WO2016190642A1 - Vegf 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Vegf 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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liposome
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정환정
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전북대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of ischemic diseases, including liposomes carrying peptides derived from VEGF (Vasecular endothelial growth factor), and administering the pharmaceutical composition to a subject suspected of ischemic disease.
  • ischemic diseases including liposomes carrying peptides derived from VEGF (Vasecular endothelial growth factor), and administering the pharmaceutical composition to a subject suspected of ischemic disease.
  • the present invention relates to a kit for evaluating ischemic diseases, including the use of the liposomes and the delivery of the liposomes carrying the VEGF-derived peptides to the ischemic lesions, and the degree of release and absorption of the supporting substances.
  • Liposomes having a particle distribution of 50 to 200 nm having an average particle size of 100 nm and whose surface is modified with polyethylene glycol can increase the absorption of VEGF-derived peptides, and thus can be usefully used as a composition for preventing and treating ischemic diseases.
  • the kit provided in the present invention is labeled with a radioactive compound containing radionuclides and radionuclides in two forms of liposomes prepared in a form in which chelate is bound to PE, which is a structural component of liposomes, and VEGF.
  • Derived peptides can be usefully used to evaluate the degree of delivery and the release and absorption of the supported liposomes.
  • Ischemic disease includes cardiovascular disease caused by blockage of blood flow, and ischemic myocardial ischemia and ischemic peripheral vascular disease.
  • cardiovascular disease is competing for the death level in Korea, and cerebrovascular disease and lower limb ischemia disease are among the three major ischemic diseases.
  • the incidence of ischemic disease is increasing in Korea, which has entered the age of westernization and aging of lifestyle, and research on treatment is being actively conducted.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • angiogenic recombinant protein such as VEGF
  • problems 1) Injected angiogenic proteins into other tissues
  • Ad.VEGF adenovirus gene transporter
  • the present invention as a result of intensive efforts to increase the VEGF absorption amount to increase the therapeutic effect of the ischemic disease, it has a particle distribution of 50 to 200 nm size, which is an average particle size of 100 nm, and the surface is modified with polyethylene glycol.
  • a liposome loaded with a VEGF-derived peptide of 2.5 ⁇ 10 -10 M or more as a drug carrier it was confirmed that an increase in VEGF absorption in ischemic lesions increases the therapeutic effect of ischemic diseases, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a liposome carrying a VEGF-derived peptide that can increase the therapeutic effect on ischemic diseases.
  • the present invention includes a liposome loaded with a VEGF-derived peptide, the liposome has a surface modified with polyethylene glycol, the average particle size of 90 to 110 nm, 50 to 200 nm particle distribution It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic disease, characterized in that it has a.
  • the VEGF-derived peptide may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the VEGF-derived peptide may include liposomes loaded at a concentration of 2.5 ⁇ 10 ⁇ 10 M or more.
  • the liposome is (a) L- ⁇ -phosphatidylcholine (Leg PC), cholesterol (cholesterol; CH) and polyethylene glycol (PEG2000) is combined PEG2000-DSPE ⁇ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N [methoxy (polyethyleneglycol) -2000] was dissolved in an organic solvent and then evaporated to give a thin surface of lipid modified with polyethylene glycol.
  • Leg PC L- ⁇ -phosphatidylcholine
  • cholesterol cholesterol
  • CH polyethylene glycol
  • PEG2000 polyethylene glycol
  • obtaining a film (b) completely hydrating the obtained thin layer in a solution containing VEGF-derived peptides to prepare liposomes carrying VEGF-derived peptides; (c) extruding the liposomes through the porous membrane to obtain liposomes bearing VEGF-derived peptite having an average particle size of 90 to 110 nm and having a particle distribution of 50 to 200 nm.
  • VEGF-derived peptite having an average particle size of 90 to 110 nm and having a particle distribution of 50 to 200 nm.
  • step (a) L- ⁇ -phosphatidyl choline, cholesterol and PEG2000-DSPE can be dissolved in a ratio of 50:40:10.
  • the organic solvent of step (a) may be a mixed solvent of chloroform and methanol.
  • the evaporation of step (a) may be carried out at 45 to 55 °C for 3 hours to 5 hours.
  • the hydration process of step (b) may be performed for 1 hour to 2 hours at 35 to 39 °C in PBS buffer solution containing the VEGF-derived peptide.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol may be 1800g / mol to 2200g / mol.
  • the ischemic disease may be one or more selected from the group consisting of myocardial infarction, middle cerebral artery stenosis disease, lower limb ischemia and cerebral infarction.
  • the composition may be in an injection form.
  • the present invention also provides a liposome carrying (a) a VEGF-derived peptide; And (b) a liposome to which a VEGF-derived peptide is supported and to which a chelate having a functional group capable of labeling a radionuclide is attached to the PE of the liposome; Wherein the liposome of (a) is labeled with a radioactive compound comprising a radionuclide, and the liposome of (b) is labeled with a radionuclide, the delivery and support of a liposome carrying a VEGF-derived peptide to an ischemic lesion Kits for evaluating the release and absorption of materials are provided.
  • VEGF-derived peptide of the present invention the average particle size of 90 to 110 nm, having a particle distribution of 50 to 200 nm, the surface for the prevention or treatment of ischemic diseases including liposomes modified with polyethylene glycol
  • the composition can significantly increase VEGF uptake compared to VEGF alone treatment, thereby effectively treating ischemic diseases such as myocardial infarction, middle cerebral artery stenosis disease, lower limb ischemia and cerebral infarction.
  • the liposome kit including DTPA-PE provided in the present invention is useful for evaluating the delivery of liposomal-derived liposomes to the ischemic lesions of the liposomes carrying the VEGF-derived peptides and the release and absorption of the supporting substances. Can be used.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF-derived peptide of the present invention a liposome carrying a control (PBS), a VEGF-derived peptide (VEGF) and a VEGF-derived peptide of the present invention through an apical puncture of a rat inducing myocardial infarction disease ⁇ PEG-LP (VEGF) ⁇ After injecting each, after one week the heart perfusion (perfusion) change is measured data.
  • PBS control
  • VEGF VEGF-derived peptide
  • VEGF-derived peptide of the present invention After injecting each, after one week the heart perfusion (perfusion) change is measured data.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF-derived peptide of the present invention a liposome carrying a control (PBS), a VEGF-derived peptide (VEGF), and a VEGF-derived peptide of the present invention through an apical puncture of a rat inducing myocardial infarction disease ⁇ PEG-LP (VEGF) ⁇
  • ischemia tissue was extracted one week later and the total vessel count measured through immunostaining (total vessel count).
  • FIG. 3 is a diagram showing an epithelial puncture of liposomes labeled with 99 mTc-HMPAO in order to compare VEGF intake of liposomes (PEG-LP (VEGF)) carrying VEGF-derived peptides of the present invention in mice with a myocardial infarction disease model. Gamma image was observed after 30 minutes and 90 minutes after injection through apical puncture.
  • PEG-LP VEGF
  • Figure 4 is a dynamic light scattering analyzer (dynamic light) which is a particle size analysis device prepared by preparing the average particle size of the liposome ⁇ PEG-LP (VEGF) ⁇ loaded with the VEGF-derived peptide of the present invention to 100 nm, 300 nm and 600 nm scattering; particle distribution data as measured by DLS, Malvern Instruments Limited, Melvern, UK).
  • VEGF liposome ⁇ PEG-LP
  • FIG. 5 shows different amounts of liposomes (PEG-LP (VEGF)) loaded with VEGF-derived peptides of the present invention, labeled with 99 mTc-HMPAO, and injected into mice with a myocardial infarction disease model, followed by 90 minutes.
  • This data shows the amount of absorption in the heart with ischemic lesion from the gamma image.
  • FIG. 6 is labeled with liposomes ⁇ PEG-LP (VEGF) ⁇ loaded with VEGF-derived peptides of the present invention with 99 mTc-HMPAO and 99 mTc-DTPA, respectively, and injected into mice having a myocardial infarction disease model, followed by 90 minutes. The data was compared from the gamma image of the absorption rate in the heart with ischemic lesion.
  • VEGF liposomes ⁇ PEG-LP
  • VEGF myocardial infarction disease injecting liposomes
  • Figure 8 is injected into each of the mice with myocardial infarction disease-containing liposomes (PEGLP (VEGF) ⁇ loaded with different concentrations of VEGF-derived peptides, after one week to extract the heart with ischemic lesions measured by immunostaining Data showing the total vessel count.
  • PEGLP myocardial infarction disease-containing liposomes
  • VEGF VEGF-derived peptide
  • PEG-LP PEG-LP
  • VEGF-derived peptide of the present invention PEGLP (VEGF)
  • FIG. 11 is a week after the injection of the control (PBS) and the VEGF-derived peptide liposomes (PEGLP) (VEGF), respectively, through a common carotid artery of a rat with a middle cerebral artery stenosis model. It is a data showing the total vessel count measured by immunostaining by extracting the brain with ischemic lesions.
  • PBS control
  • PEGLP VEGF-derived peptide liposomes
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the method of administering angiogenic recombinant proteins such as VEGF has a problem of administering a high amount of high-purity protein or continuous administration at a small dose. Therefore, there is a need to establish a delivery system that can release angiogenic proteins at the injection site and release them slowly or increase the absorption in lesion tissue.
  • the present invention sought to solve the above-mentioned problems by providing a composition for the prevention or treatment of ischemic diseases, including liposomes carrying VEGF-derived peptides.
  • This provides liposomes whose surface is modified with polyethylene glycol, has a particle distribution of 50 to 200 nm, and carries VEGF-derived peptides having an average particle size of 90 to 110 nm, and the liposomes increase the absorption of VEGF-derived peptides. Since it can be made, it can be usefully used as a composition for the prevention and treatment of ischemic disease.
  • the present invention includes liposomes carrying VEGF-derived peptides, wherein the liposomes have a surface modified with polyethylene glycol and have an average particle size of 90 to 110 nm and a particle distribution of 50 to 200 nm. It includes a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic diseases.
  • the VEGF-derived peptide may be used commercially available without limitation, and preferably, a peptide having an amino acid sequence of Ac-MRIKPHQGQHI-NH2 (SEQ ID NO: 1) may be used.
  • the liposome comprises (a) L- ⁇ -phosphatidylcholine (Egg-PC), cholesterol (cholesterol; CH) and PEG2000-DSPE ⁇ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N dissolving [methoxy (polyethyleneglycol) -2000] in an organic solvent and then evaporating to obtain a lipid thin film whose surface is modified with polyethylene glycol;
  • liposomes containing VEGF-derived peptite having an average particle size of 90 to 110 nm and having a particle distribution of 50 to 200 nm; It may be prepared by a method comprising a.
  • the L- ⁇ -phosphatidyl choline, cholesterol, and PEG2000-DSPE are mixed at a ratio of 50:40:10 in step (a), and the step (a)
  • the organic solvent may be a solvent used in general, without limitation, may be a solvent in the form of a single or mixed, such as alcohol, methanol, ethyl acetate, chloroform, butanol or hexane, preferably a mixed solvent of chloroform and methanol, More preferably, a solvent in which chloroform and methanol are mixed at 7: 3 may be used.
  • the evaporation in the step (a) may be performed for 3 to 5 hours at 45 to 55 °C.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol of step (a) is 1800g / mol to 2200g / mol, preferably polyethylene glycol having a molecular weight of 2000 g / mol can be used, commercially available that can be used without limitation.
  • the hydration process may be carried out for 1 to 2 hours at 35 to 39 °C, preferably liposomes by hydrating the lipid thin layer in a PBS buffer solution containing VEGF-derived peptides.
  • the extrusion may be performed using a polycarbonate membrane having a pore size of 400 nm, 200 nm, 100 nm and 50 nm, and after the extrusion process, to remove VEGF not contained in liposomes. Size exclusion chromatography may additionally be performed.
  • a comparative experiment was performed with a VEGF-derived peptide alone treatment group to determine whether the liposome loaded with the VEGF-derived peptide prepared by the above method increases the therapeutic efficacy for ischemic disease. And shown in FIG. 2.
  • the VEGF-derived peptide-only group compared with the control group injected with the PBS solution showed that the improvement of perfusion and the total number of blood vessels did not significantly increase, whereas the VEGF-derived peptide was not significantly increased.
  • the supported liposome (LP-VEGF) treated group was found to have a statistically significant improvement in perfusion and an increase in the total number of blood vessels compared to the control group.
  • FIG. 3 shows a change in the amount of absorption in ischemic lesions over time from the gamma image obtained by labeling and injecting a VEGF-derived peptide with liposomes labeled with 99m Tc-HMPAO. It was found to be appropriate to compare the results 90 minutes after liposome injection to exclude the effect and compare the results by absorption in ischemic lesions.
  • Figure 4 shows the particle distribution for each of the liposomes (PEG-LP (VEGF)) loaded with a VEGF-derived peptide having an average particle size of 100 nm, 300 nm and 600 nm, 50 when the average particle size is 100 nm It was confirmed to have a particle distribution of ⁇ 200 nm.
  • PEG-LP VEGF
  • Figure 5 confirms the effect of the liposome size of the VEGF-derived peptide on the liposome uptake in ischemic lesions, when the average particle size of the liposome is large, it was confirmed that the amount of absorption in the ischemic lesion is rapidly reduced, the average It was confirmed that the highest absorption was found when the particle size was around 100 nm.
  • the average particle size of the liposome is less than 50 nm, there is a problem in that the VEGF loading rate is very low and the VEGF supported by the liposome structure rupture is hard to be released, thereby lowering the therapeutic effect.
  • the amount of liposomal uptake was compared by varying the radiolabeling method to confirm the degree of absorption of VEGF or liposomes actually supported on liposomes in ischemic lesions.
  • the difference between the 99m Tc-HMPAO labeling value and the 99m Tc labeling value using DTPA is 99m Tc-HMPAO released from liposomes. It can be seen that the high rise, the absorption of liposomes in the ischemic lesion was confirmed. This means that VEGF actually loaded on liposomes is released at a high rate in ischemic lesions and liposomes are absorbed in ischemic lesions to increase the therapeutic effect of ischemic lesions.
  • the VEGF-derived peptide may be included at a concentration of 2.5 ⁇ 10 -10 M or more, and as shown in FIGS. 7 to 9, when the concentration of the VEGF-derived peptide supported on the liposome is observed differently, perfusion No significant effect was observed by the difference in the concentration of VEGF-derived peptides supported on liposomes, both for the improvement effect and the increase in total blood vessel number.
  • VEGF-derived peptides having a concentration of 2.5 ⁇ 10 -10 M or more of the present invention are supported on liposomes, have a particle distribution of 50 to 200 nm, an average particle size of 90 to 110 nm, and the surface of which is modified with polyethylene glycol. Liposomes have been shown to show an effective therapeutic effect in ischemic lesions.
  • ischemia refers to a condition in which the blood flow, which is a source thereof, is absolutely or relatively insufficient for oxygen demand of tissues and organs, and ischemia of major organs due to atherosclerotic vascular stenosis is severe such as myocardial infarction and cerebral infarction. Cause of the disease.
  • ischemic disease may include without limitation all diseases caused by the ischemic state, and specifically one selected from the group consisting of myocardial infarction, middle cerebral artery stenosis disease, lower limb ischemia and cerebral infarction. It may be more than, but is not limited thereto.
  • the liposome loaded with the VEGF-derived peptide of the present invention was confirmed to be very effective in treating myocardial infarction through the results of FIGS. 1 to 9.
  • the treatment effect for ischemic diseases other than myocardial infarction disease as shown in Figure 10 to 12 confirmed the therapeutic effect on the middle cerebral artery stenosis (MCAO), VEGF
  • the liposome (LP-VEGF) -treated group loaded with the derived peptide was found to have a statistically significant improvement in perfusion and an increase in the total number of blood vessels compared to the control group.
  • the liposomes carrying the VEGF-derived peptides of the present invention showed a high therapeutic effect not only in myocardial infarction disease but also in the middle cerebral artery stenosis disease. That is, the liposomes carrying the VEGF-derived peptides have a therapeutic effect on various ischemic lesions. it means.
  • composition for the prevention or treatment of ischemic diseases including liposomes carrying VEGF-derived peptides of the present invention, may contain one or more known active ingredients having a therapeutic effect for ischemic diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier other than the active ingredient.
  • Such carriers include, but are not limited to, any of the standard pharmaceutical carriers used in known formulations such as sterile solutions, tablets, coated tablets and capsules.
  • Such carriers are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, poly Vinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, polyvinylpyrrolidone, dextrin, milk, certain types of clays, stearic acid, talc, vegetable oils (e.g.
  • Edible oils such as edible oil, cottonseed oil, coconut oil, almond oil, peanut oil), neutral fatty acid glycerides, mineral oil, petrolatum, animal fats and oils, cellulose derivatives (e.g. crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, Excipients such as methylcellulose), or other known excipients.
  • Such carriers may also include antioxidants, wetting agents, viscosity stabilizers, flavoring agents, color additives and other ingredients.
  • the route of administration of the composition of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the composition of the present invention may be administered daily or intermittently before the procedure, the number of administrations per day may be administered once or divided into two to three times, the method and dosage of the composition is not limited thereto. In consideration of the type of the disease, the dosage form, and the therapeutic effect, it may be appropriately administered according to various methods commonly known to those skilled in the art.
  • Liposomes carrying VEGF-derived peptides according to the present invention can be administered in the form of injections for the treatment of ischemic diseases. Specifically, liposomes carrying the VEGF-derived peptide of the present invention can be directly injected into a lesion, or injected into an artery or vein in close proximity to the lesion and delivered to the lesion.
  • Compositions of the invention for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous liquids, dispersants, suspensions, or emulsions, as well as sterile powders that are reconstituted immediately before use as sterile liquids or suspensions.
  • Suitable sterile aqueous and non-aqueous carriers, diluents, solvents or vehicles include water, physiological saline, ethanol, polyols (e.g. glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and mixtures thereof, vegetable oils (e.g. Olive oil), injectable organic esters (eg ethyloleate).
  • polyols e.g. glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • vegetable oils e.g. Olive oil
  • injectable organic esters eg ethyloleate
  • coatings such as lecithin can be used to maintain a suitable specific size, and surfactants can be used to maintain proper fluidity.
  • compositions of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the treatment of ischemic diseases.
  • the present invention also provides a method for treating ischemic disease comprising administering the pharmaceutical composition to a subject suspected of ischemic disease.
  • an individual suspected of ischemic disease means a mammal including a mouse, a livestock, etc., including a human who may develop or develop an ischemic disease, but the subjects that can be treated with the pharmaceutical composition of the present invention include without limitation. do.
  • a pharmaceutical composition comprising a liposome carrying a VEGF-derived peptide of the present invention to an individual suspected of ischemic disease, the individual can be treated efficiently. Ischemic diseases are as described above.
  • the term "administration" refers to the introduction of the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suspected of ischemic disease by any suitable method, and the route of administration is through various routes of oral or parenteral as long as the target tissue can be reached. May be administered.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved and whether other agents are used in some cases, the age, weight, general state of health, sex of the patient. And various factors and similar factors well known in the medical art, including diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or concurrent with the specific composition.
  • the present invention also provides a preparation of a medicament for treating ischemic diseases of liposomes, in which a VEGF-derived peptide is supported, the surface is modified with polyethylene glycol, and has an average particle size of 90 to 110 nm and a particle distribution of 50 to 200 nm. Provides a use for
  • the present invention also provides a liposome carrying (a) a VEGF-derived peptide; And (b) a liposome to which a VEGF-derived peptide is supported and to which a chelate having a functional group capable of labeling a radionuclide is attached to the PE of the liposome; Wherein the liposome of (a) is labeled with a radioactive compound comprising a radionuclide, and the liposome of (b) is labeled with a radionuclide, the delivery and support of a liposome carrying a VEGF-derived peptide to an ischemic lesion Kits for evaluating the release and absorption of materials are provided.
  • the chelate may be at least one selected from the group consisting of DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid), SHPP ( N -succinimidyl-3- [4-hydroxyphenyl] propionate), histidine, tyrosine and tyrosine, but is not limited thereto. No, depending on the radionuclide.
  • the liposomes can be labeled with various radionuclides or compounds containing the radionuclides suitable for detection by a nuclear medical device.
  • the radionuclide that may be used may be, for example, one or more selected from the group consisting of 99m Tc, 131 I, 125 I, 124 I, 186 Re, 188 Re, 90 Y, 166 Ho and 177 Lu, but is not limited thereto. It doesn't happen.
  • 99m Tc 99m technetium
  • 99m technetium is one of the radioisotopes used to label radiopharmaceuticals, and has a short half life of 6 hours, and emits only 104 keV of gamma ray energy suitable for obtaining gamma images. It is very useful for acquiring images by administering it to human body because of its low toxicity, but it is inexpensive and convenient to use because it can be produced by generators. It is applied as a radiopharmaceutical for diagnosis and treatment in nuclear medicine.
  • Radioactive compounds comprising the radionuclide are, for example, 99m Tc-HMPAO ( 99m Tc-hexamethyl propylene amine oxime), 99m Tc-ECD ( 99m Tc-ethyl cysteinate dimer), 99m Tc-MDP ( 99m Tc-methylene diphosphonate), 99m Tc- Tet Force min (99m Tc-tetrofosmin), 99m Tc-MIBI (99m Tc-2 methoxy-isobutyl-isonitrile), 99m TcO4 with -, 99m Tc-MAA (99m Tc- macro aggregated albumin), One or more selected from the group consisting of 99m Tc-MAG3 ( 99m Tc-mercaptoacetyltriglycine) and 99m Tc-DMSA ( 99m Tc-dimercaptosuccinic acid), but is not limited thereto.
  • 99m Tc-HMPAO 99m Tc-hexamethyl propylene
  • VEGF-supported liposomes when preparing VEGF-supported liposomes, two forms of liposomes that are not bound to DTPA in PE, which is a structural component of liposomes, are prepared and DTPA-coupled liposomes are 99m Tc-DTPA (Diethylene tetramine penta-acetic acid), liposomes without DTPA binding were labeled with 99m Tc-HMPAO (hexamethyl propylene amine oxime) to obtain gamma images, which were delivered and supported to ischemic lesions of liposomes loaded with VEGF-derived peptides. The degree of release and absorption of the material was evaluated.
  • Tc-DTPA Diethylene tetramine penta-acetic acid
  • 99m Tc-HMPAO is carried in analogy to the liposome structure and VEGF-derived peptide is labeled.
  • 99m Tc is labeled on DTPA bound to PE, a liposome structural component, it is labeled as 99m Tc-DTPA bound to liposome structure.
  • FIG. 3 is a gamma image obtained after injection of 99m Tc-HMPAO-labeled liposomes through apical puncture in a rat model of myocardial infarction disease, and ischemic lesions in gamma images observed 30 minutes after liposome injection. It was confirmed that a high intake rate of 5.28% was found in the heart. Since the heart is a tissue with a large blood pool, gamma images were observed 90 minutes after infusion, which is a time sufficient to eliminate the effects of 99m Tc-HMPAO or liposomes that were not absorbed by the ischemic lesion. . As a result, the absorption rate into the heart with ischemic lesion was 4.95%, which was slightly decreased compared with 30 minutes after the injection, but it was confirmed that the value was significantly higher.
  • FIG. 6 is labeled with liposomes ⁇ PEG-LP (VEGF) ⁇ loaded with VEGF-derived peptides of the present invention with 99 mTc-HMPAO and 99 mTc-DTPA, respectively, and injected into mice having a myocardial infarction disease model, followed by 90 minutes.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the absorption in the heart with ischemic lesions from the gamma image to a data comparison after water absorption in the ischemic lesion in a liposome labeled with a 99m Tc-HMPAO observed in the gamma imaging is obtained from the 99m Tc-HMPAO, which is supported in the intake liposomes And 99m Tc-HMPAO released from liposomes and absorbed into ischemic lesions.
  • the absorption rate of 99m Tc-labeled using DTPA was confirmed to have a smaller value than liposomes labeled with 99m Tc-HMPAO as the value of liposomes absorbed into ischemic lesions.
  • the release and absorption of the supported 99m Tc-HMPAO was confirmed to occur high.
  • the kit provided in the present invention can be usefully used to evaluate the degree of delivery and release of the supporting material to the ischemic lesion of the liposome loaded with the VEGF-derived peptide in the treatment of ischemic disease patients. Confirmed.
  • a VEGF-derived peptide-supported liposome was prepared to increase the therapeutic effect of VEGF-induced ischemic disease.
  • the VEGF-derived peptide was used by purchasing a peptide having an amino acid sequence of Ac-MRIKPHQGQHI-NH2 (SEQ ID NO: 1) from peptron (Korea).
  • L- ⁇ -phosphatidylcholine Egg-PC
  • cholesterol cholesterol (cholesterol (CH)
  • L-glutathione L-glutathione
  • PEG2000-DSPE ⁇ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]
  • DTPA-DSPE ⁇ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine -Ndiethylenetriaminepentaacetic acid ⁇ was purchased from Avanti Polar Lipids, Inc., USA, and the high purity extra pure chloroform and the extra pure methanol were derived from Duck-San Pure Chemical Co., Ltd. Ltd, South Korea).
  • Liposomes were prepared using a lipid thin-film hydration / extrusion method such that an egg-PC: cholesterol: PEG2000-DSPE ratio was 50:40:10. Briefly describing the method, first dissolve Egg-PC, cholesterol and PEG2000-DSPE in a chloroform / methanol (7: 3) mixed solution to the above-mentioned lipid ratio, and then evaporate at 51 ° C. for 4 hours. evaporation) to obtain a lipid thin layer whose surface was modified with polyethylene glycol. The obtained thin layer was completely hydrated with PBS buffer solution (pH 7.4) at 37 ° C.
  • PBS buffer solution pH 7.4
  • lipid liposome
  • VEGF VEGF-derived peptide ⁇ PEG-LP
  • the prepared liposomes and VEGF derived peptides were then loaded with 400 nm, 200 using an Avanti mini extruder (Avanti Polar Lipids, Inc. USA) to obtain small unilamellar vesicles. Extrusion was carried out 20 times through a polycarbonate membrane having a pore size of nm, 100 nm and 50 nm.
  • Size exclusion chromatography was performed using a PD Midi-Trap G-25 column to remove unsupported VEGF from the liposome loaded with the VEGF-derived peptide prepared by extrusion.
  • the loading efficiency of VEGF-derived peptides in liposomes loaded with VEGF-derived peptides was measured using the difference in concentration of VEGF-derived peptide solutions before and after hydration, and the area of VEGF-derived peptides was C18 silica. It was confirmed using high performance liquid chromatography (HPLC, Thermo Scientific, USA) using a gel column (5 ⁇ m, 10 ⁇ 250 mm; YMC, Japan).
  • VEGF origin Peptide and VEGF origin Peptide Supported Liposome Myocardial infarction Efficacy in treating diseases evaluation
  • Relative perfusion (%) ⁇ ( 99 m Tc-tetrofosmin activity value at cardiac ischemic site / 99 m Tc-tetrofosmin activity value at diaphragm) ⁇ ⁇ 100
  • VEGF-derived peptide alone treatment group showed an improvement in perfusion, but no significant results were observed, whereas VEGF-derived peptides were not observed.
  • the liposome is absorbed into the ischemic lesion tissue as a drug carrier, and the VEGF-derived peptide absorbed into the ischemic lesion tissue is improved compared to the VEGF-derived peptide alone group, which increases the perfusion of the heart and the total number of blood vessels, thereby increasing the It means that the therapeutic effect is increased. That is, it was confirmed that the liposome loaded with the VEGF-derived peptide of the present invention improves the therapeutic effect of the ischemic disease as compared to the VEGF-derived peptide alone treatment group.
  • the liposomes prepared in Example 1 were labeled with 99m Tc-HMPAO (hexamethyl propylene amine oxime), and then the liposomes were injected through apical puncture of myocardial infarction model mice induced in Example 2.
  • 99m Tc-HMPAO hexamethyl propylene amine oxime
  • gamma images were obtained using a Symbia TruePoint SPECTCT gamma camera system (Siemens Healthcare, Er Weg, Germany) and the release and absorption of VEGF-supported liposomes and supported substances in ischemic lesions were compared.
  • the gamma image observed 30 minutes after the liposome injection showed a high intake rate of 5.28% in the heart with the ischemic lesion. Since the heart is a tissue with a large blood pool, gamma images were observed 90 minutes after infusion, which is a time sufficient to eliminate the effects of 99m Tc-HMPAO or liposomes that were not absorbed by the ischemic lesion. . As a result, the absorption rate into the heart with ischemic lesion was 4.95%, which was slightly decreased compared with 30 minutes after the injection, but it was confirmed that the value was significantly higher.
  • the values obtained 90 minutes after the infusion of liposomes were compared to exclude the effect of the heart's blood pool in the subsequent experiments and to compare the results due to absorption in the ischemic lesion.
  • the effect of the liposome size on which VEGF-derived peptides are supported is absorbed in ischemic lesions.
  • a VEGF-derived peptide having an average particle size of 100 nm, 300 nm, and 600 nm was loaded, and a surface-modified liposome was prepared with PEG2000. Then, 99m Tc-HMPAO (hexamethyl propylene amine oxime) was used to label liposomes.
  • 99m Tc-HMPAO hexamethyl propylene amine oxime
  • Figure 4 shows the particle distribution for each of the liposomes loaded with VEGF-derived peptides having average particle sizes of 100 nm, 300 nm and 600 nm, having a particle distribution of 50 ⁇ 200nm when the average particle size is 100 nm It was confirmed.
  • the amount of VEGF uptake released from liposomes and the amount of uptake of liposomes loaded with VEGF-derived peptides were compared by different radiolabeling methods.
  • the mixture was mixed with 99m Tc-HMPAO (hexamethyl propylene amine oxime) and stirred for 30 minutes to obtain a 99m Tc-HMPAO labeled liposome.
  • Washing with PBS using a centrifuge and size exclusion chromatography (d exclusion chromatography) was used to remove 99m Tc-HMPAO unsupported in liposomes using a PD Midi-Trap G-25 column.
  • DTPA-PE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid ⁇ combined with liposome lipid layer composition PE (diethylene tetramine penta-acetic acid) in combination with DTPA (Avanti) Liposomes were prepared and purchased from Avanti Polar Lipids, Inc., USA, and labeled with 99m Tc using a small amount of SnCl 2 (Sigma Aldrich) dissolved in 0.1N HCl solution.
  • Each liposome labeled by the above two methods was injected with 200 ⁇ l through apical puncture of the myocardial infarction model mouse induced in Example 2, and then the absorption amount was compared from the gamma image obtained after 90 minutes.
  • the 99m Tc-HMPAO is labeled in a liposome structure similarly to the VEGF-derived peptide.
  • liposome structural components
  • the absorption rate in the ischemic lesion of the 99m Tc-HMPAO labeled liposome observed in the gamma image is absorbed by the liposome and the value by 99m Tc-HMPAO supported in the ingested liposomes It is the sum of the values obtained by 99m Tc-HMPAO.
  • the absorption rate of 99m Tc-labeled using DTPA was confirmed to have a smaller value than liposomes labeled with 99m Tc-HMPAO as the value of liposomes absorbed into ischemic lesions.
  • the release and absorption of the supported 99m Tc-HMPAO was confirmed to occur high.
  • the average particle size is 100 nm, 50 ⁇ 200 nm particle distribution in the same manner as in Example 1 so that the VEGF-derived peptide concentration is 2.5 ⁇ 10 -10 M, 5.0 ⁇ 10 -10 M and 5.4 ⁇ 10 -9 M Liposomes whose surface was modified with PEG2000 were prepared.
  • the liposomes were injected 200 ⁇ l each through apical puncture of the myocardial infarction model mouse induced in Example 2, followed by observing cardiac perfusion images in the same manner as in Example 2, and measuring relative perfusion. The therapeutic effect by the VEGF derived peptide was evaluated.
  • Example 2 the total vessel count was measured in the same manner as in Example 2 to evaluate the therapeutic effect by the VEGF-derived peptide.
  • the VEGF-derived peptides of the present invention is a small concentration of liposomes It was confirmed that VEGF-derived peptides also have therapeutic effects on ischemic lesions.
  • Figure 9 is an image of the tissue observed through the immunostaining, regardless of the concentration of VEGF-derived peptides, it was confirmed that the total blood vessel number increased by the generation of neovascularization by liposome treatment carried with VEGF-derived peptides.
  • the VEGF-derived peptide having a concentration of 2.5 ⁇ 10 -10 M or more was supported on the liposome, the average particle size was 100 nm, and the surface distribution was modified with PEG2000 with a particle size of 50-200 nm in ischemic lesions. It was confirmed to show an effective therapeutic effect.
  • VEGF-derived peptides having a concentration of 5.0 ⁇ 10 -10 M were supported on liposomes.
  • the surface was modified with PEG2000 with an average particle size of 100 nm and a particle distribution of 50 to 200 nm. Prepared liposomes.
  • MCAO transient middle cerebral artery occlusion
  • Example 2 the total vessel count was measured in the same manner as in Example 2 to evaluate the therapeutic effect by the VEGF-derived peptide.
  • Figure 12 is an image of the tissue observed through the immunostaining, it was confirmed that in the midbrain artery stenosis disease, neovascularization was generated by liposomes in which the VEGF-derived peptide was carried, thereby increasing the total number of blood vessels.
  • the VEGF-derived peptide of the present invention is supported on liposomes, has an average particle size of 100 nm, has a particle distribution of 50-200 nm, and the surface-modified liposomes with PEG2000 are not only high in myocardial infarction but also in middle cerebral artery stenosis disease. It showed a therapeutic effect, which means that the liposome loaded with VEGF-derived peptides has a therapeutic effect on various ischemic lesions.
  • VEGF-derived peptide of the present invention the average particle size of 90 to 110 nm, having a particle distribution of 50 to 200 nm, the surface for the prevention or treatment of ischemic diseases including liposomes modified with polyethylene glycol
  • the composition can significantly increase VEGF uptake compared to VEGF alone treatment, thereby effectively treating ischemic diseases such as myocardial infarction, middle cerebral artery stenosis disease, lower limb ischemia and cerebral infarction.
  • the liposome kit including DTPA-PE provided in the present invention is useful for evaluating the delivery of liposomal-derived liposomes to the ischemic lesions of the liposomes carrying the VEGF-derived peptides and the release and absorption of the supporting substances. It can be used in the industry, so the industrial applicability is large.

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Abstract

본 발명은 VEGF(혈관내피세포 성장인자; Vascular endothelial growth factor) 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물을 허혈성 질환이 의심되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법, 상기 리포좀의 용도 및 상기 리포좀을 이용한, 허혈병변으로의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하기 위한 키트에 관한 것으로, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지고, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있는 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 VEGF 단독 처리에 비해 VEGF 흡수를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 키트를 이용하여, 허혈성 질환 환자의 치료과정에서 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 허혈병변으로 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2015년 5월 27일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2015-0074257호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 VEGF(혈관내피세포 성장인자; Vascular endothelial growth factor) 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 약학적 조성물을 허혈성 질환이 의심되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법, 상기 리포좀의 용도 및 허혈병변으로의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하기 위한 키트에 관한 것으로, 보다 자세하게는 VEGF 유래 펩타이드를 담지시킨, 평균 100 nm 입자크기인 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 리포좀은 VEGF 유래 펩타이드 흡수를 증가시킬 수 있으므로, 허혈성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 키트는 리포좀의 구조 성분인 PE에 킬레이트가 결합된 형태와 결합되지 않은 형태로 제조한 두 가지 형태의 리포좀에 각각 방사성 핵종 및 방사성 핵종을 포함하는 방사성 화합물로 표지하여 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하는데 유용하게 사용할 수 있다.
허혈성 질환(ischemic disease)은 혈류의 흐름이 막혀 일어나는 심혈관 질환을 포함하는 것으로 허혈성 심근경색(myocardial ischemia) 및 허혈성 말초혈관 질환(peripheral vascular disease)이 이에 해당한다. 이러한 허혈성 질환 중 심혈관질환은 우리나라에서 사망의 수위를 다투고 있으며, 이외에도 뇌혈관질환 및 하지허혈질환이 3대 허혈질환에 속한다. 생활습관의 서구화와 고령화시대로 진입한 우리나라는 이러한 허혈질환 발생률이 높아지고 있으며, 치료에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
최근에는 혈관신생의 기전이 밝혀짐에 따라 허혈 부위에 혈관신생에 관련한 인자 (factor)의 유전자 또는 단백질을 투여하여 혈관생성을 유도함으로써 측부혈류를 증가시켜 허혈성 질환을 치료하고자 하는 시도들이 이루어지고 있다. 그 중, VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관내피세포를 특이적으로 성장 분화시키는 단백질로 일반적인 혈관형성에 관여한다고 알려져 있으며, 막힌 혈류의 흐름을 원활하게 하기 위해 VEGF 유전자 등 새로운 혈관을 유도하는 유전자들이 상기 허혈성 질환 치료에 이용되고 있다 (Yla-Herttuala S and Alitalo K, Nat Med., 9(6):694-701, 2003; Khan TA et al., Gene Ther., 10(4):285-91, 2003).
하지만, VEGF와 같은 혈관신생 재조합 단백질(peptide)을 투여하는 방법은 다음과 같은 문제점이 있다. 1) 주사한 혈관신생 단백질은 다른 조직으로
이동하거나 활성을 잃어버리기 때문에 혈관신생의 효과를 보기 위해 고순도의 단백을 다량 사용하여야 하므로 막대한 비용이 든다. 2) 측부혈관의 형성을 위하여 단백질을 적은 용량으로 지속적으로 투여하는 것이 바람직하지만, 자주 주사하여야 하는 문제점이 있다. 위와 같은 문제점은 혈관신생 단백질을 주사부위에 머물면서 서서히 방출시킬 수 있는 전달시스템으로 해결될 수 있다. 그리고, 이러한 주사 전달시스템의 생체 내 분포를 정확하게 모니터링함으로써 치료효과를 효율적으로 예측할 수 있는 추적 전략이 필요하다.
이를 위해 다양한 연구가 이루어지고 있으며, VEGF가 도입된 아데노바이러스 유전자 전달체(Ad.VEGF)를 허혈성 심근 및 근육세포 모델을 대상으로 실험된 결과, 혈관이 크게 증가하는 것이 확인되었으나(Mkinen K et al., Mol. Ther., 6, 127-133, 2002), 바이러스 벡터 시스템의 경우 안정성의 문제가 남아있다. 따라서, 인체에 안전하고, VEGF 흡수량을 증가시킬 수 있는 전달시스템의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명에서는 VEGF 흡수량을 증가시켜 허혈성 질환의 치료효과를 높이기 위해 예의 노력한 결과, 평균 100 nm 입자크기인 50 내지 200 nm 크기의 입자분포를 가지며, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)로 표면이 개질되어 있고, 2.5 × 10-10M 농도 이상의 VEGF 유래 펩타이드를 담지시킨 리포좀을 약물 전달체로 사용하면, 허혈병변에서 VEGF 흡수량이 증가하여 허혈성 질환의 치료효과가 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 허혈성 질환에 대한 치료효과를 증가시킬 수 있는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하며, 상기 리포좀은 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 VEGF 유래 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 VEGF 유래 펩타이드가 2.5 × 10-10M 농도 이상으로 담지된 리포좀이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리포좀은 (a) L-α-포스파티딜 콜린(L-α-phosphatidylcholine; Egg PC), 콜레스테롤(cholesterol; CH) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG2000)이 결합되어 있는 PEG2000-DSPE{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N [methoxy (polyethyleneglycol)-2000]을 유기용매에 용해시킨 다음, 증발시켜 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 지질 박층(lipid thin film)을 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 박층을 VEGF 유래 펩타이트가 포함된 용액에 완전히 수화시켜 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 제조하는 단계; (c) 상기 리포좀을 다공성 막을 통해 압출시켜 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 이며, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 L-α-포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE를 50 : 40 : 10 비율로 용해시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 유기용매는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 증발은 45 내지 55℃에서 3시간 내지 5시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 수화 과정은 VEGF 유래 펩타이드가 포함된 PBS 버퍼 용액에서 35 내지 39℃에서 1시간 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1800g/mol 내지 2200g/mol일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 허혈성 질환은 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실실예에 따르면, 상기 조성물은 주사제형일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀; 및 (b) VEGF 유래 펩타이드가 담지되고, 리포좀의 PE에 방사성 핵종을 표지할 수 있는 작용기를 갖는 킬레이트가 결합된 리포좀; 을 포함하며, 상기 (a)의 리포좀은 방사성 핵종을 포함하는 방사성 화합물로 표지되고, 상기 (b)의 리포좀은 방사성 핵종으로 표지되는, 허혈병변으로의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있는 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 VEGF 단독 처리에 비해 VEGF 흡수를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공되는 DTPA-PE를 포함하는 리포좀 키트를 이용하여 허혈성 질환 환자의 치료과정에서 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 허혈병변으로 전달 및 담지물질의 방출과 흡수되는 정도를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 심근경색질환을 유발한 쥐의 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 심장 관류(perfusion) 변화를 측정한 데이터이다.
도 2는 심근경색질환을 유발한 쥐의 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈조직을 적출하여 면역염색을 통해 측정한 전체 혈관의 수(total vessel count)를 나타낸 데이터이다.
도 3은 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}의 VEGF 섭취량을 비교하기 위하여, 99mTc-HMPAO로 표지한 리포좀을 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 주입한 다음, 30분 및 90분 경과 후 관찰한 감마영상을 나타낸 데이터이다.
도 4는 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}의 평균 입자크기를 100 nm, 300 nm 및 600 nm을 가지도록 준비하여 입자크기 분석 장치인 동적 광산란분석기(dynamic light scattering; DLS, Malvern Instruments Limited, Melvern, 영국)로 측정한 입자분포 데이터이다.
도 5는 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 크기를 다르게 하고 99mTc-HMPAO로 표지하여 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 각각 주입한 다음, 90분 경과 후 얻은 감마영상으로부터 허혈병변이 있는 심장에서 흡수량을 관찰한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 99mTc-HMPAO 및 99mTc-DTPA으로 각각 표지하여 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 주입한 다음, 90분 경과 후 감마영상으로부터 허혈병변이 있는 심장에서 흡수량을 비교한 데이터이다.
도 7은 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEGLP(VEGF)}을 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 심장을 적출하여 관류(perfusion)을 측정한 데이터이다.
도 8은 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEGLP(VEGF)}을 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 심장을 적출하여 면역염색을 통해 측정한 전체 혈관의 수(total vessel count)를 나타낸 데이터이다.
도 9는 심근경색모델을 가진 쥐에 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각
주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 심장을 적출하여 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지이다.
도 10은 중뇌동맥협착 모델을 가진 쥐의 총경동맥(common carotid artery)을 통해 대조군(PBS) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEGLP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 뇌의 관류(perfusion)를 측정한 데이터이다.
도 11은 중뇌동맥협착 모델을 가진 쥐의 총경동맥(common carotid artery)을 통해 대조군(PBS) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEGLP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 뇌를 적출하여 면역염색을 통해 측정한 전체 혈관의 수(total vessel count)를 나타낸 데이터이다.
도 12는 중뇌동맥협착 모델을 가진 쥐에 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 뇌를 적출하여 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 허혈성 질환의 치료를 위해 VEGF를 이용한 치료가 각광을 받고 있으나, VEGF와 같은 혈관신생 재조합 단백질을 투여하는 방법은 고순도의 단백질을 다량 투여하거나, 적은 용량으로 지속적으로 투여해야하는 문제가 있으므로, 혈관신생 단백질을 주사부위에 머물면서 서서히 방출시키거나 병변조직에서 흡수량을 증가시킬 수 있는 전달시스템 구축이 필요하다.
본 발명은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm인 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 제공하며, 상기 리포좀은 VEGF 유래 펩타이드 흡수를 증가시킬 수 있으므로, 허혈성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하며, 상기 리포좀은 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm이며 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
상기 VEGF 유래 펩타이드는 일반적으로 상업적으로 판매되고 있는 것을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Ac-MRIKPHQGQHI-NH2(서열번호 1)의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 사용할 수 있다.
상기 리포좀은 (a) L-α-포스파티딜 콜린(L-α-phosphatidylcholine; Egg-PC), 콜레스테롤(cholesterol; CH) 및 PEG2000-DSPE{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]을 유기용매에 용해시킨 다음, 증발시켜 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 지질 박층(lipid thin film)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 박층을 VEGF 유래 펩타이트가 포함된 용액에 완전히 수화시켜 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 제조하는 단계;
(c) 상기 리포좀을 다공성 막을 통해 압출시켜 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 이며, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 수득하는 단계; 를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 방법을 좀 더 구체적으로 설명하면, 상기 (a) 단계에서 L-α-포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE는 50 : 40 : 10 비율이 되도록 혼합하는 것을 특징으로 하며, 상기 (a) 단계의 유기용매는 통상적으로 사용하는 용매를 제한 없이 사용할 수 있으나, 알코올, 메탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 또는 헥산 등의 단독 또는 혼합 형태인 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 클로로포름 및 메탄올이 7:3으로 혼합된 용매를 사용할 수 있다. 또한, 상기 (a) 단계에서 증발은 45 내지 55℃에서 3시간 내지 5시간 동안 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계의 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1800g/mol 내지 2200g/mol이며, 바람직하게는 2000 g/mol의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 수 있으며, 상업적으로 판매되고 있는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 수화 과정은 35 내지 39℃에서 1시간 내지 2시간 동안 수행할 수 있으며, 바람직하게 VEGF 유래 펩타이드가 포함된 PBS 버퍼 용액에 지질박층을 수화시켜 리포좀을 제조할 수 있다.
또한, 상기 (c) 단계에서 압출은 400 nm, 200 nm, 100 nm 및 50 nm의 다공크기를 가지는 폴리카보네이트 막을 이용하여 수행할 수 있으며, 압출 과정 후, 리포좀에 담지 되지 않은 VEGF를 제거하기 위해 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 추가적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 상기 방법으로 제조한 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀이 허혈성 질환에 대한 치료 효능을 증가시키는지 확인하기 위해 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군과 비교실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, PBS 용액을 주입한 대조군에 비하여 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군은 관류(perfusion)의 개선효과 및 전체 혈관의 수가 유의성 있게 증가하지 않은 것을 확인한 반면, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀(LP-VEGF) 처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 관류가 개선되고 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다.
도 3은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에 99mTc-HMPAO로 표지하여 주입한 다음 얻은 감마영상으로부터, 시간 경과에 따른 허혈 병변에서 흡수량 변화를 확인한 결과로, 심장의 혈액풀(blood pool)에 의한 영향을 배제하고, 허혈 병변에서의 흡수에 의한 결과를 비교하기 위해 리포좀 주입 90분 이후에 결과값을 비교하는 것이 적합한 것을 확인하였다.
도 4는 100 nm, 300 nm 및 600 nm의 평균 입자크기를 가지는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 각각에 대한 입자분포를 나타낸 것으로, 평균입자 크기가 100 nm인 경우 50 ~ 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 확인하였다.
또한, 도 5는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 크기가 허혈병변에서의 리포좀 흡수에 미치는 영향을 확인한 것으로, 리포좀의 평균 입자 크기가 큰 경우, 허혈병변에서의 흡수량이 급격히 감소하는 것을 확인하였으며, 평균입자 크기가 100 nm 근처일 때 가장 높은 흡수율을 보이는 것을 확인하였다. 리포좀의 평균입자 크기가 50 nm 미만인 경우에는 VEGF 담지율이 매우 적고 리포좀 구조 파열에 의한 담지된 VEGF가 방출되기 힘들어 치료효과가 낮은 문제점이 있다.
본 발명의 다른 일양태에서는 허혈병변에서 실제로 리포좀에 담지된 VEGF 또는 리포좀이 어느 정도 흡수되는지 확인하기 위해 방사선 표지방법을 다르게 하여 리포좀의 흡수량을 비교하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 99mTc-HMPAO로 표지한 값과 DTPA를 이용하여 99mTc를 표지한 값의 차이가 리포좀에서 방출된 99mTc-HMPAO의 값으로 허혈병변에서 방출 및 흡수가 높게 일어남을 알 수 있으며, 허혈병변에서 리포좀의 흡수가 일어나는 것을 확인하였다. 이는 실제 리포좀에 담지된 VEGF가 허혈병변에서 높은 비율로 방출되며 리포좀이 허혈병변에서 흡수되어 허혈병변의 치료 효과를 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 VEGF 유래 펩타이드는 2.5 × 10-10M 농도 이상으로 포함될 수 있으며, 도 7 내지 도 9에 나타난 바와 같이, 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도를 다르게 하여 관찰한 결과, 관류개선 효과 및 전체 혈관 수 증가 효과 모두 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도 차이에 의한 유의한 효과는 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명의 2.5 × 10-10M 농도 이상의 VEGF 유래 펩타이드가 리포좀에 담지되어 있고, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 이고, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 리포좀은 허혈병변에서 효과적인 치료효과를 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 용어 "허혈(ischemia)"은 조직, 장기의 산소수요에 대해 그 공급원인 혈류가 절대적 또는 상대적으로 부족한 상태를 말하며, 동맥경화성 혈관협착에 의한 주요 장기의 허혈은 심근경색, 뇌경색 등 중증질환의 원인이 된다.
본 발명에 있어서, "허혈성 질환"은 상기 허혈 상태로 인해 유발되는 모든 질환을 제한없이 포함할 수 있으며, 구체적으로는 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기 도 1 내지 도 9의 결과를 통해 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 심근경색 질환에 매우 효과적인 치료효과를 확인하였다. 또한, 심근경색질환 이외의 다른 허혈성 질환에 대한 치료효과를 확인하기 위해, 도 10 내지 도 12에 나타난 바와 같이 중뇌동맥협착 질환(transient middle cerebral artery occlusion; MCAO)에 대한 치료효과를 확인한 결과, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀(LP-VEGF) 처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 관류가 개선되고 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 심근경색 질환뿐만 아니라 중뇌동맥협착 질환에서도 높은 치료효과를 보였으며, 이는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 다양한 허혈병변 질환에 치료효과를 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 허혈성 질환 치료효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
상기 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용되는 표준의 제약학적 담체 중 어느 것이든 포함된다. 전형적으로 이러한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트린, 밀크, 특정 종류의 클레이, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름(예를 들면 식용유, 면실유, 코코넛유, 아몬드유, 낙화생유), 중성지방산 글리세라이드 등의 유상 에스테르, 광물유, 바세린, 동물유지, 셀룰로오스 유도체(예를 들면 결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스), 등의 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 또한 산화방지제, 습윤제, 점도안정제, 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물은 상기 시술 이전에 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하나, 상기 조성물의 투여방법 및 투여량은 이에 제한되지 않고, 질환의 종류나 투여 형태, 그리고 치료 효과 등을 고려하여 당업자에게 통상적으로 알려진 다양한 방법에 따라 적절히 투여할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 허혈성 질환 치료를 위하여 주사제 제형으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 직접 병소에 주사하거나, 또는 병소에 근접한 동맥 또는 정맥에 주사하여 병소에 전달할 수 있다. 비경구 투여를 위한 본 발명의 조성물로는 멸균 수성 또는 비수성 액제, 분산제, 현탁제, 또는 유제 뿐만 아니라 멸균 액제 또는 현탁제로 사용하기 직전에 재조제하는 멸균 산제가 있다. 적합한 멸균 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 생리식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 혼합물, 식물성 오일(예를 들어, 올리브 오일), 주사가능한 유기 에스터(예를 들어, 에틸올레이트)가 있다. 예를 들어, 분산제 및 현탁제의 경우에는 레시틴과 같은 피복재를 사용하여 적절한 특정 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 허혈성 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 약학적 조성물을 허혈성 질환이 의심되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 허혈성 질환이 의심되는 개체는 허혈성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명의 약학적 조성물로 치료 가능한 개체는 제한없이 포함된다. 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 약학적 조성물을 허혈성 질환이 의심되는 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 허혈성 질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 허혈성 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, VEGF 유래 펩타이드가 담지되고, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 리포좀의 허혈성 질환 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
상기 리포좀의 구성 및 허혈성 질환에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, (a) VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀; 및 (b) VEGF 유래 펩타이드가 담지되고, 리포좀의 PE에 방사성 핵종을 표지할 수 있는 작용기를 갖는 킬레이트가 결합된 리포좀; 을 포함하며, 상기 (a)의 리포좀은 방사성 핵종을 포함하는 방사성 화합물로 표지되고, 상기 (b)의 리포좀은 방사성 핵종으로 표지되는, 허혈병변으로의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하기 위한 키트를 제공한다.
상기 킬레이트는 DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid), SHPP(N-succinimidyl-3-[4-hydroxyphenyl]propionate), 히스티딘, 티로신 및 티로신을 포함하는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 방사성 핵종에 따라 달라질 수 있다.
상기 리포좀은 핵의학 장치에 의해 검출되기에 적합한 다양한 방사성 핵종 또는 상기 방사성 핵종을 함유하는 화합물로 표지될 수 있다.
사용될 수 있는 방사성 핵종은, 예를 들어, 99mTc, 131I, 125I, 124I, 186Re, 188Re, 90Y, 166Ho 및 177Lu로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이들 중 상기 99mTc(99m 테크네슘)은 방사성 의약품을 표지하기 위해 사용되는 방사성 동위원소 중 하나로, 반감기가 6시간으로 비교적 짧고, 감마영상을 얻기에 적절한 104 keV의 감마선 에너지만을 방출하기 때문에 인체에 대한 독성이 적으면서도 투과력이 커서 인체에 투여하여 영상을 얻는데 매우 유용하며, 제너레이터에서 생산을 할 수 있어 저렴하고 편리하게 사용이 가능하여 핵의학 분야에서 진단용 및 치료용 방사성 의약품으로 응용되고 있다.
상기 방사성 핵종을 포함하는 방사성 화합물은, 예를 들어, 99mTc-HMPAO(99mTc-hexamethyl propylene amine oxime), 99mTc-ECD(99mTc-ethyl cysteinate dimer), 99mTc-MDP(99mTc-methylene diphosphonate), 99mTc-테트로포스민(99mTc-tetrofosmin), 99mTc-MIBI(99mTc-2 methoxy-isobutyl-isonitrile), 99mTcO4-, 99mTc-MAA(99mTc- macro aggregated albumin), 99mTc-MAG3(99mTc-mercaptoacetyltriglycine) 및 99mTc-DMSA(99mTc-dimercaptosuccinic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는, VEGF가 담지된 리포좀의 제조 시, 리포좀의 구조 성분인 PE에 DTPA가 결합된 것과 결합되지 않은 두 가지 형태의 리포좀을 제조하여 DTPA가 결합된 리포좀은 99mTc-DTPA(diethylene tetramine penta-acetic acid)로, DTPA가 결합되지 않은 리포좀은 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)로 각각 표지하여 감마영상을 수득함으로써 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 허혈병변으로 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하였다.
본 발명에서 제조된 리포좀에 99mTc-HMPAO를 처리하면 99mTc-HMPAO는 VEGF 유래 펩타이드와 유사하게 리포좀 구조 안에 담지되어 표지가 된다. 반면에 리포좀 구조 성분인 PE에 결합된 DTPA에 99mTc를 표지시키면 리포좀 구조에 결합된 99mTc-DTPA 형태로 표지가 된다.
도 3은 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 99mTc-HMPAO로 표지한 리포좀을 주입한 다음 각각 30분 및 90분 후에 얻은 감마영상으로, 리포좀 주입 30분 후에 관찰한 감마영상에서는 허혈병변이 있는 심장에서 5.28%의 높은 섭취율을 보이는 것을 확인하였다. 심장은 혈액풀(blood pool)이 많은 조직이기 때문에 허혈병변 부위에 흡수되지 않은 99mTc-HMPAO 또는 리포좀에 의한 영향을 배제하기 위해 상기 영향이 사라지기에 충분한 시간인 주입 90분 후에 감마 영상을 관찰하였다. 그 결과, 허혈병변이 있는 심장으로의 흡수율은 4.95%로 주입 30분 후에 비해 다소 감소하였으나, 상당히 높은 값을 나타낸 것을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 99mTc-HMPAO 및 99mTc-DTPA으로 각각 표지하여 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 주입한 다음, 90분 경과 후 감마영상으로부터 허혈병변이 있는 심장에서 흡수량을 비교한 데이터로, 감마영상에서 관찰한 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀의 허혈병변에서 흡수율은 섭취된 리포좀 안에 담지되어있는 99mTc-HMPAO에 의한 값과 리포좀에서 방출되어 허혈병변에 흡수된 99mTc-HMPAO에 의한 값을 합한 값이다.
반면, DTPA를 이용하여 99mTc를 표지시킨 흡수율은 허혈병변에 흡수된 리포좀에 의한 값으로 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀에 비해 작은 값을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 허혈병변에서 리포좀의 흡수가 일어난 것을 의미하는 것으로, 99mTc-HMPAO로 표지한 값과 DTPA를 이용하여 99mTc를 표지한 값의 차이가 리포좀에서 방출된 99mTc-HMPAO의 값으로, 리포좀에 담지된 99mTc-HMPAO의 방출 및 흡수가 높게 일어남을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명에서 제공되는 키트는 허혈성 질환 환자의 치료과정에서 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 허혈병변으로 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 제조
본 발명에서는 VEGF에 의한 허혈성 질환의 치료효과를 증가시키위해 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀(liposome; LP)를 제작하였다.
VEGF 유래 펩타이드는 Ac-MRIKPHQGQHI-NH2(서열번호 1)의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 펩트론(peptron; 한국)으로부터 구매하여 사용하였다.
L-α-포스파티딜 콜린(L-α-phosphatidylcholine; Egg-PC), 콜레스테롤(cholesterol; CH) 및 L-글루타티온(L-glutathione)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Chemical Co., 미국)으로부터 구매하여 사용하였으며, PEG2000-DSPE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DTPA-DSPE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Ndiethylenetriaminepentaacetic acid}은 아반티(Avanti Polar Lipids, Inc. 미국)로부터 구입하여 사용하였으며, 고순도의 클로로포름(extra pure chloroform) 및 고순도의 메탄올(extra pure methanol)은 덕산 화학(Duck-San Pure Chemical Co., Ltd, 한국)으로부터 구매하여 사용하였다.
Egg-PC : 콜레스테롤 : PEG2000-DSPE가 50 : 40 : 10 비율이 되도록 지질 박층 수화/압출(lipid thin-film hydration/extrusion) 방법을 사용하여 리포좀을 제조하였다. 상기 방법을 간략하게 설명하면, 먼저 상기에 언급한 지질 비율이 되도록 Egg-PC, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE를 클로로포름/메탄올(7:3) 혼합용액에 용해시킨 다음, 51℃에서 4시간 동안 증발(evaporation)시켜 폴리에킬렌 글리콜로 표면이 개질된 지질박층을 수득하였다. 상기 수득한 박층을 PBS 버퍼 용액(pH 7.4)을 사용하여 37℃에서 1시간 30분 동안 완전히 수화시켜 리포좀(liposome; LP)을 제조하였으며, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}은 VEGF 유래 펩타이드가 포함된 PBS 버퍼 용액을 사용하여 제조하였다.
그 다음, 제조된 리포좀 및 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 작은 단일 라멜라 소포체(small unilamellar vesicles)를 얻기 위해 아반티 미니 압출기(Avanti mini extruder; Avanti Polar Lipids, Inc. 미국)를 사용하여 400 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm의 다공크기를 가지는 폴리카보네이트 막을 통해 20회 이상 압출하였다.
상기에서 압출하여 제조한 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에서 담지되지 않은 VEGF를 제거하기 위해 PD Midi-Trap G-25 컬럼(column)을 사용하여 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하였다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에서 VEGF 유래 펩타이드의 담지 효율(loading efficiency)은 수화 전 및 수화 후 과정에서 VEGF 유래 펩타이드 용액의 농도 차이를 이용하여 측정하였으며, VEGF 유래 펩타이드의 영역(area)은 C18 실리카 겔 컬럼(5 ㎛, 10 × 250 mm; YMC, 일본)를 이용한 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC, Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 확인하였다.
[ 실시예 2]
VEGF 유래 펩타이드 및 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 심근경색 질환에 대한 치료 효능 평가
본 발명에서는 실시예 1에서 제조한 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀이 허혈성 질환에 대한 치료 효능을 증가시키는지 확인하기 위해 VEGF 유래 펩타이드 단독처리군과 비교실험을 수행하였다.
먼저, 8주령 쥐(Sprague-Dawley)를 ㈜오리엔트 바이오로부터 구입하여 온도 22±3℃, 상대습도 60±20%, 환기횟수 10-20회/시간(hour), 조명 12 시간 (AM 08:00 점등, PM 08:00 소등), 멸균 사료 및 급수 공급의 환경에서 3일간의 순화기간 경과 후 심근경색 질환(myocardial infarction) 모델을 유발하고(Hwang HS et al., Radiology, 273(1):160, 2014) 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 실시예 1의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 200 ㎕로 각각 주입한 뒤, 일주일 동안 수술 전과 같은 사육 환경에서 사육하였다. 일주일 후, 심장 관류 이미지 측정 시약(myocardial perfusion imaging agent)인 99m테크네슘 테트로포스민(99mTc-tetrofosmin)를 사용하여 심장 방사선자동사진 (autoradiography)을 수득한 다음, 하기 수학식 1의 방법을 사용하여 상대적 관류(relative perfusion)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
[수학식 1]
상대적 관류(%) ={(심장 허혈 부위의 99mTc-tetrofosmin 활성 값)/격막의 99mTc-tetrofosmin 활성값)} × 100
또한, 허혈병변이 있는 심장 조직을 적출한 후, 포르말린 고정 및 파라핀 포매(paraffin-embedding) 과정을 통해 수득한 조직을 수화시킨 다음, 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor) 면역조직염색(immunohistochemical stainning)을 수행하였으며, 광학현미경을 사용하여 무작위로 5곳의 영상을 수득하였다. 수득된 영상으로부터 전체 혈관 수(total vessel count)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다. 상기 영상은 200×의 HPF(High Power Field)에서 관찰하였다.
이후의 모든 통계 분석은 SAS ver. 9.2 (SAS Institute, Cary, 미국)을 사용하여 수행하였으며, 차이의 유의성은 Duncan의 다중 테스트 및 ANOVA을 사용하여 결정하였으며, p<0.05에서 유의한 차이를 평가하였다. 모든 데이터는 5% 범위에서 유의성이 있었으며, 평균값±표준편차로 표기하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, PBS 용액을 주입한 대조군에 비하여 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군은 관류(perfusion)의 개선효과를 보이는 것으로 확인되었지만 유의한 결과는 관찰되지 않은 반면, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의한(P=0.003) 관류개선 효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 전체 혈관의 수를 비교한 결과 대조군에 비하여 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군은 전체 혈관의 수가 유의성 있게 증가하지 않은 것을 확인한 반면, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEGLP(VEGF)}처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다.
이는 리포좀이 약물전달체로서 허혈병변 조직에 흡수되어, 허혈병변 조직에 흡수되는 VEGF 유래 펩타이드가 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군에 비해 향상된 것으로, 이로 인해 심장의 관류 증가 및 전체 혈관 수가 증가하여 허혈병변에 대한 치료효과가 증가한 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군에 비해 허혈성 질환의 치료 효과를 향상시키는 것을 확인하였다.
[ 실시예 3]
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 주입 후, 시간 경과에 따른 허혈 병변에서 흡수량 변화 확인
본 발명에서는 심근경색 모델을 가진 쥐에 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 주입한 다음, 시간 경과에 따른 허혈 병변에서 흡수량 변화를 확인하고자 하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조한 리포좀을 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)으로 표지시킨 다음, 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 상기 리포좀을 주입하였다.
주입 30분 및 90분 경과 후에 Symbia TruePoint SPECTCT gamma camera system (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)을 이용하여 감마영상을 얻고 허혈병변에서 VEGF 담지 리포좀과 담지물질의 방출과 흡수량을 비교하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 리포좀 주입 30분 후에 관찰한 감마영상에서는 허혈병변이 있는 심장에서 5.28%의 높은 섭취율을 보이는 것을 확인하였다. 심장은 혈액풀(blood pool)이 많은 조직이기 때문에 허혈병변 부위에 흡수되지 않은 99mTc-HMPAO 또는 리포좀에 의한 영향을 배제하기 위해 상기 영향이 사라지기에 충분한 시간인 주입 90분 후에 감마 영상을 관찰하였다. 그 결과, 허혈병변이 있는 심장으로의 흡수율은 4.95%로 주입 30분 후에 비해 다소 감소하였으나, 상당히 높은 값을 나타낸 것을 확인하였다.
본 발명에서는 이후의 실험에서 심장의 혈액풀(blood pool)에 의한 영향을 배제하고, 허혈병변에서의 흡수에 의한 결과를 비교하기 위해 리포좀 주입 90분 이후에 수득한 값을 비교하였다.
[ 실시예 4]
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 크기에 따른 허혈병변에서 흡수량 비교
본 발명에서는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 크기가 허혈병변에서의 흡수에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
먼저, 실시예 1과 동일한 방법으로 100 nm, 300 nm 및 600 nm의 평균 입자크기를 가지는 VEGF 유래 펩타이드가 담지되고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀를 제조한 다음, 흡수율 측정을 위해 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)으로 리포좀을 표지하였다.
도 4는 100 nm, 300 nm 및 600 nm의 평균 입자크기를 가지는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 각각에 대한 입자분포를 나타낸 것으로, 평균입자 크기가 100 nm인 경우 50 ~ 200nm의 입자분포를 가지는 것을 확인하였다.
그 다음, 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 상기에서 제조된 크기가 다른 리포좀을 각각 200 ㎕씩 주입한 다음, 90분이 경과한 후 얻은 감마영상을 통하여 흡수량을 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 리포좀의 입자크기에 따라 허혈 병변에서의 흡수율이 차이가 나는 것을 확인하였으며, 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지는 리포좀이 가장 높은 흡수율을 보이는 것을 확인하였다.
[ 실시예 5]
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에서 방출된 VEGF와 리포좀의 허혈병변에서 흡수량 비교
본 발명에서는 방사선 표지방법을 달리하여 리포좀에서 방출된 VEGF 흡수량과 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 흡수량을 비교하였다.
먼저, 실시예 1의 방법으로 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지며 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀을 준비하는 과정에서 L-글루타티온(L-glutathione)이 용해된 용액을 이용하여 수화시켜 리포좀을 제조한
다음 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)와 혼합하여 30분 동안 충분히 교반하여 99mTc-HMPAO가 표지된 리포좀을 얻었다. 원심분리기를 이용하여 PBS로 세척하고 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 PD Midi-Trap G-25 컬럼(column)을 사용하여 리포좀에 담지되지 않은 99mTc-HMPAO를 제거하였다. 또 다른 방법으로는, 리포좀 지질층 구성물인 PE에 DTPA(diethylene tetramine penta-acetic acid)가 결합된 DTPA-PE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid}를 아반티(Avanti Polar Lipids, Inc. 미국)로부터 구입하여 사용하여 리포좀을 제조한 후 0.1N HCl 용액에 녹인 소량의 SnCl2 (Sigma Aldrich)를 이용하여 99mTc을 표지하였다.
상기 두가지 방법으로 표지된 각각의 리포좀은 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 200 ㎕씩 주입한 다음, 90분이 경과한 후 얻은 감마영상으로부터 흡수량을 비교하였다.
리포좀에 99mTc-HMPAO를 처리하면 99mTc-HMPAO는 VEGF 유래 펩타이드와 유사하게 리포좀 구조 안에 담지되어 표지가 된다. 반면에 리포좀 구조 성분인
PE에 결합된 DTPA에 99mTc를 표지시키면 리포좀 구조에 결합된 99mTc-DTPA 형태로 표지가 된다.
도 6에 나타난 바와 같이, 감마영상에서 관찰한 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀의 허혈병변에서 흡수율은 섭취된 리포좀 안에 담지되어있는 99mTc-HMPAO에 의한 값과 리포좀에서 방출되어 허혈병변에 흡수된 99mTc-HMPAO에 의한 값을 합한 값이다.
반면, DTPA를 이용하여 99mTc를 표지시킨 흡수율은 허혈병변에 흡수된 리포좀에 의한 값으로 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀에 비해 작은 값을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 허혈병변에서 리포좀의 흡수가 일어난 것을 의미하는 것으로, 99mTc-HMPAO로 표지한 값과 DTPA를 이용하여 99mTc룰 표지한 값의 차이가 리포좀에서 방출된 99mTc-HMPAO의 값으로, 리포좀에 담지된 99mTc-HMPAO의 방출 및 흡수가 높게 일어남을 확인하였다.
[ 실시예 6]
리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드 농도에 따른 허혈성 질환의 치료 효능 평가
본 발명에서는 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도에 따른 허혈성 질환의 치료 효과를 확인하고자 하였다.
먼저, VEGF 유래 펩타이드 농도가 2.5 × 10-10M, 5.0 × 10-10M 및 5.4 × 10-9M이 되도록 실시예 1과 동일한 방법으로 평균입자 크기가 100 nm이며, 50~200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀을 제조하였다.
상기의 리포좀은 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 각각 200 ㎕씩 주입한 다음, 실시예 2와 동일한 방법으로 심장 관류 이미지를 관찰하고, 상대적 관류(relative perfusion)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
또한, 실시예 2와 동일한 방법으로 전체 혈관 수(total vessel count)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도가 감소하여도 심장 관류 결과에서 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않아, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 적은 농도의 VEGF 유래 펩타이드에서도 허혈병변의 치료효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 전체 혈관의 수를 비교한 결과 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도 차이에 의한 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 9는 상기 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지로, VEGF 유래 펩타이드 농도에 상관없이 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 처리에 의해 신생혈관 생성으로 전체 혈관 수가 증가된 것을 확인하였다.
즉, 상기 결과로부터 2.5 × 10-10M 농도 이상의 VEGF 유래 펩타이드가 리포좀에 담지되어 있고, 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀은 허혈병변에서 효과적인 치료효과를 보이는 것을 확인하였다.
[ 실시예 7]
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 중뇌동맥협착 질환에 대한 치료 효능 평가
본 발명에서는 심근경색질환 이외의 다른 허혈성 질환에 대해 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 치료효과가 있는지 확인하고자 하였다.
먼저, 실시예 1과 동일한 방법으로 5.0 × 10-10M 농도의 VEGF 유래 펩타이드를 리포좀에 담지시킨 다음, 최종적으로 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀을 제조하였다.
그 다음, 8주령 쥐(Sprague-Dawley)를 ㈜오리엔트 바이오로부터 구입하여 중뇌동맥협착 질환(transient middle cerebral artery occlusion; MCAO) 모델을 유발하고(Nagasawa H et al, Stroke; a journal of cerebral circulation, 20:1037. 1989; Bunevicius A et al., BioMed research international, 2013:634598, 2013), 총경동맥(common carotid artery)을 통하여 대조군(PBS), 상기 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-(LPVEGF)}을 200 ㎕로 각각 주입한 뒤, 실시예 2와 동일한 방법으로 허혈병변이 있는 뇌의 관류 이미지를 관찰한 다음, 상대적 관류(relative perfusion)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
또한, 실시예 2와 동일한 방법으로 전체 혈관 수(total vessel count)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 처리군은 PBS 용액을 주입한 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 (P=0.003) 관류개선 효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 도 11에 나타난 바와 같이, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게(P=0.01) 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다. 도 12는 상기 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지로, 중뇌동맥협착 질환에서 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 처리에 의해 신생 혈관이 생성되어 전체 혈관 수가 증가된 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 리포좀에 담지되어 있고, 평균 입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀은 심근경색 질환뿐만 아니라 중뇌동맥협착 질환에서도 높은 치료효과를 보였으며, 이는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 다양한 허혈병변 질환에 치료효과를 가진다는 것을 의미한다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있는 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 VEGF 단독 처리에 비해 VEGF 흡수를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 DTPA-PE를 포함하는 리포좀 키트를 이용하여 허혈성 질환 환자의 치료과정에서 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 허혈병변으로 전달 및 담지물질의 방출과 흡수되는 정도를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (8)

  1. VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하며,
    상기 리포좀은 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고,
    평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, VEGF 유래 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 VEGF 유래 펩타이드는 2.5 × 10-10M 농도 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1800g/mol 내지 2200g/mol인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 주사제형인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. VEGF 유래 펩타이드가 담지되고, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 리포좀의 허혈성 질환 치료용 약제의 제조를 위한 용도.
  8. (a) VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀; 및
    (b) VEGF 유래 펩타이드가 담지되고, 리포좀의 PE에 방사성 핵종을 표지할 수 있는 작용기를 갖는 킬레이트가 결합된 리포좀; 을 포함하며,
    상기 (a)의 리포좀은 방사성 핵종을 포함하는 방사성 화합물로 표지되고, 상기 (b)의 리포좀은 방사성 핵종으로 표지되는, 허혈병변으로의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 전달 및 담지물질의 방출과 흡수 정도를 평가하기 위한 키트.
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