WO2017105209A2 - Mezcla bacteriana altamente productora de sideroforos, su proceso de obtención y su uso como agente inhibidor de fitopatogenos - Google Patents

Mezcla bacteriana altamente productora de sideroforos, su proceso de obtención y su uso como agente inhibidor de fitopatogenos Download PDF

Info

Publication number
WO2017105209A2
WO2017105209A2 PCT/MX2016/000128 MX2016000128W WO2017105209A2 WO 2017105209 A2 WO2017105209 A2 WO 2017105209A2 MX 2016000128 W MX2016000128 W MX 2016000128W WO 2017105209 A2 WO2017105209 A2 WO 2017105209A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
siderophores
medium
strains
gelosa
cnrg
Prior art date
Application number
PCT/MX2016/000128
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2017105209A3 (es
Inventor
Ramón Ignacio ARTEAGA GARIBAY
Original Assignee
Instituto Nacional De Investigaciones Forestales, Agrícolas Y Pecuarias
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Instituto Nacional De Investigaciones Forestales, Agrícolas Y Pecuarias filed Critical Instituto Nacional De Investigaciones Forestales, Agrícolas Y Pecuarias
Publication of WO2017105209A2 publication Critical patent/WO2017105209A2/es
Publication of WO2017105209A3 publication Critical patent/WO2017105209A3/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a mixed culture of bacterial strains with antagonistic capacity for pathogenic fungi of crops with agricultural importance and producing siderophores;
  • the object of this invention is a mixed bacterial culture isolated from the rhizosphere of corn that consists of a suspension of microorganism cells.
  • the process of isolation and obtaining of the microbial mixture forms the object of the present invention and is therefore considered to be an invention of the biotechnological area.
  • rhizospheric microorganisms as a biotechnological alternative in the control of pathogenic microorganisms is practiced by inoculating seeds.
  • Klopper in the 70s I use the term PGPR (plant growth promoting rhizobacteria) to refer to rhizobacteria capable of causing a beneficial effect on plants.
  • PGPR plant growth promoting rhizobacteria
  • the ability to colonize the roots is an indispensable condition for a bacterium to be considered as a true PGPR, therefore being that capacity a first step and a crucial feature for the selection of microbial inoculums to be used as biofertilizers, biopesticides, phytosimulators or bioremediators (Pe ⁇ a and Reyes, 2007).
  • Another known method for the production of siderophores is to modify a liquid CAS medium with Casamina Acids 0.3%, sucrose 0.2%, thiamine-HCI 0.0002% and succinate 0.2%, w / v that is used to produce siderophores in three stages, first they are detected with the liquid medium and in agar they are modified in small samples until a dark blue mixture is obtained, subsequently dissolved in a specific solution and the siderophores are evaluated in tobacco; subsequently a double distillation and deionization is carried out to prepare in at least three days;
  • A. SAMPLE PREPARATION 25 soil samples were taken from the rhizosphere area of a plot for the cultivation of corn; The 25 samples were mixed inside flexible containers. 10 g of the soil mixture was weighed and at least one dilution with a 1:10 ratio (1x10 1 to 1x1 Qr 7 ) in physiological saline solution (0.85% NaCl) was made. 100 pL aliquots of the dilutions were transferred to Petri dishes with Pikovskaya and CAS medium for direct selection of siderophores producers; nourishing gelase media, arginine giicerol, King B, were also used for the selection of specific microbial groups. The inoculated culture media were incubated between 25 and 47 ° C for 18 to 64 h;
  • succinic acid medium 1 mL of the bacterial suspension was transferred and 100 mL of succinic acid medium was inoculated, consisting of: K2HPO4 6.0 g / L, KH2PO4 3.0 g / L, MgS04 0.2 g / L, (NH4> 2S04 1.0 g / L and succinic acid 4.0 g / L, pH 7.0; It will be incubated at 28 ° C on an orbital shaker, at 120 rpm for 24-30 h.
  • the cryotube was placed with 0.5 mL of milk 20% sterile skim in an ice bath and 0.5 mL of the inoculum adjusted to tube 7 of the nephelometer was transferred, labeled and the cryoprotectant was equilibrated for 30 min in an ice bath, then the tubes were placed in a freezer at - 20 ° C for 24 h, the tubes were stored in a freezer at -80 ° C.
  • strains were identified with the sequence analysis of a DNA fragment of the 16S rDNA gene with the use of universal primers for the identification of prokaryotes 27f (5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3 ') and 1492r (5 * -GGTTACCTTGTTACGACTT- 3'), Identity assignment was performed with sequence analysis on the BLAST platform and was corroborated by means of an in silico phylogenetic reconstruction.
  • CM-CNRG National Center of Genetic Resources
  • INIFAP Tepatitlán de Morelos, Jalisco, Mexico
  • 3 strains were taxonomically classified at the genus and species level and were deposited in the CM-CNRG with the following keys: Pseudomonas pal! Eroniana CM-CNRG 172, Pseudomonas extremorientalis CM-CNRG 144, and Serratia gnmesii CM- CNRG 197.
  • the growth capacity of the strains in the CAS medium was determined as mixtures, first the 4 strains with gender level as mixture A and the 3 strains identified as mixture B.
  • the CAS method in solution was used to estimate the percentage of units of siderophores produced. This is a colorimetric method consisting of mixing 0.5 ml_ of supernatant with 0.5 mL of the CAS medium, the absorbency was determined at a wavelength of 630 nm, the mixture of 0.5 mL of the medium without bacteria inoculum was used as blank and 0.5 mL of the CAS medium and the absorbance at 630 nm was determined (Jakare and Chavan, 2014). The following formula was used to obtain the percentage of siderophores units:
  • % US (Ar-As) / Arx100
  • Ar Reference absorbance at 630 nm
  • As absorbency of the sample at 630 nm
  • US siderophores units. This estimate is independent of the type of siderophore present (Aparna and Hevesh, 2012).
  • the Amow method was used to detect siderophores of the catecholate type, which is based on the ability to combine catechol with nitrous acid and a yellow compound is generated.
  • a mixture of 1 mL of the culture supernatant was made with 1 mL of 0.5 M HCI and 1 mL of the nitrite-molybdate reagent; 1 mL of 1 M NaOH was added to the mixture.
  • catecholates were determined by the formation of a yellow compound when the nitrite-molybdate reagent was added and a red color changed when the NeOH was added; absorbency was measured at a length of 500 nm wave; As a blank, the medium was used without inoculating plus the other reagents (Gorkan and Pal, 2010).
  • Hydroxamate type siderophores were detected using the Atkin method, which is a colorimetric method and is based on the combination of 0.5 mL of supernatant with 2.5 mL of Atkin reagent (0.1771 g Fe (CI04) 3, 1.43 mL of Perchloric acid, titrated in 100 mL of ddhbO), incubated at room temperature for 5 minutes; A positive result due to the presence of hydroxamates is indicated by the acquisition of an orange or red color. Absorbance was determined at a wavelength at 480 nm; the uninoculated medium plus the reagents mentioned above were used as blank (Angel et al., 2013).
  • the antifungal activity of the siderophores was evaluated by placing a disk of medium with mycelium of the fungus on a Petri dish with half a dextrose potato agar to which 0.2 mL of supernatant containing the siderophores was previously inoculated and homogenized with an acoustic glass rod sterile; the box was incubated at 32 ° C for 6 days and the growth of the fungus was recorded, a box with medium was used as a control without spreading the supernatant.
  • the percentage of Fusar ⁇ um inhibition by siderophores was obtained based on the following formula:
  • Pl is the percentage of Fusarium growth inhibition
  • C is the growth area of the fungus on the control plate
  • Fs is the growth area of the fungus with the supernatant (Syed and Vidhale, 2012).
  • the biomass of the strains was generated in CAS solid medium and bacterial suspensions were made in volumes ranging from 5 mL to 1000 mL of SSF with the transfer of biomass to fit a turbidity equivalent to tube 0.5 of the McFarland Nephelometer scale. Mixtures were made with the adjusted suspensions of the strains: Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, Serratia spp. CM-CNRG 199, Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, and Pseudomonas spp. CM-CNRG 200; in equal final volumes of each suspension up to 1000 mL volumes.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un cultivo mixto de cepas bacterianas con capacidad antagónica para hongos patógenos de cultivos con importancia agrícola y productoras de sideróforos; El objeto de esta invención es un cultivo mixto bacteriano aislado de la rizósfera de maíz que consiste en una suspensión de células de los microorganismos. El procedimiento de aislamiento y obtención de la mezcla microbiana forman el objeto de la presente invención y por tanto se considera que es una invención del área biotecnológica.

Description

MEZCLA BACTERIANA ALTAMENTE PRODUCTORA DE
SIDERÓFOROS, SU PROCESO DE OBTENCIÓN Y SU USO COMO
AGENTE INHIBIDOR DE FITOPATÓGENOS
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un cultivo mixto de cepas bacterianas con capacidad antagónica para hongos patógenos de cultivos con importancia agrícola y productoras de sideróforos; El objeto de esta invención es un cultivo mixto bacteriano aislado de la rizósfera de maiz que consistente en una suspensión de células de los microorganismos. El procedimiento de aislamiento y obtención de la mezcla microbiana forman el objeto de la presente invención y por tanto se considera que es una invención del área biotecnológica.
ANTECEDENTES
El uso de microorganismos rizosféricos como una alternativa biotecnológica en el control de microorganismos patógenos se práctica mediante la inoculación de semillas. Klopper en la década de los 70s, utilizo el término PGPR (plant growth promoting rizobacteria) para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benéfico en las plantas. La capacidad para colonizar las raices es una condición indispensable para que una bacteria sea considerada como una verdadera PGPR, siendo por tanto esa capacidad un primer paso y un rasgo crucial para la selección de los inoculos microbianos a ser usados como biofertilizantes, biopesticidas, fitosimuladores o biorremediadores (Peña y Reyes, 2007). La producción de sideróforos se ha asociado con diversas bacterias de vida libre (Loredo-Osti y cois., 2004). En teoría en respuesta a la limitación de hierro de las condiciones encontradas en la superficie aérea de las plantas o en la rizósfera, los microbios producen sideróforos in situ (Loper y Buyer, 1991). Varios factores ambientales pueden modular la síntesis de sideróforos, incluyendo el pH, los niveles de hierro y sus formas químicas, la presencia de otros elementos traza y una adecuada fuente de carbono, nitrógeno y fósforo (Compant y cois., 2005). Este es uno de los principales factores limitantes de nutrientes esenciales para la vida microbiana, dado que en la naturaleza del hierro no está fácilmente disponible en la forma preferida, ios microorganismos producen pequeñas moléculas quelantes llamados sideróforos para su adquisición. Los sideróforos también juegan un papel critico en la expresión de la virulencia y el desarrollo de biopelículas por diferentes microorganismos (Saha y cois. , 2013) .
En el estado de la técnica, encontramos métodos que divulgan procesos de obtención de sideróforos cuya mezcla comprende sacarosa, CAS, MM9, Agar, Pipes, Casamino, etc. , entre otras sustancias que consisten en disolver 60.5 de CAS en agua y mexclar con 10 mi de una solución A (1 Mm de cloruro férrico, 10 Mm hcL). Bajo agitación agregar lentamente 72.9 mg HDTMA disuelto en 40 mi de agua. Autoclavar la solución azul resultante. Por otro lado autoclavar una mezcla de 750 mi de agua, 100 mi de sales MM9 (X10), 15 g de agar, 30.24 g de Pipes (6.8). Luego enfriar agregar 30 mi de solución Casamina Acids al 10% y la fuente de carbono elegida como soluciones estériles. Agregar a la solución azul obtenida anteriormente, por las paredes con suficiente agitación para lograr la mezcla pero no formar espuma.
Otro método conocido para la producción de sideróforos consiste en modificar un medio CAS liquido con Casamina Acids 0.3%, sucrosa 0.2%, tiamina-HCI 0.0002% y succinato 0.2%, w/v que se usa para producir sideróforos en tres tiempos, primero son detectados con el medio liquido y en Agar son modificados en pequeñas muestras hasta obtener una mezcla azul oscuro, posteriormente se disuelve en una solución especifica y los sideróforos son evaluados en tabaco; posteriormente se realiza una doble destilación y deionización para preparar en al menos tres días;
Los procesos anteriormente descritos y divulgados, difieren en grado significativo con el de la presente invención, porque particularmente solo preparan la producción de los sideróforos en un nivel genérico, sin caracterizarlos, ni deducir la potencia de la actividad que tienen los productos obtenidos.
OBTENCION DE LA MEZCLA MICROBIANA
A. PREPARACION DE MUESTRAS. Se realizó la toma de 25 muestras de suelo de la zona de la rizósfera de una parcela para el cultivo de maíz; se mezclaron las 25 muestras en el interior de contenedores flexibles. Se pesaron 10 g de la mezcla de suelo y se realizaron al menos una dilución con una relación 1:10 (1x10 1 a 1x1 Qr7) en solución salina fisiológica (NaCI 0.85%). Se transfirieron alícuotas de 100 pL de las diluciones a cajas de Petri con medio Pikovskaya y CAS para la selección directa de productores de sideróforos; también se utilizaron los medios de gelosa nutritiva, arginina giicerol, B de King, para la selección de grupos microbianos específicos. Los medios de cultivo inoculados se incubaron entre los 25 y 47 °C por 18 a 64 h;
B. REACTIVACION DE CEPAS. Se seleccionaron cepas de los medios Pikovskaya y CAS que generaron un halo color naranja, indicador de la producción de sideróforos. Se reactivaron las cepas en medio solido CAS para corroborar la producción de sideróforos, se ajustaron suspensiones bacterianas en 5 mL de solución salina fisiológica al tubo 0.5 en la escala de McFarland. Se transfirió 1 mL de la suspensión bacteriana y se inocularon 100 mL de medio ácido succínico, compuesto por: K2HPO4 6.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, MgS04 0.2 g/L, (NH4>2S04 1.0 g/L y ácido succínico 4.0 g/L, pH 7.0; Se incubará a 28 °C en un agitador orbital, a 120 rpm por 24-30 h. Para obtener los sideróforos, 10 mL del medio inoculado se centrifugarán a 4696 g por 10 min; el sobrenadante se someterá a los análisis que se mencionan a continuación (Bholay y col., 2012). C. AISLAMIENTO Y SEPARACION DE CEPAS. Se seleccionaron aislamientos de los otros medios con morfología macroscópica y microscópica diferentes, se purificaron las cepas en el mismo medio de donde se aislaron. Los aislamientos puros se resembraron en medios de cultivo con diferentes substratos para la evaluación de diferentes capacidades metabólicas de los aislamientos (Tabla 1).
Figure imgf000005_0001
D. CRIOPRESERVACIÓN DE CEPAS. Las cepas caracterizadas se conservaron a largo plazo en criopreservación. Se preparó un inoculo a partir de cultivo en fase de crecimiento logarítmica tardía y previa a la fase estacionaria (18 a 48 h) de las cepas caracterizadas, se ajustó el inoculo en SSF a la turbidez 7 del nefelómetro de McFarland (2.1x10» UFC/mL). Se colocó el criotubo con 0.5 mL de leche descremada al 20% estéril en un baño de hielo y se transfirieron 0.5 mL del inoculo ajustado al tubo 7 del nefelómetro, se rotularon y se equilibró el crioprotector por 30 min en un baño de hielo, después se colocaron los tubos en un congelador a -20 °C durante 24 h, se almacenaron los tubos en un ultracongelador a -80 °C.
Las cepas fueron identificadas con el análisis de la secuencia de un fragmento de DNA del gen 16S rDNA con el uso de iniciadores universales para la identificación de procaríontes 27f (5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3') y 1492r (5*-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3'), la asignación de identidad se realizó con el análisis de las secuencias en la plataforma BLAST y se corroboró por medio de una reconstrucción filogenética in silico.
NOVEDAD Y DEPOSITO DE CEPAS.
Se logró la asignación de identidad de siete cepas, 4 cepas fueron clasificadas a nivel de género debido a que no se agruparon con alguna de las especies descritas del género bacteriano correspondiente lo que permite en el poder clasificarlas como nueva especie del género; las cepas fueron depositadas en la Colección de Microorganismos del Centro Nacional de Recursos Genéticos (CM-CNRG) del INIFAP (Tepatitlán de Morelos, Jalisco, México), con las siguientes claves: Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, Serratia spp. CM-CNRG 199, Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, y Pseudomonas spp. CM-CNRG 200. 3 cepas fueron clasificadas taxonómicamente a nivel de género y especie y fueron depositadas en la CM-CNRG con las siguientes claves: Pseudomonas pal!eroniana CM-CNRG 172, Pseudomonas extremorientalis CM-CNRG 144, y Serratia gnmesii CM- CNRG 197. Se determinó la capacidad de crecimiento de las cepas en el medio CAS como mezclas, primero las 4 cepas con nivel a género como mezcla A y las 3 cepas identificadas como mezcla B.
DETERMINACIÓN DE PORCENTAJE DE UNIDADES DE SIDERÓFOROS
Para estimar el porcentaje de unidades de sideróforos producidos se utilizó el método CAS en solución. Este es un método colorimétrico consiste en mezclar 0.5 ml_ de sobrenadante con 0.5 mL del medio CAS, la absorbencia se determinó a una longitud de onda de 630 nm, se usó como blanco la mezcla de 0.5 mL del medio sin inoculo de bacterias y 0.5 mL del medio CAS y se determinó la absorbencia a 630 nm (Jakare y Chavan, 2014). Para obtener el porcentaje de unidades de sideróforos se utilizó la formula siguiente:
%US= (Ar-As)/Arx100 Dónde: Ar = Absorbencia de referencia a 630 nm; As = absorbencia de la muestra a 630 nm; US = unidades de sideróforos. Esta estimación es independiente del tipo de sideróforo presente (Aparna y Hevesh, 2012).
CARACTERIZACIÓN DE SIDERÓFOROS Pere le detección de sideróforos tipo catecolato se utilizó el método de Amow, que se bese en le capacidad de combinación del catecol con ácido nitroso y se genere un compuesto de color amarillo. Se realizó una mezcla de 1 mL del sobrenadante del cultivo con 1 mL de HCI 0.5 M y 1 mL del reactivo nitrito-molibdato; a la mezcla se adicionó 1 mL de NaOH 1 M. Le presencie de catecolatos se determinó por la formación de un compuesto de color color amarillo al adicioner el reactivo nitrito-molibdato y un cambió a color rojo al adicioner el NeOH; se midió la absorbencia a una longitud de onda de 500 nm; como blanco se utilizó el medio sin inocular más los otros reactivos (Gorkan y Pal, 2010).
La detección de sideróforos tipo hidroxamato se obtuvo con el método de Atkin, que es un método colorímétrico y se fundamenta en la combinación de 0.5 mL de sobrenadante con 2.5 mL de reactivo de Atkin (0.1771 g de Fe(CI04)3, 1.43 mL de ácido perclórico aforado en 100 mL de ddhbO), se incuba a temperatura de la habitación por 5 minutos; un resultado positivo por la presencia de hidroxamatos se indica por la adquisición de un color naranja o rojo. Se determinó la absorbencia a una longitud de onda a 480 nm; el medio sin inocular más los reactivos antes mencionados se utilizaron como blanco (Angel y col., 2013).
El ensayo de Vogel (Dave y Dube, 2000) detectó la presencia de sideróforos del tipo carboxilato; se mezclaron 3 gotas de hidróxido de sodio 2 N y se adicionó una gota de fenolftaleína, se adicionaron de 2 a10 gotas de agua hasta que la mezcla desarrolló un color rosa, se adicionó ei sobrenadante de cada una de las cepas y se consideró un resultado positivo si el color rosa desapareció. Se hizo una curva de calibración con desferramina B y ácido 2,3-hidrobenzoico para la cuantificación de sideróforos de tipo catecolato e hidroxamato respectivamente. EVALUACIÓN in vitro DE LA ACTIVIDAD ANTAGÓNICA DE SIDERÓFOROS a Fusaríum
La actividad antifúngica de los sideróforos se evaluó al colocar un disco de medio con micelio del hongo sobre una caja de Petri con medio agar papa dextrosa al que previamente se inocularon 0.2 mL de sobrenadante que contiene los sideróforos y se homogeneizo con una varilla de vidrio acodad estéril; se incubó la caja a 32 °C por 6 dias y se registró el crecimiento del hongo, se usó como control una caja con medio sin el extendido del sobrenadante. Se obtuvo el porcentaje de inhibición de Fusaríum por los sideróforos con base a la siguiente formula:
Figure imgf000009_0001
Dónde: Pl es el porcentaje de inhibición de crecimiento de Fusarium, C es el área de crecimiento del hongo en la placa control y Fs es el área de crecimiento del hongo con el sobrenadante (Syed y Vidhale, 2012). OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO PARA LA PRODUCCIÓN DE SIDERÓFOROS
Para optimizar la producción de sideróforos se hicieron pruebas con las variables: pH (4 a 8), concentración de agente quelante (PIPES 0.5% al 3%), temperatura (20 °C a 42 °C) y fuente de carbono (glucosa, sacarosa y ácido succínico del 0.5% al 6%) (Tailor y Joshi, 2012). GENERACIÓN DE LAS MEZCLAS MICROBIANAS
Se generó la biomasa de las cepas en medio solido CAS y se hicieron suspensiones bacterianas en volúmenes que van desde 5 mL a 1000 mL de SSF con la transferencia de biomasa hasta ajusfar a una turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala del Nefelómetro de McFarland. Se hicieron mezclas con las suspensiones ajustadas de las cepas: Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, Serratia spp. CM-CNRG 199, Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, y Pseudomonas spp. CM-CNRG 200; en volúmenes finales iguales de cada suspensión hasta volúmenes de 1000 mL. Se realizó otra mezcla con las cepas: Pseudomonas palleroniana CM-CNRG 172, Pseudomonas extremoríentalis CM-CNRG 144, y Serratia grimesii CM-CNRG 197; en volúmenes finales iguales de cada suspensión hasta volúmenes de 1000 mL. Las De las mezclas se tomaron volúmenes iguales para generar una mezcla microbiana con las cepas de los géneros Pseudomonas y Serratia productoras de sideróforos y con capacidad antagónica al género Fusarium. REFERENCIAS
Syed, S. A., Vidhale N. 2012. Antagonistic Activlty of Siderophore Producing Pseudomonas Aeruginosa against Aspergillus Spp. and Candida Albicans. Research journal of pharmaceutical, biological and chemica! sciences. 3, 719-726.
Nagoba, B., Vedpathak D., 2011. Medical applications of sidefophores. Eur. J. Gen. Med. 8, 229-235.
Kannahi, M., Senbagam, N. 2014. Studies on siderophore production by microbial isolates obtained from rhizosphere soil and its antibacterial activity. J. Chem. Pharm. Res. 6, 1142-1145
Seyesayamdost, M. R., Cleto, S., Carr, G., Vlamakis H., Vieira, M. J. 2012. Mixing and matching clusters: structure and biosynthesis of serratiochelin from serratia sp. V4. J. Am. Chem. Soc. 134, 13550-13553.
Aguado, G., Moreno, B., Jiménez, B. García, E., Preciado. R. E., 2012. Impacto de los sideróforos y fitosideróforos en la asimilación de hierro por las plantas: una síntesis. Rev. Fitotecnia Mexicana. 35, 9 - 21.
Saharan, B. S., Nehra. V. 2011. Plant growth promoting rhizobacteria: A critical review. Life Sciences and Medicine Research. 2011: LSMR-21.
García, M., Cardoso. E. F., Lechner, B. E., Gauthier, G. M., Lidner, H., Meló A., Haas, H. 2014. Hydroxamate production as a high affinity iron acquisition mechanism in Paracoccidiodes Spp. PLOS ONE. 9(8): e105805. do¡:10.1371/journal.pone.0105805
Ahmed, E., Holmstróm, S. J. M. 2014. Siderophores in environmental research: roles and applications. Microbial Biotechnology. 7, 196-208. Yétérian, E. 2010. Bases moléculaires de la maturation et de la sécrétion de la pyiverdine chez Pseudomonas aeruginosa. (Tesis doctoral). Universidad de Estrasburgo. Francia. Disponible en: http://scd-theses.u- strasbg.fr/1921/0lAYETERIAN_Emilie_2010r.pdf. Accesado el 23/06/2015.
Bhattacharya, A. 2010. Siderophore mediated metal uptake by pseudomonas fluorescens and its comparison to iron (iii) cheiation. Cey. J. Sci. (Bio. Sci.). 39, 147-155.
Syed, S. A., Vidhale N. 2013. Bacterial siderophore and their a ppl ¡catión: A review. Int. J. Curr. Microbiol. App.Sci. 2, 303-312.
Tailor, A. J , Joshi, B. H. 2012. Characterization and optimization of siderophore production from Pseudomonas fluorescens strain isolated from sugarcane rhizosphere. Journal of environmental research and development. 6, 688-694.
Bholay, A. D., Jadhav, P. U„ Borkataria, B. V., Mayuri, V. D. 2012. Fluorescent pseudomonads as plant growth promoting rhizobacteria and their siderophoregenesis Journal of pharmacy and biological sciences. 3, 27- 32.
Jakare, A. M., Chavan, M. D. 2014. Enhanced plant growth by siderophore producing Enterobacter spp. mz-12. Bionano Frontier. 7, 49-52.
Aparna, J. T., Bhavesh H. J. 2012. Characterization and optimization of siderophores production from Pseudomonas fluorescens strain isolated from sugarcane rhizosphere. Journal of environmental research and development. 6, 688-794.
Gorkan, K., Pal, R.B. 2010. Siderophores and pathogenecity of microogamisms. J. Biosci. Tech. 1, 127-134.
Angel, M. R., Reena, A., Aysha, O. S., Valli, S., Nirmala, P., Vinothkumar, P., 2013. Isolation of siderophore producing bacteria from rhizophere soil and their antagonistic activity against selected fungal plants pathogens. lnt.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 2, 59-65. Dave, B. P., Dube, H. C, 2000. Chemical characterization of fungal siderophores. Indian journal of experimental biology. 38, 56-62.
Sayyed, R. Z., Patel, P. R. 2011. Biocontrol potencial of siderophore producing heavy metal resistant Aicaligenes sp. and Psudomonas aeruginosa RZS3 vis-á-vis organophosphorus fungicide. Indian J. Microbiol. 51, 266-272.
Dehner, C, Awaya, J., Maurice, PM DuBois, J. 2010. Roles of siderophores, oxalate, and ascorbate in movilization of iron from hematite by aerobio bacterium Pseudomonas mendocina. Applied and environmental microbiology. 76, 2041-2048.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiendo descrito suficientemente mi invención, lo que considero como una novedad y por io tanto reclamo de mi exclusiva propiedad las siguientes reivindicaciones:
1. Un proceso para la producción de compuestos bacterianos (cepas) altamente productores de sideróforos caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
A. PREPARACION DE MUESTRAS. Se toman 25 muestras de suelo de la zona de la rizósfera de una parcela para el cultivo de maíz; se mezcla en el interior de contenedores flexibles. Se pesan 10 g de la mezcla de suelo y se realizaron al menos una dilución con una relación 1 :10 (1x10'1 a 1x107) en solución salina fisiológica (NaCI 0.85%). Se transfirieren alícuotas de 100 μΙ_ de las diluciones a cajas de Petri con medio Pikovskaya y CAS para la selección directa de productores de sideróforos; también se utilizan los medios de gelosa nutritiva, arginina glicerol, B de King, para la selección de grupos microbianos específicos. Los medios de cultivo inoculados se incuban entre los 25 y 47 °C por 18 a 64 h;
B. REACTIVACION DE CEPAS. Se seleccionan cepas de los medios Pikovskaya y CAS que generaron un halo color naranja, indicador de la producción de sideróforos. Se reactivan las cepas en medio solido CAS para corroborar la producción de sideróforos, se ajustan suspensiones bacterianas en 5 ml_ de solución salina fisiológica al tubo 0.5 en la escala de McFarland. Se transfieren 1 ml_ de la suspensión bacteriana y se inocularon 100 ml_ de medio ácido succínico, compuesto por: K2HPO4 6.0 g/L, KH2PO4
3.0 g/L, MgSO4 0.2 g/L, (NH4)2SO41.0 g/L y ácido succínico 4.0 g/L, pH 7.0; Se incuban a 28 °C en un agitador orbital, a 120 rpm por 24-30 h. Para obtener los sideróforos, 10 mL del medio inoculado se centrifugan a 4696 g por 10 min;
C. AISLAMIENTO Y SEPARACION DE CEPAS. Se seleccionan aislamientos de los otros medios con morfología macroscópica y microscópica diferentes, se purifican las cepas en el mismo medio de donde se aislaron. Los aislamientos puros se resiembran en medios de cultivo con substratos como Gelosa gelatina, Gelosa Leche, Gelosa almidón, Gelosa Baird- Parker, Caldo nitrato, Gelosa Acetato de Fowller, Gelosa Azul Victoria, Gelosa quitina coloidal, Gelosa con lignina, entre otros, y se evalúan las capacidades metabólicas de los aislamientos; y
D. CRIOPRESERVACIÓN DE CEPAS. Las cepas caracterizadas se conservan largo plazo en criopreservación. Se prepara un inoculo a partir de cultivo en fase de crecimiento logarítmica tardía y previa a la fase estacionaria (18 a 48 h) de las cepas caracterizadas, se ajusta el inoculo en SSF a la turbidez 7 del nefelómetro de McFarland (2.1x10· UFC/mL). Se coloca el criotubo con 0.5 mL de leche descremada al 20% estéril en un baño de hielo y se transfirieren 0.5 mL dei inoculo ajustado al tubo 7 del nefelómetro, se rotulan y se equilibró el crioprotector por 30 min en un baño de hielo, después se colocan los tubos en un congelador a -20 °C durante 24 h, se almacenan los tubos en un ultracongelador a -80 °C. 2. Una cepa denominada Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 3. Una cepa denominada Serratia spp. CM-CNRG 199, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno;
4. Una cepa denominada Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno;
5. Una cepa denominada Pseudomonas spp. CM-CNRG 200, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno;
6. Una cepa denominada Pseudomonas palleroniana CM-CNRG 172, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno;
7. Una cepa denominada Pseudomonas extremorientalis CM-CNRG 144, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 8. Una cepa denominada Serratia grímesii CM-CNRG 197, caracterizada porque fue obtenida a través dei proceso de preparación de la reivindicación uno;
9. El compuesto de biomasa bacteriana donde los microorganismos fueron aislados, seleccionados, conservados y depositados de conformidad con las reivindicaciones dos, tres, cuatro, cinco, seis y siete caracterizado porque se obtiene de un proceso que comprende el aislamiento tos morfotipos bacterianos compatibles en medios de cultivo selectivos, medio B de King, Arginina glicerol, medio Czapeck, gelosa nutritiva, a una temperatura de 35 °C a 37 °C durante 18 a 48 horas en condiciones aeróbicas y de obscuridad; 10. El compuesto de biomasa bacteriana de la reivindicación nueve caracterizado porque el proceso de aislamiento los morfotipos bacterianos compatibles en medios de cultivo selectivos, medio B de King, Arginina glicerol, medio Czapeck, gelosa nutritiva, a una temperatura de 35 °C a 37 °C durante 18 a 48 horas en condiciones aeróbicas y de obscuridad, es el de la reivindicación uno.
11. Un procedimiento para la selección de los morfotipos bacterianos compatibles con los género Pseudomonas y Serratia, se fundamenta en lo establecido en el manual de taxonomía sistemática de Bergey para las características de morfología colonial y microscópica, además de la siembra de las cepas en medios de cultivo selectivos de la reivindicación 1 para la obtención de cultivos axénico;
12. Los compuestos de las reivindicaciones diez y once realizado en medios de cultivos formulados en laboratorio caracterizado porque evidencia la capacidad de producción de sideróforos y compuestos con actividad antimicrobiana y su fijación de nitrógeno atmosférico:
13. El uso de los compuestos de la reivindicación doce caracterizados porque tienen actividad como agente inhibidor de fitopatógenos en cultivos preferentemente con importancia agrícola.
PCT/MX2016/000128 2015-12-14 2016-12-07 Mezcla bacteriana altamente productora de sideroforos, su proceso de obtención y su uso como agente inhibidor de fitopatogenos WO2017105209A2 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2015017262A MX2015017262A (es) 2015-12-14 2015-12-14 Mezcla bacteriana altamente productora de sideroforos, su proceso de obtención y su uso como agente inhibidor de fitopatogenos.
MXMX/A/2015/017262 2015-12-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2017105209A2 true WO2017105209A2 (es) 2017-06-22
WO2017105209A3 WO2017105209A3 (es) 2017-11-09

Family

ID=59056961

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/MX2016/000128 WO2017105209A2 (es) 2015-12-14 2016-12-07 Mezcla bacteriana altamente productora de sideroforos, su proceso de obtención y su uso como agente inhibidor de fitopatogenos

Country Status (2)

Country Link
MX (1) MX2015017262A (es)
WO (1) WO2017105209A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628664A (zh) * 2019-08-15 2019-12-31 华中农业大学 防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116179412B (zh) * 2022-11-25 2024-03-22 华南农业大学 一种具有产铁载体拮抗青枯病的菌体及其应用
CN116218730B (zh) * 2023-03-01 2023-10-10 贵州省烟草科学研究院 一种防治烟草黑胫病的菌剂

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4479936A (en) * 1982-09-27 1984-10-30 Microlife Technics, Inc. Method for protecting the growth of plants employing mutant siderophore producing strains of Pseudomonas Putida
HU231353B1 (hu) * 2014-02-10 2023-03-28 BioFil Mikrobiológiai, Géntechnológiai és Biokémiai Kft Stressztalajok oltására szolgáló talajbaktériumok

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628664A (zh) * 2019-08-15 2019-12-31 华中农业大学 防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
MX2015017262A (es) 2017-06-13
WO2017105209A3 (es) 2017-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sharma et al. The interaction between Rhizoglomus irregulare and hyphae attached phosphate solubilizing bacteria increases plant biomass of Solanum lycopersicum
Jaiswal et al. Biochar as a management tool for soilborne diseases affecting early stage nursery seedling production
Lakshmi et al. Isolation and characterization of deleterious Pseudomonas aeruginosa KC1 from rhizospheric soils and its interaction with weed seedlings
Ashraf et al. Plant growth promoting rhizobacteria and sustainable agriculture: a review
Patel et al. Alleviation of salt stress in germination of Vigna radiata L. by two halotolerant Bacilli sp. isolated from saline habitats of Gujarat
JP2014516042A (ja) 生物学的な植物保護のための液体調製物、その製造方法及びその使用
Gamalero et al. Screening of bacterial endophytes able to promote plant growth and increase salinity tolerance
Wang et al. Phosphate solubilization of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans from mycorrhizal and non-mycorrhizal cucumber plants
Parray et al. Screening of beneficial properties of rhizobacteria isolated from Saffron (Crocus sativus L) rhizosphere
Gupta et al. Analysis of plant growth promoting potential of endophytes isolated from Echinacea purpurea and Lonicera japonica
Kaushal et al. Acetylene reductase activity and molecular characterization of plant growth promoting rhizobacteria to know efficacy in integrated nutrient management system
Nath et al. Screening of Endophytic Bacterial Isolates of tea (Camellia sinensis L.) Roots for their Multiple Plant Growth Promoting Activities.
Lima-Rivera et al. Phosphate solubilization by fungi with nematicidal potential
WO2017105209A2 (es) Mezcla bacteriana altamente productora de sideroforos, su proceso de obtención y su uso como agente inhibidor de fitopatogenos
Tarkka et al. Mycorrhizal microbiomes
Borah et al. Diversity of culturable endophytic bacteria from wild and cultivated rice showed potential plant growth promoting activities
Guerrieri et al. Integrated genomic and greenhouse assessment of a novel plant growth-promoting rhizobacterium for tomato plant
Yang et al. Plant growth-promoting rhizobacteria HN6 induced the change and reorganization of Fusarium microflora in the rhizosphere of banana seedlings to construct a healthy banana microflora
Egamberdieva Colonization of Mycobacterium phlei in the rhizosphere of wheat grown under saline conditions
Çam et al. Bacillus strains exhibit various plant growth promoting traits and their biofilm-forming capability correlates to their salt stress alleviation effect on maize seedlings
Puri et al. Evaluating lodgepole pine endophytes for their ability to fix nitrogen and support tree growth under nitrogen-limited conditions
Lee et al. Isolation and identification of Burkholderia pyrrocinia CH-67 to control tomato leaf mold and damping-off on crisphead lettuce and tomato
Berg et al. PGPR interplay with rhizosphere communities and effect on plant growth and health
Barquero et al. Biocontrol of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli and Phytophthora capsici with autochthonous endophytes in common bean and pepper in Castilla y León (Spain)
Yaadesh et al. A zospirillum–Bacillus associations: synergistic effects on in vitro PGP traits and growth of pearl millet at early seedling stage under limited moisture conditions

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16876106

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16876106

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2