WO2017093531A1 - Modele de lymphome cutane primitif - Google Patents

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Laetitia ANDRIQUE
Edith CHEVRET
Jean-Philippe MERLIO
Sandrine POGLIO
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Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux
Universite de Bordeaux
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Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux
Universite de Bordeaux
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    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases

Definitions

  • the invention relates to an animal model of primary cutaneous lymphoma and methods using this model to evaluate the biological and genetic properties of primary cutaneous lymphoma tumor cells, as well as to identify or evaluate the efficacy of treatment against cutaneous lymphoma. primitive.
  • PCL Primary cutaneous lymphoma
  • the invention relates to a non-human animal model of primary cutaneous lymphoma (LCP), wherein human primary cutaneous lymphoma cells are grafted into the liver of said animal.
  • LCP primary cutaneous lymphoma
  • said animal is an adult animal.
  • said animal is a rodent, in particular a mouse.
  • the animal is an immunodeficient animal, more particularly an immunodeficient mouse such as a NOD mouse, a NOD / SCID mouse or more preferably an NSG mouse (NOO.Cg-Prkd ⁇ Ittrg ⁇ / SzJ ).
  • the grafted cells may correspond to primary cells of a patient suffering from a LCP, in particular a primary line of a patient suffering from a type T or type B LCP, or has a line LCP cell.
  • the cell lines that can be grafted mention may be made of My-La, HUT78, HH, SeAx, MAC1, MAC2A and FE-PD lines.
  • the cells are injected intrahepaticly, in particular into one or more lobes of the liver, under the hepatic capsule of the animal.
  • the cells are injected into the liver via the portal vein.
  • the invention also relates to a method for preparing an animal model of primary cutaneous lymphoma, comprising the injection of human LCP cells into the liver of a non-human animal, more particularly into one or more lobes. of the liver, under the hepatic capsule of said animal, or by injection via the portal vein.
  • the method for preparing the model may further comprise rearing said animal for at least 2 days, in particular for about 2 to 5 days, in particular for 2 or 3 days after injection of the cells, before further use of the animal model produced in the animal.
  • LCP cells from 2 to 10 million LCP cells, for example 5 million LCP cells, are injected into the liver of the animal.
  • the invention relates to a method for evaluating the efficacy of a treatment against a LCP, comprising:
  • the treatment is administered for 2 to 5 days, in particular 3 days, after the grafting of human LCP cells into the liver of the animal model.
  • the effectiveness of the treatment is evaluated from 10 to 15 days, in particular 12 days, after the administration of said treatment.
  • the invention furthermore relates, according to a fourth aspect, to a method of studying or evaluating a property of tumorigenesis, migration or invasion in human LCP cell organs, including the study of said property. in the animal model according to the invention.
  • Figure 1 shows organ sections of mice that had received LCP xenograft, immunohistochemically labeled with anti-HLA-ABC (HLA) and counter-stained with Mayer Hematoxylin (HES).
  • HLA anti-HLA-ABC
  • HES Mayer Hematoxylin
  • FIG. 2 presents the hepatic xenograft model according to the invention, (a) diagram representing an intrahepatic xenograft and methotrexate treatment protocol according to the invention; (b) Table showing the liver weight / weight ratio of the animal at day 15 after transplant, showing that methotrexate strongly reduces the formation of hepatic tumor; (c) confirmation of reduced formation of hepatic tumors by anti-HLA-ABC immunohistochemistry on liver sections; (d) HLA-ABC antigen detected by flow cytometry in different organs of mice: a significant reduction in the number of cells carrying HLA-ABC antigen was observed in the lungs and spleens of mice treated with methotrexate (ns: no significant METHO: Methotrexate).
  • FIG. 3 presents an example of characterization and sorting of human T-type LCP cells derived from a patient
  • (a) Dot plots represent the characterization of the cells of a patient in flow cytometry by labeling with an anti-human antibody.
  • -TCRV specific for the majority tumor clone and anti-CD4, CD8 and CD3 antibodies coupled to different fluorochromes.
  • the present invention relates to a non-human animal model of primary cutaneous lymphoma (LCP), wherein human LCP cells are grafted into the liver of said animal.
  • LCP primary cutaneous lymphoma
  • the animal used for producing the model is a rodent, in particular a rat or a mouse, more particularly a mouse.
  • the animal will advantageously be chosen from immunodeficient animals, in particular an immunodeficient rodent such as an immunodeficient mouse.
  • an immunodeficient rodent such as an immunodeficient mouse.
  • an immunodeficient mouse such as an immunodeficient mouse.
  • the known immunodeficient mice that may be used in the context of the present invention, mention may be made of NOD, NOD / SCID, BXN, RAG, RAG2, RAG- ⁇ C mice, or the NSG (or NOD.Cg-rfefc) mouse. IUrg ⁇ / Szi).
  • the NSG mouse is one of the most immunodeficient mice described to date.
  • the animal may be a newborn animal, a young animal or an adult animal.
  • the selected animal is an adult animal, especially a mouse aged 8 to 10 weeks.
  • the human LCP cells used to establish the model of the present invention may in particular be cutaneous T-cell lymphoma cells of different subtypes, in particular the three main subtypes that are mycosis fungoides (MF), Sezary's syndrome (SS) and cutaneous anaplastic large cell lymphoma (cALCL for primary CD30 + cutaneous anaplastic broad-cell lymphoma).
  • MF mycosis fungoides
  • SS Sezary's syndrome
  • cALCL cutaneous anaplastic large cell lymphoma
  • the human LCP cells used to establish the model may be primary LCP cells of a human patient with LCP.
  • the cells used are primary T-type LCP cells.
  • the cells used are primary LCP type B cells.
  • the primary cells of LCP Patients derived from patients can be prepared according to any means known to those skilled in the art.
  • the cells can in particular be isolated from a cutaneous biopsy from the patient, the cutaneous tissue being prepared by dissection and homogenization, in particular according to the modalities presented in the examples presented below.
  • the cells may also be isolated from a patient's blood sample, isolated on a Ficoll gradient so as to obtain the fraction of mononuclear cells, in particular according to the modalities presented in the examples presented below.
  • the heterogeneity of the T-type LCP cells and the characterization of the major clone present in the sample can then be determined according to the expression of the TCRVP and the TCRy profile.
  • the identification of the TCR profile characteristic of T-type LCP cells makes it possible to specifically select the cancer cells and to monitor the engraftment in the mouse.
  • the majority tumor cells can then be selected before the graft according to the expression of the TCRV on their surface according to the following criteria: TCRVPtumorai + CD3 + CD4 + CD8-.
  • said human LCP cells correspond to human LCP-derived cell lines such as the My-La, HUT78, HH, SeAx, MAC1, MAC2A and FE-PD lines.
  • the grafted human LCP cells may be aggressive or indolent LCP cells, or may correspond to cells representative of different stages of the disease, for example cells of early or advanced LCP.
  • human LCP cells are injected into the liver of the animal chosen. Any injection allowing the colonization of the liver by human LCP cells is considered in the context of the present invention.
  • human LCP cells can be injected into one or more lobes of the liver, more particularly under the hepatic capsule. Alternatively, the cells can be injected into the liver via the portal vein.
  • from 2 to 10 million human LCP cells in particular from 2 to 5 million cells, are injected into the liver of the animal.
  • the injection of 2 to 10 million cells can be carried out, in particular 2 to 5 million, including an injection of 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 or 5 million cells.
  • a suitable volume is injected, depending on the animal used in the constitution of the animal model and the number of cells to be injected. As an illustration, for intrahepatic injection under the hepatic capsule of an adult mouse, a volume of 50 ⁇ L maximum is injected.
  • a daily monitoring of the clinical state of the mice according to the appearance of a visible mass in the abdomen and a series of endpoint criteria defined by the animal housing animal, can then be performed.
  • the monitoring of engraftment (evaluation of the percentage of human cells) over time can be performed by blood sampling followed by an analysis of the presence of human cells in flow cytometry.
  • the engraftment in the liver of the animal can be evaluated in several ways. As an illustration, the following three experimental modalities can be used, after sacrifice of the animal:
  • the weight of the liver and the weight of each animal are measured, in particular using a precision balance. The weight ratio of the liver / weight of the animal is then calculated. This report will be considered pathological, and therefore indicative of a graft, if it is greater than 5%. For the most aggressive tumors, the tumor invasion can be visible to the naked eye.
  • a biopsy of the liver, and possibly other organs can be performed. Each piece can then be fixed, especially with 4% formalin, in particular at room temperature overnight, before paraffin embedded block. Sections of each paraffin block, in particular of 3 .mu.m thick, are made before specific immunostaining with an antibody which makes it possible to detect human cells (in particular an anti-HLA antibody).
  • the remainder of each organ not bound to formalin can be cultured in isolated cells (eg by mechanical dissociation with a scalpel).
  • the cells may be cultured in a suitable culture medium (in particular RPMI medium) supplemented with appropriate additives, in particular 20% fetal calf serum under appropriate culture conditions (eg at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO2).
  • a suitable culture medium in particular RPMI medium
  • appropriate additives in particular 20% fetal calf serum
  • Immunolabeling can then be carried out by means of an antibody which makes it possible to detect human cells (in particular an anti-HLA antibody) associated with an appropriate labeled secondary antibody which then makes it possible to detect the percentage of human cells in each organ relative to the number of cells. total (human and mouse).
  • the detection can in particular be carried out by means of a flow cytometer.
  • the expression of the variant TCRVP and the TCRy profile can also be analyzed, respectively in flow cytometry and PCR. These analyzes make it possible to determine that the cells that graft correspond to the starting tumor cells.
  • the animal After injection of the human LCP cells into the liver of the animal, the animal is raised for a suitable period of time for the grafting, in particular for at least 2 days, in particular for approximately 2 or 3 days after injection of the cells. The animal is then used in one of the methods described below.
  • the animal model according to the invention can advantageously be used in a method of evaluating the efficacy of a treatment against a LCP, comprising:
  • the treatment may correspond to any substance that may have a curative or preventive effect against a human LCP, including prodrugs of such substances.
  • the treatment may correspond to molecules whose anti-tumor properties are already known. Alternatively, the tested treatment has never been reported as having antitumor properties, the present invention being able to allow large scale screening of many substances for their effect against LCP.
  • Administration of the treatment is carried out by any appropriate route, including orally, intramuscularly, intravenously, intra-arterially, intraperitoneally, cutaneously, subcutaneously or intranasally.
  • the treatment is administered to the animal model after transplantation, in particular after at least 2 days, in particular after about 2 to 5 days, in particular after 2 or 3 days after injection of the LCP cells into the liver of the animal.
  • the skilled person will adapt the diet and / or dosage to the substance administered.
  • the test substance may be administered once on the first day of treatment, without further administration before evaluating the effect of said treatment.
  • the substance may be administered several times throughout the treatment protocol. For example, said substance can be administered daily for the duration of the protocol, one or more times per day.
  • the effectiveness of the treatment is evaluated after a suitable duration to observe a therapeutic effect.
  • the efficacy can be evaluated from 10 to 15 days after administration of the substance to the animal.
  • the effectiveness of the treatment may be evaluated 10, 11, 12, 13, 14 or 15 days after administration of the substance.
  • the effectiveness of the treatment is evaluated 11, 12 or 13 days after its administration, in particular 12 days after.
  • the grafted human LCP cells being both derived from a different animal (human cells grafted into the liver of a non-human animal) and originating from a different tissue of the liver, they will be easily detected and / or traced. in the animal model organism of the invention by means well known in the art for the discrimination of this animal and / or tissue origin.
  • the presence or absence of human LCP cells in the animal model of the invention may in particular be determined by specific immunostaining using an anti-HLA (human leukocyte antigen) antibody or a specific antibody.
  • tumor cells which make it possible to detect human immune cells present in a sample taken from the animal, in particular in a liver biopsy or any other organ in which a study of the invasion of human LCP cells is desired.
  • cells from a biopsy performed in one of the organs or tissues of the animal can be cultured, then labeled with an anti-HLA antibody and then determine the percentage of human cells (and therefore of human LCP cells, or derived from human LCP) present in said organ or tissue by means of a flow cytometer.
  • Effective treatment is identified when the number and / or size of tumors induced by the graft in the liver and / or other organs of the animal is decreased.
  • a treatment will be judged effective in case of observation of a stabilization of the number and / or size and / or dissemination to other grafted cell organs deriving from an aggressive and / or advanced LCP.
  • the effect of the treatment is compared to the effect of transplanting the same human LCP cells onto an untreated animal (or several animals), or to the effect of placebo administered to an animal (or to several animals) grafted with the same human LCP cells, used as a control.
  • the animal not treated with the drug develops tumors, and the comparison of the condition control with the therapeutic treatment allows the observation of a diminution, or even of a complete abolition, of the tumors.
  • the effect of the treatment is compared to the effect of a reference treatment.
  • the reference treatment may correspond to treatment with methotrexate. This alternative embodiment can be advantageously used to select more effective treatments, or as effective as the reference treatment, or to select treatments that may have fewer side effects than the reference treatment.
  • the invention furthermore relates to a method of studying or evaluating a property of tumorigenesis, migration and / or invasion in human LCP cell organs, including the study of said property in the model. animal according to the invention.
  • This method implements the properties of the graft described above, in particular the possibility of easily discriminating the cells derived from it by means of techniques known to those skilled in the art.
  • LCP lines My-La, HUT78, HH and MAC2A
  • FE-PD and MAC1 two indolent LCP lines
  • FCS fetal calf serum
  • the patient's cells are either skin biopsies or blood of the different lymphomas sent by the dermatology department of the Saint-André Hospital (CHU Bordeaux). Cutaneous biopsies are maintained in MEM alpha medium containing 10%> SVF, 10%> human AB serum and 1%) Streptomycin / Penicillin and complemented with human cytokines: human stem cell factor (hSCF) (50ng / ml), Fms -like tyrosine kinase 3 (Flt-3) (20 ng / ml), interleukin -7 (IL-7) (10 ng / ml), insulin (20 nM) ("patient medium").
  • hSCF human stem cell factor
  • IL-7 interleukin -7
  • the ground material is cultured at 37 ° C in a controlled atmosphere at 5% CO2 in the "patient medium” for 24 hours.
  • the cells are filtered through 70 ⁇ sieve (Becton Dickinson) and the filtrate containing cutaneous lymphoma cells is recovered for grafts.
  • the blood is diluted with the same volume of PB S (Phosphate Buffer Saline) without calcium and magnesium, and then gently deposited in a Pancoll tube (Falcon).
  • PB S Phosphate Buffer Saline
  • the samples are centrifuged at 2600 rpm for 15 minutes without brake.
  • the ring of mononuclear cells is recovered, rinsed with PBS and again centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes.
  • the cells are then counted.
  • a portion of the sample of human LCP cells from patients (1 million cells) is labeled with the TCRVP kit (Beckman Coulter) according to the supplier's recommendations.
  • the labeling is performed on a suspension of mononuclear cells in 50 .mu.l of PBS. 1 ⁇ l of each antibody of interest coupled to different fluorochromes is added and incubated for 30 minutes at 4 ° C. After washing with PBS, the cells are suspended in 350 ⁇ l of PBS and the acquisition is done using a flow cytometer FACSCanto II (BD Biosciences).
  • genomic DNA is extracted from 5 million cells using the QIAGEN DNA mini kit according to the supplier's recommendations.
  • a PCR followed by a fluorescence analysis on a capillary electrophoresis instrument is carried out to define the TCRy profile. This is carried out according to the recommendations of the supplier of the IdentiClone TM kit (In Vivo Scribe Technologies).
  • TCRV Bactet al.
  • TCRV Beckman Coulter
  • the marking is carried out on a suspension of mononuclear cells in 50 ⁇ ⁇ PBS. 1 ⁇ ⁇ of each antibody of interest (TCRVP, CD3, CD4 and CD8) coupled to different fluorochromes are added and incubated 30 minutes at 4 ° C. After washing with PBS, the cells are suspended in 350 ⁇ ⁇ PBS. TCRV tumomi CD3 + CD4 + CD8- cells are sorted on an ARIA II sorter (BD Biosciences). The antibodies used for isolation are adaptable according to the type of lymphoma.
  • mice The pain is taken into account, the animals receiving 30 minutes before the operation an injection of Vetergesic (Buprenorphine) of 3 ⁇ g (ie ⁇ .) Intraperitoneally. The mice are then shaved on the abdomen. 5x10 6 cells were grafted into the liver of adult (8-10 weeks) immunodeficient NSG (NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tmlwjl / SzJ) mice in the following ways:
  • a lobe of the liver is then externalised by pressure on both sides of the rib cage, in order to perform an injection under the liver capsule of up to 50 ⁇ L of a cell suspension containing the 5 million cells in a sterile liquid (adapted culture medium without serum) using an insulin needle (Thermo® syringe 300 ⁇ L needle 29G xl / 2 size 0.33x12mm);
  • the organ is then returned to the abdominal cavity after rinsing with saline; the peritoneal and cutaneous planes are stitched together with suture 5.0;
  • the body temperature of the animal is maintained by means of a heating mat.
  • the weight of the animals was measured daily, and their state of health was monitored throughout the protocol. Every 15 days, a blood test is performed by vein in the retro-orbital sinus so as to evaluate the presence of human cells in flow cytometry.
  • a blood test is performed by vein in the retro-orbital sinus so as to evaluate the presence of human cells in flow cytometry.
  • the mice were sacrificed, the weight of the liver and the weight of each animal were measured and the liver weight / weight ratio of the animal was calculated.
  • the livers, rats, kidneys, hearts and lungs were fixed in 4% formalin for later use in immunohistochemistry.
  • the different tissues are dissociated finely with the help of a fine chisel and the ground material is filtered through 70 ⁇ sieve (Becton Dickinson). The filtrate obtained was used for the analysis in flow cytometry.
  • mice A total of 60 mice were grafted intrahepatic with the My-La cell line. Ten mice were grafted with each of the other cell lines (HUT78, FE-PD, HH, MAC1, MAC2A)
  • My-La cells were grafted intrahepaticly into the liver of twenty NSG mice. Three days after the transplant, ten mice were treated with 0.5 mg / kg of Methotrexate (Mylan Pharmaceuticals), or DMSO as a control. The treatment was administered daily by intraperitoneal injection for 12 days. After sacrifice (day 15 post-transplant), the organs were fixed with 4% formalin to perform immunohistochemistry experiments, or mechanically dissociated to perform cell cultures prior to flow cytometric analysis (FACS).
  • Methotrexate Mylan Pharmaceuticals
  • DMSO DMSO
  • HLA-ABC antigen was detected on suspended cells obtained from mouse organs using a primary antibody (Ab70328, Abcam) and a secondary antibody coupled to Alexa Fluor® 488 marker ( AM50153).
  • labeling with ⁇ ⁇ of anti-TCRVP, CD3, CD4 and CD8 antibodies coupled to different fluorochromes is performed on a suspension of mononuclear cells in 50 ⁇ l of PBS and incubated for 30 minutes at 4 ° C. . After washing with PBS, the cells are suspended in 350 ⁇ l of PBS. The presence of TCRVPtumorai CD3 + CD4 + CD8- cells are verified and validates the engraftment of tumor cells. Detection is done at the Bordeaux University Cytometry Platform using a BD FACS Canto II device and FlowJo software.
  • Genomic DNA is extracted from 5 million xenograft cells using the QIAGEN DNA mini kit as recommended by the supplier.
  • a PCR followed by a fluorescence analysis on a capillary electrophoresis instrument is performed to define the profile TCRy. This is done according to the recommendations of the IdentiClone TM kit supplier ⁇ In Vivo Scribe Technologies) Statistical Analyzes
  • the model was validated using the My-La line, described as the most aggressive LCP line in vitro, and in vivo in subcutaneous xenograft models (Thaler et al., 2004, Establishment of a mouse xenograft model for mycosis fungoides, Exp Dermatol 13: 406-412), injected into 60 mice.
  • the other cell lines were grafted into the livers of 10 mice each. Of 110 mice grafted with LCP cells, 96 developed liver tumors. Effective grafting is observed for the majority of cell lines, with strikingly 100% efficiency for My-La, HUT78, HH and MAC1 lines.
  • T-MF transformed mycosis fungoides
  • SS Sézary syndrome cutaneaous adult T-cell leukamia / lymphoma
  • HL-ALCL Hodgkin-like anaplastic broad-cell lymphoma
  • Table 2 and FIG. 1 show that this model of intrahepatic grafting makes it possible to develop LCP tumors at the injection site, but also at the level of other organs after dissemination / migration of the cells.
  • the model developed makes it possible to study and evaluate the properties of tumorigenesis, migration and invasion in organs.
  • the characteristics of the infiltrates observed in the various organs after migration of the LCP cells from the injection site (liver) are presented in Table 3.
  • T Tumor
  • I Infiltrate
  • methotrexate a chemotherapy molecule, known for its effectiveness on the LCP.
  • FIG. 2 Given the aggressiveness and the rapidity of appearance of the tumors in the liver, as well as the appearance of signs of deterioration in the health of the mice, the number of cells injected advantageously has has been reduced to 2.5 million in 50 ⁇ of solution. The mice could therefore be treated with methotrexate on D3 after transplantation for 12 days. At day 15, the mice were sacrificed and the organs were analyzed by HLA marking on paraffin section and in cytometry.
  • liver tumors as well as organ invasion of mice decrease with methotrexate treatment.
  • This model has many advantages. It can be put in place quickly, with a study of the effects of treatment only 15 days after the LCP cell transplant. It can thus be adapted to large-scale tests and to many other therapeutic molecules to evaluate the efficacy of new treatments against PCL.

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Abstract

L'invention concerne un modèle animal de lymphome cutané primitif ainsi que des méthodes employant ce modèle pour évaluer les propriétés biologiques et génétiques des cellules tumorales de lymphome cutané primitif, ainsi que pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un traitement contre un lymphome cutané.

Description

MODELE DE LYMPHOME CUTANE PRIMITIF
L'invention concerne un modèle animal de lymphome cutané primitif ainsi que des méthodes employant ce modèle pour évaluer les propriétés biologiques et génétiques des cellules tumorales de lymphome cutané primitif, ainsi que pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un traitement contre un lymphome cutané primitif.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Les lymphomes cutanés primitifs (LCP) sont des pathologies rares, dont il existe très peu de lignées cellulaires dans le monde. Ce manque de modèles cellulaires restreint fortement les études fonctionnelles qui permettraient de mieux comprendre la pathologie et restreint également les modèles murins correspondants qui permettraient de tester de nouvelles molécules efficaces pour traiter ce type de cancer. En effet, seuls quelques modèles de xénogreffes de cellules de LCP ont été décrits, soit par greffe chez des souris adultes immunodéficientes en sous cutané (efficace uniquement avec quelques- unes des lignées les plus agressives), soit dans le foie de la souris immunodéficiente RAG2-/-yc-/- âgée de 2 à 7 jours (efficace uniquement sur deux lignées cellulaires, et peu reproductible). Aucun de ces modèles, après publication, n'a fait l'objet d'études plus poussées pour tester des molécules thérapeutiques sur les souris greffées et ainsi mettre en évidence de nouvelles thérapies pour traiter les LCP. L'absence de modèle in vivo de greffes de cellules de LCP ne permet pas d'évaluer de manière pré-clinique l'efficacité de thérapeutique générale ou ciblée. Il existe donc à l'heure actuelle un besoin urgent d'un modèle robuste, fortement reproductible et accessible techniquement pour faciliter le criblage à grande échelle de molécules thérapeutiques dirigées contre les LCP.
RESUME DE L'INVENTION
Selon un premier aspect, l'invention concerne un modèle animal non humain de lymphome cutané primitif (LCP), dans lequel des cellules de lymphome cutané primitif humain sont greffées dans le foie dudit animal.
Dans un mode particulier de réalisation, ledit animal est un animal adulte. Selon une variante, ledit animal est un rongeur, en particulier une souris. Selon un autre mode de réalisation, l'animal est un animal immunodéfïcient, plus particulièrement une souris immunodéficiente telle qu'une souris NOD, une souris NOD/SCID ou plus préférentiellement une souris NSG (NOO.Cg-Prkd^ Ittrg^^/SzJ). Selon un mode de réalisation, les cellules greffées peuvent correspondre à des cellules primaires d'un patient atteint d'un LCP, notamment une lignée primaire d'un patient atteint d'un LCP de type T ou de type B, ou a une lignée cellulaire de LCP. Parmi les lignées cellulaires susceptibles d'être greffées, on peut citer les lignées My-La, HUT78, HH, SeAx, MAC1 , MAC2A et FE-PD.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules sont injectées en intra-hépatique, notamment dans un ou plusieurs lobes du foie, sous la capsule hépatique de l'animal. Selon une variante de réalisation, les cellules sont injectées dans le foie via la veine porte.
Selon un second aspect, l'invention concerne également un procédé de préparation d'un modèle animal de lymphome cutané primitif, comprenant l'injection de cellules de LCP humain dans le foie d'un animal non humain, plus particulièrement dans un ou plusieurs lobes du foie, sous la capsule hépatique dudit animal, ou par injection via la veine porte.
Le procédé de préparation du modèle peut comprendre en outre l'élevage dudit animal pendant au moins 2 jours, en particulier pendant environ 2 à 5 jours, notamment pendant 2 ou 3 jours après injection des cellules, avant utilisation ultérieure du modèle animal produit dans l'une des applications décrites ci-dessous.
Dans un mode particulier de réalisation, de 2 à 10 millions de cellules de LCP, par exemple 5 millions de cellules de LCP, sont injectées dans le foie de l'animal.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé d'évaluation de l'efficacité d'un traitement contre un LCP, comprenant:
a) l'administration dudit traitement au modèle animal selon l'invention décrit ci-dessus; et
b) la détermination de l'effet dudit traitement sur les tumeurs induites par la greffe dans le foie et/ou la dissémination ou la migration desdites cellules dans d'autres organes de l'animal. Selon un mode particulier de réalisation, le traitement est administré de 2 à 5 jours, en particulier 3 jours, après la greffe des cellules de LCP humain dans le foie du modèle animal.
Selon un autre mode de réalisation, l'efficacité du traitement est évaluée de 10 à 15 jours, en particulier 12 jours, après l'administration dudit traitement. L'invention concerne par ailleurs, selon un quatrième aspect, un procédé d'étude ou d'évaluation d'une propriété de tumorigenèse, de migration ou d'invasion dans les organes de cellules de LCP humain, comprenant l'étude de ladite propriété dans le modèle animal selon l'invention. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 présente des coupes d'organes de souris ayant reçu une xénogreffe de LCP, marquées par immunohistochimie au moyen d'un anticorps anti-HLA-ABC (HLA) et contre-colorées à l'hématoxyline de Mayer (HES).
La figure 2 présente le modèle de xénogreffe hépatique selon l'invention, (a) schéma représentant un protocole de xénogreffe intrahépatique et de traitement au Méthotrexate selon l'invention; (b) tableau présentant les ratio poids de foie / poids de l'animal à J15 après greffe, montrant que le Méthotrexate réduit fortement la formation de tumeur hépatique; (c) confirmation de la réduction de la formation des tumeurs hépatiques par immunohistochimie anti-HLA-ABC sur des coupes de foie; (d) antigène HLA-ABC détecté par cytométrie en flux dans différents organes des souris: une réduction significative du nombre de cellules portant l'antigène HLA-ABC a été observée dans les poumons et les rates des souris traitées au Méthotrexate (ns: non significatif; METHO: Méthotrexate). La figure 3 présente un exemple de caractérisation et de tri de cellules de LCP humaines de type T issues d'un patient, (a) Les dot plots représentent la caractérisation des cellules d'un patient en cytométrie en flux par marquage avec un anticorps anti-TCRV spécifique du clone tumoral majoritaire et des anticorps anti-CD4, CD8 et CD3 couplés à différents fluorochromes. (b) Pureté du clone tumoral après tri sur trieur de cellules ARIA IL
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un modèle animal non humain de lymphome cutané primitif (LCP), dans lequel des cellules de LCP humain sont greffées dans le foie dudit animal.
Selon un mode préféré de réalisation, l'animal servant à la production du modèle est un rongeur, notamment un rat ou une souris, plus particulièrement une souris. L'animal sera avantageusement choisi parmi les animaux immunodéfïcients, notamment un rongeur immunodéfïcient tel qu'une souris immunodéfïciente. Parmi les souris immunodéfïcientes connues utilisables dans le cadre de la présente invention, on pourra citer les souris NOD, NOD/SCID, BXN, RAG, RAG2, RAG-yC, ou encore la souris NSG (ou NOD.Cg- rfefc**' IUrg^^/Szi). La souris NSG fait partie des souris les plus immunodéfïcientes décrites à ce jour. Elle combine les caractéristiques du fond génétique NOD/ShiLtJ, la mutation de l'immunodéficience combinée sévère (ou severe combined immunodeficiency en anglais, ou SCID), et une déficience en chaîne gamma du récepteur à l'IL2. Elle est caractérisée par une absence de cellules matures B et T, et par l'absence de cellules NK fonctionnelles.
L'animal peut être un animal nouveau-né, un jeune animal ou un animal adulte. De préférence, l'animal sélectionné est un animal adulte, notamment une souris âgée de 8 à 10 semaines.
Les cellules de LCP humain utilisées pour établir le modèle de la présente invention peuvent notamment être des cellules de lymphome T cutané de différents sous-types, notamment des trois principaux sous-types que sont le mycosis fongoïde (MF), le syndrome de Sézary (SS) et le lymphome cutané à grandes cellules anaplasiques (cALCL pour primary CD30+ cutaneous anaplastic large-cell lymphoma en anglais).
Les cellules de LCP humain utilisées pour établir le modèle peuvent être des cellules primaires de LCP de patient humain atteint d'un LCP. Selon une variante de ce mode de réalisation, les cellules utilisées sont des cellules primaires de LCP de type T. Selon une autre variante de ce mode de réalisation, les cellules utilisées sont des cellules primaires de LCP de type B. Les cellules primaires de LCP humaines dérivées de patients peuvent être préparées selon tout moyen connu de l'homme du métier. Les cellules peuvent notamment être isolées à partir d'une biopsie cutanée provenant du patient, le tissu cutané étant préparé par dissection et homogénéisation, notamment selon les modalités présentées dans les exemples présentés ci-dessous. Les cellules peuvent également être isolées à partir d'un prélèvement sanguin du patient, isolées sur gradient de Ficoll de manière à obtenir la fraction de cellules mononucléées, notamment selon les modalités présentées dans les exemples présentés ci- dessous. L'hétérogénéité des cellules de LCP de type T et la caractérisation du clone majoritaire présent dans l'échantillon peuvent ensuite déterminées selon l'expression du TCRVP et le profil TCRy. L'identification du profil TCR caractéristique des cellules de LCP de type T permet de sélectionner spécifiquement les cellules cancéreuses et de suivre la prise de greffe dans la souris. Les cellules tumorales majoritaires peuvent alors être sélectionnées avant la greffe selon l'expression du TCRV à leur surface en fonction des critères suivant : TCRVPtumorai +CD3+CD4+CD8-.
Selon un autre mode de réalisation, lesdites cellules de LCP humain correspondent à des lignées cellulaires dérivées de LCP humain telles que les lignées My-La, HUT78, HH, SeAx, MAC1, MAC2A et FE-PD. Les cellules de LCP humain greffées peuvent être des cellules de LCP agressif ou indolent, ou encore correspondre à des cellules représentatives de différents stades de la maladie, par exemple des cellules d'un LCP précoce ou avancé. Pour générer le modèle animal de l'invention, les cellules de LCP humain sont injectées dans le foie de l'animal choisi. Toute injection permettant la colonisation du foie par les cellules de LCP humain est envisagée dans le cadre de la présente invention. A titre illustratif, les cellules de LCP humain peuvent être injectées dans un ou plusieurs lobes du foie, plus particulièrement sous la capsule hépatique. Alternativement, les cellules peuvent être injectées dans le foie via la veine porte.
Selon un mode particulier de réalisation, de 2 à 10 millions de cellules de LCP humain, notamment de 2 à 5 millions de cellules, sont injectées dans le foie de l'animal. A titre illustratif, dans le cas de l'injection des cellules dans le foie d'une souris adulte (e.g. une souris âgée de 8 à 10 semaines), l'injection de 2 à 10 millions de cellules peut être réalisée, notamment de 2 à 5 millions, avec notamment une injection de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou encore 5 millions de cellules.
Un volume approprié est injecté, selon l'animal employé dans la constitution du modèle animal et le nombre de cellules à injecter. A titre illustratif, pour l'injection intrahépatique sous la capsule hépatique d'une souris adulte, un volume de 50 μL maximum est injecté.
Un suivi quotidien de l'état clinique des souris selon l'apparition d'une masse visible au niveau de l'abdomen et une série de critères de points limites définis par l'animalerie hébergeant les animaux, peut ensuite être réalisée. Le suivi de prise de greffe (évaluation du pourcentage de cellules humaines) au cours du temps peut être réalisé par prise de sang suivie d'une analyse de la présence de cellules humaines en cytométrie en flux.
La prise de greffe dans le foie de l'animal peut être évaluée selon plusieurs modalités. A titre illustratif, les trois modalités expérimentales suivantes peuvent être employées, après sacrifice de l'animal :
i) Le poids du foie et le poids de chaque animal est mesuré, notamment à l'aide d'une balance de précision. Le rapport poids du foie / poids de l'animal est alors calculé. Ce rapport sera considéré comme pathologique, et donc indicatif d'une prise de greffe, s'il est supérieur à 5%. Pour les prises de tumeurs les plus agressives, l'invasion tumorale peut être visible à l'œil nu.
ii) Une biopsie du foie, et éventuellement d'autres organes (notamment rein, rate, poumon, cœur, etc.) peut être réalisée. Chaque morceau peut être ensuite fixé, notamment au formol 4%, en particulier sur la nuit à température ambiante, avant inclusion en bloc de paraffine. Des coupes de chaque bloc de paraffine, notamment de 3μιη d'épaisseur, sont réalisées avant immunomarquage spécifique grâce à un anticorps qui permet de détecter les cellules humaines (notamment un anticorps anti-HLA). iii) Le reste de chaque organe non fixé au formol peut être remis en culture, en cellules isolées (e.g. par dissociation mécanique au scalpel). A titre illustratif, les cellules peuvent être mises en culture dans un milieu de culture adapté (notamment un milieu RPMI) supplémenté d'additifs appropriés, notamment de 20% de sérum de veau fœtal dans des conditions de cultures adaptées (e.g. à 37°C dans une atmosphère de 5% de CO2). Un immunomarquage peut ensuite être réalisé grâce à un anticorps qui permet de détecter les cellules humaines (notamment un anticorps anti-HLA) associé à un anticorps secondaire marqué approprié permettant ensuite de détecter le pourcentage de cellules humaines dans chaque organe par rapport au nombre de cellules total (humaines et souris). La détection peut notamment être réalisée au moyen d'un cytomètre en flux.
iv) Afin de valider la prise de greffe de cellules tumorales humaines issues de patients, l'expression du variant TCRVP et le profil TCRy peuvent également être analysés, respectivement en cytométrie en flux et PCR.Ces analyses permettent de déterminer que les cellules qui greffent correspondent bien aux cellules tumorales de départ.
Après injection des cellules de LCP humain dans le foie de l'animal, ce dernier est élevé durant un temps adapté à la prise de la greffe, notamment pendant au moins 2 jours, en particulier pendant environ 2 ou 3 jours après injection des cellules. L'animal est ensuite utilisé dans l'un des procédés décrits ci-dessous.
Le modèle animal selon l'invention peut avantageusement être utilisé dans un procédé d'évaluation de l'efficacité d'un traitement contre un LCP, comprenant:
a) l'administration dudit traitement au modèle animal selon l'invention décrit ci-dessus; et
b) la détermination de l'effet dudit traitement sur les tumeurs induites par la greffe dans le foie et/ou la dissémination et/ou la migration desdites cellules dans d'autres organes de l'animal.
Selon la présente invention, le traitement peut correspondre à toute substance susceptible d'avoir un effet curatif ou préventif contre un LCP humain, y compris des prodrogues de telles substances. Le traitement peut correspondre à des molécules dont les propriétés anti-tumorales sont déjà connues. Alternativement, le traitement testé n'a jamais été rapporté comme possédant des propriétés antitumorales, la présente invention pouvant permettre le criblage à grande échelle de nombreuses substances pour leur effet contre les LCP. L'administration du traitement est réalisée par toute voie appropriée, notamment par voie orale, intramusculaire, intraveineuse, intra artérielle, intra-péritonéale, cutanée, sous-cutanée ou intranasale. Par ailleurs, plusieurs substances peuvent être administrées en combinaison, simultanément ou de manière séparée dans le temps, afin de déterminer l'effet de ladite combinaison, qu'il s'agisse d'une synergie, d'un antagonisme ou d'une redondance d'action. Le traitement est administré au modèle animal après greffe, notamment après au moins 2 jours, en particulier après environ 2 à 5 jours, notamment après 2 ou 3 jours après injection des cellules de LCP dans le foie de l'animal. Par ailleurs, l'homme du métier adaptera le régime et/ou la posologie à la substance administrée. Par exemple, la substance à tester pourra être administrée une seule fois le premier jour du traitement, sans autre administration avant l'évaluation de l'effet dudit traitement. Alternativement, la substance pourra être administrée à plusieurs reprises tout au long du protocole de traitement. Par exemple, ladite substance peut être administrée quotidiennement sur toute la durée du protocole, une ou plusieurs fois par jour. L'efficacité du traitement est évaluée après une durée appropriée permettant d'observer un effet thérapeutique. A titre illustratif, l'efficacité peut être évaluée de 10 à 15 jours après administration de la substance à l'animal. Par exemple, l'efficacité du traitement peut être évaluée, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 jours après administration de la substance. Selon un mode particulier de réalisation, l'efficacité du traitement est évaluée 11, 12 ou 13 jours après son administration, notamment 12 jours après.
Avantageusement, les cellules de LCP humain greffées étant à la fois issues d'un animal différent (cellules humaines greffées dans le foie d'un animal non humain) et originaires d'un tissu différent du foie, elles seront facilement détectées et/ou tracées dans l'organisme du modèle animal de l'invention par des moyens bien connus de l'art permettant la discrimination de cette origine animale et/ou tissulaire. Ainsi, la présence ou l'absence de cellules de LCP humain dans le modèle animal de l'invention pourra notamment être déterminée par immunomarquage spécifique grâce à un anticorps anti-HLA (de l'anglais human leukocyte antigen) ou d'un anticorps spécifique des cellules tumorales, qui permettent de détecter des cellules immunitaires humaines présentes dans un échantillon prélevé sur l'animal, notamment dans une biopsie de foie ou de tout autre organe dans lequel une étude de l'invasion des cellules de LCP humain est souhaitée. Alternativement, les cellules issues d'une biopsie pratiquée dans l'un des organes ou tissus de l'animal peuvent être mises en culture, puis marquées au moyen d'un anticorps anti-HLA pour ensuite déterminer le pourcentage de cellules humaines (et donc de cellules de LCP humain, ou dérivées de LCP humain) présent dans ledit organe ou tissu au moyen d'un cytomètre en flux.
Un traitement efficace est identifié lorsque le nombre et/ou la taille des tumeurs induites par la greffe dans le foie et/ou dans d'autres organes de l'animal est diminué. Alternativement, un traitement sera jugé efficace en cas d'observation d'une stabilisation du nombre et/ou de la taille et/ou de la dissémination à d'autres organes de cellules greffées dérivant d'un LCP agressif et/ou avancé. Selon un mode particulier de réalisation de cet aspect, l'effet du traitement est comparé à l'effet de le la greffe des mêmes cellules de LCP humain sur un animal (ou sur plusieurs animaux) non traité, ou à l'effet d'un traitement placebo administré à un animal (ou à plusieurs animaux) greffés avec les mêmes cellules de LCP humain, utilisé comme contrôle. Dans ce mode de réalisation, l'animal non traité avec la drogue (i.e. n'ayant reçu que la greffe de LCP, ou que la greffe de LCP puis l'injection d'un traitement placebo) développe des tumeurs, et la comparaison de la condition contrôle avec le traitement thérapeutique permet l'observation d'une diminution, voire d'une abolition complète, des tumeurs. Selon un mode alternatif de réalisation, l'effet du traitement est comparé à l'effet d'un traitement de référence. Par exemple, le traitement de référence peut correspondre à un traitement au Méthotrexate. Ce mode alternatif de réalisation pourra être avantageusement mis à profit afin de sélectionner les traitements plus efficaces, ou aussi efficaces, que le traitement de référence, ou afin de sélectionner les traitements susceptibles de présenter moins d'effets secondaires que le traitement de référence.
L'invention concerne par ailleurs, un procédé d'étude ou d'évaluation d'une propriété de tumorigenèse, de migration et/ou d'invasion dans les organes de cellules de LCP humain, comprenant l'étude de ladite propriété dans le modèle animal selon l'invention. Ce procédé met en œuvre les propriétés de la greffe décrite ci-dessus, notamment la possibilité de discriminer aisément les cellules qui en sont dérivées au moyen de techniques connues de l'homme du métier.
EXEMPLES Matériel et méthodes
Lignées cellulaires
Quatre lignées de LCP agressif (My-La, HUT78, HH et MAC2A) et deux lignées de LCP indolent (FE-PD et MAC1) ont été utilisées. Elles ont été cultivées à 37°C en atmosphère régulée à 5% de CO2 dans du milieu RPMI contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF), à l'exception des cellules FE-PD cultivées en milieu IMDM supplémenté de 20% de SVF.
Cellules de patients
Les cellules de patients sont issues soit, de biopsies cutanées soit, de sang des différents lymphomes adressés par le service de dermatologie de l'hôpital Saint-André (CHU Bordeaux). Les biopsies cutanées sont maintenues dans du milieu alpha MEM contenant 10%> SVF, 10%> de sérum AB humain et 1%) Streptomycine/Pénicilline et complémenté en cytokines humaines : stem cell factor humain (hSCF) (50ng/ml), Fms-like tyrosine kinase 3 (Flt-3) (20ng/ml), interleukine -7 (IL-7) (10ng/ml), insuline (20nM) (« milieu patient »). Elles sont découpées finement à l'aide d'un ciseau fin et le broyât est cultivé à 37°C en atmosphère régulée à 5% de CO2 dans le « milieu patient » pendant 24h. Le lendemain, les cellules sont filtrées sur tamis 70μιη (Becton Dickinson) et le filtrat contenant les cellules de lymphome cutané est récupéré pour les greffes.
Le sang est dilué avec le même volume de PB S (Phosphate Buffer Saline) sans calcium et magnésium, puis déposé délicatement dans un tube Pancoll (Falcon). Les échantillons sont centrifugés à 2600 rpm pendant 15 minutes sans frein. L'anneau de cellules mononucléées est récupéré, rincé avec du PBS puis de nouveau centrifugé à 1200 rpm pendant 5 minutes. Les cellules sont ensuite comptées. Ces conditions de préparation permettent d'obtenir entre 10 à 250 millions de cellules/échantillon.
Caractérisation des cellules tumorales issues de patients
Une partie de l'échantillon de cellules de LCP humain issues de patients (1 million de cellules) est marquée avec le kit TCRVP répertoire (Beckman Coulter) selon les recommandations du fournisseur. Le marquage est réalisé sur une suspension de cellules mononucléées dans 50 μL de PBS. 1 μL de chaque anticorps d'intérêt couplés à différents fluorochromes est ajouté et incubé 30 minutes à 4 °C. Après un lavage au PBS, les cellules sont suspendues dans 350 μL de PBS et l'acquisition est faite grâce à un cytomètre en flux FACSCanto II (BD Biosciences). En parallèle, l'ADN génomique est extrait à partir de 5 millions de cellules grâce au kit DNA mini de QIAGEN selon les recommandations du fournisseur. Une PCR suivi d'une analyse en fluorescence sur instrument d'électrophorèse capillaire est réalisée pour définir le profil TCRy- Celle-ci est réalisée selon les recommandations du fournisseur du kit IdentiClone™ (In Vivo Scribe Technologies)
Isolement des cellules tumorales issues de patients
Les cellules de LCP humain issues de patients sont marquées avec l'anticorps TCRV (Beckman Coulter) correspondant au clone tumoral identifié comme décrit précédemment. Le marquage est réalisé sur une suspension de cellules mononucléées dans 50 μΐ^ de PBS. 1 μΐ^ de chaque anticorps d'intérêt (TCRVP, CD3, CD4 et CD8) couplés à différents fluorochromes sont ajoutés et incubés 30 minutes à 4 °C. Après un lavage au PBS, les cellules sont suspendues dans 350 μΐ^ de PBS. Les cellules TCRV tumomi CD3+CD4+CD8- sont triées sur un trieur ARIA II (BD Biosciences). Les anticorps utilisés pour l'isolement sont adaptables selon le type de lymphome.
Essai en agar mou
5x104, lOxlO4 ou 5x105 cellules / puits (plaques 6 puits) ont été cultivées en agar mou afin de déterminer la capacité clonogénique des lignées cellulaires de LCP, selon un protocole publié précédemment (Chevret et al, 2014, Telomerase functions beyond telomere maintenance in primary cutaneous T-cell lymphoma, Blood 123(12) : 1850-1859). Xénogreffes intra-hépatiques
La douleur est prise en compte, les animaux recevant 30 minutes avant l'opération une injection de Vetergesic (Buprenorphine) de 3μg (soit ΙΟΟμΙ.) par voie intrapéritonéale. Les souris sont ensuite rasées sur l'abdomen. 5x106 cellules ont été greffées dans le foie de souris adultes (8 à 10 semaines) NSG immunodéficientes (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlwjl/SzJ) selon les modalités suivantes :
anesthésie à l'isoflurane 2,5 %, désinfection à l'alcool 70% puis incision d'environ 5 mm sur la ligne blanche de la peau au niveau de l'épigastre (les animaux sont placés en décubitus dorsal) ;
- la même incision est ensuite réalisée au niveau du péritoine situé sous la peau ;
un lobe du foie est ensuite externalisé par pression des deux côtés de la cage thoracique, afin de procéder à une injection sous la capsule hépatique de 50μL maximum d'une suspension cellulaire contenant les 5 millions de cellules dans un liquide stérile (milieu de culture adapté sans sérum) à l'aide d'une aiguille à insuline (Thermo® seringue de 300μL aiguille 29G xl/2 taille 0,33x12mm) ;
l'organe est ensuite replacé dans la cavité abdominale après rinçage au sérum physiologique ; les plans péritonéaux et cutanés sont recousus à l'aide de fil de suture 5.0 ;
durant la totalité de l'opération, la température corporelle de l'animal est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant.
Le poids des animaux a été mesuré quotidiennement, et leur état de santé a été surveillé durant tout le protocole. Tous les 15 jours, une prise de sang est réalisée par voie veineuse dans le sinus rétro-orbital de manière à évaluer la présence de cellules humaines en cytométrie en flux. 4 à 5 semaines après la greffe de lignées de LCP humaine, les souris ont été sacrifiées, le poids du foie et le poids de chaque animal ont été mesurés et le ratio poids du foie / poids de l'animal a été calculé. Les foies, rates, reins, cœurs et poumons ont été fixés dans 4% de formol pour utilisation ultérieure en immunohistochimie. Les différents tissus sont dissociés finement à l'aide d'un ciseau fin et le broyât est filtrés sur tamis 70μιη (Becton Dickinson). Le filtrat obtenu a été utilisé pour l'analyse en cytométrie en flux.
Un total de 60 souris a été greffé en intra-hépatique avec la lignée cellulaire My-La. Dix souris ont été greffées avec chacune des autres lignées cellulaires (HUT78, FE-PD, HH, MAC1, MAC2A)
Immunohistochimie
Un marquage à l'hématoxyline de Mayer et une immunohistochimie HLA-ABC ont été réalisés sur des sections de 3μιη d'épaisseur d'organes de souris fixés au formol inclus dans de la paraffine (anticorps Abcam référence Ab70328 utilisé au 1/100e). Les coupes ont été analysées au moyen du scanner Pannoramic Scan (3DHISTECH) et du logiciel Pannoramic Viewer 1.15.4 ou en utilisant un microscope LEICA DMR couplé à une caméra NIKON DS-FI2 et le logiciel d'imagerie NIS BR. Traitement in vivo au Méthotrexate
2xl06 cellules My-La ont été greffées en intra-hépatique dans le foie de vingt souris NSG. Trois jours après la greffe, dix souris ont été traitées avec 0,5 mg/kg de Méthotrexate (Mylan Pharmaceuticals), ou du DMSO en tant que contrôle. Le traitement a été administré quotidiennement par injection intra- péritonéale pendant 12 jours. Après sacrifice (jour 15 après la greffe), les organes ont été fixés au formol 4% pour procéder à des expériences d'immunohistochimie, ou dissociées mécaniquement pour réaliser des cultures cellulaires avant analyse par cytométrie en flux (FACS).
Détection des cellules humaines par FACS au cours du suivi ou du sacrifice
Pour les lignées de LCP humain, l'antigène HLA-ABC a été détecté sur les cellules en suspension obtenues à partir des organes des souris en utilisant un anticorps primaire (Ab70328, Abcam) et un anticorps secondaire couplé au marqueur Alexa Fluor® 488 (AM50153). Pour les cellules de LCP issues de patients, un marquage avec Ι μΐ des anticorps anti- TCRVP, CD3, CD4 et CD8 couplés à différents fluorochromes est réalisé sur une suspension de cellules mononucléées dans 50 μL de PBS et incubés 30 minutes à 4 °C. Après un lavage au PBS, les cellules sont suspendues dans 350 μL de PBS. La présence de cellules TCRVPtumorai CD3+CD4+CD8- sont vérifiées et permet de valider la prise de greffe des cellules tumorales. La détection est faite à la Plateforme de Cytométrie de l'Université de Bordeaux en utilisant un appareil BD FACS Canto II et le logiciel FlowJo.
Analyse du profil TCRy après xénogreffe
L'ADN génomique est extrait à partir de 5 millions de des cellules issues de la xénogreffe grâce au kit DNA mini de QIAGEN selon les recommandations du fournisseur. Une PCR suivi d'une analyse en fluorescence sur instrument d'électrophorèse capillaire est réalisée pour définir le profil TCRy. Celle- ci est réalisée selon les recommandations du fournisseur du kit IdentiClone™ {In Vivo Scribe Technologies) Analyses statistiques
Les données ont été analysées en fonction du nombre de variables dépendantes et de la nature des variables dépendantes et indépendantes. Le test de Wilcoxon-Mann Whitney ou le test de student pour données appariées ont été utilisés pour l'analyse statistique non paramétrique, ces tests étant adaptés pour une taille d'échantillon inférieure à 30. Le seuil de signification a été choisi à P < 0,05 (* P < 0, 05, ** p < 0, 01, *** P < 0, 001). L'analyse statistique a été réalisée au moyen du logiciel MedCalc. Résultats
La possibilité d'établir un modèle de xénogreffe intrahépatique de lymphome cutané primitif LCP a été évaluée dans la souris immunodéfïciente NSG.
Dans un premier temps, le modèle a été validé au moyen de la lignée My-La, décrite comme la plus agressive des lignées LCP in vitro, et in vivo dans des modèles de xénogreffe sous-cutanée (Thaler et al. , 2004, Establishment of a mouse xenograft model for mycosis fungoides, Exp Dermatol 13 : 406- 412), injectée dans 60 souris. Les autres lignées cellulaires ont été greffées dans les foies de 10 souris chacune. Sur 110 souris greffées avec des cellules de LCP, 96 ont développé des tumeurs du foie. Une prise de greffe efficace est observée pour la majorité des lignées cellulaires, avec de manière frappante une efficacité de 100 % pour les lignées My-La, HUT78, HH et MAC1.
Les résultats obtenus avec les cellules greffées sont présentés dans le tableau 1.
Tableau 1 : capacité clonogénique des cellules greffées dans le foie de la souris NSG
Figure imgf000013_0001
Légende : T-MF : transformed mycosis fongoides ; SS Sézary syndrome ; cutaneaous adult T-cell leukamia/lymphoma ; HL- ALCL : Hodgkin-like anaplastic large-cell lymphoma
Par ailleurs, Le tableau 2 et la figure 1 montrent que ce modèle de greffe intrahépatique permet de développer des tumeurs de LCP au niveau du site d'injection, mais également au niveau d'autres organes après dissémination / migration des cellules.
Tableau 2 : Invasion des cellules après greffe dans le foie
Cellules Cellules HLA-positif dans les organes de dix souris
Lignée de
HLA-positif
LCP rate reins poumons cœur
dans le foie
LCP agressif
My-La 60/60 10/10 5/10 8/10 5/10 HUT78 10/10 8/10 8/10 5/10 4/10
HH 10/10 10/10 10/10 9/10 9/10
MAC2A 1/10 0/10 0/10 1/10 0/10
LCP d'évolution indolente
FE-PD 5/10 5/10 4/10 5/10 5/10
MAC1 10/10 8/10 7/10 8/10 8/10
Le modèle développé permet d'étudier et d'évaluer les propriétés de tumorigenèse, de migration et d'invasion dans les organes. A titre illustratif, les caractéristiques des infiltrats observés dans les différents organes après migration des cellules de LCP à partir du site d'injection (foie) sont présentées dans le tableau 3.
Tableau 3 : différence d'infiltrats dans les organes en fonction des lignées greffées
Légende : T : Tumeur ; I : Infiltrat ; E : Embol Par ailleurs, la présente invention a été validée dans un modèle de xénogreffe de cellules My-La greffées en intra-hépatique sur souris adultes (8-10 semaines), et traitées au Méthotrexate, une molécule de chimiothérapie, connue pour son efficacité sur le LCP. Les résultats sont présentés dans la figure 2. Compte tenu de l'agressivité et de la rapidité d'apparition des tumeurs dans le foie, ainsi que de l'apparition de signes de dégradation de santé des souris, le nombre de cellules injectées a avantageusement été réduit à 2,5 millions dans 50 μΕ de solution. Les souris ont pu en conséquence être traitées au Méthotrexate à J3 après la greffe et ce pendant 12 jours. A J15, les souris ont été sacrifiées et les organes ont été analysés par marquage HLA sur coupe de paraffine et en cytométrie.
Grâce au modèle présenté ici, il est montré que les tumeurs du foie ainsi que l'invasion des organes des souris diminuent grâce au traitement au Méthotrexate. Ce modèle présente de nombreux avantages. Il peut être mis en place rapidement, avec une étude des effets du traitement seulement 15 jours après la greffe des cellules de LCP. Il peut ainsi être adapté à des tests à grande échelle et à de nombreuses autres molécules thérapeutiques de manière à évaluer l'efficacité de nouveaux traitements contre les LCP.

Claims

REVENDICATIONS
1. Modèle animal non humain de lymphome cutané primitif, dans lequel des cellules de lymphome cutané primitif humain sont greffées dans le foie dudit animal, ledit animal étant un animal adulte.
2. Modèle animal selon la revendication 1, l'animal étant un rongeur immunodéfïcient.
3. Modèle animal selon la revendication 2, le rongeur immunodéfïcient étant une souris NSG.
4. Modèle animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, les cellules greffées étant des cellules primaires d'un patient atteint d'un lymphome cutané primitif, notamment des cellules de LCP de type T ou de type B.
5. Modèle animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, les cellules greffées correspondant à une lignée cellulaire de lymphome cutané primitif.
6. Modèle animal selon la revendication 5, ladite lignée cellulaire étant choisie dans le groupe constitué des lignées My-La, HUT78, HH, SeAx, MAC1, MAC2A et FE-PD.
7. Modèle animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, les cellules étant greffées dans le foie sous la capsule hépatique ou par injection via la veine porte.
8. Procédé de préparation d'un modèle animal de lymphome cutané primitif, comprenant l'injection de cellules de lymphome cutané primitif humain dans le foie d'un animal non humain.
9. Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre l'élevage dudit animal pendant au moins 3 jours.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, comprenant l'injection de 2 à 10 millions de cellules.
11. Procédé d'évaluation de l'efficacité d'un traitement contre un lymphome cutané primitif, comprenant:
a) l'administration dudit traitement au modèle animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 7; et
b) la détermination de l'effet dudit traitement sur les tumeurs induites par la greffe dans le foie et/ou la dissémination et/ou la migration desdites cellules dans d'autres organes de l'animal.
12. Procédé selon la revendication 11, le traitement étant administré de 2 à 5 jours, en particulier 3 jours, après la greffe des cellules de lymphome cutané primitif humain dans le foie du modèle animal.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, la détermination de l'effet dudit traitement étant réalisée pendant 10 à 15 jours, en particulier 12 jours.
14. Procédé d'étude ou d'évaluation d'une propriété de tumorigenèse, de migration ou d'invasion dans les organes de cellules de lymphome cutané primitif humain, comprenant l'étude de ladite propriété dans le modèle animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
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