WO2017115000A1 - Cepas de procariotas genéticamente hipervariables - Google Patents

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WO2017115000A1
WO2017115000A1 PCT/ES2017/070002 ES2017070002W WO2017115000A1 WO 2017115000 A1 WO2017115000 A1 WO 2017115000A1 ES 2017070002 W ES2017070002 W ES 2017070002W WO 2017115000 A1 WO2017115000 A1 WO 2017115000A1
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actinobacteria
strain
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nucs
gene
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Jesús BLÁZQUEZ GÓMEZ
Alfredo CASTAÑEDA GARCÍA
Ana Isabel PRIETO MÁRQUEZ
Ana ROJAS MENDOZA
Simon WADEL
Daire CANTILLON
Aidan Doherty
Mark Paget
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Sevilla
Servicio Andaluz de Salud
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Sevilla
Servicio Andaluz de Salud
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to! field of medicine and industrial production, in particular the fact that the inactivation in Actinobacteria, particularly Mycobacter ⁇ um and Streptomyces, of a homologue of the arc-origin gene nucS (also known as endoMS and encoding an endonudease) increases by two orders of magnitude the mutation rate and about an order of magnitude the frequency of recombination between non-perfectly homologous DNA sequences. Therefore, the inactivation of said gene or any of its counterparts will lead to the construction of genetically hypervariable strains in which variants with beneficial biomedical and / or indistrial characteristics can be easily selected.
  • tuberculosis a particularly Mycobacterium tuberculosis, the cause of tuberculosis (TB), is e! The most common known pathogen and the leading cause of death throughout the world due to a single bacterial pathogen that infects a third of the world's population.
  • DR-TB multi-drug-resistant strains
  • DR-TB multi-drug-resistant strains
  • XDR-TB extremely resistant tuberculosis
  • the evolutionary forces that drive the emergence and spread of drug-resistant M. tuberculosis are extrinsic, including those according to the diagnosis, treatment and idiosyncrasy of the patient, and intrinsic, including their genetic and population characteristics.
  • extrinsic including those according to the diagnosis, treatment and idiosyncrasy of the patient
  • intrinsic including their genetic and population characteristics.
  • the mutation rate is of great importance.
  • M. tuberculosis exhibits mutation rates similar to other bacterial species such as Escherichia coii and Pseudomonas aeruginosa, both in vitro and in vivo. While a broad set of mutant genes is well characterized in E. coii and P. aeruginosa, the cooperating mechanisms to prevent the acquisition and fixation of mutations in M. tuberculosis remain largely unknown. Since M. tuberculosis species appear to be genetically isolated, they acquire resistance to antibiotics exclusively through chromosomal mutations (most of which are single nucleotide polymorphisms, SNPs), it could be hypothesized that, like other bacterial pathogens that cause infections Chronic as P.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a first aspect of the present invention relates to a method for the production of hypermutable strains in microorganisms comprising: a. Identification of the existence of the gene or genes encoding the NucS endonuclease / s (NCBI reference sequence: NP__215837.1), or of a homologous or orthologous gene of nucS (reference sequence MT_1321), in a microorganism belonging to the Bacteria or Archaea domains; and b.
  • Actinoplanes_sp ._ (strain_ATCC_31044_
  • Arcanobacterium_haemolyticum_ (strain_ATCC_9345_
  • Actinobacteria_class Actinobacteria
  • Arthrobacter_chlorophenolicus_ (strain_ATCC_700700_ (Actinobacteria_class)
  • Arthrobacter_sp ._ (strain_FB24)
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  • Actinobacteria_class Actinobacteria Rothia_mucilaginosa_ (strain_DY- (Actinobacteria_class) 18) _ (Stomatococcus_mucilaginosus)
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  • Sa 1 i n is po ra_t ro pi ca_ (st ra i n_ATCC_B AA-916_ (Actinobacteria_class)
  • Segniliparus_rotundus_ (strain_ATCC_BAA-972_ (Actinobacteria_class)
  • Actinobacteria_class Actinobacteria
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  • Streptomyces_bingchenggensis_ (strain_BCW-l) (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces_cattleya_ (strain_ATCC_35852_ (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces_clavuligerus_ (strain_ATCC_27064_ (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces_cyaneogriseus_subsp._noncyanogenus (Actinobacteria_class)
  • Actinobacteria_class Actinobacteria
  • Streptomyces_griseus_subsp._griseus_ (strain_JCM_4626_ (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces_hygroscopicus_subsp.Jinggangensis_ (strain_5008) (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces_pratensis_ (strain_ATCC_33331_
  • Actinobacteria_class i Actinobacteria
  • Streptomyces_scabiei_ (strain_87.22) (Act ⁇ nobacter ⁇ a_class)
  • Streptomyces_sp. _ (st ra i n_S i rex A A- E_ i (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces_sp. _ (strain_SPB074) (Actinobacteria_class) and Actinobacteria
  • Actinobacteria_class i Actinobacteria
  • Streptomyces_sp. _MMG1533 Actinobacteria_class
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  • Actinobacteria Actinobacteria_class
  • Streptomyces_sp. _MUSC136T Actinobacteria_class
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  • Streptomyces_sp._NRRL_S-444 Actinobacteria_class
  • Streptomyces_sp._NRRL_S-495 Actinobacteria_class
  • Streptomyces_sp._NRRL_WC-3618 Actinobacteria_class
  • Streptomyces_sp._WM4235 i Actinobacteria_class
  • Streptomyces_sp._WM6378 i Actinobacteria_class
  • Actinobacteria_class Actinobacteria
  • Streptomyces_venezuelae_ strain_ATCC_10712 (Actinobacteria_class)
  • Streptomyces viridochromogenes (strain DSM 40736 (Actinobacteria_class) _ _
  • Streptosporangium roseum (stram ATCC 12428
  • Thermobispora_bispora_ (strain_ATCC_19993
  • Tsukamurella_paurometabola_ strain_ATCC_8368 (Actinobacteria
  • HalalkalicoccusJeotgali_ (strain_DSM_18796_
  • Haloarcula_marismortui_ (strain_ATCC_43049_ (Halobacteria)
  • Halobacterium_salinarum_ strain_ATCC_700922_ i (Halobacteria)
  • Halogeometricum_borinquense_ strain_ATCC_700274_ i (Halobacteria)
  • Halomicrobium_mukohataei_ strain_ATCC_700874_ (Halobacteria)
  • Haloquadratum_walsbyi_ strain_DSM_16790_ i (Halobacteria)
  • Halorubrum_lacusprofundi_ (strain_ATCC_49239_ (Halobacteria) Euryarchaeota
  • Haloterrigena_turkmenica_ (strain_ATCC_51198_
  • Methanobacterium_paludis_ (strain_DSM_25820_
  • Methanobrevibacter_ruminantium_ strain_ATCC_35063_ i (Methanobacteria)
  • Methanosphaera_stadtmanae_ strain_ATCC_43021_ i (Methanobacteria)
  • Methanocella_arvoryzae_ (strain_DSM_22066_
  • Thermococcus_barophilus_ (strain_DSM_11836_
  • Thermococcus_gammatolerans_ (strain_DSM_15229_ (Thermococci)
  • Thermococcus_kodakarensis_ strain_ATCC_BAA-918_ i (Thermococci)
  • Thermococcus_litoralis_ (strain_ATCC_51850_
  • Thermosphaera_aggregans_ strain_DSM_11486_ i (Desulfurococcales)
  • the first aspect methodology of the invention is carried out on a prokaryotic strain belonging to the domain Bacteria, genus Mycohacterium, preferably to the Mycobacterium tuberculosis complex, or to the genus Streptomyces.
  • the bacterial strain refers to other types of actinobacteria, including, among others, Bifidobacterium, Nocardia and Rhodococcus.
  • the strain also refers to the Archaea domain including, among other genera, Pyrococcus, Thermococcus and Halobacterium.
  • the bacterial strain refers to a bacterium selected from the list consisting of: Mycobacterium smegmatis or Mycobacterium tuberculosis.
  • said bacterial strain is Mycobacterium smegmatis and the locus of the inactivated stage b) gene is MS EG__4923.
  • said bacterial strain is Mycobacterium tuberculosis and the method comprises inactivation of MT _1321. More preferably, said bacterial strain is Mycobacterium tuberculosis and said inactivation consists in the production of a mutant with the negative regulation (transcriptional and / or post-transcriptional) of the nucS gene expression.
  • a second aspect of the invention relates to a microorganism obtained or obtainable by means of the method described in the first aspect of the invention.
  • a third aspect of the invention relates to a microorganism belonging to the Actinobacteria phylum, preferably belonging to the Mycobactenum genus, more preferably to the Mycobactenum tuberculosis complex, characterized in that in said strain of the gene or genes capable of encoding the endogenous ios nucS (NCBI reference sequence : NP__215837.1) or a homologous or orthologio endonuciease are inactivated.
  • said bacterial strain is Mycobactenum smegmatis and the locus of the inactivated stage b) gene is MSMEG_4923.
  • said bacterial strain is Mycobactenum tuberculosis and the method comprises inactivation of the MT_1321 gene. More preferably, said bacterial strain is Mycobactenum tuberculosis and said inactivation consists in the induction of any of the following polymorphisms in the MT_ 1321 gene: S39R, A 135S, T168A, K184E and S54I.
  • the bacterial strain is M. smegmatis me 55.
  • the bacterial strains are M. tuberculosis H37Rv and CDC155.
  • a fourth aspect of the invention relates to a composition comprising the bacterial strain or microorganism as defined in the second or third aspect of the invention.
  • a fifth aspect of the invention relates to the bacterial strain or microorganism as defined in any of the second to fourth aspects of the invention, for use as a medicament, in particular as a vaccine.
  • a sixth aspect of the invention relates to the bacterial strain or microorganism as defined in any of the second to fourth aspects of the invention, for use as a vaccine for the prevention of infection with a bacterium of the same species as the strain. bacterial used as a vaccine, preferably for use in the prevention of tuberculosis.
  • a seventh aspect of the invention relates to a method of administration of a bacterial strain or microorganism as defined in any of the second to fourth aspects of the invention, to a human being to prevent infection.
  • An eighth aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition, preferably a vaccine, comprising bacterial strains or microorganism as defined in any of the second to fourth aspects of the invention.
  • a ninth aspect of the invention relates to a method for drug screening, comprising: a. Contacting a drug, preferably an antibiotic, with a hypermutable bacterial strain obtained or obtainable according to the method of the first aspect of the invention or with a hypermutable bacterial strain as defined in any of the second to fourth aspects of the invention ;
  • a tenth aspect of the invention relates to a kit for carrying out the in vitro method of the ninth aspect of the invention, comprising:
  • An eleventh aspect refers to the use of nucS polymorphisms to predict the ability of Mycobacterium clinical strains to rapidly develop antibiotic resistance during treatments.
  • a twelfth aspect of the invention relates to the use of any of the genetically modified hypervariable strains mentioned in the present invention, including bacteria and archaebacteria, for fermentation or to improve fermentation, creation of hybrid routes to obtain new metabolites, including antibiotics, amino acids, pesticides, proteins, etc., and for the bioremediation of recalcitrant products.
  • a final aspect of the invention relates to the construction of hypervariable strains in which the regulation at will of the expression of the nucS gene or the NucS protein is forced by genetic engineering. It includes transcriptional and / or post-transcriptional gene silencing and any other methodology used for this purpose.
  • Fig 2. Nucleotide changes and effects of naturally occurring NucS polymorphisms on mutation rates. Rif-R mutation rates of the supplemented strains (calculated by the maximum likelihood method of Ma, Sarkar, Sandri-mss, which is applied in the FALCOR program). M. smegmatis Mutant AnucS is supplemented with the wild-type NucS of M. tuberculosis (nucS-TB) and its mutated alleles. The bars indicate the 95% confidence intervals (CI). The partial change indicates the increase in the mutation rate of the polymorphism-containing strains with respect to the strain complemented with the nucS allele of the wild-type M. tuberculosis strain CDC1551T
  • Fig 3 Comparison of NucS sequences and structures of P. abissy and M. tuberculosis.
  • the red letters indicate the SNPs, the purple letters indicate the catalytic sites in the archaea protein (according to Ren et al. 2009).
  • Asterisks indicate SNPs that confer a mutation rate ⁇ 7 times on the control.
  • Letters or background in yellow indicate the DNA binding sites of P. abissy endonuclease.
  • the orange box shows the B-clamp interaction domain.
  • the green letters indicate the W essential for DNA binding in the archaea enzyme.
  • Actinobacteria includes, among others, strains of Mycobacterium, Streptomyces, Bifidobacterium and Rhodococcus (see list of prokaryotic organisms in the table above).
  • the terms "Archaebacteria” and “Archaea” include, among others, strains of Pyrococcus, Thermococcus and Halobactenum (see list of prokaryotic organisms in the table above)
  • MT_1321 gene is understood as the DNA sequence encoding the NucS protein in M. tuberculosis.
  • NP_215837.1 polypeptide or protein is understood as the amino acid sequence that constitutes the NucS protein in M.
  • MSMEG_4923 is understood as the DNA sequence encoding NucS proteins in M. smegmatis.
  • M. tuberculosis strain H37Rv is understood as the model strain of the M. tuberculosis complex.
  • M. tuberculosis strain CDC1551 is understood as the model strain of the M. tuberculosis complex.
  • S39R, A135S, R144S, T168A and K184E are understood as the polymorphisms indicated in Table 2.
  • strain M. smegmatis me 2 155" is understood as the model strain of M. smegmatis.
  • strain M. smegmatis me 2 155" is understood as the model strain of M. smegmatis.
  • Streptomyces coelicolor A3 (2) strain is understood as the S. coelicolor model strain.
  • activation is understood as blocking the expression of a specific gene or a protein, either through molecular modification or negative regulation of one or both.
  • Molecular modification includes the use of conventional recombinant DNA techniques which in turn includes: the replacement of one or more nucleotides, the insertion of one or more nucleotides, the partial or complete deletion of a gene, chemically induced or radiation-induced disruptions by mutagenesis.
  • Negative regulation of the expression of a gene or protein includes transcriptional and / or post-transcriptional gene silencing.
  • NucS is defined as the absence of the NucS endonuclease in the bacterial or archaean strain.
  • the term "gene or genes encoding NucS endonuclease / s" is understood as any gene with DNA or polypeptide sequence homology, the latter obtained by translation of the gene sequence. Likewise, any gene whose polypeptide product has structural homology with the M. tuberculosis NucS protein NP_215837.1 (Published in Casta ⁇ eda-Garc ⁇ a et al. Nat. Comm. 2017).
  • nucS homologous or orthologous gene is understood as any gene with DNA sequence homology or any gene whose polypeptide product has sequence or structural homology with the M. tuberculosis NucS protein. (Published in Casta ⁇ eda-Garc ⁇ a et al. Nat. Comm. 2017), whether or not the nuclease activity is defined for NucS.
  • two genes are considered homologous when they share at least 25%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least one 80%, at least 90%, at least 95% identity over the entire amino acid sequence of the polypeptide product for which it encodes the sequence of the MT_1321 gene (NP_215837.1 polypeptide) and performs the same function or a similar function .
  • the term "hypermutable strain compared to a strain in which an inactivation of the nucS gene or a homologous or orthologous gene of nucS has not been performed” is understood as any prokaryotic individual having a homologous gene. or ortholog to nucS, has been transformed into hypermutable by partial or complete inactivation of the nucS gene.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to the amount of antibodies of the invention or of the attenuated bacterial strains of the invention that allow to produce the desired effect.
  • Pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are carriers known to those skilled in the art.
  • the compositions provided by this invention may be provided through any route of administration, for which said composition will be formulated in the appropriate dosage form and with the excipients that are pharmacologically acceptable for the route of administration chosen.
  • vaccine refers to an antigen preparation used to establish the immune system's response to a disease.
  • the present invention discloses the factors that promote a hypermutable and hyper-recombinable (genetically hypervariable) phenotype in actinobacteria and archaebacteria.
  • MSMEG_4923 the precise deletion of the MSMEG_4923 gene resulted in an increase in the mutation rate (more than two orders of magnitude higher than the wild type strain) that could be rescued by chromosomal complementation with MSMEG_4923.
  • the orthologous gene, SC05388, is inactive in Streptomyces coelicolor, showing the same hypermutator phenotype.
  • This gene encodes a homologous protein of an archaean endonuclease, NucS or EndoMS.
  • the mutational spectrum of the nucS null mutant of M. smegmatis consists almost exclusively of transitions, in contrast to the high variability found in the wild-type strain.
  • Hypermutation, hyper-recombination and the specific mutational spectrum of transitions are specific characteristics of the inactivation of the MMR system in species with a canonical system (based on MutS-L) for repair of mismatched bases. These results reveal the first strong anti-mutant gene in mycobacteria, the existence of an alternative MMR system in nature, and constitute the nucleus of the present invention. In addition, the analysis of the taxonomic distribution of NucS among 3,942 proteomes showed that NucS is present in 370 organisms (60 archaea and 310 bacteria), being practically exclusive with utS-L (only in 28 species do NucS and MutSL coexist).
  • S39 serine-39
  • S54 serine-54
  • A67 alanine-67 residues
  • S54 is found in the hinge region between the domains, while aspartic-162 (D162), threonine-168 (T168) and lysine-184 (K184) are in the C-terminal domain.
  • Valine residue-69 V69 is in the structural limits of the N-terminal domain while alanine residue-135 (A 135) is located between the two domains in a loop ( Figure 2B).
  • the T168A mutation has lost all interactions with the neighboring R203 helix, and exposure could also be a target for phosphorylation of Thr.
  • K184E is a big change in size and load and, depending on the spatial placement of E, interactions with Y126 could be lost.
  • R144S polymorphism could result in loss of local structure maintenance interactions.
  • the wild-type M. tuberculosis nucS gene (nucS-JB) reduced the mutation rate from 2.36x10 "7 to 4.17x10 " 9 (a reduction of more than 98% with respect to M. smegmatis me 2 155 AnucS), a value practically identical to that produced by complementation with the NucS-Sm gene (from M. smegmatis).
  • M. tuberculosis 's adaptations to antimicrobial treatments, including new medications, drug combinations (both old and new) and other non-antibiotic-based regimens.
  • the construction of genetically modified hypervariable variants would be useful for improving fermentations, creating hybrid routes to obtain new metabolites, including antibiotics, amino acids, pesticides, proteins , etc., and bioremediation of recalcitrant products.
  • Bacterial strains, media and growth conditions The wild strain of M. smegmatis me 2 155M and its mutant derivatives were grown at 37 ° C in Middlebrook 7H9 broth or in Middlebrook 7H10 agar (Difco) with 0.5% glycerol and 0.05% Tween 80, and enriched with 10% albumin-dextrose-catalase (Difco).
  • the media were supplemented with 25 ⁇ g / ml kanamycin or 50 ⁇ g / ml hygromycin B, when necessary.
  • Escherichia coli DH5a strain was grown at 37 ° C in Luria-Bertani (LB) medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin or 100 ⁇ g / ml hygromycin, when appropriate.
  • LB Luria-Bertani
  • M. smegmatis q> MycoMarT7.
  • the transposon pMycoMarT7, a Mariner-based system
  • smegmatis 2 155 were washed with MP buffer (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCI, 10 mM MgS04 and 2 mM CaCI2), mixed with a phage broth at a multiplicity of infection of 1: 10 and incubated (37 ° C, 3 h).
  • MP buffer 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCI, 10 mM MgS04 and 2 mM CaCI2
  • Mycobacterial cells were seeded on Middiebrook 7H10 agar with kanamycin (25 ⁇ g / ml). Insertion mutants were isolated as kanamycin resistant colonies after 3 days of incubation (37 ° C). Approximately 11,000 clones were randomly selected and inoculated into individual wells in 96-well microtiter plates containing Middiebrook 7H9 medium.
  • transposon insertion site q> MycoMarT7.
  • genomic DNA purified from each selected mutant was digested with fiam HI and religed with T4 DNA ligase.
  • the auto-linked plasmids bound the transposon in addition to the chromosomal DNA next to the insertion site.
  • the recircularized plasmids were electroporated in E. coli DH5a ⁇ pir116 and selected in LB with kanamycin (50 ⁇ g / ml).
  • the plasmids were sequenced using a specific MycoMar-primer (SecMycomar) that hybridizes to the transposon / chromosome junction side. DNA sequences adjacent to each insertion site were compared with the genome sequence M. smegmatis to identify the interrupted gene.
  • SecMycomar MycoMar-primer
  • Streptomyces coelicolor In the case of Streptomyces coelicolor, it started with 20 independent spore suspensions ( ⁇ 10 9 spores / ml) generated in MS agar. These suspensions were plated on MS agar with and without rifampicin (100 ⁇ g / ml) or sirepiomycin (50 ⁇ g / ml). 1.5 Generation of knockout mutants in nucS. Deletion mutants M. smegmatis A nucS (MSMEG_4923, nucS-Sm) and Streptomyces coelicolor A3 (2) M145 AnucS (SC05388, nucS-Sco) were generated by allelic replacement. Briefly, for the mutant M.
  • plasmid p2NIL-AMSMEG_4923 was constructed, with a phase deletion of nucS.
  • the plasmid was introduced by electroporation in M. smegmatis me 2 155. Clones with double cross-over were selected and checked by PCR and sequencing.
  • nucS of M. tuberculosis strains The sequences of the MT_ 1321 gene product were downloaded from the Ensembl database (http://bacteria.ensembl.org/index.html), the Mycobacterium tuberculosis varioma resources (http://genome.igib.res.in / tbvar /) and data from Comas et al. Only complete proteins that showed no changes were considered. About 1,000 proteins were aligned using MAFFT. The analysis of all nucS sequences in the databases of clinical M. tuberculosis strains yielded 9 simple mutations of amino acid sequence change. In addition, nucS sequences were studied in 63 strains isolated from hospitals.
  • the strains were characterized in terms of their antibiotic sensitivity profile and their genotyping in DNA fingerprint (RFLP and spoligotyping).
  • the clinical strains were divided into two groups: the drug-sensitive TB strains and the multi-drug resistant TB strains, resistant to at least isoniazid and rifampicin. A randomly selected number of 30 strains from each group were chosen for further analysis.
  • the nucS sequence of M. tuberculosis was amplified by PCR, including the upstream region with its promoter, and sequenced to identify any SNP in the MT_1321 ORF and / or the promoter region. Only one amino acid change mutation was found. In total, 10 polymorphisms in NucS were found and studied.
  • the mutagenized plasmids obtained after DH5a transformation were verified by DNA sequencing. All nucS alleles (with different point mutations) were cloned back into pMV361 to generate a set of complementation plasmids. To test the efficacy of each nucS allele to restore normal mutation rates, the mutated alleles were integrated into the chromosome and expressed in M. smegmatis AnucS. The correct insertion of the alleles was verified by PCR and sequencing. 1.8. Computational analysis of the MT_1321 protein. Given the absence of structural data for the M. tuberculosis NucS protein, the 3D structure of the P.
  • abyssi NucS protein (PDB 2VLD chain B) was used as a template for our modeling using I-TASSER (Fig. 3). This structure is composed of two distinct regions: the N-terminal binding to AND (amino acids 1-1 14) and the catalytic region C-terminal (amino acids 126-233).
  • the mold and model were structurally aligned using the Combinatorial Extension (CE) algorithm, built with PyMOL to identify relevant residues.
  • CE Combinatorial Extension
  • nucS mc 2 155 Complem.

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Abstract

En la presente invención caracterizamos un nuevo sistema de reparación de bases desapareadas (mismatch repair -MMR) en Actinobacteria. La inactivación en fase del gen de origen arqueano nucS (o un ortólogo del mismo)en actinobacterias (incluyendo Mycobacterium y Streptomyces), aumenta dos órdenes de magnitud la tasa de mutación y un orden de magnitud la recombinación entre secuencias de ADN no completamente idénticas. Este nuevo MMR está presente en todas las actinobacterias, algunas terrabacterias y en muchas arqueobacterias (se proporciona un listado completo). Asimismo a lo largo de la presente invención, describimos la construcción de organismos genéticamente hipervariables en determinadas especies y su posible uso biomédico e industrial.

Description

Cepas de procariotas genéticamente hipervariables
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a! campo de la medicina y la producción industrial, en particular al hecho de que ia inactivación en Actinobacterias, particularmente Mycobacteríum y Streptomyces, de un homólogo del gen de origen arqueano nucS (también conocido como endoMS y que codifica una endonudeasa) aumenta dos órdenes de magnitud ia tasa de mutación y cerca de un orden de magnitud la frecuencia de recombinación entre secuencias de ADN no perfectamente homologas. Por tanto, la inactivación de dicho gen o cualquiera de sus homólogos conducirá a ¡a construcción de cepas genéticamente hipervariables en las que se pueden seleccionar fácilmente variantes con características biomédicas y/o indistriales beneficiosas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Todos los seres vivos aseguran el mantenimiento de su estabilidad genética mediante el uso de una plétora de procesos de vigilancia y corrección del ADN. Estos procesos incluyen la selección de base, la edición durante ia polimerización, la corrección de bases desapareadas (mismatch repair- R), la reparación por excisión de base o nucleótido, ia reparación por reparación y el "non-homologous end joining". Hasta la fecha, el proceso de R está altamente conservado entre ios seres vivos. En todos los casos, miembros de las familias proteicas utS y utL desempeñan etapas clave en la corrección de bases desapareadas. Este sistema MMR, basado en MutS-L (que a partir de aquí llamaremos MMR canónico), es un sistema altamente sofisticado que detecta y elimina las bases apareadas incorrectamente en el DNA. La pérdida de esta actividad tiene consecuencias muy importantes en ios seres vivos, como altas tasas de mutación y la elevación de la frecuencia de recombinación entre secuencias de ADN no idénticas (homeóiogas), lo que conduce a ia pérdida de estabilidad genética y a la reducción del aislamiento genético entre especies.
Curiosamente, pese a la casi ubicuidad del sistema MMR canónico entre ios seres vivos, existen notables excepciones. Los genomas de muchas especies del dominio Archaea y de casi todos los miembros del filo Actinobacteria (dominio Bacteria), incluyendo las especies de los géneros Mycobacteríum y Streptomyces, secuenciados completamente carecen de homólogos de MutS y MutL. Sin embargo, estos procariotas exhiben tasas y espectros mutacionales similares a aquellas especies que poseen el sistema MMR canónico, lo cual sugiere la existencia de un/unos mecanismo/s responsabie/s de ia corrección de bases desapareadas en el ADN no identificados hasta el momento.
i En particula Mycobacterium tuberculosis, la causa de ¡a tuberculosis (TB), es e! patógeno más común conocido y la principal causa de muerte en todo ei mundo debido a un solo patógeno bacteriano que infecta a un tercio de la población mundial. Aunque el control de la enfermedad mejoró durante años, con una disminución en el número absoluto de casos de tuberculosis desde 2008, el aumento de cepas multi-resistentes a los medicamentos ( DR-TB), que se define como resistentes al menos a las dos drogas más poderosas anti-TB, isoniazida y rifampicina, está amenazando los esfuerzos de control. Cada año, alrededor de 480.000 personas adquieren esta forma complicada de tuberculosis (5% de todos los casos de TB son MDR-TB) y 210.000 mueren. Las cepas MDR-TB muestran tasas de mortalidad más altas y requieren tratamientos más largos con antibióticos de "segunda línea" menos eficaces y más costosos. Por otra parte, la tuberculosis extremadamente resistente (XDR-TB), una forma de tuberculosis totalmente resistente a casi todos los fármacos antituberculosos ha sido reportada en todo el mundo. XDR-TB (9% de todos los casos de MDR-TB) se está convirtiendo en una enfermedad letal que no pueden ser tratadas con éxito con ios antibióticos antituberculosos actuales.
Las fuerzas evolutivas que impulsan la aparición y propagación de M. tuberculosis resistente a fármacos son extrínsecas, incluidos las que según el diagnóstico, el tratamiento y la idiosincrasia del paciente, e intrínseca, incluyendo sus características genéticas y de la población. Entre los factores intrínsecos que pueden modular la evolución a la resistencia se ha sugerido que la tasa de mutación es de gran importancia.
Como se ha indicado anteriormente, M. tuberculosis exhibe tasas de mutación similar a otras especies bacterianas tales como Escherichia coii y Pseudomonas aeruginosa, tanto in vitro como in vivo. Mientras que un amplio conjunto de genes mutadores está bien caracterizado en E. coii y P. aeruginosa, ios mecanismos que cooperan para evitar la adquisición y fijación de mutaciones en M. tuberculosis siguen siendo en gran medida desconocidos. Dado que las especies M. tuberculosis parecen estar genéticamente aisladas, adquieren resistencia a ios antibióticos exclusivamente a través de mutaciones cromosómicas (la mayoría de ios cuales son polimorfismos de un solo nucleótido, SNP), podría hipotetizarse que, como otros patógenos bacterianos que producen infecciones crónicas como P. aeruginosa en la fibrosis quística (CF) y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la selección de cepas de M. tuberculosis con las tasas de mutación más altas debería verse favorecida bajo terapia con antibióticos. Sin embargo, este tipo de cepas hipermutables no se han caracterizado hasta ahora en M. tuberculosis. Debido a la falta de un sistema MMR reconocible en micobacterias, la regla de la hipermutación por inactivación natural de alguno de los componentes del sistema de MMR queda descartada en M. tuberculosis. Por ello, durante años se ha buscado una posible vía para la hipermutación en aislados naturales de M. tuberculosis. La deficiencia en ios genes que pertenecen al sistema GO, un sistema que evita mutaciones por 8-oxo-GTP, particularmente mutT y mutY, se sugirió como responsable de las tasas de mutación elevadas en las cepas "Beijing" de M. tuberculosis, ya que albergan diversas sustituciones no sinónimas en el gen mutT. Sin embargo, ¡a redundancia en ios genes mutT y el efecto leve en la tasa de mutación cuando se inactivan en micobacterias, sugieren un papel de menor importancia de estas sustituciones en el aumento de las tasas de mutación en M. tuberculosis. Recientemente, se ha demostrado que la inactivación del dominio DnaE1 PHP en M. tuberculosis aumenta la tasa de mutación en tres órdenes de magnitud. Análisis de secuencias de DnaEl de un gran número de M. tuberculosis aislados en clínica se identificaron 3 SNP sin sentido en aproximadamente 3% de todos ios aislamientos. Sin embargo, cuando el efecto de estos cambios en la tasa de mutación se estudió en el modelo sustituto de M. smegmatis, sólo se detectó un modesto aumento de 3 veces. Finalmente, la mutagénesis inducib!e se atribuye a una ADN poiimerasa micobacteriana especializada, DnaE2, que actúa como una enzima propensa a errores que pueden contribuir a la aparición de mutaciones de resistencia a antibióticos cuando se induce en condiciones de estrés. Por lo tanto, hasta la fecha, ninguna asociación entre hipermutabiiidad estable (es decir, no inducible) y reparación del ADN o polimorfismos de genes antimutadores se ha demostrado en aislados clínicos de M. tuberculosis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Para testar la hipótesis de la existencia de un nuevo sistema MMR (no-canónico), se construyó y se cribó una librería de inserciones del transposón O MycoMarT7 en Mycobacterium smegmatis me2 155. El chequeo de la librería rindió un clon con una tasa de mutación incrementada dos órdenes de magnitud. El estudio en profundidad de la inserción y sus consecuencias ha llevado al descubrimiento de un nuevo sistema de reparación de bases desapareadas, prácticamente alternativo al MMR canónico, y que está presente principalmente en especies del filo Actinobacteria (dominio Bacteria), algunas terrabacterias y muchas especies del dominio Archaea.
En particular, se analizó en primer lugar sí el genoma de micobacterias podría producir aielos mutantes fuertes. Tras el cribado de una gran biblioteca de transposones en me2 155 M. smegmatis (-1 1 ,000 clones), se caracterizó un gen (MS EG__4923 o nucS/endoMS) que producía un fenotipo hipermufador e hiper-recombinador cuando se inactiva. El gen ortólogo, SC05388, se inactivo en Streptomyces coeiicolor, mostrando el mismo fenotipo hípermutador. El análisis de ia distribución taxonómica de NucS entre 3.942 proteomas demostró que NucS y utS-L son prácticamente excluyentes en ¡a naturaleza (solo en 28 especies coexisten NucS y MutSL). NucS está totalmente ausente en eucariotas y virus.
Análisis in silico de ia secuencia del gen T_1321 (el ortólogo de nucS en M. tuberculosis) en ~ 1.600 genomas de M. tuberculosis y la secuenciación directa de 83 aislados clínicos se identificaron 10 SNPs sin sentido. Cinco de ellos€fue confieren un fenotipo hipermutable claro, con aumentos en la frecuencia de mutantes de uno a dos órdenes de magnitud por encima del tipo silvestre, en el sistema heteróiogo de M. smegmatis. Estas observaciones se correlacionan con las de un modelado estructural integral de los SNPs, que ayuda a comprender los efectos producidos por estas mutaciones.
Basándose en estos hallazgos, un primer aspecto de ia presente invención se refiere a un método para ia producción de cepas hipermutables en microorganismos que comprende: a. Identificación de la existencia del gen o genes que codifican para ia/s endonucleasa/s NucS (secuencia de referencia NCBI: NP__215837.1), o de un gen homólogo u ortólogo de nucS (secuencia de referencia MT_1321), en un microorganismo perteneciente a los dominios Bacteria o Archaea; y b. inactivar dichos gen o genes; donde ia inactivación de dicho gen/es cause que dicho microorganismo sea una cepa hipermutabie/hiper-recombinable (genéticamente hipervariable) en comparación con la cepa en la que no se ha realizado tal inactivación.
En este sentido, se hace notar que la inactivación de dicho gen/es causa un aumento de las frecuencias de mutación y recombinación homeóloga de secuencias de ADN parcialmente divergentes en M. smegmatis, y en todos los organismos que posean un sistema de reparación de ADN basado en NucS. Estos resultados hacen que sea plausible que tal inactivación en procariotas, en particular en cualquier actinobacteria y muchas especies del dominio Archaea incluidos, entre otros, Bifídobacterium, Nocardia, Rhodococcus: Pyrococcus, Thermococcus y Haiobacterium (ver listado de especies en ia tabla a continuación), proporcione el mismo efecto técnico, en particular, ia generación de cepas modificadas genéticamente hipervariables. Estas cepas modificadas genéticamente hipervariables pueden ser a su vez utilizadas para mejorar las fermentaciones, ia creación de rutas híbridas para obtener nuevos metaboütos, incluyendo antibióticos, aminoácidos, azúcares, proteínas, etc y ia biorremediación de ios productos recalcitrantes. A continuación mostramos una extensa lista de organismos procariotas donde la inactivación de dichos gen/es causará que dicho organismo sea una cepa hípermutable en comparación con la cepa en la que no se ha realizado tal inactivación:
Figure imgf000006_0001
Actinobacteria
Actinomyces_sp._oral_taxon_848_str._F0332
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinomyces_turicensis_ACS-279-V-Col4
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinomyces_urogenitalis_DSM_15434
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinoplanes_friuliensis_DSM_7358
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinoplanes_missouriensis_(strain_ATCC_14538_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinoplanes_sp._(strain_ATCC_31044_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinoplanes_sp._N902-109
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinosynnema_mirum_(strain_ATCC_29888_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Actinotignum_schaalii
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Aeromicrobium_marinum_DSM_15272
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria Amycolatopsis mediterranei (strain S699) (Nocardia mediterran (Actinobacteria_class) ei)
Actinobacteria
Amycolatopsis_orientalis_HCCB10007
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Amycolicicoccus_subflavus_(strain_DSM_45089_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Arcanobacterium_haemolyticum_(strain_ATCC_9345_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Arthrobacter_arilaitensis_(strain_DSM_16368_
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
A rt h ro ba ct e r_a u re sce n s_( st ra i n_TC 1 )
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Arthrobacter_chlorophenolicus_(strain_ATCC_700700_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Arthrobacter_globiformis_NBRC_12137
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Arthrobacter_sp._(strain_FB24)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Arthrobacter_sp._PAMC25486
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Austwickia_chelonae_NBRC_105200
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Be ute n be rgi a_ca ve rn a e_(st ra i n_ATCC_B AA-8_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_adolescentis_(strain_ATCC_15703_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_angulatum_DSM_20098_=_JCM_7096 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_animalis_subsp._lactis_(strain_AD011) (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_asteroides_(strain_PRL2011)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_bifidum_BGN4
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_breve_DSM_20213_=_JCM_1192 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_dentium_(strain_ATCC_27534_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Bifidobacterium_gallicum_DSM_20093_=_LMG_11596 (Actinobacteria_class) Actinobacteria
Bifidobacterium kashiwanohense PV20-2
(Actinobacteria
Actinobacteria
Bifidobacterium_longum_(strain_NCC_2705)
(Actinobacteria
Actinobacteria
Bifidobacterium_longum_subsp._longum_F8
(Actinobacteria
Actinobacteria
Bifidobacterium_pseudolongum_PV8-2
(Actinobacteria
Actinobacteria
Bifidobacterium scardovii
(Actinobacteria
Actinobacteria
Bifidobacterium_thermophilum_RBL67
(Actinobacteria
Actinobacteria
Blastococcus_saxobsidens_(strain_DD2)
(Actinobacteria
Actinobacteria
Brachybacterium_faecium_(strain_ATCC_43885
(Actinobacteria
Actinobacteria
Brachybacterium_sp._SW0106-09
(Actinobacteria
Actinobacteria
Brevibacterium mcbrellneri ATCC 49030
(Actinobacteria
Actinobacteria
Catenulispora_acidiphila_(strain_DSM_44928
(Actinobacteria
Actinobacteria
Cellulomona s_f i m i_( st ra i n_ATCC_484.
(Actinobacteria
Actinobacteria
Cellulomonas_flavigena_(strain_ATCC_482
(Actinobacteria
Actinobacteria
Cellulomonas_gilvus_(stra¡n_ATCC_13127
(Actinobacteria
Actinobacteria Clavibacter_michiganensis_subsp._sepedonicus_(strain_ATCC_331 (Actinobacteria_class) 13 Actinobacteria
Corynebacterium_argentoratense_DSM_44202
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_atypicum
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Cory ne bacte ri u m_a u ri m ucosu m_(st ra i n_ATCC_700975_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_camporealensis
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_casei_LMG_S-19264
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_diphtheriae_(strain_ATCC_700971_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_doosanense_CAU_212_=_DSM_45436 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_efficiens_(strain_DSM_44549_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_epidermidicanis
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_falsenii_DSM_44353
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_genitalium_ATCC_33030
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_glucuronolyticum_ATCC_51866
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_glutamicum_(strain_ATCC_13032_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_glyciniphilum_AJ_3170
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_halotolerans_YIM_70093_=_DSM_44683 (Actinobacteria_class) Actinobacteria
Corynebacterium_humireducens_NBRC_106098_=_DSM_45392 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebactenumjmitans
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium Jeikeium_(strain_K411)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_kroppenstedtii_(strain_DSM_44385_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_kutscheri
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_lipophiloflavum_DSM_44291
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_marinum_DSM_44953
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_maris_DSM_45190
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_matruchotii_ATCC_14266
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_mustelae
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_pseudotuberculosis_(strain_C231)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_resistens_(strain_DSM_45100_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_sp._ATCC_6931
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_sp._KPL1855
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Corynebacterium_sp._KPL1989
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
Corynebacterium_striatum_ATCC_6940
(Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_testudinoris
(Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_urealyticum_(strain_ATCC_43042 (Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_ureicelerivorans
(Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_uterequi
(Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_variabile_(strain_DSM_44702 (Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_vitaeruminis_DSM_20294 (Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacterium_xerosis
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Curtobacterium flaccumfaciens UCD-AKU
(Actinobacteria
Actinobacteria
Dermacoccus_nishinomiyaensis
(Actinobacteria
Actinobacteria
Dietzia cinnamea P4
(Actinobacteria
Actinobacteria
Frankia_alni_(strain_ACN14a)
(Actinobacteria
Actinobacteria
Frankia_sp._(strain_Ccl3)
(Actinobacteria
Actinobacteria
Frankia_sp._(strain_EANlpec)
(Actinobacteria
Actinobacteria
Frankia_sp._(strain_Eullc)
(Actinobacteria Actinobacteria
Frankia_sp._EUNlf
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Frankia_symbiont_subsp._Datisca_glomerata (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Frigoribacterium_sp._RIT-PI-h
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gardnerella_vaginalis_(strain_ATCC_14019_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gardnerella_vaginalis_JCP8481B
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Geodermatophilus_obscurus_(strain_ATCC_25078_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_amarae_NBRC_15530
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_bronchialis_(strain_ATCC_25592_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_polyisoprenivorans_(strain_DSM_44266_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_rhizosphera_NBRC_16068
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_sihwensis_NBRC_108236
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_sp._KTR9
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Gordonia_sputi_NBRC_100414
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
lntrasporangium_calvum_(strain_ATCC_23552_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
lsoptericola_variabilis_(strain_225)
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
Janibacter_hoylei_PVAS-l
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Janibacter_sp._HTCC2649
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Jonesia_denitrificans_(strain_ATCC_14870_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kineococcus_radiotolerans_(strain_ATCC_BAA-149_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kineosphaera_limosa_NBRC_100340
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kitasatospora_setae_(strain_ATCC_33774_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kocuria_rhizophila_(strain_ATCC_9341_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kocuria_sp._UCD-OTCP
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kribbella_flavida_(strain_DSM_17836_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kutzneria_albida_DSM_43870
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Kytococcus_sedentarius_(strain_ATCC_14392_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria Lechevalieria_aerocolonigenes_(Nocardia_aerocolonigenes)_ (Actinobacteria_class) (Saccharothrix_aerocolonigenes)
Actinobacteria
Leifsonia_xyli_subsp._xyli_(strain_CTCB07)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Le uco ba cte r_s p ._Ag 1
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
marine_actinobacterium_PHSC20Cl
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
Microbacterium_azadirachtae
(Act¡nobacter¡a_class)
Actinobacteria
Microbacterium_chocolatum
i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_foliorum
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_ginsengisoli
(Actinobacteria_class)
¡ Actinobacteria
Microbacterium_hydrocarbonoxydans
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_ketosireducens
(Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Microbacterium_laevaniformans_OR221
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_oxydans
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_sp._Agl
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_sp._SA39
i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_testaceum_(strain_StLB037) i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microbacterium_trichothecenolyticum
(Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Micrococcus_luteus_(strain_ATCC_4698_
\ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Microlunatus_phosphovorus_(strain_ATCC_700054_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Micromonospora_aurantiaca_(strain_ATCC_27029_ (Actinobacteria_class) Actinobacteria
Micromonospora_lupini_str._Lupac_08
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Micromonospora_sp._HK10
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Micromonospora_sp._NRRL_B-16802
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mobilicoccus_pelagius_NBRC_104925
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mobiluncus_curtisii_(strain_ATCC_43063_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mobiluncus_mulieris_ATCC_35239
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Modestobacter_marinus_(strain_BC501)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_abscessus_(strain_ATCC_19977_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_bovis
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_elephantis
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_haemophilum
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_hassiacum_DSM_44199
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Myco bacte ri u m_ka nsasi i_ATCC_12478
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_leprae_(strain_TN)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_marinum_(strain_ATCC_BAA-535_ (Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Mycobacterium_ _neoaurum_VKM_Ac-1815D
i (Act¡nobacter¡a_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_ obuense
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_ _parascrofulaceum_ATCC_BAA-614 (Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Mycobacterium_ _paratuberculosis_(strain_ATCC_BAA-968_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_ _phlei_RIVM601174
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium_ _rhodesiae_(strain_NBB3)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _sinense_(strainJDM601)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _smegmatis_(strain_ATCC_700084_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _sp._(strain_KMS)
i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _sp._EPa45
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _sp._VKM_Ac-1817D
(Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Mycobacterium _spJS623
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _thermoresistibile_ATCC_19527
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _tuberculosis_(strain_ATCC_25618_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Mycobacterium _vanbaalenii_(strain_DSM_7251_
I (Actinobacteria_class) Actinobacteria
Mycobacterium_xenopi_RIVM700367
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Na ka m u reí la_m u Iti pa rtitajst ra i n_ATCC_700099_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardia_brasiliensis_ATCC_700358
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardia_cyriacigeorgica_(strain_GUH-2)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardia_farcinica_(strain_IFM_10152)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
N oca rd i a_n ova_S H 22a
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardia_sp._NRRL_S-836
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardioides_luteus
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardioides_simplex_(Arthrobacter_simplex) (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
N o ca rd i o i d e s_s p ._( st ra i n_B A A-499_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardioides_sp._CF8
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardiopsis_alba_(strain_ATCC_BAA-2165_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardiopsis_dassonvillei_(strain_ATCC_23218_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Nocardiopsis_sp._NRRL_B-16309
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Parascardovia_denticolens_DSM_10105_JCM_12538 (Actinobacteria_class) Actinobacteria
Propionibacterium_acidipropionici_(strain_ATCC_4875_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Propionibacterium_acnes_(strain_KPA171202_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria Propionibacterium_freudenreichii_subsp._shermanii_ (Actinobacteria_class) (strain_ATCC_9614_
Actinobacteria
Propionibacterium_propionicum_(strain_F0230a) (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Propionimicrobium_lymphophilum_ACS-093-V-SCH5 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Pse u d o n o ca rd i a_d i oxa n i vo ra n s_( st ra i n_ATCC_55486_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Renibacterium_salmoninarum_(strain_ATCC_33209_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rhodococcus_aetherivorans
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rhodococcus_equi_ATCC_33707
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rhodococcus_erythropolis_(strain_PR4_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
RhodococcusJostii_(strain_RHAl)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rhodococcus_pyridinivorans_SB3094
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rhodococcus_sp._B7740
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rhodococcus_sp._RD6.2
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Rothia_dentocariosa_(strain_ATCC_17931_
(Actinobacteria_class) Actinobacteria Rothia_mucilaginosa_(strain_DY- (Actinobacteria_class) 18)_(Stomatococcus_mucilaginosus)
Actinobacteria
Saccharomonospora_glauca_K62
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Saccharomonospora_marina_XMU15
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Saccharomonospora_viridis_(strain_ATCC_15386_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Saccharopolyspora_erythraea_(strain_ATCC_11635_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Saccharothrix_espanaensis_(strain_ATCC_51144_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Saccharothrix_sp._NRRL_B-16348
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Saccharothrix_sp._ST-888
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Sa 1 i n is po ra_t ro pi ca_(st ra i n_ATCC_B AA-916_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Sanguibacter_keddieii_(strain_ATCC_51767_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Scardovia_inopinata_F0304
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Scardovia_wiggsiae_F0424
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Segniliparus_rotundus_(strain_ATCC_BAA-972_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Stackebrandtia_nassauensis_(strain_DSM_44728_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_albulus
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
St re pto myces_a 1 b u s_(st ra i n_ATCC_21838_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_auratus_AGR0001
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_avermitilis_(strain_ATCC_31267_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_bingchenggensis_(strain_BCW-l) (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_caelestis
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_cattleya_(strain_ATCC_35852_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_clavuligerus_(strain_ATCC_27064_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
St re ptomyces_coe licolo r_(stra i n_ATCC_BAA-471_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_collinus_(strain_DSM_40733_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_cyaneogriseus_subsp._noncyanogenus (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_davawensis_JCM_4913
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_ghanaensis_ATCC_14672
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_glaucescens
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_griseoaurantiacus_M045
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_griseoflavus_Tu4000
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
Streptomyces_griseus_subsp._griseus_(strain_JCM_4626_ (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_himastatinicus_ATCC_53653
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_hygroscopicus_subsp.Jinggangensis_(strain_5008) (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_incarnatus
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_katrae
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_lydicus_A02
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_mangrovisoli
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_niveus_NCIMB_11891
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_nodosus
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_pluripotens
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_pratensis_(strain_ATCC_33331_
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_pristinaespiralis_ATCC_25486
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_rimosus_subsp._rimosus_ATCC_10970
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_roseochromogenus_subsp._oscitans_DS_12.976 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_rubellomurinus
(Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Streptomyces_scabiei_(strain_87.22) (Act¡nobacter¡a_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _( st ra i n_S i rex A A- E_ i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _(strain_SPB074) (Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Streptomyces_sp. _769
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _AA4
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
i Streptomyces_sp. _AS58
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _C
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _CNQ-509
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _el4
(Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Streptomyces_sp. _Mgl
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _MMG1121 i (Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Streptomyces_sp. _MMG1533 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp. _MUSC119T (Actinobacteria_class) i Actinobacteria
Streptomyces_sp. _MUSC136T (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
i Streptomyces_sp. _NRRL_F-4428 i (Actinobacteria_class) Actinobacteria
Streptomyces_sp._NRRL_F-6491 i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._NRRL_F-6602 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._NRRL_S-444 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._NRRL_S-495 (Actinobacteria_class)
\ Actinobacteria
Streptomyces_sp._NRRL_WC-3618 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._PBH53
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
St re pto myces_sp ._PVA_94-07
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
i Streptomyces_sp._Tu6071
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._WM4235 i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._WM6372
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._WM6378 i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sp._WM6386
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_sviceus_ATCC_29083 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_tsukubensis_NRRL18488 i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Streptomyces_variegatus
(Actinobacteria_class) Actinobacteria
Streptomyces_venezuelae_(strain_ATCC_10712 (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
,„ . , . Streptomyces vietnamensis
(Actinobactena_class) _
Actinobacteria j „ . , ,. Α Λ Λ ^
,„ . , , . Streptomyces violaceusniger Tu 4113
(Actinobacteria_class) _ _
Actinobacteria „ . . . .
Streptomyces viridochromogenes
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria ri t
Streptomyces viridochromogenes (strain DSM 40736 (Actinobacteria_class) _ _
Actinobacteria
Streptomyces xiamenensis
(Actinobacteria_class) _
Actinobacteria i „ ■ · · ^ ,,„·,
Streptomyces zinciresistens K42
(Actinobacteria_class) _
Actinobacteria ! „ , ^ . . --.„ ^
Streptosporangium roseum (stram ATCC 12428
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria ! T
Terrabacter sp. 28
(Actinobacteria class) _ _
Actinobacteria
Thermobifida_fusca_(strain_YX)
(Actinobacteria
Actinobacteria
Thermobispora_bispora_(strain_ATCC_19993
(Actinobacteria
Actinobacteria
Thermomonospora_curvata_(strain_ATCC_19995 (Actinobacteria
Actinobacteria
Trueperella_pyogenes
(Actinobacteria
Actinobacteria
Tsukamurella_paurometabola_(strain_ATCC_8368 (Actinobacteria
Actinobacteria
Turicella otitidis ATCC 51513
(Actinobacteria Actinobacteria
Verrucosispora_maris_(strain_AB-18-032)
(Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Xylanimonas_cellulosilytica_(strain_DSM_15894_ i (Actinobacteria_class)
Actinobacteria
Conexibacter_woesei_(strain_DSM_14684_
(Thermoleophilia_class)
Actinobacteria
Patulibacter_medicamentivorans
(Thermoleophilia_class)
Other-Terrabacteria 'Deinococcus solí' Cha et al. 2014
Other-Terrabacteria Deinococcus_gobiensis_(strain_DSM_21396_
Other-Terrabacteria Deinococcus_maricopensis_(strain_DSM_21211_ i Other-Terrabacteria Deinococcus_peraridilitoris_(strain_DSM_19664_
Other-Terrabacteria Deinococcus_proteolyticus_(strain_ATCC_35074_
Other-Terrabacteria Deinococcus_swuensis
Other-Terrabacteria Marinithermus_hydrothermalis_(strain_DSM_14884_
\ ARCHAEA
i Euryarchaeota
HalalkalicoccusJeotgali_(strain_DSM_18796_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Haloarcula_marismortui_(strain_ATCC_43049_ (Halobacteria)
Euryarchaeota
Halobacterium_salinarum_(strain_ATCC_700922_ i (Halobacteria)
i Euryarchaeota
Halobacterium_sp._DLl
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Haloferax_volcanii_(strain_ATCC_29605_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Halogeometricum_borinquense_(strain_ATCC_700274_ i (Halobacteria)
i Euryarchaeota
Halomicrobium_mukohataei_(strain_ATCC_700874_ (Halobacteria)
Euryarchaeota
Halopiger_xanaduensis_(strain_DSM_18323_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Haloquadratum_walsbyi_(strain_DSM_16790_ i (Halobacteria)
i Euryarchaeota
Halorhabdus_tiamatea_SARL4B
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Halorubrum_lacusprofundi_(strain_ATCC_49239_ (Halobacteria) Euryarchaeota
Halostagnicola_larsenii_XH-48
i (Halobacteria)
Euryarchaeota
Haloterrigena_turkmenica_(strain_ATCC_51198_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Natrialba_magadii_(strain_ATCC_43099_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Natrinema_pellirubrum_(strain_DSM_15624_
i (Halobacteria)
Euryarchaeota
Natrinema_sp._(strain_J7-2)
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Natronobacterium_gregoryi_(strain_ATCC_43098_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Natronococcus_occultus_SP4
i (Halobacteria)
Euryarchaeota
Natronomonas_moolapensis_(strain_DSM_18674_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Natronomonas_pharaonis_(strain_ATCC_35678_
(Halobacteria)
Euryarchaeota
Methanobacterium_lacus_(strain_AL-21)
i (Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanobacterium_paludis_(strain_DSM_25820_
(Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanobacterium_sp._MBl
(Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanobrevibacter_ruminantium_(strain_ATCC_35063_ i (Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanobrevibacter_smithii_(strain_PS_
(Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanobrevibacter_sp._AbM4
(Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanosphaera_stadtmanae_(strain_ATCC_43021_ i (Methanobacteria)
Euryarchaeota Methanothermobacter_thermautotrophicus_(strain_ATCC_29096 (Methanobacteria)
Euryarchaeota
Methanocella_arvoryzae_(strain_DSM_22066_
(Methanocellales)
Euryarchaeota
Methanocella_paludicola_(strain_DSM_17711_
i (Methanocellales)
Euryarchaeota
Methanocaldococcus Jannaschii_(strain_ATCC_43067_
(Methanococci)
Euryarchaeota
Methanopyrus_kandleri_(strain_AV19_
(Methanopyri)
Euryarchaeota
Pyrococcus_abyssi_(strain_GE5_
i (Thermococci) Euryarchaeota
Pyrococcus_furiosus_(strain_ATCC_43587_
i (Thermococci)
Euryarchaeota
Thermococcus_barophilus_(strain_DSM_11836_
(Thermococci)
Euryarchaeota
Thermococcus_gammatolerans_(strain_DSM_15229_ (Thermococci)
Euryarchaeota
Thermococcus_kodakarensis_(strain_ATCC_BAA-918_ i (Thermococci)
Euryarchaeota
Thermococcus_litoralis_(strain_ATCC_51850_
(Thermococci)
Other_archeas archaeon_GW2011_AR10
Other_archeas halophilic_archaeon_DL31
Other_archeas miscellaneous_Crenarchaeota_group-l_archaeon_SG8-32-l
Other_archeas miscellaneous_Crenarchaeota_group-6_archaeon_AD8-l
TACK-Crenoarcheota
Ae ro py r u m_pe rn ix_(st ra i n_ATCC_700893_
(Desulfurococcales) i TACK-Crenoarcheota
Hyperthermus_butylicus_(strain_DSM_5456_
(Desulfurococcales)
TACK-Crenoarcheota
lgnisphaera_aggregans_(strain_DSM_17230_
(Desulfurococcales)
TACK-Crenoarcheota
Pyrolobus_fumarii_(strain_DSM_11204_
(Desulfurococcales)
TACK-Crenoarcheota
Staphylothermus_marinus_(strain_ATCC_43588_
(Desulfurococcales)
TACK-Crenoarcheota
Thermogladius_cellulolyticus_(strain_1633)
(Desulfurococcales)
TACK-Crenoarcheota
Thermosphaera_aggregans_(strain_DSM_11486_ i (Desulfurococcales)
TACK-Crenoarcheota
Acidianus_hospitalis_(strain_Wl)
(Sulfolobales)
TACK-Crenoarcheota
Sulfolobus_acidocaldarius_(strain_ATCC_33909_
(Sulfolobales) TACK-Crenoarcheota
Sulfolobus_solfatar¡cus_(stra¡n_ATCC_35092_
(Sulfolobales)
TACK-Crenoarcheota
Sulfolobus_tokodaü_(stra¡n_DSM_16993_
(Sulfolobales)
TACK-Crenoarcheota
Cald¡v¡rga_maqu¡l¡ngens¡s_(stra¡n_ATCC_700844_
(Thermoproteales)
TACK-Crenoarcheota
Pyrobaculum_aeroph¡lum_(stra¡n_ATCC_51768_
(Thermoproteales)
TACK-Crenoarcheota
Thermof¡lum_pendens_(stra¡n_Hrk_5)
(Thermoproteales)
TACK-Crenoarcheota
Thermof¡lum_sp._1910b
(Thermoproteales)
TACK-Crenoarcheota
Thermoproteus_sp._AZ2
(Thermoproteales)
TACK-Crenoarcheota
Vulcan¡saeta_d¡str¡buta_(stra¡n_DSM_14429_
(Thermoproteales)
TACK-Thaumarchaeota Cand¡datus_Cald¡archaeum_subterraneum
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la metodología de primer aspecto de la invención se efectúa sobre una cepa procariotica perteneciente al dominio Bacteria, género Mycohacterium, preferiblemente al complejo Mycobacterium tuberculosis, o al género Streptomyces. También preferiblemente, la cepa bacteriana se refiere a otros tipos de actinobacteria, incluyendo, entre otros, Bifidobacterium, Nocardia y Rhodococcus. También la cepa se refiere al dominio Archaea incluyendo, entre otros ¡os géneros, Pyrococcus, Thermococcus y Halobacterium.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la cepa bacteriana se refiere a una bacteria seleccionada de la lista que consiste en: Mycobacterium smegmatis o Mycobacterium tuberculosis. Preferiblemente, dicha cepa bacteriana es Mycobacterium smegmatis y el locus del gen inactivado de la etapa b) es MS EG__4923. Preferiblemente, dicha cepa bacteriana es Mycobacterium tuberculosis y el método comprende la inactivación de MT _1321. Más preferiblemente, dicha cepa bacteriana es Mycobacterium tuberculosis y dicha inactivación consiste en la producción de un mutante con la regulación negativa (transcripcional y/o post-transcripcionai) de la expresión de gen nucS.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un microorganismo obtenido u obtenible por medio del método descrito en el primer aspecto de la invención.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un microorganismo perteneciente al filo Actinobacteria, preferentemente perteneciente al género Mycobactenum, más preferiblemente ai complejo de Mycobactenum tuberculosis, caracterizado porque en dicha cepa del gen o genes capaces de codificar ios nucS endonucieasa (secuencia de referencia NCBI: NP__215837.1) o una endonucieasa homologa u ortóioga están inactivados. Preferiblemente, dicha cepa bacteriana es Mycobactenum smegmatis y el locus del gen inactivado de la etapa b) es MSMEG_4923. Preferiblemente, dicha cepa bacteriana es Mycobactenum tuberculosis y el método comprende la inactivación del gen MT_1321. Más preferiblemente, dicha cepa bacteriana es Mycobactenum tuberculosis y dicho inactivación consiste en la inducción de cualquiera de ios siguientes polimorfismos en el gen MT_ 1321: S39R, A 135S, T168A, K184E y S54I.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, la cepa bacteriana es M. smegmatis me 55.
En otra realización preferida del tercer aspecto de la invención, las cepas bacterianas son M. tuberculosis H37Rv y CDC155 . Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la cepa bacteriana o microorganismo tal y como se define en el segundo o tercer aspecto de la invención.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a la cepa bacteriana o microorganismo tal y como se define en cualquiera de ios aspectos segundo a cuarto de la invención, para uso como medicamento, en particular como vacuna.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a la cepa bacteriana o microorganismo tal como se define en cualquiera de los aspectos segundo a cuarto de la invención, para uso como vacuna para la prevención de una infección con una bacteria de la misma especie que la cepa bacteriana utilizada como vacuna, preferiblemente para uso en la prevención de tuberculosis. Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método de administración de una cepa bacteriana o microorganismo tal como se define en cualquiera de los aspectos segundo a cuarto de la invención, a un ser humano para prevenir la infección.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna, que comprende las cepas bacterianas o microorganismo tal y como se define en cualquiera de los aspectos segundo a cuarto de la invención.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a un método para el cribado de fármacos, que comprende: a. Poner en contacto un fármaco, preferiblemente un antibiótico, con una cepa bacteriana hipermutable obtenida u obtenible de acuerdo con el método del primer aspecto de la invención o con una cepa bacteriana hipermutable tal como se define en cualquiera de los aspectos segundo a cuarto de la invención;
b. Determinar si dicho fármaco tiene un efecto bacteriostático o bactericida in vitro sobre la cepa bacteriana específica en el paso a); y
c. Determinar la probabilidad de la cepa hipermutable para desarrollar resistencia a los fármacos probados; y/o
d. Determinar las mutaciones que confieren resistencia, sensibilidad o tolerancia a un determinado fármaco (difícil o imposible en algunos casos con una cepa silvestre).
Un décimo aspecto de la invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método in vitro del noveno aspecto de la invención, que comprende:
(i) una cepa bacteriana o una biblioteca de cepas obtenidas u obtenibles de acuerdo con el método del primer aspecto de la invención o una cepa bacteriana tal como se define en cualquiera de los aspectos segundo a cuarto de la invención; y
(ii) opcionalmente, un fármaco o una biblioteca de fármacos a probar.
Un undécimo aspecto se refiere al uso de polimorfismos de nucS para predecir la capacidad de las cepas clínicas de Mycobacterium para desarrollar rápidamente resistencia a antibióticos durante los tratamientos.
Un duodécimo aspecto de la invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas hipervariables modificadas genéticamente mencionados en la presente invención, incluyendo bacterias y arqueobacterias, para la fermentación o para mejorar las fermentaciones, la creación de rutas híbridas para obtener nuevos metabolitos, incluyendo antibióticos, aminoácidos, pesticidas, proteínas, etc., y para la biorremediación de productos recalcitrantes.
Un último aspecto de la invención se refiere a la construcción de cepas hipervariables en las que se fuerza mediante ingeniería genética la regulación a voluntad de la expresión del gen nucS o la proteína NucS. Incluye silenciado génico transcripcional y/o post-transcripcional y cualquier otra metodología empleada a tal efecto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig 1. Tasas de mutación de resistencia a rifampicina y estreptomicina de las cepas M. smegmatis mc2155 (a) y Streptomyces coelicolor A3(2) M145 (b) y sus derivados AnucS.
Fig 2. Cambios de nucleótidos y efectos de los polimorfismos de origen natural de NucS en las tasas de mutación. Tasas de mutación a Rif-R de las cepas complementadas (calculados por el método de máxima verosimilitud de Ma, Sarkar, Sandri-mss, que se aplica en el programa FALCOR). M. smegmatis AnucS muíante se complementa con los NucS de tipo silvestre de M. tuberculosis (nucS-TB) y sus alelos mutados. Las barras indican los intervalos de confianza del 95% (IC). El cambio parcial indica el aumento de la tasa de mutación de las cepas que contiene polimorfismo con respecto a la cepa complementada con el alelo nucS de la cepa de tipo salvaje de M. tuberculosis CDC1551T
Fig 3. Comparación de secuencias y estructuras de NucS de P. abissy y M. tuberculosis. A) La alineación entre las secuencias de NucS de P. abissy y de M. tuberculosis más conservadas. Los cuadros sobre la alineación indican los dominios estructurales. Las letras en rojo indican los SNPs, las letras en púrpura indican los sitios catalíticos en la proteína de arqueas (según Ren et al. 2009). Los asteriscos indican los SNP que confiere una tasa de mutación≥ 7 veces sobre el control. Las letras o el fondo en amarillo indican los sitios de unión al ADN de la endonucleasa de P. abissy. El cuadro de color naranja muestra el dominio de interacción B- clamp. Las letras en verde indican el W esencial para la unión a ADN en la enzima de arqueas. Los residuos aminoácidicos conservados se muestran en gris oscuro. B) Representación esquemática de la ubicación y mapeo de SNP en las estructuras homodiméricas. Se muestran vistas delanteras y traseras. Los dibujos en cian es el modelo de M. tuberculosis, mientras que el gris es la proteína archeaeana. Las letras en rojo indican los SNPs analizados en este estudio. El verde es el residuo de triptófano (W) esencial para la unión al ADN en la nucleasa de P. abissy. Los dibujos en púrpura indican los sitios catalíticos mientras que la cola de unión B-clamp putativa se muestra en naranja. Fig 4. Frecuencias de recombinación de M. smegmatis mc2155 y su derivado A nucS. Se muestran resultados para identidades de secuencias de 100% y 90%. La cepa muíante A nucS tiene una mayor frecuencia de recombinantes para secuencias con 90% de identidad pero no para aquellas con 100%.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES En el contexto de la presente invención, el término "Actinobacteria" incluye, entre otras, cepas de Mycobacterium, Streptomyces, Bifidobacterium y Rhodococcus (ver lista de organismos procariotas en la tabla arriba).
En el contexto de la presente invención, los términos "Arqueobacteria" y "Archaea" incluyen, entre otras, cepas de Pyrococcus, Thermococcus y Halobactenum (ver lista de organismos procariotas en la tabla de arriba)
En el contexto de la presente invención, el término "gen MT_1321 " se entiende como la secuencia de ADN que codifica la proteína NucS en M. tuberculosis.
En el contexto de la presente invención, el término "polipéptido o proteína NP_215837.1 " se entiende como la secuencia de aminoácidos que constituye la proteína NucS en M.
tuberculosis. En el contexto de la presente invención, el término "MSMEG_4923" se entiende como la secuencia de ADN que codifica las proteínas NucS en M. smegmatis.
En el contexto de la presente invención, el término "cepa M. tuberculosis H37Rv" se entiende como la cepa modelo del complejo M. tuberculosis.
En el contexto de la presente invención, el término "cepa M. tuberculosis CDC1551 " se entiende como la cepa modelo del complejo M. tuberculosis.
En el contexto de la presente invención, los términos "S39R, A135S, R144S, T168A y K184E" se entienden como los polimorfismos indicados en la Tabla 2.
En el contexto de la presente invención, el término "cepa M. smegmatis me2 155" se entiende como la cepa modelo de M. smegmatis. En el contexto de la presente invención, el término "cepa Streptomyces coelicolor A3(2)," se entiende como la cepa modelo de S. coelicolor. En el contexto de la presente invención, el término "inactivación" se entiende como el bloqueo de la expresión de un gen específico o de una proteína, ya sea a través de modificación molecular o regulación negativa de uno o ambos. La modificación molecular incluye el uso de técnicas de ADN recombinante convencionales que a su vez incluye: la sustitución de uno o varios nucleótidos, la inserción de uno o varios nucleótidos, la deleción parcial o completa de un gen, disrupciones químicamente inducida o inducida por radiación por mutagénesis. La regulación negativa de la expresión de un gen o proteína incluye silenciado génico transcripcional y/o post-transcripcional.
En el contexto de la presente invención, el término "AnucS" se define como la ausencia de la endonucleasa NucS en la cepa bacteriana o arqueana.
En el contexto de la presente invención, el término "gen o genes que codifican para ia/s endonucleasa/s NucS" se entiende como cualquier gen con homología de secuencia de ADN o polipeptídica, obtenida esta última mediante traducción de la secuencia génica. Igualmente, cualquier gen cuyo producto polipeptídico tenga homología estructural con la proteína NucS de M. tuberculosis NP_215837.1 (Publicado en Castañeda-García et al. Nat. Comm. 2017).
En el contexto de la presente invención, el término "un gen homólogo u ortólogo de nucS" se entiende como cualquier gen con homología de secuencia de ADN o cualquier gen cuyo producto polipeptídico tenga homología de secuencia o estructural con la proteína NucS de M. tuberculosis (Publicado en Castañeda-García et al. Nat. Comm. 2017), tenga o no la actividad nucleasa definida para NucS. Preferiblemente, se consideran que dos genes son homólogos cuando comparten al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% de identidad sobre la totalidad de la secuencia aminoacidica del producto polipeptídico para el que codifica la secuencia del gen MT_1321 (polipéptido NP_215837.1) y realizan la misma función o una función similar.
En el contexto de la presente invención, el término "cepa hipermutable en comparación con una cepa en la que no se ha realizado una inactivación del gen nucS o un gen homólogo u ortólogo de nucS" se entiende como cualquier individuo procariota que poseyendo un gen homólogo u ortólogo a nucS, se ha transformado en hipermutable mediante la inactivación parcial o completa del gen nucS. En el contexto de la presente invención, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de anticuerpos de la invención o de las cepas bacterianas atenuadas de la invención que permiten producir el efecto deseado. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son portadores conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones proporcionadas por esta invención se pueden facilitar a través de cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma de dosificación adecuada y con los excipientes que son farmacológicamente aceptables para la vía de administración elegida.
En el contexto de la presente invención, el término "vacuna" se refiere a una preparación de antígeno utilizado para establecer la respuesta del sistema inmune a una enfermedad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención da a conocer los factores que promueven un fenotipo hipermutable e hiper-recombinable (genéticamente hipervariable) en actinobacterias y arqueobacterias.
En la presente invención, se analizó en primer lugar si el genoma de micobacterias podría producir alelos mulantes fuertes. Tras el cribado de una gran biblioteca de transposones en me2 155 M. smegmatis (-1 1 ,000 clones), se caracterizó una inserción en un gen {MSMEG_4923 o nucS/endoMS) que produce un fenotipo hipermutador (tasa de mutación incrementada dos órdenes de magnitud) e hiper-recombinador (aumento de un orden de magnitud de secuencias de ADN no idénticas -homeólogas) cuando se inactiva. Además, la deleción precisa del gen MSMEG_4923 produjo un aumento de la tasa de mutación (más de dos órdenes de magnitud más alta que la cepa de tipo salvaje) que podrían ser rescatado por complementación cromosómico con MSMEG_4923. El gen ortólogo, SC05388, se inactivo en Streptomyces coelicolor, mostrando el mismo fenotipo hipermutador. Este gen codifica una proteína homologa de una endonucleasa arqueana, NucS o EndoMS. El espectro mutacional del mutante nulo de nucS de M. smegmatis consiste casi exclusivamente en transiciones, en contraste con la alta variabilidad que se encuentra en la cepa de tipo silvestre. La hipermutación, la hiper-recombinación y el espectro mutacional específico de transiciones son características específicas de la inactivación del sistema MMR en especies con un sistema canónico (basado en MutS-L) de reparación de bases desapareadas. Estos resultados desvelan el primer gen anti-mutador fuerte en micobacterias, la existencia de un sistema MMR alternativo en la naturaleza, y constituyen el núcleo de la presente invención. Además, el análisis de la distribución taxonómica de NucS entre 3.942 proteomas demostró que NucS está presente en 370 organismos (60 arqueas y 310 bacterias), siendo prácticamente excluyante con utS-L (solo en 28 especies coexisten NucS y MutSL).
El análisis in silico de ¡a secuencia del gen T__1321 en « 1.800 genomas de M. tuberculosis y la secuenciación directa de 83 aislados clínicos se identificaron 10 SNPs sin sentido, cinco de ellos que confieren un fenotipo bipermufable claro, con aumentos en la frecuencia de mutantes de uno a dos órdenes de magnitud por encima del tipo silvestre, en el sistema beteróiogo de M. smegmatis. Estas observaciones se correlacionan con los de un modelado estructural integral de los SNPs, que ayuda a comprender los efectos producidos por estas mutaciones. Para predecir si algunos de estos polimorfismos podrían afectar a la actividad NucS, se desarrolló y se analizó un modelado estructural integral de estos SNPs. El modelo bacteriano de NucS (ID uniprot P9WIY5, en el que la serina-144, S144, fue sustituido por arginina, R, presente en la mayoría de las secuencias de NucS M. tuberculosis) produjo puntuaciones Z>1 en los diez mejores alineaciones de plantilla (de 2,36 a 10, 17) que indica que esta proteína se puede modelar de forma fiable. Por otra parte, el modelo presenta una topología global y correcta, y por lo tanto se puede realizar la mutagénesis in silico. La figura 3A representa la alineación estructural de NucS de la arquea P. abissy y la actinobacteria M. tuberculosis, y muestra los polimorfismos estudiados en esta invención. Los residuos de serina-39 (S39), serina-54 (S54), y la alanina-67 (A67) se encuentran en el dominio N-terminal, la región putativa de unión a ADN. S54 se encuentra en la región bisagra entre los dominios, mientras que aspártico-162 (D162), treonina-168 (T168) y lisina-184 (K184) se encuentran en el dominio C-terminal. Residuo de valina-69 (V69) se encuentra en los límites estructurales del dominio N- terminal mientras que el residuo de alanina-135 (A 135) está situado entre los dos dominios en un bucle (Figura 2B).
La mayoría de las mutaciones no tenían (1 <ΔΔΘ<0) efectos en la estabilidad de la proteína o presentaron un efecto leve (2<ΔΔΘ<1). Por otra parte, ninguno mostró enfrentamientos significativos en las energías de Van der Waals, lo que sugiere que todos los polimorfismos son adecuados para el modelado. Nuestro análisis mutacional in silico de S39R, indica que las podrían establecerse interacciones adicionales con residuos vecinos, produciendo probablemente una distorsión de la estabilidad local. La mutación S54I se encuentra en un bucle expuesto, donde no se establecen más interacciones dentro de la proteína, aunque la interacción con la prolina-68 vecina podría perderse. No se ganan o pierden interacciones en la mutación A135S. El cambio A67S crea nuevas interacciones, mientras que D162H está cambiando el sitio expuesto a un grupo reactivo. La mutación T168A ha perdido todas las interacciones con la hélice vecina R203, y la exposición también podría ser un objetivo para la fosforilación de Thr. K184E es un gran cambio en tamaño y carga y, dependiendo de la colocación espacial de E, las interacciones con Y126 podrían perderse. Por último, el polimorfismo R144S podría producir perdida de interacciones de mantenimiento de la estructura local.
Por tanto, la modelización in silico de la proteína NucS de M. tuberculosis sugiere posibles efectos de varios de los 10 polimorfismos que se encuentran en las secuencias de M. tuberculosis ensayadas. Por lo tanto, se decidió estudiar estos efectos sobre la actividad NucS en la tasa de mutación, utilizando el sistema heterólogo de M. smegmatis me2 155 AnucS. En primer lugar, probamos la capacidad del gen silvestre MT_1321 de la cepa M. tuberculosis CDC1551 (que contiene la secuencia nucS más común en las bases de datos de M. tuberculosis, nombrada aquí como nucS-JB) para rescatar el fenotipo normo-mutador en la cepa M. smegmatis me2 155 AnucS. El gen silvestre nucS de M. tuberculosis (nucS-JB) redujo la tasa de mutación de 2.36x10"7 a 4.17x10"9 (una reducción de más del 98% con respecto a M. smegmatis me2 155 AnucS), un valor prácticamente idéntico al producido por la complementación con el gen NucS-Sm (procedente de M. smegmatis). Esto demuestra que tanto nucS-JB como nucS-Sm son capaces de complementar la supresión de nucS de una manera similar (Tabla 2, Figura 2). Por lo tanto, este sistema heterólogo se puede utilizar para estudiar el efecto de los polimorfismos naturales de NucS de las cepas clínicas de M. tuberculosis en la tasa de mutación.
Para caracterizar el efecto de cada polimorfismo, el gen nucS silvestre de M. tuberculosis (nucS-JB) y los 10 nucS-JB mutagenizados, conteniendo cada uno de los polimorfismos, se integraron en el cromosoma de M. smegmatis me2 155 AnucS para medir el grado de complementación del fenotipo hipermutador. La Figura 2 muestra la variación de las tasas de mutación de resistencia a la rifampicina de las cepas complementadas relacionados con la M. smegmatis me2 155 AnucS complementada con el gen silvestre MT_1321 de la cepa de control CDC1551 (nucS-JB). Los valores de tasa de mutación se pueden encontrar en la Tabla 2. Siete alelos aumentaron la tasa de mutación más de dos veces, siendo el alelo S39R el mutador más fuerte, con un aumento de 83,7 veces sobre la cepa M. smegmatis me2 155 AnucS complementados con el silvestre nucS-JB. Los alelos A135S, T168A y K184E produjeron aumentos cerca de un orden de magnitud (8,6, 9,5 y 7,3, respectivamente). Sorprendentemente, el alelo R144S (presente en la cepa H37Rv) produce también un 7,6 veces mayor. Tres alelos, S54I, V69A, y D162H, produjeron bajos, pero estadísticamente significativo (p <0,05), aumento alrededor de 2 veces. Por último, los alelos S39G y A67S no promovieron cambios aparentes en las tasas de mutación. En resumen, la construcción de cepas genéticamente hipervariables de organismos que poseen este sistema de prevención de mutación constituye una herramienta valiosa para:
la evaluación de las adaptaciones de M. tuberculosis a los tratamientos antimicrobianos, incluyendo nuevos medicamentos, combinaciones de drogas (tanto antiguas como nuevas) y otros regímenes no basados en antibióticos.
predecir la capacidad de las cepas clínicas de M. tuberculosis para desarrollar rápidamente la resistencia a antibióticos durante los tratamientos, mediante la detección de polimorfismos conocidos en NucS.
Producir cepas genéticamente modificadas de Streptomyces para la mejora de cualquier aspecto relacionado con la producción de metabolitos de todo tipo.
En cuanto a otras especies mencionadas a través de la presente invención, incluyendo bacterias y arqueobacterias, la construcción de variantes hipervariables modificadas genéticamente serían útiles para mejorar las fermentaciones, la creación de rutas híbridas para obtener nuevos metabolitos, incluyendo antibióticos, aminoácidos, pesticidas, proteínas, etc., y la biorremediación de productos recalcitrantes.
Todos estos aspectos, así como muchos otros están claramente identificados como dentro del alcance de protección de la invención en la sección titulada "Breve descripción de la invención". El propósito de los siguientes ejemplos es simplemente para ilustrar la invención y no para limitar la misma.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Materiales y Métodos
1.1. Cepas bacterianas, medios y condiciones de crecimiento. La cepa silvestre de M. smegmatis me2 155M y sus derivados mutantes se cultivaron a 37 °C en caldo Middlebrook 7H9 o en agar Middlebrook 7H10 (Difco) con 0,5% de glicerol y 0,05% de Tween 80, y enriquecido con albúmina-dextrosa-catalasa al 10% (Difco). Para la selección de cepas, los medios se suplementaron con 25 μg/ml de kanamicina o 50 μg/ml de higromicina B, cuando fue necesario. La cepa de Escherichia coli DH5a se cultivó a 37°C en medio Luria-Bertani (LB) que contiene 50 μg/ml de kanamicina o 100 μg/ml de higromicina, cuando fue apropiado. 1.2. Generación y cribado de biblioteca de inserción M. smegmatis q>MycoMarT7. El transposón (pMycoMarT7, un sistema basado en Mariner, se utilizó para obtener inserciones aleatorias en una cepa de M. smegmatis. Para la transduccion, los cultivos de M. smegmatis me2 155 se lavaron con tampón MP (50 mM Tris-HCI pH 7,5, NaCI 150 mM, MgS04 10 mM y CaCI2 2 mM), se mezclaron con un caldo de fagos a una multiplicidad de infección de 1 : 10 y se incubaron (37°C, 3 h). Las células micobacterianas se sembraron en agar Middiebrook 7H10 con kanamicina (25 μg/ml). Los mutantes de inserción se aislaron como colonias resistentes a la kanamicina después de 3 días de incubación (37°C). Aproximadamente 11.000 clones se seleccionaron al azar y se inocularon en pocilios individuales en placas de microtitulación de 96 pocilios que contenían medio Middiebrook 7H9. Para identificar las cepas hipermutadoras, 10μΙ de cada muíante se inocularon en placas de agar 7H10suplementado con varias concentraciones de rifampicina (5, 10 y 20 μg/ml) que contenían el transposón. Los clones que mostraron mayor número de colonias de resistencia a la rifampicina (RIF-R) frente a la cepa de tipo silvestre se ensayaron de nuevo dos veces y se seleccionaron para una caracterización adicional.
1.3. Localización del sitio de inserción del transposón q>MycoMarT7. Para determinar la posición de inserción del transposón en el cromosoma de M. smegmatis, el ADN genómico purificado a partir de cada muíante seleccionado se digirió con fíamHI y religado con ADN ligasa de T4. Los plásmidos auío-ligados coníenían iodo el transposón además del ADN cromosómico junto al sitio de inserción. Los plásmidos recircularizados se sometieron a electroporación en E. coli DH5a λ pir116 y se seleccionaron en LB con kanamicina (50 μg/ml). Después de la purificación, los plásmidos se secuenciaron usando un cebador MycoMar- específico (SecMycomar) que se híbrida al lado de la unión transposón/cromosoma. Las secuencias de ADN adyacentes a cada sitio de inserción se compararon con la secuencia del genoma M. smegmatis para identificar el gen interrumpido.
1.4. Estimación de las tasas de mutación. Se utilizó un análisis de fluctuación Luria-Delbruck para calcular la tasa de mutación de diversos ensayos de mutación. La tasa de mutación se estimó mediante el método de Lea-Coulson de la mediana, que se aplicó con el programa FALCOR. Para cada experimento de tasa de mutación, se iniciaron 10-30 cultivos independientes en 1 mi de caldo de Middiebrook 7H9 y el crecimiento durante 24 h (M. smegmatis), hasta que llegaron a 107-108 células/ml. Cada cultivo se diluyó con el fin de inocular 1000-10000 células/ml en 5ml de medio fresco Middiebrook 7H9, evitando cualquier muíante espontáneo aníerior en los culíivos finales. Todos los culíivos se incubaron a 37 °C con agiíación duraníe 1-2 días (M. smegmatis) hasía que alcanzaron la fase esíacionaria (108- 109 células/ml) y se sembraron en medio Middiebrook 7H10 con aníibióíicos: rifampicina 100 μg/ml; esírepíomicina, 50 μg/ml.
En el caso de Streptomyces coelicolor, se partió de 20 suspensiones independieníes de esporas ( <109 sporas/ml) generadas en MS agar. Esías suspensiones se plaquearon en MS agar con y sin rifampicina (100 μg/ml) o esírepíomicina (50 μg/ml). 1.5 Generación de mutantes knockout en nucS. Los mutantes de deleción M. smegmatis A nucS (MSMEG_4923, nucS-Sm) y Streptomyces coelicolor A3(2) M145 AnucS (SC05388, nucS-Sco) se generaron por sustitución alélica. Brevemente, para el muíante M. smegmatis AnucS, se construyó el plásmido p2NIL-AMSMEG_4923, con una deleción en fase de nucS. El plásmido fue introducido por electroporación en M. smegmatis me2 155. Se seleccionaron clones con doble "cross-over" y se chequearon por PCR y secuenciacion.
1.6. Análisis de polimorfismos en nucS de cepas de M. tuberculosis. Las secuencias del producto génico MT_ 1321 se descargaron de la base de datos Ensembl (http://bacteria.ensembl.org/index.html), los recursos del varioma de Mycobacterium tuberculosis (http://genome.igib.res.in/tbvar/) y datos de Comas et al. Sólo se consideraron las proteínas completas que no mostraron cambios. Alrededor de 1.000 proteínas fueron alineados utilizando MAFFT. El análisis de todas las secuencias de nucS en las bases de datos de cepas clínicas de M. tuberculosis rindió la existencia de 9 mutaciones simples de cambio de secuencia de aminoácidos. Además, se estudiaron las secuencias de nucS en 63 cepas aisladas de hospitales. Las cepas se caracterizaron en términos de su perfil de sensibilidad a los antibióticos y su genotipado en huella de ADN (RFLP y spoligotyping). Las cepas clínicas fueron divididas en dos grupos: las cepas de TB totalmente sensibles a la droga y las cepas de tuberculosis resistentes a múltiples fármacos, resistente al menos a isoniacida y rifampicina. Un número seleccionado al azar de 30 cepas de cada grupo se eligieron para su posterior análisis. En estas cepas, la secuencia nucS de M. tuberculosis se amplificó mediante PCR, incluyendo la región aguas arriba con su promotor, y se secuenció para identificar cualquier SNP en el ORF MT_1321 y/o la región promotora. Solo se encontró una mutación de cambio de aminoácido. En total se encontraron y estudiaron 10 polimorfismos en NucS.
1.7. Mutagénesis dirigida al sitio. Las 10 mutaciones puntuales específicas se introdujeron en el gen nucS de la cepa control de M. tuberculosis CDC1551 por mutagénesis dirigida al sitio, usando procedimientos estándar. Brevemente, la secuencia del gen nucS MT_1321 de tipo silvestre se amplificó por PCR y se clonó en pUC19 para ser utilizado como molde para la PCR mutagénica. Las mutaciones específicas individuales se introdujeron en nucS por PCR (18 ciclos de amplificación) utilizando la polimerasa Q5 (NEB) con los pares de cebadores mutagénicos apropiados. Después de la reacción PCR, una digestión Dpnl se llevó a cabo durante 4 horas a 37 °C. Los plásmidos mutagenizados obtenidos después de la transformación DH5a se verificaron por secuenciacion de ADN. Todos los alelos nucS (con diferentes mutaciones puntuales) se volvieron a clonar en pMV361 para generar un conjunto de plásmidos de complementación. Para poner a prueba la eficacia de cada alelo nucS para restaurar las tasas de mutación normales, los alelos mutados fueron integrados en el cromosoma y se expresaron en M. smegmatis AnucS. La inserción correcta de los alelos se verificó mediante PCR y secuenciacion. 1.8. Análisis computacional de la proteína MT_1321. Dada la ausencia de datos estructurales para la proteína NucS de M. tuberculosis, la structura 3D de la proteína NucS de P. abyssi (PDB 2VLD chain B) fue usada como molde para nuestra modelización mediante I- TASSER (Fig. 3). Esta estructura está compuesta de dos regiones distintas: la N-terminal de unión a AND (aminoácidos 1-1 14) y la región catalítica C-terminal (aminoácidos 126-233). El molde y el modelo fueron alineadas estructuralmente usando el algoritmo Combinatorial Extensión (CE), construido con PyMOL para identificar residuos relevantes.
Cambio de Tasa de
95% Cl cambio (veces) aminoácido Cambio de Mut
codón mc2155 AnucS complementado con nucS de M. tuberculosis nuc TB-WT WT (silvestre) 4.17x10"9 3.29-5.12x10"9 1 a
S39R AGC→AGG 3.49x10"7 2.93-4.0x10"7 83.7
S39G AGC→GGC 4.93x10"9 3.79-6.15x10"9 1.2
S54I AGT→ATT 7.94x10"9 5.49-11.07x10"9 1.9
A67S GCG→TCG 2.78x10"9 1.87-3.84x10"9 0.7
V69A GTG→GCG 8.77x10"9 6.50-1 1.2x10"9 2.1
A135S GCG→TCG 3.57x10"8 2.77-4.38x10"8 8.6
R144S (H37Rv) CGC→AGC 3.16x10"8 2.40-4.0x10"8 7.6
D162H GAC→CAC 8.98x10"9 6.42-1 1.80x10"9 2.2
T168A ACC→GCC 3.96x10"8 3.09-4.81x10"8 9.5
K184E AAG→GAG 3.06x10"8 2.37-3.75x10"8 7.3
M. smegmatis mc2155 mc2155 wt 4.57x10"10 2.51-7.37x10"10 1 b deleción
mc2155 AnucS precisa de 2.36x10"7 2.07-2.63x10"7 516.3
nucS mc2155 Complem.
8.13x10"9 6.03-10.50x10"9 17.81
AnucS/Sm-nucS Con nucS-Sm
Tabla 2 Ejemplo 2. Resultados
2.1. Identificación y caracterización de un nuevo gen antimutador.
Para explorar si el genoma de micobacterias puede albergar alelos hipermutadores fuertes, se generó una extensa biblioteca de mutantes de transposón, que consistía en ~ 1 1.000 clones independientes de M. smegmatis me2 155, y se cribó para los clones hipermutables. Un muíante, con una inserción localizada en el gen MSMEG_4923, mostró un fuerte aumento de la tasa de mutación de resistencia a la rifampicina (RIF-R). La Búsqueda en Blast de la secuencia de proteína traducida rindió un 22,78% de identidad con NucS de la archaea hipertermofila Pyrococcus abissy (http://www.uniprot.org/blast/). El gen homólogo de M. tuberculosis H37Rv RV_1321 presentó una identidad de 26,9% con NucS de P. abissy. Artículos previos definieron NucS de P. abissy como el primer miembro de una nueva familia de endonucleasas con, un papel importante en la reparación y/o replicación de ADN, aunque sin definir hasta ahora..
Se generó una cepa de M. smegmatis me2 155 que albergaba una deleción precisa del gen MSMEG_4923 , produciendo la cepa M. smegmatis AnucS. La cepa de tipo silvestre mostró una tasa de mutación de resistencia a la rifampicina (RIF-R) de 4.57x10"10 mientras que la del M. smegmatis AnucS fue 2.36x10"7 (516 veces mayor) (Figura 1A). La complementación cromosómica de esta deleción con el gen de tipo silvestre MSMEG_4923 rindió una tasa de mutación de 8.13x10"9, lo que significa una complementación de más de 96%, lo que demuestra una función anti-mutadora para este gen. . De igual forma, un muíante A nucS en S. coelicolor rinde un aumento de la íasa de muíación para resisíencia a rifampicina y esírepíomicina de dos órdenes de magniíud (Fig 1 B).
2.2. Caracterización del espectro mutacional de la deleción nucS
El especíro muíacional conferido por la eliminación nucS se caracíerizó por la secuenciación de la región que deíermina la resisíencia a rifampicina (RRDR) en el gen diana rpoB en los muíaníes independieníes 41 y 41 Rif-R íanío de M. smegmatis me2 155 como de su derivado AnucS. Mieníras que las muíaciones esponíáneas Rif-R en la cepa de íipo silvesíre represenían difereníes susíiíuciones de bases, incluyendo íransiciones, íransversiones y una deleción en fase, íodas las muíaciones en AnucS fueron específicameníe íransiciones (A:T→G:C o G:C→A:T), lo que sugiere una acíividad muy específica de NucS para eviíar la muíación.
2.3. Búsqueda de polimorfismos nucS en las bases de datos de secuencias. Para buscar posible hipermutadores entre las cepas clínicas de M. tuberculosis, el gen MT_ 1321 de todas las cepas secuenciadas de M. tuberculosis se exploró usando la base de datos EnsembI (http://bacteria.ensembl.org/index.html), El recurso del varioma Mycobacterium tuberculosis v (http: //genome.igib.res.in/tbvar/) y los datos se obtuvo de Comas et al. Se encontraron un total de 9 polimorfismos de cambio de sentido. Curiosamente, uno de ellos (que conduce al cambio de aminoácido R144S) apareció en un total de varias secuencias independientes, entre ellos el de la clásica cepa modelo de control H37Rv. Por lo tanto, decidimos designar la secuencia más común como el gen de tipo silvestre e incluimos el cambio R144S, presente en H37Rv, como el polimorfismo adicional. Por otra parte, la búsqueda de polimorfismos entre M. tuberculosis clínicos aislados se realizó en dos colecciones bien caracterizadas. El gen MT_1321 de 63 aislamientos, incluyendo 23 susceptible y 40 cepas resistentes a múltiples fármacos, se amplificó por PCR con cebadores específicos. La secuenciación de los productos mostró que cuatro de ellos contenían una mutación en el gen MT_1321 que conduce al cambio Ser39-Gly en la proteína codificada. 2.4. Análisis computacional de los polimorfismos de NucS
Para predecir si algunos de los polimorfismos podrían afectar a la actividad NucS, se desarrolló y se analizó un modelado estructural integral de estos SNPs. El modelo bacteriano de NucS (P9WIY5 ID uniprot, en el que la serina-144, S144, fue sustituido por arginina, R, presente en la mayoría de las secuencias de NucS M. tuberculosis) produjo puntuaciones Z>1 en los diez mejores alineamientos (de 2,36 a 10, 17) lo que indica que esta proteína se puede modelar de forma fiable. Por otra parte, el modelo presenta una topología global y correcta, y por lo tanto la mutagénesis in silico se puede realizar. La figura 2A representa la alineación estructural de NucS de P. abissy y M. tuberculosis, que muestra los polimorfismos estudiados en este trabajo. Los residuos de serina-39 (S39), serina-54 (S54), y la alanina-67 (A67) se encuentran en el dominio N-terminal, la región putativa de unión a ADN. S54 se encuentra en la región bisagra entre los dominios, mientras que aspártico-162 (D162), treonina-168 (T168) y lisina-184 (K184) se encuentran en el dominio C-terminal. El residuo de valina-69 (V69) se encuentra en los límites estructurales del dominio N-terminal mientras residuo de alanina-135 (A 135) está situado entre los dos dominios en un bucle (Figura 2B). La mayoría de las mutaciones no tenían (<ΔΔΘ<0) o presentaron leves (2<ΔΔΘ<1) efectos en la estabilidad de proteínas, según se midió en términos totales. Por otra parte, ninguno mostró enfrentamientos significativos en las fuerzas de Van der Waals, lo que sugiere que todos los polimorfismos son adecuados para el modelado. Nuestro análisis mutacional in silico de S39 a R, indica que las interacciones adicionales podrían establecerse con residuos de vecinos, es probable que produce una distorsión de la estabilidad local. La mutación S54I se encuentra en un bucle expuesto, donde no se establecen más interacciones dentro de la proteína, aunque la interacción con la prolina-68 vecina podría perderse. No se ganan o pierden interacciones en la mutación A135S. El cambio A67S crea nuevas interacciones dentro de las hojas, mientras que D162H está cambiando el sitio expuesto a un grupo reactivo. La mutación T168A ha perdido todas las interacciones con la hélice vecina R203, y la exposición también podría ser un objetivo para la fosforilación de Thr. K184E es un gran cambio en tamaño y carga y, dependiendo de la colocación espacial de E, las interacciones con Y126 podría perderse. Por último, el polimorfismo R144S podría producir perdida de interacciones de mantenimiento de la estructura local.
2.5. Efecto de los polimorfismos de nucS de M. tuberculosis sobre la tasa de mutación.
La modelización in silico de la proteína nucS de M. tuberculosis sugiere posibles efectos de varios de los 10 polimorfismos que se encuentran en las secuencias de M. tuberculosis ensayadas. Por lo tanto, se decidió estudiar estos efectos sobre la actividad antimutadora de NucS, comprobando su efecto sobre la tasa de mutación, utilizando el sistema heterólogo de M. smegmatis mc2155 AnucS. En primer lugar, hemos probado la capacidad del gen silvestre MT_1321 de la cepa CDC1551 de M. tuberculosis (que contiene la secuencia nucS más común en las bases de datos de M. tuberculosis) para rescatar el fenotipo normo-mutador en la cepa M. smegmatis me2 155 AnucS. El gen silvestre nucS de M. tuberculosis (nucS-J ) redujo la tasa de mutación de 2.36x10"7 a 4.17x10"9 (una reducción de más del 98% de la tasa de mutación de la M. smegmatis me2 155 AnucS. Esto demuestra que tanto nucS-JB como nucS- Sm (procedente de M. smegmatis) son capaces de complementar la supresión de nucS de una manera similar. Por lo tanto, este sistema heterólogo se puede utilizar para estudiar el efecto de los polimorfismos de nucS de M. tuberculosis en la tasa de mutación.
Para caracterizar el efecto de cada polimorfismo, el gen nucS silvestre de M. tuberculosis (nucS-TB) y los 10 nucS-TB mutagenizados conteniendo cada uno de los polimorfismos se integraron en el cromosoma de M. smegmatis me2 155 AnucS para medir el grado de complementación del fenotipo hipermutador. La Figura 2 muestra la variación de las tasas de mutación de resistencia a la rifampicina de las cepas complementadas relacionados con la M. smegmatis me2 155 AnucS complementada con el gen silvestre MT_1321 de la cepa de control CDC1551. Los valores de tasa de mutación se pueden encontrar en la Tabla 1. Siete alelos aumentaron la tasa de mutación más de dos veces, siendo el alelo S39R el mutador más fuerte, con un aumento de 83,7 veces sobre la cepa M. smegmatis me2 155 AnucS complementados con el silvestre nucS-TB. Los alelos A135S, T168A y K184E produjeron aumentos cerca de un orden de magnitud (8,6, 9,5 y 7,3, respectivamente). Sorprendentemente, el alelo R144S (presente en la cepa H37Rv) produce también un 7,6 veces mayor. Tres alelos, S54I, V69A, y D162H, produjeron bajos, pero estadísticamente significativo (p <0,05), aumento alrededor de 2 veces. Por último, los alelos S39G y A67S promovieron cambios aparentes en las tasas de mutación.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método in viíro para la producción de cepas de microorganismos pertenecientes a ios dominios Bacteria o Archaea hipermutables, que comprende:
a. Identificación de ¡a existencia del gen o genes que codifican para ía/s endonucleasa/s NucS (secuencia de referencia NCBI: NP__215837, 1), o de un gen/es homólogo u ortólogo de nucS (secuencia de referencia MT_1321), en un microorganismo perteneciente a los dominios Bacteria o Archaea; y b. inactivar dichos gen o genes; donde la inactivación de dicho gen/es hace que dicha cepa sea hipermutable en comparación con una cepa en la que no se ha realizado tal inactivación,
2. El método según la reivindicación 1 , donde el microorganismo es una actinobacteria o una arqueobacteria.
3. El método según la reivindicación 2, donde la cepa es una actinobacteria.
4. El método según la reivindicación 3, donde la cepa pertenece ai genero Mycobactenum, preferiblemente ai complejo Mycobactenum tuberculosis.
5. El método según la reivindicación 4, donde la cepa se selecciona de la lista que consiste en: Mycobactenum smegmatis y Mycobactenum tuberculosis.
6. El método según la reivindicación 5, donde dicha cepa es Mycobactenum smegmatis y el iocus del inactivado de la etapa b) es ÍV1SMEG__4923.
7. El método según la reivindicación 5, donde dicha cepa es Mycobactenum tuberculosis y el método comprende !a inactivación del gen, según la etapa b), MT_1321.
8. E¡ método según la reivindicación 7, donde dicha inactivación consiste en la producción de cualquiera de ios siguientes polimorfismos en la proteína NP_215837.1 : S39R, A135S, R144S, T188A y K184E o cualquiera de sus combinacionaciones.
9. El método según la reivindicación 3, donde dicha inactivación consiste en la deleción total o parcial del gen nucS.
10. El método de ¡a reivindicación 3, donde la cepa pertenece al género Sireptomyces.
1 1. El método de la reivindicación 3, donde la cepa se selecciona de la lista que consiste en cualquiera de las siguientes especies bacterianas: Streptomyces ssp, Bifidobacterium, Nocardia y Rhodococcus.
12. Una cepa obtenida u obtenible por medio del método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Una cepa perteneciente a los dominios Bacteria o Archaea, caracterizado porque en dicha cepa el/los gen o genes capaces de codificar la endonucleasa NucS (NCBI secuencia de referencia: NP_215837.1), o un gen/es homólogos u ortólogos de nucS, están inactivados parcial o totalmente.
14. La cepa de la reivindicación 13, donde la cepa bacteriana es Mycobacterium tuberculosis y el método comprende la inactivación del gen MT_ 1321, según la etapa b).
15. La cepa bacteriana de la reivindicación 14, donde dicha inactivación consiste en la inducción de cualquiera de los siguientes polimorfismos en el gen MT_ 1321: S39R,
A 135S, R144S, T168A y K184E, o de cualquiera de sus combinaciones.
16. La cepa bacteriana de la reivindicación 13, donde dicha inactivación consiste en la deleción total o parcial del gen nucS.
17. La cepa bacteriana de la reivindicación 13, donde la cepa bacteriana es Mycobacterium smegmatis y el gen inactivado es MSMEG_4923.
18. La cepa bacteriana de la reivindicación 17, donde la cepa bacteriana es M. smegmatis me2 155.
19. La cepa bacteriana de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la cepa bacteriana es M. tuberculosis H37Rv y CDC1551.
20. Una cepa bacteriana seleccionada de la lista que consiste en cualquiera de las especies bacterianas siguientes: Streptomyces ssp, Bifidobacterium, Nocardia o Rhodococcus, caracterizado porque en dicha cepa el gen o genes capaces de codificar la endonucleasa NucS (NCBI secuencia de referencia: NP_215837.1), o un gen/es homólogo u ortólogo de nucS (secuencia de referencia T_1321), están inactivados.
21. Una composición que comprende la cepa tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.
22. Una cepa bacteriana tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, para su uso como medicamento, en particular como vacuna.
23. Uso de una cepa bacteriana tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, para su uso en la elaboración de una vacuna para la prevención de una infección con una bacteria de la misma especie que la cepa bacteriana utilizada como vacuna.
24. Una composición farmacéutica que comprende las cepas bacterianas tal y como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.
25. Un método para la detección de resistencia a drogas, que comprende:
a. Poner en contacto un fármaco, preferiblemente un antibiótico, con una cepa bacteriana obtenida u obtenible de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ;
b. Determinar si este fármaco tiene un efecto bacteriostático o bactericida in vitro sobre la cepa bacteriana específica de la etapa a); y
c. Determinar la probabilidad de la cepa hipermutable de desarrollar resistencia a los fármacos probados.
d. Determinar las mutaciones que confieren resistencia, sensibilidad o tolerancia a un determinado fármaco.
26. Un kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 25, que comprende:
(i) una cepa bacteriana o una biblioteca de cepas obtenidas u obtenibles de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 ; y
(ii) opcionalmente un fármaco o una biblioteca de fármacos para la prueba.
27. Uso in vitro del kit de la reivindicación 26 para llevar a cabo el método de la reivindicación 25.
28. Uso de ¡a cepa tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 para la fermentación de cualquier tipo de metabolito, incluido los antibióticos.
29. Uso de la cepa tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 para bioremediación.
30. Uso in vitro de la cepa tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, para la fermentación o para mejorar las fermentaciones, la creación de rutas híbridas para obtener nuevos metabolitos, incluyendo antibióticos, aminoácidos, pesticidas, proteínas, etc., y para la biorremediación de productos recalcitrantes.
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