WO2017070726A1 - Verfahren zur bestimmung des kulturstatus von mikrobenkulturen - Google Patents

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WO2017070726A1
WO2017070726A1 PCT/AT2016/060094 AT2016060094W WO2017070726A1 WO 2017070726 A1 WO2017070726 A1 WO 2017070726A1 AT 2016060094 W AT2016060094 W AT 2016060094W WO 2017070726 A1 WO2017070726 A1 WO 2017070726A1
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Christoph Herwig
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Definitions

  • the invention relates to the determination of the culture status of microbial cultures by measuring the amino acid content.
  • carbon dioxide is re-formed, which is a C02-neutral cycle.
  • the coupling of BMP with biomass fermentation, in which the main products are CH 4 and CO 2 is particularly advantageous, so that the CO 2 fraction of the biogas can also be converted into CH 4 .
  • the methane thus obtained is usually of high purity and can be fed, for example, easily into natural gas networks.
  • BMP can be found, for example, in US Pat. No. 4,883,753, which describes fermentations of Methabacterium thermoautotrophicum and Methanococcus thermolitotrophicus, and WO 2008/094282 A1, in which CO2 from the biomass fermentation is converted to methane by means of methanogenic archaea.
  • Herwig "Method for assessing the impact of Emission gasses on physiology and productivity in biological methanogenesis”, Bio-resour., Technol., 136, 747-751 (2013); AH Seifert, S. Rittmann, C. Herwig," Analysis of process related factors to increase volumetric productivity and quality of Biomethane with Methanothermobacter marburgensis, Appl. Energ., 132, 155-162 (2014); S. Bernacchi, M. Weissgram, W. Wukovits, C. Herwig, "Process efficiency simulation for key process parameters in biological methanogenesis", AIMS Bioeng. 1 (1), 53-71 (2014); and WO 2014/128300 A1.
  • a typical fermentation process thus begins with the loading of the bioreactor with culture medium and an initial culture of the microorganism (s) used for fermentation, referred to as the "setup phase".
  • initial phase "biomass” is generated by increasing the number of microorganisms used.
  • the term “latter term” as used herein means the mass of methanogenic microorganisms which is subsequently used for the conversion of CO 2 to CH 4 described above.
  • the biomass which is increased and continues to multiply in the reactor, is continuously fed with CO2, H2 and liquid nutrient medium.
  • MER methane evolution rate
  • qcnw specific methane production rate
  • the volumetric productivity or methane formation rate MER indicates the molar amount of methane produced per liter of culture and hour from a microbial culture of defined concentration (in g / l).
  • the ability to produce methane from this culture is expressed by the specific methane production rate qcH, which in turn indicates the molar amount of methane produced by one gram of biomass per hour.
  • This object is achieved by providing a method for determining the status of a microbial culture by measuring at least one culture parameter selected from the concentrations of nutrients and metabolites, in particular amino acids, in the culture medium and gas partial pressures, and then correlating the measured values of the at least one culture parameter the status of the culture, characterized in that:
  • the concentration of at least one specific amino acid in the culture medium is determined
  • step d) the concentration of the respective amino acid and / or, if step c) is carried out, the proportion of the respective amino acid in the total protein content is correlated with the status of the culture so as to determine the viability of the culture and / or to clarify the question of whether the methane formation rate is limited by the gas exchange of the culture with the environment, ie "gas limited", or limited by the liquid nutrient supply, i. "liquid limited” is.
  • the determination of the specific secretion pattern in step a) comprises both determining which amino acids of the particular microorganism in the fully viable state are generally secreting into the surrounding medium, and determining whether and how the secreted amount of the respective amino acid at the transition from the gas-limited to the liquid-limited state or vice versa.
  • a threshold for this transition of the particular amino acid (s) may be determined in step a) by also determining the total protein content and the proportion of the amino acid in the total protein content is calculated both in the gas-limited and in the liquid-limited state.
  • the specific secretion pattern may also include information about the course of viability.
  • threshold values for the total protein content and / or for the proportion of an amino acid which is not part of the specific secretion pattern can be determined on the total protein content, ie it can be determined from which total protein content or from what proportion of the respective amino acid on the total protein content limited viability exists and from when a dying culture is present. This is under restricted Viability to understand a proportion of lysed cells greater than about 15%, and a dying culture greater than about 30%.
  • step b) the concentration of an amino acid is determined, which was determined in step a) that it is not part of the specific secretion pattern of the microorganism, wherein a concentration of this amino acid> 0 a Indicator of at least limited viability of the microorganism in the culture, since the microorganism in a fully viable state does not secrete this amino acid in the medium yes.
  • step c) If, in addition, in step c) the total protein content and / or the proportion of the amino acid determined in step b) are determined on the total protein content and a specific threshold value for it has been determined in step a), a total protein content or a proportion of the amino acid in the total protein content is below the respective one viability limited in step a), and a total protein content or content of the amino acid in the total protein content above the respective threshold indicates a dying culture.
  • step b) the concentration of an amino acid determined to be part of the specific secretion pattern of the microorganism in step a) is determined, and in step c) the total protein content is determined in the culture medium and the gravimetric fraction determined in step b) Amino acid is determined on the total protein content, wherein the proportion of this amino acid in the total protein content, depending on whether this proportion is below or above a previously determined in step a) threshold, is an indicator of a gas-limited or a liquid-limited methane production.
  • a “gas-limited” culture is to be understood as a limitation of culture growth through gas exchange with the environment, which means, above all, the uptake of CO2 and H2 into the culture medium, since these are the rate-limiting steps for methane production sufficient nutrients are contained in the culture medium, which are usually supplied as liquid solutions. If, however, enough gas is dissolved in the medium without sufficient amounts of liquid nutrient solutions being supplied, the culture is referred to as "liquid-limited”.
  • the hydrogenotrophic methanogenic microorganism according to the present invention is not particularly limited as long as it is capable of reducing carbon dioxide to methane.
  • the methanogenic microorganism according to the present invention is a methanogenic bacterium, and more preferably a methanogenous archae such as Methanobacterium alcaliphilum, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium congolense, Methanobacterium defluvii, Methanobacterium espanolae, Methanobacterium formicicum, Methanobacterium ivanovii, Methanobacterium palustre, Methanobacterium thermaggregans, Methanobacterium uligino- sum, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter arbor iphilicus, Methanobrevibacter gottschalkii, olleyae Methanobrevibacter, Methanobrevibacter ruminan- tium, Methanobrevibacter smith
  • methanogenic archaea of the species Methanosarcinia barkeri, Methanothermobacter marburgensis, Methanobacterium thermoautotrophicus, Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanococcus maripaludis, which can each be used individually or as a mixture of several thereof.
  • the methanogenic Archaee belongs to the species Methanothermobacter marburgensis, such as the deposited under DSM 2133 in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) strain, which represented the starting point for the research of the inventors.
  • Archaea are due both to the simple structure of their cell structure and to the fact that most of them are extremophiles that are viable under extreme conditions and the resulting stability and comparatively easy handling of the cultures as well as the predictability of their metabolism and reproducibility the fermentations are particularly preferred.
  • the inventors Using the above-described Methanothermobacter marburgensis strain as a model organism, the inventors have come to the following results. In terms of viability, it was found for this particular organism in step a) of the method of the invention that aspartic acid is not part of its specific secretory pattern. In order to determine the status of a culture of this microorganism, the concentration of aspartic acid is now determined in step b), with at least a limited viability of the culture being indicated by a concentration> 0.
  • the total protein content is determined by a total protein content> 0.5 pg / ml limited viability and by a total protein content> 2.0 pg / ml a dying culture is indicated because the inventors have established these specific thresholds in step a) of the method of the invention.
  • a dying culture is indicated because the inventors have established these specific thresholds in step a) of the method of the invention.
  • the methane production is limited by the gas exchange of the culture with the environment, ie "gas-limited", or limited by the supply of nutrients in the liquid medium, ie "limited liquid” is.
  • the total protein content and the proportion of alanine are determined therefrom, since in determining the specific secretion pattern of this strain of methanothermal mobacter marburgensis in step a) it has been found that alanine - as well as glutamic acid and glycine - are secreted by the microorganism even in a fully viable state and thus are part of this pattern.
  • a threshold for the proportion of alanine in the total protein content in the transition from gas-limited to liquid-limited methane production of 0.5 was determined.
  • a gas-limited methane production is indicated by a gravimetric alanine fraction ⁇ 0.5 measured in step c) and a methane production limited by liquid by an alanine fraction> 0.5.
  • This embodiment is based on the inventors' surprising discovery that in a liquid-limited methanation process the microorganism predominantly produces the amino acid alanine. Once the process is gas limited, i. On the other hand, if the nutrients supplied with the medium can not be completely used up, the proportion of alanine in the total protein content drops below 50%.
  • step c) the total protein content and the proportion of glutamic acid are determined thereon, wherein by a glutamic acid content> 0.5 a gas-limited methane production and by a glutamic acid content ⁇ 0.5 a liquid-limited methane production is displayed.
  • the ratios of glutamic acid are exactly the opposite of alanine: as long as sufficient nutrients are provided to the microorganism with the medium, i. As long as a gas-limited process takes place, mainly glutamic acid is produced. If, on the other hand, nutrients become scarce and the process is therefore limited to liquids, the proportion of glutamic acid in the total protein content drops below 50%.
  • concentrations or proportions of other amino acids in the total protein content do not allow such statements regarding the status of culture, as evidenced by the later examples, especially in the fully viable state only one third amino acid, namely glycine, is secreted into the medium, the amount of which does not change significantly in the transition from gas to liquid-limited state.
  • step c) in addition to the proportion of glutamic acid, the methanogenesis rate is determined and related to the amount of biomass supplied to the specific methane production rate qcH, which is subsequently correlated with the proportion of glutamic acid in the total protein content, whereby a transition state between gas-limited and liquid-limited methane production becomes detectable.
  • the feed streams can in turn be readjusted accordingly to provide optimal reaction conditions.
  • Example 1 shows the specific expression pattern determined in Example 1 of the microorganism used in the examples.
  • FIG. 2 shows the relationship between the proportion of aspartic acid and the total protein content and the information on the viability of the culture derivable therefrom according to Example 2 of the invention.
  • FIG. 3 shows the relationship between the proportion of aspartic acid and the total protein content as well as the non-derivability of information regarding the process status according to Comparative Example 1.
  • 4 shows the relationship between the proportion of glutamic acid and the total protein content and the information on the process status derived therefrom in accordance with Example 3 of the invention.
  • 5 shows the relationship between the proportion of alanine and the total protein content and the information on the process status derivable therefrom according to Example 4 of the invention.
  • FIG. 6 shows the relationship between the proportion of glycine and the total protein content and the non-derivability of information regarding the process status according to Comparative Example 2.
  • FIG. 7 shows the relationship between the proportion of asparagine and the total protein content as well as the non-derivability of information regarding the process status according to Comparative Example 3.
  • FIG. 8 shows the relationship between the proportion of glutamic acid and the volumetric productivity as well as the non-derivability of information regarding the process status according to Comparative Example 4.
  • FIG. 9 shows the relationship between the proportion of glutamic acid and the specific methane production rate and the information on the process status derived therefrom according to Example 5 of the invention.
  • the microorganism used in all model experiments was the strain Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 deposited with the German strain collection for microorganisms and cell cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) and thus a hydrogenotrophic, thermophilic, methanogenic Archaee.
  • the cultivation was carried out in a 10 l Biostat C + laboratory reactor (Sartorius Stedim Biotech AG, Göttingen, Germany). Germany) with the parameters described in earlier publications of the group of inventors (AH Seifert, S. Rittmann, S. Bernacchi, C. Herwig, "Process efficiency simulation for key process parameters in biological methanogenesis", AIMS Bioeng. 1 (1), 53-71 (2014); S.
  • the 10-L bioreactor was gravimetrically controlled and the harvest collected within the reaction vessel. All experiments were carried out at a pressure of 2 bar.
  • the dilution rate of the starting medium was controlled by means of a gravimetric flow controller to a constant value of 0.05 h -1 , with the exception of the targeted production of impaired viability and non-viability of the cells, for which purpose the dilution rate was 0.01 or 0, respectively.
  • 00 h "1 has been set.
  • the gas feed was adjusted to 0.5 volumes per reaction volume per minute (l / l.min) with a H2 / CO2 ratio of 4: 1.
  • the culture was stirred at 1,500 rpm, a pH of 7 and a temperature of 65 ° C were set, and the reaction volume was kept constant at 5 liters (unless otherwise stated).
  • the trace elements were kept constant at 6x and therefore, as known from the literature, were not limiting for the growth rate.
  • the only difference with the conditions known from the literature was the replacement of the base with a 1.5 M NH 3 solution, which was used both for adjusting the pH and as a nitrogen source.
  • the starting medium therefore further contained KH 2 PO 4 , NaCl and trace elements of known composition.
  • the process control was carried out using the software Lucullus (available from Securecell, Schlieren, Switzerland). Determination of the specific secretory pattern and amino acid concentrations in the culture medium was by HPLC analysis (Thermo Ultimate 3000 with an Eclipse Plus C18 column and an Agilent 1200 fluorescence detector, all available from Agilent Technologies, Santa Clara, USA).
  • Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 was cultured until steady state, after which samples were taken and analyzed by HPLC. The result of a triplicate determination is shown in Fig. 1, which shows that this microorganism, in the fully viable state, secretes four different amino acids into the culture medium, namely (in decreasing amounts) alanine, glutamic acid, glycine and traces of asparagine. As long as no other amino acids are found in the culture medium, such a culture is therefore considered to be fully viable.
  • step b) of the method of the invention determinations of aspartic acid were made in step b) of the method of the invention, in the fully viable state (dilution rate 0.05 h -1 ) in restricted life - capable state (dilution rate 0.01 h "1 ) and in the dying state (dilution rate 0.00 h " 1 ) of the culture.
  • step c) of the method the total protein content was determined in all cases as step c) of the method.
  • FIG. 2 The results are shown in FIG. 2, in which the gravimetric fraction of aspartic acid in the total protein content is plotted against the total protein content.
  • viability thresholds could be determined from the total protein content, a threshold of about 0.5 pg / ml for the transition from unrestricted to impaired viability and a threshold of about 2.0 pg / ml for the transition to impaired viability a dying culture.
  • impaired viability of a culture of this microorganism can be detected by detecting the presence of aspartic acid in the culture medium and estimating the extent of the restriction by the total protein content.
  • the microorganism in the gas-limited state mainly secretes glutamic acid, as can be seen from the proportion of glutamic acid in the total protein content of nearly 1. In the liquid-limited state, however, little glutamic acid is secreted, which can be concluded from a proportion of the total protein content below 0.2.
  • a threshold for the proportion of glutamic acid in the total protein content of about 0.5 can be established and the latter used as an indicator of the state of the culture, i. If the proportion of glutamic acid in the total protein content is greater than 0.5, the culture is in the gas-limited state; if it is below that, it is in the liquid-limited state.
  • Example 3 was repeated, but alanine was now determined instead of glutamic acid, which is also secreted by the microorganism in an unrestrictedly viable state.
  • the results are shown in FIG. Almost exactly the opposite is the case here with glutamic acid: In the gas-limited state, the microorganism secretes almost no alanine, whereas in the liquid-limited state it predominantly alanine, which can be concluded from proportions of the total protein content between 0.7 and 0.95. However, as the total protein content increases, alanine secretion decreases in the liquid-limited state and increases slightly in the gas-limited state.
  • a threshold for the proportion of alanine in the total protein content of, for example, about 0.5 can be set and the latter as an indicator of the state of the culture, ie gas-limited or liquid-limited, be used: If the proportion of alanine in the total protein content is less 0.5, the culture is in the gas-limited state, he lies above it, it is in the liquid-limited state.
  • the ratios are different when the glutamic acid portion is linked to the total protein content with the specific methane production rate qcH, i. the molar amount of methane produced by one gram of biomass per hour.
  • qcH specific methane production rate
  • the present invention provides a new method for determining the state of a culture of methane-producing microorganisms, by means of which - after the initial determination of the specific secretion pattern of the respective microorganism - a wide variety of states of a corresponding culture can be determined with high reliability, including in the simplest case, only the determination of the concentration of a single amino acid is required in the course of the fermentation process.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen des Status einer Mikrobenkultur durch Messen zumindest eines Kulturparameters sowie anschließendes Korrelieren der Messwerte des zumindest einen Kulturparameters mit dem Status der Kultur, dadurch gekennzeichnet, dass in einem mikrobiellen Methanisierungsprozess unter Verwendung eines hydrogenotrophen methanogenen Mikroorganismus vor dem Beginn des Methanisierungsprozesses das spezifische Aminosäuresekretionsmuster des jeweils eingesetzten Mikroorganismus bestimmt wird; während des Prozesses die Konzentration zumindest einer speziellen Aminosäure im Kulturmedium bestimmt wird; und gegebenenfalls zusätzlich der Gesamtproteingehalt im Kulturmedium und der Anteil der zumindest einen Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt werden; wonach die Konzentration oder gegebenenfalls der Anteil der jeweiligen Aminosäure am Gesamtproteingehalt mit dem Status der Kultur korreliert wird, um so die Lebensfähigkeit der Kultur abzuschätzen und/oder die Frage zu klären, ob die Methanbildungsrate gaslimitiert oder flüssigkeitslimitiert ist.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Kulturstatus von Mikrobenkulturen
Die Erfindung betrifft die Bestimmung des Kulturstatus von Mikrobenkulturen durch Messen des Aminosäuregehalts.
STAND DER TECHNIK
Im Zuge der stetig wachsenden Produktion erneuerbarer Energie erlangen insbesondere auch biologische Methanisierungsprozesse (BMP) zunehmende Bedeutung. In solchen Prozessen wird CO2 durch methanogene Mikroorganismen (worunter hierin vor allem Bakterien, Archaeen, Pilze und Algen zu verstehen sind, die mitunter auch kurz als Mikroben bezeichnet werden) zu Methan reduziert:
C02 + 4 H2—► CH4 + 2 H20
Bei der späteren Verbrennung des Methans zur Energiegewinnung gemäß der Gleichung: CH4 + 2 02 -»· CO2 + 2 H20
wird erneut Kohlendioxid gebildet, was einen C02-neutralen Kreislauf darstellt. Besonders vorteilhaft ist die Kopplung von BMP mit Biomassevergärung, bei der als Hauptprodukte CH4 und CO2 anfallen, so dass auch der C02-Anteil des Biogases in CH4 übergeführt werden kann. Das so erhaltene Methan ist in der Regel von hoher Reinheit und kann beispielsweise problemlos in Erdgasnetze eingespeist werden.
Beispiele für BMP finden sich etwa in US 4.883.753, wo Fermentationen von Metha- nobacterium thermoautotrophicum und Methanococcus thermolitotrophicus beschrieben werden, sowie WO 2008/094282 A1 , worin CO2 aus der Biomassefermentation mittels methanogener Archaeen zu Methan umgesetzt wird.
Um die Methanisierungsreaktion optimal steuern zu können, ist es erforderlich, den physiologischen Zustand der jeweiligen Mikrobenkultur zu kennen, wie dies die Arbeitsgruppe der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstands in früheren Forschungsarbeiten festgestellt hat; siehe S. Rittmann, A.H. Seifert, C. Herwig, "Quantit- ative analysis of media dilution rate effects on Methanothermobacter marburgensis grown in continuous culture on H2 and CO2", Biomass. Bioenerg. 36, 293-301 (2012); A.H. Seifert, S. Rittmann, S. Bernacchi, C. Herwig, "Method for assessing the impact of emission gasses on physiology and productivity in biological methanogenesis", Bio- resour. Technol. 136, 747-751 (2013); A.H. Seifert, S. Rittmann, C. Herwig, "Analysis of process related factors to increase Volumetrie productivity and quality of biomethane with Methanothermobacter marburgensis", Appl. Energ. 132, 155-162 (2014); S. Bernacchi, M. Weissgram, W. Wukovits, C. Herwig, "Process efficiency Simulation for key process parameters in biological methanogenesis", AIMS Bioeng. 1 (1 ), 53-71 (2014); sowie WO 2014/128300 A1 .
Ein typischer Fermentationsprozess beginnt demgemäß mit der Beschickung des Bioreaktors mit Kulturmedium und einer Anfangskultur des oder der zur Fermentation verwendeten Mikroorganismen, was als "Setup-Phase" bezeichnet wird. In der darauf folgenden sog. "Anfangsphase" wird durch Vermehrung der eingesetzten Mikroorganismen "Biomasse" generiert. Unter letzterem Begriff ist hierin in der Folge die Masse an methanogenen Mikroorganismen zu verstehen, die in der Folge zur oben beschrie- benen Umsetzung von CO2 zu CH4 eingesetzt wird. Zu diesem Zweck werden der im Reaktor vermehrten und sich weiterhin vermehrenden Biomasse kontinuierlich CO2, H2 sowie flüssiges Nährmedium zugeführt.
Im Zuge dieser Forschungen wurden neben üblichen Faktoren wie den Gasdrücken von eingespeistem CO2 und H2, der Zufuhrrate des Mediums als Nährstoffquelle, der Konzentration von Nährstoffen und Metaboliten auch die volumetrische Produktivität, auch als spezifische Methanbildungsrate ("methane evolution rate", MER) bezeichnet, sowie die spezifische Methanproduktionsrate (qcnw) der jeweiligen Kultur als aufschlussreiche Parameter bei der Methanproduktion ermittelt. Diese hängen wie folgt zusammen: MER (mmol/l.h) = Biomassekonzentration (g/l) x qcH (mmol/g.h)
Somit gibt die volumetrische Produktivität oder Methanbildungsrate MER die molare Menge an Methan an, die pro Liter Kultur und Stunde von einer Mikrobenkultur mit definierter Konzentration (in g/l) produziert wird. Die Fähigkeit zur Methanproduktion dieser Kultur wird durch die spezifische Methanproduktionsrate qcH ausgedrückt, die ihrerseits die molare Menge an Methan angibt, die von einem Gramm Biomasse pro Stunde produziert wird. Durch Messung diverser Parameter lassen sich somit Rückschlüsse auf den Zustand der Kultur ziehen, wozu allerdings in der Regel mehrere, in zeitlichem Abstand wiederholte Messungen durchgeführt werden müssen. Demnach besteht ein Bedarf an einem Verfahren zur einfacheren Bestimmung des Zustands der Kultur mittels einmaliger Messungen, d.h. Messungen zu einem einzigen Zeitpunkt. Somit war das Ziel der vorliegenden Erfindung die Entwicklung eines solchen vereinfachten Verfahrens.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Dieses Ziel erreicht die Erfindung durch Bereitstellung eines Verfahrens zum Bestim- men des Status einer Mikrobenkultur durch Messen zumindest eines Kulturparameters, ausgewählt aus den Konzentrationen von Nährstoffen und Metaboliten, insbesondere Aminosäuren, im Kulturmedium und Gaspartialdrücken, sowie anschließendes Korrelierens der Messwerte des zumindest einen Kulturparameters mit dem Status der Kultur, dadurch gekennzeichnet, dass:
in einem mikrobiellen Methanisierungsprozess unter Verwendung eines hydrogeno- trophen methanogenen Mikroorganismus
a) vor dem Beginn des Methanisierungsprozesses das spezifische Aminosäuresekretionsmuster des jeweils eingesetzten Mikroorganismus bestimmt wird;
b) während des Prozesses die Konzentration zumindest einer speziellen Aminosäure im Kulturmedium bestimmt wird; und
c) gegebenenfalls zusätzlich der Gesamtproteingehalt im Kulturmedium und der Anteil der zumindest einen Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt werden;
wonach
d) die Konzentration der jeweiligen Aminosäure und/oder, wenn Schritt c) durchgeführt wird, der Anteil der jeweiligen Aminosäure am Gesamtproteingehalt mit dem Status der Kultur korreliert wird, um so die Lebensfähigkeit der Kultur zu bestimmen und/oder die Frage zu klären, ob die Methanbildungsrate durch den Gasaustausch der Kultur mit der Umgebung limitiert, d.h. "gaslimitiert", oder durch die flüssige Nährstoffzufuhr limitiert, d.h. "flüssigkeitslimitiert", ist.
Die Erfinder haben im Zuge ihrer neuesten Forschungen nämlich überraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der Gesamtproteingehalt (d.h. Aminosäuregehalt von vollständig lysierten Zellen), der bekanntermaßen ein Indiz für die Lebensfähigkeit einer Mikrobenkultur darstellt, da bei hohen Proteinkonzentrationen die Lebensfähigkeit der Kultur in der Regel eingeschränkt ist, sondern auch das Vorhandensein einzelner Aminosäuren in der Kultur direkte Rückschlüsse auf den Kulturstatus zulässt.
Es wurde nämlich herausgefunden, dass Mikroorganismen auch im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand offenbar bestimmte Aminosäuren in das Kultumedium sekre- tieren, so dass für jeden Mikroorganismus ein spezifisches Sekretionsmuster im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand existiert. Ist dieses spezifische Sekretionsmus- ter einmal bestimmt, so reicht es aus, während des Methanisierungsprozesses die Konzentration einer bestimmten Aminosäure zu bestimmen, um Rückschlüsse auf den Status der Kultur ziehen zu können - und das in mehrerlei Hinsicht.
Die Ermittlung des spezifischen Sekretionsmusters in Schritt a) umfasst dabei sowohl das Bestimmen, welche Aminosäuren von dem jeweiligen Mikroorganismus im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand im Allgemeinen in das umgebende Medium sekre- tiert werden, sowie das Bestimmen, ob und wie sich die sekretierte Menge der jeweiligen Aminosäure beim Übergang vom gaslimitierten in den flüssigkeitslimitierten Zustand oder umgekehrt ändert. In jenen Fällen, in denen es zu einer solchen Ände- rung der Aminosäuresekretion kommt, kann in Schritt a) darüber hinaus ein Schwellenwert für diesen Übergang der speziellen Aminosäure(n) bestimmt werden, indem auch der Gesamtproteingehalt bestimmt und der Anteil der Aminosäure am Gesamtproteingehalt sowohl im gaslimitierten als auch im flüssigkeitslimitierten Zustand berechnet wird.
Darüber hinaus kann das spezifische Sekretionsmuster auch Informationen über den Verlauf der Lebensfähigkeit umfassen. So können in Schritt c) auch Schwellenwerte für den Gesamtproteingehalt und/oder für den Anteil einer Aminosäure, die nicht Teil des spezifischen Sekretionsmusters ist, am Gesamtproteingehalt bestimmt werden, d.h. festgestellt werden, ab welchem Gesamtproteingehalt bzw. ab welchem Anteil der jeweiligen Aminosäure am Gesamtproteingehalt eingeschränkte Lebensfähigkeit vorliegt und ab wann eine sterbende Kultur vorliegt. Hierin ist unter eingeschränkter Lebensfähigkeit ein Anteil an lysierten Zellen von mehr als etwa 15 % und unter einer sterbenden Kultur ein Anteil von mehr als etwa 30 % zu verstehen.
In der Folge reicht es gemäß dem Verfahren der Erfindung aus, zu einem beliebigen Zeitpunkt die Konzentration einer dieser Aminosäuren und gegebenenfalls auch den Gesamtproteingehalt zu diesem Zeitpunkt und den Anteil der jeweiligen Aminosäure daran zu bestimmen, um schlüssige Aussagen bezüglich des Status der Kultur treffen zu können. Weitere Messungen zu späteren Zeitpunkten sind daher nicht unbedingt erforderlich, können aber natürlich durchgeführt werden, um Statusänderungen verfol- gen zu können.
In der einfachsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dazu bloß in Schritt b) die Konzentration einer Aminosäure bestimmt, von der in Schritt a) festgestellt wurde, dass sie nicht Teil des spezifischen Sekretionsmusters des Mikroorganis- mus ist, wobei eine Konzentration dieser Aminosäure > 0 einen Indikator für zumindest eingeschränkte Lebensfähigkeit des Mikroorganismus in der Kultur darstellt, da der Mikroorganismus im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand diese Aminosäure ja nicht in das Medium sekretiert. Wird zusätzlich in Schritt c) der Gesamtproteingehalt und/oder der Anteil der in Schritt b) bestimmten Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt und wurde davor in Schritt a) ein spezifischer Schwellenwert dafür bestimmt, zeigt ein Gesamtproteingehalt bzw. ein Anteil der Aminosäure am Gesamtproteingehalt unter dem jeweiligen in Schritt a) bestimmten spezifischen Schwellenwert eingeschränkte Lebensfähigkeit an, und ein Gesamtproteingehalt bzw. ein Anteil der Aminosäure am Gesamtproteingehalt über dem jeweiligen Schwellenwert zeigt eine sterbende Kultur an.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich oder auch alternativ dazu in Schritt b) die Konzentration einer Aminosäure bestimmt, von der in Schritt a) festgestellt wurde, dass sie Teil des spezifischen Sekretionsmusters des Mikroorganismus ist, und in Schritt c) werden der Gesamtproteingehalt im Kulturmedium und der gravimetrische Anteil der in Schritt b) bestimmten Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt, wobei der Anteil dieser Aminosäure am Gesamtproteingehalt, in Abhängigkeit davon, ob dieser Anteil unter oder über einem zuvor in Schritt a) bestimmten Schwellenwert liegt, einen Indikator für eine gaslimitierte oder eine flüssigkeitslimitierte Methanproduktion darstellt.
Dies gilt für jedwede Aminosäure, für die in Schritt a) bei der Bestimmung des spezifischen Sekretionsmusters festgestellt wurde, dass bei einer Veränderung der Kulturbedingungen vom gaslimitierten zum flüssigkeitslimitierten Zustand oder umgekehrt eine Änderung der in der Medium sekretierten Menge dieser Aminosäure erfolgt, wobei ein zwischen den beiden unterschiedlichen Mengen liegender Schwellenwert bestimmbar oder festlegbar ist, wie dies in den späteren Beispielen demonstriert wird.
Wie zuvor erwähnt, ist unter einer "gaslimitierten" Kultur eine Limitierung des Kulturwachstums durch den Gasaustausch mit der Umgebung zu verstehen, worunter vor allem die Aufnahme von CO2 und H2 in das Kulturmedium gemeint ist, da diese die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte für die Methanproduktion darstellen, solange genügend Nährstoffe im Kulturmedium enthalten sind, die in der Regel als flüssige Lösungen zugeführt werden. Ist hingegen genügend Gas im Medium gelöst, ohne dass ausreichende Mengen flüssiger Nährstofflösungen zugeführt werden, wird die Kultur als "flüssigkeitslimitiert" bezeichnet.
In Kenntnis des Zustande der Kultur kann natürlich durch eine entsprechende Anpassung der Fermentationsbedingungen auf unerwünschte Zustände oder Entwicklungen der jeweiligen Kultur reagiert werden.
Der hydrogenotrophe methanogene Mikroorganismus ist gemäß vorliegender Erfindung nicht speziell eingeschränkt, solange er in der Lage ist, Kohlendioxid zu Methan zu reduzieren. Vorzugsweise ist der methanogene Mikroorganismus gemäß vorliegender Erfindung jedoch ein methanogenes Bakterium und noch bevorzugter eine metha- nogene Archaee, wie z.B. Methanobacterium alcaliphilum, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium congolense, Methanobacterium defluvii, Methanobacterium espanolae, Methanobacterium formicicum, Methanobacterium ivanovii, Methano- bacterium palustre, Methanobacterium thermaggregans, Methanobacterium uligino- sum, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter arbor iphilicus, Methanobrevibacter gottschalkii, Methanobrevibacter olleyae, Methanobrevibacter ruminan- tium, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter woesei, Methanobrevibacter wolinii, Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanobacterium thermoautotrophicus, Methanothermobacter thermoflexus, Methanothermobacter thermophilics, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus sociabilis, Methanocorpusculum bavaricum, Methanocorpusculum parvum, Methano- culleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus, Methanogenium frigidum, Methano- genium liminatans, Methanogenium marinum, Methanosarcina acetivorans, Methano- sarcina barken, Methanosarcina mazei, Methanosarcina thermophila, Methano- microbium mobile, Methanocaldococcus jannaschii, Methanococcus aeolicus, Methanococcus maripaludis, Methanococcus vannielii, Methanococcus voltaei, Methanothermococcus thermolithotrophicus und Methanopyrus kandleri. Besonders bevorzugt sind methanogene Archaeen der Spezies Methanosarcinia barkeri, Methanothermobacter marburgensis, Methanobacterium thermoautotrophicus, Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanococcus maripaludis, die jeweils einzeln oder als Gemisch mehrerer davon einsetzbar sind. Insbesondere gehört die methanogene Archaee der Spezies Methanothermobacter marburgensis an, wie z.B. der unter DSM 2133 bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegte Stamm, der den Ausgangspunkt für die Forschungen der Erfinder darstellte. Archaeen sind sowohl aufgrund des einfachen Aufbaus ihrer Zellstruktur als auch wegen des Umstands, dass es sich bei einem Großteil um Extremophile handelt, die unter extremen Bedingungen lebensfähig sind, und der daraus resultierenden Stabilität und vergleichsweise einfachen Handhabung der Kulturen sowie der Vorhersagbarkeit ihres Stoffwechsels und Reproduzierbarkeit der Fermentationen besonders be- vorzugt. Unter Verwendung des oben beschriebenen Methanothermobacter marburgensis- Stamms als Modellorganismus sind die Erfinder zu den folgenden Ergebnissen gelangt. In Bezug auf die Lebensfähigkeit wurde für diesen speziellen Organismus in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens festgestellt, dass Asparaginsäure nicht Teil seines spezifischen Sekretionsmusters ist. Zur Bestimmung des Status einer Kultur dieses Mikroorganismus wird nun in Schritt b) die Konzentration von Asparaginsäure bestimmt, wobei durch eine Konzentration > 0 zumindest eingeschränkte Lebensfä- higkeit der Kultur angezeigt wird. Dies beruht auf der Feststellung, dass, sobald in einer solchen Kultur Asparaginsäure vorgefunden wird, Zelllyse in mehr oder weniger starkem Ausmaß eingesetzt haben muss. In Kenntnis dieses Umstands können nun die übrigen Parameter der Fermentation, wie z.B. Nähstoffzufuhr im Medium, Verdünnung etc., entsprechend angepasst werden, um dem Absterben der Zellen entgegen- zuwirken.
Wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung dieses Stamms von Methanothermobacter marburgensis zusätzlich der Gesamtproteingehalt bestimmt, wird durch einen Gesamtproteingehalt > 0,5 pg/ml eingeschränkte Lebensfähigkeit und durch einen Gesamtproteingehalt > 2,0 pg/ml eine sterbende Kultur angezeigt, da die Erfinder diese spezifischen Schwellenwerte in Schritt a) des Verfahrens der Erfindung festgestellt haben. Eine solch exakte Bestimmung des Kulturstatus in Bezug auf die Lebensfähigkeit anhand des Gesamtproteingehalts war nach dem Stand der Technik bisher unmöglich.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird hingegen erneut festgestellt, ob die Methanproduktion durch den Gasaustausch der Kultur mit der Umgebung limitiert, d.h. "gaslimitiert", oder durch die Zufuhr von Nährstoffen im flüssigen Medium limitiert, d.h. "flüssigkeitslimitiert", ist. Hierzu werden in einer Ausführungsform der Gesamtproteingehalt und der Anteil an Alanin daran bestimmt, da bei der Bestimmung des spezifischen Sekretionsmusters dieses Stamms von Methanother- mobacter marburgensis in Schritt a) festgestellt wurde, dass Alanin - wie auch Glutaminsäure und Glycin - vom Mikroorganismus auch in uneingeschränkt lebensfähigem Zustand sekretiert werden und somit Teil dieses Musters sind. Darüber hinaus wurde in Schritt a) ein Schwellenwert für den Anteil von Alanin am Gesamtproteingehalt beim Übergang von gaslimitierter zu flüssigkeitslimitiertes Methanproduktion von 0,5 ermittelt.
Somit wird durch einen in Schritt c) gemessenen gravimetrischen Alanin-Anteil < 0,5 eine gaslimitierte Methanproduktion und durch einen Alanin-Anteil > 0,5 eine flüssig- keitslimitierte Methanproduktion angezeigt. Diese Ausführungsform beruht auf der überraschenden Entdeckung der Erfinder, dass bei einem flüssigkeitslimitierten Me- thanisierungsprozess der Mikroorganismus vorwiegend die Aminosäure Alanin produziert. Sobald der Prozess gaslimitiert wird, d.h. die mit dem Medium zugeführten Nährstoffe nicht vollständig aufgebraucht werden können, sinkt der Anteil an Alanin am Gesamtproteingehalt hingegen unter 50 % ab.
Alternativ oder zusätzlich dazu werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Schritt c) der Gesamtproteingehalt und der Anteil an Glutaminsäure daran bestimmt, wobei durch einen Glutaminsäure-Anteil > 0,5 eine gaslimitierte Methan- Produktion und durch einen Glutaminsäure-Anteil < 0,5 eine flüssigkeitslimitierte Methanproduktion angezeigt wird. Die Erfinder haben nämlich ebenso überraschenderweise herausgefunden, dass die Verhältnisse bei Glutaminsäure genau umgekehrt zu Alanin liegen: Solange dem Mikroorganismus mit dem Medium ausreichend Nährstoffe zur Verfügung gestellt werden, d.h. solange ein gaslimitierter Prozess abläuft, wird vorwiegend Glutaminsäure produziert. Werden hingegen Nährstoffe knapp und wird der Prozess dadurch flüssigkeitslimitiert, sinkt der Anteil von Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt auf unter 50 % ab.
Die Konzentrationen bzw. Anteile anderer Aminosäuren am Gesamtproteingehalt er- lauben solche Aussagen bezüglich des Kulturstatus nicht, wie dies durch die späteren Beispiele belegt wird, zumal im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand lediglich eine dritte Aminosäure, nämlich Glycin, in das Medium sekretiert wird, deren Menge sich beim Übergang von gas- zum flüssigkeitslimitierten Zustand nicht signifikant ändert.
In einer besonders bevorzugten Variante der letzteren Ausführungsform des Verfah- rens der Erfindung unter Verwendung des obigen Methanothermobacter marburgen- s/s-Stamms wird in Schritt c) zusätzlich zum Anteil an Glutaminsäure die Methanbildungsrate bestimmt und auf die Menge an zugeführter Biomasse bezogen, um die spezifische Methanproduktionsrate qcH zu berechnen, die in der Folge mit dem Anteil an Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt korreliert wird, wodurch ein Übergangszu- stand zwischen gaslimiterter und flüssigkeitslimitierter Methanproduktion detektierbar wird.
In Kenntnis, ob die Methanisierungsreaktion zum Zeitpunkt der Messung gas- oder flüssigkeitslimitiert ist, können die Feedströme wiederum entsprechend nachgeregelt werden, um für optimale Reaktionsbedingungen zu sorgen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird in der Folge anhand von konkreten Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben, die Folgendes darstellen.
Fig. 1 zeigt das in Beispiel 1 bestimmte spezifische Expressionsmuster des in den Beispielen eingesetzten Mikroorganismus.
Fig. 2 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Asparaginsäure und dem Gesamtproteingehalt sowie die daraus ableitbaren Informationen bezüglich der Lebensfähigkeit der Kultur gemäß Beispiel 2 der Erfindung.
Fig. 3 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Asparaginsäure und dem Gesamtproteingehalt sowie die Nichtableitbarkeit von Informationen bezüglich des Prozessstatus gemäß Vergleichsbeispiel 1 . Fig. 4 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Glutaminsäure und dem Gesamtproteingehalt sowie die daraus ableitbaren Informationen bezüglich des Prozessstatus gemäß Beispiel 3 der Erfindung. Fig. 5 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Alanin und dem Gesamtproteingehalt sowie die daraus ableitbaren Informationen bezüglich des Prozessstatus gemäß Beispiel 4 der Erfindung.
Fig. 6 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Glycin und dem Gesamt- proteingehalt sowie die Nichtableitbarkeit von Informationen bezüglich des Prozessstatus gemäß Vergleichsbeispiel 2.
Fig. 7 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Asparagin und dem Gesamtproteingehalt sowie die Nichtableitbarkeit von Informationen bezüglich des Prozess- Status gemäß Vergleichsbeispiel 3.
Fig. 8 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Glutaminsäure und der volu- metrischen Produktivität sowie die Nichtableitbarkeit von Informationen bezüglich des Prozessstatus gemäß Vergleichsbeispiel 4.
Fig. 9 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Anteil an Glutaminsäure und der spezifischen Methanproduktionsrate sowie die daraus ableitbaren Informationen bezüglich des Prozessstatus gemäß Beispiel 5 der Erfindung. BEISPIELE
Der in allen Modellversuchen eingesetzte Mikroorganismus war der bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegte Stamm Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 und somit eine hydrogenotrophe, thermophile, methanogene Archaee. Die Kultivierung er- folgte in einem 10-l-Biostat-C+-Laborreaktor (Sartorius Stedim Biotech AG, Göttingen, Deutschland) mit den in früheren Publikationen der Arbeitsgruppe der Erfinder beschriebenen Parametern (A. H. Seifert, S. Rittmann, S. Bernacchi, C. Herwig, "Process efficiency Simulation for key process parameters in biological methanogenesis", AIMS Bioeng. 1 (1 ), 53-71 (2014); S. Rittmann, A. H. Seifert, C. Herwig, "Quantitative analysis of media dilution rate effects on Methanobacter marburgensis grown in continuous culture on H2 and C02", Biomass Bioenergy 36, 293-301 (2012); S. Bernacchi, S. Rittmann, A. H. Seifert, A. Krajete, C. Herwig, "Experimental methods for Screening Parameters influencing the growth to product yield (Y(x/CH4)) of a biological methane production (BMP) process performed with Methanobacter marburgensis", AIMS Bioeng. 1 (2), 72-86 (2014)).
Der 10-l-Bioreaktor wurde gravimetrisch gesteuert und die Ernte innerhalb des Reaktionsgefäßes gesammelt. Alle Versuche wurden bei einem Druck von 2 bar durchgeführt. Die Verdünnungsrate des Ausgangsmediums wurde mittels eines gravimetri- sehen Durchflussreglers auf einen konstanten Wert von 0,05 h"1 geregelt - mit Ausnahme der gezielten Erzeugung von eingeschränkter Lebensfähigkeit und NichtLebensfähigkeit der Zellen, zu welchem Zweck die Verdünnungsrate auf 0,01 bzw. 0,00 h"1 eingestellt wurde. Die Gaszufuhr wurde auf 0,5 Volumina pro Reaktionsvolumen pro Minute (l/l.min) mit einem Verhältnis H2/CO2 von 4: 1 eingestellt. Die Kultur wurde mit 1 .500 U/min gerührt, ein pH von 7 und eine Temperatur von 65 °C wurden eingestellt, und das Reaktionsvolumen wurde mit 5 I konstant gehalten (sofern nichts anderes angegeben ist).
Die Spurenelemente wurden bei 6x konstant gehalten und waren daher, wie aus der Literatur bekannt, für die Wachstumsrate nicht limitierend. Der einzige Unterschied zu den literaturbekannten Bedingungen bestand im Austausch der Base gegen eine 1 ,5 M NH3-Lösung, die sowohl zum Einstellen des pH als auch als Stickstoffquelle diente. Das Ausgangsmedium enthielt daher weiters KH2P04, NaCI und Spurenelemente in bekannter Zusammensetzung. Die Prozesssteuerung erfolgte unter Verwendung der Software Lucullus (erhältlich von Securecell, Schlieren, Schweiz). Die Bestimmung des spezifischen Sekretionsmusters und der Aminosäure-Konzentrationen im Kultumedium erfolge mittels HPLC-Analyse (Thermo Ultimate 3000 mit einer Eclipse Plus C18-Säule und einem Agilent 1200-Fluoreszenzdetektor, alles erhältlich von Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Die Bestimmung des Gesamtpro- teingehalts erfolgte hingegen mittels des Multi-plate-Readers Infinite M200 Pro (Tecan, Männedorf, Schweiz) mit 96-Wells-Microplates (Greiner Bio-one, Frickenhausen, Deutschland) und Bradford-Reagens von Sigma Aldrich sowie einer mittels Rinderserumalbumin (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) erstellten Kalibrierkurve. BEISPIEL 1 - Bestimmung des spezifischen Sekretionsmusters gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 wurde bis zum stationären Zustand kultiviert, wonach Proben gezogen und mittels HPLC analysiert wurden. Das Ergebnis einer Dreifachbestimmung ist in Fig. 1 dargestellt, aus der hervorgeht, dass dieser Mikroorganismus im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand vier verschiedene Aminosäuren in das Kulturmedium sekretiert, nämlich (in abnehmenden Mengen) Alanin, Glutaminsäure, Glycin sowie Spuren von Asparagin. Solange keine anderen Aminosäuren im Kulturmedium vorgefunden werden, ist eine solche Kultur daher als uneingeschränkt lebensfähig anzusehen.
BEISPIEL 2 - Bestimmung von Asparaginsäure gemäß Schritt b) sowie des Gesamtproteingehalts gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens
Als illustratives Beispiel für eine Aminosäure, die nicht Teil des spezifischen Sekretionsmusters dieses Mikroorganusmus ist, wurden in Schritt b) des Verfahrens der Erfindung Bestimmungen von Asparaginsäure vorgenommen, und zwar im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand (Verdünnungsrate 0,05 h"1), im eingeschränkt lebens- fähigen Zustand (Verdünnungsrate 0,01 h"1) und im sterbenden Zustand (Verdünnungsrate 0,00 h"1) der Kultur. Parallel dazu wurde als Schritt c) des Verfahrens in allen Fällen auch der Gesamtproteingehalt bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, worin der gravimetrische Anteil an Asparaginsäure am Gesamtproteingehalt über dem Gesamtproteingehalt aufgetragen ist.
Erwartungsgemäß wurde im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand keine Asparaginsäure in das Medium sekretiert. Sobald die Lebensfähigkeit Kultur abnahm, wurde hingegen eine variierende Menge an Asparaginsäure im Medium gefunden, aus der allerdings keine Rückschlüsse auf den genauen Zustand der Kultur (eingeschränkt lebensfähig oder sterbend) gezogen werden konnten. Allerdings konnten aus dem Gesamtproteingehalt Schwellenwerte für die Lebensfähigkeit bestimmt werden, und zwar ein Schwellenwert von etwa 0,5 pg/ml für den Übergang von uneingeschränkter zu eingeschränkter Lebensfähigkeit und ein Schwellenwert von etwa 2,0 pg/ml für den Übergang von eingeschränkter Lebensfähigkeit zu einer sterbenden Kultur.
Somit kann gemäß vorliegender Erfindung eine eingeschränkte Lebensfähigkeit einer Kultur dieses Mikroorganismus mittels Nachweis der Gegenwart von Asparaginsäure im Kulturmedium festgestellt und das Ausmaß der Einschränkung anhand des Gesamtproteingehalts abgeschätzt werden.
VERGLEICHSBEISPIEL 1 - Korrelation des Asparaginsäureanteils mit gaslimitiertem oder flüssigkeitslimitiertem Zustand der Kultur
Durch Variation des Verhältnisses zwischen den Feedströmen von Nährstoffmedium und Gaszufuhr wurde jeweils ein gas- und ein flüssigkeitslimiterter Zustand der uneingeschränkt lebensfähigen Kultur herbeigeführt und erneut die Asparaginsäurekonzen- tration sowie der Gesamtproteingehalt bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dar- gestellt. Die Menge an Asparaginsäure war erwartungsgemäß durchwegs null, während der Gesamtproteingehalt stark schwankte und daher keine Aussagen bezüglich des Zustande der Kultur zuließ. BEISPIEL 3 - Bestimmung von Glutaminsäure gemäß Schritt b) sowie des Gesamtproteingehalts gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens
Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt, wobei allerdings anstatt Asparaginsäure, die nicht Teil des spezifischen Sekretionsmusters ist, Glutaminsäure bestimmt wurde, die vom Mikroorganismus im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand sekretiert wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.
Man erkennt, dass der Mikroorganismus im gaslimiterten Zustand vor allem Glutaminsäure sekretiert, wie dies aus dem Anteil von Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt von nahezu 1 hervorgeht. Im flüssigkeitslimitierten Zustand wird hingegen wenig Glutaminsäure sekretiert, was aus einem Anteil am Gesamtproteingehalt unter 0,2 geschlossen werden kann. Somit kann für Kulturen dieses Mikroorganismus ein Schwellenwert für den Anteil von Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt von etwa 0,5 festgelegt werden und Letzterer als Indikator für den Zustand der Kultur, d.h. gas- limitiert oder flüssigkeitslimitiert, herangezogen werden: Liegt der Anteil an Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt über 0,5, befindet sich die Kultur im gaslimitierten Zustand, liegt er darunter, befindet sie sich im flüssigkeitslimitierten Zustand.
BEISPIEL 4 - Bestimmung von Alanin gemäß Schritt b) sowie des Gesamtprotein- gehalts gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens
Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei allerdings anstatt Glutaminsäure nun Alanin bestimmt wurde, die ebenfalls vom Mikroorganismus im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand sekretiert wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Hier liegen die Verhältnisse fast genau umgekehrt als bei Glutaminsäure: Im gaslimi- terten Zustand sekretiert der Mikroorganismus nahezu kein Alanin, im flüssigkeitslimi- terten Zustand hingegen vorwiegend Alanin, was aus Anteilen am Gesamtproteingehalt zwischen 0,7 und 0,95 geschlossen werden kann. Bei steigendem Gesamtprotein- gehalt nimmt allerdings die Alanin-Sekretion im flüssigkeitslimiterten Zustand ab und im gaslimiterten Zustand leicht zu. Somit kann für Kulturen dieses Mikroorganismus erneut ein Schwellenwert für den Anteil von Alanin am Gesamtproteingehalt von beispielsweise etwa 0,5 festgelegt werden und Letzterer als Indikator für den Zustand der Kultur, d.h. gaslimitiert oder flüssigkeitslimitiert, herangezogen werden: Liegt der Anteil an Alanin am Gesamtproteingehalt unter 0,5, befindet sich die Kultur im gaslimitierten Zustand, liegt er darüber, befindet sie sich im flüssigkeitslimitierten Zustand.
VERGLEICHSBEISPIEL 2 - Korrelation des Glycinanteils mit gaslimitiertem oder flüssigkeitslimitiertem Zustand der Kultur
Zur Überprüfung der Verhältnisse im Falle von Glycin, der dritten Aminosäure, von der der Mikroorganismus im uneingeschränkt lebensfähigen Zustand nennenswerte Mengen in das Medium sekretiert, wurden die Beispiele 3 und 4 unter Bestimmung von Glycin wiederholt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.
Man erkennt, dass auf Basis von Glycin keine eindeutigen Rückschlüsse auf den Kulturstatus gezogen werden können, da die Mengen relativ stark variieren. Zwar sind bei steigendem Gesamtproteingehalt wiederum Tendenzen hin zu verstärkter Gly- cinsekretion im flüssigkeitslimitierten Zustand bzw. kaum noch erfolgender Sekretion im gaslimitierten Zustand erkennbar. Angesichts der zuvor festgestellten beginnenden Abnahme der Lebensfähigkeit der Kultur bei einem Gesamtproteingehalt von etwa 0,5 pg/ml ist der Glycinanteil dennoch nicht für zuverlässige Rückschlüsse verwertbar. VERGLEICHSBEISPIEL 3 - Korrelation des Asparaginanteils mit gaslimitiertem oder flüssigkeitslimitiertem Zustand der Kultur
Ähnlich wie in Vergleichsbeispiel 2 liegen die Verhältnisse bei Asparagin, der vierten vom uneingeschränkt lebensfähigen Mikroorganismus in das Medium sekretierten Aminosäure, wie dies in Fig. 7 dargestellt ist. Aufgrund der äußerst geringen sekretierten Mengen ist Asparagin für solche Korrelationen jedoch völlig ungeeignet.
VERGLEICHSBEISPIEL 4 - Korrelation des Glutaminsäureanteils mit der volumetri- sehen Produktivität
Zur Untersuchung, ob der Anteil an Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt noch weitere Rückschlüsse zulässt, wurde dieser unter Wiederholung von Beispiel 3 mit der volumetrischen Produktivität oder spezifischen Methanbildungsrate MER (in mmol/l.h) verknüpft, d.h. der molaren Menge an Methan, die pro Liter Kultur und Stunde gebildet werden. Fig. 8 zeigt, dass sich mittels dieser Korrelation keine schlüssigen Aussagen treffen lassen.
BEISPIEL 5 - Korrelation des Glutaminsäureanteils mit der spezifischen Methan- produktionsrate
Anders liegen die Verhältnisse jedoch bei Verknüpfung des Glutaminsäureanteils am Gesamtproteingehalt mit der spezifischen Methanproduktionsrate qcH , d.h. der molaren Menge an Methan, die von einem Gramm Biomasse pro Stunde produziert wird. Wie aus Fig. 9 zu erkennen, wird bei Auftrag des Glutaminsäureanteils über qcH ein Übergangszustand zwischen gaslimitiertem und flüssigkeitslimitiertem Zustand erkennbar, in dem praktisch keine Glutaminsäure in das Medium sekretiert wird.
Hierbei handelt es sich möglicherweise um den Optimalzustand für die Prozessent- Wicklung der Fermentation dieses Mikroorganismus, in dem sich Zellvermehrung und Methanproduktion die Waage halten, weswegen keine Aminosäure im Überschuss vorliegt und folglich auch keine Sekretion erfolgt.
In Summe ist jedenfalls klar erkennbar, dass die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Bestimmung des Zustande einer Kultur methanproduzierender Mikroorganismen bereitstellt, mittels dessen - nach anfänglicher Bestimmung des spezifischen Sekretionsmusters des jeweiligen Mikroorganismus - verschiedenste Zustände einer entsprechenden Kultur mit hoher Zuverlässigkeit bestimmt werden können, wozu im Verlauf des Fermentationsprozesses im einfachsten Fall lediglich die Bestimmung der Konzentration einer einzigen Aminosäure erforderlich ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zum Bestimmen des Status einer Mikrobenkultur durch Messen zumindest eines Kulturparameters, ausgewählt aus den Konzentrationen von Nährstof- fen und Metaboliten, insbesondere Aminosäuren, im Kulturmedium und Gaspartialdrü- cken, sowie anschließendes Korrelieren der Messwerte des zumindest einen Kulturparameters mit dem Status der Kultur,
dadurch gekennzeichnet, dass
in einem mikrobiellen Methanisierungsprozess unter Verwendung eines hydrogeno- trophen methanogenen Mikroorganismus
a) vor dem Beginn des Methanisierungsprozesses das spezifische Aminosäuresekretionsmuster des jeweils eingesetzten Mikroorganismus bestimmt wird;
b) während des Prozesses die Konzentration zumindest einer speziellen Aminosäure im Kulturmedium bestimmt wird; und
c) gegebenenfalls zusätzlich der Gesamtproteingehalt im Kulturmedium und der Anteil der zumindest einen Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt werden;
wonach
d) die Konzentration der jeweiligen Aminosäure und/oder, wenn Schritt c) durchgeführt wird, der Anteil der jeweiligen Aminosäure am Gesamtproteingehalt mit dem Status der Kultur korreliert wird, um so die Lebensfähigkeit der Kultur zu bestimmen und/oder die Frage zu klären, ob die Methanbildungsrate durch den Gasaustausch der Kultur mit der Umgebung oder durch die flüssige Nährstoffzufuhr limitiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Konzentration einer Aminosäure bestimmt wird, von der in Schritt a) festgestellt wurde, dass sie nicht Teil des spezifischen Sekretionsmusters des Mikroorganismus ist, wobei eine Konzentration dieser Aminosäure > 0 einen Indikator für zumindest eingeschränkte Lebensfähigkeit des Mikroorganismus in der Kultur darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in Schritt c) der Gesamtproteingehalt und/oder der Anteil der in Schritt b) bestimmten Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt werden, wobei ein Gesamtproteingehalt und/oder ein Anteil dieser Aminosäure am Gesamtproteingehalt unter einem jeweiligen, in Schritt a) bestimmten spezifischen Schwellenwert einen Indikator für eingeschränkte Lebenfähigkeit darstellt und ein Gesamtproteingehalt und/oder ein Anteil dieser Aminosäure am Gesamtproteingehalt über dem jeweiligen Schwellenwert einen Indikator für eine sterbende Kultur darstellt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Konzentration einer Aminosäure bestimmt wird, von der in Schritt a) festgestellt wurde, dass sie Teil des spezifischen Sekretionsmusters des Mikroorga- nismus ist, und
in Schritt c) der Gesamtproteingehalt im Kulturmedium und der Anteil der in Schritt b) bestimmten Aminosäure am Gesamtproteingehalt bestimmt werden,
wobei der Anteil dieser Aminosäure am Gesamtproteingehalt, in Abhängigkeit davon, ob dieser Anteil unter oder über einem zuvor in Schritt a) bestimmten Schwellenwert liegt, einen Indikator für eine gaslimitierte oder eine flüssigkeitslimitierte Methanproduktion darstellt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrogenotropher methanogener Mikroorganismus ein Stamm einer methanoge- nen Archaee eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Stamm von Methanothermobacter marburgensis eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Konzentration zumindest einer Aminosäure, ausgewählt aus Alanin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, im Kulturmedium bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Asparaginsäure bestimmt wird, wobei durch eine Asparaginsäure-Konzentration > 0 zumindest eingeschränkte Lebensfähigkeit der Kultur angezeigt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in Schritt c) der Gesamtproteingehalt bestimmt wird, wobei durch einen Gesamtproteingehalt > 0,5 pg/ml eingeschränkte Lebensfähigkeit angezeigt wird und durch einen Gesamtproteingehalt > 2,0 pg/ml eine sterbende Kultur angezeigt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Konzentration von Alanin und in Schritt c) der Gesamtproteingehalt und der Anteil an Alanin daran bestimmt werden, wobei durch einen Alanin-Anteil < 0,5 eine gaslimitierte Methanproduktion angezeigt wird und durch einen Alanin-Anteil > 0,5 eine flüssigkeitslimitierte Methanproduktion angezeigt wird.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Konzentration von Glutaminsäure und in Schritt c) der Gesamtproteingehalt und der Anteil an Glutaminsäure daran bestimmt werden, wobei durch einen Glutaminsäure-Anteil > 0,5 eine gaslimitierte Methanproduktion angezeigt wird und durch einen Glutaminsäure-Anteil < 0,5 eine flüssigkeitslimitierte Methanproduktion angezeigt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) zusätzlich die Methanbildungsrate bestimmt und auf die Menge an zugeführter Biomasse bezogen wird, um die spezifische Methanproduktionsrate qcH zu berechnen, die in der Folge mit dem Anteil an Glutaminsäure am Gesamtproteingehalt korreliert wird, wodurch ein Übergangszustand zwischen gashmiterter und flüssigkeitshmitierter Methanproduktion detektierbar wird.
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