WO2016170797A1 - 微生物産生樹脂の製造方法及び微生物産生樹脂 - Google Patents

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WO2016170797A1
WO2016170797A1 PCT/JP2016/002158 JP2016002158W WO2016170797A1 WO 2016170797 A1 WO2016170797 A1 WO 2016170797A1 JP 2016002158 W JP2016002158 W JP 2016002158W WO 2016170797 A1 WO2016170797 A1 WO 2016170797A1
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fat
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microorganism
fats
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明日香 林
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株式会社カネカ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B5/00—Preserving by using additives, e.g. anti-oxidants
    • C11B5/0021—Preserving by using additives, e.g. anti-oxidants containing oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/16—Compositions of unspecified macromolecular compounds the macromolecular compounds being biodegradable

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a microorganism-producing resin and a microorganism-producing resin.
  • Microorganism-produced resins are thermoplastic polyesters that are produced and stored as energy storage substances in the cells of many microbial species.
  • PHA produced by microorganisms using natural organic acids and fats and carbons as a carbon source is completely biodegraded by microorganisms in soil and water, and is taken into the natural carbon cycle process, which has an adverse effect on the ecosystem.
  • synthetic plastics have become serious social problems from the viewpoint of environmental pollution, waste disposal, and petroleum resources, and PHA has been attracting attention as an environmentally friendly green plastic, and its practical use is eagerly desired.
  • biocompatible plastics such as implant materials and drug carriers that do not require collection, and is expected to be put to practical use.
  • PHA produced by microorganisms has a problem that it is colored during the production process in the production thereof.
  • Patent Document 1 an aqueous suspension of microbial cells containing PHA produced by microorganisms is subjected to an enzyme treatment, and then alkali and a surfactant are added to perform physical disruption treatment at a relatively low temperature.
  • a method for obtaining a PHA having a yellowness index (YI value) of 15.0 or less is described.
  • processing conditions such as processing temperature and the type and amount of additives used for processing are limited in order to prevent a decrease in the molecular weight of PHA.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a microorganism-producing resin with little coloration, good color tone and little odor by a simple and inexpensive method suitable for industrial production.
  • the present invention provides the following microbial production resin production methods [1] to [9] and the microbial production resin [10] below.
  • a method for producing a microorganism-producing resin comprising the following steps (a) and (b): (A): a step of heat-treating oil and fat with hydrogen peroxide (b): a step of culturing microorganisms in a culture solution containing the heat-treated fat in the step (a) [2]
  • the step (a) The method for producing a microorganism-producing resin according to [1], wherein the heat treatment is performed at a temperature of 50 ° C.
  • the production method of the present invention it is possible to produce a microorganism-producing resin with little coloration, good color tone and little odor by a simple and inexpensive method suitable for industrial production.
  • the method for producing a microorganism-producing resin includes the following steps (a) and (b).
  • the present inventor has found that the cause of coloring of the microorganism-produced resin is ubiquinones produced during resin production by microorganisms, particularly ubiquinone-8.
  • the method for producing a microorganism-producing resin of the present invention is a simple and inexpensive method for producing a resin having less coloration and good color tone by suppressing the amount of ubiquinone-8 produced during microorganism cultivation.
  • the step (a) is a step of heat-treating oil and fat with hydrogen peroxide.
  • the heating temperature in the heating step is not particularly limited as long as an oil or fat that can suppress the production of ubiquinone-8 in the culture solution is obtained, but the production of ubiquinone-8 is suppressed, and a resin with low coloration and low YI value is obtained.
  • the lower limit of the treatment temperature is preferably 50 ° C. or higher, more preferably 60 ° C. or higher, and particularly preferably 70 ° C. or higher in terms of easy point, less fat and oil coloring, and more easy effects such as deodorization.
  • the upper limit of the treatment temperature is preferably less than 150 ° C, more preferably less than 130 ° C, and particularly preferably less than 120 ° C in that it is easy to suppress decomposition due to decomposition of fats and oils and excessive coloring.
  • the time for the heat treatment is not particularly limited as long as oils and fats that can suppress the formation of ubiquinone-8 are obtained, but the lower limit is set to 0. 5 hours or more are preferable, 1.5 hours or more are more preferable, and 2.0 hours or more are more preferable. Further, the upper limit of the heat treatment time is preferably 6 hours or less, more preferably 5 hours or less, from the viewpoint of ensuring productivity and facilitating the coloring of fats and oils.
  • the stirring method is not particularly limited as long as the fats and oils and hydrogen peroxide can be mixed uniformly, but a method of mixing by rotating the turbine blade at a high rotational speed can be preferably used as a method in which droplets are likely to be fine and uniform.
  • Oils and fats are not particularly limited as long as microorganisms can be cultured, and can be used regardless of the content of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids.
  • fats derived from animals such as beef tallow, bone oil, pork tallow, chicken oil, whale oil, sheep oil, goat fat, horse oil, milk fat, sebum and fish oil; palm oil, palm kernel oil, palm olein oil Oil derived from palm palm (also called oil palm), palm oil derived from coconut palm, corn oil, olive oil, honey seed oil, cottonseed oil, castor oil, soybean oil, rapeseed oil, sunflower oil, rice oil, safflower oil, etc. Plant-derived oils and fats; or residual oils of these oils and fats.
  • residual oils dark oils composed of fatty acids and the like generated in the deoxidation process particularly during oil refining can be used.
  • the residual oil is a process of distilling fats and oils during the refining of fats and oils, including the fats and oils remaining in the distillation vessel after distillation, and the remaining parts excluding the target part due to refining caused by the refining of fats and oils That is, it is a component having a higher color tone than the distilled component (oil and fat as a product).
  • Residual oil has a strong color and odor, and is generally not suitable for the production of microbially produced resins and is not used. However, according to the production method of the present invention, even if residual oil is used, it is colored. It is possible to produce a microorganism-producing resin that has little odor and can withstand practical use.
  • dark oil refers to fats and oils mainly composed of fatty acids obtained by sulfuric acid decomposition of soda oil cake generated in the deoxidation process during refining of fats and oils.
  • the kind of fats and oils does not ask
  • the above fats and oils it is preferable to use plant-derived fats and oils from the viewpoint of availability. From the viewpoint of cost and availability, it is preferable to use oil derived from palm palm such as palm oil and palm kernel oil. Moreover, although it is not preferable in terms of color tone and odor, since wastes and non-edible materials are used, residual oil is preferable in terms of low environmental burden and cost. From the viewpoint of availability, it is preferable to use a palm oil-derived residual oil such as palm kernel oil, among the residual oils.
  • Hydrogen peroxide is not limited as long as it can suppress the production of ubiquinone-8, and it can be preferably used in the form of a gas or a liquid dissolved in a solvent such as water or an organic solvent. In view of this, it is more preferable to use a hydrogen peroxide solution in which hydrogen peroxide is mixed with water.
  • the hydrogen peroxide concentration in the hydrogen peroxide solution is preferably 1% by weight or more, more preferably 5% by weight in terms of suppressing the production of ubiquinone-8 and being excellent in color tone reduction effect. 10% by weight or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the hydrogen peroxide concentration in the hydrogen peroxide solution is preferably 70% by weight or less, more preferably 65% by weight, and particularly preferably 60% by weight in terms of availability and handleability.
  • the concentration of hydrogen peroxide added to the fats and oils a higher concentration is preferable, but the lower limit is 0.01 wt.% Because the effect of reducing the color tone of the fats and the finally obtained microorganism-produced resin is easily obtained. % Or more is preferable, 0.1% by weight or more is more preferable, and 1% by weight or more is particularly preferable. Moreover, 90 weight% or less is preferable at the point which is easy to suppress decomposition
  • alkali metal hydroxide salts or carbonates such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium carbonate and potassium carbonate are used to further suppress the formation of ubiquinone-8 in fats and oils. Is preferably added.
  • an alkali metal hydroxide salt in that the amount of the surfactant used can be suppressed.
  • the lower limit of the addition concentration is 0 with respect to the amount of the hydrogen peroxide solution in that the effect of reducing the color tone of the finally obtained microorganism-produced resin is easily obtained.
  • 0.01% by weight or more is preferable, 0.05% by weight or more is more preferable, and 0.1% by weight or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the addition concentration is preferably 5% by weight or less, more preferably 4.5% by weight or less, and particularly preferably 4.0% by weight or less in that it is easy to suppress a decrease in the molecular weight of the oil.
  • Step (b) is a step of culturing microorganisms with a culture solution containing the oil and fat heat-treated in step (a).
  • the culture step is not particularly limited as to the method for culturing microorganisms, but for example, the method described in JP-A No. 05-93049 can be preferably used.
  • a culture solution can be prepared using a medium having a known composition as described in WO2008 / 010296.
  • the culture broth contains the oil and fat heat-treated with hydrogen peroxide in the step (a), and the lower limit of the content of the fat and oil in the culture broth is preferably 0.01% by weight or more. 0.05% by weight or more is more preferable, and 0.1% by weight or more is most preferable. This is to prevent the growth of microorganisms from being stopped or the amount of resin accumulated in the microorganisms from being reduced by depletion of fats and oils during the culture. Moreover, as an upper limit, 5 weight% or less is preferable, 1 weight% or less is more preferable, and 0.5 weight% or less is the most preferable. This is to prevent the growth of microorganisms from stopping by causing substrate inhibition or foaming trouble during the culture.
  • the microorganism that produces the microorganism-produced PHA is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce PHAs.
  • PHA poly (3-hydroxybutyrate)
  • PHB poly (3-hydroxybutyrate)
  • Examples of the copolymer-producing bacteria of hydroxybutyrate and other hydroxyalkanoates include Aeromonas caviae, which is a PHBV and PHBH-producing bacterium, and Alcaligenes eutrophus, which is a P3HB4HB-producing bacterium.
  • Aeromonas caviae which is a PHBV and PHBH-producing bacterium
  • Alcaligenes eutrophus which is a P3HB4HB-producing bacterium.
  • PHBH in order to increase the productivity of PHBH, Alkaligenes eutrophus AC32 strain (Alcaligenes eutrophus AC32, FERM BP-6038) into which genes of the PHA synthase group have been introduced (T. Fukui, Y. Doi, J. Bateriol).
  • microorganisms obtained by culturing these microorganisms under appropriate conditions and accumulating PHBH in the cells are used.
  • genetically modified microorganisms into which various PHA synthesis-related genes have been introduced may be used according to the PHA to be produced, and it is preferable to optimize the culture conditions including medium components according to the microorganism.
  • step (C) Purification step In addition to the steps (a) and (b), it is preferable to include a step (c): a step of taking out a resin component from the microorganism cultured in the step (b).
  • a step of taking out a resin component from the microorganism is also referred to as a purification process. Thereby, it can be set as the state which raised the purity of the target microorganism production resin.
  • the method for taking out the resin component from the microorganism is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a known method can be used.
  • the method described in JP 2012-115145 A can be preferably used.
  • (D) Emulsification step] In addition to the above steps (a) and (b), (d): It is preferable to include a step of emulsifying the oil and fat by adding a surfactant to the oil and fat heat-treated in the step (a). '): It is further preferable to include a step of emulsifying the oil and fat by adding a surfactant and an alkali to the oil and fat heat-treated in the step (a).
  • the process of emulsifying fats and oils is also referred to as an emulsification process.
  • the emulsification step is included between (a) the heat treatment step and (b) the culturing step.
  • a method for adding a surfactant to the oil and fat heat-treated in the step (a) will be described.
  • the surfactant can be dissolved in water and used as an emulsion.
  • the emulsified liquid is added to the fats and oils obtained in the step (a), or the fats and oils obtained in the step (a) are added to the emulsified liquids as an inclusion method.
  • emulsifying fats and oils by vigorous stirring. Cultivation of microorganisms can be further promoted by carrying out strong stirring and uniformly emulsifying.
  • the emulsifier is not particularly limited as long as it can uniformly emulsify fat and water and water, and examples thereof include a high-pressure homogenizer, an ultrasonic crusher, an emulsifier-disperser, and a bead mill.
  • Examples of the surfactant used in the step (d) or (d ′) include an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include fatty acid soaps (for example, atrium laurate, sodium palmitate, etc.); higher alkyl sulfates (for example, sodium lauryl sulfate, potassium lauryl sulfate, etc.); alkyl ether sulfates ( For example, POE lauryl sulfate triethanolamine, etc .; Phosphate ester salt (POE oleyl ether sodium phosphate, POE stearyl ether phosphate, etc.); Sulfosuccinate (eg, sodium di-2-ethylhexyl sulfosuccinate, monolauroyl monoethanol) Sodium amidopolyoxyethylene sulfosuccinate, sodium lauryl polypropylene glycol sulfosuccinate, etc.); alkylbenzene sulfonates (eg, linear dodecyl benzene sulfonate sodium Um, linear dodecyl
  • cationic surfactant examples include quaternary ammonium salts (for example, tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium hydroxide, tetrabutylammonium chloride, etc.); alkylamine salts (for example, monomethylamine hydrochloride, dimethylamine). Hydrochloride, trimethylamine hydrochloride, etc.); substances having a pyridine ring (for example, butylpyridinium chloride, dodecylpyridinium chloride, cetylpyridinium chloride, etc.).
  • quaternary ammonium salts for example, tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium hydroxide, tetrabutylammonium chloride, etc.
  • alkylamine salts for example, monomethylamine hydrochloride, dimethylamine. Hydrochloride, trimethylamine hydrochloride, etc.
  • substances having a pyridine ring for example, butylpyr
  • lipophilic nonionic surfactant examples include fatty acid monoglycerides, sorbitan fatty acid esters (for example, sorbitan monooleate, sorbitan monoisostearate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan Sesquioleate, sorbitan trioleate, diglycerol sorbitan penta-2-ethylhexylate, diglycerol sorbitan tetra-2-ethylhexylate); glycerin polyglycerin fatty acids (eg mono cottonseed oil fatty acid glycerin, glyceryl monoerucate, sesquioleic acid) Glycerin, glyceryl monostearate, ⁇ , ⁇ '-oleic acid pyroglutamic acid glycerin, monostearic acid glycerin malic acid, etc.); propylene glycol Fatty
  • hydrophilic nonionic surfactant examples include POE sorbitan fatty acid esters (for example, POE sorbitan monooleate, POE sorbitan monostearate, POE sorbitan monooleate, POE sorbitan tetraoleate, etc.); POE sorbite fatty acid Esters (eg, POE sorbite monolaurate, POE sorbite monooleate, POE sorbite pentaoleate, POE sorbite monostearate, etc.); POE glycerin fatty acid esters (eg, POE glycerin monostearate, POE glycerin monoisostearate) Rate, POE glycerin triisostearate, etc.); POE fatty acid esters (for example, POE distearate, POE monodiolate, ethylene glycol distearate) POE alkyl ethers (for example, POE lauryl ether
  • amphoteric surfactants include lecithin, amidopropyl betaines (for example, coconut oil fatty acid amidopropyl betaine, lauric acid amidopropyl betaine, myristic acid amidopropyl betaine, palm kernel oil fatty acid amidopropyl betaine, etc.); amidosulfobetaine (Amidopropyl hydroxysulfobetaine laurate, etc.); amidoamine oxides (amidopropyl dimethylamine oxide laurate, etc.); carbobetaines (eg hydroxyalkyl (C12-14) hydroxyethylmethylglycine, etc.).
  • amidopropyl betaines for example, coconut oil fatty acid amidopropyl betaine, lauric acid amidopropyl betaine, myristic acid amidopropyl betaine, palm kernel oil fatty acid amidopropyl betaine, etc.
  • amidosulfobetaine Amidopropyl hydroxysulfobetaine laur
  • casein sodium which is an anionic surfactant, is particularly preferable because it is easy to culture and emulsify.
  • the pH of the emulsion is preferably in the range of 7 to 11 in terms of easy emulsification of fats and oils.
  • the pH of the emulsion can be adjusted by adding an alkali. Therefore, it is preferable to add an alkali together with a surfactant to prepare the emulsion.
  • alkali that can be used is not particularly limited as long as the pH of the emulsion can be adjusted to 7 to 11.
  • alkali metal water including sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide and the like can be used.
  • sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide, and lithium hydroxide are preferable, and sodium hydroxide is particularly preferable in terms of industrial production and price.
  • disodium hydrogenphosphate is preferable at the point which can stabilize emulsification.
  • the preparation of the emulsion when the surfactant is used as the emulsion in the emulsification step will be specifically described.
  • the temperature of the emulsion and fat when the emulsion is added to the fat obtained in the step (a) or the fat obtained in the step (a) is added to the emulsion is higher than the melting point of the fat. Desirably, the temperature is preferably adjusted to 30 to 80 ° C. from the viewpoint of suppressing the decomposition of the surfactant and facilitating emulsification.
  • the concentration of the oil / fat obtained in the step (a) with respect to water is preferably 40 to 70% by weight of the oil / fat in terms of easy culturing. Further, the concentration of the surfactant with respect to the fats and oils obtained in the step (a) is such that a good emulsified state can be easily obtained, so that the surfactant is 0.01 to 1 weight of the fats and oils obtained in the step (a). % Is preferred.
  • microorganism-produced resin produced by the above production method is not particularly limited as long as it is a resin composition containing a microorganism-produced resin.
  • R is an alkyl group represented by C n H 2n + 1 , and n is an integer of 1 or more and 15 or less.
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • the PHA may be a homopolymer having a PHA unit structure or a copolymer in which two or more kinds are copolymerized.
  • PHA poly (3-hydroxybutyrate)
  • PHBV poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
  • PHBH poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)
  • P3HB4HB poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate
  • poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctadecanoate) etc.
  • PHB, PHBV, P3HB3HV3HH, PHBH, and P3HB4HB are easily industrially produced It is preferable from a certain point.
  • PHB, PHBV, P3HB3HV3HH, PHBH, and P3HB4HB are particularly preferable in that they have an excellent balance of properties such as mechanical properties and biodegradability.
  • the average composition ratio of the repeating units of the microorganism-produced PHA is preferably from 80 mol% to 99 mol% in terms of the balance between flexibility and strength, and the poly (3-hydroxybutyrate) composition is 85 mol%. % To 97 mol% is more preferable.
  • the composition ratio of poly (3-hydroxybutyrate) is less than 80 mol%, the rigidity tends to be insufficient, and when it exceeds 99 mol%, the flexibility tends to be insufficient.
  • the ratio of each monomer that is a repeating unit in the copolymer resin of PHA can be measured by gas chromatography as follows. To about 20 mg of dried PHA, 2 ml of a sulfuric acid / methanol mixture (15/85 (weight ratio)) and 2 ml of chloroform are added and sealed, and heated at 100 ° C. for 140 minutes to obtain the methyl ester of the PHA decomposition product. After cooling, 1.5 g of sodium hydrogen carbonate is added little by little to neutralize it, and the mixture is allowed to stand until the generation of carbon dioxide gas stops.
  • the monomer unit composition of the PHA decomposition product in the supernatant is analyzed by capillary gas chromatography to determine the ratio of each monomer in the copolymer resin.
  • GC-17A manufactured by Shimadzu Corporation was used, and “NEUTRA BOND-1” manufactured by GL Science Co., Ltd. (column length: 25 m, column inner diameter: 0.25 mm, liquid film thickness: 0.2 mm). 4 ⁇ m) is used. He is used as the carrier gas, the column inlet pressure is 100 kPa, and 1 ⁇ l of the sample is injected. As temperature conditions, the temperature is raised from an initial temperature of 100 ° C. to 200 ° C. at a rate of 8 ° C./min, and further from 200 to 290 ° C. at a rate of 30 ° C./min.
  • the microorganism-produced resin produced by the production method of the present invention has little odor and coloring, so agriculture, fishery, forestry, horticulture, medicine, hygiene, food industry, clothing, non-clothing, packaging, automobiles, building materials, other It can be suitably used in the field. In particular, it can be particularly suitably used in the medical and hygiene fields such as biocompatible plastics such as drug carriers.
  • the color tone (HPLC analysis) was measured as follows. Add 0.5 ml of methanol to 0.5 g of PHA dry powder, treat with ultrasound for 30 minutes, extract the causative agent of coloration, filter it with a 0.45 ⁇ m PTFE membrane filter, and select “Prominence” (Shimadzu Corporation) HPLC analysis was performed. The degree of color tone was evaluated by calculating the area of the peak of ubiquinone-8 which is a causative substance of coloring in PHA from the chart of the HPLC analysis result. A material containing a large amount of ubiquinone-8 indicates a strong coloring.
  • ⁇ Color sensory evaluation> For the sensory evaluation of the color tone of the culture solution, the evaluation was performed by 10 evaluators regarding the culture solution immediately after the completion of the culture, and when 6 or more people judged white or cream color, ⁇ , 6 people The case where it was judged that there was clear coloring such as yellow or brown as described above was rated as x. Further, the sensory evaluation of the color tone of dry PHA was evaluated by the same method as in the case of the culture solution after weighing 50 g of dry PHA into a screw tube.
  • the color (YI value) was measured as follows.
  • a PHA press sheet was prepared, and its YI value was measured.
  • the PHA press sheet is prepared by sandwiching 3.0 g of dried PHA between 15 cm square metal plates and inserting metal plates with a thickness of 0.5 mm into the four corners of the metal plate. (Haka type made by Takabayashi Rika Co., Ltd.), heated at 160 ° C for 7 minutes, then pressed while heating at about 5Mps for 2 minutes, and then left at room temperature to cure PHA. I went in a dripping way.
  • the YI value was measured with a color difference meter “SE-2000” (manufactured by Nippon Denshoku Co., Ltd.) using a 30 mm measuring plate and a white standard plate placed thereon.
  • ⁇ Odor sensory evaluation> For the odor sensory evaluation of fats and oils, weigh 50ml of fats and oils into a screw tube and have 10 evaluators smell the odors. When 6 or more people feel that the odor is weak, When it felt, it was set as x. For the odor sensory evaluation of dry PHA, 50 g of dry PHA was weighed on a screw tube and evaluated by the same method as that for fats and oils.
  • Palm Fatty Acid Distillate (hereinafter sometimes referred to as PFAD oil) which is a residual oil of palm palm-derived oil and fat
  • EFB compressed oil Empty Fruit Bunches compressed oil
  • the color tone (absorbance) is measured and the odor sensory evaluation is performed. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 For culture purification, Ralstonia eutropha KNK-005 strain described in paragraph [0049] of WO2008 / 010296 was cultured in the same manner as described in paragraphs [0050] to [0053], and PHA A bacterial cell culture solution containing bacterial cells containing This will be described in detail below.
  • As the carbon source 70 parts by weight of the emulsified liquid prepared in Preparation Example 5 was added to and mixed with 130 parts by weight of the treated oil and fat prepared in Preparation Example 1.
  • composition of the seed medium is 1% (w / v) Meat-extract, 1% (w / v) Bacto-Tryptone, 0.2% (w / v) Yeast-extract, 0.9% (w / v ) Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.15% (w / v) KH 2 PO 4 (pH 6.8).
  • the composition of the preculture medium is 1.1% (w / v) Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19% (w / v) KH 2 PO 4 , 1.29% (w / v) (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O, 2.5% (w / v) palm double olein oil, 0.5% (v / v) trace metal salt solution ( 1.6N (w / v) FeCl 3 .6H 2 O, 0.1% (w / v) CaCl 2 .2H 2 O, 0.02% (w / v) CoCl 2 .6H 2 O in 0.1N hydrochloric acid 0.016% (w / v) CuSO 4 .5H 2 O, 0.012% (w / v) NiCl 2 .6H 2 O dissolved).
  • the composition of the resin production medium is 0.385% (w / v) Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.067% (w / v) KH 2 PO 4 , 0.291% (w / v) (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O, 0.5% (v / v) Trace metal salt solution (1.6% (w / v) in 0.1N hydrochloric acid FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1% (w / v) CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02% (w / v) CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016% (w / v) CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.012% (w / v) NiCl 2 ⁇ 6H 2 O dissolved), 0.05% (w / v) BIOSPUREX 200K (antifoaming agent: manufactured by Cognis Japan).
  • the treated fat and oil prepared in Preparation Example 1 was used as a single carbon source, and the specific substrate supply rate was 0.08 to 0.1 (g fat and oil) ⁇ (g net dry cell weight) throughout the culture. -1 ⁇ (h) -1 was added.
  • a glycerol stock (50 ⁇ l) of KNK-005 strain was inoculated into a seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to perform seed culture.
  • 1.0% (v / v) of a seed culture solution was inoculated into a 3 L jar fermenter (MDL-300, manufactured by Maruhishi Bio-Engine) containing 1.8 L of a preculture medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 33 ° C., a stirring speed of 500 rpm, an aeration rate of 1.8 L / min, and the culture was performed for 28 hours while controlling the pH between 6.7 and 6.8.
  • a 7% aqueous ammonium hydroxide solution was used for pH control.
  • the cells were collected by centrifugation, and subjected to high-pressure crushing at a pressure of 450 to 550 kgf / cm 2 using an enzyme treatment and a high-pressure crusher (high-pressure homogenizer model PA2K type manufactured by Niro Soavi).
  • the crushing liquid after high-pressure crushing was centrifuged, the supernatant was removed, and the recovered PHA solution was agglomerated and dried.
  • the obtained PHA dry powder was subjected to odor sensory evaluation, color (YI value) measurement, and color tone (HPLC analysis). The results are shown in Table 2.
  • Example 2 As the carbon source used in the culture medium, the same as in Example 1 except that the emulsified liquid obtained using the treated oil and fat prepared in Preparation Example 4 instead of the treated oil and fat prepared in Preparation Example 1 was used. PHA dry powder was obtained by this method. The obtained PHA dry powder was subjected to odor sensory evaluation, color (YI value) measurement, and color tone (HPLC analysis). The results are shown in Table 2.
  • Example 1 A PHA dry powder was obtained in the same manner as in Example 1 except that PFAD oil that was not treated in Preparation Example 1 was used as the carbon source used in the medium.
  • the obtained PHA dry powder was subjected to odor sensory evaluation, color (YI value) measurement, and color tone (HPLC analysis). The results are shown in Table 2.
  • the PHA of Example 1 produced by the production method of the present invention was compared with the PHA of Comparative Example 1 produced using fats and oils not treated with hydrogen peroxide solution.
  • the peak area of 8 was small, that is, the content of ubiquinone-8 as an impurity was extremely small, and the YI value was also small, that is, the coloring was small.
  • PHA of Example 2 manufactured using the oil and fat heat-processed at 120 degreeC which is less colored than the oil and fat processed at 95 degreeC has a color tone compared with PHA in Example 1 by the measurement of (HPLC analysis). Although the peak area of ubiquinone-8 was slightly higher, the content of ubiquinone-8 was less than the PHA of Comparative Example 1, and the coloring was also less.
  • Example 3 As the carbon source used in the medium, the same procedure as in Example 1 was used except that the treated oil and fat prepared in Preparation Example 2 was used instead of the treated fat and oil prepared in Preparation Example 1. Culture was performed by the method. The obtained bacterial cell culture was subjected to color sensory evaluation, and the results are shown in Table 3.
  • Example 2 It cultured by the method similar to Example 3 except having used EFB pressing oil which does not process the preparation example 2 as a carbon source used for a culture medium. The obtained bacterial cell culture was subjected to color sensory evaluation, and the results are shown in Table 3.
  • Example 4 As the carbon source used in the medium, the same procedure as in Example 1 was used except that the treated oil and fat prepared in Preparation Example 3 was used instead of the treated oil and fat prepared in Preparation Example 1. Culture was performed by the method to obtain PHA dry powder. The obtained bacterial cell culture solution and PHA dry powder were subjected to color sensory evaluation, and the results are shown in Table 3.
  • Example 3 A PHA dry powder was obtained by culturing in the same manner as in Example 4 except that the dark oil not treated in Preparation Example 3 was used as the carbon source used in the medium.
  • the obtained bacterial cell culture solution and PHA dry powder were subjected to color sensory evaluation, and the results are shown in Table 3.
  • the culture solutions of Examples 3 and 4 containing PHA produced by the production method of the present invention are the culture solutions of Comparative Examples 2 and 3 containing PHA produced using fats and oils not treated with hydrogen peroxide. Compared with, the coloring was clearly less. Moreover, Example 4 which obtained PHA dry powder clearly had little coloring compared with the comparative example 3.

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Abstract

工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、着色が少なく色調が良好であり、臭気が少ない微生物産生樹脂の製造方法を提供する。　下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含むことを特徴とする微生物産生樹脂の製造方法。 （ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程 （ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程

Description

微生物産生樹脂の製造方法及び微生物産生樹脂
　本発明は、微生物産生樹脂の製造方法及び微生物産生樹脂に関する。
　微生物産生樹脂、中でもポリヒドロキシアルカノエート（以後、ＰＨＡと称することがある。）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解され、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになるため、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチック材料である。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に優しいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体などの生体適合性プラスチックとして利用が可能と考えられており、実用化が期待されている。
　しかしながら、微生物産生のＰＨＡには、その製造に際し、培養工程などで着色してしまうという課題があった。特許文献１には、微生物が産生したＰＨＡを含有する微生物細胞の水性懸濁液に酵素処理を行った後、アルカリ及び界面活性化剤を添加し、比較的低温で物理的破砕処理を行うことで、黄色度指数（ＹＩ値）が１５．０以下のＰＨＡを得る方法が記載されている。しかしながら、ＰＨＡの分子量の低下を防ぐために処理温度等の処理条件や処理に用いる添加物の種類や量等が制限されてしまうという、加工性の点で改善の余地があった。さらに、ＰＨＡの色調を改善するために、薬剤を多量に要する、設備が大規模となるという点で、この方法は、実用化が困難であった。
特開２０１２－１１５１４５号公報
　本発明の目的は、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、着色が少なく色調が良好であり、臭気が少ない微生物産生樹脂の製造方法を提供する。
　本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、下記［１］～［９］の微生物産生樹脂の製造方法、および下記［１０］の微生物産生樹脂を提供する。
［１］下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含むことを特徴とする微生物産生樹脂の製造方法。
（ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程
（ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程
［２］前記（ａ）工程において、５０℃以上１５０℃未満の温度で加熱処理することを特徴とする［１］に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［３］前記油脂が、植物由来の油脂を含有していることを特徴とする［１］または［２］に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［４］前記油脂が、残渣油を含有していることを特徴とする［１］または［２］に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［５］前記油脂が、パームやし由来の油脂を含有していることを特徴とする［１］または［２］に記載の微生物産生樹脂の製造方法
［６］（ｃ）：前記（ｂ）工程で培養した微生物から樹脂成分を取り出す工程を含むことを特徴とする［１］～［５］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［７］（ｄ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤を含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする［１］～［６］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［８］（ｄ’）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤及び水酸化ナトリウムを含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする［１］～［６］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［９］前記微生物産生樹脂がポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする［１］～［８］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［１０］［１］～［９］のいずれか１に記載の製造方法により製造された微生物産生樹脂。
　本発明の製造方法によれば、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、着色が少なく色調が良好であり、臭気が少ない微生物産生樹脂を製造することができる。
　以下、好ましい実施の形態の一例を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
　微生物産生樹脂の製造方法は、下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含む。
（ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程
（ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程
　本発明者は、微生物産生樹脂の着色の原因は、微生物による樹脂産生時に生成するユビキノン類、特にユビキノン－８であることを見出した。本発明の微生物産生樹脂の製造方法は、微生物培養時のユビキノン－８の生成量を抑制することにより、簡便且つ安価に、着色が少なく色調が良好な樹脂を製造するものである。
　以下に各工程について詳細に説明する。
　［（ａ）加熱処理工程］
　（ａ）工程は、油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程である。加熱工程における加熱温度は、培養液中のユビキノン－８の生成が抑制できる油脂が得られればとくに限定されないが、ユビキノン－８の生成が抑制され、着色が少なく、ＹＩ値が低い樹脂が得られやすい点や、油脂の着色が少ないことや脱臭等の効果がより得られやすい点で、処理温度の下限は、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましく、７０℃以上が特に好ましい。また、油脂の分解や高温になりすぎることによる着色を抑制しやすい点で、処理温度の上限は、１５０℃未満が好ましく、１３０℃未満がより好ましく、１２０℃未満が特に好ましい。上記温度範囲で油脂を処理することにより、ユビキノン－８の生成がより抑制され、着色の少ない樹脂が得られる。
　また、加熱処理の時間としては、ユビキノン－８の生成が抑制できる油脂が得られれば特に制限は無いが、油脂の着色が少ないことや脱臭等の効果が得られやすい点で、下限が０．５時間以上が好ましく、１．５時間以上がより好ましく、２．０時間以上がさらに好ましい。また、加熱処理時間の上限は、生産性の確保や油脂の着色が抑制しやすい点で、６時間以下が好ましく、５時間以下がより好ましい。
　加熱処理を行う間、過酸化水素を含有した油脂を撹拌することが好ましい。その撹拌方法は、油脂と過酸化水素が均一に混合できれば特に制限されないが、液滴が細かく均一になりやすい方法としてタービン翼を高回転数で回転させて混合する方法を好ましく用いることができる。
　（油脂）
　油脂は、微生物を培養することができれば特に限定されず、飽和脂肪酸・不飽和脂肪酸の含有率に関係なく使用することができる。具体的には、例えば、牛脂、骨油、豚脂、鶏油、鯨油、羊脂、山羊脂、馬油、乳脂、皮脂及び魚油など動物由来の油脂；パーム油、パーム核油、パームオレイン油などのパームやし（アブラヤシとも称する）由来の油脂、ココヤシ由来のヤシ油、コーン油、オリーブ油、ミツバ種子油、油綿実油、ヒマシ油、大豆油、菜種油、ひまわり油、米油及びサフラワー油等の植物由来の油脂；あるいは、それら油脂の残渣油を用いることができる。また、残渣油の中でも、特に油脂精製時の脱酸工程で発生した脂肪酸等からなるダーク油を用いることができる。
　ここで、残渣油とは、油脂の精製時における油脂の蒸留工程で、蒸留後に蒸留容器内に残った油脂を含む、油脂の精製により生じた精製により目的とする部分を除いた残りの部分のことを指し、蒸留成分（製品としての油脂）よりも色調が高い成分である。残渣油は、着色や臭気が強いため、一般的には、微生物産生樹脂の製造には適しておらず使用されないが、本発明の製造方法に依れば、残渣油を使用したとしても、着色や臭気が少なく実用に耐えうる微生物産生樹脂を製造することができる。
　また、ダーク油とは、残渣油のうち、油脂の精製時の脱酸工程で発生したソーダ油滓を硫酸分解した脂肪酸が主体の油脂をいう。油脂の種類は動物由来および植物由来を問わない。
　上記油脂の中でも、入手性の観点からは、植物由来の油脂を用いることが好ましい。費用や入手性の点で、パーム油、パーム核油などのパームやし由来の油脂を用いることが好ましい。また、色調や臭気の面で好ましくないものの、廃棄物及び非可食原料を使用するため、環境負荷が少ない点及び費用の点で、残渣油が好ましい。入手性の観点から、残渣油の中でも特に、パーム核油などのパームやし由来の油脂の残渣油を用いることが好ましい。
　（過酸化水素）
　過酸化水素は、ユビキノン－８の生成を抑制することができれば限定されず、気体状、水や有機溶媒などの溶媒に溶解した液体状でも好ましく用いることが出来るが、油脂との均一混合が容易であるという点で、過酸化水素を水に混合させた過酸化水素水を用いることがより好ましい。
　過酸化水素水を用いる場合、過酸化水素水における過酸化水素濃度は、ユビキノン－８の生成を抑制し、色調低減効果に優れる点において、１重量％以上が望ましく、５重量％がより好ましく、１０重量％以上が特に好ましい。また、過酸化水素水における過酸化水素濃度の上限は、入手性や取り扱い性の点で、７０重量％以下が好ましく、６５重量％がより好ましく、６０重量％が特に好ましい。
　過酸化水素水の油脂類への添加濃度としては、濃度が高い方が好ましいが、油脂および最終的に得られる微生物産生樹脂の色調低減効果が得られやすい点から、下限が、０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましく、１重量％以上が特に好ましい。また、油脂の分解を抑制しやすい点で、添加濃度の上限は９０重量％以下が好ましく、８５重量％以下がより好ましく、８０重量％以下が特に好ましい。
　また、過酸化水素添加時に、油脂のユビキノン－８の生成をより抑制させるため、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の水酸化物塩または炭酸塩を添加することが好ましい。特に、後の工程として（ｄ）工程を有する場合に、界面活性剤の使用量を抑制出来る点で、アルカリ金属の水酸化物塩を用いることが好ましい。
　アルカリ金属の水酸化物塩または炭酸塩を用いる場合、添加濃度の下限は、最終的に得られる微生物産生樹脂の色調低減効果が得られやすい点で、過酸化水素水の量に対して、０．０１重量％以上が好ましく、０．０５重量％以上がより好ましく、０．１重量％以上が特に好ましい。また、油脂の分子量の低下を抑制しやすい点で、添加濃度の上限は、５重量％以下が好ましく、４．５重量％以下がより好ましく、４．０重量％以下が特に好ましい。以下に、本発明の生分解性プラスチックの製造方法の一態様について、詳細に説明するが、本発明の製造方法は、これに限定されない。
　［（ｂ）培養工程］
　（ｂ）工程は、前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程である。培養工程としては、微生物の培養方法については特に限定はないが、例えば特開平０５－９３０４９号公報等に挙げられる方法を好ましく用いることができる。
　（培養液）
　国際公開第２００８／０１０２９６号に記載されるような公知の組成の培地を用いて、培養液を調製することができる。培養液には、（ａ）工程で過酸化水素を含有させて加熱処理した油脂が含まれるが、その培養液における油脂の含有量の下限値としては、０．０１重量％以上が好ましく、０．０５重量％以上がより好ましく、０．１重量％以上が最も好ましい。培養中に油脂が枯渇することによって、微生物の増殖が停止、または微生物内に蓄積した樹脂が減少しないようにするためである。また、上限値としては、５重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましく、０．５重量％以下が最も好ましい。培養中に基質阻害や発泡トラブルを起こすことによって、微生物の増殖が停止しないようにするためである。
　（微生物）
　微生物産生ＰＨＡを生産する微生物としては、ＰＨＡ類生産能を有する微生物であれば特に限定されない。例えば、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（以下、「ＰＨＢ」と略称する。）生産菌としては、１９２５年に発見されたＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍが最初で、他にもカプリアビダス・ネケイター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）（旧分類：アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、ラルストニア・ユートロフア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓ）などの天然微生物が知られており、これらの微生物ではＰＨＢが菌体内に蓄積される。
　また、ヒドロキシブチレートとその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体生産菌としては、ＰＨＢＶおよびＰＨＢＨ生産菌であるアエロモナス・キヤビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）などが知られている。特に、ＰＨＢＨに関し、ＰＨＢＨの生産性を上げるために、ＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス　ＡＣ３２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　ＡＣ３２，　ＦＥＲＭ　ＢＰ－６０３８）（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐ４８２１－４８３０（１９９７））などがより好ましく、これらの微生物を適切な条件で培養して菌体内にＰＨＢＨを蓄積させた微生物菌体が用いられる。また上記以外にも、生産したいＰＨＡに合わせて、各種ＰＨＡ合成関連遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物を用いても良いし、微生物に合わせて培地成分を含む培養条件を最適化することが好ましい。
　［（ｃ）精製工程］
　上記（ａ）工程および（ｂ）工程の他、（ｃ）：前記（ｂ）工程で培養した微生物から樹脂成分を取り出す工程を含むことが好ましい。このように微生物から樹脂成分を取り出す工程は精製工程ともいう。これにより、目的とする微生物産生樹脂の純度を高めた状態とすることができる。
　微生物から樹脂成分を取り出す方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができ、例えば、特開２０１２－１１５１４５号公報に挙げられる方法を好ましく用いることができる。
　［（ｄ）乳化工程］
　上記（ａ）工程および（ｂ）工程の他、（ｄ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤を含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことが好ましく、（ｄ’）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤及びアルカリを含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことがさらに好ましい。このように、油脂を乳化させる工程を、乳化工程ともいう。
　（ｄ）または（ｄ’）乳化工程は、（ａ）加熱処理工程と（ｂ）培養工程の間に含む。
　前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に、界面活性剤を含有させる方法について述べる。界面活性剤は、水に溶解させ、これを乳化液として用いることができる。その含有方法として、具体的には、（ａ）工程で得られた油脂に当該乳化液を添加し、または、当該乳化液に（ａ）工程で得られた油脂を添加した後、乳化機により、強撹拌を行い油脂を乳化させることが挙げられる。強撹拌を行い均一に乳化させることにより、微生物の培養をより促進させることが出来る。ここで、乳化機は、油脂と水を均一に乳化させることができる装置であれば特に限定されないが、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、ビーズミル等が挙げられる。
　（ｄ）または（ｄ’）工程で使用する界面活性剤としては、陰イオン界面活性化剤、陽イオン界面活性化剤、両性界面活性化剤、非イオン界面活性化剤が挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸セッケン（例えば、ラウリン酸アトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）；高級アルキル硫酸エステル塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム等）；アルキルエーテル硫酸エステル塩（例えば、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン等）；リン酸エステル塩（ＰＯＥオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ＰＯＥステアリルエーテルリン酸等）；スルホコハク酸塩（例えば、ジ－２－エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等）；アルキルベンゼンスルホン酸塩（例えば、リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、リニアドデシルベンゼンスルホン酸等）；高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩（例えば、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等）；Ｎ－アシルグルタミン酸塩（例えば、Ｎ－ラウロイルグルタミン酸モノナトリウム、Ｎ－ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ－ミリストイル－Ｌ－グルタミン酸モノナトリウム等）；硫酸化油（例えば、ロート油等）；ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸；ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩；α－オレフィンスルホン酸塩；高級脂肪酸エステルスルホン酸塩；二級アルコール硫酸エステル塩；高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩；ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム；Ｎ－パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン；カゼインナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム等が挙げられる。
　陽イオン界面活性化剤としては、例えば、第４級アンモニウム塩（例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム等）；アルキルアミン塩（例えば、モノメチルアミン塩酸塩、ジメチルアミン塩酸塩、トリメチルアミン塩酸塩等）；ピリジン環を有する物質（例えば、塩化ブチルピリジニウム、塩化ドデシルピリジニウム、塩化セチルピリジニウム等）等が挙げられる。
　親油性非イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ－２－エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ－２－エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン等）；グリセリンポリグリセリン脂肪酸類（例えば、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α’－オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸等）；プロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、モノステアリン酸プロピレングリコール等）；硬化ヒマシ油誘導体；グリセリンアルキルエーテル等が挙げられる。
　親水性非イオン性界面活性剤としては、例えば、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンテトラオレエート等）；ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥソルビットモノラウレート、ＰＯＥソルビットモノオレエート、ＰＯＥソルビットペンタオレエート、ＰＯＥソルビットモノステアレート等）；ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥグリセリンモノステアレート、ＰＯＥグリセリンモノイソステアレート、ＰＯＥグリセリントリイソステアレート等）；ＰＯＥ脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥジステアレート、ＰＯＥモノジオレエート、ジステアリン酸エチレングリコール等）；ＰＯＥアルキルエーテル類（例えば、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥオレイルエーテル、ＰＯＥステアリルエーテル、ＰＯＥベヘニルエーテル、ＰＯＥ－２－オクチルドデシルエーテル、ＰＯＥコレスタノールエーテル等）；プルロニック型類（例えば、プルロニック等）；ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（例えば、ＰＯＥ・ＰＯＰセチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ－２－デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰモノブチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ水添ラノリン、ＰＯＥ・ＰＯＰグリセリンエーテル等）；テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物類（例えば、テトロニック等）；ＰＯＥヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体（例えば、ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油トリイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、ＰＯＥ硬化ヒマシ油マレイン酸等）；ＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体（例えば、ＰＯＥソルビットミツロウ等）；アルカノールアミド（例えば、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等）；ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル；ＰＯＥアルキルアミン；ＰＯＥ脂肪酸アミド；ショ糖脂肪酸エステル；アルキルエトキシジメチルアミンオキシド；トリオレイルリン酸等が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えば、レシチン、アミドプロピルベタイン類（例えば、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ミリスチン酸アミドプロピルベタイン、パーム核油脂肪酸アミドプロピルベタイン等）；アミドスルホベタイン類（ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等）；アミドアミンオキシド類（ラウリン酸アミドプロピルジメチルアミンオキシド等）；カルボベタイン類（例えば、ヒドロキシアルキル（Ｃ１２－１４）ヒドロキシエチルメチルグリシン等）が挙げられる。
　（ｄ）または（ｄ’）工程で使用する界面活性剤の中でも、特に培養および乳化させやすい点で、陰イオン性界面活性剤であるカゼインナトリウムが好ましい。
　乳化工程において界面活性剤を乳化液として用いる場合に、その乳化液のｐＨは、油脂を乳化させやすい点で、乳化液のｐＨを７～１１の範囲にすることが好ましい。乳化液のｐＨの調製は、アルカリを添加することにより行うことができる。よって、その乳化液の調製には、界面活性剤と共にアルカリを添加することが好ましい。
　使用できるアルカリとしては、乳化液のｐＨを７～１１に調整することが出来れば特に限定されるものではなく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等を含めたアルカリ金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の有機酸のアルカリ金属塩；ホウ砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、りん酸水素二ナトリウム１２水、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウム等のアルカリ金属のリン酸塩；水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；あるいはアンモニア水等が挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。また、タンパク質を併用している場合、乳化が安定化できる点で、りん酸水素二ナトリウムが好ましい。
　（ｄ）または（ｄ’）乳化工程において界面活性剤を乳化液として用いる場合における、乳化液の調製について具体的に述べる。（ａ）工程で得られた油脂に当該乳化液を添加し、または、当該乳化液に（ａ）工程で得られた油脂を添加する時の乳化液と油脂の温度は、油脂の融点以上が望ましく、界面活性剤の分解を抑制し乳化させやすい点で、３０～８０℃に調整することが好ましい。
　（ａ）工程で得られた油脂に、界面活性剤を含有させる際のそれぞれの含有量について述べる。界面活性剤を乳化液として用いる場合、水に対する（ａ）工程で得られた油脂の濃度は、培養しやすい点で、油脂が水の４０～７０重量％であることが好ましい。また、（ａ）工程で得られた油脂に対する界面活性剤の濃度は、良好な乳化状態がえられやすい点で、界面活性剤が（ａ）工程で得られた油脂の０．０１～１重量％であることが好ましい。
　（微生物産生樹脂）
　上記の製造方法で製造される微生物産生樹脂は、微生物産生樹脂を含有する樹脂組成物であれば特に制限されないが、生分解性に優れている点で、下記一般式（１）
［－ＣＨＲ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－］　（１）
（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと称することがある。）で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが好ましい。
　ＰＨＡは、ＰＨＡ単位構造の単重合体であっても、２種以上が共重合した共重合体であってもよい。例えば、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、〔ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３-ヒドロキシバレレート－ｃｏ－３-ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシオクタデカノエート）等を工業的に生産が容易である点から好ましい。これらのなかでも特に、機械的特性や生分解性等の特性バランスに優れている点で、ＰＨＢ、ＰＨＢＶ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ、ＰＨＢＨ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢが好ましい。
　前記微生物産生ＰＨＡの繰り返し単位の平均組成比は、柔軟性と強度のバランスの観点から、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）の組成比が８０モル％～９９モル％であることが好ましく、８５モル％～９７モル％であることがより好ましい。ポリ（３－ヒドロキシブチレート）の組成比が８０モル％未満であると剛性が不足する傾向があり、９９モル％より多いと柔軟性が不足する傾向がある。
　前記ＰＨＡの共重合樹脂中の繰り返し単位である各モノマー比率は、以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定できる。乾燥ＰＨＡ約２０ｍｇに、２ｍｌの硫酸／メタノール混液（１５／８５（重量比））と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得る。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生が止まるまで放置する。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、上清中のＰＨＡ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析することにより、共重合樹脂中の各モノマー比率を求められる。
　前記ガスクロマトグラフとしては、島津製作所社製「ＧＣ－１７Ａ」を用い、キャピラリーカラムにはＧＬサイエンス社製「ＮＥＵＴＲＡ　ＢＯＮＤ－１」（カラム長：２５ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ、液膜厚：０．４μｍ）を用いる。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧を１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌ注入する。温度条件は、８℃／分の速度で初発温度１００℃から２００℃まで昇温し、さらに２００～２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温する。
　本発明の製造方法により製造される微生物産生樹脂は、臭いや着色が少ないため、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、食品産業、衣料、非衣料、包装、自動車、建材、その他の分野に好適に用いることができる。特に、薬物担体などの生体適合性プラスチック等の医学、衛生品分野に特に好適に用いることが出来る。
　次に本発明を以下の実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、以下の例に限定されるものではない。
　＜色調（吸光度）の測定＞
　油脂の色調の測定は以下のとおり行った。油脂をその油脂の融点以上に加温し、十分溶融させた状態で、測定用セルにセッティングし、吸光度計「ＵＶ－１７００」（島津製作所社製）にて、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し色調を評価した。過酸化水素を含有させて加熱処理した油脂については、油脂を静置して得られた油層部分の油脂を回収し、その回収した油脂について色調（吸光度）の測定を行った。尚、吸光度の高い油脂は、強く着色していることを示す。
　＜色調（ＨＰＬＣ分析）の測定＞
　色調（ＨＰＬＣ分析）の測定は、以下のとおり行った。ＰＨＡ乾燥紛体０．５ｇに、メタノール３ｍｌ添加し、超音波で３０分間処理し、着色の原因物質を抽出し、これを０．４５μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルターで濾過して、「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ」（島津製作所製）にてＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析結果のチャートから、ＰＨＡ中の着色の原因物質であるユビキノン－８のピークの面積を算出することにより色調の度合いを評価した。ユビキノン－８を多く含む材料は、着色が強いことを示している。
　＜色調官能評価＞
　培養液の色調官能評価は、培養が終了した直後の培養液について１０名の評価者に何色といえるか判断してもらい、６人以上が白またはクリーム色と判断した場合を○、６人以上が黄色または茶色等の明らかな着色があると判断した場合を×とした。また、乾燥ＰＨＡの色調官能評価は、乾燥ＰＨＡをスクリュー管に５０ｇはかり取り、培養液の場合と同様の方法により評価した。
　＜色味（ＹＩ値）の測定＞
　色味（ＹＩ値）の測定は、以下のとおり行った。ＰＨＡのプレスシートを作製し、そのＹＩ値を測定した。ＰＨＡのプレスシートの作製は、乾燥させたＰＨＡ３．０ｇを、１５ｃｍ四方の金属板で挟み、さらに金属板の四隅に厚さ０．５ｍｍの金属板を挿入して、これを実験用小型プレス機（高林理化株式会社製Ｈ－１５型）にセットして、１６０℃にて７分間加温後、約５Ｍｐｓにて２分間加熱しながらプレスし、プレス後は室温に放置してＰＨＡを硬化させたる方法で行った。ＹＩ値は、色差計「ＳＥ－２０００」（日本電色社製）にて、３０ｍｍ測定板を使ってプレスシートを載せ、その上に白色標準板を被せて測定した。
　＜臭気官能評価＞
　油脂の臭気官能評価は、油脂をスクリュー管に５０ｍｌはかり取り、１０名の評価者に臭いを嗅いでもらい、６人以上が臭気が弱いと感じた場合を○、６人以上が臭気が強いと感じた場合を×とした。乾燥ＰＨＡの臭気官能評価は、乾燥ＰＨＡをスクリュー管に５０ｇはかり取り、油脂の場合と同様の方法により評価した。
　（油脂の評価）
　パームやし由来の油脂の残渣油であるＰａｌｍ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ（以下、ＰＦＡＤ油と称することがある）、パームやし由来の油脂の残渣油であるＥｍｐｔｙ　Ｆｒｕｉｔ　Ｂｕｎｃｈｅｓ圧搾油（以下、ＥＦＢ圧搾油と称することがある。）、及び食用油を製造する過程の脱酸工程で分離される脂肪酸を主とした副産物であるダーク油のそれぞれについて、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。
　（調製例１）
　パームやし由来の油脂の残渣油であるＰＦＡＤ油を、１Ｌのセパラブルフラスコに５００ｇとり、一段タービン翼により撹拌し、９５℃まで昇温した。その後、３０ｗｔ％の過酸化水素水を５０ｇ添加し、３．５時間反応させた。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。
　（調製例２）
　パームやし由来の油脂の残渣油であるＥＦＢ圧搾油を、１Ｌのセパラブルフラスコに５００ｇとり、一段タービン翼により撹拌し、９０℃まで昇温した。その後、３０ｗｔ％の過酸化水素水を５０ｇ添加し、１．５時間反応させた。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。
　（調製例３）
　食用油を製造する過程の脱酸工程で分離される脂肪酸を主とした副産物であるダーク油を、１Ｌのセパラブルフラスコに５００ｇとり、一段タービン翼により撹拌し、７０℃まで加熱した。その後、３０ｗｔ％の過酸化水素水を１５０ｇと３０ｗｔ％水酸化ナトリウムを２１０μＬ添加し、５時間反応させた。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。
　（調製例４）
　ＰＦＡＤ油の温度を９５℃まで昇温したことに代えて、１２０℃まで昇温した以外は、調製例１と同様の方法で、ＰＦＡＤ油を処理した。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。
　（調製例５）
　水７０ｇにりん酸水素二ナトリウムを０．９４５ｇとカゼインナトリウムを０．６５ｇを混合し、均一になるまで室温で撹拌し、乳化液を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　調製例１～調製例４の結果から、（ａ）加熱処理工程により、油脂の色調と臭気を低減できていることが分かる。
　（実施例１）
　培養精製には、国際公開第２００８／０１０２９６号段落［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ－００５株を、同段落［００５０］～［００５３］に記載の方法と同様の方法で培養し、ＰＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。以下に詳述する。炭素源としては、調製例１で調製した処理後の油脂１３０重量部に、調製例５で作成した乳化液７０重量部を添加して混合したものを用いた。
　種母培地の組成は、１％（ｗ／ｖ）　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１％（ｗ／ｖ）　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％（ｗ／ｖ）　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％（ｗ／ｖ）　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。前培養培地の組成は、１．１％（ｗ／ｖ）　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９％（ｗ／ｖ）　ＫＨ２ＰＯ４、１．２９％（ｗ／ｖ）　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５％（ｗ／ｖ）パームダブルオレイン油、０．５％（ｖ／ｖ）　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％（ｗ／ｖ）　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％（ｗ／ｖ）　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％（ｗ／ｖ）　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％（ｗ／ｖ）　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。
　樹脂生産培地の組成は０．３８５％（ｗ／ｖ）　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７％（ｗ／ｖ）　ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１％（ｗ／ｖ）　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）　微量金属塩溶液（０．１Ｎ　塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％（ｗ／ｖ）　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％（ｗ／ｖ）　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％（ｗ／ｖ）　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％（ｗ／ｖ）　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５％（ｗ／ｖ）　ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。炭素源は調製例１で調製した処理後の油脂を単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８～０．１（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量)－１×（ｈ）－１となるように流加した。
　ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－１０００型）に５．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源として調製例１で調製した処理後の油脂を使用した。培養は６４時間行った。得られた菌体培養液を６０℃で３０分間滅菌した。その後、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、酵素処理および高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で４５０～５５０ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。
　高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を排除し、回収したＰＨＡ溶液を凝集し、乾燥した。得られたＰＨＡ乾燥紛体について臭気官能評価、色味（ＹＩ値）の測定、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定を行い、その結果を表２に示した。
　（実施例２）
　培地に用いる炭素源として、調製例１で調製した処理後の油脂に代えて調製例４で調製した処理後の油脂を用いて得られた乳化液を用いた以外は、実施例１と同様の方法でＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られたＰＨＡ乾燥紛体について臭気官能評価、色味（ＹＩ値）の測定、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定を行い、その結果を表２に示した。
　（比較例１）
　培地に用いる炭素源として、調製例１の処理をしないＰＦＡＤ油を用いた以外は、実施例１と同様の方法でＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られたＰＨＡ乾燥紛体について臭気官能評価、色味（ＹＩ値）の測定、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定を行い、その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　本発明の製造方法で製造された実施例１のＰＨＡは、過酸化水素水で処理していない油脂を用いて製造された比較例１のＰＨＡに比べ、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定によるユビキノン－８のピーク面積が小さく、つまり不純物であるユビキノン－８の含有量がきわめて少なく、また、ＹＩ値も小さく、つまり着色も少なかった。また、９５℃で処理した油脂よりも着色の少ない、１２０℃で加熱処理した油脂を用いて製造された実施例２のＰＨＡは、実施例１にＰＨＡに比べ色調は（ＨＰＬＣ分析）の測定によるユビキノン－８のピーク面積はやや高いものの、比較例１のＰＨＡに比べ、ユビキノン－８の含有量が少なく、また、着色も少なかった。
　（実施例３）
　培地に用いる炭素源として、調製例１で調製した処理後の油脂に代えて調製例２で調製した処理後の油脂を用いて得られた乳化液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で培養した。得られた菌体培養液について色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。
　（比較例２）
　培地に用いる炭素源として、調製例２の処理をしないＥＦＢ圧搾油を用いた以外は、実施例３と同様の方法で培養した。得られた菌体培養液について色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。
　（実施例４）
　培地に用いる炭素源として、調製例１で調製した処理後の油脂に代えて調製例３で調製した処理後の油脂を用いて得られた乳化液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で培養を行い、ＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られた菌体培養液及びＰＨＡ乾燥粉体について、それぞれ色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。
　（比較例３）
　培地に用いる炭素源として、調製例３の処理をしないダーク油を用いた以外は、実施例４と同様の方法で培養い、ＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られた菌体培養液及びＰＨＡ乾燥粉体について、それぞれ色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　本発明の製造方法で製造されたＰＨＡを含む実施例３及び４の培養液は、それぞれ過酸化水素水で処理していない油脂を用いて製造されたＰＨＡを含む比較例２及び３の培養液に比べ、明らかに着色が少なかった。また、ＰＨＡ乾燥粉体を得た実施例４は、比較例３に比べ、明らかに着色が少なかった。
　表２及び表３に示されるように、油脂を過酸化水素により処理することによって、培養液及び乾燥ＰＨＡのいずれにおいても、色調及び臭気を低減する効果が見られた。

Claims (11)

  1. 　下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含むことを特徴とする微生物産生樹脂の製造方法。
    （ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程
    （ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程
  2. 　前記（ａ）工程において、５０℃以上１５０℃未満の温度で加熱処理することを特徴とする請求項１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  3. 　前記油脂が、植物由来の油脂を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  4. 　前記油脂が、残渣油を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  5. 　前記油脂が、パームやし由来の油脂を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  6. 　前記油脂が、パームやし由来の残渣油を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  7. 　（ｃ）：前記（ｂ）工程で培養した微生物から樹脂成分を取り出す工程を含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  8. 　（ｄ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤を含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  9. 　（ｄ’）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤及び水酸化ナトリウムを含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  10. 　前記微生物産生樹脂がポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法により製造された微生物産生樹脂。
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