WO2017099572A1

WO2017099572A1 - Diterpenos de salvia amarissima y su uso como moduladores de la multiresistencia a fármacos en tumores

Info

Publication number: WO2017099572A1
Application number: PCT/MX2016/000126
Authority: WO
Inventors: Alfredo Roberto ORTEGA HERNÁNDEZ; Alfredo Rubén TOSCANO; Francisco Elihú BAUTISTA REDONDA; Mabel Clara FRAGOSO SERRANO
Original assignee: Universidad Nacional Autónoma de México
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2017-06-15
Also published as: MX2015016921A; MX373100B

Abstract

Con este objetivo, en la presente invención se describen y reclaman extractos / fracciones y compuestos obtenidos de los mismos, que comprenden diterpenos con un esqueleto carbonado novedoso no convencionales y sus propiedades farmacológicas, aislados de Salvia amarissima. Asimismo, la invención se relaciona a los extractos y/o fracciones estandarizadas y compuestos obtenidos de los mismos de la clase de diterpenos útiles como modulares de la multiresistencia a fármacos en carcinoma de mama.

Description

DITERPENOS DE Salvia amarisslma Y SU USO COS^O MODULADORES DE LA MULTIRESISTENCIA A FÁRMACOS EN TUMORES

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con el campo de la química medicina!, farmacéutica y oncología, describe compuestos novedosos diterpenos a partir de una fuente naturai úfiies como moduladores de la muiíiresisíencia a fármacos en carcinoma de mama.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el campo de !a farmacognosia y ía fitoquímica, se realiza un esfuerzo continuo para encontrar nuevas fuentes de compuestos nuevos o compuestos que se conozca poseen actividad biológica útií a ia humanidad en diversas áreas de aplicación. Se realiza trabajo sustancial para encontrar, por ejemplo, fuentes de compuestos activos contra enfermedades crónicas, condiciones metabólicas o proliferación celular no controlada. En las céluias tumoraies, la pérdida gradual de la hipersensibilidad a agentes anticancerígenos da origen ai fenómeno de muStiresistencia a fármacos [Véase Komarova, M. I...; Wodarz, D. Proc. Nati Acad. Se/, U.S.A. 2005, 102, 9714-9719, Incluida como referencia en su totalidad.] Este fenómeno es originado por distintos mecanismos moleculares; uno de los principales y comúnmente descritos es la resistencia mediada por ias bombas de extrusión o eflujo, y constituye una de las principales causas de! fracaso de ia quimioterapia contra el cáncer [Véase Kruh, G. D., Oncogene 2003, 22, 7262-7264. Véase también Szákacs, G,; Hall, M. D.; Gotíesman, M. M.; Boumendjel, A. ; Kachadourian, R.; Day, B. J.; Baubichon-Cortay, H.; Di Pietro, A. Chem. Rev. 2014, 114, 5753-5774. Todas las anteriores, incluidas como referencia en su totalidad.] La multiresistencia a fármacos es preocupante aun cuando el tratamiento consistiera de una combinación de fármacos con dianas múltiples. Para resolver este problema de resistencia se han planteado diversas estrategias, una de ellas es la identificación de moduladores de la multiresistencia. Actualmente se dispone de varios moduladores de ia muítiresistencia cruzada a fármacos antineopiásicos (e.g. quinina, verapamil, reserpina, ciclosporina A, tariquinor, etc), sin embargo su uso está limitado debido a las altas dosis requeridas para obtener un efecto modulador y a los efectos adversos asociados[Véase Karthikeyan, S.; Hoti, S. L. Anti-Cancer Agents ¡n Medicina! Chemistry 2015, 15, 605-615. Incluida como referencia en su totalidad.] En este sentido, los metaboiitos aislados de especies vegetales del género Salvia han demostrado tener propiedades fisicoquímicas que les confieren un tamaño y lipofilia adecuadas para atravesar membranas celulares y capacidad para interaefuar con blancos moleculares de interés terapéutico[Véase Butelman, E. R.; Prisinzano, T. E.; Deng, H.; Rus, S.; Kreek, . J. J, Pharmacol. Exp. Ther. 2009, 328, 588-597. Véase también. Teksin, Z. S.; Lee, i. J.; Nemieboka, N. .; Gthman, A. A.; Upreti, V. V.: Hassan, H. E., Syed, S. S.; Prlsinzano, T. E.; Eddington N. D. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, 72, 471-477. Todas las anteriores, incluidas como referencia en su totalidad.] Adicionaímente, compuestos de este género han mostrado actividad ciíotóxica contra células cancerosas en humanos. [Véase Faie!la, L; Da! Piaz, F.¡ Bisio, A.; Tosco, A.; De Tornmasi, N. Mol. BioSyst. 2012, 8, 2637-2644. Véase también Vasiljevik, T.; Groer, C. E.; Lebner, .; Navarro, H.; Prisinzano, T. E. J. Nat. Prod. 2014, 77, 1817-1824. Véase también Bautista, E.; a!donado, E.; Ortega, A. J. Nat. Prod. 2012, 75, 951-958). Todas las anteriores, incluidas como referencia en su totalidad.]

En particular, S. amarissima ha sido sujeta a diversos estudios sobre su composición química, que ha dado lugar al aislamiento de la amarisolída, un glicósído de neoclerodano. Más aún, las propiedades farmacológicas de los compuestos pertenecientes a esta especie no se han descrito a la fecha.

Anteriormente, aldonado E.; Cárdenas, J.; Bojórquez, H.; Escamiila, E. M.; Ortega, A. Amarisolide, a neo-cierodane diterpene glycoside frorn Salvia amarissima. Phytochemistry 1998, 42, 1 105- 108 (incluida como referencia en su totalidad), describen ei aislamiento en alto rendimiento y la elucidación estructural de un gücósido de clerodano aislado de las partes aéreas de una población de Salvia amarissima colectada en Oaxaca, México, Se liberó y caracterizó estructuralmente la aglicona a través de una bsotransformación empleando una cepa de Fusarium miíirsiforme. No describe su evaluación biológica.

A su vez, López-Ferrer, C. E.; Sáncbez-Dirso. M. G.; Arrieta-Baez, D.; Román-García, J. H. Estudio preliminar fítoquímico y de la actividad antimicrobiana de Salvia amarissima Ort. Investigación Universitaria Multidisciplinaria 2010, 9, 67-76, {incluida como referencia en su totalidad) describen la obtención y evaluación de la actividad antibacteriana de ¡os extractos de hexano, metano! y agua de sus partes aéreas. Las cepas contra las que se ensayaron los extractos son: Escherichia cois ATCC 8739, Klebsielia pneumonías ATCC 13883, Pseudo onas aeruginosa ATCC 9027, Saimoneila tiphy ATCC 6539, Shigelia fíexneri 12022, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Micrococcus ¡uteus ATCC 12228 y Bacfflus subtilis ATCC 29212, Los resultados de esta evaluación no indicaron actividad antibacteriana significativa.

Por otro lado, a la fecha se han presentado y concedido patentes, como la patente US 9,024,043 referentes a compuestos de la clase de diterpenos de fórmula general A - en donde R1 , R2, R3 y 4 pueden ser ya sea alfa o beta orientados, R1 y R3 son -OH o los sustituyentes R1 y R3 juntos forman un enlace peróxido (-0-0-), R2 y R4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de H y OH - aislados de Anisochilius (Lamiaceae), y sus extractos y/o fracciones útiles para el tratamiento, prevención, inhibición o coníroi de crecimiento y profileración de la actividad de micobacíerias en mamíferos; así como el uso de los extractos y fracciones estandarizados de dichos compuestos de la clase diterpenos para el tratamiento de cánceres.

Fórmula general A

También se ha estudiado la capacidad como moduladores de MDR de compuestos provenientes de Ipomoea, purgina II y jaíapinosido, en donde los dos compuestos son potentes moduladores de ía muítiresistencia. Sus limitantes son el rendimiento obtenido durante su aislamiento que es demasiado bajo debido a su complejidad estructural y fas metodologías empleadas para su purificación (HPLC-prep), hacen demasiado costosa su obtención. Por otra parte la síntesis total de estos productos tampoco es rentable debido a ía gran cantidad de pasos implicados y su bajo rendimiento. [Véase Castañeda-Gómez, J.; Figueroa-González, G.; Jacobo, N.; Pereda-Miranda, R. J. Nat. Prod. 2013, 76, 64-71. Véase también Bautista, E.; Fragoso-Serrano, .; Pereda-Miranda, R. J. Nat. Prod. 2015, 78, 168-172. Todas las anteriores, incluidas como referencia en su totalidad.]

A pesar de la cantidad de extractos de plantas que se han seleccionado y examinado por su capacidad antícancerígena, o moduíadora de MDR, ninguno presenta resultados alentadores; por el contrario, los extractos de Salvia amarissima, inesperadamente mostraron propiedades potentes como agentes citotóxicos contra el cáncer, así como DRs. Así mismo, ios compuestos obtenidos de ios extractos/fracciones y posteriormente aisíados y purificados, mostraron propiedades potentes mayores como MDRs que las logradas con fármacos conocidos control.

Con este objetivo, en la presente invención se presentan los resultados de los ensayos con los extractos y/o fracciones y compuestos aislados de los mismos que comprenden diterpenos a partir de Salvia amarissima, útiles como agentes citotóxicos para la prevención, tratamiento, inhibición o control del cáncer en mamíferos. La invención se relaciona además a ¡os extractos y/o fracciones estandarizadas y compuestos aislados de los mismos, de la clase de diterpenos útiles como moduladores de ía muítiresistencia a fármacos en carcinoma de mama, coíon y cérvix, en donde dichos compuestos son un nuevo tipo de moduladores de origen vegetai.

SUDARIO DE LA INVENCIÓN

En ia presente invención, se presentan compuestos novedosos diterpenos con esqueletos de carbono no convencionales así como sus propiedades farmacológicas, obtenidos a partir de Salvia amarissima, para el tratamiento de carcinomas y como moduladores de la muitiresistencia a fármacos (MDR),

Más particularmente, ia presente invención presenta tos extractos y/o fracciones, obtenidos de Salvia amarissima, y compuestos aislados de los mismos, que comprenden diterpenos, útiles como agentes citotóxicos para la prevención, tratamiento, inhibición o control del cáncer en mamíferos. La invención se relaciona además a los extractos y/o fracciones estandarizadas y compuestos aislados de ios mismos, de la clase de diterpenos útiles como moduladores de la muitiresistencia a fármacos en carcinoma de mama, colon y cérvix, en donde dichos compuestos son un nuevo tipo de modulares de origen vegetal.

Los extractos y/o fracciones obtenidos de S. amarissima que comprenden diterpenos, están representados por ios compuestos 1-4. En una modalidad de ia presente invención, el compuesto de fórmuia 1 está representado por un esqueleto carbonado novedoso y no convencional al que se llama amarisano.

Fórmula 1

En una modalidad adicional de la presente invención, los compuestos de fórmula 2-4, están representados por un esqueleto carbonado de clerodano, en donde el compuesto 2 está representado por un esqueleto carbonado de 9,10-seco clerodano:

en donde ei compuesto 1 es (4R,6S.6¾_I7S,8^,E,10^,Z)- ,7-dihidroxi-6'-metil-4,7-dihidro-3^,H,5H- espirofl-benzoíuran-ej'-cidodecalcIfuranJ-l'.S^'H^'H^diona (también llamado teotihuacanina); en donde el compuesto 2 es {3aR)-3a-(2-(6-(furan-3-!l}-4-meti!-2-oxo-2H- piran-3-ii)etil)-7a-h!droxi"3,3a,7,7a-tetrahidroisobenzofuran-1 ,4-diona (Amarissina A); en donde el compuesto 3 es {2S.3S,5R_!6a^,R,8^,S_!10a^,S)-5-(furan-3-il)-2"hidroxi-8^,-metil-4,5_I8M0^*- tetra idro-2H-espiro[furan-3,7'-na to[1 ,8a-c]furar_l]-3'₎9'(1'H,6a"H)-diona (Amarissina B); y en donde el compuesto 4 es (3R_!4aS_!4bS,7aS,10aS,12aS)-3-(furan-3-ií)-4b,7a-dihidroxi-4a- metil-4,4a,4b,5,10,11 ,12,12a-octahidroisobenzofuro[4,3a-f]isocromen-1 ,8(3H,7aH)-diona (Amarissina C).

En otra modalidad de la presente invención, los compuestos de fórmulas 1-4 se aislan de tas extractos y/o fracciones obtenidos a partir de Sa/v/^'a amarissims.

En otra modalidad, los compuestos 1-4 se aislaron de la fracción de AcOEt.

Es otro objeto de la invención ia aplicación de los diterpenos de fórmula 1-4 como agentes citoíóxicas y como nuevos tipos de moduladores de origen vegetal contra ia multiresistencia a fármacos en carcinoma de mama, colon y cérvix.

Es un objeto de ía presente invención la aplicación del dipterpeno de fórmula 1 , obtenido y aislado de las partes aéreas de Saivia amarissima como modulador de la multiresistencia a fármacos en carcinoma de mama, colon y cérvix.

Es otro objeto de la presente invención la aplicación del compuesto de fórmula 1 en la resensibilización a vinblastina contra tumores resistentes a este aníicancerígeno.

Es otro objeto de la presente invención, describir y proteger un proceso para ¡a extracción de compuestos de fórmula 1 , 2, 3 y 4, en donde dicho proceso comprende;

a . Secar las hojas y flores;

b . Moler las hojas y flores secas;

c . Realizar una extracción por percolación con disolvente hasta obtención de un residuo; d . Someter a partición con hexano;

e . Realizar extracciones con MeOH/H₂0 80:20 y obtener los extractos respectivos; . Concentrar la fracción hidroalcohóíiea y someter a partición con AcOEt, obteniendo fracciones de AcOEt;

g . Someter a aislamiento y purificación los compuestos diterpenos con cromatografía en columna con un sistema de alusión con disolventes polares y no polares, y cromatografía de líquidos de alta resolución.

En un objeto adicional de la presente invención, la estructura del compuesto de fórmula 1 representa una plataforma química (scaffoíd) para el desarrollo de nuevos moduladores de ia multiresistencia en la quimioterapia del cáncer. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra la estructura química de ios compuestos de fórmula 1-4, diterpenos obtenidos y aislados de Salvia amaríssi a.

Figura 2. Diagrama ORTEP del compuesto de fórmula 1.

Figura 3. Diagrama ORTEP del compuesto de fórmula 2.

Figura 4. Espectro Ή RMN de teotihuacanina en CDCI₃ + DMSOd6

Figura 5. Espectro ¹³C RMN de teotihuacanina en CDC¡₃ + DMSO-d6

Figura 6. Espectro Ή-CÜSY de teotihuacanina en CDCI₃ + D SO-d6

Figura 7. Espectro HSQC de teotihuacanina en CDCI₃ + DMSO-cf6

Figura 8, Espectro HMBC de teotihuacanina en CDCI₃ + DMSO-d8

Figura 9. Espectro NOESY de teotihuacanina en CDCI₃ + DMSO~d6

Figura 10. Difracción de rayos-X de monocristai de teotihuacanina.

Figura 11. Difracción de rayos-X de monocristai del compuestos de fórmula 2.

Figura 12. Espectro de Ή RMN del compuesto 2 (CDCI₃ + D SO-cfo 500MHz).

Figura 13. Espectro de ¹³C RMN dei compuesto 2 (CDCI₃ + DMSG~d₆, 125MHz).

Figura 14. Espectro Ή-¹Η COSY del compuesto 2 (CDCI₃ + DMSQ-cf₆).

Figura 15. Espectro HMBC del compuesto 2 (CDCI₃ + D SO~d_s).

Figura 16. Espectro NOESY dei compuesto 2 (CDCI₃ + DMSO-cí₆).

Figura 17. Espectro de Ή RMN del compuesto 3 (CDCI_3> 500MHz).

Figura 18. Espectro de ³C RMN del compuesto 3 (CDCI₃, 125MHz).

Figura 19. Espectro ¹H-¹H COSY dei compuesto 3 (CDCI₃).

Figura 20. Espectro HSQC del compuesto 3 (CDC!₃).

Figura 21. Espectro HMBC del compuesto 3 (CDCI₃).

Figura 22. Espectro NOESY de! compuesto 3 (CDCI₃).

Figura 23. Espectro de Ή RMN del compuesto 4 (CDC!₃ + DMSO~d_e> 500MHz).

Figura 24. Espectro de ³C RMN de! compuesto 4 (CDCI₃ + DMSO-efe 125MHz).

Figura 25. Espectro ¹H- H COSY del compuesto 4 (CDC!₃ + DMSO-c/₆).

Figura 26. Espectro HSQC del compuesto 4 (CDCI₃ + DMSO~d₆).

Figura 27. Espectro HMBC del compuesto 4 (CDCI₃ + DMSO-c/e).

Figura 28. Espectro NOESY del compuesto 4 (CDC¡₃ + DMSO-c/₆).

Figura 29. Espectro de Masas de baja resolución del compuesto 1.

Figura 30. Espectro de Masas de alta resolución el compuesto 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En la presente invención, se entiende por "extracto" a ia preparación de consistencia líquida, semisóiida, o sólida obtenidos a partir de drogas vegetales o tejidos animales por el uso de disolventes o fluidos supercríticos. Asimismo, en la presente invención, se debe entender como "fracción", a la parte de un extracto, obtenida a través del uso de un método de separación de mezclas (e. g. extracción líquido-líquido, cromatografía, centrifugación, eíc); mientras que para ia presente invención, se entiende que un "extracto estandarizado" es una cantidad aceptable {intervalo} de una sustancia con actividad terapéutica conocida.

Salvia amaríssima es una planta herbácea endémica de México. Salvia amañssima se recolectó en Sas inmediaciones del municipio de Teotihuacán, y los compuestos se extraen y aislan utilizando disolventes co o acetona, metano!, acetato de etilo, cloroformo, hexarso, diclorornetano o combinaciones de ios mismos, llevando - posterior a una cromatografía en columna con gel de sílice y empleando uno o más sistemas como mezclas de elusión, y cromatografía de líquidos de alta resolución - al aislamiento de los mismos.

Los compuestos tal como se aislaron de los extractos y fracciones obtenidas de SaMa amañssima, fueron sujetos a elucidación estructural por metodologías y técnicas analíticas conocidas por una persona con conocimientos en la técnica y se encontró que comprenden compuestos díterpénicos, con un esqueleto carbonado novedoso no convencional al que se llama amarisano, representado por ejemplo, por el compuesto de fórmula 1 , y/o con un esqueleto carbonado de clerodano representado por ejemplo por los compuestos de fórmula 2, 3 y 4, en donde el compuesto 2 es particularmente un esqueleto carbonado de 9,10-seco clerodano. Los compuestos de fórmula 1-4, se encuentran presentes de forma indíviduai o como una combinación de los mismos en ¡os extractos y/o fracciones obtenidas de S. amaríssima, tal como se muestra en la presente especificación. Las estructuras y los esqueletos carbonados de los diterpenos 1-4 se confirmaron por RM tal como se muestra en las figuras 2-28 y detalles en las Tablas 1-4.

El compuesto novedoso, diterpeno de fórmula 1 , con esqueleto carbonado de amarisano, debido a un enlace C-C entre C-16 C-20, tiene la estructura:

Compuesto de fón Los compuestos novedosos, diterpenos con esqueleto carbonado de clerodano, tienen Sa estructura:

Compuestos de fórmula 2-4 en donde, el compuesto 2 es particularmente un esqueleto carbonado de 9,10-seco clerodano.

El proceso para la extracción, aislamiento y purificación de compuestos de fórmula 1 , 2, 3 y 4 a partir de Sa/w^'a a arissima, comprende los siguientes pasos:

a . Secar las hojas y flores;

b . Moler las hojas y flores secas;

e . Realizar extracciones con MeOH/H₂0 80:20 y obtener los extractos respectivos; f . Concentrar la fracción hidroalcohólica y someter a partición con AcOEt, obteniendo fracciones de AcOEt;

g . Someter a aislamiento y purificación los compuestos diterpenos con Cromatografía en columna con un sistema de elusión con disolventes polares y no polares, y Cromatografía de líquidos de aita resolución.

Los compuestos de fórmula 1 -4, se encuentran presentes de forma individual o como una combinación de los mismos en los extractos y/o fracciones obtenidas de S. amarissima de acuerdo a! proceso de extracción, aislamiento y purificación anterior.

Los compuestos de la presente invención extraídos, aislados, purificados y caracterizados son Sos siguientes: eS compuesto 1 es (4R,6S,6'S,7S,8^,E,10^,Z)-4,7-dihidroxi-6'-metil-4,7- díhidrΌ-3Ή,5H-espiroí1 -benzofu a -6_:7^,-cJclodeca[c]fu an]-1 5^,{4Ή,6Ή)-diona

(teotihuacanina): el compuesto 2 es (3aR}-3a-{2-(6-{furan-3nl)-4-metii-2-oxo-2H-piran-3- i¡)eíi!)--7a-h!drQxi-3,3a,7,7a-tetrahidroisobenzofuran~1 ,4-diona (Amarissina A); el compuesto 3 es (2S,3S,5R,6a^,R,8ⁱS,10a'S)-5-{furan-3-íl)~2-hídroxi-8^,-met!l-4,5,8\ 10^etrahi espiroífuran-3,7'-naftoí1 _t8a-c]furan]-3\9^1H6a'H)-diona (Amarissina B); y el compuesto 4 es (3R,4aS,4bS,7aS,10aS_!12aS)-3-íruran-3-i¡Hb,7a-d!h!droxi-4a-meiil-4,4a,4b,5,10,1 1 ,12,12a QctanÍdraisobenzofuro¡4,3a-f]isocrornen-1 ,8(3H,7aH)~diona (Amarissina C).

De este modo, la invención proporciona extractos o fracciones estandarizados y compuestos aislados de los mismos, a partir de S. amanssima, de Sa clase de diíerpenos con un esqueleto carbonado novedoso a! que se flama amarisano, de fórmula 1 , o compuestos de esqueleto carbonado clerodano de fórmula 2, 3 ó 4, ya sea de forma individual o una combinación de los mismos, en donde Sos compuestos son Teatihuacanina, Amarissina A, Amarissina B, Amarissina C.

Los compuestos de fórmula 1-4 se aislaron de las fracciones / extractos utilizando ai menos una técnica de separación seleccionada de partición, precipitación, cristalización, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase reversa, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico o combinaciones de ios mismos, metodologías y técnicas analíticas conocidas por una persona con conocimientos en la técnica.

Las estructuras de ios compuestos han sido elucidadas y caracterizadas a detalle por anáíisis de sus espectros ta! como se describe a continuación en ios Ejemplos de la presente invención, así como de la interpretación de los mismos (véase figuras 2-28 y detalles en las Tablas 1 -4).

Los siguientes ejemplos, que incluyen modalidades preferidas, servirán para ilustrar cómo llevar a la práctica la invención, entendiéndose que los ejemplos particulares mostrados a continuación sólo son ejemplos para propósitos ilustrativos de las modalidades preferidas discutidas de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

La pianta de la especie, Salvia amanssima, fue recolectada en las inmediaciones del Municipio de Teotihuacán, Estado de México.

Las hojas y flores secas y molidas (700 g) de Sa/v/a amarissima se sometieron a extracción por percolación con acetona {6-10 L) para obtener un residuo de 30-50 g. Este residuo se sometió a partición disolviendo con hexano caliente (0.5-1.5 L) y haciendo extracciones en un embudo de separación con una mezcla MeOH/H_?0 80:20 (0.1 -0.5 L x 4} para obtener 15- 25 g de la fracción hexánica. La fracción hidroalcohólica se concentró a una quinta parte de su volumen y se sometió a partición con AcOEt (0.2-0.8 L x 4) para obtener 2-5 g de la fr. hidroalcohólica y 10-15 g de la fr. de AcOEí.

Los compuestos 1-4 (Figura 1 } se aislaron de la fracción de AcOEt.

Las técnicas de aislamiento y purificación consistieron de dos tipos: * Cromatografía en columna con gei de sílice y empleando uno o más de ios siguientes sistemas como mezclas de elusión: Hexano/AcOEt, CHCI₃/AcQEi, GH₂C!₂/AcOEt y Hexano/Acetona.

« Cromatografía de líquidos de alta resolución: Columna Symetry C18, detector de índice de refracción y mezclas de MeQH/H₂Q_s f¥teCN/H₂0 y MeCN/ eOH.

Los puntos de fusión (sin corregir) se determinaron en un aparato de Fisher-Johns. Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro Perkin-Elrner. Los espectros UV se registraron en un Shimadzu. Los espectros ÍR se obtuvieron en un espectrómetro Bruker. Los experimentos de RMN se realizaron en un Bruker Avance III, utilizando como referencia TMS. Los datos de H DARTMS se registraron en un espectrómetro de masas JEOL. La cromatografía en columna asistida con vacío se realizó sobre gel de sílice 80 (Merck), a menos que se indique lo contrario. GeS de sílice de malla 230-400 se usó para la cromatografía flash, y ia CCF se sometió a revelado medíante aspersión con 3% CeS0 en H₂S0₄ 2N seguido por calentamiento.

El compuesto de fórmula 1 , sólido de color amarillo-blanquecino, con punto de fusión 256-258 °C, presentó las siguientes propiedades: [a]²² _D +209 (c 0.10, Me₂CO); UV ( eOH) Amax (!og ε) 224 (4.39); IR (KBr) vmax 3524, 3479, 1744, 1689, 853 crrf¹ correspondientes a bandas para grupos hidroxilo, una γ-lactona, un carbonita de cetona y un anillo de furarvo. Adicionalmente, el compuesto de fórmula 1 presentó una fórmula molecular: C₂₀H₂oG6_> deducida de! ión molecular observado a m/z 357.13406 en su espectro de masas (HRDARTMS, calculada para 357.13381 ), indicando que tiene 1 1 grados de insaturación. En su espectro de RMN de ¹³C se observaron 20 señales, estas se mostraron en los espectros DEPT y HSQC como un metilo, tres metiíenos, nueve metinos y siete átomos de carbonos no protonadas. Los espectros de RMN de H y ¹³C confirmaron la presencia de ía lactona (8_C 172.4, C- 8; 73.8, C- 9; δ_Η 5.24, d, J - 18.Ü Hz, H-13_Pro„_R; 4.65, d, J = 18.0 Hz, H-19_Pro._s), y de un anillo de furano disustituido (5_C 150.9, C-16; 123.7, C-13; δ_Η 7.26, d, J = 1.9 Hz, H-15; 6.35, d, J = 1.9 Hz, H-14). En el espectro de RMN de ¹H se observaron cuatro señales de protones vinílicos a δ_Η 6.38 (dd, J = 10.2, 8.5 Hz), 5.93 (d, J = 10.6 Hz), 5.52 (d, J = 17.2 Hz), y 5.82 (dd, J = 17.2, 8.1 Hz), asignados a Sos protones H-2, H-3, H-1 y H~10 respectivamente por sus correlaciones homonucieares observadas en el espectro COSY. Estos datos, y la presencia de dos señales de carbonos cuaternarios a δ₀ 157.6 (C-5, C) y 123.9 (C-4, C) indicaron que 1 posee un anillo de 10 miembros por lo que es 5, 10-seco con respecto al esqueleto carbonado de clerodano. Esto se confirmó por las correlaciones heteronucleares H BC de H-10 con 01 (6_C 129.5) y C-9 (6_C 47.2); así como de H~19_Pro.._R V H-6a (¾ 3.76, d, J = 15.2 Hz) con C-5. La posición del carbonita de cetona (5_C 208.3) se estableció en C-7 por sus correlaciones HIV1BC con H-6a y H-8 (δ_Η 2.86, d, J = 6.9 Hz). En el espectro de RMN de 'Η, una señal a δ_Η 4.27 (dd, J = 13.8, 5.8 Hz) se asignó a H-12 por sus correlaciones HMBC con C-13 y C-16. La seña! asignada a H-12 también presento correlaciones homonucleares en el espectro CQSY con dos señales a δ_Η 2.35 (dd, J = 13,8, 5.8 Hz) y 1.81 (dd, J = 13.8, 1 .7 Hz), asignadas a H-1 1a y H-1 1 β respectivamente. Una seña! adicional, característica de un protón gemina! a un hidroxilo se observó a δ_Η 4.43 (s) y se asignó a H-20 por los picos cruzados con C-8, C-9, C-10, C-1 1. C-13 y C-16 observados en el espectro HMBC. Lo anterior indicó que el compuesto 1 posee un en!ace C-C entre C-16 y C-20, para formar un espiro ciclo de seis miembros (Figuras 4-9).

Así ia estructura de 1 , constituye un nuevo esqueleto carbonado a! que se dio eí nombre de amarisano, y el nombre trivial asignado a 1 es teotihuacanina, en alusión al sitio de recolección del material vegetal.

El compuesto de estructura 1 , constituye un nuevo esqueleto carbonado, llamado amarisano, ya que existe un enlace C-C entre C- 6 y C-20.

La configuración relativa de 1 se estableció considerando su relación biosintética con los diterpenos de tipo cierodano, considerando ia disposición α de! metilo en C-17. Así las correlaciones NOESY observadas de H₃-17 con H-8 y H-20, y de H-8 con H-12 indicaron que ios dos hidroxilos en el espiro ciclo de seis miembros poseen una orientación c s-β. Lo anterior se confirmó por !a determinación de ia configuración absoluta de 1 a través de difracción de rayos-X de monocrisfal (Figura 10 y Tabla 3) usando radiación de Cu Ka (Parámetro de Flack =-0.09(10); λ = 1.54178 Á). En la Figura 2 se observa también un diagrama ORTEP del compuesto de fórmula 1.

Tabla 1. ¹H (400 MUz) y ¹³C RMH (100 MHz), datos para el compuesto de fórmula 1 en

CDCf3-DW!SO-d§ {§ en ppm, J en %) posición ¾ _{¡ ¡}it (j _m HZ)

¹ 5,82 dd (17.2, 8.5) 129.5,CH

2 6.38 dd (10.2, 8.5) 131.5, CH

3 5.93 d (10.6) 118.8.CH

4 323.9, C

5 157.6, C

6a 3.76 d (15.2) 41.0, CH₂

6/7 2.85 d (15.2)°

7 208.3, C

8 2.86 q (7.0)" 59.8, CH

9 47.2, C

10 5.52 d (17.2) 133.9, CH

lia 2.35 dd (13.8, 5.8) 33.5, CH₂

\\β 1.81 dd (13.8, 9.7)

12 4.27 dd (9.4, 6. í) 61.9, CH

13 123.7, C

14 6.35 d (1.9) 108.7, CH

15 7.26 d (1.9) 142.2, CH

16 150.9, C

17 1.24 d (7.0) 9.1, CH₃

18 172.4, C

\ -ProR 5.24 d (18.0) 73.6, CH₂

\9-ProS 4.65 d (18.0)

20 4.43 s 65.0, CH

"Sobrepuesto

o r-o

o o

Tabia 2. ¹H {500 MHz) y ³C RMN (125 MHz), datos para los compuestos de fórmula 2-4 en CDCI₃ {δ en ppm, J en Hz)

4"^'

posición muí', in Hz) S tiuili. (J in Hz) <¾ mult. U m Hz)

6.03 d (101) 127_.3, CH 620 dd (9,6, 2.2) 135.6, CH 2.48 dd (18.9, 49) 29.5, CH_:

Ib 2.37 brd(18.9)

2 6.77 dd (^¡0.1, ¡42.5. CU 6.48 ddd (9.6, 125.9, CH 6.07 d( 10.4) 1 0.2. CH

3a 2.8 i dd(U>.5, 29.7, CII2 7.03 d (5.2) 1 82. H 5.83 dd (10.4, 3.7) 1 6.2. CK

3b 2.70 brü(;9.5

75.6, C 130.8. C 75.9. C

5 57.0, C 43.4, C 40. i. C

6a 1.67 ddd (13.!.13.1,4.9) 28.6, CH₂ 2,28 d (13.3)" 43.7, CH, 1.65 m" 24.5, CH;

6b 1.73 ddd (13.1.13.1.4.9) 2.56 brd(13.3)'^; 1.29 dd (13.7, 9.0)

7a 255 ddd (1 .5, 12.5.5.2) 21.8. CH, 207.9, C 2.07 m 1 8,CH,

7b 2.34 ddd (12.5, 12.5,5.2) 1.65 m^i!

8 120.6, C 2.91 q(6.9) 49.1, CH 2.47 m⁶ 43.0. CH

;— i

9 149.8. C 59.9, C 41.2, C

!0 197.1. C 3.26 br s 45.2, C 47.9, C

lia 6.16 s 104.1. CH 2.60 dd (13.1, 8.1)^1, 42.7, CH, 3.11 dd (16.1, 8,5) 33.7. CH_:

11b 2.31 dd (13.1,8.1)* 1.90 d (16.1)

12 ! 1.3. C 5.18 í (8.1) 74.0, CH 5,66 d (8.5) 71.2. CH

13 119.0. C 128.2.C 127.4, C

14 6.60 br s 1 6.2. CH 6.45 d (1. † 109.0, CH 6.39 s 108.5. CH

15 7.46 br s 143.6, CH 7.38 i (1.5) ! 43.8, CH 7.37 s 138.7, CH

16 7.91 bis 141.3. CH 7.40 br s (40.0, CH 7.44 s Ί'"·4.2, CH

17 161.5, C 1.18 d (6.91 9.3, CH, 172.8, C

S8 173.7. C 168.5, C 175,0, C

\9-Pro .85 d (8.7) 69.4. CH, 4.17 d (9.3) 75.5, CH- 4.29 d (8.3 j 71.4, CH,

\9-P .45 d (8.7) 4.46 dd(9.3, 1.5) 4.S d(8.3)

20 18.3, CH, 4.85 s 98.3, CH 1.26 s 27.4, CH,

^,! En CDCIJ-DMSO-Í,;. Sobrepuesto

Ta fa 3. Datos de difracción de rayos-X de mooocrista! usando radiación de Cu Ka.

Compuesto fórmula 1, Teotihuacantsia

Precisión de enlace: C-C » 0.0042 A Longitud de onda = 1.54178

^CeWa: a«10.1?5€C4> b-I2.2477(5) C»I3.4918(6}

al ha-90 b€ a»90 gatmta»90

Temperatura: _: 298

Calcu!ado Reportado

Volumen 1€ 81.45112) 1681.45 Í12

Grupo espacia! ? 21 21 21 P 21 22 21

Grupo Hafi P 2ac 2ai> P 2ac 2ab

Fórmula (radical) C20 H20 06 C20 H20 06

Fórmula (suma) C20 H20 06 C20 H20 06

Mr 3 SS , 3€ 3S6 , 3S

Dx . g - J .1..408 1.408

i **

MU («88-1} 0.865 0 , 8€ &

752,0

r u j u 75 .55

h, k, Imax i 2 , 15 , 16

KX€í f 3435 t 1967] 3428

Tmin, Tniax 0.906,0.936 . . . ¾>,.*>

Tmin' 0.906

Método de corrección = # Límites T Reportados: Tsnin-G , SQB max*Q .936 abuCorr * MOLTI-SCAN

Integridad de datos = · 1.74/1.0Ó T etalmax)- 74.47€

(refecciones} = « 0.0421! 2899) ¾ wR2 {reflecciones) = σ.ΐθδβί 3428)

S - 1.062 Npar» 239

El compuesto 2, se aisló como un sólido amarillento, con punto de fusión 230-232 °C, presentó las siguientes propiedades: [α]²²ο +93 (c 0.15, Me₂CO); UV (MeOH) Amax (iog ε) 211 (4.25), 330 (4.52); IR (KBr) vmax 3270, 1780, 1687, 1845, 875 crrf¹. En su espectro de masas obtenido por HRDARTMS se observó un ión molecular a m/z 371.11323, congruente con una formula molecular C20H19O7 (calculada para 371.11308), indicando 12 grados de insaturación. El espectro de IR mostró bandas para dos carbonilos correspondientes a y y δ- lactonas, y una cetona α,β-insaíurada, asi como un anillo de furano, Eí espectro de RMN de ^,3C mostró 20 señales, de las cuales, tres son de carbonilos y seis señales más de carbonos no protonados. E! experimento DEPT mostró señales para seis metinos, cuatro metiíenos y un metilo ^yinííico. Ei espectro de RMN de H mostró dos sistemas de espín característicos de ¡os clerodanos, ei primero de ellos, correspondió a una 18, 9-y-iactona, con señales a δ_Η 4.85 (d, J = 8.7 Hz, H~19_Pro._R) y 4.45 (d, J ~ 8.7 Hz, H--19_Pro._s); y el segundo sistema de espín, característico de un anillo de furano monosustituido con señales a δ_Η 7.91 (sa, H-16), 7.48 isa, H-15) y 6.60 (sa, H-14). Adicionalmente, en el espectro de 'H RMN se observaron señales para dos rnetiienos a δ_Η 2.55 (ddd, J = 12.5, 12.5 y 5.2 Hz), 2.34 (ddd, J = 12.5, 12.5 y 5.2 Hz), 1.73 (ddd, J = 13.1 , 13.1 y 4.9 Hz) y 1.67 (ddd, J = 13.1 , 13.1 y 4.9 Hz), asignadas a H₂-7 y H₂-8 por sus correlaciones COSY. Esto se sustentó por las correlaciones HMBC de H₂-6 con C-19 (Ó_c 69.4) y de H₂-7 con C-5 (8c 75.6). La posición de la cetona α,β-insaturada se estableció en C-10 (6_C 197.1 ) por las correlaciones H BC de este carbono con H₂-19, H₂- 6 y dos señales adicionales de protones vinílicos a δ_Η 6.03 (d, J = 10.1 Hz) y 6.77 (dd, J = 10.1 , 3.2 Hz), asignadas a H-1 y H-2, respectivamente. En el espectro COSY estas últimas dos señales mostraron picos cruzados con las señales de un metileno a δ_Η 2.81 (dd, J = 19.5, 3.2 Hz) y 2.70 (da, J = 19.5 Hz) se asignaron a H₂-3. Por su parte, ía señal del metileno H₂-3 mostró una correlación en e! espectro HMBC con una señai a 5_C 75.8, asignada a C-4. Asi, el desplazamiento químico de C-4 indicó la presencia de un grupo hidroxilo en esta posición (Figuras 12-16). Estos datos espectroscópicos indicaron que 2 es un 9,10-seco cierodano. Esta suposición se confirmó por la comparación de sus datos espectroscópicos con aquellos descritos para la saivianduiina B, aislada de Salvia íavandubides, los cuales fueron estrechamente similares [Véase Ortega, A.; Cárdenas, J.; Toscano, A,; aldonado, E.; Aumelas, A.; Van Calsteren, M. R.; Janko ski, C. Phytochemistry 1991 , 30, 3357-3360]. Adicionalmente, el espectro HMBC de 2 mostró correlaciones de H-14 y H-16 con una señal a ; 151.3 (C), asignada a C-12, indicando que 2 difiere de ía saivianduiina B por la presencia de un doble enlace en C-1 1 y la ausencia de un hidroxilo en C-7. Esto se confirmó por las correlaciones HMBC de H-11 (δ_Η 6.16, s) con C-8 (5_C 120.6, C), C-9 (¾ 149.8, C), C- 13 (8_C 1 19.0, C) y C-20 (6_C 18.3, CH₃). La configuración absoluta de 2 se determinó a través de difracción de rayos-X de monocristaí (Figura 11 y Tabla 4). El resultado de esta determinación permitió establecer su estereoquímica como la mostrada en la figura 3.

Con relación a Sos compuestos 1 y 2 de la presente invención, éstos tienen al esqueleto de cierodano como precursor biogenético y solo se indican las rupturas de ios enlaces C-C que dan origen a! nuevo esqueleto o esqueleto reareglado. Para el caso de 1 , se tiene una ausencia del enlace 5, 10, tal como se hace mención de un 5, 10-seco en la caracterización de dicho compuesto de fórmula 1 , esto es, un 5,10-seco-clerodano; sin embargo, en dicho compuesto de fórmula 1 existe un enlace C-C entre C-16 y C-20 siendo que el producto resultante constituye un nuevo esqueleto carbonado, el cual ha sido llamado amarisano. Para el caso del compuesto 2, sólo es un cierodano rearegiado por la ruptura del enlace C~C 9,10. En este caso 2, es un 9, 10-seco-c!erodano como la saivianduiina 8. Precisión de enlace: C-C « 0.0052 A Longitud de onda

Celda; *-i€ .6901 {35 b-16.3901 ÍS) -5.S2Í1QS

alpha-50 beta -90 gamma» 120

Temperatura: 298 K

Calculado Reportado

Volumen 1438.14 Í7> 1438.14Í6

Grupo espacia! P 31 P 31

Grupo Hall P 31 P 31

Fórmula (radical) C20 MI 8 O? C20 H18 07

Fórmula (suma) C2 H18 07 C20 Hit 07

Mr 370.34 370.34

Dx,g cra-3 I .283 i .285

¾

Mu (raro- 1} 0.82.1 0.821

F000 582.0 532.0

POOO' 58 .06

h, k, Itnax 21, 21,7 21,21,7

Kref. 3 36 { 1968] 3891

Tmín, Traax 0,930,0.943 0.705,0.94

Titán' 0,687

Método de corrección = # Límites T Reportados: Tmín-o . "05 Τι_¾¾¾-0.944

AbsCorr ^« MÜLTI-SCftK

Integridad de datos = 1.93/0,59 Th*ta Craax) · 74.481

R { refecciones) = 0.036a i 3036) R2 (reftecciorses) = 0.0836 ( 38M)

S » 1.033 Hpar* 248

El compuesto 3, se aisló como un sólido blanco amarillento, con punto de fusión 132-134 °C, presentó las siguientes propiedades: [a]²² _D +16 (c 0.10, CHCI₃); ÜV {MeOH) Ámax (log ε) 207 (4.21), 297 (3.98): ÍR (KBr) vmax 3359, 1733, 1704, 873 cm^"1. Tiene una formula molecular C₂oH₂o0₆, deducida de su espectro de masas de alta resolución (DARTTOF+, [M + H]⁺ m/z 357.13338, calculada para 357.13381). Su espectro de RMN de '³C mostró 20 señales, y en conjunto con el análisis de su espectro de RMN de ¹H se observaron señales para una 18,19-y-lactona {5_C 168.5, C-18; 75.8, C-19; δ_Η 4.46, 4.17, H₂-19) y un anillo de furano (δ₀ 128.2, C-13; δ_Η 7.40, H-16; 7.38, H-15, 6.45, H-14). Señales adicionales en el espectro de RMN de H se observaron a δ_Η 7.03 (d, J = 5.2 Hz), 6.48 (ddd, J = 9.6, 5.2, 3.3 Hz) y 6.20 (dd, 9.6, 2.2 Hz), asignadas a H-3, H-2 y H-1 respectivamente. En e! espectro COSY, la señal de H-1 mostró un pico cruzado con una señal a δ_Η 3.26 (sa), asignada a H-10. La información anterior sugirió ¡a presencia de un 1,3-dieno en el anillo A del esqueleto de clerodano [Véase también Bautista, E.; Toscano, R. A.; Ortega, A. J. Nal Prod.2014, 77, 1088-1092]. La presencia de una señal en el espectro de RMN de ¹H a 5_H 4.85 (s) sugirió ia presencia de un hemiacetal en la estructura de 3, Su posición se estableció en C-20 por los picos cruzados observados en e! espectro HMBC de esta señal con C-8 (8_C 49.1 , CH), C-9 (5_C 59.9, C), C-1 1 (6_C 42.7, CH₂) y C-12 (6_C 74.0, CH). La comparación de ios datos especíroscopicos de 3 con los descritos para ia dugesina F, un cierodano aislado de Sa/v/a dugesi [Xu, G.; Zhao, F.; Yang, X. W.; Zhou J.; Yang, L. X.; Shen, X. L; Hu, Y. J.; Zhao, Q. S. Nal Prod. Bioprospect. 2011 , 1, 81 -86], indicó que ambos compuestos difieren entre sí en su estereoquímica. Esta suposición se sustentó por las diferencias en los valores de sus rotaciones ópticas específicas (compuesto 3: [a ⁵ _D +18.0, c 0.10, CDCI₃; versus dugesina Fi [a ⁵ _D -26.1 , c 0.08, CDCI₃, literatura). La estereoquímica de 3 se determinó considerando su coexistencia con 1 en la planta y los mismos orígenes biosintéticos [Bautista, E.; Fragoso- Serrano, M.; Toscano, R. A.; García-Peña, M. R.; Ortega, A. Org. Lett. 2015, 17, 3280-3282]. Esto permitió establecer la disposición del metilo en C-17 y el metileno en C-19 como a. Así, las correlaciones NOESY de H₃-17 con H-12 y H~20 determinaron un anillo de furano y el hidroxilo del lactol como α-orientados. ES pico cruzado en e! espectro NOESY entre H₂-19 y H-10 determino una decalina con fusión cis. Esto se confirmó por el efecto Cotton negativo observado a 310 nm en ia curva de dicroísmo circuiar electrónico ¡Véase Bautista, E.; Toscano, R. A.; Ortega, A. J. Nst. Prod. 2014, 77, 1088-1092].

El compuesto 4 se aisló en forma de cristales incoloros, tiene un punto de fusión 288-270 °C, presentó las siguientes propiedades: [a]²² _D ÷85 (c 0.18, CHC!₃); UV ( eOH) Amax (log ε) 206 (3.90); IR (KBr) vmax 3424, 3254, 1771 , 1723, 876 cm ^{" 1}. Mostró un ion pseudomolecuiar a m/z 375.14503 en su espectro de masas de alta resolución (DART-TOF+), consistente con la formula molecular C20H23O7. El espectro de IR mostró bandas de absorción para dos grupos hidroxilo, una yPy una δ-iactonas, y un anillo de furano. El análisis de los espectros de RMN de ¹H y ¹³C confirmaron la presencia de una 18,19-y-lactona (8_C 175.0, C-18; 71.4, C-19; δ_Η 4.89, H-19_Pro._s; 4.29, H- 19_Pf0._R); una 17,12-&-lactona (6_C 172.8, C-17; 71.2, C-12; δ_Η 5.66, H-12); y un anillo de furano (5_G 127.4, C-13; δ_Η 7.44, H-16; 7.37, H-15; 6.39, H-14). En el espectro de RMN de ¹H se observaron dos señales de protones vinílicos a δ_Η 6.07 (d, J = 10.4 Hz) y 5.83 (dd, J = 10.4, 3.7 Hz), asignadas a los protones H-2 y H-3 por las correiaciones COSY observadas entre ellas. En el espectro de RMN de ¹³C, dos señales de carbonos oxigenados a 6_C 75.9 y 47.9 se asignaron a los carbonos C-4 y C-10 respectivamente por las correlaciones HMBC de H-2 y H-3 con C-4, y de H₂-1 (S_H 2.48, dd, J = 18.9, 4.9 Hz, H-1a; 2.37, da, J = 18.9 Hz, H-1b), Η-β (δ_Η 2.47, m), H₂-19 y H₃-20 (δ_Η 1 .26, s) con C-10. Esos datos espectroscópicos sugirieron que 3 es un hidroxiclerodano. La comparación de estos datos con los descritos para otros hidroxiclerodanos indicó que ei compuesto 3 difiere de ia infuscatina [Véase Bautista, E.; Toscano, R. A.; Calzada, F.; Díaz, E.; Yépez- ulia, L.; Ortega, A, J. Nat, Prod. 2013, 76, 1970-1975] por la ausencia de un grupo hidroxilo en C-8 y por ia posición deí doble enlace. Adicionaimente, ei valor de ia constante de acopiamiento de H-12 (JH-I I¡*-H-I2 = 8.5 Hz) estableció un aniíío de furano a- orientado. La interacción en e! espectro NOESY de H₃-20 con H-8 y H₂-19 determinó una δ- lacíona c/s-fusionada y una disposición α de! met ieno en C-19.

De este modo, la invención proporciona extractos o fracciones estandarizados y compuestos obtenidos de los mismos de ia clase de diterpenos con un esqueleto carbonado novedoso no convencional al que se llama amarisano, representado por ejemplo, por el compuesto de fórmula 1 , y/o con un esqueleto carbonado de cierodano representado por ejemplo por los compuestos de fórmula 2, 3 y 4, en donde el compuesto 2 es particularmente un esqueleto carbonado 9, 10-seco cierodano. Los compuestos de fórmula 1 -4, se encuentran presentes de forma individual o como una combinación de los mismos en los extractos y/o fracciones obtenidas de S. amarissima, tai como se muestra en la presente especificación, y en donde los compuestos extraídos, aislados, purificados y caracterizados son Sos siguientes: teotihuacanina, Amarissina A, Amarissína B, Amarissina C, en donde el compuesto 1 es (4R,6S_i6 7S,8^ 10 )~4J-dibidroxi-6 net^

ciclodeca[c]furan]-1 ',5'(4'H,6'H)-diona (teotihuacanina); e! compuesto 2 es (3aR)-3a-(2-(6-

(furan-3-i!)-4-metil-2-oxo-2H-piran-3-i^

diona (Amarissina A); el compuesto 3 es (2S,3S,5R,6a 8'S,10a'S)-5-(furan-3-il)-2- ^ metι!-4,5.8^ 10'-tetrah!d o-2H-espiro[furan-3_:7^,-nafto[1 ,8a-c]furan]-3 9 1Ή,6aΉ)-diona

(Amarissina B); y el compuesto 4 es (3R_p4aS,4bS,7aS,10aS,12aS)-3-(furan-3-il)-4b_I7a- dihidroxi-4a-met¡l-4,4a,4b,5,10,1 1 ,12,12a-octahidroisobenzofuro[4,3a-f]isocromen-

1 ,8(3H, 7aH)-diona (Amarissina C).

De acuerdo a otra modalidad de la invención, los compuestos aislados han sido estudiados para vanas actividades, incluyendo su acción como agentes citotóxicos y como moduladores de la muítiresistencia en la quimioterapia del cáncer.

Ejemplo 2

El estudio íitoquímico de las partes aéreas de Salvia amarissima, colectadas en las montañas que rodean el valle de Teotihuacán condujo a la obtención de extractos y fracciones que comprenden compuestos diterpénicos aislados de fórmula 1 -4, uno de eilos con un esqueleto carbonado novedoso ai que se dio el nombre de teotihuacanina(l ), y el resto con esqueleto carbonado de cierodano a los que se les dio ei nombre de Amarissina A, Amarissina B y Amarissina C (3-4). La exploración de las propiedades citotóxicas de estos diterpenos contra líneas celulares de cáncer de mama ( CF-7 y DA-MB-231 ), colon (HCT- 15 y HCT-1 16} y cérvix (HeLa) indicó que 1 es activo contra céiuias de carcinoma coíorecfa (HCT-15 ICso = 12.9 ± 1.7 jig/mL y HCT-1 16 iC_S0 = 10.9 ± 1.0 .ug/mL) y cérvix (IC₅₀ = 13.7 ± 4.7 ο/ηιί). Por su parte, eí compuesto 2 mostró actividad contra las líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7 IC₅o = 18.2 ± 2.02 μ π)1 y MDA-MB-231 ¡C₅₀ = 19.3 ± 0.82 ng/mL) y cérvix {ÍC₆₀ = 14.0 ± 1 .04 μ§ΙνηΙ). Adiciona!mente, se evaluó a estos diterpenos (1-4, Figura 1 ) por su capacidad mcduladora de la multiresistencia a fármacos en una línea celular de cáncer de mama resistente a vínblastina ( MCF-7 _Vjfi+). Los resultados de esta evaluación indicaron que el compuesto de fórmula 1 (teotihuacanina) actúa como un potente modulador de! fenómeno de mu!tiresistencia con una potencia mayor a la reserpina, empleada como control positivo en el ensayo.

Las líneas celulares de carcinoma de colon (HCT-15 y HCT-116), cérvix (HeLa) y de mama ( DA-MB-231 y MCF-7) fueron obtenidas de la American Type Culture Collection. La resistente CF-7/Vm se desarrolló a través de la exposición continua a la vínblastina durante cinco años consecutivos como se ha reportado [Tetrahedron Lett. 1988, 29, 363-366, incluida como referencia en su totalidad]. Todas las líneas celulares fueron mantenidas en medio RPMI 1640 suplementario con suero bovino fetal al 10% y se cultivaron a 37° C en una atmósfera de 5% de C0₂ en aire (100% de humedad). Para mantener la resistencia a los fármacos, las células MCF-7/Vin+ se cultivaron en medio que contenía 0.192 pg/ml de vínblastina. Al mismo tiempo, un stock de células CF-7/Vin- se mantuvo en medio libre de vínblastina.

La citotoxicidad y la reversión a D se determinó utilizando ei ensayo SRB [Tetrahedron Lett. 1988, 29, 363-366; Cáncer Inst. 1990, 82, 1 107-1 1 12, incluido como referencia en su totalidad]. Las céiuias se cosecharon en fase logarítmica de su ciclo de crecimiento y fueron tratadas por triplicado con varias concentraciones de las muestras de prueba (0.2 a 25 pg/ml) y se incubaron durante 72 h a 37° C en una atmósfera bumidificada de 5% de C0₂. El ensayo se llevó a cabo bajo condiciones estáticas y los resultados se expresan como la concentración que inhibe el 50% del crecimiento control después del período de incubación (ÍC₅₀). Los valores se estimaron a partir de un gráfico semilogaritmico de la concentración del fármaco (pg/mi) contra el porcentaje de inhibición de crecimiento. La vínblastina se incluyó como control positivo. Los efectos de reversión como moduladores se investigaron con el mismo método. Las células MCF-7 y MDR MCF-7 Vin se sembraron en placas de 96 pocilios y se trataron con varias concentraciones de vínblastina (0.000128-10 pg/ml) en presencia o ausencia de diterpeno f disuelto en una mezcla de agua/DMSO, 9:1 ) a 25 g/ml durante 72 h como se ha descrito [Cáncer Inst. 1990, 82, 1107- 1 1 12] previamente. La capacidad del diterpeno para potenciar la citotoxicidad de vínblastina se midió mediante el cálculo de la ¡C₅₀ como se describe anteriormente. En estos experimentos, se utilizó reserpina (5 pg/ml) como un fármaco de control positivo. Eí valor de ia reversión de la resistencia (RF), como un parámetro de ¡a potencia, se caículó dividiendo ef SC₅₀ de vinblastina sola por la !C₅₀ de vinblastina en presencia del compuesto de prueba, Tabla 5. Citotoxicidad de Sos iterpenos aislados de SaMa amarissíma contra líneas celulares de carcinoma humano

ICsc uig/mL

Mama Colon

DA- B-

Compuesto MCF-7 HCT-15 HCT-116 HeLa

231

f-xtracto de acetona >25 >25 >25 >25 >25

Fracción de AeÜEt >25 >25 1.05 ±0.21 >25 25

Teotihuacanina (I t >20 12.3 ± í .5 12.9 i: 1.7 !0.9± 1.0 13.7 d: 4.9

2 18.2 ±2.02 19.3 ± 0.82 >20 >20 14,0 ± 1.04

3 >20 > 20 >20 20 20

4 >20 >20 >20 >20 20

Tabla 8. Actividad moduladora de la citotoxiddad a vinblastina en líneas celulares sensibles y resistentes de cáncer de mama

iC_5l, Uig/roL) ersion de ia resistencia" compuesto MCF-7A'in^" MCf-7/V ^' MCF-7 ssns R-'

Vinblastina ! ,08 ± 0.06 1.37 ± 0.23 0,047 ±0.01

Extracto de acetona 0.03 + 0.01 0.22 ± 0.04 ND 36 6.2 ND

Fracción de acetato d etilo 0.02*0.009 0.29 ±0.18 0.00251 54 4.7 187.3

Tcotihucanina (0.000128 <O.O0O¡28 <0.000!28 8-137.5 1 703.! 367.2

Teotihucanina <í† 0.15 ± 0.08 0.19 ±0,05 0.02 01 7.2 2.4

2 0.35 ±0,11 0.27 ±0.17 ND 3.1 5.1 ND

2" 0.44 + 0.17 1.24 ±0.28 ND 2.5 1.1 ND

0.02 ±0.015 0.59 ±0.25 ND 54 2.3 D

0.12 + 0.09 1.23 + 0.23 ND 9 !.! ND

4 0.45 i 0.22 1.24 + 0.30 ND 2.4 i.! ND

4" 0.72 ±0.16 1.27 + 0.28 ND 1.5 1.1 ND

Reserpina' 0.037 :: 0.01 0.3! ±0.19 0.003 ±0.00! 29.2 4.4 15.7

"Diluciones señales de ó-OOG 128 a 10 ;:g/mL úe vitibiastina en presencia c ausencia de díterper.o (25 " Diíerpeno = 5 μ« Γη1.. Cada valor representa eí promedio a DE de tres experimentos independientes. "Reserpina - 5 gmL como control positivo. = 1C50 VinblastinaIC50 Vinbiastina en presencia de diterpeno, ND - No determinado.

El compuesto de fórmula 1 es un modulador del fenómeno de multiresistencía a fármacos (MDR) en céiuias de cáncer MCF-7. Los resultados dei ensayo se muestran en la Tabia 6. La reversión de ia resistencia (RF_MCF-7/vin+^> 10703 a 25 pg/ml y RF_McF-7/vin+ 7.2 a 5 pg/mi) revela que el compuesto 1 es más potente que el control positivo (reserpina, RF MCF-7/v¡n+ 4,4 a 5 ug/rol). Por lo tanto, el compuesto 1 representa una nueva clase de modulador de MDR potente, con efectos aún visibles en la contraparte sensible {RFMCF-T sen-i ^> 367 a 25 Mg/ml). Además, el vaior de la reversión a la resistencia es más alta que las descritas para purgina Π ( F_McF-7 vin+ > 2140) y jalapinosido (RF_McF-7/v¡n+ > 1906), dos potentes moduladores de MDR derivados de la planta conocida como raíz de Jalapa (especie dei género ¡pomoea). Como resultado de lo anterior, e! compuesto de fórmula 1 (teotíhuacanina) es una plataforma para el desarrollo de moduladores de MDR más potentes para ia quimioterapia dei cáncer.

VENTAJAS Y APLICACIÓN INDUSTRIAL DE LA FRESENTE INVENCIÓN

El compuesto 1 representa una estructura privilegiada debido a su esqueleto carbonado novedoso al que se llama amarisano. Esta característica estructural junto con su potente actividad moduíadora y citotóxica hace a la teotíhuacanina 1 una plataforma química para optimizar su capacidad de resensibiliación a células cancerosas resitentes a vinblastina y desarrollar moduladores semisintéticos más potentes. Asimismo, para la fabricación de medicamentos útiles en la modulación de la multiresistencia a fármacos, como antlcancerígenos.

Por su parte, el compuesto 2 también mostró citotoxicidad contra líneas celulares de cáncer de mama y cérvix. Junto con ei compuesto 1 , son agentes citotóxicos útiles para ¡a fabricación de medicamentos para la prevención, tratamiento, inhibición o control deí cáncer en mamíferos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un compuesto diterpeno aislado a partir de extractos y fracciones obtenidos de Salvia a arissima, caracterizado porque comprende un esqueleto de amarisano.

2. - El compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el esqueleto de amarisano tiene la estructura de fórmula 1 :

en donde existe un enlace C-C entre C-16 y C-20.

3. - El compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto de fórmula 1 es: (4 ,6S,6OJS 'E,10^,2)-4_l7-dih!droxi-6'-metil-4,7-dihidro--3^!H_!5H~ espiro[1-benzofuran-6,7'-cidodecaíc]furan]-1^,,5'{4'H,8ⁱH)-diona.

4. - E! compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto de fórmula 1 presenta:

a. una fórmula molecular de C₂oH₂₀0₅;

b, un punto de fusión de 258-258 °C

c. una rotación óptica de [o ² ₀ +209 (c 0.10, Me₂CO)

d. señales de ¹H R N (d_H Mult) en: 5.82 dd, H-1 ; 6,38 dd, H-2; 5.93 d, H-3; 376 d, H-

6a: 2.85 d, H6fa; 2.86 q, H-8; 5.52 d, H-9; 5.52 d, H-10; 2.35 dd, H-11 a; 1.81 dd, H-

11/); 4.27 dd, H-12; 6.35 d, H-14; 7.26 d, H-15; 124 d, H-17; 5.24 d, H-19Pro R; 4.65 d, H-19Pro S: 4.43 s, H-20;

e. señales de ¹¾ RMN (d_c) en: 129.5, C-1 ; 131.5, C-2; 1 8.8, C-3. 123.9, C-4, 157.6, C-

5; 41.0, C-6; 208.3, C-7; 59.8, C-8; 47.2, C-9; 133.9, C-10; 33.5, C-1 1 ; 61.9, C-12;

123,7, C-13; 108.7, C-14; 142.2, C-15; 150.9, C-16; 9.1 , C-17; 172.4, C-18; 73.6, C-

19; 65.0, C-20;

f. ión molecular observado a miz 357.13406 en su espectro de masas (HRDARTMS, calculada para 357.13381 );

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3524, 3479, 1 44, 1689, 853 [cm^" ] h. Señales UV ( eOH) Amax (log ε) 224 (4.39);

i. una difracción de rayos-X de monocristal, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con la Figura 10, con dimensiones de celda unitaria: a = 0.1756 (4); b = 12.2477 (5); c = 13.4918 (6); alpha = 90; beta = 90; gamma = 90; y grupo espacial P 21 21 21.

5. - ES compuesto diterpeno de conformidad con ia reivindicación 1 , caracterizado porque ei extracto es un extracto de acetona.

6. - E¡ compuesto diterpeno de conformidad con ¡a reivindicación 1 , caracterizado porque ía fracción es una fracción de AcOEt.

7. - Un compuesto diterpeno aisiado a partir de extractos y fracciones obtenidos de Salvia amarissima., caracterizado porque comprende la estructura de fórmula 2:

8. - El compuesto diterpeno de conformidad con ¡a reivindicación 7, caracterizado porque el compuesto de fórmula 2 es: (3aR)-3a-(2-(6-(furan-3-il}-4-metil-2-oxo-2H-piran-3-il)etil)-7a- hidroxi-3 , 3a ,7 , 7a-tetrahidroisobenzof uran- 1 ,4-diona .

9. - Ei compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el compuesto de fórmula 2 presenta:

a. una fórmula molecular de Ο₂₀Η₁₃Ο₇;

b. un punto de fusión de 230-232 °C

c. una rotación óptica de [a ² _D +93 (c 0. 5, Me₂CO)

d. señales de ¹H RMN (d_H uít) en: 6.03 d, H-1 a; 6.77 dd, H-2; 2.81 dd, H~3a; 2.70 br d, H-3b; 1.67 ddd, H-6a; 1.73 ddd, H-6b; 2.55 ddd, H-7a; 2.34 ddd, H-7b; 6.16 s, H-

11a; 6,60 br s, H-14; 7.46 br s, H- 15; 7.91 br s, H- 6; 4.85 d, H-19PraR; 4.45 d, H- 19Pro-S; 2.10 s, H-20;

e. señales de ³C RMN (ofc) en: 127.3, C-1 a; 142.5, C-2; 29.7, C-31 ; 75.6, C~4; 57.0, C- 5; 28.6, C-6a; 21.8, C-7a; 120.6, C~8; 249.8, C-9; 197.1 , C- 0; 104.1 , C-1 1a; 151.3, C-12; 119.0, C-13; 106.2, C-14; 143.6, C~15; 141.3, C-16; 161.5, C-17; 173.7, C- 8;

69.4, C-19ProR; 18.3, C-20;

f ión molecular observado a m/z 371.11323 en su espectro de masas (HRDARTMS, calculada para 371.11308);

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3270, 1780, 1687, 1645, 875 fcm^'1]

h. Señales UV ( eOH) Ámax (íog ε) 21 1 (4.25);

i. una difracción de rayos-X de monocristal, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con la Figura 1 1 , con dimensiones de celda unitaria: a = 16.8901 (3); b = 16.8901 (3); c = 5.821 1 (1 ); alpha = 90; beta = 90; gamma = 120; y grupo espacia! P31.

10. - ES compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque ei extracto es un extracto de acetona.

1 1. - E! compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la fracción es una fracción de AcOEL

12. - Un compuesto diterpeno como modulador de la multiresistencia a fármacos, que tiene ¡a estructura de fórmuía 1 :

13. - El compuesto diterpeno de conformidad con ¡a reivindicación 12, caracterizado porque la estructura de fórmula 1 es: (4R,6S,6'S,7S,8Έ,10^,Z)-4 -dihidroxl·6"-·met!¡-^■4J-dihidro-3Ή_!5H- espiro[1-benzofuran-6,7'-cíciodeca[c]furan]-1ⁱ,5^l{4'H,8'H)-diona.

14. - ES compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque ei compuesto de fórmula 1 presenta:

a. una fórmuia molecular de C₂oH₂o0₆;

b. un punto de fusión de 256-258 °C

c. una rotación óptica de [a]²² _D +209 (c 0.10, Me₂CO)

d. señales de ¹H RMN (d_H MuK) en: 5.82 dd, H-1 ; 6.38 dd, H-2; 5.93 d, H-3: 3.76 d, H- 8a; 2.85 d, H6<b; 2.86 q, H-8; 5.52 d, H-9; 5.52 d, H-10; 2.35 dd, H-11a; 1.81 dd, H-

1 16; 4.27 dd, H-12; 6.35 d, H-14; 7.26 d, H-15; 1.24 d, H-17; 5.24 d, H-19Pro f?; 4.65 d, H-19Pm S¡ 4.43 s, H-20;

e. señales de ¹³C R N (d_c) en: 129.5, C-1 ; 131.5, C-2; 1 18.8, C-3; 123.9, C-4; 157.6, C- 5; 41.0, C-6; 208.3, C-7; 59.8, C-8; 47.2, C-9; 133.9, C-10; 33.5, C-11 ; 61.9, C-12; 123.7, C-13; 108.7, C-14; 142.2, C-15; 150.9, C-16; 9.1 , C-17; 172.4, C-18; 73.6, C-

19; 65.0, C-20;

f. ion molecular observado a rn/z 357.13406 en su espectro de masas (HRDA T S, calculada para 357.13381 );

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3524, 3479, 1744, 1689, 853 [cm^' ] h. Señales UV (MeOH) Ámax (log ε) 224 (4,39);

i. una difracción de rayos-X de monocristal, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con la Figura 10, con dimensiones de celda unitaria: a = 10.1756 (4); b = 12.2477 (5); c = 13.4918 (6); alpha = 90; beta = 90; gamma = 90; y grupo espacial P 21 21 21. 15 - El compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la estructura de fórmula 1 , es un esqueleto de amarisano. 16 - Un compuesto con esqueleto de amarisano como modulador de la mulíiresistencia a fármacos, que tiene la estructura de fórmula 1 :

en donde existe un enlace C-C entre el C-16 y C20.

17. - ES compuesto con esqueleto de amarisano de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque es (4R,6S_<6'S,7S_!8'E,10^,Z)-4,7-dihidroxi-6^,-metii-4,7-dihidro-3'H,5H- espirofl-benzofuran-ej'-ciclodecafcJfuranJ-l '.S^'H.e'H^diona,

18. - El compuesto con esqueleto de amarisano de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el compuesto de fórmula 1 presenta:

a. una fórmula molecular de C₂oH₂o0₆;

b. un punto de fusión de 256-258 °C

c. una rotación óptica de [a]²² _D +209 (c 0,10, fvte₂CG)

d. señales de ¹H R N (ri_H ult) en: 5.82 dd, H-1 ; 6.38 dd, H-2; 5.93 d, H-3; 3.76 d, H- 6a; 2.85 d, H6b; 2.86 q, H-8; 5.52 d, H-9; 5.52 d, H-10; 2.35 dd, H-11 a; 1.81 dd, H-

116; 4.27 dd, H-12; 6.35 d, H-14; 7.26 d, H-15; 1.24 d, H-17; 5.24 d, H-19Pro R¡ 4.65 d, H-19Fro S; 4.43 s, H-20;

e. señales de ³C R N (d_c) en: 129.5, C-1 ; 1315, C-2; 1 18.8, C-3; 123.9, C-4; 157.6, C- 5; 41.0, C-6; 208.3, C-7; 59.8, C-8; 47.2, C-9; 133.9, C-10; 33.5, C-1 1 ; 61.9, C-12; 123.7, C-13; 108.7, C-14; 142.2, C-15; 150.9, C-16; 9.1 , C-17; 172.4, C-18; 73.6, C-

19; 65.0, C-20;

f. ión molecular observado a m/z 357.13406 en su espectro de masas (HRDART S, calculada para 357.13381 );

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3524, 3479, 1744, 1689, 853 [cm^"1] h. Señales UV (MeOH) Amax (log ε) 224 (4.39);

i. una difracción de rayos-X de monocrístal, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con la Figura 10, con dimensiones de celda unitaria: a = 10.1758 (4); b = 12.2477 (5); c = 13.4918 (6); alpha = 90; beta = 90; gamma = 90; y grupo espacial P 21 21 21.

19. - Extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, obtenidos de Salvia amarissima, que comprenden díterpenos.

20.- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, obtenidos de Salvia amaríssima, de conformidad con la reivindicación 19, caracterizados porque los extractos son de acetona.

21- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, obtenidos de Salvia amaríssima, de conformidad con la reivindicación 19, caracterizados porque las fracciones son fracciones de AcOEt.

22.- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 19, caracterizados porque los diterpenos tienen las siguientes estructuras de fórmula 1-4:

23. - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizados porque el compuesto de fórmula 1 es (4R,6S,6'S,7S,8^1Q7)~4,7-dinidroxi-6'-m^^

cidodeca[c]furan]-1',5'(4^,H,6'H}-diona.

24. - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizados porque el compuesto de fórmula 2 (3aR)-3a-(2-(6-(furan-3- il)~4~metil~2-oxo-2H^iran-3-il)etí¡}-7a-hidra

25. - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizados porque el compuesto de fórmula 3

(2S,3S,5R,6aΉ,8Έ,10a'S}-5-(furan-3-il)-2-hídro i-8^,-metiS-4,5,8 10^et ahidro-2H- espiro[furan-3,7'-nafío[1 ,8a-c]furan]-3',9'(1^,H,6a'H)-dior!a.

26 - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizados porque el compuesto de fórmula 4 (3R,4aS,4bS,7aS,1QaS,12aS)~3-(furan-3-ií^

octahidroisobenzofuro[4,3a-f]isocromen-1,8(3H,7aH)-diona.

27.- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22 y 23, caracterizados porque el compuesto de fórmula 1 es un esqueleto de amarisano.

28.- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22 y 23, caracterizado porque el compuesto de fórmula 1 presenta: a. una fórmula molecular de C₂₀H₂o0₆;

b. un punto de fusión de 256-258 °C

c. una rotación óptica de [a ² _D +209 (c 0,10, Me₂CO)

d. señales de ¹H RMH {d_H Mult) en: 5.82 dd, H-1 ; 6.38 dd, H-2; 5.93 d, H-3; 3.78 d, H- 6a; 2.85 d, ñb; 2.86 q, H-8; 5.52 d, H-9; 5.52 d, H-10; 2.35 dd, H-11 a; 1.81 dd, H- 1 1 b; 4.27 dd, H-12; 6.35 d, H-14; 7.26 d, H-15; 1.24 d, H-17; 5.24 d, H-19Pro R; 4.65 d, H-19Pro S; 4.43 s, H-20;

e. señales de ³C RMN (d_c) en: 129.5, C-1 ; 131.5, C-2; 1 18.8, C-3; 123.9, C-4; 157.6, C- 5; 41.0, C-6; 208.3, C-7; 59.8, C-8; 47.2, C-9; 133.9, C-10; 33.5, C-11 ; 81.9, C-12; 123.7, C-13; 108.7, C-14; 142.2, C-15; 150.9, C-16; 9.1 , C-17; 172.4, C-18; 73.6, C- 19; 65.0, C-20;

f. ión molecular observado a m/z 357.13406 en su espectro de masas (HRDARTMS, calculada para 357.13381 );

g. bandas en e! espectro infrarrojo (KBr) en: 3524, 3479, 1744, 1689, 853 [crrf¹] h. Señales UV (MeOH) Amax (!og ε) 224 (4.39);

i. una difracción de rayos-X de monocristai, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con la Figura 10, con dimensiones de celda unitaria: a = 10.1756 (4); b = 12.2477 (5); c = 13.49 8 (6); alpha = 90; beta = 90; gamma = 90; y grupo espacial P 21 21 21.

29.- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22 y 24, caracterizado porque el compuesto de fórmula 2 presenta:

a. una fórmula molecular de C₂oHi₉0_?;

b. un punto de fusión de 230-232 °C

c. una rotación óptica de [a]²² _D 93 (c 0.15, e₂CO)

d. señales de ¹H RMN (d_H Mult) en: 6.03 d, H-1 a; 6.77 dd, H-2, 2.81 dd, H-3a; 2.70 br d, H-3b; 1.67 ddd, H-6a; 1.73 ddd, H-6fo; 2.55 ddd, H-7a; 2.34 ddd, H~7b; 6.16 s, H-1 1a; 6.60 br s, H-14; 7.46 br s, H-15; 7.91 br s, H-16; 4.85 d, H-19Profl; 4.45 d, H-19Pra-S; 2.10 s, H-20;

e. señales de ¹³C RMH (d_c) en: 127.3, C-1 a; 142.5, C-2; 29.7, C-31 ; 75.6, C-4; 57.0, C- 5; 28.6, C-6a; 21.8, C-7a: 120.6, C-8; 249.8, C-9; 197.1 , C-10; 104.1 , C-1 1 a; 151.3, C-12; 1 19.0, C-13; 106.2, C-14; 143.6, C-15; 141.3, C-16; 161.5, C-17; 173.7, C-18; 69.4, C-19ProP; 18.3, C-20;

f. ión molecular observado a m/z 371.11323 en su espectro de masas {HRDARTMS, calculada para 371.1 1308);

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3270, 1780, 1687, 1645, 875 [cm^"1] h. Señales UV (MeOH) Amax ( og ε) 21 1 (4.25); i. una difracción de rayos-X de monocristaí, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con Sa Figura 1 1 , con dimensiones de celda unitaria: a = 16.8901 (3); b = 18,8901 (3); c = 5.8211 (1 ); alpha = 90; beta = 90; gamma = 120; y grupo espacia! P31.

30. - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de ios mismos, de conformidad con la reivindicación 22 y 25, caracterizado porque el compuesto de fórmula 3 presenta:

a. una fórmula molecular de C₂oH2o0₆;

b. un punto de fusión de 132-134 °C

c. una rotación óptica de [a]²² _D +16 (c 0.10, CHCI₃)

d. señales de ¹H R N (d_H ult) en: 6.20 dd, H-1 a; 6.48 ddd„ H-2; 7,03 d, H-3a; 2.28 d, H-6a; 2.56 br d, H-6b; 2.91 q, H-8; 3.26 br s, H-10; 2.60 dd, H-1 1a; 2.31 dd, H-1 1 b; 5.18 f, H-12; 6.45 d, H-14; 7.38 t, H-15; 7.40 br s, H~16; 1.18 d, H-17; 4.17 d, H- WProR; 4.46 dd, H-1 QProS; 4.85 s, H-20;

e. señales de "C RMN (d_c) en: 135.6, C-1 a; 125.9, C-2; 128.2, C-3a; 130.8, C-4; 43.4, C-5; 43.7, C~6a; 207.9, C-7a; 49.1 , C-8; 59.9, C-9; 45.2, C-10; 42.7, C-1 1a; 74.0, C- 12; 128.2, C-13; 109.0, C-14; 143.8, C-15; 140.0, C-16; 9.3, C-17; 168.5, C-18; 75.8, C-19ProR; 98.3, C-20;

f. ion molecular, DARTTOF+, [M + Hf m/z 357.13338, calculada para 357.13381 ;

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3359, 1733, 1704, 873 [crn ¹]

h. Señales UV (MeOH) Amax (log ε) 207 (4.21 }, 297 (3.96);

31 . - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 22 y 26, caracterizado porque el compuesto de fórmula 4 presenta:

a. una fórmula molecular de C20H23O7;

b. un punto de fusión de 268-270 °C

c. una rotación óptica de [a]²² _D ÷85 (c 0.18, CHCI₃);

d. señales de ¹H RMN (d_H Mult) en: 2.48 dd, H-1 a; 2.37 br d, H-1b; 6.07 d, H-2; 5.83 dd, H-3a; 1.65 m, H-6a; 1.29 dd, H-6b; 2.07 m, H~7a; 1.65 m, H-7b; 2.47 m, H~8; 3.1 1 dd, H-11a; 1.90 d, H-1 1b; 5.66 d, H-12; 6.39 s, H-14; 7.37 s, H-15; 7.44 s, H- 6; 4.29 d, H-19ProR; 4.89 d, H-19ProS; 1.26 s, H-20;

e. señales de ¹ C RMN (d_c) en: 29.5, O a; 130.2, C-2; 126.2, C-3a; 75.9, C-4; 40.1 , C- 5; 24.5, C-6a; 16.8, C-7a; 43.0, C-8; 41.2, C-9; 47.9, C-10; 33.7, C-11a; 71.2, C-12; 127.4, C-13; 108.8, C-14; 138.7, C-15; 144.2, C-16; 172.8, C-17; 175.0, C-18; 71.4, C-19ProR; 27.4, C-20;

f. ión pseudomolecufar a m/z 375.145Q3 en su espectro de masas de alta resolución (DART-TOF+);

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3424, 3254, 1771 , 1723, 876 [cm^"1] h. Señales UV (MeOH) Amax (Sog ε) 206 (3.90);

32. ~ Los extractos, fracciones y compuestos aislados de Sos mismos, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizados además porque los diterpenos de fórmula 1 -4 se encuentran presentes en ei extracto y/o fracción de forma individual o como una combinación de los mismos.

33.- Los extractos, fracciones y compuestos aislados de ios mismos, de conformidad con la reivindicación 32, caracterizados además porque los diterpenos de fórmula 1 -4 se aislan de la fracción de AcOEt.

34. - Los extractos, fracciones y compuestos aislados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque los compuestos diterpenos aislados se encuentran presentes de forma individuas o como una combinación de los mismos en las fracciones de AcOEt.

35. - Un método de extracción, aislamiento y purificación de compuestos diterpenos con actividad citotoxica y moduiadora de la multiresistencsa a fármacos a partir de Salvia amaríssima, que comprende los siguientes pasos:

a. Secar las hojas y flores;

b. Moler las hojas y flores secas;

c. Realizar una extracción por percolación con disolvente hasta obtención de un residuo; d. Someter a partición con hexano;

e. Realizar exfracciones con eOH/H₂0 80:20 y obtener Sos extractos respectivos; f. Concentrar la fracción hidroalcohólica y someter a partición con AcOEt, obteniendo fracciones de AcOEt;

g. Someter a aislamiento y purificación los compuestos diterpenos con cromatografía en columna con un sistema de elusión con disolventes polares y no polares, y cromatografía de líquidos de alta resolución.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el disolvente puede ser polar, no polar, una combinación de los mismos.

37.- ES método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque los disolventes son acetona, metano!, acetato de etilo, cloroformo, hexano, dicSorometano o combinaciones de Sos mismos.

38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el disolvente es preferiblemente acetona.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque los compuestos diterpenos aislados se encuentran presentes de forma individual o como una combinación de los mismos en los extractos y/o fracciones.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque los compuestos diterpenos se aislaron de las fracciones de AcOEt,

41. - E! método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque los compuestos diterpenos aislados se encuentran présenles de forma individua! o como una combinación de ¡os mismos en las fracciones de AcOEt,

42. - ES método de conformidad con ia reivindicación 35, caracterizado porque los com uestos diterpenos tienen las siguientes estructuras de fórmula 1 -4:

43. - ES método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque eí compuesto de fórmula 1 es (4R,8S,8'S_Í7S_>8'E_!10^,Z)-4_!7-dihidroxi-6^,-metil-4,7~dihidro~3'H,5H-espiro[1- benzofuran-BJ'-ciclodecafcJfuranl-l'.S'í^H.e'H^diona.

44. - E! método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el compuesto de fórmula 2 (3aR)-3a-(2-{6-(furan-3-!S}-4-metil-2-oxo-2H-piran-3-il)etil)-7a-hidroxi-3,3a,7,7a- tetrahidroisobenzofuran-1 ,4-diona.

45. - Eí método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el compuesto de fórmula 3 (2S,3S,5R_!6a ,8'S_> 10a'S)-5~{furan-3-!l)-2-hidroxi-8'-metil-4,5,8\10^,-tetrahidro~

2H-espiro[furan-3,7^,-nafto[1.Sa-clfuranj-S'^ I ^!H,6a'H)-diona .

46. - El método de conformidad con ia reivindicación 42, caracterizado porque eí compuesto de fórmula 4 (3R,4aS,4bS,7aS,10aS,12aS)-3-(furan-3-i!Hb,7a~dihidroxi-4a-meti!- 4,4a, 4b,5, 10,1 1 , 12, 12a-ocfahidroisobenzofuro[4,3a-f]isocromen-1 ,8(3H,7aH}-diona.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 42 y 43, caracterizado porque el compuesto de fórmula 1 es un esqueleto de amarisano.

48.- El método de conformidad con la reivindicación 42 y 43, caracterizado porque el compuesto de fórmuSa 1 presenta:

a. una fórmula molecular de C₂oH2oO_g:

b. un punto de fusión de 256-258 °C

c. una rotación óptica de [a]²² _D +209 (c 0.10, Me₂CO)

d. señales de ¹H RMH (d_H Mult) en: 5.82 dd, H~1 ; 6.38 dd, H-2; 5.93 d, H-3; 3.76 d, H- 6a; 2.85 d. H6b; 2.86 q, H-8; 5.52 d, H-9; 5.52 d, H-10; 2.35 dd, H-11 a; 181 dd, H- 11 ); 4,27 dd, H-12; 6.35 d, H-14; 7.26 d, H-15; 1.24 d, H-17; 5.24 d, H-19Pro R; 4.65 d, H-1 BPro S 4.43 s, H-20; e. señales de ³C RMN (d_c) en: 129.5, C-1; 131.5, C-2; 118.8, C-3; 123.9, C-4; 157.6, C- 5; 41.0, C-6; 208.3, C-7; 59.8, C-8; 47.2, C-9; 133.9, C-10; 33.5, C-11; 61.9, C-12; 123.7, C-13; 108.7, C-14; 142.2, C-15; 150.9, C-16; 9.1, C-17; 172.4, C-18: 73.6, C- 19; 65.0, C-20;

f. ion molecular observado a miz 357.13406 en su espectro de masas (HRDARTMS, calculada para 357.13381);

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3524, 3479, 1744, 1689, 853 [cm^"1] h. Señales UV (MeOH) Amax (!og ε) 224 (4.39);

i. una difracción de rayos-X de monocrisía!, utilizando radiación Cu Ka, de conformidad con ia Figura 10, con dimensiones de celda unitaria: a = 10.1758 (4); b = 2.2477 (5); c = 13.4918 (6); aipha = 90; beta = 90; gamma = 90; y grupo espacia! P 21 21 21.

49. - Ei método de conformidad con ¡a reivindicación 42 y 44, caracterizado porque e! compuesto de fórmula 2 presenta:

a. una fórmula molecular de C₂oH<a0₇;

b. un punió de fusión de 230-232 °C

c. una rotación óptica de [af² _D +93 (c 0.15, e₂CO)

d. señales de ¹H RMN (d_H Mult) en: 6.03 d, H~1a; 8.77 dd, H-2; 2.81 dd, H-3a; 2.70 br d, H-3b; 1.67 ddd, H-6a; 173 ddd, H-6b; 2.55 ddd, H-7a; 2.34 ddd, H-7b; 6.16 s, H-11a; 6.60 br s, H-14; 7.46 br s, H-15; 7.91 br s, H-16; 4.85 d, H-19Pro 4.45 d, H-19Pro-S; 2.10 s, H-20;

e. señales de ¹³C RMN (cf_c) en: 127.3, C-1a; 142.5, C-2; 29.7, C-31 ; 75.6, C-4; 57.0, C- 5; 28.6, C-6a; 21.8, C~7a; 120.6, C-8; 249.8, C-9; 197.1 , C-10; 104.1 , C-11a; 151.3, C-12; 119.0, C-13; 106.2, C-14; 143.6, C-15; 141.3, C-16; 161.5, C-17; 173.7, C-18; 69.4, C-I BProR; 18.3, C-20;

f. ión molecular observado a m/z 371.11323 en su espectro de masas (HRDARTMS, calculada para 371.11308);

g. bandas en el espectro infrarrojo (KBr) en: 3270, 1780, 1687, 1645, 875 [cm^'1] h. Señales UV (MeOH) Amax (log ε) 211 (4.25);

i. una difracción de rayos-X de monocrisía!, utiüzando radiación Cu Ka, de conformidad con la Figura 11 , con dimensiones de celda unitaria: a = 16.8901 (3); b = 16.8901 (3); c = 5.8211 (1); alpha = 90; beta = 90; gamma = 120; y grupo espacial P31.

50. - El método de conformidad con la reivindicación 42 y 45, caracterizado porque el compuesto de fórmula 3 presenta:

a. una fórmula molecular de Ο_?0Η₂₀Ο₆;

b. un punto de fusión de 132-134 °C

c. una rotación óptica de [af² _D +16 (c 0.10, CHCS₃) d. señales de ¹H RMN (d_H Muí!) en: 6.20 dd, H-1 a; 6.48 ddd, H-2; 7.03 d, H-3a; 2.28 d, H-6a; 2.56 br d, H-6b; 2.91 q, H-8; 3.28 br s, H-10; 2.60 dd, H-1 1 a; 2.31 dd, H-1 1 b; 5.18 t H-12; 6,45 d, H-14; 7.38 t, H-15; 7.40 br s, H-16; 1.18 d, H-17; 4.17 d, H- 19PraR; 4.46 dd, H-19ProS; 4.85 s, H-20;

e. señales de ¹³C RMN (d_c) en: 135.6, C-1 a; 125.9, C-2: 128.2, C-3a; 130.8, C-4; 43.4, C-5; 43.7, C-6a; 207.9, C-7a; 49.1 , C-8; 59.9, C-9; 45.2, C-10; 42.7, C-1 1 a; 74.0, C- 12; 128.2, C-13; 109.0, C-14; 143.8. C-15; 140.0, C-16; 9.3, C-17; 168.5, C-18; 75.8, C-19Pro/?; 98.3, C-20;

f. ion molecular, DARTTOF+, [M + H]* m/z 357.13338, calculada para 357.13381 ;

g. bandas en e! espectro infrarrojo (KBr) en: 3359, 1733, 1704, 873 [cm^"1]

h. Señales UV (MeOH) Amax (log ε) 207 (4.21 ), 297 (3.96);

51. - El método de conformidad con la reivindicación 42 y 46, caracterizado porque el compuesto de fórmula 4 presenta:

a. una fórmula molecular de C20H23O7;

b. un punto de fusión de 268-270 °C

c. una rotación óptica de [af ² _D +85 (c 0.18, CHCI₃);

d. señales de ¹H RMN (d_H Mult) en: 2.48 dd, H-1 a; 2.37 br d, H-1 b; 8.07 d, H-2; 5.83 dd, H-3a; 1.65 m, H-6a: 1.29 dd, H-6b; 2.07 m, H-7a; 1.65 m, H-7b; 2.47 m, H-8; 3. 1 dd, H-1 1 a; 1.90 d, H-1 1b; 5.66 d, H-12: 6.39 s, H-14; 7.3? s, H-15; 7.44 s, H-16; 4.29 d, H-19ProR; 4.89 d, H-19PfaS; 1.26 s, H-20;

e. señales de ¹³C RMN (d_c) en: 29.5, C-1 a; 130.2, C-2; 126.2, C~3a; 75.9, C-4; 40.1 , C- 5; 24.5, C-6a; 16,8, C-7a; 43.0, C-8; 41.2, C-9; 47.9, C-10; 33.7, C-1 1a; 712, C~12; 127.4, C-13; 108.8, C-14; 138.7, C-15; 144.2, C-16; 172.8, C-17; 175.0, C-18; 71.4, C-19PraP; 27.4, C-20;

f. ion pseudomoiecu!ar a m/z 375.14503 en su espectro de masas de alta resolución (DART-TOF+);

g. bandas en ei espectro infrarrojo (KBr) en: 3424, 3254, 1771 , 1723, 876 [cm^"1j

h. Señales UV (MeOH) Amax (iog ε) 206 (3.90);

52. - Compuestos diterpenos aislados a partir del método de extracción, aislamiento y purificación de la reivindicación 35-38.

53. - Un compuesto diterpeno de la fórmula 1 :

aisiado mediante e! método de extracción, aislamiento y purificación de la reivindicación 35- 38.

54.- Un compuesto diterpeno de la fórmula 2:

aislado mediante el método de extracción, aislamiento y purificación de la reivindicación 35- 38.

55.- Un compuesto diterpeno de la fórmula

aislado mediante el método de extracción, aisiamienío y purificación de la reivindicación 35 38.

56.- Un compuesto diterpeno de la fórmula 4:

57. - Un compuesto con esqueleto de amarisano, aislado mediante el método de extracción, aislamiento y purificación de la reivindicación 35-38.

58. - Ei compuesto con esqueleto de amarisano de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque tiene la estructura:

en donde existe un enlace C-C entre C-16 y C20.

59. - Uso de los compuestos diterpenos de las reivindicaciones 1 y 7 como agentes citotóxícos.

60. - El uso de los compuestos diterpenos de conformidad con ¡a reivindicación 59, en donde el agente citotóxíco es un compuesto de fórmula 1 ó 2.

61 . - El uso de los compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 60, en donde el compuesto de fórmula 1 es;

62.- El uso de ios compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 60, en donde el compuesto de fórmula 2 es:

63. - El uso de los compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el compuesto de fórmula 1 presenta actividad citotóxica contra células de carcinoma colorectaí (HCT-15 IC₅₀ = 12.9 ± 1.7 pg/mL y HCT-1 16 SC₅₀ = 10.9 ± 1.0 pg/mL).

64. - El uso de los compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el compuesto de fórmula 1 presenta actividad citotóxica contra células de cáncer de mama ( DA- B 231 10» = 12.3 ± 1.5 pg/mL

65. - El uso de los compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el compuesto de fórmula 1 presenta actividad citotóxica contra cáncer de cérvix (HeLa ÜC₅₀ =

13.7 ± 4.7 pg/mL).

66. - E! uso de los compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 62, en donde e! compuesto de íórmuia 2 presenta actividad ciíotóxica contra cáncer de mama (MCF-7 IC₅₀ = 18.2 ± 2.02 pg/mL y MDA-MB-231 IC_EC = 19-3 ± 0.82 pg/mL).

67. - El uso de los compuestos diterpenos de conformidad con la reivindicación 62, en donde ei compuesto de fórmula 2 presenta actividad ciíotóxica contra cáncer de cérvix (HeLa iCso ^ 14.0 ± 1.04 Mg/mL),

68. - Uso de! compuesto diterpeno de ¡a reivindicación 12, como modulador de la multiresisíencia a fármacos en carcinoma de mama, colon y cérvix.

69. - El uso del compuesto diterpeno de conformidad con ia reivindicación 68, en donde el modulador de la multiresisíencia a fármacos es un compuesto de fórmula 1.

70 - El uso del compuesto diterpeno de ¡a reivindicación 69, en donde el compuesto de fórmula 1 es:

71. - Ei uso del compuesto diterpeno de conformidad con ia reivindicación 70, en donde ei compuesto de fórmula 1 presenta actividad de la reversión de la muitiresistencia en cáncer de mama (RF_MCF-7 V_ÍFH > 10703 a 25 pg/ml y RF _MC -7_{/ I}+ 7.2 a 5 pg/ml),

72. - El uso del compuesto diterpeno de la reivindicación 1 , en la resensibiiización a vinblastina contra tumores resistentes a este anticancerfgeno.

73. - Ei uso del compuesto diterpeno de conformidad con la reivindicación 72, en donde el compuesto diterpeno es un compuesto de fórmula 1 :

74. - El uso del compuesto diterpeno de conformidad con ia reivindicación 73, en donde el compuesto de fórmula 1 es: {4R_>6S,6'S,7S,8^íE,10^,Z)-4,7-dihidroxi-6^,-met!!-4_i7-dihidro-3^,H,5H- e3p!ro[1-benzofuran-6,7^,-cíclodeca[c]furan]-1'_!5^,{4'H_l6'H)-diona.

75. - Uso de! compuesto con esqueleto de amarisano de la reivindicación 12, como modulador de la muitiresistencia a fármacos en carcinoma de mama, colon y cérvix. 76,- El uso del compuesto con esqueleto de amarisano de conformidad con la reivindicación 75, en donde el modulador de la muiíiresistencia a fármacos es un compuesto de fórmula 1 :

en donde existe un enlace C~C entre C16 y C20.

77. - E! uso del compuesto con esqueieto de amarisano de conformidad con la reivindicación 76, en donde e! compuesto de fórmula 1 es: (4R_l6S,6'S,7S,8^,E,10^,Z)-4_l7-dshidroxi-8'-metil- 4J-dihid o-3Ή,5H-espiro[1-benzofυran-6, '-cidodeca[c]fu anj- ,5"(4Ή,6'H)-diona,

78. - Ei uso del compuesto con esqueleto de amarisano de conformidad con la reivindicación 75 y 76, en donde el compuesto de fórmula 1 presenta actividad de ía reversión de ía rnuitiresisíertcia en cáncer de mama (RFMc_F-7/vin+ ^> 10703 a 25 pg/mi y RF _MCF-7/v¡n+ ⁷-2 a 5 pg/ml).