WO2017112988A1 - Moléculas com núcleo híbrido, composição farmacêutica, processo de síntese e seus usos - Google Patents

Moléculas com núcleo híbrido, composição farmacêutica, processo de síntese e seus usos Download PDF

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hybrid
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Marco Antonio CESCHI
Leandra FRANCISCATO CAMPO
Carlos Alberto SARAIVA GONÇALVES
Eduardo Luis KONRATH
Jesse SOBIESKI DA COSTA
Daniela FRAGA DE SOUZA
João Paulo BIZARRO LOPES
Viktor SARAIVA CÂMARA
Laurent Emmanuel DARDENNE
Isabella ALVIM GUEDES
Ana Luiza MARTINS KARL
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Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul
Laboratório Nacional De Computação Científica-Lncc
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    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Definitions

  • the present invention describes hybrid core molecules based on tetrahydroacridine and thianeptin nuclei, separated by methylene spacer chains via coupling reaction, a pharmaceutical composition comprising these molecules, a process for synthesizing these molecules, and their uses.
  • the present invention is in the fields of Medicinal Chemistry, Pharmacology and Medicine.
  • AD Alzheimer's disease
  • tacrine TAA
  • 9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine Figure 1
  • AD Alzheimer's disease
  • hybrid molecules are an important strategy in designing the architecture of a new drug prototype from the combination of defined structural and biological characteristics of distinct compounds.
  • This strategy makes it possible to add different pharmacophoric groups to the hybrid and thus simultaneously modulate multiple targets of multifactorial diseases such as Alzheimer's disease.
  • Such a strategy usually involves the synthesis of hybrid compounds having in a single molecule two or more nuclei of pharmacological interest, of which one is generally the acetylcholinesterase (AChE) inhibitor type (WO2004032929-A2).
  • AChE acetylcholinesterase
  • the tacrine nucleus is most commonly incorporated into these compounds as an AChE CAS site inhibitor.
  • Interest in these molecules was driven by contributions from Pang et al., Who demonstrated the excellent performance of compounds with double simultaneous interaction with AChE CAS and PAS (peripheral anionic site) (Pang, YP; Quiram, P .; Jelacic, T .; Hong, F.; Brimijoin, S., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23646), as well as against the notes of Inestrosa et al (Inestrosa, N.
  • AChE and BuChE constitute the group of cholinesterases.
  • AChE is mainly found in neuronal synapses.
  • BuChE is synthesized by the liver and is found in large quantities in serum.
  • Acetylcholinesterase among other physiological functions, acts on postsynaptic cells, performing acetylcholine hydrolysis and terminating nerve impulse transmission.
  • the physiological function of BuChE is not yet well known, but its participation in the regulatory mechanism of AChE levels in the cholinergic synapse is suggested.
  • the observation that the BuChE / AChE ratio increases with AD progress, with the significant increase in BuChE in the hippocampus and temporal cortex, should favor the use of inhibitors.
  • BuChE treatments in treatments of moderate to advanced forms of AD (Giacobini, E., Pharmacol. Res. 2004, 50, 433).
  • Tianeptin (Stablon ® ), 7- (3-chloro-6-methyl-6,11-dihydrodibenzo [c, f [1,2] thiazepin-1-ylamino) heptanoic acid S, S-dioxide, is a tricyclic class antidepressant drug and is a derivative of the thiazepine nucleus, more specifically a dioxodibenzo [1,2] thiazepine derivative, containing two fused benzene rings and the 7-aminoeptanoic acid side chain. This drug was synthesized at the Servier Institute, France, and first described in FR 2104728.
  • Tianeptin has properties such as neuroprotective antidepressant and anxiolytic. (Guzman, et al., 2009, WO / 2010/051239; Blanchard, 2002, US Patent 6,441, 165; Huet De Barochez & Wuthrich, 1999, US Patent 5,888,542).
  • thianeptin regulates calcium intake by preventing over stimulation of AMPA receptors and modulates NMDA receptor activity by normalizing their activity in the hippocampus, characteristics that are related to aging for Alzheimer's disease (reviewed in Mcewen, BS; Chattarji, S ; Diamond, DM; Jay, TM; Reagan, LP; Svenningsson, P.; Fuchs, E., Mol. Psychiatry. 2010, 15, 237).
  • Glial activation releases a variety of proinflammatory cytokines that contribute to neuronal dysfunction (Khansari, N.; Shakiba, Y; Mahmoudi, M., Recent Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov. 2009, 3, 73 ). Elevated levels of S100B, a glia-derived protein, have been observed in patients' CSF in the early stages of Alzheimer's disease (Peskind, ER; Griffin, W. S; Akama, KT; Raskind, MA; Van Eldik, LJ, Neurochem.
  • the present invention aims to solve the constant problems in the state of the art from a novel hybrid nucleus molecule based on tetrahydroacridine and thianeptin nuclei, separated by methylene spacer chains via coupling reaction.
  • hybrid core molecules having the following structure:
  • X2 and X3 are independently selected from the halogen groups, OH, OR, HS, SR, NH 2 , NH, NHR or other leaving groups, or electron donors, where R is selected from alkyl, aryl, allyl, benzyl or propargyl;
  • R 1 and R 2 are independently selected from the groups H, alkyl, aryl, allyl benzyl or propargyl;
  • n and m can range from 1 to 20.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising hybrid core molecules having the following structure:
  • - Xi, X 2 and X 3 are independently selected from the halogen groups, OH, OR, HS, SR, NH 2 , NH, NHR or other electron withdrawing or donor groups, where R is selected from the alkyl groups. aryl, allyl, benzyl or propargyl;
  • R 1 and R 2 are independently selected from the groups H, alkyl, aryl, allyl benzyl or propargyl;
  • n and m can range from 1 to 20.
  • the present invention discloses a hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction, and wherein the hybrid core molecule has the following structure: on what:
  • X2 and X3 are independently selected from the halogen groups, OH, OR, HS, SR, NH 2 , NH, NHR or other electron withdrawing or donor groups, where R is selected from the alkyl, aryl groups allyl, benzyl or propargyl;
  • R 1 and R 2 are independently selected from the groups H, alkyl, aryl, allyl benzyl or propargyl;
  • n and m can range from 1 to 20.
  • the present invention discloses the use of said hybrid core molecules to inhibit cholinesterase enzymes.
  • the present invention discloses the use of said hybrid core molecules to decrease secretion of at least one glial protein.
  • the present invention discloses the use of said hybrid core molecules in the preparation of a medicament for treating Alzheimer's disease.
  • inventive concept common to all claimed protection contexts is hybrid core molecules based on tetrahydroacridine and thianeptin nuclei, separated by methylene spacer chains via coupling reaction.
  • Figure 1 shows the structures of the tacrine and thianeptin molecules.
  • Figure 2 shows the structure of bis (n) -tacrine.
  • Figure 3 shows 1 H NMR spectra (CDCl 3 , 300
  • Figure 4 shows the 1 H NMR spectra (300 MHz
  • Figure 5 shows the 1 H NMR spectra (300 MHz
  • Figure 6 shows the 1 H NMR spectra (300 MHz
  • Figure 7 shows a scheme of formation of intermediates 2a, 2b, and 2c.
  • Figure 8 shows an illustrative scheme of the coupling reaction.
  • Figure 9 shows the binding modes of inhibitor (f) -1a complexed with the 2ckm conformation of AChE.
  • Figure 10 shows the binding modes of inhibitor (S) -1a complexed with AChE conformation 1 q83.
  • hybrid nucleus molecules having the following structure: on what:
  • X2 and X3 are independently selected from the halogen groups, OH, OR, HS, SR, NH 2 , NH, NHR or other electron withdrawing or donor groups, where R is selected from the alkyl, aryl groups allyl, benzyl or propargyl;
  • R 1 and R 2 are independently selected from the groups H, alkyl, aryl, allyl benzyl or propargyl;
  • n and m can range from 1 to 20.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising hybrid core molecules having the following structure:
  • - , ⁇ , X 2 and X 3 are independently selected from the halogen groups, OH, OR, HS, SR, NH 2 , NH, NHR or other electron withdrawing or donor groups, where R is selected from the alkyl groups, aryl, allyl, benzyl or propargyl;
  • R 1 and R 2 are independently selected from the groups H, alkyl, aryl, allyl benzyl or propargyl;
  • n and m can range from 1 to 20.
  • the present invention provides a hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction, and wherein the hybrid core molecules have the following structure:
  • - Xi, X 2 and X 3 are independently selected from the halogen groups, OH, OR, HS, SR, NH 2 , NH, NHR or other electron withdrawing or donor groups, where R is selected from the alkyl groups. aryl, allyl, benzyl or propargyl;
  • R 1 and R 2 are independently selected from the groups H, alkyl, aryl, allyl benzyl or propargyl;
  • n and m can range from 1 to 20.
  • the present invention discloses the use of said hybrid core molecules to inhibit cholinesterase enzymes. In a fifth object, the present invention discloses the use of said hybrid core molecules to decrease secretion of at least one glial protein.
  • the present invention discloses the use of said hybrid core molecules in the preparation of a medicament for treating Alzheimer's disease.
  • the present invention discloses said molecules.
  • X is Cl or hydrogen
  • - "n" ranges from 3 to 5.
  • the present invention discloses said hybrid core molecules wherein said molecules inhibit cholinesterase enzymes.
  • the present invention discloses said hybrid core molecules wherein said molecules are capable of decreasing the secretion of at least one glial protein.
  • the present invention discloses said hybrid core molecules wherein said molecules are capable of decreasing S100B secretion.
  • the present invention discloses said hybrid core molecules for use in the preparation of a medicament for treating Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising said hybrid core molecules at a concentration of from 0.01 ⁇ 0,1 to 0.1 ⁇ .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising said hybrid core molecules which is capable of inhibiting cholinesterase enzymes.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising said hybrid core molecules which is capable of decreasing the secretion of at least one glial protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising said hybrid core molecules which is capable of decreasing S100B secretion.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising said hybrid core molecules for use in the preparation of a medicament for treating Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising said hybrid core molecules, wherein the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention discloses said hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction and a coupling reagent.
  • the present invention provides said hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction and a coupling reagent selected from 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and dicycloexylcarbodiimide (DCC).
  • the present invention discloses said hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction, the 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide coupling reagent ( EDC) and the additive 1-hydroxy-1H-benzotriazole (HOBt).
  • the present invention provides said hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction, the dicycloexylcarbodiimide coupling reagent (DCC) and the dimethylaminopyridine catalyst (DMAP).
  • DCC dicycloexylcarbodiimide coupling reagent
  • DMAP dimethylaminopyridine catalyst
  • the present invention provides said hybrid core molecule synthesis process, wherein the process comprises a coupling reaction in a solvent selected from chloroform, dichloromethane, toluene, acetonitrile, dimethylformamide (DMF) and tetrahydrofuran (THF).
  • a solvent selected from chloroform, dichloromethane, toluene, acetonitrile, dimethylformamide (DMF) and tetrahydrofuran (THF).
  • the present invention features the use of said hybrid core molecule to decrease secretion of S100B.
  • the pharmaceutical composition in a pharmaceutically acceptable carrier, could assist in the treatment of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, and also with multifactorial use for other disorders, including oxidative stress, which has a neurodegenerative effect.
  • the drugs tacrin and tianeptin were chosen as structural nuclei for the synthesis of new tacrin-thianeptin hybrids, with the purpose of aggregating new enzyme-substrate interactions and also aggregating different bioactive pharmacophoric groups in the same compound.
  • the hybrid preparation process according to the present invention is based on the coupling reaction between thianeptine and 9-alkylamino-1,2,3,4-tetrahydroacridines in the presence of a coupling reagent, such as 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) together with 1-hydroxy-1H-benzotriazole (HOBt) additive or use of reagent dicyclohexylcarbodiimide (DCC) using dimethylaminopyridine (DMAP) as a catalyst.
  • a coupling reagent such as 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) together with 1-hydroxy-1H-benzotriazole (HOBt) additive or use of reagent dicyclohexylcarbodiimide (DCC) using dimethylaminopyridine (DMAP) as a catalyst.
  • the tacrine-thianeptine hybrids were evaluated as inhibitors of cholinesterase enzymes AChE and BuchE.
  • the impact of these compounds on cellular integrity was also evaluated by measuring the enzyme Lactic Dehydrogenase (LDH).
  • LDH Lactic Dehydrogenase
  • Thianeptin was extracted from Stablon ® tablets. Stablon tablets were macerated, dissolved in tetrahydrofuran (THF) and stirred for 30 minutes. The solution was filtered and then concentrated on a rotary evaporator. The resulting crude product was purified by silica gel column chromatography, using as eluent mixture CHCl 3 -MeOH-NH 4 OH with gradient mode elution; initial ratio 93: 6.5: 0.5 to 80: 19.5: 0.5 ratio. It was observed by hydrogen and carbon nuclear magnetic resonance that thianeptin was obtained in high purity (Figure 3).
  • Tacrine-tianeptine hybrid 1 to
  • Anticholinesterase activity was determined using the colorimetric method described by ELLMAN and colleagues (Ellman, G.L; Courtney, KD; Andres, V; Featherstone, RM, Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88), with modifications. microplates, using tacrin and bis (7) - tacrin as inhibitory controls.
  • As sources of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) enzymes rat brain homogenate supernatant and human plasma, respectively, were employed.
  • adult male Wistar rats (2-3 months old) provided by the UFRGS Department of Biochemistry, kept in plastic boxes with free access to water and food in 12 hour light / dark cycles (7 am - 7 pm). : 00 h), in a controlled temperature environment (23 ⁇ 2 Q C) and monitored humidity were used. All experiments were approved by the Animal Use Ethics Committee of the Federal University of Rio Grande do Sul.
  • the rats were beheaded, the cortices were rapidly dissected and homogenized in Tris buffer. 10 mM HCl, pH 7.2 containing 160 mM sucrose. The homogenates were then centrifuged at 10,000 xg for 10 min at 4 ° C and aliquotted for enzymatic experiments, and stored at -20 ° C.
  • human plasma was obtained from healthy volunteers (24-32 years old ) of both sexes with written consent, and the protocol was approved by the Research Ethics Committee of the Federal University of Rio Grande do Sul.
  • DTNB 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzoic acid
  • acetylthiocholine iodide substrate 0.8 mM
  • AChE enzyme solution and molecules to be tested solubilized in 1% DMSO (maximum final concentration)
  • BuChE activity assays were conducted similarly, except for the use of BuChE as an enzyme and iodide source.
  • mice were beheaded, the hippocampi were dissected rapidly and the cross sections (300 ⁇ ) were quickly obtained using a Mcllwain tissue cutter.
  • One slice per well was placed in a 24-well culture plate.
  • the slices were incubated in oxygenated physiological medium containing 120 mM NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM CaCl 2 , 1.0 mM MgSO 4 , 25.0 mM Hepes, 1.0 mM KH 2 PO 4 and 10 1.0 mM glucose, pH 7.4 at room temperature.
  • the medium was changed every 15 min for fresh medium.
  • the slices were incubated in medium with tacrina-thianeptin (1b and 1c) analogous compounds or thianeptin at concentrations of 0.03 ⁇ ; 0,1 ⁇ or 0,3 ⁇ for 1 h at 30 ° C.
  • S100B concentration of S100B was determined in the slice incubation medium at 1h. S100B levels were determined by ELISA using 50 ⁇ sample and 50 ⁇ Tris buffer incubated for 2 h in a microtiter plate previously coated with anti-S100B monoclonal antibody (SH-B1 from Sigma). Anti-S100 polyclonal antibody (from DAKO) was incubated for 30 min and then peroxidase-conjugated anti-rabbit antibodies was added for an additional 30 min. The color reaction with o-phenylenediamine was measured at 492 nm. The standard curve of S100B ranged from 0.002-1 ng / mL.
  • LDH Lactic Dehydrogenase
  • Lactic Dehydrogenase was dosed in the incubation medium of acute hippocampal slices. THE LDH is present in all cells of the body, and increased concentrations indicate a higher incidence of cell disruption.
  • Lactate dehydrogenase assay was performed in 150 ⁇ of extracellular medium using a commercial kinetic assay from Bioclin (QUIBASA QU ⁇ MICA B ⁇ SICA Ltda.).
  • This methodology consists in the accomplishment of the molecular mooring in each representative structure in order to implicitly include the protein flexibility.
  • Selected structures were 1 zgc (Torpedo Californica) (Haviv, H.; Wong, MD; Greenblatt, H.M; Carlier, PR; Pang, Y.-P; Silman, I.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 1 1029. doi: 101021 / ja051765f.), 2ckm (Torpedo Californica) (Rydberg, EH; Brumshtein, B.; Greenblatt, HM; Wong, MD; Shaya, D .; Williams L. .D. , J.
  • Homo sapiens structures were not selected because there are no HsAchE complexes with inhibitors of similar size to those being evaluated. All inhibitors of the three representative structures (i) interact at the catalytic site, (ii) interact with the peripheral anionic site (PAS), and (iii) are analogous to tacrine.
  • PAS peripheral anionic site
  • the isomers, protonation states, and ligand interactions were predicted with the LigPrep / Epik tool.
  • the different AChE conformations were prepared with the PrepWizard tool respecting the protonation state of the active site amino acid residues described in the literature: Glu202 and Glu327 negatively charged and neutral His440 in ND1. Subsequently, the hydrogen bonding network was optimized between protein and inhibitor.
  • the R isomer of inhibitor 1a had the best mode of binding in the 2ckm complex (-16.989 kcal / mol, Figure Figure 9) where the chlorinated phenyl group of thianeptin is ⁇ -stacked with Trp279 and Tyr70.
  • the S-isomer has the best mode of binding with the enzyme conformation in complex q83 (-17.735 kcal / mol, Figure 10), where cation- ⁇ -type interactions of protonated thianeptin nitrogen with Trp279 are predicted, ⁇ -stacking with Tyr70 and T-stacking with Tyr334.
  • halogen in the tacrine moiety is located at an adjacent hydrophobic site formed by the amino acid residues Trp432, Met436, Ile439 and Pro446.
  • Hydrogen-binding interactions of the amide group with amino acid residues Tyr121 and / or Tyr334 are only present in linker inhibitors with up to four carbon atoms between the tacrine nucleus and the amide function.

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Abstract

A presente invenção descreve moléculas com núcleo híbrido baseado em núcleos de tetraidroacridina e tianeptina, separados por cadeias espaçadoras metilênicas, via reação de acoplamento, uma composição farmacêutica compreendendo estas moléculas, um processo de síntese destas moléculas, e seus usos. A presente invenção se situa nos campos da Química Medicinal, Farmacologia e Medicina.

Description

MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PROCESSO DE SÍNTESE E SEUS USOS
Campo da Invenção
[0001] A presente invenção descreve moléculas com núcleo híbrido baseado em núcleos de tetraidroacridina e tianeptina, separados por cadeias espaçadoras metilênicas, via reação de acoplamento, uma composição farmacêutica compreendendo estas moléculas, um processo de síntese destas moléculas, e seus usos. A presente invenção se situa nos campos da Química Medicinal, Farmacologia e Medicina.
Antecedentes da Invenção
[0002] A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa que resulta na perda progressiva e irreversível de funções cerebrais. Cerca de 200 mil pessoas no mundo com menos de 65 anos de idade são portadoras da DA, o que corresponde a população mais jovem de pessoas com a doença, enquanto cinco milhões de pessoas com 65 anos ou mais apresentam a DA. É estimado que em 2050 cerca de 13,8 milhões de pessoas desenvolverão a DA. (Kumar, A.; Singh, A.; Ekavali, Pharmacol. Rep. 2015, 67, 195; Alzheimer's Association Report, Alzheimer's & Dementia 2015, 11, 332).
[0003] A maioria dos casos de DA tem causas substancialmente desconhecidas. Hoje ainda não há tratamentos terapêuticos capazes de interromper a progressão da doença, embora algumas drogas têm sido recentemente introduzidas no mercado, destinadas especialmente no controle dos sintomas cognitivos. Estas drogas, Rivastigmina (Exelon®), Galantamina (Razadyne®, Reminyl®), Tacrina (Cognex®), Donepezil (Aricept®) compartilham o mecanismo de ação de inibição da acetilcolinesterase (AChE), enquanto Memantina (Namenda®) atua como um antagonista do receptor NMDA {N-metil D-Aspartato). [0004] Dentre os derivados quinolínicos sintéticos, a tacrina (THA) ou 9- amino-1 ,2,3,4-tetraidroacridina, Figura 1 , é de elevada importância e teve comprovada sua atividade farmacológica pela primeira vez em 1949 como agente analéptico. Em 1961 foi descrito pela primeira vez seu efeito sobre enzimas colinesterases (Kozurkova, M.; Hamulakova, S. ; Gazova, Z.; Paulikova, H.; Kristian, P., Pharmaceuticals 2011 , 4, 382). Foi a primeira droga aprovada nos Estados Unidos, em 1993, para o tratamento sintomático da doença de Alzheimer (DA), para a qual ainda não há um tratamento eficiente na prevenção, cura ou até mesmo retardamento do seu progresso.
[0005] Pang e colaboradores realizaram a síntese de compostos do tipo bis(n)-tacrina, que são moléculas com duas unidades de tacrina ligadas por uma cadeia espaçadora de metilenos (Figura 2) (Pang, Y. P.; Quiram, P.; Jelacic, T.; Hong, F.; Brimijoin, S., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23646). O dímero bis(7)-tacrina se mostrou mil vezes mais potente na inibição da acetilcolinesterase do que a tacrina, e possui maior seletividade na inibição da AChE em relação à butirilcolinesterase (BuChE). A partir dos estudos de Pang et al., diferentes dímeros da tacrina têm sido sintetizados e avaliados quanto à inibição de enzimas colinesterase (Hu, M. K; Shaw, J., 2001 , Patente, WO2001 17529-A1 ).
[0006] Também são descritos na literatura diversos compostos híbridos contendo diferentes núcleos de interesse farmacológico voltados para o estudo de doenças neurodegenerativas (Gil, A. M., et al. 2004, patente WO2004032929-A2).
[0007] Devido à complexidade da doença de Alzheimer, por seu caráter multifatorial, há grande interesse da comunidade científica no design de moléculas "multialvo", que possam interagir simultaneamente com diferentes fatores da doença, de maneira a impedir o seu progresso mais do que apenas "mitigar" seus sintomas.
[0008] A construção de moléculas híbridas é uma estratégia importante no desenho da arquitetura de um novo protótipo de fármacos a partir da combinação de características estruturais e biológicas definidas de compostos distintos. Esta estratégia permite agregar ao híbrido diferentes grupos farmacoforicos e assim, modular simultaneamente múltiplos alvos de doenças multifatoriais, tal como a doença de Alzheimer. Essa estratégia geralmente envolve a síntese de compostos híbridos que possuem em uma única molécula dois ou mais núcleos de interesse farmacológico, dos quais, geralmente um é do tipo inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChE) (WO2004032929-A2).
[0009] O núcleo tacrina é o mais comumente incorporado nestes compostos como inibidor do sítio CAS {catalytic active site) da AChE. O interesse por tais moléculas foi impulsionado frente às contribuições de Pang et al., que demonstraram a excelente atuação de compostos com dupla interação simultânea aos CAS e PAS {peripheral anionic site) da AChE (Pang, Y. P.; Quiram, P.; Jelacic, T.; Hong, F.; Brimijoin, S., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23646), bem como frente aos apontamentos de Inestrosa et al (Inestrosa, N. C; Alvarez, A.; Pérez, C. A.; Moreno, R. D.; Vicente, M.; Linker, C; Casanueva, O. I.; Soto, C; Garrido, J., Neuron 1996, 16, 881 ), que indicaram que o PAS da enzima pode acelerar a deposição de peptídeos beta-amiloide (Αβ). Essa nova geração de moléculas híbridas é planejada de forma a atuar simultaneamente nos CAS e PAS das ChEs, e em outros fatores da DA.
[0010] As enzimas AChE e BuChE constituem o grupo das colinesterases. A AChE é encontrada principalmente nas sinapses neuronais. A BuChE é sintetizada pelo fígado, sendo encontrada em grandes quantidades no soro. A acetilcolinesterase, entre outras funções fisiológicas, age em células pós-sinápticas, realizando a hidrólise da acetilcolina e encerrando a transmissão do impulso nervoso. A função fisiológica da BuChE ainda não é bem conhecida, mas é sugerida sua participação no mecanismo regulatório dos níveis da AChE na sinapse colinérgica. Além disso, a observação de que a razão BuChE/AChE eleva com o progresso da DA, com o aumento significativo da BuChE no hipocampo e córtex temporal, deve favorecer o uso de inibidores seletivos de BuChE em tratamentos de formas moderadas a avançadas de DA (Giacobini, E., Pharmacol. Res. 2004, 50, 433).
[0011] Tianeptina (Stablon®), 7- (3-cloro-6-metil - 6,1 1 - dihidrodibenzo [c,f [1 ,2] tiazepin-1 1 -ilamino) ácido heptanoico S,S-dióxido, é uma droga antidepressiva, da classe dos tricíclicos, e é um derivado do núcleo tiazepina, mais especificamente um derivado dioxodibenzo[1 ,2]tiazepina, contendo dois anéis benzênicos fundidos e como cadeia lateral o ácido 7-aminoeptanoico. Esta droga foi sintetizada no Instituto Servier, França, e descrita pela primeira vez na patente FR 2104728. Possui fórmula química C2i H24CIN2NaO4S com peso molecular 436,95g. A tianeptina apresenta propriedades como antidepressiva a neuroprotetora e ansiolítica. (Guzman, et al., 2009, patente WO/2010/051239; Blanchard, 2002, patente US 6,441 ,165; Huet De Barochez & Wuthrich, 1999, patente US 5,888,542). Possui propriedades neuroquímicas distintas dos demais antidepressivos tricíclicos ou não-tricíclicos, atuando no aumento da captação neuronal do neurotransmissor serotonina, podendo atuar também como anticonvulsivante e analgésico (Nowakowska, E.; Kus, K., Chodera, A.; Rybakowski, J. Arzneimittelforschung 2000, 50, 5; Uzbay, T. I., Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. 2008, 32, 915). Adicionalmente, a tianeptina regula a entrada de cálcio prevenindo a super estimulação dos receptores AMPA e modula a atividade dos receptores NMDA normalizando sua atividade no hipocampo, características que estão relacionadas ao envelhecimento quanto à doença de Alzheimer (revisado em Mcewen, B. S.; Chattarji, S.; Diamond, D. M.; Jay, T. M.; Reagan, L. P. ; Svenningsson, P. ; Fuchs, E., Mol. Psychiatry. 2010, 15, 237).
[0012] A ativação glial libera uma variedade de citocinas pró- inflamatórias que contribuem para a disfunção neuronal (Khansari, N.; Shakiba, Y.; Mahmoudi, M., Recent Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov. 2009, 3, 73). Níveis elevados de S100B, uma proteína derivada da glia, têm sido observados no líquor de pacientes nos primeiros estágios da doença de Alzheimer (Peskind, E. R.; Griffin, W. S; Akama, K. T.; Raskind, M. A. ; Van Eldik, L. J., Neurochem. Int. 2001 , 39, 409) e no soro de pacientes com Depressão Maior (Schroeter, M. L; Abdul-Khaliq, H.; Diefenbacher, A.; Blasig; I. E. Neuroreport, 2002, 13, 1675), sugerindo um papel da glia nessas patologias. Já foi demonstrado anteriormente que a tacrina não é capaz de modificar a secreção de S100B in vitro (Lunardi, P.; Nardin, P.; Guerra, M. C; Abib, R.; Leite M. C; Gonçalves C. A., Life Sei. 2013, 92, 701 ).
[0013] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.
Sumário da Invenção
[0014] Dessa forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de uma nova molécula com núcleo híbrido baseado em núcleos de tetraidroacridina e tianeptina, separados por cadeias espaçadoras metilênicas, via reação de acoplamento.
[0015] Em um primeiro objeto a presente invenção apresenta moléculas com núcleo híbrido, com a seguinte estrutura:
Figure imgf000007_0001
em que:
- Χι , X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20.
[0016] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende moléculas com núcleo híbrido com a seguinte estrutura:
Figure imgf000008_0001
em que:
- Xi, X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20.
[0017] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta um processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento, e em que a molécula com núcleo híbrido possui a seguinte estrutura:
Figure imgf000009_0001
em que:
- Χι , X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20.
[0018] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta o uso das ditas moléculas com núcleo híbrido para inibir enzimas colinesterases.
[0019] Em um quinto objeto, a presente invenção apresenta o uso das ditas moléculas com núcleo híbrido para diminuir a secreção de pelo menos uma proteína oriunda da glia.
[0020] Em um sexto objeto, a presente invenção apresenta o uso das ditas moléculas com núcleo híbrido na preparação de um medicamento para tratar a Doença de Alzheimer.
[0021] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados são as moléculas com núcleo híbrido baseado em núcleos de tetraidroacridina e tianeptina, separados por cadeias espaçadoras metilênicas, via reação de acoplamento.
[0022] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.
Breve Descrição das Figuras
[0023] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente, são apresentadas as presente figuras:
[0024] A figura 1 mostra as estruturas das moléculas tacrina e tianeptina.
[0025] A figura 2 mostra a estrutura da bis(n)-tacrina.
[0026] A figura 3 apresenta os espectros de RMN de a) 1H (CDCI3, 300
MHz) da tianeptina e b) 13C (APT, CDCI3, 75 MHz) da tianeptina
[0027] A figura 4 apresenta os espectros de RMN de a) 1 H (300 MHz,
CDCI3) e b) 13C-APT (75 MHz, CDCI3) do composto 1a.
[0028] A figura 5 apresenta os espectros de RMN de a) 1H (300 MHz,
CDCI3) e b) e 13C-APT (75 MHz, CDCI3) do composto 1 b.
[0029] A figura 6 apresenta os espectros de RMN de a) 1H (300 MHz,
CDCI3) e b) 13C-APT (75 MHz, CDCI3) do composto 1 c.
[0030] A figura 7 mostra um esquema de formação dos intermediários 2a, 2b, e 2c.
[0031] A figura 8 mostra um esquema ilustrativo da reação de acoplamento.
[0032] A figura 9 mostra os modos de ligação do inibidor (fí)-1a complexado com a conformação 2ckm da AChE.
[0033] A figura 10 mostra os modos de ligação do inibidor (S)-1a complexado com a conformação 1 q83 da AChE.
Descrição Detalhada da Invenção
[0034] Em um primeiro objeto a presente invenção apresenta moléculas com núcleo híbrido, com a seguinte estrutura:
Figure imgf000011_0001
em que:
- Χι , X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20.
[0035] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende moléculas com núcleo híbrido com a seguinte estrutura:
Figure imgf000011_0002
em que: - Χι, X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20.
[0036] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta um processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento, e em que as moléculas com núcleo híbrido possuem a seguinte estrutura:
Figure imgf000012_0001
em que:
- Xi, X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20.
[0037] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta o uso das ditas moléculas com núcleo híbrido para inibir enzimas colinesterases. [0038] Em um quinto objeto, a presente invenção apresenta o uso das ditas moléculas com núcleo híbrido para diminuir a secreção de pelo menos uma proteína oriunda da glia.
[0039] Em um sexto objeto, a presente invenção apresenta o uso das ditas moléculas com núcleo híbrido na preparação de um medicamento para tratar a Doença de Alzheimer.
[0040] Em uma concretização, a presente invenção apresenta as ditas moléc
Figure imgf000013_0001
em que:
- X é Cl ou hidrogénio; e
- "n" varia entre 3 e 5.
[0041] Em uma concretização, a presente invenção apresenta as ditas moléculas com núcleo híbrido em que as ditas moléculas inibem enzimas colinesterases.
[0042] Em uma concretização, a presente invenção apresenta as ditas moléculas com núcleo híbrido em que as ditas moléculas são capazes de diminuir a secreção de pelo menos uma proteína oriunda da glia.
[0043] Em uma concretização, a presente invenção apresenta as ditas moléculas com núcleo híbrido em que as ditas moléculas são capazes de diminuir a secreção de S100B.
[0044] Em uma concretização, a presente invenção apresenta as ditas moléculas com núcleo híbrido por ser utilizada na preparação de um medicamento para tratar a Doença de Alzheimer. [0045] Em uma concretização, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende as ditas moléculas com núcleo híbrido em uma concentração de 0,01 μΜ até 0,1 μΜ.
[0046] Em uma concretização, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende as ditas moléculas com núcleo híbrido que é capaz de inibir enzimas colinesterases.
[0047] Em uma concretização, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende as ditas moléculas com núcleo híbrido que é capaz de diminuir a secreção de pelo menos uma proteína oriunda da glia.
[0048] Em uma concretização, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende as ditas moléculas com núcleo híbrido que é capaz de diminuir a secreção de S100B.
[0049] Em uma concretização, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende as ditas moléculas com núcleo híbrido por ser utilizada na preparação de um medicamento para tratar a Doença de Alzheimer.
[0050] Em uma concretização, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende as ditas moléculas com núcleo híbrido, em que a composição farmacêutica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0051] Em uma concretização, a presente invenção apresenta o dito processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento e um reagente de acoplamento.
[0052] Em uma concretização, a presente invenção apresenta o dito processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento e um reagente de acoplamento selecionado entre 1 -etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e dicicloexilcarbodiimida (DCC). [0053] Em uma concretização, a presente invenção apresenta o dito processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento, o reagente de acoplamento 1 -etil-3- (3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e o aditivo 1 -hidroxi-1 H-benzotriazol (HOBt).
[0054] Em uma concretização, a presente invenção apresenta o dito processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento, o reagente de acoplamento dicicloexilcarbodiimida (DCC) e o catalisador dimetilaminopiridina (DMAP).
[0055] Em uma concretização, a presente invenção apresenta o dito processo de síntese de moléculas com núcleo híbrido, em que o processo compreende uma reação de acoplamento em um solvente selecionado entre clorofórmio, diclorometano, tolueno, acetonitrila, dimetilformamida (DMF) e tetraidrofurano (THF).
[0056] Em uma concretização, a presente invenção apresenta o uso da dita molécula com núcleo híbrido para diminuir a secreção de S100B.
[0057] A composição farmacêutica, em um veículo farmaceuticamente aceitável, poderia auxiliar no tratamento de doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer, e também com uso multifatorial para outros distúrbios, incluindo estresse oxidativo, que possui efeito neurodegenerativo.
Exemplos:
[0058] Neste trabalho, os fármacos tacrina e tianeptina foram escolhidos como núcleos estruturais para a síntese de novos híbridos tacrina-tianeptina, com o objetivo de agregar novas interações enzima-substrato e também agregar em um mesmo composto diferentes grupos farmacofóricos bioativos.
[0059] O processo de preparo de híbridos de acordo com a presente invenção baseia-se na reação de acoplamento entre tianeptina e 9-alquilamino- 1 ,2,3,4-tetraidroacridinas, na presença de um reagente de acoplamento, como por exemplo 1 -etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) juntamente com o aditivo 1 -hidroxi-1 H-benzotriazol (HOBt) ou ainda o uso do reagente dicicloexilcarbodiimida (DCC) empregando-se dimetilaminopiridina (DMAP) como catalisador.
[0060] Inicialmente, avaliou-se os híbridos tacrina-tianeptina como inibidores das enzimas colinesterases AChE e BuchE. Foi avaliado também o impacto desses compostos sobre a integridade celular através da medição da enzima Desidrogenase Lática (LDH). Além disso, foi medido o efeito dos compostos sobre a secreção de S100B.
Obtenção dos híbridos tacrina-tianeptina 1a, 1 b e 1 c
Extração de Tianeptina (STABLON)
[0061] A tianeptina foi extraída de comprimidos Stablon®. Os comprimidos de Stablon foram macerados, dissolvidos em tetraidrofurano (THF) e mantidos sob agitação por 30 minutos. A solução foi filtrada e a seguir concentrada em um evaporador rotatório. O produto bruto resultante foi purificado por cromatografia em coluna com sílica gel, empregando como mistura eluente CHCl3-MeOH-NH4OH com eluição no modo gradiente; proporção inicial 93:6,5:0,5 até a proporção 80:19,5:0,5. Observou-se por Ressonância magnética nuclear de hidrogénio e carbono que a tianeptina foi obtida em alto grau de pureza (Figura 3).
[0062] A mistura de tianeptina (0,20 mmol), 1 -etil-3-(3'- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 0,20 mmol) e 1 -hidróxi-1 H-benzotriazol (HOBt, 0,20 mmol) em CH2CI2 anidro (1 mL) foi mantida sob agitação e atmosfera inerte por 2 h. Então, adicionou-se a solução das 9-alquilamino- 1 ,2,3,4-tetraidroacridinas 2a-2c (0,18 mmol) em CH2CI2 anidro (0,5 mL) sobre a mistura reacional, e a reação permaneceu sob agitação e atmosfera inerte por mais 20 h. Decorrido este período, adicionou-se água (0,2 mL), secou-se com Na2SO4 anidro e filtrou-se. O solvente foi removido à pressão reduzida e o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel empregando como mistura eluente hexano-acetato de etila-trietilamina (eluição no modo gradiente; proporção inicial 85:14:1 até a proporção 0:99:1 ). Os produtos foram obtidos em rendimento de 85-88 % e posteriormente caracterizados pelos métodos espectroscopicos adequados, sendo que, alguns exemplos representativos estão mostrados nas Figuras 4 a 6.
[0063] Descreve-se na Figura 7, o processo de obtenção dos intermediários 2a-2c, via reação de acoplamento entre 9-cloro-1 ,2,3,4- tetraidroacridinas e 1 ,n-alcanodiaminas na presença de Kl como catalisador e n-pentanol como solvente, sob refluxo por 18 h, conforme protocolo da literatura (Luo, W.; Li, Y. P.; He, Y.; Huang, S. L; Tan, J. H.; Ou, T. M.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S., Bioorg. Med. Chem.2011, 19, 763).
Híbrido tacrina-tianeptina 1 a
[0064] Sólido amarelo; rendimento: 75%; ponto de fusão 75-76 °C; IV {ΚΒή Vmaxcm"1: 3321, 3065, 2929, 1649, 1556, 1490, 1331, 1153; RMN-1H (CDCI3) δ 7,95 (d, 1 H, J = 9,0 Hz), 7,94 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,84 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,48-7,22 (m, 7H), 6,00 (t, 1 H, J= 6,1 Hz), 4,96 (s, 1 H), 4,94 (sl, 1 H), 3,48- 3,28 (m, 4H), 3,32 (s, 3H), 3,04-2,96 (m, 2H), 2,76-2,66 (m, 2H), 2,50-2,34 (m, 2H), 2,28 (sl, 1H), 2,15 (t, 2H, J= 7,5 Hz), 1,94-1,82 (m, 4H), 1,71 (qn, 2H, J = 6,3 Hz), 1,66-1,52 (m, 2H), 1,50-1,37 (m, 2H), 1,32-1,18 (m, 4H); RMN-13C (CDCI3) δ 174,2; 159,9; 150,8; 148,1; 140,2; 138,7; 138,4; 136,9; 134,3; 134,0; 132,4; 131,6; 130,6; 129,5; 128,6; 128,2; 128,1; 127,5; 124,5; 118,8; 116,6; 66,6; 48,1 ; 45,2; 39,0; 36,7; 36,5; 34,1 ; 31 ,6; 29,9; 29,2; 27,0; 25,8; 25,2; 23,1 ; 22,8;
Híbrido tacrina-tianeptina 1 b
[0065] Sólido amarelo; rendimento: 88%; ponto de fusão 45-47 °C; IV {ΚΒή i cm"1 : 3350, 3409, 3061 , 2927, 1639, 1560, 1140, 1107, 763; RMN-1 H (CDCI3) 7,94 (d, 1H, J= 1,8 Hz), 7,92 (d, 1H, J= 9,0 Hz), 7,88 (d, 1H, J= 8,7 Hz), 7,60-7,48 (m, 1H), 7,46-7,24 (m, 7H), 5,94 (t, 1H, J= 5,8 Hz), 4,96 (s, 1H), 3,45 (t, 2H, J= 6,9 Hz), 3,33 (s, 3H), 3,28-3,18 (m, 2H), 3,10-2,98 (m, 2H), 2,72-2,60 (m, 2H), 2,48-2,38 (m, 2H), 2,08 (t, 2H, J= 7,5 Hz), 1,95-1,80 (m, 4H), 1,70-1,36 (m, 8H), 1,36-1,17 (6H); RMN-13C (CDCI3) δ 173,3; 158,5; 150,7; 147,4; 140,2; 138,6; 138,5; 136,9; 134,2; 132,3; 131,5; 130,4; 129,4; 128,6; 128,4; 128,2; 128,0; 123,8; 122,9; 120,3; 1 16,3; 66,4; 49,0; 48,0; 39,1 ; 38,9; 36,6; 34,0; 29,9; 29,1 ; 29,0; 27,2; 27,0; 25,7; 24,9; 23,1 ; 22,8.
Híbrido tacrina-tianeptina 1 c
[0066] Sólido amarelo; rendimento: 68%; ponto de fusão 62-63 °C; IV {ΚΒή i cm"1 : 3396, 3061 , 2929, 1649, 1560, 1329, 1 153, 763; RMN-1 H (CDCI3) 7,99-7,91 (m, 2H), 7,89 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 7,58-7,48 (m, 1 H), 7,48- 7,22 (m, 7H), 5,89 (sl, 1 H), 4,97 (s, 1 H), 4,00 (sl, 1 H), 3,45 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,33 (s, 3H), 3,24-3,14 (m, 2H), 3,10-2,98 (m, 2H), 2,72-2,50 (m, 3H), 2,41 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 2,09 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1 ,98-1 ,80 (m, 4H), 1 ,72-1 ,34 (m, 10H), 1 ,34-1 ,18 (4H); RMN-13C (CDCI3) δ 173,2; 158,4; 150,9; 147,3; 140,2; 138,6; 138,5; 136,9; 134,2; 132,3; 131 ,5; 130,4; 129,4; 128,5; 128,4; 128,2; 128,0; 123,7; 123,0; 120,2; 1 15,9; 66,4; 49,3; 48,0; 39,2; 38,9; 36,6; 34,0; 31 ,4; 29,9; 29,5; 29,1 ; 27,0; 25,7; 24,9; 24,3; 23,1 ; 22,8.
Avaliação da atividade das enzimas AChE e BuChE
[0067] A atividade anticolinesterásica foi determinada através do método colorimétrico descrito por ELLMAN e colaboradores (Ellman, G. L; Courtney, K. D.; Andres, V.; Featherstone, R. M., Biochem. Pharmacol. 1961 , 7 , 88), com modificações laboratoriais para microplacas, empregando-se tacrina e bis (7)- tacrina como controles inibitórios. Como fonte das enzimas acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BuChE), foram empregados sobrenadante de homogenato de cérebro de ratos e plasma humano, respectivamente. Para tanto, ratos Wistar machos adultos (2-3 meses de idade) fornecidos pelo Departamento de Bioquímica da UFRGS, mantidos em caixas de plástico com livre acesso a água e alimento em ciclos de claro/escuro de 12 horas (07:00 - 19:00 h), em ambiente com temperatura controlada (23 ± 2Q C) e umidade monitorada foram utilizados. Todos os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[0068] Para a obtenção da fonte de AChE, os ratos foram decapitados, os córtices foram rapidamente dissecados e homogeneizados em tampão Tris- HCI 10 mM, pH 7,2 contendo sacarose 160 imM. Os homogenatos foram então centrifugados a 10,000 x g durante 10 min a 4o C e aliquotados para os experimentos enzimáticos, sendo estocados a -20° C. Para a fonte de BuChE, plasma humano foi obtido de voluntários sadios (24-32 anos de idade) de ambos os sexos com consentimento escrito, sendo que o protocolo foi aprovado pelo Comité de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. As amostras de sangue foram centrifugadas a 1000x g durante 15 minutos à temperatura ambiente em tubos contendo heparina, sendo separado o plasma, que foi aliquotado para os experimentos enzimáticos, então estocados a -20° C até seu emprego. A concentração de proteínas para ambas as amostras enzimáticas foi medida através da modificação de Peterson para o método de Lowry (Peterson, G. L, Anal. Biochem. 1977, 83, 346), empregando-se albumina bovina como padrão.
[0069] Para a determinação da atividade da AChE, foram empregados DTNB (ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) na concentração de 10 mM, como reagente cromogênico, o substrato iodeto de acetiltiocolina (0,8 mM), solução da enzima AChE e as moléculas a serem testadas, solubilizadas em DMSO a 1 % (concentração final máxima). Para a determinação da atividade da BuChE, os ensaios foram conduzidos de maneira semelhante, exceto pela utilização de BuChE como fonte enzimática e de iodeto de S-butiriltiocolina (0,8 mM) como substrato. As incubações dos produtos na presença das enzimas foram todas realizadas em temperatura ambiente e as absorvâncias do ânion amarelado do ácido 5-tio-2-nitrobenzoico monitoradas a 415 nm em um SPECTRAmax 190 durante 6 minutos, em intervalos de 30 segundos. Os valores de IC50 foram determinados através dos gráficos de log de atividade (inibição) vs resposta, processados através de um software (GraFit 6.0). Todos os resultados foram calculados como médias ± DP de 3 experimentos independentes, cada um desenvolvido em triplicata.
Avaliação dos níveis da proteína de S100B e enzima Desidrogenase Lática (LDH) Preparação e incubação de fatias cerebrais
[0070] Os ratos foram decapitados, os hipocampos foram dissecados rapidamente e as secções transversais (300 μΜ) foram rapidamente obtidas utilizando um cortador de tecido Mcllwain. Uma fatia por poço foi colocada em uma placa de cultura de 24 poços. As fatias foram incubadas em meio fisiológico oxigenado contendo NaCI 120 mM, KCI 2,0 mM, CaCI2 1 ,0 mM, MgSO4 1 ,0 mM, 25,0 mM Hepes, 1 ,0 mM de KH2PO4 e 10,0 mM de glucose, pH 7,4 a temperatura ambiente. O meio foi trocado a cada 15 min por meio fresco. Após um período de estabilização de 120 min, as fatias foram incubadas em meio com os compostos híbridos análogos da tacrina-tianeptina (1 b e 1 c) ou tianeptina nas concentrações de 0,03 μΜ; 0,1 μΜ ou 0,3 μΜ durante 1 h a 30° C.
ELISA para S100B
[0071] Foi verificado se a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas pode ser alterada pelos compostos análogos híbridos tacrina-tianeptina 1 b e 1c (Figura 8) e/ou por tianeptina nas concentrações de 0,03 μΜ; 0,1 μΜ ou 0,3 μΜ.
[0072] A concentração de S100B foi determinada no meio de incubação de fatias em 1 h. Níveis de S100B foram determinados por ELISA, utilizando 50 μΐ de amostra e 50 μΐ de tampão Tris, incubados durante 2 h em uma placa de microtitulação previamente revestidas com anticorpo monoclonal anti-S100B (SH-B1 , da Sigma). Anti-S100 anticorpo policlonal (da DAKO) foi incubado durante 30 min e, em seguida, anticorpos anti-rabbit conjugado com peroxidase foi adicionada durante mais 30 min. A reação de cor com o-fenilenodiamina foi medida a 492 nm. A curva padrão de S100B variou 0,002-1 ng / mL.
Determinação da Desidrogenase Lática (LDH) no meio de incubação
[0073] Além disso, é fundamental a determinação do impacto desses compostos sobre a integridade celular, para tanto a enzima Desidrogenase Lática (LDH) foi dosada no meio de incubação de fatias hipocampais agudas. A LDH se encontra presente em todas as células do organismo, sendo que concentrações aumentadas indicam maior incidência de rompimento celular.
[0074] Ensaio da lactato desidrogenase foi realizado em 150 μΙ_ de meio extracelular, utilizando um ensaio cinético comercial da Bioclin (QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda.).
Análise estatística
[0075] Os dados paramétricos são relatados como médias ± erro padrão e foram analisados por ANOVA de uma via (seguido de teste de Dunnett). Os valores de p <0,05 foram considerados significativos.
Resultados
[0076] Os resultados demonstraram que apenas a tianeptina, nas concentrações mais altas (0,1 μΜ e 0,3 μΜ), aumentou a concentração de LDH no meio de incubação das fatias (109,7 ± 5,5 % e 1 10,8 ± 6,7 %, em relação ao controle; p = 0,0374), contudo tanto o composto 1 c na concentração de 0,03 μΜ (67,4 ± 13,6 %; p = 0,0327), quanto o composto 1 b nas concentrações de 0,03 μΜ e 0,1 μΜ (72,7 ± 14,8 % e 74,9 ± 1 1 ,7 %, respectivamente; p = 0,0380) foram hábeis em diminuir a secreção de S100B em relação ao controle. Os resultados são bastante interessantes, uma vez que não foi encontrada incidência de diminuição da integridade celular com a utilização dos análogos, mesmo nas concentrações mais altas, diferentemente da tianeptina. Além disso, dois dos três análogos testados (1 c e 1 b) foram capazes de diminuir a concentração basal de S100B, que por sua vez encontra-se aumentada tanto na Depressão Maior, quanto nos primeiros estágios da doença de Alzheimer. Modelagem Molecular de Inibidores de Acetilcolinesterase
[0077] Atualmente existem diversas estruturas tridimensionais da enzima acetilcolinesterase (AChE) disponíveis no Protein Data Bank (PDB) complexadas com uma ampla variedade de inibidores (Bernstein, F. C; Koetzle, T. F.; Williams, G. J.; Meyer Jr., E. F.; Brice, M. D.; Rodgers, J. R. et al.; The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures, J. Mol. Biol. 1977, 112, 535). Devido à significativa variação conformacional observada em regiões específicas da cavidade de ligação da acetilcolina (ACh) do sítio aniônico periférico (PAS, peripheral anionic site), selecionamos três estruturas representantes para realizar estudos de ensemble docking (Johnson G.; Moore S. W. Curr. Pharm. Des. 2006 12 217). Esta metodologia consiste na realização do atracamento molecular em cada estrutura representante com o objetivo de incluir implicitamente a flexibilidade proteica. As estruturas selecionadas foram 1 zgc { Torpedo Californica) (Haviv, H.; Wong, D. M.; Greenblatt, H. M.; Carlier, P. R.; Pang, Y.-P; Silman, I.; et al. J. Am. Chem. Soe. 2005, 127, 1 1029. doi:10.1021 /ja051765f.), 2ckm { Torpedo Californica) (Rydberg, E. H.; Brumshtein, B.; Greenblatt, H. M.; Wong, D. M., Shaya, D.; Williams L. .D., et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 5491 . doi:10.1021 /jm060164b).e 1 q83 {Mus musculus) (Bourne, Y.; Kolb, H. C; Radie, Z.; Sharpless, K. B.; Taylor, P.; Marchot, P. Proc. Natl. Acad. Sei. 2004, 101, 1449. doi:10.1073/pnas.0308206100).
[0078] Não foram selecionadas estruturas de Homo sapiens por não haver complexos da HsAchE com inibidores de tamanho similar aos que estão sendo avaliados. Todos os inibidores das três estruturas representantes (i) interagem no sítio catalítico, (ii) interagem com o sítio aniônico periférico (PAS), e (iii) são análogos à tacrina. Quatro moléculas de águas estruturais, conservadas nas três estruturas representantes, foram utilizadas durante os estudos de atracamento molecular.
[0079] Os isômeros, estados de protonação e interações dos ligantes foram preditos com a ferramenta LigPrep/Epik. As diferentes conformações da AChE foram preparadas com a ferramenta PrepWizard respeitando o estado de protonação dos resíduos de aminoácido do sítio ativo descritos na literatura: Glu202 e Glu327 carregados negativamente e His440 neutra em ND1 . Posteriormente foi realizada a otimização da rede de ligações de hidrogénio entre proteína e inibidor.
[0080] Os estudos de ensemble docking foram realizados com os programas de atracamento molecular Glide e DockThor. A seleção da melhor conformação para cada inibidor e isômero foi feita de acordo com o valor de glide Emodel, e a energia utilizada para comparação entre diferentes isômeros e inibidores foi o docking score.
[0081] Os modos de ligação obtidos no estudo de ensemble docking são similares para todos os inibidores testados em AChE. Em todos os casos, o grupamento análogo à tacrina mantém as interações já descritas na literatura para este inibidor: (i) interação do tipo ττ-stacking com Trp84 e Phe330, e (ii) ligação de hidrogénio do nitrogénio protonado aromático com o oxigénio carbonílico da cadeia principal da His440. A maior variabilidade dos modos de ligação entre os inibidores se encontra na região da tianeptina.
[0082] O isômero R do inibidor 1a teve melhor modo de ligação no complexo 2ckm (-16,989 kcal/mol, Figura Figura 9) em que o grupo fenila clorado da tianeptina faz ττ-stacking com Trp279 e Tyr70. A amina próxima à tacrina faz ligação de hidrogénio com uma água. Não foram observadas ligações com hidrogénio do grupo amida com os resíduos de tirosina localizados nesta região.
[0083] O isômero S possui o melhor modo de ligação com a conformação da enzima no complexo 1 q83 (-17,735 kcal/mol, Figura 10), em que são previstas interações do tipo cátion- π do nitrogénio protonado da tianeptina com Trp279, ττ-stacking com Tyr70 e T-stacking com Tyr334. Já a amida do linkeríaz ligação de hidrogénio com Tyr121 e Tyr334. De acordo com os resultados de ensemble docking, o halogênio, na porção tacrina, está localizado em um sítio hidrofóbico adjacente, formado pelos resíduos de aminoácido Trp432, Met436, Ile439 e Pro446. As interações por ligação de hidrogénio do grupo amida com os resíduos de aminoácido Tyr121 e/ou Tyr334 só estão presentes nos inibidores com linker com até quatro átomos de carbono entre o núcleo tacrina e a função amida.

Claims

Reivindicações
1 . MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO, caracterizadas por possuir a estrutura:
Figure imgf000024_0001
em que:
- Χι , X2 e X3 são selecionados, independentemente, entre os grupos dos halogênios, OH, OR, HS, SR, NH2, NH, NHR ou outros grupos retiradores ou doadores de elétrons, onde R é selecionado entre os grupos alquila, arila, alila, benzila ou propargila;
- Ri e R2 são selecionados, independentemente, entre os grupos H, alquila, arila, alila benzila ou propargila; e
- "n" e "m" podem variar entre 1 e 20
2. MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por possuir a estrutura:
Figure imgf000024_0002
em que:
- X é Cl ou hidrogénio; e
- "n" varia entre 3 e 5
3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender moléculas com núcleo híbrido conforme definido na reivindicação 1
4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender as ditas moléculas com núcleo híbrido em uma concentração de 0,01 μΜ até 0,1 μΜ
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável
6. PROCESSO DE SÍNTESE DE MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO conforme definida na reivindicação 1 , caracterizado por compreender uma reação de acoplamento
7. PROCESSO DE SÍNTESE de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender um reagente de acoplamento
8. PROCESSO DE SÍNTESE de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo dito reagente de acoplamento ser selecionado entre 1 -etil- 3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e dicicloexilcarbodiimida (DCC)
9. PROCESSO DE SÍNTESE de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender 1 -hidroxi-1 H-benzotriazol (HOBt) se o reagente de acoplamento for 1 -etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)
10. PROCESSO DE SÍNTESE de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender dimetilaminopiridina (DMAP) se o dito reagente de acoplamento for dicicloexilcarbodiimida (DCC)
1 1 . PROCESSO DE SÍNTESE de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender um solvente selecionado entre clorofórmio, diclorometano, tolueno, acetonitrila, dimetilformamida (DMF) e tetraidrofurano (THF)
12. Uso DE MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO conforme definido na reivindicação 1 , caracterizada por ser para inibir enzimas colinesterases
13. Uso DE MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO conforme definido na reivindicação 1 , caracterizado por ser para diminuir a secreção de pelo menos uma proteína oriunda da glia
14. Uso DE MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela dita proteína oriunda da glia ser S100B
15. Uso DE MOLÉCULAS COM NÚCLEO HÍBRIDO conforme definido na reivindicação 1 , caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar a Doença de Alzheimer
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CAMARA, VIKTOR SARAIVA ET AL.: "Síntese, caracterização e avaliação biológica de hibridos tacrina-tianeptina'';", SINTESE ORGÂNICA;, 20 August 2014 (2014-08-20), Porto Alegre, RS, Retrieved from the Internet <URL:http://hdl.handle.net/10183/1142222> *
CESCHI, M. A. ET AL.: "Novel series of tacrine-tianeptine hybrids: Synthesis, cholinesterase inhibitory activity, S100B secretion and a molecular modeling approach '';", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 121, 2016, pages 758 - 772, XP029685818 *
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