WO2017054064A1 - Meio de cultura para a realização de um teste para avaliação de risco à cárie dentária, teste para avaliação de risco à cárie dentária e método de obtenção do meio de cultura - Google Patents

Meio de cultura para a realização de um teste para avaliação de risco à cárie dentária, teste para avaliação de risco à cárie dentária e método de obtenção do meio de cultura Download PDF

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WO2017054064A1
WO2017054064A1 PCT/BR2016/000107 BR2016000107W WO2017054064A1 WO 2017054064 A1 WO2017054064 A1 WO 2017054064A1 BR 2016000107 W BR2016000107 W BR 2016000107W WO 2017054064 A1 WO2017054064 A1 WO 2017054064A1
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WO
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culture medium
dental caries
test
risk assessment
assessment test
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PCT/BR2016/000107
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Paulo Henrique TOMAZINHO
Atila VISINONI
Eduardo PIZZATTO
João Armando BRANCHER
Luciane Variani PIZZATTO
Original Assignee
Tomazinho Paulo Henrique
Visinoni Atila
Pizzatto Eduardo
Brancher João Armando
Pizzatto Luciane Variani
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention has particular application in the Public Health, Collective Health and Oral Health segments.
  • the invention for which this patent application is filed contemplates a simplified salivary test for detecting dental caries risk whose Snyder bacterial culture medium has been modified by the addition of gelatin with the aim of making it more consistent enabling its use in municipal or state health facilities, schools, day care centers, churches, among others, to identify individuals, especially children, at risk of developing caries disease,
  • Preventing caries disease is relatively simple. Therefore, it is essential to identify individuals at risk for the disease.
  • caries lesions are identified by clinical examination with a mouth mirror and a probe exploratory, complemented by radiographic examination.
  • a clinical examination does not predict caries activity, nor does it indicate an individual's susceptibility to dental caries.
  • salivary tests for caries disease are not new. Following are some documents that deal with this subject, aiming at the perfect positioning of the state of the art.
  • EP2762883A1 suggests a method for measuring the color change of an oxidation-reduction indicator, which method is applicable for counting carcinogenic bacteria. Color change is measured by reacting a reagent with a test sample, wherein the test reagent contains an oxidation-reduction indicator, an oxidation-reduction promoter, and a halogenated salt.
  • US876540082 relates to a method of semi-quantitative determination of cariogenic bacteria in a saliva and / or plaque sample, wherein the microorganisms contained in a saliva and / or plaque sample are contacted with a carbon source, which is fermented by cariogenic bacteria to form acids. This acid formation is then detected by determining the pH at least once within 12 hours after the addition of the carbon source, where semi-quantitative determination of the cariogenic bacteria in the sample is performed by comparing the pH with minus a reference value provided in the kit.
  • EP2680597A1 relates to a method for determining the condition of a patient's oral cavity, and an analytical tool, apparatus and program that can be used for the method.
  • CA500537 describes a test kit and method for determining Streptococcus muans. Briefly, a patient's saliva is introduced into a diluent solution which is added to a predetermined amount of bacitracin. Then the diluent solution is stirred with a paddle coated with sterile culture medium. The shovel is incubated and thereafter the amount of S. mutans in the saliva is determined semi-quantitatively by comparing the percent colony density with a standard Streptococcus mutans colony density plot included in the kit.
  • CA2439830A1 relates to a method for determining the risk of caries in a patient by analyzing lactic acid and / or lactate in their saliva.
  • the invention also describes a method for classifying caries risk in a patient based on a capture device, a buffer substance containing lactate dehydrogenase and NAD forming the assay mixture.
  • US20020177171 discloses a method for identifying a person's susceptibility to tooth decay by assaying, in a saliva sample, an agent that has high binding capacity to Streptococcus mutans but has low binding capacity to Actinomycetes naes ⁇ undi ⁇ . , another agent having high binding capacity to S. mutans agglutinin, and a last agent having high binding capacity in A. naesiundii,
  • the purpose of this invention is to produce a gelatin-enriched pH-indicator salivary test that can be applied at the clinical examination site without any laboratory apparatus other than the collection vial.
  • the culture medium is prepared in a glass vial, deposited in ice forms and, once frozen, is placed in tubes.
  • the salivary test is taken to the research site (school, nursery, etc.) and applied to all individuals.
  • the guidance for test application is simple; The individual places the culture medium in the oral cavity by moistening it with saliva for 20 seconds, without chewing and without suction movements. After this time the saliva-wrapped culture medium is returned to the original container. Once this is done, the container is hermetically sealed, identified and incubated at 37 ° C for 24 hours, after which time the color change in the culture medium is observed or not. If there is a color change, the individual is at risk for dental caries,
  • the culture medium is composed of peptone, agar, KH2 PO4, MgSO4, THO, bromocresol green, streptomycin, distilled water and geiatin.
  • the innovation of this technique is exactly the addition of geiatin to the environment, which allows its geiification, enabling its use in field research and epidemiological surveys in large populations.
  • action planning focuses on individuals at risk for the disease.
  • the invention becomes an important and revolutionary ally in eliminating the difficulty of diagnosing individuals at risk of developing caries disease, as well as the high cost of curative dental treatment for this disease,
  • ID 1 Shows a form of preparation of the culture medium by way of illustration
  • FIG. 3 Illustrates one form of culture medium presentation, which may vary as desired or required.
  • One embodiment of the culture medium according to the invention comprises its preparation in Er ⁇ enmeyer flasks (a), after which it is dispensed into bead forms (b); Once this has been done, it is autoclaved and packed in tubes (c), leading to the obtainment of a gouging medium (1) which, in the example of this invention, is in the form of a tablet, and obviously can assume other shapes without departing from the inventive scope. proposed.
  • the culture medium (1) presented herein has a spherical, concave shape approximately 15 mm in diameter and 5 mm in thickness.
  • Biconvexity (2) is important for retaining saliva during test application; however, it may be applied to other media formats (i), without this being a modification of the invention proposed in this patent application.
  • each culture medium (1) in tablet form costs R $ 0.33.
  • the application can then be done on a large number of individuals. From the results, only individuals at risk for the disease would be selected for treatment, whether preventive or curative. Of course treatment costs would be significantly minimized.
  • the culture medium used was that of Snyder which is composed of peptone, agar, K 2 PO 4 , gS04.7H 20 , pH indicator and streptomycin dissolved in 1 (one) liter of distilled water.
  • This medium was modified by the addition of a thickener, the hydrolyzed collagen (gelatin) to make it more consistent and was prepared in Erienmeyer flasks (a).
  • Five milliliters of this culture medium were dispensed as spherical ice (b) and washed.
  • the obtained solid blue colored culture media was packed into Falcon tubes (c) and transported to the site as required. clinical examinations and saliva collection were performed.
  • the table below shows, in the exemplary embodiment of the invention, a table with the components of the culture medium:
  • thickener is generic and several of them can be used, such as xanthan gum, gelatin or hydrolyzed collagen.
  • the salivary test was applied to all subjects. For this, all volunteers were instructed to place the culture medium in the oral cavity and wrap it with saliva for at least 20 seconds, without chewing and without suction movements. After this time they were instructed to return the saliva-wrapped medium to the original container.
  • the culture medium (1) packed in the Falcon tube (c) was hermetically sealed, identified and transported to the microbiology laboratory for incubation at 37 ° C (3). At 24, 48 and 72 hours, they were analyzed by two previously calibrated examiners, to detect color change from blue to yellow. The initial color (4) (blue) showed no caries risk and , with color change occurring (5), the caries risk was identified. Visual analysis was performed separately by these two examiners and color change was considered when both record the change in forms. In case of disagreement between the evaluators it was considered that there was no color change.
  • Salivary test data were compared between study groups at 24, 48 and 72 hours. For this evaluation, the McNemar statistical test was used. All statistical analyzes were performed using Statistica 7.0 software (Addinsoft, 2004), assuming a significance level of 0.05.
  • culture medium (1) was modified by the addition of geiatin, forming a solid tablet at room temperature. This tablet was packed in autoclaved tubes and taken to Socai for dental examinations. The volunteer was instructed to bathe the pellet in saliva for 20 seconds. The pellet was again deposited into the tube and incubated at 37 ° C for 24, 48 and 72 hours.

Abstract

A presente invenção trata-se do desenvolvimento de um teste simplificado para detectar cárie dentária. Este teste simplificado foi construído a partir de um meio de cultura bacteriano conhecido, porém modificado pelo acréscimo de gelatina, possibilitando a sua solidificação em temperatura ambiente, o que permite a introdução do mesmo na cavidade bucal de indivíduos. A grande vantagem deste protocolo proposto é a aplicação do teste em grupos populacionais numerosos, previamente aos exames clínicos e laboratoriais, o que permite selecíonar os indivíduos com risco potencial de cárie dentária para tratamentos preventivos ou curativos. Naturalmente os custos dos tratamentos curativos diminuiriam significativamente. Além disso, o teste pode ser empregado em larga escala em campanhas de saúde pública, uma vez que é barato e não-invasivo. Esse método mostrou-se extremamente confíável na pesquisa piloto e a mudança de cor que houve no teste foi associada com a alta prevalência de cárie. Esses dados sugerem que este método pode ser utilizado com segurança na predição do risco à doença.

Description

MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RÍSCO À CÁRIE DENTÁRIA, TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA E MÉTODO DE OBTENÇÃO DO MEIO DE CULTURA BREVE SUMÁRIO
[0001 ] Traía a presente solicitação de Patente de invenção de um inovador teste destinado à avaliação de risco à cárie dentária, que compreende a produção de um teste salivar com indicador de pH enriquecido com gelatina passível de ser aplicado no local do exame clinico,sem nenhum aparato laboratorial a não ser o frasco de cole a. O meio de cultura é preparado em frasco de vidro (a), depositado em formas de gelo (b) e depois de geieífícado é acondicionado em tubos (c).
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção apresenta particular aplicação nos segmentos de Saúde Pública, Saúde Coletiva e Saúde bucal
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] A invenção para a qual se pleiteia a presente solicitação de patente contempla um teste salivar simplificado para detecção de risco à cárie dentária cujo meio de cultura bacteriana de Snyder foi modificado pela adição de gelatina com o objetívo de deixá-io mais consistente possibilitando a sua utilização em unidades de saúde municipais ou estaduais, escolas, creches, igrejas, entre outros, para identificar indivíduos, especialmente crianças, com risco de desenvolvimento da doença cárie,
[0004] A prevalência da cárie dentária, doença de natureza infecciosa e multifatoríai, tem reduzido significativamente no Brasil. Apesar disso, grupos de crianças continuam apresentando alta aíividade de cárie. No mundo, estima-se que 20 a 25% das crianças e adolescentes concentrem entre 60 a 80% da prevalência de cárie da população. No Brasil, 17% das crianças apresentaram 46% do total de lesões de cárie da população avaliada, fenómeno denominado polarização da cárie dentária. Q tratamento da doença sobrecarrega enormemente os serviços públicos de saúde e o custo do mesmo é significativo, impactando no orçamento de governos municipais, estaduais ou federais.
[0005] Prevenir a doença cárie é relativamente simples. Para tanto ê imprescindível identificar os indivíduos com risco à doença. Aíuafmeníe as lesões de cárie são identificadas por meio do exame clínico com um espelho de boca e uma sonda exploradora, complementado com exame radiográfico. No entanto, um exame clínico não prevê ativsdade de cárie, nem indica a suscetibilidade do individuo à cárie dentária.
[0006] Por outro lado, testes salivares coiorimêtricos para diagnóstico de cárie vem sendo empregados, embora o custo desses testes convencionais inviabilize a sua utilização em larga escala, especialmente em países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento.
ESTADO DA TÉCNICA
[0007] Como citado anteriormente, testes salivares para detecção da doença cárie não são novidade. A seguir, são apresentados alguns documentos que tratam desse assunto, objetivando o perfeito posicionamento do estado da técnica.
10008] À patente EP2762883A1 sugere um método para a medição da alteração de cor de um indicador de oxidação-redução, cujo método é aplicável para a contagem de bactérias ca riogê nicas. A mudança de cor é medida por meio da reação de um reagente com uma amostra de teste, em que o reagente de teste contém um indicador de oxidação-redução, um promotor de oxidação-redução, e um sal halogenado.
[0009] A patente US876540082 refere~se a um método de determinação semi- quantitatíva de bactérias cariogênicas numa saliva e/ou amostra da placa bacteriana, em que os microrganismos contidos em uma amostra de saliva e/ou placa são postos em contato com uma fonte de carbono, o qual é fermentado pelas bactérias cariogênicas formando ácidos. Esta formação de ácido é então detectada através da determinação do pH, pelo menos, uma vez dentro de um período de 12 horas após a adição da fonte de carbono, onde a determinação semi-quantitatíva das bactérias cariogênicas na amostra é realizada comparando o pH com peio menos um valor de referência fornecido no kit.
[0010] A patente EP2680597A1 refere-se a um método para a determinação do estado da cavidade bucaí de um paciente, e uma ferramenta analítica, um aparelho e um programa que pode ser usado para o método.
[0011] A patente CA500537 descreve um kit de teste e método para determinação de Streptococcus muíans. Resumidamente, a saliva de um paciente é introduzida numa solução diluente a qual é adicionada a uma quantidade pré-determínada de bacitracina. Em seguida, a solução diluente é agitada com uma pá revestida por meio de cultura estéril. A pá é incubada e, após isso, a quantidade de S. mutans na saliva é determinada semi-quantiíativamente por comparação da percentagem de densidad de colónias com um gráfico padrão de densidade de colónias de Streptococcus mutans incluído no kit.
[0012] A patente CA2439830A1 refere-se a um método para a determinação do risco de cárie num paciente através da análise do ácido láctico e/ou lactato na sua saliva. A invenção também descreve um método para classificar risco de cárie em um paciente com base em um dispositivo de captação, uma substância tampão contendo lactato desidrogenase e NAD formando a mistura de ensaio.
[0013] A patente US20020177171 revela um método para identificar a susceptibilidade de uma pessoa à cárie dentária através do ensaio, em uma amostra de saliva um agente que tenha alta capacidade de ligação ao Streptococcus mutans, mas que tenha baixa capacidade de ligação ao Actinomycetes naesíundií, um outro agente que tenha alta capacidade de ligação a aglutinina do S. mutans, e um último agente que tenha alta capacidade de ligação em A. naesiundii,
OBJETiVO E DESCRIÇÃO GERAL DÃ iMVENÇÃO
[0014] Como foi observado anteriormente, os métodos para predição da doença cárie citados requerem aparato laboratorial que encarecem sobremaneira o custo do exame. Além disso, o que toma os métodos inadequados é a exigência de exame clínico, coleta de saliva, ou ambos, para identificar os indivíduos com risco à cárie. Quando populações numerosas, tais como estudantes de uma escola, devem ser examinadas, o tempo exigido para exame e material odontológico utilizado inviabiliza a aplicação destes testes.
[0015] A proposta desta invenção é produzir um teste salivar com indicador de pH enriquecido com gelatina que possa ser aplicado no locai do exame clínico, sem nenhum aparato laboratorial a não ser o frasco de coleta. O meio de cultura é preparado em frasco de vidro, depositado em formas de geio e, depois de ge!eificado, é acondicionado em tubos .
[0016] O teste salivar é levado ao local da pesquisa (escola, creche, etc.) e aplicado em todos os indivíduos. A orientação para aplicação do teste é simples; o indivíduo coloca o meio de cultura na cavidade bucal umedecendo-o com saliva durante 20 segundos, sem mastigar e sem movimentos de sucção. Após esse período de tempo o meio de cultura envolvido com saliva é devolvido para o recipiente original. [0017] Feito isso, o recipiente ê hermeticamente fechado, identificado e incubado a 37° C por 24 horas, período após o quai é obsen/ada a mudança, ou não, de cor no meio de cultura. Se houver mudança de cor, o individuo possui risco à cárie dentária,
10018] Ern nhas gerais, o meio de cultura ê composto por peptona, ágar, KH2P04, MgSO^.TH O, verde bromocresol, estreptomícina, água destilada e geiatina. A inovação desta técnica é exatamente a adição de geiatina ao meio, o que possibiiita a sua geieificação, propiciando a sua utilização em pesquisas de campo e ievantamentos epidemiológicos em grandes populações. Desta forma, o planejamento das ações concentra-se nos indivíduos com risco à doença.
[0019] Assim, a invenção se torna um importante e revolucionário aliado no sentido de eliminar a dificuldade para diagnosticar indivíduos com risco de desenvolvimento de doença cárie, bem como o alto custo do tratamento odontológico curativo para essa doença,
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0020] A invenção será, a seguir, descrita em uma forma de realização, sendo que, para melhor entendimento, referências serão feitas aos desenhos anexos, nos quais estão representadas:
RG. 1 : Mostra uma forma de preparo do meio de cultura, a título ilustrativo;
F!G. 2: Ilustra uma sequência de desenvolvimento do teste a partir do meio de cultura;
FIG. 3: Ilustra uma forma de apresentação do meio de cultura, que poderá variar conforme se deseje ou necessite.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0021 ] O MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO Â CÁRIE DENTÁRIA, TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA E MÉTODO DE OBTENÇÃO DO MEfO DE CULTURA, objeto desta solicitação de patente de invenção, compreende o uso de um meio de cultura (1 ) composto por peptona, ágar, KH2P04, MgSO .7H O, verde bromocresol,
•4 2.
estreptomícina, água destilada e gelatina. A inovação desta técnica é exatamente a adição de gelatina ao meio, o que possibilita a sua geieificação, propiciando a sua utilização em pesquisas de campo e levantamentos epidemiológicos em grandes populações. [0022] Uma forma de obtenção do meio de cultura, segundo a invenção, compreende a sua preparação em frascos Eríenmeyer (a), após o que é dispensado em formas de geio (b); feito isso, é autoctavado e acondicionado em tubos (c), levando à obtenção de um meio de cuitura (1 ) que, no exemplo desta invenção, possui a forma de uma pastilha, obviamente podendo assumir outros formatos sem que isso fuja ao escopo inventivo proposto.
[0023] Em conformidade com a presente invenção, o meio de cultura (1) aqui apresentado possui um formato esférico, bicôncavo, com aproximadamente 15 milímetros de diâmetro e 5 milímetros de espessura, A biconvexidade (2) é importante para reter saliva durante a aplicação do teste; no entanto, a mesma poderá ser aplicada a outros formatos de meios d cuitura (í), sem que isso represente alteração da invenção proposta de forma inédita nesta solicitação de Patente.
[0024] Tecnicamente, estima-se que cada meio de cultura (1) em formato de pastilha custe R$ 0,33. A aplicação pode então ser feita em uma grande quantidade de indivíduos. A partir dos resultados, somente os indivíduos com risco â doença seriam selecionados para o tratamento, seja efe preventivo ou curativo. Evidentemente os custos do tratamento seriam significativamente minimizados.
TESTES PARA DESENVOLVIMENTO E VIABILIZAÇÃO DO PRODUTO
[0025] Para testar a eficiência do teste para diagnóstico de cárie foi realizado um estudo piloto prévio com uma amostra populacional de conveniência composta por indivíduos com alto risco à cárie dentária e baixo risco à cárie dentária, Participaram do estudo 94 indivíduos, de ambos os sexos, que foram divididos em dois grupos: G1 composto por 53 alunos do primeiro ano do curso de Odontologia de uma instituição privada da cidade de Curítíba-PR com idade média de 21 anos (± 5 anos); G2 constituído por 41 crianças regularmente matriculadas em uma escola da rede municipal de ensino da mesma cidade, com idade média de 8 (oito) anos (± 2 anos).
[0026] Para avaliar o risco de cárie dentária, a ídéía foi categorizar os dois grupos de indivíduos classificando as pessoas de acordo com aspectos que favorecem o desenvolvimento da doença. Para tanto, os indivíduos, ou seus responsáveis, responderam um questionário sobre hábitos de alimentação, de higiene denta! e categorização socioeconómica de acordo com orientações da tabela ANEP e indicadores utilizados no levantamento epidemiológico SB Brasil. Os exames clínicos foram realizados cora o auxílio de espelho e sonda odontológica, espátula de madeira, gaze e luvas e os indivíduos foram diagnosticados de acordo com o índice de dentes com cavitação ou com lesão de mancha branca, seguindo as instruções aplicadas no levantamento epidemiológico SB Brasil. Peio fato de a média de cárie dentária em Curitiba ser baixa (1 ,53) foram considerados de baixa experiência de cárie dentária os indivíduos livres de cárie (CPO-D=0), e de alta experiência de cárie os indivíduos com CPO-D>3.
[0027] O meio de cultura utilizado foi o de Snyder qve é composto por peptona, ágar, K 2PO4, gS04.7H20, indicador de pH e estreptomicína dissolvidos em 1 (um) litro de água destilada. Esse meio foi modificado pelo acréscimo de um espessante, o colágeno hidrolisado (gelatina) visando deixá-lo mais consistente e foi preparado em frascos Erienmeyer (a). Cinco mililitros desse meio de cultura foram dispensados em forma de gelo com formato esférico (b) e auíodavados. Os meios de cultura sólidos obtidos, de cor azul, foram acondicionados em tubos Falcon (c) e transportados para o local no qua! foram realizados os exames clínicos e coleía de saliva.
[0028] A tabela abaixo mostra, no exemplo da realização da invenção, uma tabela com os componentes do meio de cultura:
Tabela - Componentes do Meio de Cultura
Figure imgf000008_0001
Importante:
~ Indicadores de pH qu podem ser utilizados:
Azul de bromocresol;
Verde de bromocresol;
Me t yl Orange;
Methyired; Congo md.
- O termo espessarrte é genérico e podem ser utilizados vários deles, tais como goma xantana, gelatina ou colágeno hidrolisado.
ÍQG29] O teste salivar foi aplicado em todos os indivíduos. Para isso, todos os voluntários foram orientados a colocar o meio de cultura na cavidade bucal e envolvê-lo com saliva durante pelo menos 20 segundos, sem mastigar e sem movimentos de sucção. Após esse período de tempo foram orientados a devolver o meio envolto em saliva ao recipiente original.
[0030] Assim, o meio de cultura (1) acondicionado no tubo Falcon (c) foi hermeticamente fechado, identificado e transportado ao laboratório de microbiologia para incubação a 37° C (3). Nos períodos de tempo de 24, 48 e 72 horas foram analisados por dois examinadores anteriormente calibrados, para detecção de mudança de cor de azul para amarelo, sendo que, mantida a cor inicial (4) (azul) não se constatou risco à cárie e, ocorrendo alteração de cor (5), restou identificado o risco à cárie. A análise visual foi realizada separadamente por esses dois examinadores e considerou-se mudança de cor quando ambos registram em formuiários a alteração. Em caso de discordância entre os avaliadores considerou-se que não houve mudança de cor.
AMÁLISE ESTATÍSTICA
[0031] Os dados relativos ao teste salivar foram comparados entre os grupos do estudo nos tempos 24, 48 e 72 horas. Para tal avaliação foi utilizado o teste estatístico de McNemar. Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa Statistica 7.0 (Addinsoft, 2004), assumindo um nível de significância de 0,05.
RESULTADOS OBTIDOS APÓS A APLICAÇÃO DO TESTE
[0032] Com o intuito de avaliar o teste salivar, os indivíduos de ambos os grupos receberam o meio de cultura modificado. No início do experimento, tempo zero, todos os meios de cultura apresentavam cor azul. Após a exposição do meio à cavidade bucal, a mudança de cor dos mesmos foi avaliada em 24, 48 e 72 horas. Foi possível verificar que houve diferenças estatísticas significativas entre os períodos, havendo o acréscimo significativo do número de casos positivos nos indivíduos vulneráveis à cárie dentária no período de 24 horas (0=6,422; z=2,534; p=0,016). Na comparação entre os demais períodos verificou-se aumento no número de casos positivos, porém não houve diferenças estatísticas entre as frequências observadas (0=1 ,754; z=1 , 324; p=0,228).
Í0033] A Tabela a seguir mostra as Frequências absolutas e relativas percentuais dos casos positivos para o teste salivar. G1 : grupo de indivíduos com baixa vulnerabilidade à cárie; G2: grupo de indivíduos com alta vulnerabilidade à cárie dentária.
Teste Salivar
24 horas 4β horas 72 horas
Tempo (Àtividade de (Àtividade (Atividade
Zero Cárie de Cárie de Cárie
Acentuada) Moderada) Pequena)
G1 (n«53) 0 (0%) 0 (0%) 14 (26%) 29 (55%)
G2 (n=41 ) 0 (0%) 31 (74%) 40 (97%) 41 (100%)
CONCLUSÕES OBTIDAS APÓS OS TESTES
[0034] No estudo relatado acima, o meio de cultura (1 ) foi modificado peio acréscimo de geiatina, formando uma pastilha sólida à temperatura ambiente, Essa pastilha foi acondicionada em tubos autoclavados e levadas para o Socai dos exames odontológicos. O voluntário foi orientado para que banhasse a pastilha em saliva durante 20 segundos, A pastilha foi novamente depositada no tubo e incubada em estufa a 37 °C por 24, 48 e 72 horas.
[0035] A análise dos meios de cultura mostrou que em 31 indivíduos (74%) vulneráveis à cárie a mudança de cor no meio de cultura foi evidente nas primeiras 24 horas, indicando alto risco para cárie dentária, ou seja, o meio de cultura foi eficiente e confirmou o risco de cárie dentária em indivíduos que reúnem fatores que predispõe à doença. Tão importante quanto essa observação é o fato de que nenhum teste salivar aplicado no grupo de jovens com baixa vulnerabilidade à cárie dentária mudou de cor nas primeiras 24 horas. Após 48h o índice de mudança de cor passou para 95% e em 72 horas todos os meios de cultura mudaram de cor do grupo de crianças vulneráveis à cárie. Dessa forma, conclui-se que o teste salivar manteve a confiabilidade e acurácia nos resultados do grupo amostrai. Os resultados obtidos mostram que o teste salivar é confiável para análise de risco à cárie dentária, haja vista que nos indivíduos vulneráveis à cárie o acréscimo de casos positivos nas primeiras 24 horas foi estatisticamente significante, enquanto que no grupo com baixa vulnerabilidade à cárie não houve nenhuma aiteração de cor nas primeiras 24 horas no teste coiorimétrico.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1) MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, para a realização de um leste de risco a cárie dentária, a partir do contato do meio de cultura com a saliva, caracterizado pelo uso de um meio de cultura (1) bacteriano original líquido Snyder modificado pelo acréscimo de espessante permitindo ao referido meio de cultura bacteriano (1) assumir um estado sólido, para contaío com a cavidade bucal,
2) MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRÍE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por o meio de cultura sólido (1 ) compreender as seguintes concentrações, em peso: Peptona, de 10 a 100 g; KH2PQ4, de 1 a 100 g; Ágar, de 10 a 100 g; MGS04.7H20, de 5 a 100 g; indicador de pH, de 1 a 100 g; Estreptomicina, de 1 a 100 g: Água Destilada, 1 Lt; Coiágeno Hidrolisado - gelatina ou espessante -,de 20 a 200 g.
3) MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por os componentes do meio de cultura (1 ), em uma realização, apresentarem a seguinte concentração em peso: peptona, de 10 a 100 g; KH2P0 , de 1 a 100 g; Ágar, de 10 a 100 g; MgS04. H2O, de 5 a 100 g; Indicador de Ph, de 1 a 100 g; Estreptomicina, de 1 a 100 g; Agua destilada, 1 Lt; coiágeno Hidrolisado - gelatina ou espessante ~,de 20 a 200 g.
4) MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO Â CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 1 , 2 e 3, caracterfead© por os indicadores de pH serem seSecionados entre: Azul de bromocresoí; Verde de bromocresoi; Methyí Orange;Methytred e; Congo red.
5) MEIO DE CULTURA PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 1 , 2, 3 e 4, caracterizado por o meio de cultura (1 ) apresentar biconvexidade (2).
6) MESO DE CULTURA PARÁ A REALIZAÇÃO DE UM TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 1 , 2, 3, 4 e 5, caracterizado por o espessante ser selecionado entre goma xantana, gelatina ou coiágeno hidrolisado. 7) TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, a ser realizado a partir do meio de cultura das reivindicações anteriores, caracterizado por o meio de cultura (1 ), após contato com a saiiva, ser acondicionado no tubo Falcon (c) posteriormente hermeticamente fechado, identificado e transportado ao laboratório de microbiologia para incubação (3); após os períodos de tempo verifica~se a para detecção de mudança de cor, sendo que, mantida a cor inicial (4) não existe risco á cárie e, ocorrendo alteração de cor (5), fica identificado o risco à cárie.
8) TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRiE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o contato do meio de cultura sólido (1 ) com a saiiva ser de peio menos 20 s.
9) TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a temperatura de incubação ser de 37 °C.
10) TESTE PARA AVALIAÇÃO DE RISCO À CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado po os períodos de tempo para verificação da eventual mudança de cor serem selecionados entre 24, 48 e 72 horas.
11 ) MÉTODO DE OBTENÇÃO DO MEIO DE CULTURA, para obtenção do meio de cultura sólido (1 ) das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o meio de cultura modificado pela adição do espessante ser colocado em uma forma de obtenção do melo de cultura, compreendendo a sua preparação em frascos Eríenmeyer (a), após o que é dispensado em formas de gelo (b); feito isso, ê autoclavado e acondicionado em tubos (c), levando à obtenção de um meio de cultura sólido (1 ).
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Title
SNYDER ML.: "A Simple Colorimetric Method for the Estimation of Relative Numbers of Lactobacilli in the Saliva.", JOURNAL OF DENTAL RESEARCH, vol. 4, no. 19, 1940, pages 349 - 355, XP055374884 *

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