WO2016163382A1 - Method for producing organic acid - Google Patents

Method for producing organic acid Download PDF

Info

Publication number
WO2016163382A1
WO2016163382A1 PCT/JP2016/061216 JP2016061216W WO2016163382A1 WO 2016163382 A1 WO2016163382 A1 WO 2016163382A1 JP 2016061216 W JP2016061216 W JP 2016061216W WO 2016163382 A1 WO2016163382 A1 WO 2016163382A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organic acid
microalga
microalgae
aqueous medium
acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/061216
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
誠久 蓮沼
Original Assignee
国立大学法人神戸大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人神戸大学 filed Critical 国立大学法人神戸大学
Priority to JP2017511006A priority Critical patent/JP6883330B2/en
Publication of WO2016163382A1 publication Critical patent/WO2016163382A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Provided is a method for producing an organic acid, whereby it becomes possible to produce the organic acid from a microalga effectively. An organic acid can be produced effectively by allowing carbon dioxide and an optical energy to be utilized directly by a microalga and then collecting the organic acid, which is an intercellular metabolite of the microalga, from the microalga. Specifically, an organic acid is produced by culturing a microalga in an aqueous medium containing carbonate ions and/or bicarbonate ions and then collecting the organic acid which is an intercellular metabolite of the microalga. Alternatively, an organic acid is produced by culturing a microalga, in which the function of a NADPH-O2 oxidoreductase and/or the function of a rate-controlling enzyme in the glycolytic system from glycogen to the citric acid cycle is enhanced, in an aqueous medium and then collecting the organic acid which is an intercellular metabolite of the microalga. For example, succinic acid, among organic acids, has been produced utilizing petroleum or the like as a raw material. According to the method of the present invention, an organic acid can be produced by effectively utilizing a biomass. The organic acid produced by the method can be used effectively in foods, medicines and other various fields.

Description

有機酸の製造方法Method for producing organic acid
　本発明は、微細藻による有機酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an organic acid using microalgae.
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１５－７８８８９号及び２０１５－２２８５１８号優先権を請求する。 This application claims the priority of Japanese Patent Application Nos. 2015-78889 and 2015-228518, which are incorporated herein by reference.
　コハク酸は有機酸に属し、ポリエステル、ポリアミド等のポリマー原料として用いられる。また、乳酸やコハク酸等の有機酸は、食品、医薬品、その他化学品の合成原料として広く用いられている。これら有機酸は、現在、化石燃料資源由来の原料より、工業的に製造されているが、近年の化石燃料資源枯渇への危惧や大気中の二酸化炭素（CO2）増加という地球規模での環境問題の背景から、再生可能エネルギーの１つとして、デンプン及びセルロースなどの糖質系バイオマスからの生産が期待されている。 Succinic acid belongs to organic acids and is used as a raw material for polymers such as polyester and polyamide. Organic acids such as lactic acid and succinic acid are widely used as synthetic raw materials for foods, pharmaceuticals, and other chemicals. These organic acids are currently produced industrially from raw materials derived from fossil fuel resources, but there are concerns about the recent depletion of fossil fuel resources and an increase in atmospheric carbon dioxide (CO 2 ) on a global scale. From the background of the problem, production from carbohydrate biomass such as starch and cellulose is expected as one of renewable energy.
　微細藻類は、水生生物であり、光を利用してCO2から糖質エネルギーを生産することが可能である。水生であることから、食糧や土地利用との競合を回避することができ、バイオエネルギー生産に有望な生体システムとして注目されている。しかし、バイオベース化学品の製造に共通する課題は、大量生産を可能にし、そして価格を安くすることにある。このため、生産性効率向上が求められているが、微細藻類を利用する場合の大きな課題の１つが、細胞密度が低い点である。微細藻類の光合成評価システムが本発明者らにより開発され（非特許文献１及び２）、微細藻類の増殖性を決定する因子を特定及び強化することにより、細胞密度を増大させる方法を模索しており、各種検討が進められている。 Microalgae are aquatic organisms that can produce carbohydrate energy from CO 2 using light. Because it is aquatic, it can avoid competition with food and land use, and is attracting attention as a promising biological system for bioenergy production. However, a common challenge in the production of bio-based chemicals is to enable mass production and lower prices. For this reason, although productivity efficiency improvement is calculated | required, one of the big subjects in the case of utilizing a micro algae is a point with a low cell density. A microalgae photosynthesis evaluation system has been developed by the present inventors (Non-patent Documents 1 and 2), and a method for increasing the cell density by identifying and enhancing the factors that determine the microalgae's growth potential has been sought. Various studies are underway.
　微細藻類の増殖性に関し、シアノバクテリアの１種であるシネコシスティスPCC6803種（Synechocystis sp. PCC6803）において、フラボジアイロンタンパク質（Flavodiiron protein）であるFlv1及びFlv3のそれぞれを欠損させた場合、変動光下での細胞増殖及び光合成が阻止されたことが報告されている（非特許文献３）。 Regarding the growth of microalgae, when one of the cyanobacteria Synechocystis PCC6803 (Synechocystis Fsp. PCC6803) lacks each of Flavironiron protein Flv1 and Flv3, under varying light It has been reported that cell growth and photosynthesis are blocked (Non-patent Document 3).
　水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下で、有機原料をコハク酸に変換する工程を含むコハク酸の製造方法について開示がある（特許文献１）。ここでは、水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩の濃度を特定の範囲とし、次いでアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加することにより、コハク酸の産生速度が高まることが開示されている。しかしながら、微細藻を用いた方法については検討されていない。 There is a disclosure of a method for producing succinic acid including a step of converting an organic raw material into succinic acid in the presence of a microorganism or a processed product thereof in an aqueous medium (Patent Document 1). Here, it is disclosed that the production rate of succinic acid is increased by setting the concentration of the alkali metal succinate in the aqueous medium to a specific range and then adding ammonia and / or ammonium salt. However, methods using microalgae have not been studied.
　化石燃料資源を用いず、環境に優しい方法でより効率的に有機酸を製造する方法の開発が望まれている。例えば微細藻について、コハク酸を含む有機酸について、細胞外産生はほとんど知られておらず、微細藻についての代謝物についても十分に解明されていない。 Development of a method for producing organic acids more efficiently by an environmentally friendly method without using fossil fuel resources is desired. For example, regarding microalgae, little extracellular production is known for organic acids including succinic acid, and metabolites for microalgae have not been fully elucidated.
国際公開WO2013/69786号公報International Publication WO2013 / 69786 Publication
　本発明は、化石燃料資源を用いず、環境に優しく効果的な有機酸の製造方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an organic acid production method that is environmentally friendly and effective without using fossil fuel resources.
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、微細藻からCO2と光エネルギーを直接資源化して、細胞内代謝物である有機酸を回収することで効果的に有機酸を産生可能となり、その結果環境に優しく効果的な有機酸の製造方法を提供しうることを見出し、本発明を完成した。具体的には、微細藻を炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンを含む水性媒体中で培養し、細胞内代謝物である有機酸を回収することによる。さらに、NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能及び／又はグリコーゲンからクエン酸回路に至る解糖系での律速酵素の機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養し、細胞内代謝物である有機酸を回収することによる。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have effectively converted CO 2 and light energy directly from microalgae to effectively recover organic acids that are intracellular metabolites. It has been found that an organic acid can be produced, and as a result, a method for producing an organic acid that is environmentally friendly and effective can be provided, and the present invention has been completed. Specifically, the microalgae is cultured in an aqueous medium containing carbonate ions and / or bicarbonate ions, and an organic acid that is an intracellular metabolite is recovered. In addition, microalgae with enhanced NADPH-O 2 oxidoreductase function and / or rate-limiting enzyme function in glycolysis from glycogen to citrate cycle are cultured in aqueous medium, and are organic metabolites that are intracellular metabolites. By recovering the acid.
　即ち、本発明は以下よりなる。
１．以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
（Ａ）炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000 mMの水性媒体中で微細藻を培養する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
２．炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000 mMの水性媒体が、（１）二酸化炭素の充填、及び／又は、（２）炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか１種又は２種以上の炭酸塩の添加、による水性媒体である、前項１に記載の製造方法。
３．（１）二酸化炭素の充填、及び／又は、（２）炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか１種又は２種以上の炭酸塩の添加が、微細藻の培養の嫌気培養条件下で行われる、前項２に記載の製造方法。
４．二酸化炭素の充填が、水性媒体中で飽和状態になるまで行われる、前項２又は３に記載の製造方法。
５．前記微細藻がシアノバクテリア、ユーグレナ及びクラミドモナスから選択されるいずれか１種又は２種以上である、前項１～４のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
６．シアノバクテリアが、シネコシスティスである、前項５に記載の有機酸の製造方法。
７．前記有機酸が、脂肪族ジカルボン酸である、前項１～６のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
８．前記有機酸が、コハク酸、乳酸、酢酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸から選択されるいずれか１種又は２種以上である、前項１～６のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
９．微細藻が、PEPカルボキシラーゼの機能が増強された微細藻である、前項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
１０．以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
（ａ）PEPカルボキシラーゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
（ｂ）前記（ａ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
１１．微細藻が、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強された微細藻である、前項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
１２．以下の（ｃ）及び（ｄ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
（ｃ）ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
（ｄ）前記（ｃ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
１３．微細藻が、ホスフォグルコムターゼの機能が増強された微細藻である、前項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
１４．以下の（ｅ）及び（ｆ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
（ｅ）ホスフォグルコムターゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
（ｆ）前記（ｅ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
１５．微細藻を炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000 mMの水性媒体中で培養することを特徴とする、微細藻内のクエン酸回路の活性化方法。
１６．微細藻が、NADPH-O2オキシドレダクターゼの発現又は発現増強するように形質転換された微細藻である、前項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
１７．以下の（Ｃ）及び（Ｄ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
（Ｃ）NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
（Ｄ）前記（Ｃ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
１８．以下の（ｇ）～（ｉ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
（ｇ）NADPH-O2オキシドレダクターゼが発現又は発現増強するように微細藻を形質転換する工程；
（ｈ）前記（ｇ）のNADPH-O2オキシドレダクターゼを発現又は発現増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
（ｉ）前記（ｈ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
１９．前記NADPH-O2オキシドレダクターゼが、フラボジアイロンタンパク質である、前項１６～１８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
２０．前記フラボジアイロンタンパク質がFlv3である、前項１９に記載の有機酸の製造方法。
２１．PEPカルボキシラーゼ、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ホスフォグルコムターゼ、及びNADPH-O2オキシドレダクターゼから選択されるいずれか１種又は複数種のタンパク質が発現増強するように形質転換された、有機酸の製造用微細藻。
２２．前記NADPH-O2オキシドレダクターゼがFlv3である、前項２１に記載の有機酸の製造用微細藻。
２３．前記微細藻がシアノバクテリアである、前項２１又は２２の有機酸の製造用微細藻。 That is, this invention consists of the following.
1. The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (A) and (B):
(A) a step of culturing microalgae in an aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM;
(B) The process of collect | recovering the organic acid produced from the microalga of said (A).
2. An aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM is (1) filled with carbon dioxide and / or (2) sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, 2. The production method according to item 1, which is an aqueous medium obtained by adding any one or two or more carbonates selected from magnesium carbonate.
3. (1) Filling with carbon dioxide and / or (2) adding one or more carbonates selected from sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, 3. The production method according to item 2, which is performed under anaerobic culture conditions for culturing microalgae.
4). 4. The production method according to item 2 or 3, wherein the carbon dioxide is filled until saturated in an aqueous medium.
5. 5. The method for producing an organic acid according to any one of items 1 to 4, wherein the microalga is one or more selected from cyanobacteria, Euglena, and Chlamydomonas.
6). 6. The method for producing an organic acid according to 5 above, wherein the cyanobacteria is Synechocystis.
7). 7. The method for producing an organic acid according to any one of items 1 to 6, wherein the organic acid is an aliphatic dicarboxylic acid.
8). 7. The organic acid according to any one of the preceding items 1 to 6, wherein the organic acid is one or more selected from succinic acid, lactic acid, acetic acid, fumaric acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, and citric acid. A method for producing an organic acid.
9. 9. The method for producing an organic acid according to any one of 1 to 8 above, wherein the microalga is a microalga in which the function of PEP carboxylase is enhanced.
10. The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (a) and (b):
(A) culturing a microalga with enhanced function of PEP carboxylase in an aqueous medium;
(B) A step of recovering the organic acid produced from the microalga of (a).
11. 9. The method for producing an organic acid according to any one of 1 to 8 above, wherein the microalga is a microalga in which the function of pyruvate ferredoxin oxidoreductase is enhanced.
12 The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (c) and (d):
(C) culturing a microalga with enhanced function of pyruvate ferredoxin oxidoreductase in an aqueous medium;
(D) A step of recovering the organic acid produced from the microalga of (c).
13 9. The method for producing an organic acid according to any one of 1 to 8 above, wherein the microalga is a microalga in which the function of phosphoglucomutase is enhanced.
14 The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (e) and (f):
(E) culturing a microalga with enhanced function of phosphoglucomutase in an aqueous medium;
(F) The process of collect | recovering the organic acid produced from the micro algae of said (e).
15. A method for activating a citric acid cycle in a microalgae, comprising culturing the microalgae in an aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM.
16. 9. The method for producing an organic acid according to any one of 1 to 8 above, wherein the microalga is a microalga transformed so as to express or enhance expression of NADPH-O 2 oxidoreductase.
17. The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (C) and (D):
(C) culturing a microalga with enhanced function of NADPH-O 2 oxidoreductase in an aqueous medium;
(D) The process of collect | recovering the organic acids produced from the microalga of said (C).
18. A method for producing an organic acid from microalgae comprising the following steps (g) to (i):
(G) transforming microalgae so that NADPH-O 2 oxidoreductase is expressed or enhanced;
(H) culturing a microalga in which the NADPH-O 2 oxidoreductase of (g) is expressed or enhanced in an aqueous medium;
(I) The process of collect | recovering the organic acid produced from the micro algae of said (h).
19. 19. The method for producing an organic acid according to any one of 16 to 18 above, wherein the NADPH-O 2 oxidoreductase is a flavodi iron protein.
20. 20. The method for producing an organic acid according to 19 above, wherein the flavodi iron protein is Flv3.
21. Production of an organic acid transformed to enhance expression of any one or more proteins selected from PEP carboxylase, pyruvate ferredoxin oxidoreductase, phosphoglucomutase, and NADPH-O 2 oxidoreductase Microalgae for use.
22. 22. The microalgae for producing an organic acid according to the item 21, wherein the NADPH-O 2 oxidoreductase is Flv3.
23. 23. The microalgae for producing an organic acid according to item 21 or 22, wherein the microalgae are cyanobacteria.
　微細藻を炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンを含む水性媒体中で培養することで微細藻内のクエン酸回路を活性化することができる。本発明の有機酸の製造方法によれば、微細藻の光合成によって合成されたグリコーゲンと、水性媒体から取り込まれた炭素源とを有効活用して細胞内代謝物である有機酸を効果的に産生しうる。さらに、NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能及び／又はグリコーゲンからクエン酸回路に至る解糖系での律速酵素の機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養することで、より効果的に有機酸を産生することができる。その結果、化石燃料資源を用いず、環境に優しく効果的に有機酸を製造することができる。 The citrate cycle in the microalgae can be activated by culturing the microalgae in an aqueous medium containing carbonate ions and / or bicarbonate ions. According to the method for producing an organic acid of the present invention, an organic acid that is an intracellular metabolite is effectively produced by effectively utilizing glycogen synthesized by photosynthesis of microalgae and a carbon source taken up from an aqueous medium. Yes. Furthermore, by culturing microalgae with enhanced NADPH-O 2 oxidoreductase function and / or rate-limiting enzyme function in the glycolysis system from glycogen to citrate cycle in an aqueous medium, more effective organic An acid can be produced. As a result, organic acids can be produced effectively and environmentally friendly without using fossil fuel resources.
微細藻（シネコシスティス）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the production result of the organic acid by microalgae (cinekocystis). Example 1 微細藻（シネコシスティス）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the production result of the organic acid by microalgae (cinekocystis). Example 1 微細藻（ユーグレナ）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例２）It is a figure which shows the production result of the organic acid by a micro algae (Euglena). (Example 2) 微細藻（クラミドモナス）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例３）It is a figure which shows the production result of the organic acid by a micro algae (Chlamydomonas). (Example 3) CO2通気条件下での微細藻（シネコシスティス）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例４）By CO 2 aeration in the microalgae (Synechocystis) is a diagram showing the production results of the organic acid. Example 4 微細藻によるコハク酸の産生経路を示す図である。（実施例５）It is a figure which shows the production pathway of succinic acid by a micro algae. (Example 5) PEPカルボキシラーゼを過剰発現させた微細藻（シネコシスティス）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例５）It is a figure which shows the production result of the organic acid by the micro algae (Synecocystis) which overexpressed PEP carboxylase. (Example 5) PGMを過剰発現させたPCC6803（PGMox）の作製方法を示す図である。（実施例６）It is a figure which shows the preparation methods of PCC6803 (PGMox) which overexpressed PGM. (Example 6) PCC6803（PGMox）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例６）It is a figure which shows the production result of the organic acid by PCC6803 (PGMox). (Example 6) PFOを過剰発現させたPCC6803（PFORox）の作製方法を示す図である。（実施例７）It is a figure which shows the preparation methods of PCC6803 (PFORox) which overexpressed PFO. (Example 7) PCC6803（PFORox）による有機酸の産生結果を示す図である。（実施例７）It is a figure which shows the production result of the organic acid by PCC6803 (PFORox). (Example 7) Flv3過剰発現微細藻の培養による乳酸及びコハク酸の産生を確認した結果図である。（実施例８）It is a figure which confirmed the production of lactic acid and succinic acid by culturing Flv3 overexpressing microalgae. (Example 8) Flv3過剰発現微細藻の培養によるグリコーゲン及びATPの細胞内蓄積量を確認した結果図である。（実施例９）It is a figure which confirmed the intracellular accumulation amount of glycogen and ATP by culture | cultivation of the Flv3 overexpression microalgae. Example 9 微細藻（シネコシスティス）細胞内代謝物質の13C標識率の経時変化を示す図である。（参考例１）It is a figure which shows a time-dependent change of the 13 C labeling rate of a micro algae (cinekocystis) intracellular metabolite. (Reference Example 1) 微細藻（シネコシスティス）の細胞内代謝経路を示す図である。（参考例１）It is a figure which shows the intracellular metabolic pathway of a micro algae (cinekocystis). (Reference Example 1) 微細藻の培養による、細胞密度及びグリコーゲンの細胞内蓄積量を経時的に測定した結果図である。（参考例２）It is a result figure which measured with time the cell density and the amount of intracellular accumulation of glycogen by culture of micro algae. (Reference Example 2) 微細藻の培養による、酢酸、乳酸及びコハク酸の細胞内蓄積量を経時的に測定した結果図である。（参考例３）It is a result figure which measured intracellular accumulation amount of acetic acid, lactic acid, and succinic acid by cultivation of micro algae with time. (Reference Example 3) 微細藻の培養による細胞内代謝プロファイルを調べた結果を示す図である。クエン酸回路のうち、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸、乳酸の細胞内蓄積量を経時的に測定した結果を示す図である。（参考例４）。It is a figure which shows the result of having investigated the intracellular metabolic profile by culture | cultivation of a micro algae. It is a figure which shows the result of having measured the intracellular accumulation amount of phosphoenolpyruvate, pyruvate, and lactic acid with time in a citric acid circuit. (Reference Example 4). 微細藻の培養による細胞内代謝プロファイルを調べた結果を示す図である。クエン酸回路のうち、ホスフォエノールピルビン酸、リンゴ酸、フマル酸及びコハク酸の細胞内蓄積量を経時的に測定した結果を示す図である。（参考例４）It is a figure which shows the result of having investigated the intracellular metabolic profile by culture | cultivation of a micro algae. It is a figure which shows the result of having measured the intracellular accumulation amount of phosphoenolpyruvate, malic acid, fumaric acid, and succinic acid with time in a citric acid circuit. (Reference Example 4) 微細藻の培養による有機酸の産生に伴うATPの利用を確認した図である。即ちATP、ADP及びAMPの経時的変化を測定することで、ATPの利用を確認した結果を示す図である。（参考例５）It is the figure which confirmed utilization of ATP accompanying the production of organic acid by culture of micro algae. That is, it is a figure showing the result of confirming the use of ATP by measuring the temporal change of ATP, ADP and AMP. (Reference Example 5)
　本発明は、有機酸の製造方法に関し、特に以下の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法に関する。
（Ａ）炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンを20～2000 mM含む水性媒体中で微細藻を培養する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。 The present invention relates to a method for producing an organic acid, and particularly relates to a method for producing an organic acid from microalgae including the following steps.
(A) a step of culturing microalgae in an aqueous medium containing 20 to 2000 mM carbonate ions and / or bicarbonate ions;
(B) The process of collect | recovering the organic acid produced from the microalga of said (A).
１．微細藻
　本明細書において、「微細藻」とは、葉緑素（クロロフィル）を持ち、光合成を行う微生物をいう。微細藻は、光合成によって大気中のCO2を固定化して糖類（例えば、グリコーゲン）を合成し、他方、水（H2O）から酸素（O2）を発生させ得る（「酸素発生型光合成」ともいう）。微細藻は、単細胞形態を有するものであってもよく、又はコロニー形態（例えば、フィラメント、シート又はボール）を有するものであってもよい。微細藻は、海洋又は淡水のいずれで繁殖するものであってもよい。 1. Microalgae In the present specification, “microalgae” refers to a microorganism having chlorophyll (chlorophyll) and performing photosynthesis. Microalgae can synthesize saccharides (eg, glycogen) by immobilizing CO 2 in the atmosphere by photosynthesis, while generating oxygen (O 2 ) from water (H 2 O) (“oxygen-generating photosynthesis”) Also called). The microalgae may have a single cell morphology or may have a colony morphology (eg, filaments, sheets or balls). The microalgae may be propagated in either the ocean or fresh water.
　本発明の微細藻は、原核生物のシアノバクテリア（ラン藻類）及び真核生物（例えば、緑藻類、珪藻類、渦鞭毛藻、紅藻、プラシノ藻、ユーグレナ藻、真正眼点藻など）の何れであってもよい。シアノバクテリア（ラン藻類）としては、例えばシネコシスティス属（Synechocystis）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、スピルリナ属（Spirulina）、アナベナ属（Anabaena）、シネココッカス属（Synechococcus）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、ノストック属（Nostoc）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcu）、ミクロシスティス属（Microcystis）、グロエオバクター属（Gloeobacter）などが挙げられる。真核生物としては、例えばクラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロレラ属（Chlorella）、ドナリエラ属（Dunaliella）、ヘマトコッカス属（Hematococcus）、ボルボックス属（Volvox）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）などの緑藻類；リゾソレニア属（Rhizosolenia）、ケトセロス属（Chaetoceros）、シクロテラ属（Cyclotella）、シリンドロテカ（Cylindrotheca）、ナビクラ属（Navicula）、フェオダクチラム属（Phaeodactylum）、タラシオシラ属（Thalassiosira）、フィッツリフェラ属（Fistulifera）などの珪藻類；アンフィジニウム属（Amphidinium）、シンビオジニウム属（Symbiodinium）などの渦鞭毛藻；シアニディオシゾン属（Cyanidioschyzon）、ポルフィリジウム属（Phorphyridium）などの紅藻；オストレオコッカス属（Ostreococcus）などのプラシノ藻；ユーグレナ属（Euglena）などのユーグレナ藻；ナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）などの真正眼点藻などが挙げられる。例えば、微細藻類の微生物種としては、シネコシスティスPCC6803種（Synechocystis sp. PCC6803）、シネココッカスPCC7002種（Synechococcus sp. PCC7002）、アルスロルピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）（「スピルリナ（Spirulina）」とも称される）、スピルリナ・マキシマ（Spirulina maxima）、スピルリナ・サブサルサ（Spirulina subsalsa）、アナベナPCC7120種（Anabaena sp. PCC7120）、クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス種（Chlamydomonas sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ドナリエラ種（Dunaliella sp.）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Hematococcus pluvialis）、ボルボックス・カルテリ（Volvox carteri）、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Botryococcus braunii）、シクロテラ・クリプティカ（Cyclotella cryptica）、シリンドロテカ・フジフォルミス（Cylindrotheca fusiformis）、ナビクラ・サプロフィラ（Navicula saprophila）、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）、フィッツリフェラ種（Fistulifera sp.）、アンフィジニウム種（Amphidinium sp.）、シンビオジニウム・ミクロアドリアチクム（Symbiodinium microadriaticum）、シアニディオシゾン・メロレ（Cyanidioschyzon merolae）、ポルフィリジウム種（Porphyridium sp.）、オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、ナンノクロロプシス・オキュラタ（Nannochloropsis oculata）などが挙げられる。 The microalgae of the present invention may be any of prokaryotic cyanobacteria (Cyanobacteria) and eukaryotes (for example, green algae, diatoms, dinoflagellates, red algae, prasino algae, Euglena algae, true ocular algae, etc.) There may be. Examples of cyanobacteria (Cyanobacteria) include, for example, Synechocystis, Arthrospira, Spirulina, Anabaena, Synechococcus, Thermosynechococcus, Thermosynechococcus, Stock genus (Nostoc), Prochlorococcus (Prochlorococcu), Microcystis (Microcystis), Gloeobacter (Gloeobacter) etc. are mentioned. Examples of eukaryotes include green algae such as Chlamydomonas, Chlorella, Dunaliella, Hematococcus, Volvox, and Botryococcus; Rhizosolenia Rhizosolenia, Chaetoceros, Cyclotella, Cylindrotheca, Navicula, Phaeodactylum, Thalassiosira, Fitzlifera Genus; Amphidinium, Symbiodinium and other dinoflagellates; Cyanidioschyzon, Phorphyridium and other red algae; Ostreococcus, etc. Plasinophytic algae, such as Euglena -Grenade algae; true eye spot algae such as Nannochloropsis. For example, microbial species of microalgae are Synechocystis PCC6803 (Synechocystis sp. PCC6803), Synecococcus PCsp. Spirulina maxima, Spirulina subsalsa, Anabaena PCC7120 (Anabaena sp. PCC7120), Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas lora Pyrenoidosa (Chlorella pyrenoidosa), Donaliella salina (Dunaliella salina), Donaliella species (Dunaliella sp.), Hematococcus pluvialis, Volvox カ ル carteri, Volvox carteri, Botryococcus boura tryococcus braunii), Cyclotella cryptica, Cylindrotheca fusiformis, Navicula saprophila, Phaeodactylumanaira sana sp.), Amphidinium species (Amphidinium sp.), Symbiodiniumriamicroadriaticum, Cyanidioschyzon merolae, Porphyridium species (Porphyridium sp.), Ostreococcus tauri (Ostreococcus tauri), Euglena gracilis, Nannochloropsis oculata, and the like.
　本発明の方法に使用可能な微細藻は、野生型であってもよいし、有機酸を効果的に産生するように改変された微細藻であってもよい。改変の方法は、自体公知の方法や今後開発されるあらゆる方法を適用することができ、例えば遺伝子組換え等の手法により改変することができる。そのような微細藻として、例えば有機酸の産生を増強しうる酵素を過剰発現しうる遺伝子組換え微細藻が挙げられる。例えば、NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能及び／又はグリコーゲンからクエン酸回路に至る解糖系での律速酵素の機能が増強された微細藻を利用することができる。 The microalgae that can be used in the method of the present invention may be a wild type or a microalga modified so as to effectively produce an organic acid. As a modification method, a method known per se or any method developed in the future can be applied. For example, the modification can be performed by a technique such as gene recombination. Examples of such microalgae include genetically modified microalgae that can overexpress an enzyme capable of enhancing the production of organic acids. For example, it is possible to use a microalga in which the function of NADPH-O 2 oxidoreductase and / or the function of the rate-limiting enzyme in the glycolysis system from glycogen to the citrate cycle is enhanced.
　本明細書において「NADPH-O2オキシドレダクターゼ」とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）に変換し、かつO2からH2Oを生成することを触媒する酵素をいう。当該酵素は、微細藻類が保有する光合成光化学系Ｉにおいて、還元型フェレドキシンからの電子伝達によりNADP+からの変換により生じたNADPHを再度NADP+に変換し、かつ酸素から水を生成し得る。 As used herein, “NADPH-O 2 oxidoreductase” refers to converting reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) to oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ), and from O 2 to H An enzyme that catalyzes the production of 2 O. In the photosynthetic photosystem I possessed by microalgae, the enzyme can convert NADPH generated by conversion from NADP + by electron transfer from reduced ferredoxin to NADP + again, and generate water from oxygen.
　本発明のNADPH-O2オキシドレダクターゼとしては、例えば、フラボジアイロンタンパク質（以下「Flv」ともいう。）が挙げられる。フラボジアイロンタンパク質としては、例えば、Flv3、Flv1などが挙げられ、特に好適にはFlv3である。フラボジアイロンタンパク質は、上記微細藻に由来するものが挙げられる。Flv3及びFlv1は、光合成光化学系ＩにおけるO2の光還元に関与している。例えば、Flv3としては、上記微細藻に由来するものが挙げられる。例えば、微細藻の形質転換のために、シネコシスティスPCC6803種（Synechocystis sp. PCC6803）由来のflv3遺伝子（sll0550：コード領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す）が用いられ得る。本明細書において、例えばFlv3又はFlv1は、Flv3又はFlv1についてデータベースにて開示されたアミノ酸配列で特定されるほか、前記開示されたアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において必要な酵素活性を有するアミノ酸配列でも特定することができる。あるいはFlv3又はFlv1についてデータベースにて開示されたアミノ酸配列と例えば、70％以上の配列同一性を有し、本発明において必要な酵素活性を有するアミノ酸配列でも特定することができる。 Examples of the NADPH-O 2 oxidoreductase of the present invention include flavodi iron protein (hereinafter also referred to as “Flv”). Examples of the flavodi iron protein include Flv3 and Flv1, and Flv3 is particularly preferable. Examples of the flavodi iron protein include those derived from the above-mentioned microalgae. Flv3 and Flv1 are involved in the photoreduction of O 2 in the photosynthetic photosystem I. For example, examples of Flv3 include those derived from the above-mentioned microalgae. For example, for the transformation of microalgae, the flv3 gene derived from Synechocystis sp. PCC6803 species (sll0550: the base sequence and amino acid sequence of the coding region are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2) can be used. In the present specification, for example, Flv3 or Flv1 is specified by the amino acid sequence disclosed in the database for Flv3 or Flv1, and one or several amino acids in the disclosed amino acid sequence are deleted, substituted or added It is also possible to specify an amino acid sequence having an enzyme activity necessary for the present invention. Alternatively, for example, an amino acid sequence having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence disclosed in the database for Flv3 or Flv1 and having the enzyme activity required in the present invention can be specified.
　本発明で用いられるNADPH-O2オキシドレダクターゼに係る遺伝子は、上記フラボジアイロンタンパク質を発現しうる遺伝子をいい、具体的にはFlv3又はFlv1を発現しうる遺伝子をいい、特に好適にはFlv3を発現しうる遺伝子をいう。具体的には、データベースにて開示される塩基配列からなるDNAであっても良いし、当該DNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えばMolecular Cloning, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New Yorkの1.101～1.104頁に開示される条件をいう。前記DNAにハイブリダイズしうる限り、配列特異的な結合がもたらされるので、このような機能性オリゴヌクレオチドも本発明のNADPH-O2オキシドレダクターゼに係る遺伝子に包含される。 The gene related to NADPH-O 2 oxidoreductase used in the present invention refers to a gene capable of expressing the above flavodi iron protein, specifically refers to a gene capable of expressing Flv3 or Flv1, particularly preferably Flv3. A gene that can be expressed. Specifically, it may be a DNA having a base sequence disclosed in a database, or a gene that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the DNA under stringent conditions. Stringent conditions refer to the conditions disclosed on pages 1.101 to 1.104 of Molecular Cloning, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York, for example. As long as it can hybridize to the DNA, sequence-specific binding is brought about, so such a functional oligonucleotide is also included in the gene related to NADPH-O 2 oxidoreductase of the present invention.
　このような遺伝子は、例えば、開示される又は公知の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、各種生物から抽出したDNA、各種cDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、例えばPCR増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリーなどに由来する核酸を鋳型とし、本発明で発現又は発現しようとする酵素をコードする遺伝子の一部であるDNA断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。遺伝子は、宿主微生物での発現を最適にするように、コドンが最適化されてもよい。コドンの最適化は、当業者が通常用いる任意の手段、装置を用いて実施することができる。 Such a gene, for example, using primers designed based on the disclosed or known base sequences, DNA extracted from various organisms, various cDNA libraries or genomic DNA libraries etc. as a template, For example, it can be obtained as a nucleic acid fragment by PCR amplification. In addition, a nucleic acid fragment can be obtained by performing hybridization using a nucleic acid derived from the above library as a template and a DNA fragment that is a part of a gene encoding an enzyme to be expressed or expressed in the present invention as a probe. Can do. Alternatively, the gene may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods. The gene may be codon optimized to optimize expression in the host microorganism. Codon optimization can be performed using any means and apparatus commonly used by those skilled in the art.
　本明細書において、「NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能が増強された微細藻」とは、「NADPH-O2オキシドレダクターゼの発現又は発現増強するように形質転換された微細藻」をいう。本明細書において、「NADPH-O2オキシドレダクターゼの発現又は発現増強する」とは、NADPH-O2オキシドレダクターゼに係る遺伝子の発現が増強されることをいう。本明細書において、NADPH-O2オキシドレダクターゼに係る遺伝子の発現が増強される形態は、発明の微細藻においてこれら遺伝子の発現を増強する改変が行われる前に比べて、当該NADPH-O2オキシドレダクターゼの生産量又は活性の増大が確認される形態であればよく、特に限定されない。遺伝子の発現を増強する改変は、自体公知の方法によっても良いし、今後開発されるあらゆる方法によっても良い。遺伝子の発現が増強されている実施形態としては、例えば、内因性のいずれかの遺伝子がより強力なプロモーター（構成的プロモーター又は誘導性プロモーターのいずれであってもよい）の制御下に連結された実施形態が挙げられる。また、追加的に内因性及び／又は外因性のいずれかの遺伝子が導入されている実施形態が挙げられる。追加的に導入されたいずれかの遺伝子は、好ましくは構成的プロモーターなど強力なプロモーターで作動可能に保持されている。発現の増強について、本明細書中においては「過剰発現」ともいう。 In the present specification, "fine algae function of NADPH-O 2 oxidoreductase is enhanced" refers to a "transformed microalgae to express or enhanced expression of NADPH-O 2 oxidoreductase". In the present specification, “expression or enhancement of expression of NADPH-O 2 oxidoreductase” means that expression of a gene related to NADPH-O 2 oxidoreductase is enhanced. In this specification, the form in which the expression of the gene of the NADPH-O 2 oxidoreductase is enhanced, as compared with the prior modified to enhance expression of these genes in microalgae of the invention is carried out, the NADPH-O 2 oxide There is no particular limitation as long as it is a form in which an increase in the production amount or activity of reductase is confirmed. The modification that enhances gene expression may be a method known per se, or any method developed in the future. In an embodiment in which gene expression is enhanced, for example, any endogenous gene is linked under the control of a stronger promoter (which can be either a constitutive promoter or an inducible promoter). Embodiments are mentioned. In addition, an embodiment in which either an endogenous gene and / or an exogenous gene is additionally introduced can be mentioned. Any additionally introduced gene is preferably operably retained by a strong promoter, such as a constitutive promoter. The enhancement of expression is also referred to as “overexpression” in the present specification.
　プロモーターとしては、微細藻にて機能する任意のプロモーターを使用することができる。例えば、微細藻がシアノバクテリア（ラン藻類）の場合、ラン藻に由来し得るsbDII、psbA3、psbA2、nirA、petE、nrsRS、nrsABCD、ndhF3、rbcL、rbcX、glnA、atp1、atp2、petF1などのプロモーターが挙げられる。 As the promoter, any promoter that functions in microalgae can be used. For example, when the microalgae are cyanobacteria (Cyanobacteria), promoters such as sbDII, psbA3, psbA2, nirA, petE, nrsRS, nrsABCD, ndhF3, rbcL, rbcX, glnA, atp1, atp2, petF1, etc. Is mentioned.
　上記遺伝子を微細藻に導入するためのプラスミドベクターの一例は、pTCP2031Vベクターである。pTCP2031Vベクターは、psbA2（slr1311）プロモーター、並びにslr2030及びslr2031のコード領域の一部（相同組換え用プラットフォームとして）、及びクロラムフェニコール耐性カセットを含む組換えプラスミドなどが挙げられる（Satoh Sら, 2001, J. Biol. Chem. 276, 4293-4297；Horiuchi Mら, 2010, Biochem. J. 431, 135-140）。 An example of a plasmid vector for introducing the above gene into microalgae is the pTCP2031V vector. Examples of the pTCP2031V vector include a psbA2 (slr1311) promoter, a part of the coding region of slr2030 and slr2031 (as a platform for homologous recombination), and a recombinant plasmid containing a chloramphenicol resistance cassette (Satoh S et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 4293-4297; Horiuchi M et al., 2010, Biochem. J. 431, 135-140).
　組換え用構築物、例えば、上記のように作製された発現ベクター又は染色体組込み型ベクターを、宿主微細藻に導入し、形質転換微細藻を作製することができる。 A recombination construct, for example, an expression vector or a chromosome-integrated vector prepared as described above can be introduced into a host microalgae to produce a transformed microalgae.
　形質転換微細藻（特にシアノバクテリア）の形質転換には、多くの場合、遺伝子相同組換え法が用いられ得る。遺伝子相同組換え法のために、例えば、pTCP2031Vベクターが好適に用いられ得る。形質転換のための発現ベクター又は複製可能なプラスミドの導入は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト-PEG法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法などが挙げられる。 In many cases, gene homologous recombination methods can be used for transformation of transformed microalgae (particularly cyanobacteria). For the gene homologous recombination method, for example, the pTCP2031V vector can be preferably used. For introducing an expression vector or replicable plasmid for transformation, a method known per se or any method developed in the future can be applied. Examples thereof include electroporation method, protoplast-PEG method, microinjection method, particle gun method, calcium phosphate method, lipofection method, calcium ion method and the like.
　形質転換株は、遺伝子導入に用いられた発現ベクター又は染色体組込み型ベクターが有する選択マーカーなどを利用して選択される。宿主微生物それぞれに適した培地に、選択マーカーに応じた抗生物質又は薬剤を添加することができる。このような選択用培地として、微細藻の生育に適した任意の培地を使用することができる。例えば、BG-11寒天培地（例えば、Rippka Rら, 1979, J Gen Microbiol 111: 1-61に記載される：シアノバクテリアに用いられ得る）；HSM寒天培地及びTAP寒天培地（これらは、例えば、福澤ら、2009，低温科学，67:17-21に記載される：緑藻などの真核生物に用いられ得る）などが挙げられる。まずこの選択マーカーに基づき形質転換体の選抜を行い、次いで、目的とする遺伝子（すなわち、NADPH-O2オキシドレダクターゼ遺伝子）又はその産物の発現を解析することにより、形質転換体の選抜を行うことができる。NADPH-O2オキシドレダクターゼ発現産物は、例えば、ウエスタンブロット法によって確認することができる。 The transformed strain is selected by using a selection marker or the like possessed by the expression vector used for gene transfer or the chromosome integration type vector. Antibiotics or drugs corresponding to the selection marker can be added to a medium suitable for each host microorganism. As such a selective medium, any medium suitable for the growth of microalgae can be used. For example, BG-11 agar (eg described in Rippka R et al., 1979, J Gen Microbiol 111: 1-61: can be used for cyanobacteria); HSM agar and TAP agar (these are for example Fukuzawa et al., 2009, Cryogenic Science, 67: 17-21: Can be used for eukaryotes such as green algae). First, transformants are selected based on this selection marker, and then transformants are selected by analyzing the expression of the target gene (ie, NADPH-O 2 oxidoreductase gene) or its product. Can do. The NADPH-O 2 oxidoreductase expression product can be confirmed, for example, by Western blotting.
　本明細書における解糖系での律速酵素の例として、ホスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPカルボキシラーゼ：PEPC）、ホスフォグルコムターゼ（PGM：phosphoglucomutase）、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素（PFO）が挙げられる（図６参照）。 Examples of rate-limiting enzymes in the glycolysis system in this specification include phosphoenolpyruvate carboxylase (PEP carboxylase: PEPC), phosphoglucomutase (PGM), and pyruvate ferredoxin oxidoreductase (PFO). (See FIG. 6).
　本明細書において、PEPカルボキシラーゼとは、炭酸固定経路のC4経路でホスフォエノールピルビン酸とCO2からオキサロ酢酸を合成する酵素をいう。本明細書において、ホスフォグルコムターゼ（PGM：phosphoglucomutase）とは、グリコーゲンの代謝において、グルコース-1-リン酸（G1P）とグルコース-6-リン酸（G6P）とを相互変換する酵素である。本明細書において、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素（PFO）とは、酸化還元酵素に分類され、解糖系におけるピルビン酸とアセチルCoAとを相互変換する酵素である。 In this specification, PEP carboxylase refers to an enzyme that synthesizes oxaloacetate from phosphoenolpyruvate and CO 2 through the C 4 pathway of the carbonic acid fixation pathway. In the present specification, phosphoglucomutase (PGM) is an enzyme that interconverts glucose-1-phosphate (G1P) and glucose-6-phosphate (G6P) in the metabolism of glycogen. In this specification, pyruvate ferredoxin oxidoreductase (PFO) is classified as an oxidoreductase, and is an enzyme that interconverts pyruvate and acetyl CoA in a glycolytic system.
２．水性媒体
　上記において「水性媒体」とは、種培養及び／又は本培養に用いられる水溶液をいう。後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。具体的には、微細藻に応じて、人工又は天然の海水、あるいは淡水（例えば、蒸留水）を用いてもよい。例えば、BG-11培地（J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979)）；HSM培地及びTAP培地（低温科学，67:17-21 (2009)）、Cramer-Myers培地（CM培地）等を使用することができる。具体的には、以下の表１に示す組成の培地を用いてもよい。 2. Aqueous medium In the above, “aqueous medium” refers to an aqueous solution used for seed culture and / or main culture. As will be described later, an aqueous solution containing a nitrogen source, an inorganic salt and the like is preferable. Specifically, artificial or natural seawater or fresh water (for example, distilled water) may be used according to the microalgae. For example, BG-11 medium (J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979)); HSM medium and TAP medium (Cryogenic Science, 67: 17-21 (2009)), Cramer-Myers medium (CM medium), etc. can do. Specifically, a medium having the composition shown in Table 1 below may be used.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　培養での有機酸の生産反応を効率的に行うために、水性媒体には、前記培地に炭素源として有機原料を添加しても良い。本培養に用いる有機原料は、前記微細藻が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、目的とする有機酸に応じて選択可能であり、一般的な有機原料から選択できる。例えば、グルコース、スクロース、又はフルクトースが好ましく、特にグルコース又はスクロースが好ましい。また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であってもよい。これらの有機原料は、単独でも組み合わせても使用できる。水性媒体には炭酸イオン、重炭酸イオン又CO2を含有させることができる。 In order to efficiently perform an organic acid production reaction in culture, an organic raw material may be added to the medium as a carbon source in the aqueous medium. The organic raw material used in the main culture is not particularly limited as long as the microalgae can be assimilated and proliferated. Usually, carbohydrates such as galactose, lactose, glucose, fructose, sucrose, saccharose, starch, and cellulose; glycerol, Fermentable carbohydrates such as polyalcohols such as mannitol, xylitol, and ribitol are used, can be selected according to the target organic acid, and can be selected from general organic raw materials. For example, glucose, sucrose, or fructose is preferable, and glucose or sucrose is particularly preferable. Moreover, the starch saccharified liquid, molasses, etc. which contain the said fermentable saccharide | sugar are also used, The saccharide | sugar liquid which the said fermentable saccharide extracted from plants, such as sugarcane, sugar beet, and a sugar maple, may be sufficient. These organic materials can be used alone or in combination. The aqueous medium can contain carbonate ions, bicarbonate ions or CO 2 .
３．培養条件
　微細藻の培養温度は、通常15～40℃、好ましくは20～37℃であり、より好ましくは25℃～35℃である。水性媒体のpHは、微細藻の増殖に適した任意のpH、例えば、pH 5～10、好ましくは、pH 6～9、より好ましくは、pH 6～8に調整することができる。pHは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって適宜調整することができる。 3. Culture conditions The culture temperature of the microalgae is usually 15 to 40 ° C, preferably 20 to 37 ° C, more preferably 25 to 35 ° C. The pH of the aqueous medium can be adjusted to any pH suitable for microalgae growth, such as pH 5-10, preferably pH 6-9, more preferably pH 6-8. The pH can be appropriately adjusted by adding sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide or the like.
　本発明の有機酸の製造方法に関し、微細藻は予め前培養することができる。例えば、（１）前々培養、（２）前培養、（３）本培養（光独立栄養）、（４）本培養（嫌気、暗所）等のステップを経て培養することができる。（１）～（３）の培養では、通気培養を行うことができ、培養期間としては、好ましくは各々3日～14日、より好ましくは3日～5日である。通気培養のために、空気やCO2を混合した空気を水性媒体に通気することができる。 Regarding the method for producing an organic acid of the present invention, microalgae can be pre-cultured in advance. For example, it can be cultured through steps such as (1) pre-culture, (2) pre-culture, (3) main culture (photoautotrophic), (4) main culture (anaerobic, dark). In the cultures (1) to (3), aeration culture can be performed, and the culture period is preferably 3 to 14 days, more preferably 3 to 5 days. For aeration culture, air or air mixed with CO 2 can be aerated through an aqueous medium.
　本明細書の（３）本培養（光独立栄養）において、「光独立栄養」とは一般的な意味で使用され、微細藻が光合成によってCO2と水から糖を作り、これをエネルギー源として成長する仕組みをいう。光独立栄養時の光照射条件は自然光又は人工光のいずれであってもよく、その強さは、水性媒体中の藻体密度及び培養槽の深さ等によって、適宜調節することができる。例えば、30～2000μmol photons m-2 s-1、好ましくは、30～1000μmol photons m-2 s-1、より好ましくは、50～600μmol photons m-2 s-1の自然光又は人工光が用いられ得る。上記範囲であると、微細藻が光合成を行って順調に増殖し得る。光照射は、連続的であっても周期的であってもよい。屋外の大規模培養については、コストを最小限にし、かつ人工照明の追加費用を回避するために、明／暗周期を設けてもよい。 In this specification (3) Main culture (photoautotrophic), “photoautotrophic” is used in a general sense, and microalgae make sugar from CO 2 and water by photosynthesis, and use this as an energy source. A mechanism for growth. The light irradiation condition at the time of photoautotrophic may be either natural light or artificial light, and the intensity thereof can be appropriately adjusted depending on the algal body density in the aqueous medium, the depth of the culture tank, and the like. For example, natural or artificial light of 30 to 2000 μmol photons m −2 s −1 , preferably 30 to 1000 μmol photons m −2 s −1 , more preferably 50 to 600 μmol photons m −2 s −1 may be used. . Within the above range, microalgae can perform photosynthesis and grow smoothly. The light irradiation may be continuous or periodic. For outdoor large scale cultures, a light / dark cycle may be provided to minimize costs and avoid the additional cost of artificial lighting.
　本明細書の（４）本培養（嫌気、暗所）において、「嫌気培養」とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて培養することをいう。嫌気的条件とするために、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス（N2）等の不活性ガスを供給して反応させる、又はCO2含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。嫌気・暗所条件の工程で、有機酸は水性媒体中に排出される。 In the present culture (4) main culture (anaerobic, dark place), “anaerobic culture” refers to culturing while keeping the dissolved oxygen concentration in the solution low. In order to achieve anaerobic conditions, for example, the container is sealed and reacted without aeration, supplied with an inert gas such as nitrogen gas (N 2 ), or reacted with a CO 2 -containing inert gas. This method can be used. In the process of anaerobic / dark conditions, the organic acid is discharged into the aqueous medium.
　本明細書の（４）本培養（嫌気、暗所）において、炭酸イオン、重炭酸イオン及び／又はCO2が含有されていることが重要である。炭酸イオン、重炭酸イオンは、20～2000 mM、好ましくは20～500 mM、さらに好ましくは20～150 mMが含有されているのが好適である。水性媒体への炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの導入は、(1)CO2の充填、及び／又は、(2)炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか１種又は２種以上の炭酸塩の添加によることができる。CO2を充填する場合は、飽和状態になるまで充填することができる。CO2が飽和状態になることで、炭酸イオン濃度は20～2000 mMとなる。 In (4) main culture (anaerobic, dark place) in the present specification, it is important that carbonate ions, bicarbonate ions and / or CO 2 are contained. It is preferable that the carbonate ions and bicarbonate ions contain 20 to 2000 mM, preferably 20 to 500 mM, more preferably 20 to 150 mM. The introduction of carbonate ions and / or bicarbonate ions into the aqueous medium is selected from (1) filling of CO 2 and / or (2) sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate. Any one or two or more carbonates can be added. In the case of filling with CO 2 , the filling can be performed until saturation occurs. When CO 2 is saturated, the carbonate ion concentration is 20 to 2000 mM.
４．微細藻から産生された有機酸の回収
　以上の様な方法で産生された有機酸は、必要に応じて、水性媒体から、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる分離、精製方法により分離、精製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠心分離、濃縮等により微細藻及びその産生物と分離した後、カラム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事により、結晶として採取する方法等が挙げられる。本発明で、製造の対象となる有機酸としては、特に限定されるものではないが、クエン酸回路において産生される細胞内代謝有機酸であり、具体的には有機カルボン酸である。有機カルボン酸として、例えばコハク酸、乳酸、酢酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸等が挙げられる。有機酸のうちコハク酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸等の脂肪族ジカルボン酸が好適であり、特にコハク酸が好適である。 4). Recovery of Organic Acid Produced from Microalgae Organic acid produced by the above method is separated and purified from an aqueous medium as necessary by a method known per se or any separation and purification method developed in the future. can do. Specifically, after separation from microalgae and their products by ultrafiltration membrane separation, centrifugation, concentration, etc., purification by known methods such as column method, crystallization method, etc., and drying as crystals The method of collecting is mentioned. In the present invention, the organic acid to be produced is not particularly limited, but is an intracellular metabolic organic acid produced in a citric acid cycle, specifically, an organic carboxylic acid. Examples of the organic carboxylic acid include succinic acid, lactic acid, acetic acid, fumaric acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, citric acid and the like. Among organic acids, aliphatic dicarboxylic acids such as succinic acid, fumaric acid, 2-ketoglutaric acid and malic acid are preferred, and succinic acid is particularly preferred.
５．有機酸の製造
　上記方法で微細藻から産生された有機酸を回収することで、化石燃料資源を用いず、環境に優しく効果的に有機酸を製造することができる。すなわち、微細藻の光合成と微細藻に取り込まれた炭素源によりバイオマスから有機酸を産生可能となり、環境に優しく効果的に有機酸を製造することができる。水性媒体への炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの供給は、例えば電気や鉄鋼等の製造工程において産業的に排出された大気中のCO2を利用し、有効活用することができる。大気中のCO2を有効活用できる点で、自然環境に対して優れた効果を有する。さらに、本発明の微細藻によれば、バイオマスとして使用される水性媒体は淡水のみならず海水を活用することができ、水資源の枯渇や耕作地の限界に左右されず安定的に有効活用することができる。 5. Production of organic acid By collecting the organic acid produced from the microalgae by the above method, the organic acid can be produced effectively and environmentally friendly without using fossil fuel resources. That is, organic acid can be produced from biomass by photosynthesis of microalgae and a carbon source taken into the microalgae, and the organic acid can be produced effectively and environmentally. The supply of carbonate ions and / or bicarbonate ions to the aqueous medium can be effectively utilized using, for example, CO 2 in the atmosphere discharged industrially in the manufacturing process of electricity, steel, and the like. It has an excellent effect on the natural environment in that it can effectively utilize CO 2 in the atmosphere. Furthermore, according to the microalgae of the present invention, the aqueous medium used as biomass can utilize not only fresh water but also seawater, and can be stably and effectively utilized regardless of the depletion of water resources or the limits of cultivated land. be able to.
６．クエン酸回路
　本発明は、微細藻を炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000 mMの水性媒体中で培養することを特徴とする、微細藻内クエン酸回路の活性化方法にも及ぶ。本発明の方法によれば、クエン酸回路が活性化され、その結果、細胞内代謝物である有機酸の産生が増強される。 6). TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for activating a citric acid circuit in a microalgae, which comprises culturing microalgae in an aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM. It also extends. According to the method of the present invention, the citric acid cycle is activated, and as a result, the production of organic acids that are intracellular metabolites is enhanced.
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）微細藻（シネコシスティス）による有機酸の産生
　本実施例において、微細藻類の微生物種としてシネコシスティスPCC6803種（Synechocystis sp. PCC6803）グルコース耐性（GT）（Williams JGK, 1988, Methods Enzymol 167: 766-778）（以下、本実施例及び各実施例において「PCC6803（GT）」という。）を用いた。 (Example 1) Production of organic acid by microalgae (Sinechocystis) In this example, as a microbial species of microalgae, Synechocystis sp. PCC6803, glucose tolerance (GT) (Williams JGK, 1988, Methods Enzymol 167: 766-778) (hereinafter referred to as “PCC6803 (GT)” in this example and each example).
（１）前々培養
　BG-11寒天培地（1.5% Agarを含むBG-11）上で生育したPCC6803（GT）のコロニーを白金耳でとり、水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地（Rippka Rら, 1J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979)）に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。藻体密度は、Shimadzu UV mini spectrophotometer（紫外可視分光光度計：株式会社島津製作所製）を用いてOD750により測定した。培養後のOD750は1～1.5であった。通気とは、特に言及しない場合は空気による通気を意味する。以下の実施例についても同様である。 (1) Pre-culture PCC6803 (GT) colonies grown on BG-11 agar medium (BG-11 containing 1.5% Agar) were picked with a platinum loop and added to an aqueous medium (70 mL). Then, the cells were cultured at 30 ° C. for 4-5 days under 50 μmol photons m −2 s- 1 under aeration conditions. Here, a culture solution containing 17.6 mM NaNO 3 and 20 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium (Rippka R et al., 1J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979)) was used as an aqueous medium. The algal density was measured by OD 750 using a Shimadzu UV mini spectrophotometer (ultraviolet visible spectrophotometer: manufactured by Shimadzu Corporation). The OD 750 after culture was 1 to 1.5. The ventilation means air ventilation unless otherwise specified. The same applies to the following embodiments.
（２）前培養
　上記（１）で前々培養したPCC6803（GT）を、OD750が0.1になるように水性媒体（150 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は1～1.5であった。 (2) Pre-culture PCC6803 (GT) pre-cultured in (1) above is added to an aqueous medium (150 mL) so that OD 750 is 0.1, and 50 μmol photons m − at pH 7.8 under aeration conditions. They were cultured for 4 to 5 days at 30 ℃ in 2 s- 1. Here, a culture solution containing 17.6 mM NaNO 3 and 20 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 1 to 1.5.
（３）本培養（光独立利用）
　上記（２）で前培養したPCC6803（GT）を、OD750が0.4になるように水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは、水性媒体としてBG-11液体培地に5 mM NH4Cl, 50 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は6～7であった。培養後、フィルター（polytetrafluoroethylene膜、孔径1μm）濾過にてPCC6803（GT）を回収した。 (3) Main culture (light independent use)
PCC6803 (GT) pre-cultured in (2) above is added to an aqueous medium (70 mL) so that the OD 750 is 0.4, and 120 μmol photons m -2 s- 1 under CO 2 aeration conditions at pH 7.8. And then cultured at 30 ° C. for 3 days. Here, a culture solution containing 5 mM NH 4 Cl and 50 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 6-7. After the culture, PCC6803 (GT) was collected by filtration with a filter (polytetrafluoroethylene membrane, pore size 1 μm).
（４）本培養（嫌気・暗所）
　上記（３）で回収したPCC6803（GT）を、OD750が20になるように水性媒体（10 mL）に加えた。ここでは水性媒体として100 mM Hepes-KOH（pH7.8）を用いた。0～500 mMの炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）を水性媒体に添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下で培養を開始し、72時間後にPCC6803（GT）を含む水性媒体を回収した。 (4) Main culture (anaerobic / dark)
PCC6803 (GT) recovered in (3) above was added to an aqueous medium (10 mL) so that the OD 750 was 20. Here, 100 mM Hepes-KOH (pH 7.8) was used as an aqueous medium. 0-500 mM sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) was added to the aqueous medium, and after 10 minutes of N 2 aeration, the culture was started under anaerobic conditions, and after 72 hours, the aqueous medium containing PCC6803 (GT) was recovered. .
　上記（４）で回収した水性媒体を、各々14000g、4℃にて5分間遠心分離し、上清を回収し、0.45μm孔径Mini-UniPrep（GEヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて濾過した。濾過液について、コハク酸、乳酸、酢酸及びグリコーゲンの産生量を、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラム（Aminex HPX-87H；Bio-Rad社製）及び屈折率検出器（RID-10A；株式会社島津製作所製）を備えたHPLCにより測定した。フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸の産生量は非特許文献２に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動／質量分析（CE/MS）システム（CE：Agilent G7100；MS，Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製）及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア（Agilent Technologies社製）により制御される液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析（LC/QqQ-MS）システム（LC：Agilent 1200 series；MS，Agilent 6460 with Jet Stream Technology；Agilent Technologies社製）を用いて分析し、測定した。その結果、NaHCO3濃度の増加に伴って、有機酸（コハク酸、乳酸、酢酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸）の産生量は増加の傾向を示した（図１、２）。NaHCO3濃度を調節することで、PCC6803（GT）によりコハク酸、乳酸及び酢酸を効果的に産生可能であることが確認された。 The aqueous medium recovered in (4) above is centrifuged at 14000 g and 4 ° C. for 5 minutes, respectively, and the supernatant is recovered and filtered using 0.45 μm pore size Mini-UniPrep (manufactured by GE Healthcare Japan). did. For the filtrate, the production amount of succinic acid, lactic acid, acetic acid and glycogen was measured using a high performance liquid chromatography (HPLC) column (Aminex HPX-87H; manufactured by Bio-Rad) and a refractive index detector (RID-10A; Shimadzu Corporation). Measured by HPLC equipped with Seisakusho. The production amounts of fumaric acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, and citric acid were extracted from intracellular metabolites as described in Non-Patent Document 2, and a capillary electrophoresis / mass spectrometry (CE / MS) system (CE: Liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC / QqQ-MS) controlled by Agilent G7100; MS, Agilent G6224AA LC / MSD TOF; Agilent Technologies) and MassHunter Workstation Data Acquisition software (Agilent Technologies) Analysis and measurement were performed using a system (LC: Agilent 1200 series; MS, Agilent 6460 with Jet Stream Technology; manufactured by Agilent Technologies). As a result, the production amount of organic acids (succinic acid, lactic acid, acetic acid, fumaric acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, citric acid) tended to increase as the NaHCO 3 concentration increased (FIG. 1, 2). It was confirmed that succinic acid, lactic acid and acetic acid can be effectively produced by PCC6803 (GT) by adjusting the NaHCO 3 concentration.
（実施例２）微細藻（ユーグレナ）による有機酸の産生
　本実施例において、微細藻類の微生物種としてユーグレナ（Euglena gracilis (NIES-48)）株を用いた。以下「NIES-48」という。 (Example 2) Production of organic acid by microalgae (Euglena) In this example, Euglena gracilis (NIES-48) strain was used as a microbial species of microalgae. Hereinafter referred to as “NIES-48”.
（１）前々培養
　Cramer-Myers寒天培地（1.5% Agarを含むCM培地）上で生育したNIES-48のコロニーを白金耳でとり、水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、表２に示す組成のCM培地に7.5mM (NH4)2HPO4を含む培養液を用いた。培養後のOD750は1～1.5であった。 (1) Pre-culture NIES-48 colonies grown on Cramer-Myers agar medium (CM medium containing 1.5% Agar) were picked with a platinum loop, added to an aqueous medium (70 mL), and aerated at pH 7.8. Under the conditions, the cells were cultured for 4 to 5 days at 30 ° C. in 50 μmol photons m −2 s- 1 . Here, as an aqueous medium, a culture solution containing 7.5 mM (NH 4 ) 2 HPO 4 in a CM medium having the composition shown in Table 2 was used. The OD 750 after culture was 1 to 1.5.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）前培養
　上記（１）で前々培養したNIES-48を、OD750が0.1になるように水性媒体（150 mL）に加え、pH3.5にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、CM培地に7.5 mM (NH4)2HPO4を含む培養液を用いた。培養後のOD750は1～1.5であった。 (2) Pre-culture NIES-48 previously cultured in (1) above is added to an aqueous medium (150 mL) so that the OD 750 is 0.1, and 50 μmol photons m -2 at pH 3.5 under aeration conditions. The cells were cultured for 4 to 5 days at 30 ° C. with s- 1 . Here, a culture medium containing 7.5 mM (NH 4 ) 2 HPO 4 in a CM medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 1 to 1.5.
（３）本培養（光独立利用）
　上記（２）で前培養したNIES-48を、OD750が0.4になるように水性媒体（70 mL）に加え、pH3.5にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて5日間培養した。ここでは、水性媒体としてCM培地に3 mM (NH4)2HPO4を含む培養液を用いた。培養後のOD750は6～7であった。培養後、遠心分離（3000g、5分、4℃）によりNIES-48を回収した。 (3) Main culture (light independent use)
NIES-48 pre-cultured in (2) above is added to an aqueous medium (70 mL) so that OD 750 is 0.4, and 120 μmol photons m -2 s- 1 at pH 3.5 under CO 2 aeration conditions. The cells were cultured at 30 ° C for 5 days. Here, a culture medium containing 3 mM (NH 4 ) 2 HPO 4 in CM medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 6-7. After culturing, NIES-48 was recovered by centrifugation (3000 g, 5 minutes, 4 ° C.).
（４）本培養（嫌気・暗所）
　上記（３）で回収したNIES-48を、OD750が20になるように水性媒体（10 mL）に加えた。ここでは水性媒体として100 mM Hepes-KOH（pH7.8）を用いた。そして、0、100、200 mMとなるようにNaHCO3を水性媒体に添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下で170rpmで撹拌しながら30℃で培養を開始し、72時間培養した。密閉状態を維持したままNIES-48を含む水性媒体を回収した。 (4) Main culture (anaerobic / dark)
NIES-48 recovered in (3) above was added to an aqueous medium (10 mL) so that the OD 750 was 20. Here, 100 mM Hepes-KOH (pH 7.8) was used as an aqueous medium. Then, NaHCO 3 was added to the aqueous medium so as to be 0, 100, 200 mM, and after culturing N 2 for 10 minutes, cultivation was started at 30 ° C. with stirring at 170 rpm under anaerobic conditions, and cultured for 72 hours. . An aqueous medium containing NIES-48 was recovered while maintaining a sealed state.
　上記（４）で培養したNIES-48を含む水性媒体を、各々14000g、4℃にて5分間遠心分離し、上清を回収し、実施例１と同手法により濾過した。さらに実施例１と同手法により、コハク酸、乳酸、酢酸及びクエン酸の産生量を測定した。その結果、NaHCO3濃度が100 mMでコハク酸、乳酸及び酢酸の産生量は各々増加し、200 mMでは、乳酸及び酢酸の産生量は減少の傾向を示した（図３）。一方、クエン酸はNaHCO3濃度の増加に伴って、産生量は増加の傾向を示した（図３）。NaHCO3濃度を調節することで、ユーグレナにより有機酸（コハク酸、乳酸、酢酸、クエン酸）を効果的に産生可能であることが確認された。 The aqueous medium containing NIES-48 cultured in (4) above was centrifuged at 14000 g and 4 ° C. for 5 minutes, respectively, and the supernatant was collected and filtered by the same method as in Example 1. Further, production amounts of succinic acid, lactic acid, acetic acid and citric acid were measured by the same method as in Example 1. As a result, when the NaHCO 3 concentration was 100 mM, the production amounts of succinic acid, lactic acid, and acetic acid increased, and when the concentration was 200 mM, the production amounts of lactic acid and acetic acid tended to decrease (FIG. 3). On the other hand, the production amount of citric acid tended to increase as the concentration of NaHCO 3 increased (FIG. 3). It was confirmed that organic acids (succinic acid, lactic acid, acetic acid, citric acid) can be effectively produced by Euglena by adjusting the NaHCO 3 concentration.
（実施例３）微細藻（クラミドモナス）による有機酸の産生
　本実施例において、微細藻類の微生物種としてクラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）株を用いた。以下「C. reinhardtii」という。 (Example 3) Production of organic acid by microalgae (Chlamydomonas) In this example, a Chlamydomonas reinhardtii strain was used as a microbial species of microalgae. Hereinafter referred to as “C. reinhardtii”.
（１）前々培養
　TAP寒天培地（1.5%Agarを含むTAP培地）上で生育したC. reinhardtiiのコロニーを白金耳でとり、水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、100μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体としてMB6N培地を用いた。培養後のOD750は2.5～3.5であった。TAP培地及びMB6N培地の組成は表３に示した。 (1) Pre-culture C. reinhardtii colonies grown on TAP agar medium (TAP medium containing 1.5% Agar) were removed with a platinum loop, added to an aqueous medium (70 mL), and aerated with CO 2 at pH 7.8. Under the conditions, the cells were cultured at 30 ° C. for 4 to 5 days at 100 μmol photons m −2 s- 1 . Here, MB6N medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 2.5-3.5. The composition of the TAP medium and MB6N medium is shown in Table 3.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）前培養
　上記（１）で前々培養したC. reinhardtiiを、OD750が0.1になるように水性媒体（150 mL）に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは水性媒体としてMB6N培地を用いた。培養後のOD750は2.5～3.5であった。 (2) Pre-culture C. reinhardtii previously cultured in (1) above is added to an aqueous medium (150 mL) so that the OD 750 is 0.1, and 120 μmol photons m at pH 7.8 under CO 2 aeration conditions. The cells were cultured at −2 s- 1 at 30 ° C. for 3 days. Here, MB6N medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 2.5-3.5.
（３）本培養（光独立利用）
　上記（２）で前培養したC. reinhardtiiを、OD750が0.4になるように水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて5日間培養した。ここでは水性媒体としてMB6N培地を用いた。培養後のOD750は3.5～4.5であった。培養後、遠心分離（14000g、5分、4℃）でC. reinhardtiiを回収した。 (3) Main culture (light independent use)
C. reinhardtii pre-cultured in (2) above is added to an aqueous medium (70 mL) so that the OD 750 is 0.4, and 120 μmol photons m −2 s- 1 at pH 7.8 under CO 2 aeration. The cells were cultured at 30 ° C for 5 days. Here, MB6N medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 3.5 to 4.5. After cultivation, C. reinhardtii was recovered by centrifugation (14000 g, 5 minutes, 4 ° C.).
（４）本培養（嫌気・暗所）
　上記（３）で回収したC. reinhardtiiを、OD750が20になるように水性媒体（10 mL）に加えた。ここでは水性媒体として50 mM Hepes-KOH (pH7.8)を用いた。また、0、100 mMとなるようにNaHCO3を添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下170rpmで撹拌しながら、30℃で培養を開始し、72時間培養した。密閉状態を維持したままC. reinhardtiiを含む水性媒体を回収した。 (4) Main culture (anaerobic / dark)
C. reinhardtii recovered in (3) above was added to an aqueous medium (10 mL) so that the OD 750 was 20. Here, 50 mM Hepes-KOH (pH 7.8) was used as an aqueous medium. Further, NaHCO 3 was added so as to be 0 and 100 mM, N 2 aeration was performed for 10 minutes, cultivation was started at 30 ° C. with stirring at 170 rpm under anaerobic conditions, and cultivation was continued for 72 hours. An aqueous medium containing C. reinhardtii was recovered while maintaining a sealed state.
　上記（４）で回収した水性媒体を、各々14000g、4℃にて5分間遠心分離し、実施例１と同手法により上清を回収し、0.45μm孔径Mini-UniPrep（GEヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて濾過した。濾過液について、さらに実施例１と同手法により、コハク酸、乳酸及び酢酸の産生量を測定した。その結果、NaHCO3濃度が100 mMの場合にコハク酸、乳酸及び酢酸の産生量は各々増加した（図４）。NaHCO3濃度を調節することで、クラミドモナスにより有機酸（コハク酸、乳酸、酢酸）を効果的に産生可能であることが確認された。 The aqueous medium recovered in (4) above was centrifuged at 14000 g and 4 ° C. for 5 minutes, respectively, and the supernatant was recovered by the same method as in Example 1. 0.45 μm pore size Mini-UniPrep (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) (Manufactured by company). With respect to the filtrate, the production amounts of succinic acid, lactic acid and acetic acid were further measured by the same method as in Example 1. As a result, when the NaHCO 3 concentration was 100 mM, the production amounts of succinic acid, lactic acid, and acetic acid increased (FIG. 4). It was confirmed that organic acids (succinic acid, lactic acid, acetic acid) can be effectively produced by Chlamydomonas by adjusting the NaHCO 3 concentration.
（実施例４）微細藻（シネコシスティス）による有機酸の産生
　本実施例では、微細藻類を飽和状態のCO2条件下で培養したときの有機酸の産生について確認した。本実施例では、実施例１と同様にPCC6803（GT）を用いた。 (Example 4) Production of organic acid by microalgae (cinekocystis) In this example, production of organic acid was confirmed when microalgae were cultured under saturated CO 2 conditions. In this example, PCC6803 (GT) was used as in Example 1.
（１）前々培養
　BG-11寒天培地（1.5% Agarを含むBG-11）上で生育したPCC6803（GT）のコロニーを白金耳でとり、水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地（Rippka Rら, 1J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979)）に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。藻体密度は、Shimadzu UV mini spectrophotometer（紫外可視分光光度計：株式会社島津製作所製）を用いてOD750により測定した。培養後のOD750は1～1.5であった。通気とは、特に言及しない場合は空気による通気を意味する。以下の実施例についても同様である。 (1) Pre-culture PCC6803 (GT) colonies grown on BG-11 agar medium (BG-11 containing 1.5% Agar) were picked with a platinum loop and added to an aqueous medium (70 mL). Then, the cells were cultured at 30 ° C. for 4-5 days under 50 μmol photons m −2 s- 1 under aeration conditions. Here, a culture solution containing 17.6 mM NaNO 3 and 20 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium (Rippka R et al., 1J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979)) was used as an aqueous medium. The algal density was measured by OD 750 using a Shimadzu UV mini spectrophotometer (ultraviolet visible spectrophotometer: manufactured by Shimadzu Corporation). The OD 750 after culture was 1 to 1.5. The ventilation means air ventilation unless otherwise specified. The same applies to the following embodiments.
（２）前培養
　上記（１）で前々培養したPCC6803（GT）を、OD750が0.1になるように水性媒体（150 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は1～1.5であった。 (2) Pre-culture PCC6803 (GT) pre-cultured in (1) above is added to an aqueous medium (150 mL) so that OD 750 is 0.1, and 50 μmol photons m − at pH 7.8 under aeration conditions. They were cultured for 4 to 5 days at 30 ℃ in 2 s- 1. Here, a culture solution containing 17.6 mM NaNO 3 and 20 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 1 to 1.5.
（３）本培養（光独立利用）
　上記（２）で前培養したPCC6803（GT）を、OD750が0.4になるように水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは、水性媒体としてBG-11液体培地に5 mM NH4Cl, 50 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は6～7であった。培養後、フィルター（polytetrafluoroethylene膜、孔径1μm）濾過にてPCC6803（GT）を回収した。 (3) Main culture (light independent use)
PCC6803 (GT) pre-cultured in (2) above is added to an aqueous medium (70 mL) so that the OD 750 is 0.4, and 120 μmol photons m -2 s- 1 under CO 2 aeration conditions at pH 7.8. And then cultured at 30 ° C. for 3 days. Here, a culture solution containing 5 mM NH 4 Cl and 50 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 6-7. After the culture, PCC6803 (GT) was collected by filtration with a filter (polytetrafluoroethylene membrane, pore size 1 μm).
（４）本培養（嫌気・暗所）
　上記（３）で回収したPCC6803（GT）を、OD750が20になるように水性媒体（10 mL）に加えた。ここでは水性媒体として100 mM Hepes-KOH（pH7.8）を用いた。72時間N2を通気する条件及び72時間CO2を通気する条件下で培養し、PCC6803（GT）を含む水性媒体を回収した。この条件により、液体培地においてN2及びCO2は飽和状態となった。 (4) Main culture (anaerobic / dark)
PCC6803 (GT) recovered in (3) above was added to an aqueous medium (10 mL) so that the OD 750 was 20. Here, 100 mM Hepes-KOH (pH 7.8) was used as an aqueous medium. Cultivation was carried out under conditions of aeration with N 2 for 72 hours and aeration of CO 2 for 72 hours, and an aqueous medium containing PCC6803 (GT) was recovered. Under these conditions, N 2 and CO 2 became saturated in the liquid medium.
　上記（４）で回収した水性媒体を、各々14000g、4℃にて5分間遠心分離し、上清を回収し、0.45μm孔径Mini-UniPrep（GEヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて濾過した。濾過液について、コハク酸、乳酸、酢酸及びグリコーゲンの産生量を、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラム（Aminex HPX-87H；Bio-Rad社製）及び屈折率検出器（RID-10A；株式会社島津製作所製）を備えたHPLCにより測定した。フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸の産生量は非特許文献２に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動／質量分析（CE/MS）システム（CE：Agilent G7100；MS，Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製）及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア（Agilent Technologies社製）により制御される液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析（LC/QqQ-MS）システム（LC：Agilent 1200 series；MS，Agilent 6460 with Jet Stream Technology；Agilent Technologies社製）を用いて分析し、測定した。その結果、CO2での培養条件下で、コハク酸及び酢酸の産生量は増加の傾向を示した（図５）。 The aqueous medium recovered in (4) above is centrifuged at 14000 g and 4 ° C. for 5 minutes, respectively, and the supernatant is recovered and filtered using 0.45 μm pore size Mini-UniPrep (manufactured by GE Healthcare Japan). did. For the filtrate, the production amount of succinic acid, lactic acid, acetic acid and glycogen was measured using a high performance liquid chromatography (HPLC) column (Aminex HPX-87H; manufactured by Bio-Rad) and a refractive index detector (RID-10A; Shimadzu Corporation). Measured by HPLC equipped with Seisakusho. The production amounts of fumaric acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, and citric acid were extracted from intracellular metabolites as described in Non-Patent Document 2, and a capillary electrophoresis / mass spectrometry (CE / MS) system (CE: Liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC / QqQ-MS) controlled by Agilent G7100; MS, Agilent G6224AA LC / MSD TOF; Agilent Technologies) and MassHunter Workstation Data Acquisition software (Agilent Technologies) Analysis and measurement were performed using a system (LC: Agilent 1200 series; MS, Agilent 6460 with Jet Stream Technology; manufactured by Agilent Technologies). As a result, the production amount of succinic acid and acetic acid tended to increase under the culture conditions with CO 2 (FIG. 5).
（実施例５）PEPカルボキシラーゼ過剰発現微細藻による有機酸の産生
　本実施例ではPEPカルボキシラーゼ過剰発現微細藻による有機酸の産生を確認した。本実施例では実施例１に示すPCC6803（GT）を用いて、遺伝子組換え操作によりPEPカルボキシラーゼ過剰発現株PCC6803（PEPox）を作製した。PCC6803（PEPox）の作製方法は以下のとおりである。微細藻によるコハク酸の産生経路を図６に示し、PEPカルボキシラーゼ作用点を示した。 (Example 5) Production of organic acid by microalgae overexpressing PEP carboxylase In this example, production of organic acid by microalgae overexpressing PEP carboxylase was confirmed. In this example, a PEP carboxylase overexpression strain PCC6803 (PEPox) was prepared by gene recombination using PCC6803 (GT) shown in Example 1. The production method of PCC6803 (PEPox) is as follows. The production route of succinic acid by microalgae is shown in FIG. 6, and the PEP carboxylase action point is shown.
５－１．rbcLターミネーター及びslr0168領域下流のコード領域の一部は、PCC6803（GT）から抽出したゲノムDNAから、プライマーセットとして、配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチド、配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。得られた増幅断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clonetech社製、タカラバイオ株式会社より入手）を用いてPstI及びHindIII消化pBluescript II SK(+)(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)に挿入し、 pBluescript-TrbcL-slr0168を得た。 5-1. The rbcL terminator and a part of the coding region downstream of the slr0168 region use the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 as a primer set from genomic DNA extracted from PCC6803 (GT) And amplified by PCR. The obtained amplified fragment was inserted into PstI and HindIII digested pBluescriptBlueII SK (+) (AgilentgilTechnologies, Palo Alto, CA) using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clonetech, Takara Bio Inc.). PBluescript-TrbcL-slr0168 was obtained.
配列番号３：5'-CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGTTACAGTTTTGGCAATTAC-3'
配列番号４：5'-GCCAGCCCCAACACCTGACGCGTTTCCCCACTTAGATAAAAAATCC-3'
配列番号５：5'-TCTAAGTGGGGAAACGCGTCAGGTGTTGGGGCTGGC-3'
配列番号６：5'-TGATTACGCCAAGCTTCTAAGTCAGCGTAAATCTGACAATG-3' Sequence number 3: 5'-CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGTTACAGTTTTGGCAATTAC-3 '
Sequence number 4: 5'-GCCAGCCCCAACACCTGACGCGTTTCCCCACTTAGATAAAAAATCC-3 '
Sequence number 5: 5'-TCTAAGTGGGGAAACGCGTCAGGTGTTGGGGCTGGC-3 '
Sequence number 6: 5'-TGATTACGCCAAGCTTCTAAGTCAGCGTAAATCTGACAATG-3 '
５－２．カナマイシン耐性カセット及びrbcLプロモーターはpCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 及びPCC6803（GT）のゲノムDNAからプライマーセットとして配列番号５及び６に示すオリゴヌクレオチド、配列番号７及び８に示すオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。得られた増幅断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clonetech社製、タカラバイオ株式会社より入手）を用いて XhoI及びXbaI消化pBluescript-TrbcL-slr0168に挿入し、pBluescript-Kmr-PrbcL-TrbcL-slr0168を得た。 5-2. As the kanamycin resistance cassette and rbcL promoter, the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 were used as primer sets from the genomic DNA of pCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) and PCC6803 (GT). And amplified by PCR. The resulting amplified fragment, In-Fusion HD Cloning Kit with (Clonetech Inc., Takara available from Bio Inc.) was inserted into the XhoI and XbaI digested pBluescript-TrbcL-slr0168, pBluescript- Km r -PrbcL-TrbcL- got slr0168.
配列番号７：5'-CGGGCCCCCCCTCGAGCCGGAATTGCCAGCTGGGGC-3'
配列番号８：5'-TGGACTTTCTAATTAGAGCGGCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA-3'
配列番号９：5'-TCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGCCGCTCTAATTAGAAAGTCCA-3'
配列番号１０：5'-CCGGGGATCCTCTAGACATATGGGTCAGTCCTCCAT-3' Sequence number 7: 5'-CGGGCCCCCCCTCGAGCCGGAATTGCCAGCTGGGGC-3 '
Sequence number 8: 5'-TGGACTTTCTAATTAGAGCGGCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA-3 '
Sequence number 9: 5'-TCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGCCGCTCTAATTAGAAAGTCCA-3 '
SEQ ID NO: 10: 5'-CCGGGGATCCTCTAGACATATGGGTCAGTCCTCCAT-3 '
５－３．slr0168領域上流のコード領域の一部は、PCC6803（GT）から抽出したゲノムDNAから、プライマーセットとして配列番号９及び１０に示すオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。得られた増幅断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clonetech社製、タカラバイオ株式会社より入手）を用いて KpnI及びXhoI消化pBluescript-Kmr-PrbcL-TrbcL-slr0168に挿入し、pBluescript-slr0168-Kmr-PrbcL-TrbcL-slr0168を得た。 5-3. A part of the coding region upstream of the slr0168 region was amplified by PCR from the genomic DNA extracted from PCC6803 (GT) using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 9 and 10 as primer sets. The obtained amplified fragment was inserted into In-Fusion HD Cloning Kit KpnI and XhoI digested pBluescript-Km r with (Clonetech Inc., Takara available from Bio Inc.) -PrbcL-TrbcL-slr0168, pBluescript -slr0168- Km r -PrbcL-TrbcL-slr0168 was obtained.
配列番号１１：5'-TATAGGGCGAATTGGGTACCATGACTATTCAATACACCCCCCTAG-3'
配列番号１２：5'-TACCGTCGACCTCGAGCACCAGACCAAAGCCGGGAATTTC-3' Sequence number 11: 5'-TATAGGGCGAATTGGGTACCATGACTATTCAATACACCCCCCTAG-3 '
Sequence number 12: 5'-TACCGTCGACCTCGAGCACCAGACCAAAGCCGGGAATTTC-3 '
５－４．pUC19（タカラバイオ）のNdeI部位（CATATG）にAatII及びEcoRIで消化されたCACATGを置き換え、合成DNAを挿入した。pBluescript-slr0168-KMR-PrbcL-TrbcL-slr0168をKpnI及びHindIIIで消化した後、slr0168を含む断片は、上記作製したpUC19ベクターのKpnI/HindIII部位に挿入し、pSKrbcL-slr0168を作製した。 5-4. CACATG digested with AatII and EcoRI was substituted for the NdeI site (CATATG) of pUC19 (Takara Bio), and the synthetic DNA was inserted. After digesting pBluescript-slr0168-KMR-PrbcL-TrbcL-slr0168 with KpnI and HindIII, the fragment containing slr0168 was inserted into the KpnI / HindIII site of the pUC19 vector prepared above to prepare pSKrbcL-slr0168.
５－５．PEPカルボキシラーゼをコードするppc（sll0920）は、PCC6803（GT）から抽出したゲノムDNAから、プライマーセットとして配列番号１１及び配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。得られた増幅断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製、タカラバイオ株式会社より入手）を用いてNdeI/SalI消化pSKtrc-slr0168に挿入し、pSKtrc-slr0168/sll0920を得た。 5-5. Ppc (sll0920) encoding PEP carboxylase was amplified by PCR from genomic DNA extracted from PCC6803 (GT) using the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 as primer sets. The obtained amplified fragment was inserted into NdeI / SalI-digested pSKtrc-slr0168 using In-Fusion®HD®Cloning®Kit (manufactured by Takalon Bio Inc., Clontech) to obtain pSKtrc-slr0168 / sll0920.
配列番号１３：5'- AGGAAACAGACCCATATGAACTTGGCAGTTCCTGC -3'
配列番号１４：5'- AACCTGCAGGTCGACTCAACCAGTATTACGCA -3' SEQ ID NO: 13: 5'-AGGAAACAGACCCATATGAACTTGGCAGTTCCTGC-3 '
SEQ ID NO: 14: 5'-AACCTGCAGGTCGACTCAACCAGTATTACGCA-3 '
５－６．得られたプラスミドpSKtrc-slr0168/sll0920ベクター（sll0920コード領域を含む）によりPCC6803（GT）を形質転換した。コントロールとして、空ベクター（sll0920コード領域を含まないプラスミドpSKtrc-slr0168ベクター）での形質転換を行った。上記により形質転換され、sll0920が過剰発現するよう作製されたPCC6803（GT）をPCC6803（PEPox）ということとする。また、形質転換されていない野生型のPCC6803（GT）をPCC6803（VC）ということとする。 5-6. PCC6803 (GT) was transformed with the obtained plasmid pSKtrc-slr0168 / sll0920 vector (including the sll0920 coding region). As a control, transformation with an empty vector (plasmid pSKtrc-slr0168 vector not containing the sll0920 coding region) was performed. PCC6803 (GT) transformed so as to overexpress sll0920 is referred to as PCC6803 (PEPox). In addition, wild-type PCC6803 (GT) that is not transformed is referred to as PCC6803 (VC).
５－７．上記作製されたPCC6803（PEPox）及びPCC6803（VC）について、実施例１の（１）～（３）と同様の培養条件に基づいて、培養した。（４）の嫌気・暗所条件下での本培養において、0又は100 mMのNaHCO3を水性媒体に添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下で培養を開始し、72時間後にPCC6803（PEPox）又はPCC6803（VC）を含む水性媒体を回収した。回収した水性媒体について、実施例１と同手法によりコハク酸、乳酸及び酢酸の産生量を測定した。その結果、コハク酸及び酢酸は、NaHCO3添加の有無にかかわらず、PEPカルボキシラーゼ過剰発現株PCC6803（PEPox）の方が高い産生能を示したのに対し、乳酸はNaHCO3添加の有無により産生能に変動することが確認された（図７）。 5-7. The above-prepared PCC6803 (PEPox) and PCC6803 (VC) were cultured based on the same culture conditions as in (1) to (3) of Example 1. In the main culture under anaerobic / dark conditions in (4), 0 or 100 mM NaHCO 3 was added to the aqueous medium, and after 10 minutes of N 2 aeration, the culture was started under anaerobic conditions, and after 72 hours. An aqueous medium containing PCC6803 (PEPox) or PCC6803 (VC) was recovered. About the collect | recovered aqueous medium, the production amount of succinic acid, lactic acid, and acetic acid was measured by the same method as Example 1. FIG. As a result, succinic acid and acetic acid showed higher production ability in the PEP carboxylase overexpression strain PCC6803 (PEPox) regardless of the presence or absence of NaHCO 3 addition, whereas lactic acid produced by the presence or absence of NaHCO 3 addition. (Fig. 7).
（実施例６）PGM過剰発現微細藻による有機酸の産生
　本実施例では、PGM過剰発現微細藻による有機酸の産生を確認した。本実施例では実施例１に示すPCC6803（GT）を用いて、遺伝子組換え操作によりPGM過剰発現株PCC6803（PGMox）を作製した。PCC6803（PGMox）の作製方法は、図８に示した。微細藻によるコハク酸の産生経路を図６に示し、PGM作用点を示した。 (Example 6) Production of organic acid by PGM overexpressing microalgae In this example, production of organic acid by PGM overexpressing microalgae was confirmed. In this example, using PCC6803 (GT) shown in Example 1, a PGM overexpression strain PCC6803 (PGMox) was produced by gene recombination. A method for producing PCC6803 (PGMox) is shown in FIG. The production route of succinic acid by microalgae is shown in FIG.
　上記実施例５の５－１．～５－３．と同手法によりpBluescript-slr0168-Kmr-PrbcL-TrbcL-slr0168を作製した。pSKtrc-slr0168/sll0726によりPCC6803（GT）を形質転換し、sll0726が過剰発現するよう作製されたPCC6803（GT）を、本実施例においてPCC6803（PGMox）という。また、形質転換されていない野生型のPCC6803（GT）を、実施例５－６．と同様にPCC6803（VC）という。 Example 5-1. ~ 5-3. And to prepare a pBluescript-slr0168-Km r -PrbcL- TrbcL-slr0168 by the same technique. PCC6803 (GT) prepared by transforming PCC6803 (GT) with pSKtrc-slr0168 / sll0726 and overexpressing sll0726 is referred to as PCC6803 (PGMox) in this example. In addition, untransformed wild-type PCC6803 (GT) was prepared in Example 5-6. Like PCC6803 (VC).
　上記作製されたPCC6803（PGMox）及びPCC6803（VC）について、実施例１の（１）～（３）と同様の培養条件に基づいて、培養した。（４）の嫌気・暗所条件下での本培養において、10分間のN2通気後、嫌気条件下で培養を開始し、72時間後にPCC6803（PGMox）又はPCC6803（VC）を含む水性媒体を回収した。回収した水性媒体について、実施例１と同手法によりコハク酸、乳酸及び酢酸の産生量を測定した。その結果いずれについても、PGM過剰発現株PCC6803（PGMox）の方が高い産生能を示した（図９）。 The above-prepared PCC6803 (PGMox) and PCC6803 (VC) were cultured based on the same culture conditions as in (1) to (3) of Example 1. In main culture under anaerobic and dark conditions in (4), after 10 minutes of N 2 aeration, the culture is started under anaerobic conditions, and after 72 hours, an aqueous medium containing PCC6803 (PGMox) or PCC6803 (VC) is added. It was collected. About the collect | recovered aqueous medium, the production amount of succinic acid, lactic acid, and acetic acid was measured by the same method as Example 1. FIG. As a result, the PGM overexpressing strain PCC6803 (PGMox) showed higher productivity in all cases (FIG. 9).
（実施例７）PFOR過剰発現微細藻による有機酸の産生
　本実施例では、PFOR過剰発現微細藻による有機酸の産生を確認した。本実施例では実施例１に示すPCC6803（GT）を用いて、遺伝子組換え操作によりSynechococcus sp. PCC7002由来PFOR遺伝子（A1443）を過剰発現する株PCC6803（PFORox）を作製した。PCC6803（PFORox）の作製方法は、図１０に示した。微細藻によるコハク酸の産生経路を図６に示し、PFOの作用点を示した。 (Example 7) Production of organic acid by PFOR overexpressing microalgae In this example, production of organic acid by PFOR overexpressing microalgae was confirmed. In this example, using the PCC6803 (GT) shown in Example 1, a strain PCC6803 (PFORox) overexpressing the PFOR gene (A1443) derived from Synechococcus sp. PCC7002 was prepared by gene recombination. The method for producing PCC6803 (PFORox) is shown in FIG. The production route of succinic acid by microalgae is shown in FIG. 6, and the action point of PFO is shown.
　上記実施例５の５－１．～５－３．と同手法によりpBluescript-slr0168-Kmr-PrbcL-TrbcL-slr0168を作製した。pSKtrc-PFOR（A1443）によりPCC6803（GT）を形質転換した。PFOR（A1443）が過剰発現するよう作製されたPCC6803（GT）を本実施例においてPCC6803（PFORox）ということとする。また、形質転換されていない野生型のPCC6803（GT）を実施例５－６．と同様にPCC6803（VC）という。 Example 5-1. ~ 5-3. And to prepare a pBluescript-slr0168-Km r -PrbcL- TrbcL-slr0168 by the same technique. PCC6803 (GT) was transformed with pSKtrc-PFOR (A1443). PCC6803 (GT) prepared so that PFOR (A1443) is overexpressed is referred to as PCC6803 (PFORox) in this example. In addition, untransformed wild-type PCC6803 (GT) was used in Example 5-6. Like PCC6803 (VC).
　上記作製されたPCC6803（PFORox）及びPCC6803（VC）について、実施例１の（１）～（３）と同様の培養条件に基づいて、培養した。（４）の嫌気・暗所条件下での本培養において、0又は100 mMのNaHCO3を水性媒体に添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下で培養を開始し、72時間後にPCC6803（PFORox）又はPCC6803（VC）を含む水性媒体を回収した。回収した水性媒体について、実施例１と同手法によりコハク酸、乳酸及び酢酸の産生量を測定した。その結果、コハク酸はNaHCO3添加の有無にかかわらずPFOR過剰発現株PCC6803（PFORox）の方が高い産生能を示し、NaHCO3を添加することでより高く産生されることが確認された。乳酸はNaHCO3の添加によって高い産生能が確認され、PFOR過剰発現株PCC6803（PFORox）の方が高い産生能を示した（図１１Ａ）。また、細胞密度（Cell concentration）も、光培養72時間後のOD750により測定した。その結果、細胞密度については殆ど差を認めなかった（図１１Ｂ）。 The above-prepared PCC6803 (PFORox) and PCC6803 (VC) were cultured under the same culture conditions as in (1) to (3) of Example 1. In the main culture under anaerobic / dark conditions in (4), 0 or 100 mM NaHCO 3 was added to the aqueous medium, and after 10 minutes of N 2 aeration, the culture was started under anaerobic conditions, and after 72 hours. An aqueous medium containing PCC6803 (PFORox) or PCC6803 (VC) was recovered. About the collect | recovered aqueous medium, the production amount of succinic acid, lactic acid, and acetic acid was measured by the same method as Example 1. FIG. As a result, it was confirmed that succinic acid showed higher productivity in the PFOR overexpressing strain PCC6803 (PFORox) regardless of the presence or absence of NaHCO 3 addition, and was produced higher by adding NaHCO 3 . Lactic acid was confirmed to have a high productivity by the addition of NaHCO 3 , and the PFOR overexpression strain PCC6803 (PFORox) showed a higher productivity (FIG. 11A). Cell density was also measured by OD 750 after 72 hours of light culture. As a result, there was almost no difference in cell density (FIG. 11B).
（実施例８）Flv3過剰発現微細藻による有機酸の産生
８－１．Flv3過剰発現微細藻の作製
　本実施例では実施例１に示すPCC6803（GT）を用いて、遺伝子組換え操作によりFlv3過剰発現株PCC6803（Flv3ox）を作製した。PCC6803（Flv3ox）の作製方法は以下のとおりである。 (Example 8) Production of organic acid by Flv3 overexpressing microalgae 8-1. Production of Flv3-overexpressing microalgae In this example, using the PCC6803 (GT) shown in Example 1, Flv3-overexpressing strain PCC6803 (Flv3ox) was produced by gene recombination. The production method of PCC6803 (Flv3ox) is as follows.
　PCC6803（GT）から抽出したゲノムDNAから、フォワードプライマー（5'-GGAATTATAACCATAATGTTCACTACCCCCCTCCC-3'：配列番号１５）及びリバースプライマー（5'-GGCATGGAGGACATATTAGTAATAATTGCCGACTT-3'：配列番号１６）を用いて、flv3（sll0550）コード領域をPCRにより増幅した。 From the genomic DNA extracted from PCC6803 (GT), using forward primer (5'-GGAATTATAACCATAATGTTCACTACCCCCCTCCC-3 ': SEQ ID NO: 15) and reverse primer (5'-GGCATGGAGGACATATTAGTAATAATTGCCGACTT-3': SEQ ID NO: 16), flv3 (sll0550) The coding region was amplified by PCR.
　得られた1.7kb増幅断片を、In-Fusion Cloning Kit（Clonetech社製、タカラバイオ株式会社より入手）を用いてNdeI消化pTCP2031Vベクターに挿入した。pTCP2031Vベクターは、psbA2（slr1311）プロモーター、及びslr2030及びslr2031のコード領域の一部（相同組換え用プラットフォームとして）、及びクロラムフェニコール耐性カセットを含む組換えプラスミドである（Satoh Sら, 2001, J. Biol. Chem. 276, 4293-4297；Horiuchi Mら, 2010, Biochem. J. 431, 135-140）。 The obtained 1.7 kb amplified fragment was inserted into the NdeI digested pTCP2031V vector using In-Fusion Cloning Kit (available from Clonetech, Takara Bio Inc.). The pTCP2031V vector is a recombinant plasmid containing the psbA2 (slr1311) promoter and part of the coding region of slr2030 and slr2031 (as a platform for homologous recombination) and a chloramphenicol resistance cassette (Satoh S et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 4293-4297; Horiuchi M et al., 2010, Biochem. J. 431, 135-140).
　得られたプラスミドpTCP2031Vベクター（flv3コード領域を含む）によりPCC6803（GT）を形質転換し、PCC6803（Flv3ox）を作製した。コントロールとして、空ベクター（flv3コード領域を含まないプラスミドpTCP2031Vベクター）での形質転換を行った。また、形質転換されていない野生型のPCC6803（GT）をPCC6803（VC）ということとする。 PCC6803 (GT) was transformed with the obtained plasmid pTCP2031V vector (including flv3 coding region) to prepare PCC6803 (Flv3ox). As a control, transformation with an empty vector (plasmid pTCP2031V vector not containing the flv3 coding region) was performed. In addition, wild-type PCC6803 (GT) that is not transformed is referred to as PCC6803 (VC).
８－２．有機酸産生プロセスの検討
　本実施例では、PCC6803（Flv3ox）を用いて有機酸産生プロセスの検討を行った。 8-2. Examination of organic acid production process In this example, an organic acid production process was examined using PCC6803 (Flv3ox).
（１）前々培養
　BG11寒天培地（1.5%Agarを含むBG11）上で生育したPCC6803（Flv3ox）のコロニーを白金耳でとり、水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地（Rippka Rら, 1979, J Gen Microbiol 111: 1-61）に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。Shimadzu UV mini spectrophotometer（紫外可視分光光度計：株式会社島津製作所製）を用いてOD750により細胞密度を測定した。培養後のOD750は1～1.5であった。 (1) Pre-culture Incubate PCC6803 (Flv3ox) colonies grown on BG11 agar medium (BG11 containing 1.5% Agar) with a platinum loop, add to aqueous medium (70 mL), and aerated at pH 7.8 The cells were cultured at 30 ° C. for 4-5 days at 50 μmol photons m -2 s -1 Here, a culture solution containing 17.6 mM NaNO 3 and 20 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium (Rippka R et al., 1979, J Gen Microbiol 111: 1-61) was used as an aqueous medium. Cell density was measured by OD 750 using Shimadzu UV mini spectrophotometer (UV-visible spectrophotometer: manufactured by Shimadzu Corporation). The OD 750 after culture was 1 to 1.5.
（２）前培養
　上記（１）で前々培養したPCC6803（Flv3ox）を、OD750が0.1になるように水性媒体（150 mL）に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4～5日間培養した。ここでは水性媒体として、G-11液体培地に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は1～1.5であった。 (2) Pre-culture PCC6803 (Flv3ox) pre-cultured in (1) above was added to an aqueous medium (150 mL) so that OD 750 was 0.1, and 50 μmol photons m − at pH 7.8 under aeration conditions. The cells were cultured at 30 ° C. for 2-5 days for 2-5 days. Here, a culture solution containing 17.6 mM NaNO 3 and 20 mM Hepes-KOH in a G-11 liquid medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 1 to 1.5.
（３）本培養（光独立利用）
　上記（２）で前培養したPCC6803（Flv3ox）を、OD750が0.4になるように水性媒体（70 mL）に加え、pH7.8にて1% CO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは、水性媒体としてBG-11液体培地に5 mM NH4Cl/NaNO3, 50 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は6～7であった。培養後、菌体を遠心分離（14000g、5分、4℃）で回収した。 (3) Main culture (light independent use)
PCC6803 (Flv3ox) pre-cultured in (2) above is added to an aqueous medium (70 mL) so that the OD 750 is 0.4, and 120 μmol photons m -2 s under 1% CO 2 aeration at pH 7.8. The cells were cultured at 30 ° C for 3 days at -1 . Here, a culture solution containing 5 mM NH 4 Cl / NaNO 3 and 50 mM Hepes-KOH in a BG-11 liquid medium was used as an aqueous medium. The OD 750 after culture was 6-7. After the cultivation, the cells were collected by centrifugation (14000 g, 5 minutes, 4 ° C.).
（４）本培養（嫌気・暗所）
　上記（３）で培養したPCC6803（Flv3ox）を、OD750が20になるように水性媒体（10 mL）に加え、N2通気による嫌気条件下で10分後に170rpmで撹拌し、30℃で培養を開始した。ここでは水性媒体として50 mM Hepes-KOHを用いた。密閉状態を維持したまま水性媒体を回収し、OD/pHを測定し、有機酸分析、メタボローム解析、グリコーゲン分析を行った。 (4) Main culture (anaerobic / dark)
PCC6803 (Flv3ox) cultured in (3) above is added to an aqueous medium (10 mL) so that the OD 750 is 20, and stirred at 170 rpm after 10 minutes under anaerobic conditions with N 2 aeration, and cultured at 30 ° C. Started. Here, 50 mM Hepes-KOH was used as an aqueous medium. The aqueous medium was recovered while maintaining the sealed state, OD / pH was measured, and organic acid analysis, metabolome analysis, and glycogen analysis were performed.
８－３．PCC6803（Flv3ox）の培養による有機酸の産生
　上記８－２の嫌気・暗所条件下で培養したPCC6803（Flv3ox）及び比較例としてのPCC6803（VC）について、コハク酸及び乳酸の産生量を確認した。水性媒体中の窒素源として塩化アンモニウム（NH4Cl）を用いた。
　上記８－２の（４）で培養したPCC6803（Flv3ox）培養液及び比較例の培養液を、各々14000g、4℃にて5分間遠心分離し、上清を回収した。0.45μm孔径Mini-uniPrep（GEヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて濾過し、HPLCカラム（Aminex HPX-87H；Bio-Rad社製）及び屈折率検出器（RID-10A；株式会社島津製作所製）を備えた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（株式会社島津製作所製）を用いて、コハク酸及び乳酸の産生量を測定した。その結果、Flv3過剰発現させたPCC6803（Flv3ox）がコハク酸及び乳酸のいずれについても高い産生量を示した（図１２）。 8-3. Production of organic acids by culturing PCC6803 (Flv3ox) Production of succinic acid and lactic acid was confirmed for PCC6803 (Flv3ox) cultured under anaerobic and dark conditions in 8-2 above and PCC6803 (VC) as a comparative example. . Ammonium chloride (NH 4 Cl) was used as a nitrogen source in the aqueous medium.
The PCC6803 (Flv3ox) culture solution cultured in (8) (4) and the culture solution of the comparative example were each centrifuged at 14000 g and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was collected. Filter using 0.45μm pore size Mini-uniPrep (GE Healthcare Japan), HPLC column (Aminex HPX-87H; Bio-Rad) and refractive index detector (RID-10A; Shimadzu Corporation) The amount of succinic acid and lactic acid produced was measured using high performance liquid chromatography (HPLC) (manufactured by Shimadzu Corporation). As a result, PCC6803 (Flv3ox) overexpressed in Flv3 showed a high production amount for both succinic acid and lactic acid (FIG. 12).
（実施例９）PCC6803（Flv3ox）の培養による細胞内グリコーゲン及びATP
　実施例８（８－２）の嫌気・暗所条件下で培養したPCC6803（Flv3ox）及び比較例としてのPCC6803（VC）について、細胞内グリコーゲン及びATPの蓄積量を測定した。水性媒体中の窒素源として塩化アンモニウム（NH4Cl）を用いた。その結果、グリコーゲン及びATPのいずれについてもFlv3過剰発現させたPCC6803（Flv3ox）が高い蓄積量を示した（図１３）。 (Example 9) Intracellular glycogen and ATP by culture of PCC6803 (Flv3ox)
For PCC6803 (Flv3ox) cultured under anaerobic / dark conditions in Example 8 (8-2) and PCC6803 (VC) as a comparative example, the amounts of intracellular glycogen and ATP accumulated were measured. Ammonium chloride (NH 4 Cl) was used as a nitrogen source in the aqueous medium. As a result, PCC6803 (Flv3ox) overexpressed in Flv3 showed a high accumulation amount for both glycogen and ATP (FIG. 13).
（１）グリコーゲン定量
　1μm孔径ポリテトラフルオロエチレン（PTEE）メンブレンフィルター（Omnipore；Millipore社製）を用いて5 mg乾燥重のPCC6803（Flv3ox）を採取した。濾過直後、細胞を20 mMの予冷した炭酸アンモニウムで洗浄した。すぐに、メンブレンフィルター上のPCC6803（Flv3ox）を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥機（Labconco社製）内で凍結乾燥した。既報（Izumi Yら, 2013, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 930: 90-97）の通り、細胞からグリコーゲンを抽出した後、サイズ排除HPLCカラム（OHpak SB-806M HQ；昭和電工株式会社製）及び屈折率検出器（RID-10A；株式会社島津製作所製）を備えた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（株式会社島津製作所製）を用いて、グリコーゲン含量を測定した。 (1) Quantification of glycogen 5 mg dry weight of PCC6803 (Flv3ox) was collected using a 1 μm pore size polytetrafluoroethylene (PTEE) membrane filter (Omnipore; manufactured by Millipore). Immediately after filtration, the cells were washed with 20 mM pre-chilled ammonium carbonate. Immediately, PCC6803 (Flv3ox) on the membrane filter was frozen in liquid nitrogen and lyophilized in a lyophilizer (Labconco). As previously reported (Izumi Y et al., 2013, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 930: 90-97), after extracting glycogen from cells, size exclusion HPLC column (OHpak SB-806M HQ; manufactured by Showa Denko KK) And the glycogen content was measured using a high performance liquid chromatography (HPLC) (manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a refractive index detector (RID-10A; manufactured by Shimadzu Corporation).
（２）ATP定量
　ATP量は、非特許文献２に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動／質量分析（CE/MS）システム（CE：Agilent G7100；MS，Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製）及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア（Agilent Technologies社製）により制御される液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析（LC/QqQ-MS）システム（LC：Agilent 1200 series；MS，Agilent 6460 with Jet Stream Technology；Agilent Technologies社製）を用いて分析し、測定した。 (2) ATP quantification As described in Non-Patent Document 2, the amount of ATP is obtained by extracting intracellular metabolites and capillary electrophoresis / mass spectrometry (CE / MS) system (CE: Agilent G7100; MS, Agilent G6224AA LC / MSD TOF; Agilent Technologies) and liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC / QqQ-MS) system (LC: Agilent 1200 series) controlled by MassHunter Workstation Data Acquisition software (Agilent Technologies) MS, Agilent 6460 with Jet Stream Technology (manufactured by Agilent Technologies) and analyzed.
（参考例１）微細藻（シネコシスティス）における細胞内代謝物の確認
　本参考例では、微細藻として実施例１に示したPCC6803（GT）を用い、細胞内代謝物質の13C標識率の経時変化を確認した。PCC6803（GT）を100 mMのNaH13CO3を含む100 mM Hepes-KOH水性媒体（pH7.8）に懸濁し、N2通気後嫌気条件下で培養した。ラベル後24時間目に、1μm孔径ポリテトラフルオロエチレン（PTEE）メンブレンフィルター（Omnipore；Millipore社製）を用いて5 mg乾燥重のPCC6803（GT）を採取した。濾過直後、細胞を20 mMの予冷した炭酸アンモニウムで洗浄した。すぐに、メンブレンフィルター上のPCC6803（GT）を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥機（Labconco社製）内で凍結乾燥した。非特許文献２に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動／質量分析（CE/MS）システム（CE：Agilent G7100；MS，Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製）及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア（Agilent Technologies社製）により制御される液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析（LC/QqQ-MS）システム（LC：Agilent 1200 series；MS，Agilent 6460 with Jet Stream Technology；Agilent Technologies社製）を用いて分析し、測定した。その結果を、図１４に示した。細胞内代謝経路は図１５に示した。上記結果より、PCC6803（GT）の嫌気条件培養により、微細藻に取り込まれたNaHCO3は、有機酸に異化されることが確認された。 (Reference Example 1) Confirmation of intracellular metabolites in microalgae (Sinecocystis) In this reference example, PCC6803 (GT) shown in Example 1 was used as a microalgae, and 13 C labeling rate of intracellular metabolites was changed over time. It was confirmed. PCC6803 (GT) was suspended in 100 mM Hepes-KOH aqueous medium (pH 7.8) containing 100 mM NaH 13 CO 3 and cultured under anaerobic conditions after aeration with N 2 . At 24 hours after labeling, 5 mg dry weight PCC6803 (GT) was collected using a 1 μm pore size polytetrafluoroethylene (PTEE) membrane filter (Omnipore; manufactured by Millipore). Immediately after filtration, the cells were washed with 20 mM pre-chilled ammonium carbonate. Immediately, PCC6803 (GT) on the membrane filter was frozen in liquid nitrogen and lyophilized in a lyophilizer (Labconco). As described in Non-Patent Document 2, intracellular metabolites are extracted, and capillary electrophoresis / mass spectrometry (CE / MS) system (CE: Agilent G7100; MS, Agilent G6224AA LC / MSD TOF; manufactured by Agilent Technologies) And MassHunter Workstation Data Acquisition software (manufactured by Agilent Technologies)-Liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC / QqQ-MS) system (LC: Agilent 1200 series; MS, Agilent 6460 with Jet Stream Technology; (Agilent Technologies) was used for analysis and measurement. The results are shown in FIG. The intracellular metabolic pathway is shown in FIG. From the above results, it was confirmed that NaHCO 3 incorporated into microalgae was catabolized to an organic acid by anaerobic culture of PCC6803 (GT).
（参考例２）微細藻の培養による細胞密度及びグリコーゲン蓄積量の確認
　本参考例では微細藻としてPCC6803（GT）を用い、実施例８の嫌気・暗所条件下で培養したときの、細胞密度変化、グリコーゲン蓄積量を確認した。水性媒体中の窒素源として塩化アンモニウム（NH4Cl）又は硝酸ナトリウム（NaNO3）を用いた。 (Reference Example 2) Confirmation of Cell Density and Glycogen Accumulation Amount by Microalgae Culture In this reference example, PCC6803 (GT) was used as the microalgae, and the cell density when cultured under the anaerobic / dark conditions of Example 8 Changes and glycogen accumulation were confirmed. Ammonium chloride (NH 4 Cl) or sodium nitrate (NaNO 3 ) was used as a nitrogen source in the aqueous medium.
（１）細胞密度
　上記培養したPCC6803（GT）について、Shimadzu UV mini spectrophotometer（紫外可視分光光度計：株式会社島津製作所製）を用いてOD750により細胞密度を測定した。
　その結果、窒素源の違いによる細胞密度はほとんど差がなかった（図１６Ａ）。 (1) Cell density The cell density of the cultured PCC6803 (GT) was measured with an OD 750 using a Shimadzu UV mini spectrophotometer (UV-visible spectrophotometer: manufactured by Shimadzu Corporation).
As a result, there was almost no difference in cell density due to the difference in nitrogen source (FIG. 16A).
（２）グリコーゲン定量
　グリコーゲンは、実施例９）と同手法により測定した。その結果、窒素源の違いによるグリコーゲンの細胞内蓄積量はほとんど差がなかった（図１６Ｂ）。 (2) Quantification of glycogen Glycogen was measured by the same method as in Example 9). As a result, there was almost no difference in the intracellular accumulation amount of glycogen due to the difference in nitrogen source (FIG. 16B).
（参考例３）微細藻の培養による有機酸の定量
　本参考例ではPCC6803（GT）を参考例２と同手法にて培養したときの酢酸、乳酸及びコハク酸の産生を確認した。乳酸及びコハク酸の産生量は、非特許文献２に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動／質量分析（CE/MS）システム（CE：Agilent G7100；MS，Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製）及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア（Agilent Technologies社製）により制御される液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析（LC/QqQ-MS）システム（LC：Agilent 1200 series；MS，Agilent 6460 with Jet Stream Technology；Agilent Technologies社製）を用いて分析し、測定した。 (Reference Example 3) Quantification of Organic Acid by Culture of Microalgae In this reference example, production of acetic acid, lactic acid and succinic acid when PCC6803 (GT) was cultured in the same manner as in Reference Example 2 was confirmed. The amount of lactic acid and succinic acid produced was determined by extracting intracellular metabolites and capillary electrophoresis / mass spectrometry (CE / MS) system (CE: Agilent G7100; MS, Agilent G6224AA LC as described in Non-Patent Document 2. / MSD TOF; Agilent Technologies) and liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC / QqQ-MS) system (LC: Agilent 1200 series) controlled by MassHunter Workstation Data Acquisition software (Agilent Technologies) MS, Agilent 6460 with Jet Stream Technology (manufactured by Agilent Technologies) and analyzed.
　その結果、自己発酵において酢酸、乳酸及びコハク酸の細胞内蓄積量は、培養時間と共に増加、又はやや増加傾向が認められた。酢酸の細胞内蓄積量は、窒素源の違いによる差はほとんど認められなかったが（図１７Ａ）、乳酸及びコハク酸については塩化アンモニウムを窒素源として用いたほうが蓄積量が多いことが観察された（図１７Ｂ、Ｃ）。 As a result, the amount of acetic acid, lactic acid and succinic acid accumulated in cells during auto-fermentation increased or slightly increased with the culture time. There was little difference in the amount of acetic acid accumulated in the cells due to differences in the nitrogen source (FIG. 17A), but it was observed that lactic acid and succinic acid had a larger accumulation amount when ammonium chloride was used as the nitrogen source. (FIGS. 17B and C).
（参考例４）微細藻の培養による細胞内代謝プロファイル
　本参考例では、PCC6803（GT）を参考例２と同手法にて培養したときの細胞内代謝プロファイルを調べた。細胞内代謝プロファイルは、非特許文献２に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動／質量分析（CE/MS）システム（CE：Agilent G7100；MS，Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製）及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア（Agilent Technologies社製）により制御される液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析（LC/QqQ-MS）システム（LC：Agilent 1200 series；MS，Agilent 6460 with Jet Stream Technology；Agilent Technologies社製）を用いて分析し、測定した。 Reference Example 4 Intracellular Metabolic Profile by Microalgae Culture In this reference example, the intracellular metabolic profile when PCC6803 (GT) was cultured in the same manner as in Reference Example 2 was examined. As described in Non-Patent Document 2, the intracellular metabolite profile is obtained by extracting intracellular metabolites, and capillary electrophoresis / mass spectrometry (CE / MS) system (CE: Agilent G7100; MS, Agilent G6224AA LC / MSD TOF Liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC / QqQ-MS) system (LC: Agilent 1200 series; MS, Agilent) controlled by Agilent Technologies) and MassHunter Workstation Data Acquisition software (Agilent Technologies) 6460 with Jet Stream Technology (manufactured by Agilent Technologies) and analyzed.
　その結果、上記培養によりコハク酸、乳酸及びリンゴ酸等の有機酸の細胞内蓄積が確認された（図１８、１９）。特に培養開始6～24時間の間に、微細藻内にコハク酸、乳酸及びリンゴ酸の蓄積がピークになることを観察した。 As a result, intracellular accumulation of organic acids such as succinic acid, lactic acid and malic acid was confirmed by the above culture (FIGS. 18 and 19). In particular, it was observed that accumulation of succinic acid, lactic acid and malic acid reached a peak in the microalgae during 6 to 24 hours from the start of culture.
（参考例５）微細藻の培養によるATPの利用
　本参考例では、PCC6803（GT）を参考例２と同手法にて培養したときの細胞内のATP量を調べた。即ち、コハク酸、乳酸及びリンゴ酸等の有機酸の産生に伴うATPの利用を確認した。その結果、有機酸の産生に伴い、ATPがADP及びAMPに分解することが確認された（図２０）。即ち、細胞内に蓄積されたATPを有効活用し、コハク酸、乳酸及びリンゴ酸等の有機酸が効果的に産生されることが確認された。即ち、本発明のFlv3が過剰発現するよう作製されたPCC6803（Flv3ox）によれば、より効果的に有機酸が産生されることが示唆された。 (Reference Example 5) Use of ATP by culturing microalgae In this reference example, the amount of ATP in cells when PCC6803 (GT) was cultured in the same manner as in Reference Example 2 was examined. That is, the use of ATP accompanying the production of organic acids such as succinic acid, lactic acid and malic acid was confirmed. As a result, it was confirmed that ATP was decomposed into ADP and AMP with the production of the organic acid (FIG. 20). In other words, it was confirmed that organic acids such as succinic acid, lactic acid and malic acid were effectively produced by effectively utilizing ATP accumulated in the cells. That is, it was suggested that PCC6803 (Flv3ox) prepared so that Flv3 of the present invention is overexpressed produces organic acids more effectively.
　以上詳述したように、本発明の方法で微細藻を培養することで、バイオマスを有効活用することができる。微細藻の光合成と微細藻に取り込まれた炭素源によりバイオマスから有機酸を産生することができる。さらに、NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能及び／又はグリコーゲンからクエン酸回路に至る解糖系での律速酵素の機能が増強された微細藻によれば、より効果的に細胞内代謝物である有機酸を回収することができる。水性媒体への炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの供給は、例えば電気や鉄鋼等の製造工程において産業的に排出された大気中のCO2を利用し、有効活用することができる。従来は、有機酸のうち例えばコハク酸等は石油等を原料として産生されていたが、その際にCO2が排出されていたのに対し、本発明の方法によれば、有機酸の製造工程でCO2を排出しないばかりか、大気中のCO2を有効活用できる点で、自然環境に対して優れた効果を有する。さらに、本発明の微細藻によれば、バイオマスとして使用される水性媒体は淡水のみならず海水を活用することができ、水資源の枯渇や耕作地の限界に左右されず安定的に有効活用することができる。 As described in detail above, biomass can be effectively utilized by culturing microalgae by the method of the present invention. Organic acids can be produced from biomass by photosynthesis of microalgae and carbon sources incorporated into microalgae. Furthermore, according to the microalga with enhanced NADPH-O 2 oxidoreductase function and / or rate-limiting enzyme function in glycolysis from glycogen to citrate cycle, organic metabolites that are intracellular metabolites are more effective. The acid can be recovered. The supply of carbonate ions and / or bicarbonate ions to the aqueous medium can be effectively utilized using, for example, CO 2 in the atmosphere discharged industrially in the manufacturing process of electricity, steel, and the like. Conventionally, for example, succinic acid among organic acids has been produced using petroleum or the like as a raw material, but CO 2 was emitted at that time, whereas according to the method of the present invention, the production process of organic acid in not only does not emit CO 2, in that it can effectively utilize the CO 2 in the atmosphere, it has an excellent effect against the natural environment. Furthermore, according to the microalgae of the present invention, the aqueous medium used as biomass can utilize not only fresh water but also seawater, and can be stably and effectively utilized regardless of the depletion of water resources or the limits of cultivated land. be able to.
　製造された有機酸は、食品、医薬品、その他各種分野において有効に利用される。例えばコハク酸では医薬品の賦形剤、pH調整剤、食品として調味料、その他の食品添加物、工業的にはメッキ等にも利用される。また、炭酸ガスを発泡する入浴剤等の成分としても利用される。 The organic acid produced is effectively used in food, pharmaceuticals and other various fields. For example, succinic acid is used for pharmaceutical excipients, pH adjusters, seasonings as foods, other food additives, and industrially for plating. It is also used as a component such as a bathing agent that foams carbon dioxide gas.

Claims (23)

  1. 以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
    （Ａ）炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000mMの水性媒体中で微細藻を培養する工程；
    （Ｂ）前記（Ａ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。     The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (A) and (B):
    (A) a step of culturing microalgae in an aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM;
    (B) The process of collect | recovering the organic acid produced from the microalga of said (A).
  2. 炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000mMの水性媒体が、（１）二酸化炭素の充填、及び／又は、（２）炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか１種又は２種以上の炭酸塩の添加、による水性媒体である、請求項１に記載の製造方法。 An aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM is (1) filled with carbon dioxide and / or (2) sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, carbonate The manufacturing method of Claim 1 which is an aqueous medium by the addition of any 1 type, or 2 or more types of carbonates selected from magnesium.
  3. （１）二酸化炭素の充填、及び／又は、（２）炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか１種又は２種以上の炭酸塩の添加が、微細藻の培養の嫌気培養条件下で行われる、請求項２に記載の製造方法。 (1) Filling with carbon dioxide and / or (2) adding one or more carbonates selected from sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, The manufacturing method of Claim 2 performed under the anaerobic culture conditions of culture | cultivation of a micro algae.
  4. 二酸化炭素の充填が、水性媒体中で飽和状態になるまで行われる、請求項２又は３に記載の製造方法。 The production method according to claim 2 or 3, wherein filling with carbon dioxide is performed in an aqueous medium until saturation occurs.
  5. 前記微細藻がシアノバクテリア、ユーグレナ及びクラミドモナスから選択されるいずれか１種又は２種以上である、請求項１～４のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the microalgae is one or more selected from cyanobacteria, Euglena, and Chlamydomonas.
  6. シアノバクテリアが、シネコシスティスである、請求項５に記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to claim 5, wherein the cyanobacteria is Synechocystis.
  7. 前記有機酸が、脂肪族ジカルボン酸である、請求項１～６のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 1 to 6, wherein the organic acid is an aliphatic dicarboxylic acid.
  8. 前記有機酸が、コハク酸、乳酸、酢酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸から選択されるいずれか１種又は２種以上である、請求項１～６のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 7. The organic acid according to claim 1, wherein the organic acid is one or more selected from succinic acid, lactic acid, acetic acid, fumaric acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, and citric acid. Method for producing organic acid.
  9. 微細藻が、PEPカルボキシラーゼの機能が増強された微細藻である、請求項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 1 to 8, wherein the microalga is a microalga in which the function of PEP carboxylase is enhanced.
  10. 以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
    （ａ）PEPカルボキシラーゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
    （ｂ）前記（ａ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。     The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (a) and (b):
    (A) culturing a microalga with enhanced function of PEP carboxylase in an aqueous medium;
    (B) A step of recovering the organic acid produced from the microalga of (a).
  11. 微細藻が、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強された微細藻である、請求項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 1 to 8, wherein the microalga is a microalga in which the function of pyruvate ferredoxin oxidoreductase is enhanced.
  12. 以下の（ｃ）及び（ｄ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
    （ｃ）ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
    （ｄ）前記（ｃ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。     The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (c) and (d):
    (C) culturing a microalga with enhanced function of pyruvate ferredoxin oxidoreductase in an aqueous medium;
    (D) A step of recovering the organic acid produced from the microalga of (c).
  13. 微細藻が、ホスフォグルコムターゼの機能が増強された微細藻である、請求項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 1 to 8, wherein the microalga is a microalga in which the function of phosphoglucomutase is enhanced.
  14. 以下の（ｅ）及び（ｆ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
    （ｅ）ホスフォグルコムターゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
    （ｆ）前記（ｅ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。     The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (e) and (f):
    (E) culturing a microalga with enhanced function of phosphoglucomutase in an aqueous medium;
    (F) The process of collect | recovering the organic acid produced from the micro algae of said (e).
  15. 微細藻を炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの含有量が20～2000mMの水性媒体中で培養することを特徴とする、微細藻内のクエン酸回路の活性化方法。 A method for activating a citric acid cycle in a microalgae, comprising culturing the microalgae in an aqueous medium having a carbonate ion and / or bicarbonate ion content of 20 to 2000 mM.
  16. 微細藻が、NADPH-O2オキシドレダクターゼの発現又は発現増強するように形質転換された微細藻である、請求項１～８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 1 to 8, wherein the microalgae are microalgae transformed so as to express or enhance expression of NADPH-O 2 oxidoreductase.
  17. 以下の（Ｃ）及び（Ｄ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
    （Ｃ）NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
    （Ｄ）前記（Ｃ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。     The manufacturing method of the organic acid from a micro algae including the process of the following (C) and (D):
    (C) culturing a microalga with enhanced function of NADPH-O 2 oxidoreductase in an aqueous medium;
    (D) The process of collect | recovering the organic acids produced from the microalga of said (C).
  18. 以下の（ｇ）～（ｉ）の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法：
    （ｇ）NADPH-O2オキシドレダクターゼが発現又は発現増強するように微細藻を形質転換する工程；
    （ｈ）前記（ｇ）のNADPH-O2オキシドレダクターゼを発現又は発現増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程；
    （ｉ）前記（ｈ）の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。     A method for producing an organic acid from microalgae comprising the following steps (g) to (i):
    (G) transforming microalgae so that NADPH-O 2 oxidoreductase is expressed or enhanced;
    (H) culturing a microalga in which the NADPH-O 2 oxidoreductase of (g) is expressed or enhanced in an aqueous medium;
    (I) The process of collect | recovering the organic acid produced from the micro algae of said (h).
  19. 前記NADPH-O2オキシドレダクターゼが、フラボジアイロンタンパク質である、請求項１６～１８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to any one of claims 16 to 18, wherein the NADPH-O 2 oxidoreductase is a flavodi iron protein.
  20. 前記フラボジアイロンタンパク質がFlv3である、請求項１９に記載の有機酸の製造方法。 The method for producing an organic acid according to claim 19, wherein the flavodi iron protein is Flv3.
  21. PEPカルボキシラーゼ、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ホスフォグルコムターゼ、及びNADPH-O2オキシドレダクターゼから選択されるいずれか１種又は複数種のタンパク質が発現増強するように形質転換された、有機酸の製造用微細藻。 Production of an organic acid transformed to enhance expression of any one or more proteins selected from PEP carboxylase, pyruvate ferredoxin oxidoreductase, phosphoglucomutase, and NADPH-O 2 oxidoreductase Microalgae for use.
  22. 前記NADPH-O2オキシドレダクターゼがFlv3である、請求項２１に記載の有機酸の製造用微細藻。 The microalga for producing an organic acid according to claim 21, wherein the NADPH-O 2 oxidoreductase is Flv3.
  23. 前記微細藻がシアノバクテリアである、請求項２１又は２２の有機酸の製造用微細藻。 The microalgae for producing an organic acid according to claim 21 or 22, wherein the microalgae are cyanobacteria.
PCT/JP2016/061216 2015-04-08 2016-04-06 Method for producing organic acid WO2016163382A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017511006A JP6883330B2 (en) 2015-04-08 2016-04-06 Manufacturing method of organic acid

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-078889 2015-04-08
JP2015078889 2015-04-08
JP2015228518 2015-11-24
JP2015-228518 2015-11-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016163382A1 true WO2016163382A1 (en) 2016-10-13

Family

ID=57073101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/061216 WO2016163382A1 (en) 2015-04-08 2016-04-06 Method for producing organic acid

Country Status (2)

Country Link
JP (2) JP6883330B2 (en)
WO (1) WO2016163382A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016181902A1 (en) * 2015-05-08 2018-02-22 国立研究開発法人理化学研究所 Organic acid production method using Euglena

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010507369A (en) * 2006-10-20 2010-03-11 アリゾナ ボード オブ リージェンツ フォー アンド オン ビハーフ オブ アリゾナ ステイト ユニバーシティ Modified cyanobacteria
WO2012040698A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Montana State University Bicarbonate trigger for inducing lipid accumulation in algal systems
JP2015073469A (en) * 2013-10-08 2015-04-20 国立大学法人神戸大学 Method of enhancing growth function of microalgae

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010507369A (en) * 2006-10-20 2010-03-11 アリゾナ ボード オブ リージェンツ フォー アンド オン ビハーフ オブ アリゾナ ステイト ユニバーシティ Modified cyanobacteria
WO2012040698A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Montana State University Bicarbonate trigger for inducing lipid accumulation in algal systems
JP2015073469A (en) * 2013-10-08 2015-04-20 国立大学法人神戸大学 Method of enhancing growth function of microalgae

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGERMAYR S. A. ET AL.: "Exploring metabolic engineering design principles for the photosynthetic production of lactic acid by Synechocystis sp. PCC6803", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, vol. 7, no. 99, June 2014 (2014-06-01), pages 1 - 15, XP021191102 *
CHI Z. ET AL.: "Bicarbonate produced from carbon capture for algae culture", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 29, no. 11, November 2011 (2011-11-01), pages 537 - 541, XP028318598 *
CHI Z. ET AL.: "Bicarbonate-based integrated carbon capture and algae production system with alkalihalophilic cyanobacterium", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 133, 9 February 2013 (2013-02-09), pages 513 - 521, XP055319974 *
CHI Z. ET AL.: "Selection of microalgae and cyanobacteria strains for bicarbonate-based integrated carbon capture and algae production system", APPL BIOCHEM BIOTECHNOL., vol. 172, no. 1, 4 October 2013 (2013-10-04), pages 447 - 457, XP055319972 *
GUTEKUNST K. ET AL.: "The bidirectional NiFe- hydrogenase in Synechocystis sp. PCC6803 is reduced by flavodoxin and ferredoxin and is essential under mixotrophic, nitrate-limiting conditions", J BIOL CHEM., vol. 289, no. 4, 5 December 2013 (2013-12-05), pages 1930 - 1937, XP055319969 *
HASUNUMA T. ET AL.: "Overexpression of flv3 improves photosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 by enhancement of alternative electron flow", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, vol. 7, no. 493, 31 December 2014 (2014-12-31), pages 1 - 10, XP021210424 *
HOLLINSHEAD W. D. ET AL.: "Boosting D-lactate production in engineered cyanobacteria using sterilized anaerobic digestion effluents", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 169, pages 462 - 467, XP055272989 *
LIAN L. ET AL.: "Role of two phosphohexomutase genes in glycogen synthesis in Synechocystis sp. PCC6803", CHIN SCI BULL., vol. 58, no. 36, December 2013 (2013-12-01), pages 4616 - 4621, XP035323249 *
OSANAI T. ET AL.: "Genetic manipulation of a metabolic enzyme and a transcriptional regulator increasing succinate excretion from unicellular cyanobacterium", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 6, 6 October 2015 (2015-10-06), pages 1 - 10, XP055319980 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016181902A1 (en) * 2015-05-08 2018-02-22 国立研究開発法人理化学研究所 Organic acid production method using Euglena

Also Published As

Publication number Publication date
JP6883330B2 (en) 2021-06-09
JP7176787B2 (en) 2022-11-22
JPWO2016163382A1 (en) 2018-02-01
JP2021106614A (en) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hasunuma et al. Temperature enhanced succinate production concurrent with increased central metabolism turnover in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
Doebbe et al. Functional integration of the HUP1 hexose symporter gene into the genome of C. reinhardtii: impacts on biological H2 production
Hasunuma et al. Improved sugar-free succinate production by Synechocystis sp. PCC 6803 following identification of the limiting steps in glycogen catabolism
Chandra et al. Role of cultural variables in augmenting carbohydrate accumulation in the green microalga Scenedesmus acuminatus for bioethanol production
US9051575B2 (en) Alga in which production of photosynthetic products is improved, and use for said alga
JP2017099397A (en) Production of butanol and related higher alcohol with designer calvin circuit channel and hydrogenation
US9914947B2 (en) Biological production of organic compounds
Zhu et al. Efficient utilization of carbon to produce aromatic valencene in Saccharomyces cerevisiae using mannitol as the substrate
JP7176787B2 (en) Method for producing organic acid
US9309541B2 (en) Biological production of organic compounds
WO2018051916A1 (en) Method for producing organic acid
US9783581B2 (en) Method for producing plastic raw material from blue-green algae
JP2015073469A (en) Method of enhancing growth function of microalgae
CN109825441B (en) Method for improving carbon sequestration efficiency of microalgae, transgenic chlamydomonas and application
CN116355820A (en) Engineering strain for high yield of ergothioneine and method for producing ergothioneine by same
Fang Metabolic engineering and molecular biotechnology of microalgae for fuel production
JPWO2014142051A1 (en) Method for producing plastic raw materials and related substances in cyanobacteria
Tiwari et al. Algal photobiohydrogen production
WO2021162099A1 (en) Recombinant microalgae, and method for producing organic acid using microalgae
JP6778870B2 (en) Cyanobacteria mutant strain and succinic acid and D-lactic acid production method using it
JP7431426B2 (en) Organisms capable of assimilating L-lactic acid and resource circulation methods using them
CN114561417B (en) Corynebacterium glutamicum engineering strain for preparing psicose and application thereof
JP2021153524A (en) Methods for producing organic acids
CN116240118A (en) Recombinant strain for improving organic acid production level and fermentation strength, construction method and application thereof
Schäfer Improvement of Corynebacterium glutamicum for production of lysine and ectoine from industrial raw materials

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16776548

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017511006

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16776548

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1