WO2016209037A1 - 대용량 메타지놈 분석을 통한 유용 유전자원 탐색 방법 및 이의 이용 - Google Patents

대용량 메타지놈 분석을 통한 유용 유전자원 탐색 방법 및 이의 이용 Download PDF

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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for searching for a very fast useful gene source through a large-capacity metagenome analysis and its use.
  • Metanome is defined as the genome set of all microorganisms in a particular natural environment. Microorganisms make up the largest number of living organisms, but more than 99% of the microorganisms in the environment cannot be grown in a laboratory because they are difficult to provide conditions similar to the natural environment in which they exist. Metagenome allows you to directly extract DNA from various microorganisms in the natural environment, whether or not they can be cultured in the laboratory, and to search for genes, identify them, and analyze their function.
  • enzymes are biocatalysts produced by living organisms, and attempts have been made to use enzymes derived from microorganisms and metagenomes for catalytic reactions required in chemical synthesis processes. Enzymes have high ultra-precision, specificity, selectivity, and high efficiency characteristics compared to chemical catalysts, and thus have great utility in various industrial fields.
  • the catalytic efficiency of enzymes is 10 8 to 10 14 times that of non-enzymatic reactions under similar reaction conditions and the reaction selectivity is very high compared to chemical catalysis.
  • enzymes that can react under special circumstances such as high temperature, high pressure, and reaction under organic solvents, they are highly valuable as future industrial preparations.
  • Methods for measuring the presence and activity of enzymes for the search for such enzymes include a search method using microorganisms and a search method using a non-culturable metagenome.
  • various strain collections are essential and the selection of candidate strains through direct culture and activity comparison of these strains should be preceded.
  • it requires a lot of labor and research costs and takes a long time.
  • a high-throughput screening system has been developed and utilized to overcome this problem.However, in order to identify a desired useful enzyme, it is necessary to purify the genomic DNA from a candidate strain, construct a DNA library, and use an expression system. Only by re-identification and selection of the enzyme activity, the sequencing of the library strains can provide useful enzyme resources.
  • a DNA library is constructed by using a metagenome purified from gDNA directly from an environmental sample, which is also a function-based enzyme screening or degeneracy primers using an expression system.
  • the purpose of this study is to classify DNA of useful enzyme resources (DNA sequence-based enzme screening).
  • a library (Libarary) is produced by direct cloning of the metagenome, and then directly confirmed the presence of an enzyme that reacts with a substrate and converts it into a desired substance through expression. This method has the advantage of being able to confirm the existence of the gene source, but a considerable labor and time is invested in the production and expression process of the library, and since the E.
  • coli system is mainly used as an expression system, a heterologous gene expression system is used. system). Gene expression of bacteria in distantly evolving relations where the composition or use of promoters or codons does not match E. coli may be affected and expression is less efficient than these efforts and investments There is this.
  • a primer prepared based on the characteristic motif of the target enzyme is used to identify the nucleotide sequence of the desired enzyme through a polymerase chain reaction.
  • this method also uses a primer prepared based on the motif of a specific enzyme, so that the obtained nucleotide sequence is amplified by being biased by one enzyme, and the sequencing of the nucleotide sequence directly by sequencing the DNA library containing the target enzyme is carried out. There is a problem that needs to be confirmed.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • the degeneracy cannot determine the nucleotide sequence of a gene encoding a specific amino acid sequence, but it is possible to synthesize oligonucleotides containing all possible nucleotide sequences.
  • DNA fragments of genes encoding the protein may be obtained based on amino acid sequence information.
  • the primer designed for this purpose is called degenerate primer and the polymerase chain reaction is called degenerate polymerase chain reaction.
  • This method is a technique for cloning the gene from a known amino acid sequence, but is now widely used when searching for a group of genes based on primary structure (base sequence) information of abundantly accumulated nucleic acids.
  • base sequence base sequence
  • the present inventors can amplify a large amount of genes of amplified fragments by amplifying genes of peptides such as various enzymes in a method for quickly and accurately determining a utility value of a metagenome sample in searching for peptides such as industrially useful enzymes.
  • DNA fragments amplified by the present invention was completed by identifying the large-capacity nucleotide sequence of the useful peptide through the next-generation sequencing method.
  • one aspect of the present invention relates to a method for analyzing metagenome information using a superfamily-specific degenerate primer set of a target gene.
  • Another aspect of the present invention relates to a superfamily-specific degenerate primer set of the gene of interest.
  • the sequence of the site where the primer and the gene of interest bind is at least 80% homology
  • the degeneracy ratio is 1,500 or less
  • the temperature of the annealing is 70 ° C. or less
  • the length of the primer is 30 bases or less
  • the size of the amplified fragment may be 1,000 bp or less.
  • the primer set has the degenerate ratio of 800 or less;
  • the primer length is 25 bases or less
  • the size of the amplified fragment may be 500 bp or less.
  • the metagenome sample may be a metagenome library, a vector into which the metagenome library is introduced, or a cell transformed with the vector.
  • the metagenome sample may be soil, swamps, volcanoes, tidal flats, torsion, fresh water, seawater, body fluids, urine, agricultural products, aquatic products or feces.
  • the target gene may be to encode a polypeptide, oligopeptide, enzyme, antibiotic resistance gene, antibacterial peptide, antifungal peptide, oligopeptide, or marker.
  • Single-molecule real-time sequencing ion semiconductor sequencing, pyrosequencing, sequencing by synthesis (Illumina), sequencing by ligation (SBL), and chain stop It may be to use one or more methods selected from the group consisting of Chain termination.
  • Another aspect of the present invention is a superfamily specific degenerate primer set of the target gene for meta-gnome information analysis
  • the sequence of the site where the primer and the gene of interest bind is at least 80% homology
  • the degeneracy ratio is 1,500 or less
  • the temperature of the annealing is 70 ° C. or less
  • the length of the primer is 30 bases or less
  • the primer set is provided, wherein the size of the amplification fragment is 1,000 bp or less.
  • the primer set preferably has a degeneracy rate of 800 or less;
  • the primer length is 25 bases or less
  • the size of the amplified fragment may be less than 500 bp.
  • the method for analyzing information of the metagenome according to the present invention, and the primer set used therein, may be applied to the present invention for quick determination of a large value of metagenome samples.
  • using the superfamily-specific degenerate primer of the present invention it is possible to quickly search for the presence or absence of genetic information of the peptides of interest in the metagenome by a simple method, so that a large amount can be obtained from various metagenome samples at high speed. It can be used to collect useful peptide resource information.
  • it can be used to search for a new peptide gene through the design and manufacture of superfamily-specific degenerate primers of the desired new peptides.
  • the method of the present invention can be applied not only to enzymes, but also to studies related to polypeptides, oligopeptides, antibiotic resistance genes, antimicrobial peptides, antifungal peptides, oligopeptides, markers or SNPs (Single-Nucleotide Polymorphism).
  • Figure 1 shows a high-speed large-capacity enzyme search method through the analysis of large-capacity meta-genome information which is a schematic diagram of the present invention.
  • Figure 2 shows a method for producing a superfamily-specific degenerate primer used in the present invention.
  • Figure 3 shows the optimal PCR conditions (A) for target gene amplification using the superfamily-specific degenerate primers used in the present invention (A) and the resulting results (B) and negative control (negative control). PCR results (C) are shown.
  • Figure 4 shows the analysis (phylum) and genus (genus) for identifying the microbial community (microbial community) of the meta-gnome samples of the Volcanic region of Indonesia as an example of the meta-gnome samples analyzed by the method of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of electrophoresis analysis for identifying the target gene after PCR using each superfamily specific degenerate primer and metagenome samples by the method of the present invention.
  • Figure 6 shows a microbial phylum analysis of each meta-gnome sample of the pyruvate kinase gene of the genes analyzed by the method of the present invention.
  • the sequence of the site where the primer and the gene of interest bind is at least 80% homology
  • the degeneracy ratio is 1,500 or less
  • the temperature of the annealing is 70 ° C. or less
  • the length of the primer is 30 bases or less
  • the size of the amplified fragment may be 1,000 bp or less.
  • the sequence of the site where the primer and the gene bind is 80% or more and 100% or less homology
  • the degeneracy ratio is greater than 0 and less than 1,500
  • the temperature of the annealing is at least 30 ° C and at most 70 ° C;
  • the primer is at least 4 bases and at most 30 bases in length;
  • the size of the amplified fragment may be 100 bp or more and 1,000 bp or less.
  • the primer set has a degeneracy rate of 0 to 800;
  • the primer length is 4 or more and 25 bases or less.
  • the size of the amplified fragment may be 100 bp or more and 500 bp or less.
  • the metagenome sample may be a metagenome library, a vector into which the metagenome library is introduced, or a cell transformed with the vector.
  • the metagenome sample may be soil, swamps, volcanoes, tidal flats, torsion, fresh water, seawater, body fluids, urine, agricultural products, aquatic products or feces.
  • the metagenome library may be obtained by taking a microbial community in a natural or specific region, extracting a genome directly, and introducing the vector into a vector.
  • the vector may be a plasmid, fosmid, cosmid, bacterial artificial chromosome (BAC), yeast artificial chromosome (YAC), or the like, depending on the user's purpose.
  • the target gene may be to encode a polypeptide, oligopeptide, enzyme, antibiotic resistance gene, antibacterial peptide, antifungal peptide, oligopeptide, or marker.
  • the polypeptide, peptide or oligopeptide is a polymer of amino acids through peptide bonds, the peptide may be an enzyme, an antibacterial peptide or a marker.
  • the antimicrobial peptides have an antibiotic effect on bacteria, fungi, protozoa, viruses, etc., and may be bacteriocin, defensin, indolisidine, cathelicidine, lacsoferricin, lysozyme, and the like.
  • the enzymes include Catalase Hydroperoxidase II (KatE), Catalase Hydroperoxidase I (Cata), 4-aminobutyrate transaminase (GabT), UDP-N Acetylglucosamine-2-epimerase (UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase, WegB), L-arabinose isomerase (AraA), phytase (Phy), subtilisin (Subtilisin, AprE), Cellulase-1, YtoP, Cellulase-2, EglS, Triosephosphate isomerase (TpiA), Pyruvate kinase (PyrK), etc. Can and does not limit its kind.
  • the marker is a marker for predicting and diagnosing the onset, prognosis, genotype, sensitivity to drugs, and the like, and there is no limitation on the type of the disease.
  • the target gene may be an antibiotic resistance gene.
  • the antibiotic resistance is drug resistance that can survive microorganisms exposed to antibiotics, which can be caused by various genetic modifications.
  • the antibiotic may be ampicillin, aminoglycoside, beta-lactam, erythromycin, mescillin, vancomycin, quinolone antibiotics, and the like, but is not limited thereto.
  • Single-molecule real-time sequencing ion semiconductor sequencing, pyrosequencing, sequencing by synthesis (Illumina), sequencing by ligation (SBL), and chain stop It may be to use one or more methods selected from the group consisting of Chain termination.
  • Another aspect of the present invention is a superfamily specific degenerate primer set of the target gene for meta-gnome information analysis
  • the sequence of the site where the primer and the gene of interest bind is at least 80% homology
  • the degeneracy ratio is 1,500 or less
  • the temperature of the annealing is 70 ° C. or less
  • the length of the primer is 30 bases or less
  • the primer set is provided, wherein the size of the amplification fragment is 1,000 bp or less.
  • the primer set is preferably
  • the sequence of the site where the primer and the gene bind is 80% or more and 100% or less homology
  • the degeneracy ratio is greater than 0 and less than 1,500
  • the temperature of the annealing is at least 30 ° C and at most 70 ° C;
  • the primer is at least 4 bases and at most 30 bases in length;
  • the size of the amplified fragment may be 100 bp or more and 1,000 bp or less.
  • the primer set is more preferably
  • the degeneracy rate is from 0 to 800;
  • the primer length is 4 or more and 25 bases or less.
  • the size of the amplified fragment may be 100 bp or more and 500 bp or less.
  • primer means a synthetic or natural oligonucleotide.
  • the primer serves as a starting point for the synthesis under conditions in which the synthesis of the primer extension product complementary to the nucleic acid chain (template) is induced, i.e., the presence of a polymerizer such as nucleotides and DNA polymerase, and conditions of suitable temperature and pH.
  • a polymerizer such as nucleotides and DNA polymerase
  • the primer is preferably single chain.
  • the primer is an oligodioxyribonucleotide.
  • Primers of the invention may include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the superfamily specific degenerate primer set of the target gene of the present invention is a forward degenerate primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse degenerate primer set consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 ;
  • IUB ambiguity codes are used to represent the sequences of the primers.
  • A represents adenine
  • G represents guanine
  • C represents cytosine
  • T represents thymine.
  • R is G or A
  • Y is T or C
  • M is A or C
  • K is G or T
  • S is G or C
  • W is A or T
  • B is G or C or T
  • D is A or G or T
  • H is A or C or T
  • V is A or G or C or T
  • N is A or G or C or T.
  • Another aspect of the present invention provides a metagenome analysis kit comprising the primer set described above.
  • Kits of the invention can include reagents required for PCR reactions, such as buffers, DNA polymerases, DNA polymerase cofactors and deoxyribonucleotide-5'-triphosphates.
  • the kits of the present invention may include antibodies that inhibit the activity of various polynucleotide molecules, reverse transcriptases, various buffers and reagents, DNA polymerases.
  • the optimal amount of reagent used in a particular reaction can be readily determined by one of ordinary skill in the art having knowledge of the subject matter herein.
  • the kit of the present invention comprises the aforementioned components in a separate package or compartment.
  • another aspect of the present invention provides a method for selecting a superfamily specific degenerate primer set of a gene of interest for meta-genome information analysis comprising the step of selecting a nucleotide sequence that satisfies the following conditions:
  • the degeneracy ratio is less than 1,500
  • the temperature of the annealing is 70 ° C. or less
  • the length of the primer is 30 bases or less
  • the size of the amplified fragment is 1,000 bp or less.
  • the method of selecting a superfamily specific degenerate primer set of the target gene for analyzing the metagenome information is preferably
  • the sequence of the site where the primer and the gene bind is at least 80% and at most 100% homology
  • the degeneracy ratio is greater than 0 and less than 1,500
  • the temperature of the annealing is at least 30 ° C and at most 70 ° C;
  • the primer is at least 4 bases and at most 30 bases in length;
  • the method of selecting a superfamily specific degenerate primer set of the target gene for analyzing the metagenome information is more preferred.
  • the degeneracy rate is from 0 to 800;
  • the primer length is 4 or more and 25 bases or less; And selecting a base sequence that satisfies the condition that the size of the amplified fragment is 100 bp or more and 500 bp or less.
  • Catalase Hydroperoxidase II (KatE), Catalase Hydroperoxidase I (CatA), 4-aminobutyrate transaminase (GabT), UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase (WegB), L-arabinose isomerase (AraA), Phytase Genetic information of (Phy), Subtilisin (AprE), Cellulase1 (YtoP), Cellulase2 (EglS), Triosephosphate isomerase (TpiA), and Pyruvate kinase (PyrK) enzymes were used.
  • the amino acid sequence of each enzyme gene was aligned on the condition that the amino acid homology with the target protein was 35%, and the nucleotide sequences encoding these were identified based on the amino acid sequence having a high homology of 80% or more. After the alignment again (alignment). Based on the complementarity of the nucleotide sequences, the degeneracy rate of the superfamily-specific degenerate primer (1,500 or less, preferably 800 or less), annealing temperature value (70 ° C.
  • primer length (30 base or less, preferably 25 bases) On the basis of the base sequence determined so as to satisfy the following conditions, and the low site having a homology of 40% or less of the base sequence inside the primer binding site and the size of the amplification fragment of 1,000 bp or less (or optionally 500 bp or less). Degenerate primers were prepared.
  • the present invention comprises Catalase HydroperoxidaseII (KatE) gene amplification in the forward degenerate primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse degenerate primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 prepared by the above process Provide a primer for.
  • forward degenerate primers and reverse degenerate primers are degenerate primers that are supposed to amplify genes of known enzymes in the same manner as well as degenerate primers used to amplify genes of known enzymes. Includes all of them.
  • 4-aminobutyrate transaminase F 5'-SCV GAR GCV GTY GAR AAC GC-3 '(SEQ ID NO: 5);
  • UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase F 5'- TCA YGT BGA RGC BGG VYT GMG-3 '(SEQ ID NO: 7);
  • L-arabinose isomerase F 5'-GAA CYT NAA CCA RDC NGC NCA CGG-3 '(SEQ ID NO: 9);
  • L-arabinose isomerase 5'- CCA GTC DCC TTC NSC NSC RAA NCC-3 '(SEQ ID NO: 10);
  • Subtilisin F 5'-CAC GGH ACN CAT KKN GCN GG-3 '(SEQ ID NO: 13);
  • Subtilisin R 5'- GGA GWB GCC ATD SWB GTD CCG-3 '(SEQ ID NO: 14);
  • Cellulase-1 F 5'- ATV TAY GTH ATH RTY GAY TGG C-3 '(SEQ ID NO: 15);
  • Cellulase-1 R 5'-RTG HGT DSC BGH ATA RAA ATG-3 '(SEQ ID NO: 16);
  • Cellulase-2 F 5'- GSN CAY WTG GAY GAR RTS GG-3 '(SEQ ID NO: 17);
  • Cellulase-2 R 5'- CCN AHY TCY TCC TGN ACN GT-3 '(SEQ ID NO: 18);
  • Triosephosphate isomerase F 5'- GGN GCV TMY ACH GGY GAR-3 '(SEQ ID NO: 19);
  • Triosephosphate isomerase R 5'- GC CCA NAY NGG YTC RTA VGC-3 '(SEQ ID NO: 20);
  • Pyruvate kinase F 5'- CGN HTN AAC TTY TCS CAY GG-3 '(SEQ ID NO: 21);
  • Pyruvate kinase R 5'-CAT BSA STC DAG CAT YTG HGT CGC-3 '(SEQ ID NO: 22).
  • an object of the present invention is to provide a forward degenerate primer pair and a reverse degenerate primer pair complementary to the base sequence of the conserved region present in the enzyme.
  • the degenerate primer of the present invention is for selectively amplifying and detecting a high homology (80% or more) by analyzing amino acid sequences of enzyme genes belonging to a specific enzyme superfamily, and having high complementarity of genes of a specific enzyme gene. Will bind to the sequence.
  • the 11 pairs of degenerate primers exemplified above can be used to determine whether the 11 enzymes mentioned above are present in any strain and metagenome.
  • the genes of representative microorganisms of various domains known to produce Catalase Hydroperoxides II were previously searched in a database, and alignment was performed using at least five amino acid sequences of selected genes. .
  • the peptides were first selected to have at least 35% homology.
  • Sequences with more than 80% homology between many genes were selected as regions for degenerate primer design. After converting the selected amino acid sequence with high homology back to the base sequence, the degenerate ratio (1,500 or less, preferably 800 or less), an annealing temperature value (70 or less), primer Length (30 or less, preferably 25 or less) conditions are limited, homology of the base sequence inside the primer binding site is low to 40% or less, and the size of the amplification fragment is 1,000 bp or less (preferably 500 bp or less) A degenerate primer was prepared based on the nucleotide sequence determined to be. The remaining degenerate primers for detecting other known enzymes were also designed and constructed by the above method.
  • FIG. 2 An example of a degenerate primer design is shown in FIG. 2.
  • Degenerate primers (SEQ ID NO: 1; 5'-CRC TTY GAY CAY GAR MGB ATY CC-3 'and SEQ ID NO: 2; 5'-ATG AAR AAS ACH for catalase hydroperoxides II (KatE))
  • the genomic DNA of E. coli MG1655 using the amino acid sequence of KatE gene for the preparation of this degenerate primer was used as a template.
  • Polymerization chain reaction (PCR) was performed.
  • the remaining degenerate primers were also subjected to polymerase chain reaction (PCR) using the genomic DNA of E. coli MG1655 as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR reactions were as follows: 100 ng template (genome DNA of E. coli MG1655 and Bacillus subtilis 168 obtained), 12.5 ⁇ l EmeraldAmp GT PCR Master Mix, 0.2 ⁇ M (final concentration) for each forward and reverse degenerate. Final 25 ⁇ l solution containing primer, sterile distilled water. PCR reactions were denatured at 94 ° C. for 30 seconds, X ° C. (54 ° C. catalase hydroperoxides II, catalase hydroperoxides I; 58 ° C. gaba transaminases, UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase) L-arabinose isomerase; 52 ° C.
  • the amplified PCR product was confirmed by performing electrophoresis on a 2% agarose gel.
  • Amplified gene fragments of the size expected in Escherichia coli MG1655 and Bacillus subtilis 168 (about 280 bp catalase hydroperoxidases II; about 350 bp catalase hydroperoxidases I; about 300 bp Gabba transaminases; about 540 bp UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase; about 570 bp L-arabinose isomerase; about 400 bp phytate; about 490 bp subtilisin; about 335 bp cellulose; about 300 bp triosphosphate Isomerase, about 760 bp pyruvate kinase).
  • PCR was performed by setting the annealing temperature to 70 ° C. or higher in the PCR reaction conditions as a negative control group. As a result, as shown in FIG. 3C, when the annealing temperature was 70 ° C or higher, it was confirmed that the desired fragments were not amplified.
  • the PCR product was purified using a Qiaquick Gel extraction kit (QIAGEN, Germany), and then ligated to a pGEM T-easy vector (Promega, USA) to catalyze hydroperoxides II, catalase hydroperoxyoxy of E. coli MG1655.
  • the recombinant vector was mixed with 100 ⁇ l of E. coli DH5 (competent cell) prepared for transformation, and then transformed Escherichia coli into which the vector was introduced with heat-shock at 42 ° C. for 90 seconds.
  • Transformed Escherichia coli was selected by plating on LB medium containing 100 ⁇ g / ml.
  • the plasmid DNA was recovered using a plasmid extraction kit (Biofact, Korea), and commissioned to a Solgent company (Korea) for sequencing.
  • a plasmid extraction kit Biofact, Korea
  • Solgent company Solgent company
  • the polymerase chain reaction was performed to search for the target gene by using the metagenome as a template.
  • the PCR reactions used were as follows: 100 ng template (received Soil A metagenome DNA), 12.5 ⁇ l EmeraldAmp GT PCR Master Mix, 0.2 ⁇ M (final concentration) each Forward and Reverse primer, final 25 containing sterile distilled water ⁇ l of solution. PCR reactions were denatured at 94 ° C. for 30 seconds, X ° C. (54 ° C. catalase hydroperoxides II, catalase hydroperoxides I; 58 ° C.
  • Lane 1 is a PCR amplification product of the coding gene.
  • Amplification patterns of various target genes were identified in polymerase chain reaction using eight kinds of metagenomes as templates. Prior to utilizing next-generation sequencing equipment, PCR was performed using Soil A metagenome as a template to confirm whether degenerate primers prepared in meta-genome-based PCR had binding ability with target genes.
  • Amplification fragments obtained by performing (about 300 bp catalase hydroperoxidases II, about 350 bp catalase hydroperoxides I, about 300 bp Gaba transaminases) using a Qiaquick Gel extraction kit (QIAGEN, Germany) After purification, the gene was cloned into pGEM T-easy vector and sequence analysis through general sanger sequencing revealed that the target enzyme genes were not only detected, but also various strains containing the genes of the enzymes were detected. The Blast search results on the website showed this.
  • Table 1 and Table 2 are the results of analyzing the genetic information of a number of meta-genomic samples by using the meta-genome information analysis method according to the present invention.
  • FIG. 1 shows an ultra-high speed large capacity enzyme search method through large capacity meta-genome information analysis.
  • the method for analyzing information of the metagenome according to the present invention, and the primer set used therein, can be applied to the present invention for the quick determination of the utility value of the vast metagenome sample.
  • the superfamily-specific degenerate primer of the present invention it is possible to quickly search for the presence or absence of genetic information of the peptides of interest in the metagenome by a simple method, so that a large amount can be obtained from various metagenome samples at high speed. It can be used to collect useful peptide resource information.
  • it can be used to search for a new peptide gene through the design and manufacture of superfamily-specific degenerate primers of the desired new peptides.
  • the method of the present invention can be applied not only to enzymes, but also to studies related to polypeptides, oligopeptides, antibiotic resistance genes, antibacterial peptides, antifungal peptides, oligopeptides, markers or SNPs (Single-Nucleotide Polymorphism).

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Abstract

본 발명은 대용량 메타지놈 정보 분석을 위한 디제너레이트 프라이머 및 이를 이용하여 메타지놈 정보를 분석하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메타지놈의 정보 분석 방법, 및 이에 이용되는 프라이머 세트는 방대한 메타지놈 샘플 효용 가치의 빠른 판별을 위하여 본 발명이 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 슈퍼패밀리-특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 프라이머를 이용하여 메타지놈에서 목적 펩타이드들의 유전정보의 유무를 간단한 방법에 의해 빠르게 탐색할 수 있으므로 다양한 메타지놈 샘플로부터 고속으로 대량의 유용 펩타이드 자원 정보를 수집하는데 사용이 가능하다. 또한, 이러한 본 발명의 방법을 기반으로 하여 목적하는 새로운 펩타이드들의 슈퍼패밀리-특이적 디제너레이트 프라이머 설계 및 제작을 통하여 새로운 펩타이드 유전자를 탐색하는데 사용이 가능하다. 또한, 이러한 방법은 효소뿐 만 아니라, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 항생제 내성 유전자, 항균펩타이드, 항진균펩타이드, 올리고펩타이드, 마커 또는 SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) 관련 연구에도 본 발명의 방법이 적용될 수 있다.

Description

대용량 메타지놈 분석을 통한 유용 유전자원 탐색 방법 및 이의 이용
본 발명은 대용량 메타지놈 분석을 통한 초고속 유용 유전자원 탐색 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
메타지놈(metagenome)이란 특정 자연 환경에 존재하는 모든 미생물의 유전체 집합으로 정의된다. 미생물은 전체 생물 중 가장 많은 수를 차지하고 있지만, 미생물들이 존재하는 원래의 자연환경과 유사한 조건을 제공해 주기가 어렵기 때문에 환경에 존재하고 있는 미생물들의 99% 이상은 실험실에서 배양할 수 없다. 메타지놈을 이용하면 실험실에서의 배양 가능 여부와 관계없이 자연 환경에서 존재하는 다양한 미생물 유래의 DNA를 직접 추출하여 유전자의 탐색, 동정 및 기능 분석이 가능하다.
이러한 메타지놈 시료의 분석을 통해 미생물들의 특정 환경 내에서의 역할을 규명함으로써 미생물을 이용한 폐수처리, 화학적 화합물 생산, 의약품 생산, 바이오 에너지 생산, 산업공정에서의 이용 등 산업, 환경, 에너지, 농업, 의료 등 인간의 삶과 관련된 전반적인 모든 분야에 도움을 줄 수 있다. 최근 메타지놈 연구가 각광을 받는 이유는 앞에서 언급한 대로 그 응용분야인 신물질 또는 신규한 효소의 탐색에 유용하기 때문이다. 특히, 효소는 생물체가 만들어 내는 생촉매(biocatalyst)로써 화학 합성 공정에서 필요한 촉매반응에 미생물 및 메타지놈에서 유래한 효소를 이용하려는 시도가 이루어지고 있다. 효소는 화학촉매에 비해 고도의 초정밀성, 특이성, 선택성 및 고효율성의 특성을 지니기에 다양한 산업분야로의 이용성은 매우 우수하다. 효소의 촉매 효율성은 비슷한 반응 조건 하에서의 비효소적 반응에 비해 108 ~ 1014배나 되며 화학 촉매반응에 비해 반응의 선택성이 매우 높다. 이뿐만 아니라 고온, 고압, 유기용매하의 반응 등 특수한 상황에서도 반응이 가능한 효소가 존재할 경우, 미래 산업용 제제로 활용가치가 매우 높은 품목이다.
초기에는 효소의 가격 면에서 경제적 타당성이 매우 낮아 현실적으로 사용이 어려웠으나, 근래는 유전자조작기술, 생물공학기술 및 분자진화기술을 포함한 신기술의 눈부신 발전으로 말미암아 새로운 기능효소개발을 위한 고속탐색(High-throughput screening) 및 개량이 가능하여 신응용 분야로의 확대 적용이 가능하다.
이러한 효소의 탐색을 위해 효소의 존재유무 및 활성을 측정할 수 있는 방법에는 미생물을 활용한 탐색법과 배양이 불가(non-culturable)한 메타지놈을 활용한 탐색법이 있다. 전자의 경우, 다양한 균주 컬렉션(Strain collection)이 필수이며, 이들 균주의 직접적인 배양 및 활성 비교를 통한 후보 균주의 선정이 선행되어야 한다. 또한, 많은 노동력 및 연구비가 필요하고 오랜 시간이 소요되는 단점이 있다. 이를 극복하고자 최근에 초고속 탐색 시스템(High-throughput screening system)이 개발 및 활용되고 있으나, 목적하는 유용 효소의 확인을 위해서는 반드시 후보 균주로부터 게놈디엔에이(gDNA)의 정제 및 DNA library 구축, 발현 시스템을 활용한 효소 활성의 재확인 및 선정 library균주의 염기서열 재분석을 통해서만이 목적 유용 효소 자원을 확보할 수 있다. 후자의 경우에는 환경시료로부터 바로 gDNA를 정제한 메타지놈을 활용하여 DNA library를 구축하는 방법이며, 이 또한 발현시스템을 활용한 활성 비교 (Function-based enzyme screening) 또는 디제너러시 프라이머 (degeneracy primers)를 활용한 목적 유용 효소 자원의 DNA를 확보하는 방법 (DNA sequence-based enzme screening)으로 구분된다. 활성에 기초한 효소 탐색법의 경우 메타지놈의 직접적인 클로닝에 의해 라이브러리(Libarary)를 제작한 뒤 발현을 통해 기질과 반응하여 원하는 물질로 변환시키는 효소의 존재를 직접적으로 확인하는 방법이다. 이 방식은 유전자원의 존재를 확실하게 확인할 수 있다는 장점이 있지만, 라이브러리의 제작과 발현과정에 상당한 노동력과 시간이 투자되며, 발현 시스템으로 주로 대장균 시스템을 주로 이용하므로 이종 유전자 발현 시스템(Heterologous gene expression system)의 한계를 가진다. 프로모터(promoter)나 코돈(codon)의 구성 또는 사용이 대장균과 맞지 않는 진화적인 유연관계가 먼 세균의 유전자의 경우 그 발현이 영향을 받을 수도 있으며 이러한 노력과 투자에 비해서 탐색의 효율이 낮다는 단점이 있다. 염기서열에 기초한 효소 탐색법의 경우 목적 효소의 특징적인 motif에 근거하여 제작된 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 목적하는 효소의 염기서열을 확인하는 방법이다. 하지만 이 방법 또한 특정 효소의 motif를 근거로 제작한 프라이머를 사용하므로 확보한 염기서열이 어느 한 효소에 치우쳐서 증폭이 되는 문제가 있으며 목적하는 효소가 들어가 있는 DNA library를 직접적으로 시퀀싱을 통한 염기서열의 확인을 해야한다는 문제가 있다.
중합효소연쇄반응법(PCR)은 유전자 검출 방법 중 하나로 특정 디옥시리보핵산 영역을 시험관 내에서 중합효소에 의해 증폭하는 방법이다. 중합효소연쇄반응법은 수 시간의 효소 반응으로 유전자의 폭발적인 대량 생산을 가능하게 하였으며, 그 응용성이 매우 높은 디옥시리보핵산 검출의 중심 기법이 되었고, 분자 생물학적인 접근을 필요로 하는 모든 생명과학 분야에서 필수적인 기술이 되었다. 한편, "디제너러시(degeneracy)"는 한 종류의 아미노산이 복수의 코돈(codon)에 대응하는 현상을 말한다. 디제너러시로 인하여 어떤 특이한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 염기서열은 결정할 수 없지만, 가능성이 있는 염기서열 모두를 포함하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성할 수 있다. 디제너레이트 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 하면 아미노산 서열정보를 바탕으로 그 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 단편이 얻어질 가능성이 있다. 이와 같은 목적으로 디자인된 프라이머를 디제너레이트 프라이머, 중합효소연쇄반응을 디제너레이트 중합효소연쇄반응법이라고 한다. 이 방법은 기지의 아미노산 서열로부터 그 유전자를 클로닝하는 기술이지만 현재는 풍부하게 축적된 핵산의 일차구조(염기서열) 정보를 기초로 유전자군을 검색할 때 널리 이용된다. 효소의 실질적인 존재 유무나 활성은 알 수 없어서 최종적으로는 발현을 통해 확인을 거쳐야 한다는 단점이 있지만, 노동 집약적인 방법에서 벗어나 메타지놈으로부터 목적하는 DNA를 선별할 수 있다는 장점이 있다.
[선행기술문헌]
대한민국 출원번호 : 1020090130204
이에, 본 발명자들은 산업적 유용 효소 등의 펩타이드 탐색에 있어서 메타지놈 시료의 효용 가치를 신속하고 정확하게 판단하기 위한 방법으로 다양한 효소 등의 펩타이드의 유전자를 대량 증폭하고 증폭된 단편들의 대용량 염기서열의 효율적이고 신속한 분석을 위해 바코드 시퀀스 (bar-code sequence)로 활용할 수 있는 목적 펩타이드에 특이적인 슈퍼패밀리(Superfamily) 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 설계하고 제작하여 중합연쇄반응에 이용하여 메타지놈 시료로부터 대량으로 증폭된 DNA단편들을 차세대 염기서열 분석방법을 통하여 유용 펩타이드의 대용량 염기서열을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명의 일 양상은 목적 유전자의 슈퍼 패밀리 특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 (degenerate) 프라이머 세트를 이용한 메타지놈 정보의 분석 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 목적 유전자의 슈퍼 패밀리 특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 (degenerate) 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 일 양상은
(1) 목적 유전자의 슈퍼 패밀리 특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 (degenerate) 프라이머 세트로 주형인 메타지놈 시료의 유전자를 증폭하는 단계; 및
(2) 상기 유전자의 증폭 산물의 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는, 메타지놈 정보의 분석 방법을 제공한다.
상기 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트는
i) 35% 이상의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
ii) 프라이머와 목적 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상의 상동성을 나타내고;
iii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 1,500 이하이며;
iv) 어닐링의 온도가 70℃ 이하이고;
v) 프라이머의 길이가 30 염기 이하이며;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 40% 이하이며;
vii) 증폭 단편의 크기가 1,000 bp 이하일 수 있다.
더욱 바람직하게 상기 프라이머 세트는 상기 디제너러시 비율이 800 이하;
상기 프라이머 길이가 25 염기 이하; 및
상기 증폭 단편의 크기가 500 bp 이하일 수 있다.
상기 메타지놈 시료는 메타지놈 라이브러리, 상기 메타지놈 라이브러리가 도입된 벡터, 또는 상기 벡터로 형질전환된 세포일 수 있다.
또한, 상기 메타지놈 시료는 토양, 늪지대, 화산, 갯벌, 염전, 담수, 해수, 체액, 소변, 농산물, 수산물 또는 분변일 수 있다.
또한, 상기 목적 유전자는 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 효소, 항생제 내성 유전자, 항균펩타이드, 항진균펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 마커를 코딩하는 것 일 수 있다.
또한, 상기 (2)의 서열 분석 단계는
단일-분자 실시간 시퀀싱 (Single-molecule real-time sequencing), 이온 반도체 시퀀싱 (Ion semiconductor), 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing), SBS (Sequencing by synthesis) (Illumina), SBL (Sequencing by ligation), 및 연쇄 정지반응 (Chain termination)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 메타지놈 정보 분석을 위하여 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트로서,
i) 35% 이상의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
ii) 프라이머와 목적 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상의 상동성을 나타내고;
iii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 1,500 이하이며;
iv) 어닐링의 온도가 70℃ 이하이고;
v) 프라이머의 길이가 30 염기 이하이며;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 40% 이하이며;
vii) 증폭 단편의 크기가 1,000 bp 이하인 것인, 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 디제너러시 비율이 800 이하;
상기 프라이머 길이가 25 염기 이하; 및
상기 증폭 단편의 크기가 500 bp 이하인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 메타지놈의 정보 분석 방법, 및 이에 이용되는 프라이머 세트는 방대한 메타지놈 샘플 효용 가치의 빠른 판별을 위하여 본 발명이 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 슈퍼패밀리-특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 프라이머를 이용하여 메타지놈에서 목적 펩타이드들의 유전정보의 유무를 간단한 방법에 의해 빠르게 탐색할 수 있으므로 다양한 메타지놈 샘플로부터 고속으로 대량의 유용 펩타이드 자원 정보를 수집하는데 사용이 가능하다. 또한, 이러한 본 발명의 방법을 기반으로 하여 목적하는 새로운 펩타이드들의 슈퍼패밀리-특이적 디제너레이트 프라이머 설계 및 제작을 통하여 새로운 펩타이드 유전자를 탐색하는데 사용이 가능하다. 또한, 이러한 방법은 효소뿐만 아니라, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 항생제 내성 유전자, 항균펩타이드, 항진균펩타이드, 올리고펩타이드, 마커 또는 SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) 관련 연구에도 본 발명의 방법이 적용 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 전체모식도인 대용량 메타지놈 정보분석을 통한 초고속 대용량 효소 탐색방법을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 사용된 슈퍼패밀리-특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 프라이머 제작 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 사용된 슈퍼패밀리-특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 프라이머를 이용하여 타겟유전자 증폭을 위한 PCR 최적 조건(A)과 이에 따른 결과(B) 및 음성 대조군(negative control) PCR 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 방법으로 분석한 메타지놈 샘플 중 일 예로 인도네시아 화산지역 메타지놈 샘플의 미생물 커뮤니티(microbial community) 확인을 위한 문(phylum) 및 속(genus) 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 방법으로 각각의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 및 메타지놈 샘플을 사용하여 PCR 수행 후 목적 유전자 확인을 위한 전기영동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 방법으로 분석한 유전자 중 일 예로 피루브산 키나아제 (Pyruvate kinase) 유전자의 메타지놈 샘플별 미생물 phylum 분석을 나타낸 것이다.
본 발명의 일 양상은
(1) 목적 유전자의 슈퍼 패밀리 특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 (degenerate) 프라이머 세트로 주형인 메타지놈 시료의 유전자를 증폭하는 단계; 및
(2) 상기 유전자의 증폭 산물의 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는, 메타지놈 정보의 분석 방법을 제공한다.
상기 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트는
i) 35% 이상의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
ii) 프라이머와 목적 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상의 상동성을 나타내고;
iii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 1,500 이하이며;
iv) 어닐링의 온도가 70℃이하이고;
v) 프라이머의 길이가 30 염기 이하이며;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 40% 이하이며;
vii) 증폭 단편의 크기가 1,000 bp 이하일 수 있다.
바람직하게는 상기 프라이머는
i) 35% 이상 100% 이하의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
ii) 프라이머와 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상 100% 이하의 상동성을 나타내고;
iii) 디제너러시 비율(degeneracy ratio)가 0 이상 1,500 이하이며;
iv) 어닐링의 온도가 30℃ 이상 70℃이하이고;
v) 프라이머의 길이가 4 염기 이상 30 염기 이하이며;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 0% 이상 40% 이하이며;
vii) 증폭 단편의 크기가 100 bp이상 1,000 bp 이하일 수 있다.
더욱 바람직하게 상기 프라이머 세트는 상기 디제너러시 비율이 0 이상 800 이하;
상기 프라이머 길이가 4 이상 25 염기 이하; 및
상기 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 500 bp 이하일 수 있다.
상기 메타지놈 시료는 메타지놈 라이브러리, 상기 메타지놈 라이브러리가 도입된 벡터, 또는 상기 벡터로 형질전환된 세포일 수 있다.
또한, 상기 메타지놈 시료는 토양, 늪지대, 화산, 갯벌, 염전, 담수, 해수, 체액, 소변, 농산물, 수산물 또는 분변일 수 있다.
상기 메타게놈 라이브러리는 자연 또는 특정 지역에 있는 미생물 군집을 채취하고 유전체를 직접 추출하여 벡터에 도입시킴으로써 이루어질 수 있다. 벡터는 사용자의 목적에 따라 플라스미드, 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid), BAC(bacterial artificial chromosome), YAC(yeast artificial chromosome) 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 목적 유전자는 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 효소, 항생제 내성 유전자, 항균펩타이드, 항진균펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 마커를 코딩하는 것일 수 있다.
상기 폴리펩타이드, 펩티드 또는 올리고펩타이드는 펩타이드 결합을 통한 아미노산의 중합체로, 상기 펩타이드는 효소, 항균 펩타이드 또는 마커일 수 있다.
상기 항균 펩타이드는 박테리아, 진균, 프로토조아, 바이러스 등에 대하여 항생 효과를 나타내는 것으로서, 박테리오신, 디펜신, 인돌리시딘, 카텔리시딘, 락소페리신, 라이소자임 등일 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 효소는 카탈라아제 하이드로페록시다아제 II(Catalase HydroperoxidaseII, KatE), 카탈라아제 하이드로페록시다아제 I (Catalase HydroperoxidaseI, CatA), 4- 아미노부티레이트 트랜스아미나아제 (4-aminobutyrate transaminase, GabT), UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 (UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase, WegB), L-아라비노스 아이소머라아제 (L-arabinose isomerase, AraA), 피타아제 (Phytase, Phy), 서브틸리신 (Subtilisin, AprE), 셀룰라아제-1 (Cellulase-1, YtoP), 셀룰라아제-2 (Cellulase-2, EglS), 트리오세포스페이트 아이소머라아제 (Triosephosphate isomerase, TpiA), 피루브산 키나아제 (Pyruvate kinase, PyrK) 등일 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 마커는 질병의 발병, 예후, 유전형, 약제에 대한 민감성 등을 예측 및 진단하기 위한 표지자로서, 그 질환의 종류 등에 대한 제한이 없다.
또한 상기 목적 유전자는 항생제 내성 유전자일 수 있다.
상기 항생제 내성은 미생물이 항생제에 노출되어도 생존할 수 있는 약제 내성으로, 이는 다양한 유전적 변형에 의하여 유발될 수 있다. 상기 항생제로는 암피실린, 아미노글리코시드, 베타락탐, 에리스로마이신, 메시실린, 반코마이신, 퀴놀론계 항생제 등일 수 있으며 그 종류에 한정되지 않는다.
또한, 상기 (2)의 서열 분석 단계는
단일-분자 실시간 시퀀싱 (Single-molecule real-time sequencing), 이온 반도체 시퀀싱 (Ion semiconductor), 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing), SBS (Sequencing by synthesis) (Illumina), SBL (Sequencing by ligation), 및 연쇄 정지반응 (Chain termination)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 메타지놈 정보 분석을 위하여 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트로서,
i) 35% 이상의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
ii) 프라이머와 목적 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상의 상동성을 나타내고;
iii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 1,500 이하이며;
iv) 어닐링의 온도가 70℃이하이고;
v) 프라이머의 길이가 30 염기 이하이며;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 40% 이하이며;
vii) 증폭 단편의 크기가 1,000 bp 이하인 것인, 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 바람직하게는
i) 35% 이상 100% 이하의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
ii) 프라이머와 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상 100% 이하의 상동성을 나타내고;
iii) 디제너러시 비율(degeneracy ratio)가 0 이상 1,500 이하이며;
iv) 어닐링의 온도가 30℃이상 70℃이하이고;
v) 프라이머의 길이가 4 염기 이상 30 염기 이하이며;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 0% 이상 40% 이하이며;
vii) 증폭 단편의 크기가 100 bp이상 1,000 bp 이하일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 더욱 바람직하게는
상기 디제너러시 비율이 0 이상 800 이하;
상기 프라이머 길이가 4 이상 25 염기 이하; 및
상기 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 500 bp 이하일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 프라이머는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉,뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트는 서열번호 1에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 2에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 3에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 4에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 5에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 6에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 7에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 8에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 9에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 10에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 11에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 12에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 17에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 18에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 서열번호 19에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 20에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트; 또는 서열번호 21에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 22에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머 세트를 포함하며, 목적 유전자의 서열에 따라 달라질 수 있는바 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 프라이머의 서열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용한다. 따라서 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타낸다. 또한, R은 G 또는 A, Y는 T 또는 C, M은 A 또는 C, K는 G 또는 T, S는 G 또는 C, W는 A 또는 T, B는 G 또는 C 또는 T, D는 A 또는 G 또는 T, H는 A 또는 C 또는 T, V는 A 또는 G 또는 C, N은 A 또는 G 또는 C 또는 T를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.
또한, 본 발명의 또 다른 양상은 상술한 프라이머 세트를 포함하는 메타지놈 분석 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적의 양은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 구획에 상술한 성분들을 포함한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양상은 하기 조건을 만족하는 염기서열을 선별하는 단계를 포함하는, 메타지놈 정보 분석을 위한 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트의 선별방법을 제공한다:
i) 35% 이상의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적임;
ii) 목적 유전자에 결합하는 부위의 서열이 80% 이상의 상동성을 나타냄;
ii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 1,500 이하임;
iv) 어닐링의 온도가 70℃ 이하임;
v) 프라이머의 길이가 30 염기 이하임;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 40% 이하임; 및
vii) 증폭 단편의 크기가 1,000 bp 이하임.
상기 메타지놈 정보 분석을 위한 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트의 선별방법은 바람직하게는
i) 35% 이상 100% 이하의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적임;
ii) 프라이머와 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상 100% 이하의 상동성을 나타냄;
iii) 디제너러시 비율(degeneracy ratio)가 0 이상 1,500 이하임;
iv) 어닐링의 온도가 30℃ 이상 70℃ 이하임;
v) 프라이머의 길이가 4 염기 이상 30 염기 이하임;
vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 0% 이상 40% 이하임; 및
vii) 증폭 단편의 크기가 100 bp이상 1,000 bp 이하;인 조건을 만족하는 염기서열을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 메타지놈 정보 분석을 위한 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트의 선별방법은 보다 바람직하게는
상기 디제너러시 비율이 0 이상 800 이하임;
상기 프라이머 길이가 4 이상 25 염기 이하임; 및 상기 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 500 bp 이하;인 조건을 만족하는 염기서열을 선별하는 단계를 포함한다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 : Superfamily -specific 디제너레이트 프라이머의 제조
본 발명에서는 목적 펩타이드의 예시로서 Catalase HydroperoxidaseII (KatE), Catalase HydroperoxidaseI (CatA), 4-aminobutyrate transaminase (GabT), UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase (WegB), L-arabinose isomerase (AraA), Phytase (Phy), Subtilisin (AprE), Cellulase1 (YtoP), Cellulase2 (EglS), Triosephosphate isomerase (TpiA), 및 Pyruvate kinase (PyrK) 효소들의 유전자 정보를 사용하였다. 상기 목적 단백질과의 아미노산 상동성이 35%인 것을 조건으로, 각각의 효소 유전자의 아미노산 서열을 얼라인먼트(alignment)하고 상동성이 80% 이상으로 높은 아미노산 서열을 기반으로 하여 이들을 코딩하는 염기 서열을 확인한 후 다시 얼라인먼트 (alignment)를 하였다. 염기서열의 상보성을 기반으로 하여 Superfamily-specific 디제너레이트 프라이머의 디제너러시 비율(1,500 이하, 바람직하게 800이하), 어닐링 온도값(70℃ 이하), 프라이머 길이 (30 염기 이하, 바람직하게 25 염기 이하)를 만족하고, 프라이머 결합 부위 안쪽 염기서열의 상동성이 40% 이하인 낮은 부위 및 증폭 단편의 크기가 1,000 bp 이하(또는 선택적으로 500 bp이하)의 조건을 만족하도록 결정된 염기서열을 바탕으로 하여 디제너레이트 프라이머를 제작하였다.
본 발명은 상기와 같은 과정으로 제작된 서열번호 1에 나타낸 염기서열로 이루어진 포워드 디제너레이트 프라이머 및 서열번호 2에 나타낸 염기서열로 이루어진 리버스 디제너레이트 프라이머로 구성된 상기에 Catalase HydroperoxidaseII (KatE) 유전자 증폭용 프라이머를 제공한다. 여기서, 포워드 디제너레이트 프라이머 및 리버스 디제너레이트 프라이머는 공지된 효소들의 유전자를 증폭하는데 사용된 디제너레이트 프라이머 뿐만 아니라 이와 동일한 방식에 의해 공지된 효소들의 유전자를 증폭할 것으로 추정되는 디제너레이트 프라이머를 모두 포함한다.
또한, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 외에 동일한 방법으로 제조된 디제너레이트 프라이머의 구체적인 예시를 하기에 개시하였다:
catalase Hydroperoxidase II F: 5'- CRC TTY GAY CAY GAR MGB ATY CC-3' (서열번호 1);
catalase Hydroperoxidase II R: 5'- ATG AAR AAS ACH GGV AWG TTR TTB CC-3' (서열번호 2);
catalase Hydroperoxidase I F: 5'- TGG CCN RTH AAG MAR AAR TAY GG-3' (서열번호 3);
catalase Hydroperoxidase I R: 5'- ACR GTY TCY TCR TCR TTC ATN SCC-3' (서열번호 4);
4-aminobutyrate transaminase F: 5'- SCV GAR GCV GTY GAR AAC GC-3' (서열번호 5);
4-aminobutyrate transaminase R: 5'- GCC HTC DCC BTG HAY CGG YTC-3' (서열번호 6);
UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase F: 5'- TCA YGT BGA RGC BGG VYT GMG-3' (서열번호 7);
UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase R: 5'- TG HAY VCC DCC VGA RTC VGT-3' (서열번호 8);
L-arabinose isomerase F: 5'- GAA CYT NAA CCA RDC NGC NCA CGG-3' (서열번호 9);
L-arabinose isomerase R: 5'- CCA GTC DCC TTC NSC NSC RAA NCC-3' (서열번호 10);
Phytase F: 5'- ACN CKK AAA ACV GGY GAR GC-3' (서열번호 11);
Phytase R: 5'- CAR SAG RAA WAT YTC VGY MAG C-3' (서열번호 12);
Subtilisin F: 5'- CAC GGH ACN CAT KKN GCN GG-3' (서열번호 13);
Subtilisin R: 5'- GGA GWB GCC ATD SWB GTD CCG-3'(서열번호 14);
Cellulase-1 F: 5'- ATV TAY GTH ATH RTY GAY TGG C-3' (서열번호 15);
Cellulase-1 R: 5'- RTG HGT DSC BGH ATA RAA ATG-3' (서열번호 16);
Cellulase-2 F: 5'- GSN CAY WTG GAY GAR RTS GG-3'(서열번호 17);
Cellulase-2 R: 5'- CCN AHY TCY TCC TGN ACN GT-3' (서열번호 18);
Triosephosphate isomerase F: 5'- GGN GCV TMY ACH GGY GAR-3' (서열번호 19);
Triosephosphate isomerase R: 5'- GC CCA NAY NGG YTC RTA VGC-3 '(서열번호 20);
Pyruvate kinase F: 5'- CGN HTN AAC TTY TCS CAY GG-3' (서열번호 21);
Pyruvate kinase R: 5'- CAT BSA STC DAG CAT YTG HGT CGC-3' (서열번호 22).
따라서, 본 발명은 효소에 존재하는 보존 영역의 염기서열에 상보적인 정방향 디제너레이트 프라이머와 역방향 디제너레이트 프라이머 쌍을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 디제너레이트 프라이머는 특정 효소 superfamily에 속하는 효소 유전자들의 아미노산 서열 분석을 통하여 상동성이 높은 부분(80% 이상)을 선택적으로 증폭하여 검출하기 위한 것이며, 특정 효소 유전자의 유전자의 상보성이 높은 서열에 결합하게 된다.
상기 예시한 11 쌍의 디제너레이트 프라이머들을 이용하여 임의의 균주 및 메타지놈에 위에서 언급한 11가지 효소들이 존재하는지 여부를 확인할 수 있다.
실시예 1: Superfamily -specific 디제너레이트 프라이머의 설계 및 제작
기존에 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈II (KatE)를 생산하는 것으로 알려진 다양한 도메인(Domain)별 대표적인 미생물들의 유전자를 데이터베이스에서 검색한 후 선정된 유전자의 아미노산 서열을 최소 5종류 이상 사용하여 얼라이먼트를 수행하였다. 상기 펩타이드에서 상동성이 35% 이상인 것을 1 차 선별하였다.
다수의 유전자간에 상동성이 80% 이상으로 높은 서열을 2 차 선정하여 디제너레이트 프라이머 설계를 위한 구역으로 선정하였다. 선정된 상동성이 높은 아미노산 서열을 다시 염기서열로 변환한 후, 디제너레이트 프라이머 제작시 중요한 요소인 디제너러시 비율(1,500 이하, 바람직하게 800 이하), 어닐링 온도값 (70℃ 이하), 프라이머 길이(30 염기이하, 바람직하게 25 염기이하) 조건을 한정하고, 프라이머 결합 부위 안쪽 염기서열의 상동성이 40% 이하로 낮으며, 증폭단편의 크기가 1,000 bp 이하(바람직하게 500 bp이하)가 되도록 결정된 염기서열을 바탕으로 하여 디제너레이트 프라이머를 제작하였다. 다른 공지 효소를 검출하기 위한 나머지 디제너레이트 프라이머들 또한 상기의 방법으로 설계 및 제작하였다.
디제너레이트 프라이머 설계의 일 예를 도 2에 나타내었다.
실시예 2: 중합효소연쇄반응 ( PCR ) 수행 및 증폭된 유전자 단편의 확인
제작한 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈II (KatE) 탐색용 디제너레이트 프라이머들 (서열번호 1; 5'-CRC TTY GAY CAY GAR MGB ATY CC-3'와 서열번호 2; 5'-ATG AAR AAS ACH GGV AWG TTR TTB CC-3')의 목적 유전자와의 결합 유무를 확인하기 위하여, 본 디제너레이트 프라이머 제작을 위해 KatE 유전자의 아미노산 서열이 사용된 대장균 MG1655의 게놈 디엔에이(genomic DNA)를 주형으로 하여 중합연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 나머지 디제너레이트 프라이머들 또한 대장균 MG1655의 게놈 디엔에이(genomic DNA)를 주형으로 하여 중합연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 예외적으로 서브틸리신과 셀룰레이스 탐색용 디제너레이트 프라이머들의 목적 유전자와의 결합 유무를 확인하기 위해선, 대장균 MG1655이 아닌 바실러스 서브틸리스 168의 게놈 디엔에이(genomic DNA)를 주형으로 하여 중합연쇄반응(PCR)을 실시하였다.
이용된 PCR 반응액은 다음과 같다: 100 ng 주형 (수득한 대장균 MG1655 및 바실러스 서브틸리스 168의 게놈 DNA), 12.5 ㎕ EmeraldAmp GT PCR Master Mix, 0.2 μM(최종 농도) 각 Forward 및 Reverse 디제너레이트 프라이머, 멸균 증류수를 포함하는 최종 25 ㎕의 용액. PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, X℃(54℃ 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈II, 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈I; 58℃ 가바 트렌스아미네이즈, UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머레이즈, L-아라비노즈 아이소머레이즈; 52℃ 파이테이즈, 셀룰레이스2; 56℃ 서브틸리신, 파이루베이트 카이네이즈, 51℃ 트리오스포스페이트 아이소머레이즈, 47℃ 셀룰레이스1) 에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장으로 구성된 사이클을 30회 수행하였다. PCR 산물을 도 3 과 같이 확인하였다.
도 3 에 나타난 바와 같이, 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. 대장균 MG1655와 바실러스 서브틸리스 168에서 예상했던 크기의 증폭된 유전자 단편(약 280 bp 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈II; 약 350 bp 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈I; 약 300 bp 가바 트렌스아미네이즈; 약 540 bp UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머레이즈; 약 570 bp L-아라비노즈 아이소머레이즈; 약 400 bp 파이테이즈; 약 490bp 서브틸리신; 약 335 bp 셀룰레이스; 약 300 bp 트리오스포스페이트 아이소머레이즈, 약 760 bp 파이루베이트 카이나제)을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 개시된 조건이 최적 조건임을 확인하기 위하여, 음성대조군으로서 PCR 반응 조건 중 어닐링 온도를 70℃ 이상으로 설정하여 PCR을 실시하였다. 그 결과, 도 3C에 나타낸 바와 같이, 어닐링 온도가 70℃ 이상일 때는, 목적하는 단편들이 증폭되지 않는 것을 확인하였다.
실시예 3: 증폭된 유전자의 염기서열 분석
상기 PCR 산물을 Qiaquick Gel extraction kit (QIAGEN, 독일)를 사용하여 정제한 후, pGEM T-easy 벡터(Promega, 미국)에 라이게이션시켜 대장균 MG1655의 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈 II, 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈 I, 가바 트렌스아미네이즈, UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머화효소, L-아라비노즈 아이소머레이즈, 파이테이즈, 서브틸리신, 셀룰레이스, 트리오스포스페이트 아이소머레이즈, 파이루베이트 카이나제를 암호화하는 유전자가 포함된 벡터pGEM T-katE, catA, gabT, wegB, araA, phy, aprE, ytoP, eglS, tpiA, pyrK를 제작하였다.
또한, 상기 재조합 벡터를 형질전환을 위해 준비된 100 ㎕의 대장균 DH5 (competent cell)와 혼합한 후, 42℃에서 90초간 열충격 (heat-shock)으로 상기 벡터가 도입된 형질전환 대장균을 제조하고, 암피실린 100 ㎍/ml을 포함하는 LB배지에 도말하여 형질전환된 대장균을 선별하였다. 플라스미드 DNA를 회수하기 위해 플라스미드 추출 키트 (Biofact, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하고 염기서열 분석을 Solgent 회사(한국)에 의뢰하였다. 염기서열을 분석한 결과, 대장균 MG1655와 바실러스 서브틸리스 168에 포함된 상기 효소들의 유전자와 PCR 산물이 동일한 유전자임을 확인하였다.
실시예 4: 메타지놈에 중합효소연쇄반응 ( PCR ) 수행 및 증폭된 유전자 단편의 확인
제작한 디제너레이트 프라이머들의 목적 유전자와의 결합능을 확인한 후 메타지놈을 주형으로 활용하여 목적 유전자의 탐색을 위한 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 사용된 PCR 반응액은 다음과 같다: 100 ng 주형 (수득한 Soil A 메타지놈 DNA), 12.5 ㎕ EmeraldAmp GT PCR Master Mix, 0.2 μM(최종 농도) 각 Forward 및 Reverse 프라이머, 멸균 증류수를 포함하는 최종 25 ㎕의 용액. PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, X℃(54℃ 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈II, 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈I; 58℃ 가바 트렌스아미네이즈, UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머레이즈, L-아라비노즈 아이소머레이즈; 52℃ 파이테이즈, 셀룰레이스2; 56℃ 서브틸리신, 파이루베이트 카이네이즈, 51℃ 트리오스포스페이트 아이소머레이즈, 47℃ 셀룰레이스1) 에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장으로 구성된 사이클을 30회 수행하였다. PCR 산물을 도 5와 같이 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. Lane 1이 암호화 유전자의 PCR 증폭산물이다.
실시예 5: 메타지놈에서 증폭된 유전자의 염기서열 분석
8 종류의 메타지놈을 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응에서 다양한 목적 유전자의 증폭 양상을 확인하였다. 차세대 염기서열 분석장비의 활용을 하기에 앞서, 메타지놈을 주형으로 한 PCR에서도 제작한 디제너레이트 프라이머들이 목적 유전자들과의 결합능이 있는지를 확인하기 위하여 Soil A 메타지놈을 주형으로 사용하여 PCR을 수행하여 획득한 증폭단편들(약 300 bp 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈II, 약 350 bp 카탈레이즈 하이드로펄옥시데이즈I, 약 300 bp 가바 트렌스아미네이즈)을 Qiaquick Gel extraction kit (QIAGEN, 독일)를 사용하여 정제한 후, pGEM T-easy 벡터에 클로닝하여 일반적인 sanger sequencing을 통한 염기서열 분석 결과, 상기의 목적 효소 유전자들이 검출되는 것은 물론이거니와 상기의 효소들의 유전자를 포함하고 있는 다양한 균주들이 검색되는 것을 NCBI 웹사이트의 Blast 검색결과를 통하여 확인할 수 있었다.
상기의 실험을 통하여 메타지놈으로부터 다양한 목적 유전자의 정보 수집이 가능한 것을 확인한 후 8 종류의 메타지놈을 주형으로 하여 PCR을 통하여 획득한 증폭 단편들을 차세대 염기서열 분석장비 활용에 필요한 충분한 양을 확보하기 위해 다시 한번 획득한 증폭 단편들을 주형으로 사용하고 각각의 효소에 맞는 Superfamily-specific 디제너레이트 프라이머를 사용하여 실시예 4의 PCR 수행 조건으로 PCR을 재수행하였다. 증폭된 PCR산물을 회수한 후 메타지놈별로 증폭된 PCR산물을 모아서 총 8개의 샘플로 차세대 염기서열 분석장비 (Miseq)를 활용하여 염기서열을 분석하였다. 하나의 메타지놈에 여러 종류의 PCR 산물이 혼합되어 있기에 염기서열 결과 분석을 위하여 Superfamily-specific 디제너레이트 프라이머의 염기서열을 barcode sequences로 사용하여 염기서열을 분리, 분석을 수행하였다.
하기 표 1 및 표 2는 본 발명에 따른 메타지놈 정보 분석방법을 활용하여 다수의 메타지놈 샘플의 유전자 정보를 분석한 결과이다.
[표 1]
분석 메타지놈 샘플의 microbial community 분석에 따른 phylum 및 genus 개수
Figure PCTKR2016006792-appb-I000001
[표 2]
분석 메타지놈 샘플에 따른 타켓 효소별 phylum 및 genus 개수 분석결과
Figure PCTKR2016006792-appb-I000002
또한, 본 발명에 따른 메타지놈 유전자 정보 분석에 대한 방법을 도 1에 도식화하였다. 도 1은 대용량 메타지놈 정보분석을 통한 초고속 대용량 효소 탐색방법을 나타낸 것이다.
이상의 실험결과를 통하여, 본 발명에 따른 메타지놈의 정보 분석 방법, 및 이에 이용되는 프라이머 세트는 방대한 메타지놈 샘플 효용 가치의 빠른 판별을 위하여 본 발명이 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 슈퍼패밀리-특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 프라이머를 이용하여 메타지놈에서 목적 펩타이드들의 유전정보의 유무를 간단한 방법에 의해 빠르게 탐색할 수 있으므로 다양한 메타지놈 샘플로부터 고속으로 대량의 유용 펩타이드 자원 정보를 수집하는데 사용이 가능하다. 또한, 이러한 본 발명의 방법을 기반으로 하여 목적하는 새로운 펩타이드들의 슈퍼패밀리-특이적 디제너레이트 프라이머 설계 및 제작을 통하여 새로운 펩타이드 유전자를 탐색하는데 사용이 가능하다. 또한, 이러한 방법은 효소뿐 만 아니라, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 항생제 내성 유전자, 항균펩타이드, 항진균펩타이드, 올리고펩타이드, 마커 또는 SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) 관련 연구에도 본 발명의 방법이 적용될 수 있다.

Claims (10)

  1. (1) 목적 유전자의 슈퍼 패밀리 특이적 (superfamily-specific) 디제너레이트 (degenerate) 프라이머 세트로 주형인 메타지놈 시료의 유전자를 증폭하는 단계; 및
    (2) 상기 유전자의 증폭 산물의 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는, 메타지놈 정보의 분석 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트는
    i) 35% 이상 100%이하의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
    ii) 프라이머와 목적 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상 100% 이하의 상동성을 나타내고;
    iii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 0 이상 1,500 이하이며;
    iv) 어닐링의 온도가 30℃ 이상 70℃ 이하이고;
    v) 프라이머의 길이가 4 염기 이상 30 염기 이하이며;
    vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 0% 이상 40% 이하이며;
    vii) 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 1,000 bp 이하인 것인, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 프라이머 세트는 상기 디제너러시 비율이 0 이상 800 이하; 상기 프라이머 길이가 4 이상 25 염기 이하; 및 상기 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 500 bp 이하인 것인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 메타지놈 시료는 메타지놈 라이브러리, 상기 메타지놈 라이브러리가 도입된 벡터, 또는 상기 벡터로 형질전환된 세포인 것인, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 메타지놈 시료는 토양, 늪지대, 화산, 갯벌, 염전, 담수, 해수, 체액, 소변, 농산물, 수산물 또는 분변인 것인, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 목적 유전자는 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 효소, 항생제 내성 유전자, 항균펩타이드, 항진균펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 마커를 코딩하는 것인, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 (2)의 서열 분석 단계는
    단일-분자 실시간 시퀀싱 (Single-molecule real-time sequencing), 이온 반도체 시퀀싱 (Ion semiconductor), 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing), SBS (Sequencing by synthesis), SBL (Sequencing by ligation), 및 연쇄 정지반응 (Chain termination)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것인, 방법.
  8. 메타지놈 정보 분석을 위한 목적 유전자의 슈퍼패밀리 특이적 디제너레이트 프라이머 세트로서,
    i) 35% 이상 100%이하의 아미노산 상동성을 나타내는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적이고;
    ii) 프라이머와 목적 유전자가 결합하는 부위의 서열이 80% 이상 100% 이하의 상동성을 나타내고;
    iii) 디제너러시 비율 (degeneracy ratio)이 0 이상 1,500 이하이며;
    iv) 어닐링의 온도가 30℃ 이상 70℃ 이하이고;
    v) 프라이머의 길이가 4 염기 이상 30 염기 이하이며;
    vi) 프라이머 결합부위 안쪽의 상동성이 0% 이상 40% 이하이며;
    vii) 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 1,000 bp 이하인 것인, 프라이머 세트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 프라이머 세트는 상기 디제너러시 비율이 0 이상 800 이하; 상기 프라이머 길이가 4 이상 25 염기 이하; 및 상기 증폭 단편의 크기가 100 bp 이상 500 bp 이하인 것인, 프라이머 세트.
  10. 제8항의 프라이머 세트를 포함하는 메타지놈 분석 키트.
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