to those skilled in the art. It may be for example a culture reactor, wells, tubes or wells for example microdilution plates.
Selon l'invention le contenant de culture peut être par exemple une enceinte avec une extrémité fermée, du type tube, puits, etc. ou une enceinte présentant deux ouvertures. Il peut s'agir également d'un contenant comprenant une extrémité fermée de sorte à former un fond plat, un contenant avec une extrémité fermée de sorte à former un fond hémisphérique, un contenant comprenant deux extrémités ouvertes. Lorsque le contenant comprend deux extrémités ouvertes ledit contenant peut être configuré afin de permettre un écoulement du milieu de culture en flux constant ou en flux discontinu. Il peut s'agir par exemple de plaque de microdilution le type de plaque défini par exemple par l'American National Standards Institute et la Society for Biomolecular Screening (« microplates ») portant 96 puits, 384 et même 1536, ou à l'inverse 48 ou 24 puits ou tout autre nombre de puits. According to the invention the culture container may be for example an enclosure with a closed end, of the tube type, well, etc. or an enclosure having two openings. It may also be a container comprising a closed end so as to form a flat bottom, a container with a closed end so as to form a hemispherical bottom, a container comprising two open ends. When the container comprises two open ends, said container may be configured to allow flow of the culture medium in a constant flow or in a discontinuous flow. It may be for example microdilution plate type of plate defined for example by the American National Standards Institute and the Society for Biomolecular Screening ("microplates") carrying 96 wells, 384 and even 1536, or conversely 48 or 24 wells or any other number of wells.
Il peut s'agir par exemple d'un contenant de culture constitué par tout matériau connu de l'homme du métier adapté. Il peut s'agir par exemple de plastique, par exemple du polycarbonate, du polypropylène, polystyrène, etc., de verre, de métal. It may be for example a culture container consisting of any material known to those skilled in the art. It may be for example plastic, for example polycarbonate, polypropylene, polystyrene, etc., glass, metal.
Il peut s'agir par exemple de microplaques en polycarbonate ou polypropylène à fond plat, conique ou rond. Avantageusement lorsque le contenant est en polycarbonate ou le polypropylène cela permet d'éviter une adhésion non désirée du microorganisme sur les surfaces internes du contenant.  It may be, for example microplates polycarbonate or polypropylene flat-bottom, conical or round. Advantageously, when the container is made of polycarbonate or polypropylene, this makes it possible to prevent unwanted adhesion of the microorganism to the internal surfaces of the container.
Il peut s'agir par exemple de contenant en polystyrène, par exemple tout polystyrène connu de l'homme du métier. Avantageusement, lorsque les surfaces internes du contenant sont en polystyrène la fixation du ligand dudit microorganisme pourra être améliorée. L'homme du métier, de par ses connaissances générales saura adapter/choisir le polystyrène adapté pour une meilleur fixation du ligand, par exemple en fonction de ces propriétés physicochimiques, par exemple hydrophiles, hydrophobes.  It may be for example polystyrene container, for example any polystyrene known to those skilled in the art. Advantageously, when the internal surfaces of the container are made of polystyrene, the fixing of the ligand of said microorganism can be improved. The person skilled in the art, by his general knowledge will be able to adapt / choose the polystyrene suitable for a better fixation of the ligand, for example according to these physicochemical properties, for example hydrophilic, hydrophobic.
Selon l'invention, le milieu de culture peut être tout milieu de culture connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce dans lequel au moins un microorganisme est susceptible de se développer. Il peut s'agir par exemple d'un milieu naturel ou synthétique. Il peut s'agir par exemple d'un milieu de culture pour la croissance bactérienne, par exemple le milieu BHI (« Brain Heart Infusion »; bouillon cœur cerveau), le milieu LB (« Lysogeny broth » également appelé « Luria Bertani »), le milieu MH (« milieu Mueller- Hinton »), de bouillon glucosé, de milieu de culture de levures, par exemple le milieu Sabouraudv L'homme du métier de part ces connaissances générales saura choisir le milieu de culture adapté en fonction du microorganisme. According to the invention, the culture medium may be any culture medium known to those skilled in the art and / or commercially available in which at least one microorganism is likely to develop. It may be for example a natural or synthetic environment. For example, it may be a culture medium for bacterial growth, for example BHI (Brain Heart Infusion) medium, LB medium ("Lysogeny broth" also called "Luria Bertani"). , medium MH ("Mueller-Hinton medium"), glucose broth, yeast culture medium, for example the medium Sabouraudv The skilled person on the one hand these General knowledge will know how to choose the appropriate culture medium according to the microorganism.
Selon l'invention par « ligand du microorganisme » on entend tout ligand connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un ligand choisi dans le groupe comprenant les anticorps, les peptides, les aptamères.  According to the invention, the term "ligand of the microorganism" is understood to mean any ligand known to those skilled in the art. It may be for example a ligand chosen from the group comprising antibodies, peptides, aptamers.
Dans la présente, les anticorps peuvent être tout anticorps connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple d'anticorps monoclonaux, d'anticorps polyclonaux ou un mélange de ceux-ci. Il peut s'agir par exemple d'anticorps disponibles dans le commerce, par exemple d'anticorps commercialisés par la société AbCam, Acris, Fitzgerald, GeneTex, ThermoFisher Scientific.  In the present invention, the antibodies can be any antibody known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or a mixture thereof. These may be, for example, commercially available antibodies, for example antibodies marketed by AbCam, Acris, Fitzgerald, GeneTex or ThermoFisher Scientific.
Dans la présente, les peptides peuvent être tout peptide connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple de peptides commercialisés par la société Clinisciences, Proteomic Solutions, Biomatik, Casio, Genscript.  In the present invention, the peptides may be any peptide known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be for example peptides marketed by the company Clinisciences, Proteomic Solutions, Biomatik, Casio, Genscript.
Dans la présente, les aptamères peuvent être tout aptamère connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple d'aptamères commercialisés par la société Aptagen, IBA, Novaptech.  In the present, aptamers can be any aptamer known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be for example aptamers marketed by the company Aptagen, IBA, Novaptech.
Dans la présente, le « ligand du microorganisme » peut être un ligand spécifique ou non spécifique du microorganisme.  Herein, the "microorganism ligand" may be a specific or non-specific ligand of the microorganism.
Selon l'invention, le ligand non spécifique peut être tout ligand connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple d'un ligand choisi dans le groupe comprenant la Protéine A, la Protéine G, la Protéine L.  According to the invention, the nonspecific ligand may be any ligand known to those skilled in the art and / or commercially available. It may be for example a ligand chosen from the group comprising Protein A, Protein G and Protein L.
Selon l'invention le ligand du microorganisme peut être fixé à la surface des parois internes du contenant à une concentration comprise de 0,1 à 20 μ9/ιτιΙ, par exemple de 0,5 à 5μ9/ιτιΙ, par exemple égal à 6 μ9/ιτιΙ.  According to the invention, the ligand of the microorganism can be attached to the surface of the inner walls of the container at a concentration of 0.1 to 20 μ9 / ιτιΙ, for example from 0.5 to 5μ9 / ιτιΙ, for example equal to 6 μ9 / ιτιΙ.
Selon l'invention, le ligand du microorganisme peut être fixé à la surface des parois internes du contenant par tout procédé et/ou moyen connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une adsorption passive, communément appelée « coating », par exemple comprenant l'incubation du ligand dans le contenant de culture permettant l'adsorption dudit ligand sur les parois dudit contenant puis lavage du contenant afin d'éliminer les ligands non fixés. Il peut s'agir par exemple de procédé utilisant des polymères de couplage, par exemple le polypropylène, le polycarbonate, associés par exemple à des silylsulfonylazides. According to the invention, the ligand of the microorganism may be attached to the surface of the inner walls of the container by any method and / or means known to those skilled in the art. It may be for example a passive adsorption, commonly called "coating", for example comprising incubating the ligand in the culture container to adsorb said ligand to the walls of said container and then washing the container to remove unbound ligands. It may be for example a process using coupling polymers, for example polypropylene or polycarbonate, for example associated with silylsulfonyl azides.
Selon l'invention, la surface des parois internes du contenant de culture peuvent comprendre un ou plusieurs ligand(s) fixé(s) à leur surface. Lorsque la surface des parois internes du contenant de culture comprend plusieurs ligand fixés à la surface, le procédé de fixation peut comprendre une première étape de fixation de ligand, par exemple un ligand choisi dans le groupe comprenant la Protéine A, la Protéine G, la Protéine L suivi d'une seconde étape de fixation, par exemple de ligand choisi dans le groupe comprenant des anticorps.  According to the invention, the surface of the inner walls of the culture container may comprise one or more ligand (s) attached to their surface. When the surface of the inner walls of the culture container comprises a plurality of ligands attached to the surface, the method of attachment may comprise a first ligand binding step, for example a ligand selected from the group consisting of Protein A, Protein G, Protein L followed by a second binding step, for example ligand selected from the group comprising antibodies.
Selon l'invention, lesdites, au moins deux, particules, peuvent être choisies dans le groupe comprenant une particule chargée électriquement, une particule magnétique, une particule revêtue d'au moins une couche magnétique, une particule magnétisable, une particule revêtue d'une couche magnétisable, un mélange de deux ou plusieurs de ces particules. En fait, il peut s'agir de toute particule permettant de mettre en œuvre la présente invention.  According to the invention, said at least two particles may be selected from the group consisting of an electrically charged particle, a magnetic particle, a particle coated with at least one magnetic layer, a magnetizable particle, a particle coated with a magnetizable layer, a mixture of two or more of these particles. In fact, it may be any particle for implementing the present invention.
Selon l'invention, les particules reposent sur une surface immergée dans le milieu de culture. Lesdites particules sont en position stables, c'est-à-dire au repos, en l'absence du champ magnétique, ou électromagnétique. Avantageusement, lesdites particules peuvent être des particules de toute forme adaptée à la mise en œuvre de la présente invention, par exemple sous forme de bille, de palet, de forme géométrique asymétrique, par exemple avec une face plane, etc.  According to the invention, the particles rest on a surface immersed in the culture medium. Said particles are in stable position, that is to say at rest, in the absence of the magnetic field, or electromagnetic. Advantageously, said particles may be particles of any form suitable for the implementation of the present invention, for example in the form of a ball, a puck, an asymmetric geometric shape, for example with a flat face, etc.
Toute taille appropriée de particules magnétiques ou magnétisables peut être utilisée. La taille peut être choisie par exemple en fonction de la taille du microorganisme, et/ou de la taille du contenant le milieu de culture pour la mise en œuvre du procédé de l'invention et/ou du microorganisme. Par exemple la particule magnétique ou magnétisable peut présenter une taille de, par exemple de 10nm à Ι ΟΟμιτι, par exemple de 0,1 à Ι Ομιτι. Any suitable size of magnetic or magnetizable particles may be used. The size may be chosen for example depending on the size of the microorganism, and / or the size of the medium containing the culture medium for carrying out the method of the invention and / or the microorganism. For example, the magnetic or magnetizable particle may have a size of, for example from 10 nm to Ι ΟΟμιτι, for example from 0.1 to Ι Ομιτι.
Selon l'invention, les particules peuvent être de tailles identiques ou différentes, la proportion entre les particules de tailles différentes, relatives au microorganisme considéré, pouvant modifier la sensibilité du test.  According to the invention, the particles may be of identical or different sizes, the proportion between the particles of different sizes, relative to the microorganism in question, which can modify the sensitivity of the test.
Lorsque les particules sont de tailles différentes, les petites particules peuvent présenter une taille, par exemple, de 10 nm à 1 μιτι, par exemple de 100 à 500 nm, et les grosses particules peuvent présenter une taille, par exemple, de 1 μιτι à 100 μιτι, par exemple de 1 μιτι à 10μιτι, par exemple de 1 μηι à 5μιτι. Bien sûr, la taille respective des grandes et des petites particules est choisie de manière à pouvoir déterminer différents stades de développement.  When the particles are of different sizes, the small particles may have a size, for example, from 10 nm to 1 μm, for example from 100 to 500 nm, and the large particles may have a size, for example, from 1 μm to 1 μm. 100 μιτι, for example from 1 μιτι to 10μιτι, for example from 1 μηι to 5μιτι. Of course, the respective size of the large and small particles is chosen so as to determine different stages of development.
Selon l'invention, on peut également utiliser une pluralité de particules de tailles identiques avec une magnétisation différente. Le mouvement des particules sera dépendant de leur magnétisation, le blocage étant quant à lui maintenu constant du fait de l'encombrement relatif des particules dû à leur taille.  According to the invention, it is also possible to use a plurality of particles of identical sizes with different magnetization. The movement of the particles will be dependent on their magnetization, the blocking being kept constant because of the relative size of the particles due to their size.
Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre avec une pluralité de particules, par exemple de 2 à 10 000 000, de 1000 à 10 000 000, de 1000 à 1 000 000, de de 10 000 à 1 000 000, de 100 000 à 1 000 000, de 10 000 à 100 000, avantageusement de 1 000 à 1 000 000 de particules.  According to the invention, the method of the invention can be implemented with a plurality of particles, for example from 2 to 10,000,000, from 1,000 to 10,000,000, from 1,000 to 1,000,000, from 10,000 to 10,000,000. 1,000,000, 100,000 to 1,000,000, 10,000 to 100,000, preferably 1,000 to 1,000,000 particles.
Selon l'invention, les particules peuvent être éclairées, par exemple au moyen d'une source lumineuse. L'éclairage permet avantageusement d'augmenter le contraste entre les particules et la solution.  According to the invention, the particles can be illuminated, for example by means of a light source. The illumination advantageously makes it possible to increase the contrast between the particles and the solution.
Selon l'invention, lesdites, au moins deux, particules sont de préférence des particules génératrices d'un signal détectable. La détection de ce signal sera fonction des propriétés des particules. À titre d'exemple il peut s'agir de particules fluorescentes, fluorescentes en FRET, phosphorescentes, radioactives, chimioluminescentes, réfléchissantes ou colorées. Par exemple dans le cas où les, au moins deux, particules sont fluorescentes, la fluorescence émise par les particules peut être détectée par exemple visuellement, et/ou par tout moyen optique connu de l'homme du métier. Lesdites, au moins deux, particules peuvent être par exemple éclairée, pour suivre son mouvement au moyen d'une source lumineuse, par exemple par un faisceau laser. According to the invention, said at least two particles are preferably particles generating a detectable signal. The detection of this signal will depend on the properties of the particles. By way of example, they may be fluorescent, FRET fluorescent, phosphorescent, radioactive, chemiluminescent, reflective or colored particles. For example, in the case where the at least two particles are fluorescent, the fluorescence emitted by the particles can be detected, for example visually, and / or by any optical means known to those skilled in the art. Said at least two particles may for example be illuminated to follow its movement by means of a light source, for example by a laser beam.
Par exemple, dans le cas d'utilisation de la technologie FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer), la fluorescence émise par une première particule excitée par une longueur d'onde va elle-même exciter la seconde molécule qui va émettre généralement de la fluorescence à une longueur d'onde très éloignée de la première longueur d'onde excitatrice, et après un temps tel que l'émission bruit de fond due à la première excitation soit éteinte. Ce transfert du premier type de particule au second ne peut se faire que si les particules sont très proches et est proportionnel au nombre de particules rassemblées/agrégées.  For example, in the case of using FRET technology (Fluorescence Resonance Energy Transfer), the fluorescence emitted by a first particle excited by a wavelength will itself excite the second molecule that will generally emit fluorescence. a wavelength very far from the first exciting wavelength, and after a time such that the background noise emission due to the first excitation is extinguished. This transfer of the first type of particle to the second can only be done if the particles are very close and is proportional to the number of particles collected / aggregated.
Par exemple dans le cas où les, au moins deux, particules sont phosphorescentes, ces particules peuvent être visualisées par exemple visuellement, par tout moyen optique connu de l'homme du métier.  For example, in the case where the at least two particles are phosphorescent, these particles can be visualized, for example visually, by any optical means known to those skilled in the art.
Par exemple dans le cas où les, au moins deux, particules sont radioactives, ces particules peuvent être détectées même au travers de liquides ou milieux de cultures optiquement opaques, ainsi qu'au travers de plaques de microdilution optiquement opaques par tout dispositif de détection de la radioactivité émise connue de l'homme du métier, notamment la méthode classique de révélation sur film autoradiographique. Il suffit alors de plaquer le film sensible sous la plaque de microdilution et de révéler ensuite l'image du fond de ladite plaque de microdilution.  For example, in the case where the at least two particles are radioactive, these particles can be detected even through optically opaque liquids or culture media, as well as through optically opaque microdilution plates by any detection device. radioactivity emitted known to those skilled in the art, especially the conventional method of revelation on autoradiographic film. It is then sufficient to press the sensitive film under the microdilution plate and then reveal the bottom image of said microdilution plate.
Par exemple dans le cas où les, au moins deux, particules sont chimioluminescentes la détection des particules peut se former par ajout dans le milieu du réactif chimique permettant l'émission d'énergie lumineuse par les particules. La détection de ce signal peut être par exemple visuelle et/ou par tout moyen connu de l'homme du métier notamment par l'utilisation de caméra CCD (« Charge Coupled Device ») sensible aux longueurs d'ondes émises, qui balaient (scannent) les cupules, les puits de la plaque de microdilution. For example, in the case where the at least two particles are chemiluminescent, the detection of the particles can be formed by adding to the medium the chemical reagent allowing the emission of light energy by the particles. The detection of this signal may be for example visual and / or by any means known to those skilled in the art in particular by the use of CCD camera ("Charge Coupled Device ") sensitive to the wavelengths emitted, which scan (scan) the wells, the wells of the microdilution plate.
Par exemple dans le cas où les, au moins deux, particules sont réfléchissantes la détection des particules peut être par exemple visuelle ou par tout moyen optique connu de l'homme du métier. Avantageusement, lesdites, au moins deux, particules peuvent être par exemple éclairées, pour suivre leurs mouvements au moyen d'une source lumineuse, par exemple par un faisceau laser.  For example, in the case where the at least two particles are reflective, the detection of the particles may be, for example, visual or by any optical means known to those skilled in the art. Advantageously, said at least two particles may for example be illuminated, to follow their movements by means of a light source, for example by a laser beam.
Par exemple dans le cas où les, au moins deux, particules sont colorées, la détection de la particule peut être par exemple visuelle et/ou par tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection de particules colorées. Avantageusement, si les particules sont attirées vers le centre et fond des puits comme décrit dans WO 2005/090944, une image peut être acquise par un appareil de type scanner puis être analysée par un logiciel d'analyse d'images permettant une quantification des particules rassemblées/agrégées au centre du puits.  For example, in the case where the at least two particles are colored, the detection of the particle may for example be visual and / or by any means known to those skilled in the art for the detection of colored particles. Advantageously, if the particles are attracted towards the center and bottom of the wells as described in WO 2005/090944, an image can be acquired by a scanner-type apparatus and then analyzed by an image analysis software allowing quantification of the particles. collected / aggregated at the center of the well.
Selon l'invention, les particules peuvent avantageusement être choisies de couleurs différentes en fonction de leur taille et/ou en fonction de leur pouvoir magnétique.  According to the invention, the particles may advantageously be chosen from different colors depending on their size and / or according to their magnetic power.
II peut s'agir également d'une particule excitable, par exemple une particule fluorescente en FRET. L'homme du métier de part ces connaissances générales, adaptera /choisira les propriétés visuelles desdites, au moins deux, particules peut en fonction du milieu. Avantageusement la détection du mouvement desdites, au moins deux, particules est d'autant plus facile que le contraste entre lesdites, au moins deux, particules et le milieu de culture est grand.  It may also be an excitable particle, for example a fluorescent particle in FRET. Those skilled in the art on the basis of this general knowledge, will adapt / choose the visual properties of said at least two particles can according to the medium. Advantageously, the detection of the movement of said at least two particles is all the easier as the contrast between said at least two particles and the culture medium is great.
Selon l'invention, l'observation de peut être réalisée par tout moyen connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un dispositif optique, par exemple un microscope, un appareil photo, d'un scanner de document, par exemple un scanner perfection V600 EPSON, une observation visuelle.  According to the invention, the observation of can be carried out by any means known to those skilled in the art. It may be for example an optical device, for example a microscope, a camera, a document scanner, for example a perfection scanner V600 EPSON, a visual observation.
Selon l'invention, l'observation peut permettre de mesurer, par exemple l'intensité, le contraste, la variance, d'image, par exemple via tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple un logiciel d'imagerie, par exemple ImageJ permettant, par exemple de mesurer, par exemple des différences de contrastes, d'intensités, correspondant par exemple aux particules, dans des zones d'une image à une autre et ainsi de déterminer les différences d'une observation à une autre. According to the invention, the observation can make it possible to measure, for example the intensity, the contrast, the image variance, for example via any means known to those skilled in the art, for example software imaging, for example to measure, for example differences in contrast, intensity, for example corresponding to the particles, in areas of an image to another and thus to determine the differences of a observation to another.
Selon l'invention, l'utilisation de particules émettrices d'un signal, par exemple des particules colorées, fluorescentes, phosphorescentes, luminescentes, radioactives peut permettre, par exemple une observation automatisée  According to the invention, the use of particles emitting a signal, for example colored particles, fluorescent, phosphorescent, luminescent, radioactive may allow, for example automated observation
Dans la présente invention, le champ permettant de mettre en mouvement lesdites, au moins deux particules magnétisables peut être un champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique. Ledit champ magnétique, ou électrique ou électromagnétique peut être généré, par exemple par un aimant ou par un solénoïde. L'aimant peut être par exemple sous forme de barreau, de pointe, de pièce, etc. ou toute forme appropriée pour la mise en œuvre de la présente invention. Le champ peut, par exemple être appliqué par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par impulsion, par augmentation progressive du champ électrique ou électromagnétique, par variations de champ électrique ou électromagnétique ou par une combinaison ces applications.  In the present invention, the field for moving said at least two magnetizable particles can be a magnetic field, or an electric field, or an electromagnetic field. Said magnetic field, or electric or electromagnetic field may be generated, for example by a magnet or a solenoid. The magnet may be for example in the form of a bar, tip, piece, etc. or any form suitable for carrying out the present invention. The field may, for example, be applied by any means known to those skilled in the art, for example by pulse, by gradual increase of the electric or electromagnetic field, by electric or electromagnetic field variations or by a combination of these applications.
Une augmentation progressive du champ magnétique, ou électrique ou électromagnétique peut être obtenue, par exemple, par rapprochement d'un aimant ou d'un solénoïde selon une trajectoire rectiligne ou sinusoïdale, ou selon un mouvement oscillant présentant ou non une amplitude d'oscillation et/ou une fréquence variables. Des variations de champ plus complexes peuvent être obtenues, par exemple par rotation ou par des combinaisons de mouvements d'un matériau aimanté à proximité desdites, au moins deux, particules.  A progressive increase of the magnetic field, or electric or electromagnetic field can be obtained, for example, by bringing a magnet or a solenoid in a rectilinear or sinusoidal trajectory, or in an oscillating movement with or without an amplitude of oscillation and / or a variable frequency. More complex field variations can be obtained, for example by rotation or by combinations of motions of a magnetized material in proximity to said at least two particles.
Ainsi, selon l'invention, ledit champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique peut être généré par des moyens générateurs de champ qui peuvent être ou non en mouvement.  Thus, according to the invention, said magnetic, or electrical, or electromagnetic field may be generated by field generating means which may or may not be in motion.
Lorsque plusieurs particules doivent être mises en mouvement, le champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique doit pouvoir regrouper lesdites particules sur ladite surface immergée dans le milieu de culture ou à ladite surface dudit milieu de culture. When several particles have to be set in motion, the magnetic, electrical, or electromagnetic field must be able to grouping said particles on said immersed surface in the culture medium or on said surface of said culture medium.
Selon l'invention, par composé, on entend tout composé, par exemple naturel ou obtenu par synthèse ou hémi-synthèse chimique, connu de l'homme du métier susceptible de modifier la croissance/développement de microorganismes et/ou capable de tuer un microorganisme. Il peut s'agir par exemple d'un biocide, par exemple un désinfectant, un produit de protection, un produit de lutte contre les espèces dites nuisibles et autre et/ou tout biocide inclus dans la liste selon la directive 98/8/CE ou le règlement (UE) n °528/2012, d'un antibiotique, d'un anti-fongique.  According to the invention, "compound" means any compound, for example natural or obtained by synthesis or chemical hemi-synthesis, known to those skilled in the art capable of modifying the growth / development of microorganisms and / or capable of killing a microorganism . It may be for example a biocide, for example a disinfectant, a protection product, a product for the control of the so-called harmful and other species and / or any biocide included in the list according to the directive 98/8 / EC or Regulation (EU) No 528/2012, an antibiotic, an anti-fungal.
Il peut s'agir par exemple d'un antibiotique choisi dans le groupe comprenant l'acide fusidique, les aminosides, les bêta-Lactamines, les pénicillines, les inhibiteurs de bêta-lactamases, les céphalosporines, les carbapénèmes, les monobactames, la cyclosérine, la daptomycine, la fosfomycine, les lincosamides, les macrolides et kétolides, la mupirocine, les nitro-imidazolés, les nitrofuranes, les oligosaccharides, les oxazolidinones, les polypeptides: bacitracine, glycopeptides, polymyxines et colistine, les quinolones, les rifamycines, les sulfamides et les diaminopyridines, les synergistines, les tétracyclines, les antifongiques, ou un quelconque mélange de ceux-ci.  This may be, for example, an antibiotic chosen from the group comprising fusidic acid, aminoglycosides, beta-lactams, penicillins, beta-lactamase inhibitors, cephalosporins, carbapenems, monobactams, cycloserine. , daptomycin, fosfomycin, lincosamides, macrolides and ketolides, mupirocine, nitroimidazoles, nitrofurans, oligosaccharides, oxazolidinones, polypeptides: bacitracin, glycopeptides, polymyxins and colistin, quinolones, rifamycins, sulfonamides and diaminopyridines, synergistines, tetracyclines, antifungals, or any mixture thereof.
Il peut s'agir par exemple d'un anti-fongique choisi dans le groupe comprenant le Miconazole, le Ketoconazole, le Clotrimazole, l'Éconazole, le Bifonazole, le Butoconazole, le Fenticonazole, Nsoconazole, l'Oxiconazole, le Sertaconazole, le Sulconazole, le Thiabendazole, le Tioconazole, le Fluconazole, l'Itraconazole, Nsavuconazole, le Ravuconazole, le Posaconazole, le Voriconazole, la Terbinafine, l'Amorolfine, la Naftifine, la Butenafine, la Mycosubtiline ou un quelconque mélange de ceux-ci.  It may be, for example, an anti-fungal chosen from the group comprising Miconazole, Ketoconazole, Clotrimazole, Econazole, Bifonazole, Butoconazole, Fenticonazole, Nsoconazole, Oxiconazole, Sertaconazole, Sulconazole, Thiabendazole, Tioconazole, Fluconazole, Itraconazole, Nsavuconazole, Ravuconazole, Posaconazole, Voriconazole, Terbinafine, Amorolfine, Naftifine, Butenafine, Mycosubtiline or any mixture thereof.
II peut s'agir également de tout nouveau composé dont on cherche à mettre en évidence une éventuelle activité antibiotique et/ou antifongique, seule ou en association avec un ou plusieurs autres composés. Selon l'invention, l'antibiotique et/ou l'anti-fongique peut-être en solution dans le milieu de culture, ou sous forme déshydratée ou lyophilisée, et/ou fixé sur la surface immergée dans ledit milieu. It may also be any new compound which is to highlight a possible antibiotic and / or antifungal activity, alone or in combination with one or more other compounds. According to the invention, the antibiotic and / or the anti-fungal may be in solution in the culture medium, or in dehydrated or freeze-dried form, and / or fixed on the surface immersed in said medium.
Les moyens de fixation utilisables de l'antibiotique et/ou de l'anti- fongique sont ceux connus de l'homme du métier pour la fixation d'un antibiotique et/ou d'un anti-fongique sur une surface. Il peut s'agir par exemple de ceux disponibles dans le commerce, par exemple commercialisé par la société NUNC (Danemark), Corning (Etats-Unis), et Greiner Bio-One (Autriche).  The usable binding means of the antibiotic and / or the anti-fungal are those known to those skilled in the art for the attachment of an antibiotic and / or an anti-fungal to a surface. These may be for example those commercially available, for example marketed by the company NUNC (Denmark), Corning (United States), and Greiner Bio-One (Austria).
Selon l'invention, on peut introduire dans le milieu de culture un ou plusieurs composés, par exemple un ou plusieurs antibiotiques  According to the invention, one or more compounds may be introduced into the culture medium, for example one or more antibiotics.
Avantageusement, lorsque le procédé selon l'invention permet de de tester différents antibiotiques et/ou anti-fongiques seuls et/ou de rechercher un effet de combinaison ou d'association d'antibiotiques et/ou d'anti-fongique dans un format couramment appelé « échiquier » (ou checkerboard en anglais). La mise en œuvre du procédé de l'invention avec un mélange d'antibiotiques et/ou d'anti-fongique (combinaison, association) peut permettre avantageusement de détecter d'éventuels effets additifs, synergiques et/ou antagonistes.  Advantageously, when the method according to the invention makes it possible to test different antibiotics and / or anti-fungal agents alone and / or to seek a combination or combination effect of antibiotics and / or anti-fungal agents in a commonly-used format. called "chessboard" (or checkerboard in English). The implementation of the method of the invention with a mixture of antibiotics and / or anti-fungal (combination, combination) can advantageously allow to detect possible additive, synergistic and / or antagonistic effects.
Par « effet additif », on entend l'addition des actions d'au moins deux antibiotiques permettant, par exemple, de trouver une combinaison d'antibiotiques ayant un même effet antibiotique qu'un antibiotique seul, mais avec des concentrations inférieures.  By "additive effect" is meant the addition of the actions of at least two antibiotics making it possible, for example, to find a combination of antibiotics having the same antibiotic effect as an antibiotic alone, but with lower concentrations.
Par « effet synergique », on entend une amélioration de l'efficacité d'un antibiotique et/ou d'anti-fongique par ajout d'au moins un deuxième antibiotique et/ou d'anti-fongique, ce mélange d'antibiotiques et/ou d'anti-fongique ayant un effet supérieur à l'addition de l'effet de chaque antibiotique et/ou anti-fongique seul.  By "synergistic effect" is meant an improvement in the effectiveness of an antibiotic and / or antifungal by adding at least a second antibiotic and / or antifungal, this mixture of antibiotics and / or anti-fungal having an effect greater than the addition of the effect of each antibiotic and / or anti-fungal alone.
Enfin par « effet antagoniste » on entend l'inhibition de l'action d'un antibiotique et/ou d'un anti-fongique sur le microorganisme par l'ajout d'au moins un deuxième antibiotique et/ou anti-fongique. Ce mode de réalisation peut permettre de sélectionner des combinaisons, des associations d'antibiotiques et/ou d'anti-fongiques (« co-drug ») pertinentes pour, par exemple, inhiber le développement du microorganisme. Finally, "antagonistic effect" means the inhibition of the action of an antibiotic and / or an anti-fungal on the microorganism by the addition of at least a second antibiotic and / or anti-fungal. This embodiment can make it possible to select combinations, combinations of antibiotics and / or anti-fungals ("co-drug") relevant for, for example, inhibiting the development of the microorganism.
Selon l'invention, les antibiotiques et/ou anti-fongiques peuvent également être introduits successivement dans le milieu afin d'identifier des effets additifs, synergiques ou antagonistes tels que décrit précédemment.  According to the invention, the antibiotics and / or antifungals can also be introduced successively into the medium in order to identify additive, synergistic or antagonistic effects as described above.
Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de déterminer/détecter et/ou d'identifier la sensibilité de microorganismes à des composés. Aussi, le procédé selon l'invention permet avantageusement d'identifier de nouveau biocide, par exemple de nouveau antibiotique et/ou antifongique. En outre, le procédé selon l'invention peut avantageusement permettre de déterminer la spécificité d'un composé, par exemple s'il s'agit d'un antibiotique et/ou un antifongique.  Advantageously, the method according to the invention makes it possible to determine / detect and / or identify the sensitivity of microorganisms to compounds. Also, the method according to the invention advantageously makes it possible to identify a new biocide, for example a new antibiotic and / or antifungal. In addition, the method according to the invention may advantageously make it possible to determine the specificity of a compound, for example if it is an antibiotic and / or an antifungal.
Selon l'invention par « agent physique » on entend la température, le rayonnement thermique, la pression, des rayonnements, ou radiations. Il peut s'agir par exemple de tout rayonnement connus de l'homme du métier, par exemple des rayonnements corpusculaires, des rayonnements ondulatoires et/ou des rayonnements électromagnétiques.  According to the invention, the term "physical agent" means temperature, thermal radiation, pressure, radiation, or radiation. It may be for example any radiation known to those skilled in the art, for example corpuscular radiation, ripple radiation and / or electromagnetic radiation.
Selon l'invention le procédé peut comprendre préalablement à l'étape a) les étapes suivantes:  According to the invention, the method may comprise, prior to step a), the following steps:
A1 ) introduire dans un contenant (a2) de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme, i. au moins deux particules magnétiques ou magnétisables ii. au moins un microorganisme permettant d'ensemencer ledit milieu, et  A1) introducing into a culture container (a2) comprising a liquid culture medium suitable for the development of said microorganism, i. at least two magnetic or magnetizable particles ii. at least one microorganism for seeding said medium, and
iii. au moins un composé et/ou agent physique  iii. at least one compound and / or physical agent
A2) maintenir le milieu de culture ensemencé et ladite au moins deux molécule dans des conditions permettant un développement et/ou croissance dudit microorganisme, le milieu obtenu étant le milieu introduit dans le contenant de l'étape a).  A2) maintaining the seeded culture medium and said at least two molecules under conditions allowing growth and / or growth of said microorganism, the medium obtained being the medium introduced into the container of step a).
Selon l'invention le contenant (a2) et le contenant de l'étape a) peuvent être identique ou différent. Par exemple le contenant (a2) peut être par exemple en plastique, par exemple en polycarbonate, en polypropylène, polystyrène, en verre, en métal. Avantageusement, le contenant peut être un puit de microplaques en polycarbonate et/ou polypropylène à fond plat, conique ou rond. Avantageusement, le polycarbonate ou le polypropylène permet de réduire l'attachement des microorganismes à la surface des parois internes du contenant favorisant avantageusement sa croissance. According to the invention, the container (a2) and the container of step a) may be identical or different. For example the container (a2) can for example be made of plastic, for example polycarbonate, polypropylene, polystyrene, glass, metal. Advantageously, the container may be a microplate well made of polycarbonate and / or polypropylene with a flat, conical or round bottom. Advantageously, the polycarbonate or polypropylene reduces the attachment of microorganisms to the surface of the inner walls of the container favoring its growth advantageously.
Selon l'invention, lorsque le procédé comprend les étapes A1 et A2, le contenant de culture de l'étape a) peut être avantageusement différent du contenant a2. Il peut s'agir par exemple d'un contenant un polystyrène tel que décrit ci-dessus.  According to the invention, when the process comprises steps A1 and A2, the culture container of step a) may advantageously be different from the container a2. It may be for example a polystyrene container as described above.
Selon l'invention, le maintien du milieu de culture ensemencé dans des conditions permettant un développement et/ou croissance dudit microorganisme peut être réalisé pendant 30 minutes à 6 heures, par exemple de 1 à 5 heures, de 2 à 4 heures. Avantageusement, le milieu de culture est maintenu dans des conditions permettant un développement et/ou croissance dudit microorganisme pendant 2 à 5 heures.  According to the invention, the maintenance of the seeded culture medium under conditions allowing a development and / or growth of said microorganism can be carried out for 30 minutes to 6 hours, for example from 1 to 5 hours, from 2 to 4 hours. Advantageously, the culture medium is maintained under conditions allowing growth and / or growth of said microorganism for 2 to 5 hours.
L'homme du métier, par ces connaissances générales saura choisir les conditions de pH, la température, l'oxygénation, l'apport en sources métabolisables et en composants essentiels (tels que minéraux) permettant un développement et/ou croissance dudit microorganisme.  Those skilled in the art, by this general knowledge will be able to choose the conditions of pH, temperature, oxygenation, the supply of metabolizable sources and essential components (such as minerals) for development and / or growth of said microorganism.
Selon l'invention, le procédé peut être réalisé dans une pluralité de contenants comprenant à la surface de leurs parois internes un ligand dudit microorganisme comprenant chacun : According to the invention, the process may be carried out in a plurality of containers comprising on the surface of their internal walls a ligand of said microorganism each comprising:
ledit milieu de culture,  said culture medium,
ladite, au moins deux particules, et  said, at least two particles, and
ledit microorganisme,  said microorganism,
ledit composé et/ou agent physique,  said compound and / or physical agent,
lesdits contenants comprenant une concentration différente dudit composé et/ou agent physique et/ou un composé et/ou agent physique différent d'un contenant à l'autre. Selon l'invention, les différents contenants peuvent être regroupés sur un même support, par exemple sur une plaque comportant de 1 à 384 puits, par exemple 6, 12, 24, 48, 96, etc. said containers comprising a different concentration of said compound and / or physical agent and / or a compound and / or physical agent different from one container to another. According to the invention, the different containers may be grouped together on the same support, for example on a plate comprising from 1 to 384 wells, for example 6, 12, 24, 48, 96, etc.
Selon l'invention, le procédé peut permettre avantageusement de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de la croissance planctonique, c'est-à-dire dans la phase liquide, dans le milieu de culture, dudit microorganisme.  According to the invention, the method may advantageously make it possible to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the planktonic growth, that is to say in the liquid phase, in the culture medium, of said microorganism.
Selon l'invention, la détermination de la concentration minimale de l'antibiotique inhibant la croissance dudit microorganisme, c'est à dire la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) peut être réalisée par mise en œuvre successivement ou simultanément du procédé de l'invention dans des conditions identiques utilisant un milieu de culture liquide approprié au développement d'un microorganisme, au moins deux particules magnétiques ou magnétisables, au moins un microorganisme et au moins un composé dans une concentration différente d'une réalisation à une autre. Ladite concentration d'antibiotique peut être établie par exemple selon une suite géométrique de raison ½ à partir d'une concentration initiale X, par exemple X, X/2, X/4, X/8, etc., ou de tout autre suite géométrique appropriée. Lors de la mise en œuvre du procédé de l'invention, et parmi les réalisations, la première concentration, c'est-à-dire la concentration la plus faible à partir de laquelle les particules sont mobiles, reflétant l'activité de l'antibiotique sur la croissance des bactéries, correspond à la concentration minimale inhibitrice (CMI). Cette estimation de la mobilité des particules peut être faite simplement visuellement, par exemple comme pour les antibiogrammes en tubes, ou avantageusement suite à l'analyse de l'image par un logiciel adapté, comme par exemple le logiciel BFC Eléments (marque déposée) développé par la société BioFilm Control. Ainsi, le procédé selon l'invention permet avantageusement de déterminer la concentration minimale d'antibiotique à partir de laquelle le microorganisme est sensible à l'antibiotique dans sa croissance, c'est-à-dire la concentration minimale pour laquelle les, au moins deux, particules peuvent être mises en mouvement/agrégées par application du champ magnétique dans un desdits contenant. According to the invention, the determination of the minimum concentration of the antibiotic inhibiting the growth of said microorganism, that is to say the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) can be achieved by successively or simultaneously implementing the method of the invention in identical conditions using a liquid culture medium suitable for the development of a microorganism, at least two magnetic or magnetizable particles, at least one microorganism and at least one compound in a concentration different from one embodiment to another. Said antibiotic concentration can be established for example according to a geometric sequence of reason ½ from an initial concentration X, for example X, X / 2, X / 4, X / 8, etc., or any other sequence geometrically appropriate. In carrying out the process of the invention, and among the embodiments, the first concentration, that is to say the lowest concentration from which the particles are mobile, reflecting the activity of the antibiotic on the growth of bacteria, corresponds to the minimum inhibitory concentration (MIC). This estimation of the mobility of the particles can be made simply visually, for example as for antibiograms in tubes, or advantageously following the analysis of the image by a suitable software, such as the software BFC Elements (trademark) developed by the company BioFilm Control. Thus, the method according to the invention advantageously makes it possible to determine the minimum concentration of antibiotic from which the microorganism is sensitive to the antibiotic in its growth, that is to say the minimum concentration for which the, at least two, particles can be set in motion / aggregated by application of the field in one of said containers.
Le procédé de l'invention peut être également mis en œuvre avec une concentration de composé nulle, ladite réalisation constituant un témoin de croissance du microorganisme dans le milieu de culture. Un autre témoin peut consister à valider la stérilité du milieu en présence de particules pendant la durée du test. Un autre témoin peut consister à valider que l'antibiotique ne provoque pas d'artéfacts dans le milieu en présence de particules.  The method of the invention can also be implemented with a zero compound concentration, said embodiment constituting a growth control of the microorganism in the culture medium. Another control may consist in validating the sterility of the medium in the presence of particles during the test period. Another witness may be to validate that the antibiotic does not cause artifacts in the medium in the presence of particles.
Quel que soit le mode de mise en œuvre de l'invention, le procédé de l'invention peut avantageusement être réalisé simultanément dans une pluralité de contenants.  Whatever the mode of implementation of the invention, the method of the invention may advantageously be carried out simultaneously in a plurality of containers.
Lorsque le procédé de l'invention est mis en œuvre dans une pluralité de contenants, pour la mise en mouvement des particules dans lesdits contenants, une pluralité de champs magnétiques, par exemple d'aimants, peuvent avantageusement être utilisés. Les aimants peuvent par exemple être fixés sur un support de telle manière à permettre une juxtaposition de chaque contenant dans lequel on réalise le procédé de l'invention avec un aimant du support. L'application du champ magnétique sur lesdits contenants est indépendante d'un contenant à un autre. Le champ magnétique appliqué auxdits contenants peut être identique ou différent d'un contenant à l'autre, de préférence identique.  When the method of the invention is implemented in a plurality of containers, for the movement of the particles in said containers, a plurality of magnetic fields, for example magnets, can advantageously be used. The magnets may for example be fixed on a support so as to allow a juxtaposition of each container in which the method of the invention is carried out with a magnet of the support. The application of the magnetic field on said containers is independent of one container to another. The magnetic field applied to said containers may be identical or different from one container to another, preferably identical.
Le procédé de l'invention permet donc également, avantageusement, de déterminer la concentration minimale inhibitrice d'un antibiotique pour la croissance bactérienne pour ledit microorganisme par la réalisation du procédé de l'invention dans les différents contenants en une seule étape sur un seul support.  The method of the invention therefore also advantageously makes it possible to determine the minimum inhibitory concentration of an antibiotic for bacterial growth for said microorganism by carrying out the process of the invention in the different containers in a single step on a single support. .
Avantageusement, le procédé de l'invention permet par exemple de suivre les recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie, relatives aux conditions techniques générales pour les méthodes de dilution.  Advantageously, the method of the invention allows for example to follow the recommendations of the Committee of the Antibiogram of the French Society of Microbiology, relating to the general technical conditions for the dilution methods.
Selon l'invention, on peut également déterminer, avantageusement, la concentration minimale inhibitrice dudit antibiotique vis-à-vis de la croissance dudit microorganisme en suspension dans chaque contenant. Le procédé de l'invention peut par exemple être utilisé pour la mise en œuvre d'un antibiogramme d'aide à la prescription de l'antibiotique (ou des antibiotiques) efficace(s) sur un microorganisme prélevé chez un patient, par application du procédé de l'invention. Ce microorganisme peut alors être testé avec différents antibiotiques, par exemple sur un seul support d'analyse, pour optimiser le traitement de ce patient. L'application du procédé sur ledit microorganisme permet de vérifier que le micro-organisme est bien sensible à des antibiotiques à une concentration par exemple égale à la CMI. According to the invention, it is also possible to determine, advantageously, the minimum inhibitory concentration of said antibiotic with respect to the growth of said microorganism suspended in each container. The method of the invention may, for example, be used for the implementation of an antibiogram of assistance with the prescription of the antibiotic (or antibiotics) effective (s) on a microorganism taken from a patient, by application of the method of the invention. This microorganism can then be tested with different antibiotics, for example on a single analysis support, to optimize the treatment of this patient. Application of the method to said microorganism makes it possible to verify that the microorganism is indeed sensitive to antibiotics at a concentration, for example equal to the MIC.
Le procédé de l'invention peut permettre également de suivre in- vitro l'évolution de la CMI d'un microorganisme d'un patient vis-à-vis d'un antibiotique. Cet aspect est important pour des traitements au long cours, ou pour des malades immunodéprimés sujets à des infections chroniques avec le même micro-organisme. Le procédé de l'invention permet de suivre l'apparition d'une résistance à un traitement. Le procédé permet alors de trouver d'autres antibiotiques plus aptes à inhiber la croissance dudit microorganisme.  The method of the invention can also make it possible to follow in vitro the evolution of the MIC of a microorganism of a patient with respect to an antibiotic. This aspect is important for long-term treatments, or for immunocompromised patients prone to chronic infections with the same microorganism. The method of the invention makes it possible to monitor the appearance of resistance to a treatment. The method then makes it possible to find other antibiotics more able to inhibit the growth of said microorganism.
Avantageusement, le procédé de l'invention, de par l'application du champs et l'agrégation ou non des particules permet d'obtenir un résultat rapide et visuel de la sensibilité ou non du microorganisme au composé et/ou agent physique.  Advantageously, the process of the invention, by the application of the field and the aggregation or not of the particles makes it possible to obtain a rapid and visual result of the sensitivity or not of the microorganism to the compound and / or physical agent.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.  Other advantages may still appear to those skilled in the art on reading the examples below, illustrated by the appended figures, given for illustrative purposes.
Brève description des figures Brief description of the figures
La figure 1 (A, B, C) montre que le blocage des microbilles est proportionnel au nombre de bactéries dans les puits, au moment de l'aimantation, et permet de déterminer le seuil à partir duquel les microbilles sont bloquées. La figure 1 A est une photographie d'une plaque multipuits après application du champ, les points au centre des puits correspond au regroupement des particules, la figure 1 B représente le schéma de la plaque et les conditions pour chaque puits à savoir le ligand fixé : anticorps anti E. coli (Ac anti-coli) ou anticorps anti S. aureus (Ac anti S. aureus) ainsi que les concentrations de départ des bactéries pour chaque contenant. La figure 1 C est un graphique des BFI obtenus en fonction des quantités de bactéries S. aureus déposées dans des contenants (puits) dont sur les surfaces internes desquels les anticorps anti- Staphylococcus aureus avaient été recouvertes ("coatés") à 6μ9/ιτιΙ, pour 2 conditions en réplicats (Expériences 1 et 2). FIG. 1 (A, B, C) shows that the blocking of the microbeads is proportional to the number of bacteria in the wells, at the time of magnetization, and makes it possible to determine the threshold at which the microbeads are blocked. FIG. 1A is a photograph of a multiwell plate after application of the field, the points in the center of the wells corresponds to the grouping of the particles, FIG. 1B represents the diagram of the plate and the conditions for each well, namely the fixed ligand. : anti-E. coli (anti-coli) antibody or anti S. aureus (Ac anti S. aureus) as well as the starting concentrations of the bacteria for each container. FIG. 1C is a graph of the BFIs obtained as a function of the amounts of S. aureus bacteria deposited in containers (wells) on whose internal surfaces the anti-Staphylococcus aureus antibodies had been coated ("coated") at 6μ9 / ιτιΙ for 2 conditions in replicates (Experiments 1 and 2).
La figure 2 est une photographie de plaque multipuits après la mise en œuvre du procédé. Elle correspond à un exemple de détermination de Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de 3 antibiotiques sur des souches de Staphylococcus aureus.  Figure 2 is a photograph of multiwell plate after the implementation of the method. It corresponds to an example of determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of 3 antibiotics on strains of Staphylococcus aureus.
EXEMPLES EXAMPLES
Exemple 1 : détermination de la quantité de bactéries nécessaires au blocage des microbilles. Example 1: Determination of the amount of bacteria needed to block the microbeads.
Les résultats sont représentés sur la figure 1 .  The results are shown in Figure 1.
Plusieurs colonies (environ 6) de Staphylococcus aureus ont été prises sur une boite de Pétri contenant du milieu Mueller-Hinton gélosé et resuspendues dans du milieu Mueller-Hinton liquide. La densité optique (à 600nm) a été mesurée, considérant qu'une unité de DO correspond à 1 x109 bactéries/ml. Une plaque de polystyrène a été préalablement recouverte (« coatée ») avec des anticorps anti- staphylococcus aureus (Anti- Staphylococcus aureus de lapin, fraction IgG purifiée, Acris). Pour ce faire, la plaque a été incubée pendant une nuit, à 4°C, avec 20C^I/puits avec une solution d'anticorps aux concentrations 1 ; 2 ; 4 ; 6 ou 8μg/ml dans du tampon phosphate salin (PBS). La plaque a été lavée 2 fois au laveur de plaque avec du PBS additionné de Tween-20 à 0,1 % afin d'éliminer les anticorps non adsorbés sur le polystyrène. Après le dernier lavage, les puits ont été laissés vides. 200μΙ de solution de bactéries à une concentration de 0 à 1 x108/ml dans un milieu Mueller-Hinton, en présence de microbilles magnétiques, de l'ordre de 5x105 à 2x107 par puits, ont été ajoutés et laissés pendant 30 minutes pour permettre la capture des bactéries par les anticorps et la décantation des microbilles magnétiques. La microplaque a été ensuite recouverte de 10ΟμΙ de liquide de contraste et placée 1 minute sur un bloc portant 96 mini-aimants disposés de telle sorte qu'ils soient centrés par rapport aux puits. La microplaque a été ensuite placée sur un scanner, piloté par le logiciel BFCE 3 et une image a été capturée. L'image est ensuite analysée et une valeur de BFI (BioFilm Index) tel que décrite dans Chavant et al. [10] a été calculée. Une valeur de 0 correspond à un blocage total des microbilles alors qu'une valeur de 20, ou proche, correspond à une mobilité totale des billes. Toutes les valeurs intermédiaires sont possibles. Several colonies (about 6) of Staphylococcus aureus were taken on a Petri dish containing Mueller-Hinton agar medium and resuspended in liquid Mueller-Hinton medium. The optical density (at 600 nm) was measured, considering that a unit of OD corresponds to 1 × 10 9 bacteria / ml. A polystyrene plate was previously coated ("coated") with anti-staphylococcus aureus antibodies (anti-Staphylococcus aureus rabbit, purified IgG fraction, Acris). For this purpose, the plate was incubated overnight at 4 ° C. with 20 ° C. / well with an antibody solution at concentrations 1; 2; 4; 6 or 8 μg / ml in phosphate buffered saline (PBS). The plate was washed 2 times with the plate washer with PBS supplemented with 0.1% Tween-20 to remove the non-adsorbed antibodies on the polystyrene. After the last wash, the wells were left empty. 200 μl of bacteria solution at a concentration of 0 to 1 × 10 8 / ml in Mueller-Hinton medium, in the presence of magnetic microbeads, of the order of 5 × 10 5 to 2 × 10 7 per well, were added and left for 30 minutes. to allow the capture of bacteria by antibodies and the decantation of magnetic microbeads. The microplate was then covered with 10ΟμΙ of contrast liquid and placed 1 minute on a block carrying 96 mini-magnets arranged so that they are centered relative to the wells. The microplate was then placed on a scanner, driven by the BFCE 3 software and an image was captured. The image is then analyzed and a BFI (BioFilm Index) value as described in Chavant et al. [10] was calculated. A value of 0 corresponds to a total blocking of the microbeads whereas a value of 20, or near, corresponds to a total mobility of the balls. All intermediate values are possible.
Le plan de plaque a été défini tel que décrit dans la figure 1 B. Le plan détaille les 2 variables testées : la quantité de bactéries déposées dans les puits, ainsi que la concentration d'anticorps anti- Staphylococcus aureus utilisés pour le revêtement des puits (coating). La figure 1 A correspond à l'image brute obtenue. La figure 1 C correspond à la représentation graphique des BFI obtenus en fonction des quantités de bactéries S. aureus déposées dans des contenants (puits) dont sur les surfaces internes desquels les anticorps anti- Staphylococcus aureus avaient été coatés à 6μ9/ιτιΙ, pour 2 conditions en réplicats (1 et 2).  The plate plan was defined as described in Figure 1 B. The plan details the 2 variables tested: the amount of bacteria deposited in the wells, as well as the concentration of anti-Staphylococcus aureus antibodies used for coating wells (coating). Figure 1 A corresponds to the raw image obtained. FIG. 1C corresponds to the graphical representation of the BFIs obtained as a function of the amounts of S. aureus bacteria deposited in containers (wells) of which on the internal surfaces of which the anti-Staphylococcus aureus antibodies had been coated at 6μ9 / ιτιΙ, for 2 replicate conditions (1 and 2).
Tel que démontré sur les figures 1 A et 1 C, plus le nombre de bactérie présentes dans le milieu est grand, plus la mobilité des particules est réduite. En d'autres termes, le blocage des billes est proportionnel au nombre de bactéries présentes dans le milieu. Le blocage des microbilles est total (BFI = 0) pour une quantité de 1 .108 S. aureus. As demonstrated in FIGS. 1A and 1C, the greater the number of bacteria present in the medium, the lower the mobility of the particles. In other words, the blockage of the beads is proportional to the number of bacteria present in the medium. Blocking microbeads is total (BFI = 0) for an amount of 1 .10 8 S. aureus.
Exemple 2 : antibiogrammes selon le procédé de l'invention et comparaison par rapport aux procédés de l'état de la technique. Example 2: antibiograms according to the method of the invention and comparison with the methods of the state of the art.
La détermination de la Sensibilité ou de la Résistance des souches, sur la base de leur CMI, à différents antibiotiques a été établie selon le protocole standard du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM), en milieu Mueller-Hinton liquide par dilution de raison 2. Ce protocole est bien connu de l'homme de l'art et est décrit dans les Conditions techniques générales pour les méthodes de dilution (Bulletin de la Société Française de Microbiologie, 1993, 8, 156-66 [1 ] ; Clinical Microbiological Infection 1996, 2, Suppl. 1 [2]). Les mêmes valeurs ont été obtenues en milieu BHI liquide. The determination of the sensitivity or the resistance of the strains, on the basis of their MIC, with different antibiotics was established according to the standard protocol of the Committee of the Antibiogram of the French Society of Microbiology (CA-SFM), in medium Mueller -Hinton liquid dilution reason 2. This protocol is well known to those skilled in the art and is described in the General Technical Conditions for the methods of dilution (Bulletin of the French Society of Microbiology, 1993, 8, 156-66 [1], Clinical Microbiological Infection 1996, 2, Suppl.1 [2]). The same values were obtained in liquid BHI medium.
La qualification de Sensible (S) ou Résistante (R) d'une souche est basée sur la position relative de la CMI déterminée par rapport au « breakpoint », valeur prenant en compte différents paramètres. Ainsi, pour un type de bactérie donné, et un antibiotique donné, une valeur de breakpoint a été établie par des comités. Cette valeur de breakpoint sert de seuil : si la CMI de la souche testée est inférieure au breakpoint, la bactérie est dite Sensible, c'est-à-dire une « faible » dose d'antibiotique suffit à inhiber sa croissance, si au contraire la CMI de la souche est supérieure au « breakpoint », la souche est dire Résistante. Pour certains antibiotiques, cette valeur n'est pas unique mais peut s'étaler sur plusieurs concentrations.  The Sensible (S) or Resistant (R) qualification of a strain is based on the relative position of the MIC determined with respect to the "breakpoint", a value taking into account different parameters. Thus, for a given type of bacterium, and a given antibiotic, a breakpoint value has been established by committees. This breakpoint value serves as a threshold: if the MIC of the strain tested is lower than the breakpoint, the bacteria is called Sensitive, ie a "low" dose of antibiotic is enough to inhibit its growth, if on the contrary the MIC of the strain is superior to the "breakpoint", the strain is to say Resistant. For some antibiotics, this value is not unique but can spread over several concentrations.
Dans cet exemple, 2 souches de S. aureus ont été choisies car présentant des profils de Sensibilité / Résistance opposés pour les 3 antibiotiques choisis.  In this example, 2 S. aureus strains were chosen because they had opposite Sensitivity / Resistance profiles for the 3 selected antibiotics.
La souche A929 est fosfomycine (S), érythromycine (S) et rifampicine (R).  The strain A929 is fosfomycin (S), erythromycin (S) and rifampicin (R).
La souche B198 est fosfomycine (R), érythromycine (R) et rifampicine (S).  Strain B198 is fosfomycin (R), erythromycin (R) and rifampicin (S).
Les antibiotiques (érythromycine, référence E1300000 ; fosfomycine, référence F0400000 ; rifampicine, référence R0700000) provenaient de EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines and healthcare ; Conseil de l'Europe) et répondent aux critères de la pharmacopée européenne.  Antibiotics (erythromycin, reference E1300000, fosfomycin, reference F0400000, rifampicin, reference R0700000) came from EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare, Council of Europe) and meet the criteria of the European Pharmacopoeia.
Les bactéries ont été resuspendues dans un tube contenant 2ml de milieu Mueller-Hinton liquide et laissées à pousser sous agitation légère pendant 2h. Cette étape a pour but d'obtenir des bactéries en phase exponentielle de croissance et de standardiser leur croissance pendant les 2 heures en microplaque, en présence d'antibiotiques. Cette croissance, en présence d'antibiotiques a été réalisée dans des microplaques en polypropylène, à fond rond, de marque et référence Nunc 054309, ce type de support étant préféré pour limiter l'adhésion des microorganismes à ce stade. The bacteria were resuspended in a tube containing 2 ml of liquid Mueller-Hinton medium and left to grow with light agitation for 2 hours. This step aims to obtain bacteria exponential growth phase and standardize their growth during the 2 hours microplate, in the presence of antibiotics. This growth, in the presence of antibiotics, was carried out in polypropylene microplates, with a round bottom, of brand and reference Nunc 054309, this type of support being preferred to limit the adhesion of microorganisms at this stage.
Des microplaques polystyrène, à fond plat de marque et référence Costar 3370, ont été recouvertes avec des anticorps polyclonaux de lapin, anti- staphylococcus aureus, selon le procédé suivant. Une plaque de polystyrène a été préalablement recouverte (« coatée ») avec des anticorps anti-staphylococcus aureus (Anti-Staphylococcus aureus de lapin, fraction IgG purifiée, Acris). Pour ce faire, la plaque a été incubée pendant une nuit, à 4°C, avec 200μΙ/ρυίΐε d'une soution d'anticorps à la concentration de 6μg/ml dans du tampon phosphate salin (PBS). La plaque a été lavée 2 fois au laveur de plaque avec du PBS additionné de Tween-20 à 0,1 % afin d'éliminer les anticorps non adsorbés sur le polystyrène. Après le dernier lavage, les puits ont été laissés vides.  Polystyrene microplates, flat-bottom brand and Costar reference 3370, were coated with polyclonal rabbit antibodies, anti-staphylococcus aureus, according to the following method. A polystyrene plate was previously coated ("coated") with anti-staphylococcus aureus antibodies (anti-Staphylococcus aureus rabbit, purified IgG fraction, Acris). To do this, the plate was incubated overnight at 4 ° C., with 200 μl / μl of a suspension of antibody at a concentration of 6 μg / ml in phosphate buffered saline (PBS). The plate was washed 2 times with the plate washer with PBS supplemented with 0.1% Tween-20 to remove the non-adsorbed antibodies on the polystyrene. After the last wash, the wells were left empty.
Une seconde plaque, non coatée, a servi de contrôle.  A second plate, uncoated, served as a control.
Dans d'autres microplaques en polypropylène, à fond rond, de marque et référence Nunc 054309, pour chacune des conditions testées, 40μΙ de solution d'antibiotique à une concentration 10X a été déposée. Les solutions déposées étaient 10 fois plus concentrées que la concentration finale recherchée car l'addition ensuite de 360μΙ de milieu contenant les bactéries a pour effet de les diluer d'un facteur 10 (400/40). La concentration exprimée dans les résultats est la concentration finale, en présence des bactéries.  In other polypropylene microplates, round bottom, brand and reference Nunc 054309, for each of the conditions tested, 40 .mu.l of antibiotic solution at a concentration 10X was deposited. The deposited solutions were 10 times more concentrated than the desired final concentration because the addition of 360 μΙ of medium containing the bacteria has the effect of diluting them by a factor of 10 (400/40). The concentration expressed in the results is the final concentration, in the presence of bacteria.
Suite à l'addition des 40μΙ d'antibiotiques, 360μΙ de milieu Mueller- Hinton, contenant les microbilles à une concentration de l'ordre de 5.105 à 2.107 par puits ont été ajoutés (pour 2 puits). Following the addition of the 40 μΙ of antibiotics, 360 μΙ of Mueller-Hinton medium containing the microbeads at a concentration of about 5 × 10 5 to 2 × 10 7 per well were added (for 2 wells).
L'inoculum de départ des staphylocoques correspond à une mesure de DO à 600nm de 0,04, soit de l'ordre de 4.107 bactéries/ml, soit en quantité, 8.106 bactéries dans les 200μΙ de milieu réactionnel. L'incubation à 37°C a lieu pendant 2h. The starting inoculum of the staphylococci corresponds to a measurement of OD at 600 nm of 0.04, ie of the order of 4.10 7 bacteria / ml, or in quantity, 8.10 6 bacteria in the 200 μΙ of reaction medium. Incubation at 37 ° C takes place for 2 hours.
Suite à l'incubation pendant 2h dans la microplaque Nunc 054309 en présence d'antibiotiques, 200μΙ du milieu réactionnel de chaque puits (milieu Mueller Hinton, bactéries, antibiotiques, microbilles magnétiques) ont été transférés dans les puits coatés de la microplaque Costa 3370 (et non coatés, en contrôle) et laissés pendant 30 minutes pour permettre la capture des bactéries par les anticorps et la décantation des microbilles magnétiques. Following the incubation for 2h in the Nunc 054309 microplate in the presence of antibiotics, 200μΙ of the reaction medium of each well (Mueller Hinton medium, bacteria, antibiotics, magnetic microbeads) were transferred to the wells coated with the Costa 3370 microplate ( and uncoated, in control) and left 30 minutes to allow the capture of bacteria by antibodies and decantation of magnetic microbeads.
Les microplaques ont été ensuite recouvertes de 10ΟμΙ de liquide de contraste et placées 1 minute sur un bloc portant 96 mini-aimants disposés de telle sorte qu'ils soient centrés par rapport aux puits. Les microplaques ont été ensuite placées sur un scanner, piloté par le logiciel BFCE 3 et une image a été capturée.  The microplates were then covered with 10ΟμΙ of contrast liquid and placed 1 minute on a block carrying 96 mini-magnets arranged so that they are centered relative to the wells. The microplates were then placed on a scanner, driven by the BFCE 3 software and an image was captured.
La lettre S définit la souche comme Sensible (CMI inférieure au breakpoint EUCAST) alors que la lettre R définit la souche comme Résistante (CMI supérieure au breakpoint EUCAST).  The letter S defines the strain as Sensible (CMI lower than the breakpoint EUCAST) while the letter R defines the strain as Resistant (CMI superior to the breakpoint EUCAST).
Le schéma de plaque est le suivant :  The plate scheme is as follows:
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0001
Les valeurs dans le tableau sont en μ9/ιτιΙ (ou mg/l). The values in the table are in μ9 / ιτιΙ (or mg / l).
La valeur du breakpoint est mentionnée en caractère gras entre crochets.  The value of the breakpoint is indicated in bold in square brackets.
A partir de ce schéma de plaque, deux plaques A et B ont été établies. La plaque A a été recouverte avec les anticorps anti-S. aureus, ligand du microorganisme, alors que la plaque B ne l'a pas été. Ainsi, une plaque comprenait des contenants de culture comprenant à la surface de leurs parois interne un ligand du microorganisme (plaque A) ou non (plaque B). Les résultats obtenus après application du champ magnétique sont représentés sur la figure 2 A et 2B. From this plate scheme, two plates A and B were established. Plate A was coated with anti-S antibodies. aureus, ligand of the microorganism, whereas the plate B was not. Thus, a plate included culture containers comprising on the surface of their internal walls a ligand of the microorganism (plate A) or not (plate B). The results obtained after applying the magnetic field are shown in FIGS. 2A and 2B.
Tel que représenté sur la figure 2B, en l'absence de ligand sur la surface interne de la paroi du contenant de culture (condition contrôle), aucun blocage n'a pu être observé et un regroupement/agrégation des particules a été observé quelque soit les conditions d'incubations du microorganisme. Aussi, il apparaît clairement que le ligand fixé sur la surface des parois internes du contenant est nécessaire pour la détermination de la Sensibilité ou de la Résistance du microorganisme.  As shown in FIG. 2B, in the absence of ligand on the inner surface of the wall of the culture container (control condition), no blocking could be observed and aggregation / aggregation of the particles was observed regardless of the incubation conditions of the microorganism. Also, it is clear that the ligand attached to the surface of the inner walls of the container is necessary for the determination of the sensitivity or resistance of the microorganism.
Sur la figure 2 A, il apparaît que dans la colonne 1 (souche S) les microbilles ne sont pas bloquées à partir de la ligne C, donc au-dessus de la valeur du breakpoint, alors que dans la colonne 2 (souche R) les microbilles sont mobiles uniquement dans la ligne A, à une concentration supérieure au breakpoint.  In FIG. 2A, it appears that in column 1 (strain S) the microbeads are not blocked from the line C, hence above the value of the breakpoint, whereas in column 2 (strain R) the microbeads are mobile only in line A, at a higher concentration than the breakpoint.
De même, dans la colonne 3 (souche S), les microbilles sont mobiles dès la ligne F, alors qu'en colonne 4 (souche R), les microbilles sont bloquées à toutes les concentrations d'érythromycine.  Similarly, in column 3 (strain S), the microbeads are mobile from line F, while in column 4 (strain R), the microbeads are blocked at all concentrations of erythromycin.
En colonne 5 (souche R), les microbilles sont bloquées à toutes concentrations de rifampicine, alors qu'en colonne 6 (souche S), les microbilles sont mobiles dès la ligne G.  In column 5 (strain R), the microbeads are blocked at all concentrations of rifampicin, while in column 6 (strain S), the microbeads are mobile from line G.
Les résultats obtenus sont donc conformes et identiques à ceux obtenus avec les procédés de l'état de la technique, en particulier les procédés de référence de détermination d'un antibiogramme.  The results obtained are therefore consistent and identical to those obtained with the methods of the state of the art, in particular the reference methods for determining an antibiogram.
En outre, tel que démontré dans cet exemple, le procédé selon l'invention permet avantageusement d'obtenir un résultat fiable, conforme, sans mise en œuvre de dispositif complexe. En outre, le procédé selon l'invention permet de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un composé et de déterminer sa CMI dans un temps 3 à 4 fois inférieur au procédé connus, par exemple entre 3 et 5 heures.  In addition, as demonstrated in this example, the method according to the invention advantageously makes it possible to obtain a reliable, consistent result, without implementation of a complex device. In addition, the method according to the invention makes it possible to determine the sensitivity of a microorganism to a compound and to determine its MIC in a time 3 to 4 times less than the known method, for example between 3 and 5 hours.
Le procédé selon l'invention, de par l'obtention rapide de la sensibilité ou de la résistance du microorganisme à une molécule, par exemple un antibiotique, d'adapter rapidement et/ou de confirmer le traitement antibiotique d'un patient fournissant ainsi un réel avantage clinique, par exemple en gagnant 24 heures dans le traitement et son éventuel adaptation. The process according to the invention, by rapidly obtaining the sensitivity or the resistance of the microorganism to a molecule, for example an antibiotic, to quickly adapt and / or confirm the antibiotic treatment of a patient thereby providing a real advantage clinical, for example by gaining 24 hours in treatment and its eventual adaptation.
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à au moins un composé et/ou agent physique comprenant les étapes suivantes: 1. A method of determining the sensitivity of a microorganism to at least one compound and / or physical agent comprising the steps of:
a) introduire dans un contenant de culture comprenant à la surface de ces parois internes un ligand dudit microorganisme, un milieu de culture liquide de microorganisme comprenant  a) introducing into a culture container comprising on the surface of these internal walls a ligand of said microorganism, a microorganism liquid culture medium comprising
i. au moins deux particules magnétiques ou magnétisables ii. au moins un microorganisme, et  i. at least two magnetic or magnetizable particles ii. at least one microorganism, and
iii. au moins un composé et/ou agent physique  iii. at least one compound and / or physical agent
lesdites au moins deux particules magnétiques ou magnétisables reposant sur une surface immergée par le milieu de culture dans ledit contenant,  said at least two magnetic or magnetizable particles resting on a surface immersed by the culture medium in said container,
b) déterminer la sensibilité du microorganisme audit composé et/ou agent physique par application d'un champ magnétique capable d'agréger lesdites au moins deux particules magnétiques ou magnétisables, l'absence d'agrégation desdites particules révélant l'insensibilité dudit microorganisme audit composé et/ou agent physique ou l'agrégation desdites particules révélant la sensibilité dudit microorganisme audit composé et/ou agent physique.  b) determining the sensitivity of the microorganism to said compound and / or physical agent by applying a magnetic field capable of aggregating said at least two magnetic or magnetizable particles, the absence of aggregation of said particles revealing the insensitivity of said microorganism to said compound and / or physical agent or aggregation of said particles revealing the sensitivity of said microorganism to said compound and / or physical agent.
2. Procédé selon la revendication 1 , ledit procédé comprenant avant l'étape a) les étapes suivantes: 2. Method according to claim 1, said method comprising before step a) the following steps:
A1 ) introduction dans un contenant a1 de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme, i. au moins deux particules magnétiques ou magnétisables, ii. au moins un microorganisme permettant d'ensemencer ledit milieu, et  A1) introduction into a culture container a1 comprising a liquid culture medium suitable for the development of said microorganism, i. at least two magnetic or magnetizable particles, ii. at least one microorganism for seeding said medium, and
iii. au moins un composé et/ou agent physique  iii. at least one compound and / or physical agent
A2) maintenir le milieu de culture ensemencé et ladite au moins une molécule dans des conditions permettant un développement et/ou croissance dudit microorganisme, le milieu obtenu étant le milieu introduit dans le contenant de l'étape a). A2) maintaining the inoculated culture medium and said at least one molecule under conditions permitting a development and / or growth of said microorganism, the medium obtained being the medium introduced into the container of step a).
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ligand dudit microorganisme est choisi dans le groupe comprenant les anticorps, les peptides, les aptamères. 3. Method according to any one of the preceding claims, wherein the ligand of said microorganism is selected from the group comprising antibodies, peptides, aptamers.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ligand est fixé à la surface des parois internes dudit contenant à une concentration de 0,1 à 2C^g/ml 4. A process according to any one of the preceding claims, wherein the ligand is attached to the surface of the inner walls of said container at a concentration of 0.1 to 2Cg / ml.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ligand dudit microorganisme est choisi parmi un anticorps monoclonal, un anticorps polyclonal ou un mélange de ceux-ci. The method of any of the preceding claims, wherein the ligand of said microorganism is selected from a monoclonal antibody, a polyclonal antibody or a mixture thereof.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la concentration d'anticorps fixés est comprise de 0,5 à 7μ9/ιτιΙ. 6. The method of claim 5, wherein the concentration of bound antibodies is from 0.5 to 7μ9 / ιτιΙ.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont soumises à un champ électromagnétique, éventuellement appliqué par impulsion et/ou un champ électrique. 7. Method according to any one of the preceding claims wherein said at least two particles are subjected to an electromagnetic field, optionally pulsed and / or an electric field.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont soumises à une augmentation progressive du champ électromagnétique. The method of any of the preceding claims, wherein said at least two particles are subject to a gradual increase in the electromagnetic field.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit champ magnétique est généré par des moyens générateurs de champ en mouvement. The method of any of the preceding claims, wherein said magnetic field is generated by moving field generating means.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont éclairées au moyen d'une source lumineuse pour détecter son mouvement. The method according to any one of the preceding claims, wherein said at least two particles are illuminated by means of a light source to detect its movement.
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites particules, au moins deux, sont génératrices d'un signal. 1 1. A method as claimed in any one of the preceding claims, wherein said at least two particles are generating a signal.
12. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel lesdites particules, au moins deux, sont excitables, fluorescentes ou phosphorescentes ou radioactives ou chimioluminescentes. 12. Method according to the preceding claim, wherein said particles, at least two, are excitable, fluorescent or phosphorescent or radioactive or chemiluminescent.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le procédé est réalisé avec une pluralité de particules de 2 à 10 000 000 particules. The method of any of the preceding claims, wherein the process is performed with a plurality of particles of 2 to 10,000,000 particles.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'antibiotique est choisi dans le groupe comprenant l'acide fusidique, les aminosides, les béta-Lactamines, les pénicillines, des inhibiteurs le béta-lactamases, les céphalosporines, les carbapénèmes, les monobactames, la cyclosérine, la daptomycine, la fosfomycine, les lincosamides, les macrolides et kétolides, la mupirocine, les nitro-imidazolés, les nitrofuranes, les Oligosaccharides, les oxazolidinones, les polypeptides, glycopeptides, polymyxines et colistine, les quinolones, les rifamycines, les sulfamides et les diaminopyridines, les synergistines, les tétracyclines, les antifongiques. 14. A method according to any preceding claim wherein the antibiotic is selected from the group consisting of fusidic acid, aminoglycosides, beta-Lactamines, penicillins, beta-lactamase inhibitors, cephalosporins, carbapenems. , monobactams, cycloserine, daptomycin, fosfomycin, lincosamides, macrolides and ketolides, mupirocine, nitroimidazoles, nitrofurans, oligosaccharides, oxazolidinones, polypeptides, glycopeptides, polymyxins and colistin, quinolones, rifamycins, sulfonamides and diaminopyridines, synergistins, tetracyclines, antifungals.
15. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel on utilise une pluralité de contenants comprenant à la surface de leurs parois internes un ligand dudit microorganisme comprenant chacun : 15. The method of claim 1, wherein a plurality of containers comprising on the surface of their inner walls a ligand of said microorganism each comprising:
ledit milieu de culture,  said culture medium,
- lesdites, au moins deux particules, et ledit microorganisme,  said at least two particles and said microorganism,
ledit composé et/ou agent physique,  said compound and / or physical agent,
lesdits contenants comprenant une concentration différente dudit composé et/ou agent physique et/ou un composé et/ou agent physique différent d'un contenant à l'autre. said containers comprising a different concentration of said compound and / or physical agent and / or a compound and / or physical agent different from one container to another.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on détermine grâce à la pluralité desdits contenants la concentration minimale de l'antibiotique pour ledit microorganisme. 16. The method of claim 15, wherein the plurality of said containers determines the minimum concentration of the antibiotic for said microorganism.
17. Utilisation du procédé définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 pour déterminer la concentration minimale inhibitrice d'un microorganisme d'un antibiotique. 17. Use of the method defined according to any one of claims 1 to 16 for determining the minimum inhibitory concentration of a microorganism of an antibiotic.
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