WO2016140540A1 - 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균 동정 - Google Patents

뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균 동정 Download PDF

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    • C12Y301/13—Exoribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.13)

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying bacteria by analyzing nucleic acids of extracellular vesicles from which external nucleic acids have been removed by nuclease treatment.
  • Extracellular vesicles consist of spherical phospholipid bilayers with diameters of 20-200 nm, often called nanovesicles.
  • Gram-negative bacteria-derived extracellular vesicles contain LPS (lipopolysaccharide), toxic proteins, and DNA and RNA, which are bacterial nucleic acids.
  • Gram-positive bacteria-derived extracellular vesicles contain peptidoglycan and lipoteichoic acid, cell wall components.
  • extracellular vesicles thus represent the cells or bacteria from which their components are derived.
  • extracellular vesicles derived from pneumococci contain pneumococcal specific proteins and nucleic acids.
  • Ribosomal RNA on the other hand, is an RNA constituting ribosomes, and occupies about 80% of the RNA in the cell.
  • the rRNA consists of the same nucleotide sequence and different variable regions for each individual, and bacteria can be distinguished by analyzing different nucleotide sequences.
  • the sequence of 16S rRNA which makes up the small 30S ribosomal subunit of bacteria, consists of about 1500 bases, most of which are highly conserved, while exhibiting high diversity of sequences in some intervals. In other words, one of the very few changes among bacterial species has almost no sequence diversity, but high diversity among other species, 16S rRNA gene is most suitable for evolutionary phylogenetic analysis, and is widely used for bacterial identification.
  • extracellular vesicles represent the cells or bacteria from which they are derived, they contain nucleic acids such as bacterial DNA, rRNA and mRNA. Therefore, studies have been conducted to identify bacteria and diagnose infection by using nucleic acids present in extracellular vesicles.
  • nucleic acids present in extracellular vesicles are present not only inside and outside the extracellular vesicles, but because they are likely to be derived from dead bacteria of other species, their origin is unclear, so the location of nucleic acids is not considered. If used without diagnosis, the bacteria cannot be identified accurately and the accuracy of diagnosis of infectious diseases can be reduced.
  • the present inventors have found that a specific bacterium can be identified only by nucleic acid present in the extracellular vesicles when the extracellular vesicles are removed by treating the bacteria-derived extracellular vesicles with nucleases. By this, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a bacterial identification method using the nucleic acid of the nuclease-treated bacteria-derived extracellular vesicles.
  • the present invention comprises the steps of (a) separating the extracellular vesicles from the sample; (b) treating the extracellular vesicles with nucleases; (c) analyzing the nucleic acid using a bacterial species specific primer for the product treated with the nuclease; And (d) provides a method of identifying bacteria using the nuclease-treated bacteria-derived extracellular vesicles comprising the step of determining the presence of bacteria in accordance with the presence or absence of detection of the assay product.
  • the present invention comprises the steps of (a) treating a nuclease in a sample; (b) isolating extracellular vesicles from the nuclease-treated sample; (c) analyzing the nucleic acid using the bacterial species specific primer for the isolated extracellular vesicles; And (d) provides a method of identifying bacteria using the nuclease-treated bacteria-derived extracellular vesicles comprising the step of determining the presence of bacteria in accordance with the presence or absence of detection of the assay product.
  • the step of separating the extracellular vesicles is a method selected from the group consisting of continuous centrifugation, ultra-centrifugation, polymer-based precipitation, gel filtration, etc. It may include.
  • the method may further include separating and purifying the nucleic acid between the steps (b) and (c).
  • the sample may be a body fluid selected from the group consisting of blood, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, runny nose, and stool.
  • the sample may be an ambient environment selected from the group consisting of dust, tap water, sea water, soil, air, and rain water.
  • the sample may be a fermented food selected from the group consisting of beer, miso, soy sauce, kimchi, yogurt, and yogurt.
  • the nuclease is characterized in that the deoxyribonuclease (deoxyribonuclease) or ribonuclease (ribonuclease).
  • the ribonuclease is RNase A, RNase H, RNase I, RNase II, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V , RNase V1, Polynucleotide Phosphorylase, RNase PH, RNase R, RNase D, Oligoribonuclease, Exoribonuclease I, and Exoribonuclease II.
  • the nucleic acid may be 16S rDNA, 16S rRNA, DNA or mRNA.
  • the primer is bacterial species specific 16S rRNA, 16S rDNA; Or DNA or RNA for an antibiotic resistance gene or a pathogenic gene.
  • the nucleic acid assay is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR, real time RT-PCR, and fluorescence in situ hybridization (FISH). It may be carried out by a method selected from the group consisting of.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the method of the present invention by treating the bacteria-derived extracellular vesicles with nucleases to remove the nucleic acid outside the extracellular vesicles can increase the possibility of using the bacterial identification method using the extracellular vesicles, the accuracy of the bacterial identification method Can improve.
  • Figure 1 shows the specific 16S rRNA of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus species when the RNA of S. aureus was added to the P. aeruginosa- derived extracellular endoplasmic reticulum and treated with or without ribonuclease. PCR results using primers.
  • Figure 2a is the result of confirming the presence of ribosomal RNA of P. aeruginosa , Staphylococcus aureus (S. aureus ), and these bacteria-derived extracellular vesicles
  • Figure 2b P. aeruginosa through PCR , Staphylococcus aureus (S. aureus), these bacteria-derived extracellular vesicles, and mammalian cells (SW480, Colon26) bacteria common to the 16S rRNA, Pseudomonas (Pseudomonas) or staphylococcal species (Staphylococcus) species-specific 16S rRNA, and mammalian Results of identifying common 18S rRNA.
  • FIG. 3A to 3C show RNAs of extracellular vesicles derived from P. aeruginosa and S. aureus with or without ribonuclease treatment
  • FIG. 3A shows ribonuclease treatment. by the result it shows that the decrease in the amount of total RNA
  • Figure 3b the result shows the 16S rRNA and the reduction of the 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa by ribonuclease treatment
  • Figure 3c Pseudomonas (Pseudomonas) species or Staphylococcus PCR results confirm the presence of 16S rRNA of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus using Staphylococcus species-specific 16S rRNA primers.
  • Figures 4a to 4c is a plasmid of the common common 16S rRNA of P. aeruginosa- derived extracellular vesicles with or without ribonuclease treatment and the transcripts of acpP, aprA, katB, recN, and rpoD, which are P.
  • Figure 4a is a result showing the real-time PCR results Ct Value (cycles)
  • Figure 4b is a table showing the Ct Value (cycles)
  • Figure 4c Is a schematic representation of the location of the 16S rRNA and each of the transcripts outside and inside the extracellular vesicles.
  • Figures 5a to 5c shows the amount of mRNA that is the transcript of atlA and clfB which are bacteria common 16S rRNA and Staphylococcus aureus-specific genes of S. aureus- derived extracellular vesicles with or without ribonuclease treatment
  • FIG. 5A is a result showing real-time PCR result Ct Value (cycles)
  • FIG. 5B is a table showing Ct Value (cycles)
  • FIG. 5C is the above. 16S rRNA and each of the transcripts are shown schematically in the location of the outside and inside the extracellular vesicles.
  • Figure 6a and 6b Pseudomonas aeruginosa in mice (P. aeruginosa) cells derived from rat, and the outside of the ER-specific Pseudomonas (Pseudomonas) species in samples obtained from mice after revolving handle nuclease time ever 16S rRNA and mouse
  • Figure 6a is a blood sample
  • Figure 6b is a result of PCR using a urine sample.
  • the present invention provides a bacterial identification method using the nucleic acid of the bacteria-derived extracellular vesicles from which the external nucleic acid is removed by nuclease treatment.
  • Pseudomonas aeruginosa ) -derived extracellular endoplasmic reticulum was added to the total RNA of Staphylococcus aureus and then treated with ribonuclease (RNase) to the isolated Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles.
  • RNase ribonuclease
  • the endoplasmic reticulum was obtained to obtain all nucleic acids, and treated with deoxyribonuclease (DNase) to obtain only RNA, followed by PCR.
  • DNase deoxyribonuclease
  • RNA was decomposed by Staphylococcus aureus and was not identified by P. aeruginosa.
  • Pseudomonas species specific 16S rRNA to which it belongs was identified. Therefore, it was confirmed that specific bacteria can be identified through ribosomal RNA of extracellular vesicles in the presence of various bacteria (see Example
  • ribonuclease when ribonuclease was treated to Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles, it was confirmed that about 96-97% of the total RNA was removed.
  • 16S rRNA ribonuclease it was the small amount present inside the ER after the treatment, ribonuclease treatment by using the PCR Identification common 16S rRNA, Pseudomonas (Pseudomonas) or Staphylococcus aureus (Staphylococcus) species-specific 16S rRNA of the bacteria By removing most of the nucleic acid, it was confirmed that the bacteria can be identified through a small amount of nucleic acid inside the extracellular vesicles (see Example 3).
  • ribonuclease after treatment of ribonuclease to the extracellular vesicles of Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus, bursting the endoplasmic reticulum to obtain all nucleic acids, and then treated with deoxyribonuclease to obtain only RNA to perform real-time PCR The amount of gene transcripts specific for bacterial common 16S rRNA and Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus was confirmed.
  • the present invention comprises the steps of separating the extracellular vesicles from the sample; Treating the extracellular vesicles with nucleases; Analyzing the nucleic acid using the bacterial species specific primer for the product treated with the nuclease; And it provides a method for identifying bacteria using a nuclease-treated bacteria-derived extracellular vesicles comprising the step of determining the presence of bacteria in accordance with the detection of the analyte.
  • the present invention also provides a method of treating a nuclease in a sample; Separating extracellular vesicles from the nuclease-treated sample; Analyzing the nucleic acid on the isolated extracellular vesicles using a bacterial species specific primer; And it provides a method for identifying bacteria using a nuclease-treated bacteria-derived extracellular vesicles comprising the step of determining the presence of bacteria in accordance with the detection of the analyte.
  • the extracellular vesicles of the present invention are secreted from cells, and the inside and the outside are distinguished by a double lipid membrane, and have cell membrane lipids, cell membrane proteins, genes, and metabolites of the derived cells.
  • the extracellular vesicles may have a spherical shape and may have a diameter of 20 to 1000 nm, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid analysis step of the present invention may further comprise the step of separating and purifying the nucleic acid from the extracellular vesicles, the process of separating the nucleic acid from the extracellular vesicles is a method and principle for separating the gene from the existing cells or tissues Is the same, and the method of separating genes is not limited thereto.
  • the sample includes blood, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, runny nose, and stool from the body, and includes dust, tap water, sea water, soil, air, and rainwater. It may be derived from the environment or may be obtained from fermented foods such as beer, miso, soy sauce, kimchi, yogurt, and yoghurt, but is not limited thereto.
  • the method for separating extracellular vesicles from the sample of the present invention is performed through continuous centrifugation, ultracentrifugation, polymer-based precipitation, and gel filtration. It can be carried out, according to the existing method for separating extracellular vesicles, but is not limited thereto.
  • nuclease refers to an enzyme that catalyzes the hydrolysis of a nucleic acid into nucleotides, and in a broad sense, is involved in the hydrolysis of nucleotides or nucleosides. It also contains enzymes.
  • the nuclease of the present invention may be, but is not limited to, deoxyribonuclease (DNase) or ribonuclease (RNase).
  • nucleic acid is a genetic material of a living organism composed of a monomer, a nucleotide composed of a pentose sugar, a phosphate group, and a base, and typically includes DNA (deoxyribonucleic acid) and RNA (ribonucleic acid). do. More specifically, deoxyribonucleic acid including DNA includes DNA, mtDNA, cDNA, and the like, and ribonucleic acid including RNA includes RNA, mRNA, tRNA, rRNA, ncRNA, sgRNA, shRNA, siRNA, snRNA, miRNA, snoRNA, and LNA.
  • nucleic acid of the present invention may be, but is not limited to, 16S rDNA, 16S rRNA, DNA, and / or mRNA.
  • Nucleic acids used for analysis among the components of the extracellular vesicles are polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real time polymerase chain reaction (real) can be identified through time polymerase chain reaction (real time PCR), real time reverse transcription polymerase chain reaction (real time RT-PCR), and Fluorescence in situ hybridization (FISH). It is not limited thereto.
  • the primer for the polymerase chain reaction is bacterial species specific 16S rRNA, 16S rDNA; Or DNA or RNA for an antibiotic resistance gene or a pathogenic gene, but is not limited thereto.
  • Example 1 Bacterial origin in the presence of various bacteria Extracellular Endoplasmic reticulum Ribosomes Identification of specific bacteria through RNA
  • rRNA ribosome RNA
  • Pseudomonas aeruginosa was cultured and centrifuged to obtain supernatant, and then filtered through 0.45 ⁇ m and 0.22 ⁇ m filters in order to remove the cells in the culture medium, followed by adding Staphylococcus aureus RNA to the culture medium. Thereafter, the culture solution was separated by ultrafast centrifugation at 150,000 g at 4 ° C. for 3 hours to separate Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles.
  • the isolated Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles were treated with or without the RNA degrading ribonuclease (Ribonuclease; RNase) and incubated at 95 ° C. for 10 minutes to explode the vesicles to release all nucleic acids in and out of the extracellular vesicles. It was.
  • Deoxyribonuclease (DNase) treatment removes DNA from nucleic acids from extracellular vesicles and then inhibits DNase activity through DNase inhibitors, random primers, AMV reverse transcriptase, dNTP, A ribonuclease inhibitor (RNase inhibitor) was added and cDNA synthesis was performed.
  • DNase Deoxyribonuclease
  • Ribosomal RNA was identified from aeruginosa ), Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus , and extracellular vesicles isolated from the cultures of the two bacteria.
  • Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles were placed in a flask containing LB medium in an O.D. incubator in a 37 ° C incubator. After culturing until 600 measured value is 1.5, Pseudomonas aeruginosa cells were removed by centrifugation at 6,000 g for 20 minutes at 4 ° C. After passing the supernatant through a 0.45 ⁇ m filter to remove the remaining bacteria, using a filter having a 100 kD membrane (membrane) was isolated and concentrated only the cell culture having a size larger than 100 kD. The concentrated cell culture medium having a size larger than 100 kD was filtered through a 0.22 ⁇ m filter, followed by ultrafast centrifugation at 150,000 g at 4 ° C. for 3 hours to obtain extracellular vesicles.
  • a filter having a 100 kD membrane membrane
  • Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles were placed in a flask containing nutrient broth medium in an O.D. Cells were removed by centrifugation for 20 minutes at 10,000 g at 4 ° C. after incubation until 600 measurements reached 1.5. Subsequently, the same procedure as in the case of Pseudomonas aeruginosa was carried out to obtain an extracellular vesicle derived from Staphylococcus aureus.
  • RNA Separation Kit (MoBio) was used to separate RNA from cells and extracellular vesicles obtained from Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus. After lysis buffer containing ⁇ -mercaptoethanol was treated to individual cells and extracellular vesicles, chemical and physical disruption was performed using glass beads. After removing the glass bead by centrifugation, the supernatant obtained was treated in a column to which only RNA was bound. DNase was treated with RNA bound to the column to separate only the RNA from which DNA was finally removed.
  • miRNeasy RNA Isolation Kit QIAGEN
  • RNA from Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus cells and extracellular vesicles was analyzed using a Bioanalyzer 2100 instrument.
  • P. aeruginosa cells, P. aeruginosa EV ( P. aeruginosa EV), S. aureus cells ( S. aureus cells) and Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles ( S. aureus EV) was confirmed that the presence of both 16S rRNA and 23S rRNA.
  • RNA (1 ⁇ g) obtained from the Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus cells, each bacterial-derived extracellular vesicles, and mammalian cells CDNA synthesis was performed.
  • RNA was obtained and quantified from the extracellular vesicles treated with or without ribonuclease by the method of Example 2, and as shown in FIG. 3A, 96-97% of the total amount of RNA contained in the extracellular vesicles. Was confirmed to be removed by ribonuclease treatment.
  • FIG. 3B RNA was isolated from Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles treated with or without ribonuclease, and analyzed by Bioanalyzer 2100. As a result, most 16S rRNA and 23S rRNA were removed. It was confirmed that a small amount of 16S rRNA remained after ribonuclease treatment.
  • cDNA synthesis was carried out in the same manner as in Example 1 using RNA obtained from Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles with or without ribonuclease.
  • RNA obtained from Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles with or without ribonuclease.
  • RNA obtained from Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles with or without ribonuclease.
  • RNA obtained from Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles with or without ribonuclease.
  • Pseudomonas Pseudomonas species-specific 16S rRNA
  • each of the bacteria-derived extracellular vesicles (10 ⁇ g in proteins) was incubated at 95 ° C. for 10 minutes. The extracellular vesicles were expelled to release all nucleic acids present in and out of the extracellular vesicles. Thereafter, DNA was treated to remove DNA, followed by inhibition of DNase activity through DNase inhibitor treatment, and cDNA synthesis was performed in the same manner as in Example 1. Using the synthesized cDNA as a template, real-time PCR was performed on 16S rRNA and common Pseudomonas aeruginosa or Staphylococcus aureus-specific transcripts.
  • acpP gene encoding Acyl carrier protein (ACP) as a Pseudomonas aeruginosa specific gene, aprA gene encoding alkaline protease, katB gene encoding catalase, and DNA repair protein (DNA repair protein) RecN gene encoding RecN, and RNA polymerase sigma factor RNA polymerase sigma factor
  • ACP Acyl carrier protein
  • RecN DNA repair protein
  • the Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles had a threshold cycle (Ct) value of 16S rRNA followed by about 10 cycles by ribonuclease treatment, whereas transcripts (atlA and clfB) did not differ significantly in the cycle.
  • Ct threshold cycle
  • transcripts atlA and clfB are not affected by ribonuclease, and thus most of them are extracellular vesicles. It exists inside.
  • mice After injection of Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles into mice, blood and urine were obtained from the mice to treat ribonuclease, which confirmed the possibility of identification of Pseudomonas aeruginosa by identifying extracellular vesicle-derived ribosomal RNA and transcript.
  • mice C57BL / 6, male, 6-8 weeks were intraperitoneally injected with Pseudomonas aeruginosa-derived extracellular vesicles (10 ⁇ g in proteins) and blood and urine were obtained 0, 0.5, 2, 6, and 24 hours later. After treatment with ribonuclease in mouse blood and urine, PowerMicrobiome TM is not required for the separation of extracellular vesicles derived from bacteria.
  • RNA was isolated using RNA isolation kit (MoBio). CDNA synthesis was carried out according to the method of Example 1 using RNA (1 ⁇ g) obtained from mouse blood and urine. PCR was performed using the synthesized cDNA as a template to confirm the presence of Pseudomonas species specific 16S rRNA and mouse specific 18S rRNA.
  • Pseudomonas species-specific 16S rRNA in mouse blood begins to be identified from 0.5 hours and then shows a tendency to decrease to 24 hours, mouse specific 18S rRNA only in 0.5 hours I was identified.

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Abstract

본 발명은 뉴클레아제를 처리에 의해 외부의 핵산이 제거된 세포밖 소포체의 핵산을 이용하여 세균을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 세균 유래 세포밖 소포체에 뉴클레아제를 처리하여 세포밖 소포체 외부의 핵산을 제거함으로써 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법의 사용 가능성을 높일 수 있으며, 상기 세균 동정방법의 정확성을 향상시킬 수 있다.

Description

뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균 동정
본 발명은 뉴클레아제 처리에 의해 외부의 핵산이 제거된 세포밖 소포체의 핵산을 분석하여 세균을 동정하는 방법에 관한 것이다.
그람 음성균(Gram-negative bacteria) 및 그람 양성균(Gram-positive bacteria)은 세포간 정보교환을 위해 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 세포 밖 환경으로 분비한다. 세포밖 소포체는 20-200 nm의 직경을 가지는 구형의 인지질 이중층으로 구성되어 있으며, 흔히 나노소포체(nanovesicles)라고도 불린다. 그람 음성균 유래 세포밖 소포체는 LPS(lipopolysaccharide), 독성 단백질, 및 세균의 핵산(nucleic acids)인 DNA와 RNA 등을 가지고 있다. 그람 양성균 유래 세포밖 소포체는 독성 단백질 및 핵산 이외에 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 함유하고 있다. 또한, 핵산과 같이 세포 밖에서 불안정할 수 있는 물질들은 세포밖 소포체 내부에 싸여져서 분비됨으로써 세포 밖에서도 안정하게 존재할 수 있다. 따라서 세포밖 소포체는 그 구성 성분이 유래된 세포 또는 세균을 대변한다. 예를 들어, 폐렴구균에서 유래한 세포밖 소포체는 페렴구균 특이적 단백질 및 핵산을 포함하고 있다.
한편, 리보좀 RNA(ribosomal RNA; rRNA)는 리보좀을 구성하는 RNA로서, 세포 내 RNA의 약 80%를 차지한다. rRNA는 각 개체별로 동일한 염기 서열 부분과 상이한 염기 서열 부분(variable region)으로 이루어져 있으며, 상이한 염기서열 부분을 분석하여 세균을 구분할 수 있다. 예를 들면, 세균의 작은 30S 리보좀 소단위체를 구성하는 16S rRNA의 서열은 약 1500개의 염기로 구성되어 있으며, 대부분 상당히 보존되어있는 한편, 일부 구간에서는 높은 염기서열의 다양성을 나타낸다. 즉, 세균 종간에는 변화가 매우 적은 부위 중의 하나로 서열의 다양성이 거의 없는 반면 타종 간에는 다양성이 높게 나타나므로 16S rRNA 유전자는 진화론적 계통 분석에 가장 적합하며, 세균 동정에 많이 사용되고 있다.
세포밖 소포체는 유래된 세포 또는 세균을 대변하고 있기 때문에, 세균의 DNA, rRNA 및 mRNA 등의 핵산을 포함하고 있다. 따라서 세포밖 소포체에 존재하는 핵산을 이용하여 세균을 동정하고 감염 여부를 진단하고자 하는 연구들이 수행되고 있다. 하지만 세포밖 소포체에 존재하는 핵산은 세포밖 소포체의 내부뿐만 아니라 외부에도 존재하며, 외부에 존재하는 핵산은 다른 종의 죽은 세균에서 유래될 가능성이 있어 그 유래가 불분명하기 때문에 핵산의 위치를 고려하지 않고 진단에 사용할 경우, 세균을 정확하게 동정할 수 없으며, 감염질환 진단의 정확성을 떨어뜨릴 수 있다.
그러나 아직까지 세포밖 소포체 내부와 외부에 존재하는 핵산을 구분하여 진단에 사용한 경우는 없다.
본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여 세균 유래 세포밖 소포체에 뉴클레아제를 처리하여 세포밖 외부의 핵산을 제거하였을 때 세포밖 소포체에 존재하는 핵산만으로 특정 세균의 동정이 가능함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체의 핵산을 이용한 세균 동정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 세포밖 소포체에 뉴클레아제를 처리하는 단계; (c) 상기 뉴클레아제가 처리된 산물에 대하여 세균 종 특이적인 프라이머를 이용하여 핵산을 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석 산물의 검출 유무에 따라 세균의 존재 여부를 판정하는 단계를 포함하는, 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 샘플에 뉴클레아제를 처리하는 단계; (b) 상기 뉴클레아제가 처리된 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 세포밖 소포체에 대하여 세균 종 특이적인 프라이머를 이용하여 핵산을 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석 산물의 검출 유무에 따라 세균의 존재 여부를 판정하는 단계를 포함하는, 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 세포밖 소포체를 분리하는 단계는 연속적인 원심분리, 초고속원심분리, 폴리머를 이용한 침전법(polymer-based precipitation), 및 겔 여과법 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b) 및 (c) 단계 사이에 핵산을 분리 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 샘플은 혈액, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 콧물, 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 샘플은 먼지, 수돗물, 바닷물, 흙, 공기, 및 빗물로 이루어진 군으로부터 선택되는 주변 환경일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 샘플은 맥주, 된장, 간장, 김치, 요구르트, 및 요거트로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효식품일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 뉴클레아제는 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease) 또는 리보뉴클레아제(ribonuclease)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 리보뉴클레아제는 RNase A, RNase H, RNase I, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V, RNase V1, Polynucleotide Phosphorylase, RNase PH, RNase R, RNase D, Oligoribonuclease, Exoribonuclease I, 및 Exoribonuclease Ⅱ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 16S rDNA, 16S rRNA, DNA 또는 mRNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프라이머는 세균 종 특이적인 16S rRNA, 16S rDNA; 또는 항생제 내성 유전자 또는 병원성 유전자에 대한 DNA 또는 RNA를 타겟으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산 분석은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), real-time PCR, real time RT-PCR, 및 FISH(fluorescence in situ hybridization)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 세균 유래 세포밖 소포체에 뉴클레아제를 처리하여 세포밖 소포체 외부의 핵산을 제거함으로써 세포밖 소포체를 이용한 세균 동정방법의 사용 가능성을 높일 수 있으며, 상기 세균 동정방법의 정확성을 향상시킬 수 있다.
도 1은, 녹농균(P. aeruginosa) 유래 세포밖 소포체 분리과정에서 황색포도상구균(S. aureus)의 RNA를 넣고 리보뉴클레아제를 처리하거나 처리하지 않았을 때 녹농균과 황색포도상구균 종 특이적 16S rRNA의 프라이머를 이용한 PCR 수행 결과이다.
도 2a는, 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도상구균(S. aureus), 및 이들 세균 유래 세포밖 소포체의 리보좀 RNA의 존재를 확인한 결과이며, 도 2b는, PCR을 통하여 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도상구균(S. aureus), 이들 세균 유래 세포밖 소포체, 및 포유류 세포(SW480, Colon26)에서 세균 공통 16S rRNA, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 또는 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적 16S rRNA, 및 포유류 공통적 18S rRNA를 확인한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는, 리보뉴클레아제 처리 유무에 따른 녹농균(P. aeruginosa)과 황색포도상구균(S. aureus) 유래 세포밖 소포체의 RNA를 확인한 결과로써, 도 3a는, 리보뉴클레아제 처리에 의해 전체 RNA의 양이 감소함을 보여주는 결과이고, 도 3b는, 리보뉴클레아제 처리에 의한 녹농균의 16S rRNA와 23S rRNA의 감소를 보여주는 결과이며, 도 3c는, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 또는 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적 16S rRNA 프라이머를 사용하여 녹농균과 황색포도상구균의 16S rRNA의 존재를 PCR로 확인한 결과이다.
도 4a 내지 도 4c는, 리보뉴클레아제 처리 유무에 따른 녹농균(P. aeruginosa) 유래 세포밖 소포체의 세균 공통적 16S rRNA와 녹농균 특이적 유전자인 acpP, aprA, katB, recN, 그리고 rpoD의 전사체인 mRNA의 양을 실시간 PCR(Real-time PCR)을 통해 확인한 결과로서, 도 4a는, 실시간 PCR 결과 Ct Value(cycles)를 보여주는 결과이고, 도 4b는, Ct Value(cycles)를 표로 나타낸 것이며, 도 4c는, 상기 16S rRNA와 각 전사체들이 세포밖 소포체의 외부와 내부에 존재하는 위치를 모식도로 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는, 리보뉴클레아제 처리 유무에 따른 황색포도상구균(S. aureus) 유래 세포밖 소포체의 세균 공통적 16S rRNA와 황색포도상구균 특이적 유전자인 atlA 및 clfB의 전사체인 mRNA의 양을 실시간 PCR(Real-time PCR)을 통해 확인한 결과로서, 도 5a는, 실시간 PCR 결과 Ct Value(cycles)를 보여주는 결과이고, 도 5b는, Ct Value(cycles)를 표로 나타낸 것이며, 도 5c는, 상기 16S rRNA와 각 전사체들이 세포밖 소포체의 외부와 내부에 존재하는 위치를 모식도로 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는, 마우스에 녹농균(P. aeruginosa) 유래 세포밖 소포체를 복강 투여하고 마우스에서 샘플을 얻어 리보뉴클레아제를 처리한 후 시간별로 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적 16S rRNA와 마우스의 18S rRNA의 존재를 PCR을 통해 확인한 결과로서, 도 6a는 혈액 샘플, 도 6b는 소변 샘플을 이용해 PCR을 수행한 결과이다.
본 발명은 뉴클레아제 처리에 의해 외부의 핵산이 제거된 세균 유래 세포밖 소포체의 핵산을 이용한 세균 동정방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래 세포밖 소포체 분리과정에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 전체 RNA를 넣어준 후 분리된 녹농균 유래 세포밖 소포체에 리보뉴클레아제(ribonuclease; RNase)를 처리하였다. 소포체를 터트려 모든 핵산을 얻고 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease; DNase)를 처리하여 RNA만을 얻은 후 PCR을 수행한 결과, 리보뉴클레아제 처리에 의해 황색포도상구균 유래 RNA는 분해되어 동정되지 않았으며, 녹농균이 속하는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA는 동정되었다. 따라서 다양한 세균이 존재하는 상황에서 세포밖 소포체의 리보좀 RNA를 통해 특정세균을 동정할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 녹농균과 황색포도상구균 세포 및 상기 세균들 유래 세포밖 소포체로부터 모두 세균의 공통적인 16S rRNA와 23S rRNA가 존재함을 확인하였다. 또한, 인간 및 마우스 유래 포유동물세포(SW480, Colon26)에서 각각 RNA를 분리하여 상기 세균 및 세균 유래 세포밖 소포체와 함께 PCR을 수행한 결과, 녹농균과 황색포도상구균 세포 및 이들 세균 유래 세포밖 소포체에서 세균의 공통적인 16S rRNA를 확인하였고, 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적 프라이머를 이용한 경우 각각 녹농균과 황색포도상구균이 동정되었다. 포유류 세포에서는 포유류의 공통적인 18S rRNA만이 동정됨을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 녹농균 또는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 리보뉴클레아제를 처리한 경우 전체 RNA의 약 96-97%가 제거된 것을 확인하였다. 하지만 16S rRNA의 경우 리보뉴클레아제 처리 후에도 소포체 내부에 소량 존재하였으며, PCR을 통해 세균의 공통적 16S rRNA, 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적 16S rRNA를 동정함으로써 리보뉴클레아제 처리에 의해 대부분의 핵산이 제거되나, 세포밖 소포체 내부의 소량의 핵산을 통해 세균의 동정이 가능함을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 녹농균 또는 황색포도상구균의 세포밖 소포체에 리보뉴클레아제를 처리한 후 소포체를 터트려 모든 핵산을 얻은 후 디옥시리보뉴클레아제를 처리하여 RNA만을 얻어 실시간 PCR을 수행하여 세균 공통적인 16S rRNA와 녹농균 또는 황색포도상구균에 특이적인 유전자 전사체의 양을 확인하였다. 상기 두 가지 세균의 경우 모두 세균의 공통적인 16S rRNA는 세포밖 소포체 내부에 소량 남아있음을 확인하였으며, 각 세균에 특이적인 유전자의 전사체들은 대부분 소포체 내부에 존재하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스에 녹농균 유래 세포밖 소포체를 복강으로 주입한 후 혈액과 소변을 얻어 리보뉴클레아제를 처리한 결과, PCR을 통해 혈액과 소변에서 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA를 확인함으로써 녹농균을 동정하였다(실시예 5 참조).
본 발명은 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 단계; 상기 세포밖 소포체에 뉴클레아제를 처리하는 단계; 상기 뉴클레아제가 처리된 산물에 대하여 세균 종 특이적인 프라이머를 이용하여 핵산을 분석하는 단계; 및 상기 분석 산물의 검출 유무에 따라 세균의 존재 여부를 판정하는 단계를 포함하는 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 샘플에 뉴클레아제를 처리하는 단계; 상기 뉴클레아제가 처리된 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포밖 소포체에 대하여 세균 종 특이적인 프라이머를 이용하여 핵산을 분석하는 단계; 및 상기 분석 산물의 검출 유무에 따라 세균의 존재 여부를 판정하는 단계를 포함하는 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법을 제공한다.
본 발명의 상기 세포밖 소포체는 세포에서 분비되고, 이중 지질막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 유래한 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 유전자, 및 대사물등을 가지고 있다. 또한, 상기 세포밖 소포체는 구형의 형태를 가지며 직경이 20 내지 1000 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 핵산 분석 이전 단계에서는 세포밖 소포체로부터 핵산을 분리 정제하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 세포밖 소포체로부터 핵산을 분리하는 과정은 기존에 세포나 조직에서 유전자를 분리하는 방법과 원리는 동일하며, 유전자를 분리하는 방법이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 샘플은 혈액, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 콧물, 및 대변 등 체내 유래를 포함하며, 먼지, 수돗물, 바닷물, 흙, 공기, 및 빗물 등의 주변 환경 유래, 또는 맥주, 된장, 간장, 김치, 요구르트, 및 요거트 등 발효 식품에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법은 연속적인 원심분리(centrifugation), 초고속원심분리(ultracentrifugation), 폴리머를 이용한 침전법(polymer-based precipitation), 및 겔 여과법(gel filtration)을 통해 수행될 수 있으며, 기존에 세포밖 소포체를 분리하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “뉴클레아제”는 핵산을 뉴클레오티드(nucleotide)로 가수분해할 때 촉매작용을 하는 효소를 의미하며, 넓은 의미로는 뉴클레오티드나 뉴클레오시드(nucleoside)의 가수분해에 관여하는 효소도 포함한다. 본 발명의 상기 뉴클레아제는 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease; DNase) 또는 리보뉴클레아제(ribonuclease; RNase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 리보뉴클레아제는 RNase A, RNase H, RNase I, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V, RNase V1, Polynucleotide Phosphorylase, RNase PH, RNase R, RNase D, Oligoribonuclease, Exoribonuclease I, 및 Exoribonuclease Ⅱ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “핵산”은 오탄당, 인산기, 염기로 구성된 뉴클레오티드(nucleotide)인 모노머(monomer)로 구성된 생명체의 유전물질로서, 대표적으로 DNA(deoxyribonucleic acid)와 RNA(ribonucleic acid)를 포함한다. 보다 구체적으로 DNA를 포함하는 디옥시리보핵산은 DNA, mtDNA, 및 cDNA 등이 있고, RNA를 포함하는 리보핵산은 RNA, mRNA, tRNA, rRNA, ncRNA, sgRNA, shRNA, siRNA, snRNA, miRNA, snoRNA 및 LNA 등이 있으며, 그밖에 핵산 유사체인 GNA, PNA, TNA, 및 모폴리노(morpholino) 등을 포함한다. 본 발명의 상기 핵산은 16S rDNA, 16S rRNA, DNA, 및/또는 mRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포밖 소포체의 구성 성분 중에서 분석에 사용되는 핵산은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 역전사중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction; real time PCR), 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real time reverse transcription polymerase chain reaction; real time RT-PCR), 및 제자리형광잡종화(Fluorescence in situ hybridization; FISH) 등을 통해 확인될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 중합효소연쇄반응을 위한 프라이머는 세균 종 특이적인 16S rRNA, 16S rDNA; 또는 항생제 내성 유전자 또는 병원성 유전자에 대한 DNA 또는 RNA를 타겟으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 다양한 세균 존재하에서 세균 유래 세포밖 소포체의 리보좀 RNA를 통한 특정 세균의 동정
다양한 세균이 존재하는 상황에서 특정 세균을 동정하기 위한 방법으로서, 세균 유래 세포밖 소포체 안에 존재하는 리보좀 RNA(ribosomal RNA; rRNA)를 이용하여 세균을 동정하고자 하였다.
구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 키운 배양액을 원심분리하고, 상층액을 얻어 0.45 ㎛와 0.22 ㎛ 필터에 차례로 걸러 배양액 내의 세포를 제거한 후 배양액에 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 RNA를 넣어주었다. 이후 상기 배양액을 4℃에서 150,000 g로 3시간 동안 초고속원심분리하여 배양액으로부터 녹농균 유래 세포밖 소포체를 분리하였다. 분리한 녹농균 유래 세포밖 소포체에 RNA 분해효소인 리보뉴클레아제(Ribonuclease; RNase)를 처리하거나 처리하지 않고 95℃에서 10분 동안 배양하여 소포체를 터트려 세포밖 소포체 안과 밖에 존재하는 모든 핵산이 나오도록 하였다. 디옥시리보뉴클레아제(Deoxyribonuclease; DNase)를 처리하여 세포밖 소포체로부터 나온 핵산에서 DNA를 제거한 후 DNase 억제제를 통해 DNase 활성을 저해하고, 랜덤 프라이머(random primer), AMV 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP, 리보뉴클레아제 억제제(RNase inhibitor)를 넣고 cDNA 합성을 수행하였다. 이후 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA와 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적인 16S rRNA의 존재 여부를 PCR을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 리보뉴클레아제를 처리하지 않은 녹농균 유래 세포밖 소포체에서는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA와 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적인 16S rRNA가 모두 동정되었다. 반면에 리보뉴클레아제를 처리한 녹농균 유래 세포밖 소포체에서는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA만이 동정되었다. 따라서 리보뉴클레아제 처리를 통해 배양액에 넣어준 포도상구균의 RNA가 분해되어 동정되지 않았음을 확인하였다.
실시예 2. 세균 유래 세포밖 소포체에서 리보좀 RNA 존재 확인
세균 유래 세포밖 소포체에 리보좀 RNA가 존재하는지 확인하기 위해 그람 음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 그람 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 및 상기 두 가지 세균의 배양액에서 분리한 세포밖 소포체에서 리보좀 RNA를 확인하였다.
녹농균 유래 세포밖 소포체는 녹농균을 LB 배지가 들어있는 플라스크에 넣고 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 O.D. 600 측정값이 1.5가 될 때까지 배양한 후 4℃에서 6,000 g로 20분 동안 원심분리를 수행하여 녹농균 세포를 제거하였다. 상층액을 0.45 ㎛ 필터로 통과시켜 남아있는 세균을 제거한 뒤에 100 kD 멤브레인(membrane)을 가지는 필터를 이용하여 100 kD보다 큰 사이즈를 가지는 세포 배양액만을 분리하여 농축하였다. 100 kD보다 큰 사이즈를 가지는 농축된 세포 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 거른 후 4℃에서 150,000 g로 3시간 동안 초고속원심분리를 수행하여 세포밖 소포체를 얻었다.
황색포도상구균 유래 세포밖 소포체는 황색포도상구균을 nutrient broth 배지가 들어있는 플라스크에 넣고 37℃ 인큐베이터에서 O.D. 600 측정값이 1.5가 될 때까지 배양한 후 4℃에서 10,000 g로 20분 동안 원심분리를 수행하여 세포를 제거하였다. 이후 과정은 상기 녹농균의 경우와 동일하게 수행하여 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체를 얻었다.
녹농균 또는 황색포도상구균에서 얻은 세포와 세포밖 소포체로부터 RNA를 분리하기 위해 PowerMicrobiomeTM RNA 분리 키트(MoBio)를 이용하였다. β-mercaptoethanol을 포함하는 lysis buffer를 각각의 세포와 세포밖 소포체에 처리한 뒤에 glass bead를 이용하여 화학적 그리고 물리적인 파쇄를 수행하였다. 원심분리를 통해 glass bead를 제거한 후 얻은 상층액을 RNA만이 결합하는 컬럼(column)에 처리하였다. 컬럼에 RNA가 결합한 상태에서 DNase를 처리하여 최종적으로 DNA가 제거된 RNA만을 분리하였다.
또한, 세균 또는 세균 유래 세포밖 소포체에서 분리한 RNA와 비교하기 위하여 포유동물의 세포에서 RNA를 분리하였다. 인간 유래 세포의 경우 SW480 세포에서, 마우스 유래 세포의 경우 Colon26 세포에서 miRNeasy RNA 분리 키트(QIAGEN)를 이용하여 RNA 추출을 수행하였다. 각각의 세포에 TRIzol 용액을 처리하고 5분 동안 배양한 뒤에 클로로포름(chloroform)을 처리하여 aqueous phase를 얻었다. Aquenous phase를 100% 에탄올과 섞은 뒤에 RNA만 결합하는 컬럼에 처리하였다. 컬럼에 RNA가 결합한 상태에서 DNase를 처리하여 최종적으로 DNA가 제거된 RNA만을 분리하였다.
녹농균 및 황색포도상구균 세포와 세포밖 소포체에서 얻은 RNA를 Bioanalyzer 2100 장비를 이용하여 전체 RNA를 분석하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 녹농균 세포(P. aeruginosa cell)와 녹농균 유래 세포밖 소포체(P. aeruginosa EV), 황색포도상구균 세포(S. aureus cell)와 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV) 모두 16S rRNA와 23S rRNA가 존재함을 확인하였다.
상기 결과에 더하여 PCR을 통해 리보좀 RNA의 존재를 확인하기 위해 상기 녹농균과 황색포도상구균 세포 및 각 세균 유래 세포밖 소포체, 그리고 포유류 세포에서 얻은 RNA(1 ㎍)를 이용하여 실시예 1의 방법과 동일하게 cDNA 합성을 수행하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여 세균 공통적인 16S rRNA, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA, 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적인 16S rRNA, 그리고 포유류 공통적인 18S rRNA를 증폭시키기 위한 각각의 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 녹농균 및 황색포도상구균 세포와 세포밖 소포체는 모두 세균의 공통적인 16S rRNA가 존재하는 반면에 포유동물세포에는 세균 공통적인 16S rRNA는 존재하지 않았다. 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA는 녹농균 유래 세포와 세포밖 소포체에서만 동정되었으며, 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적인 16S rRNA는 황색포도상구균 유래 세포와 세포밖 소포체에서만 동정되는 종 특이적인 특성을 보였다. 반면에 포유류 공통적인 18S rRNA는 포유동물세포에서는 동정되었으나, 세균 유래 세포와 세포밖 소포체에서는 모두 동정되지 않았다.
실시예 3. 리보뉴클레아제 처리 후 세균 유래 세포밖 소포체의 리보좀 RNA 존재 확인
상기 실시예 2의 방법으로 얻은 녹농균 또는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 리보뉴클레아제 1 ㎍/㎖을 37℃에서 10분 동안 처리한 후 리보뉴클레아제 억제제를 처리하고 4℃에서 150,000 g로 3시간 동안 초고속원심분리를 수행하여 리보뉴클레아제가 처리된 세포밖 소포체를 다시 얻었다.
리보뉴클레아제를 처리하거나 또는 처리하지 않은 세포밖 소포체에서 실시예 2의 방법으로 각각 RNA를 얻어 정량한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 세포밖 소포체가 가지고 있는 전체 RNA 양의 96-97%가 리보뉴클레아제 처리에 의해 제거됨을 확인하였다. 또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 리보뉴클레아제를 처리하거나 또는 처리하지 않은 녹농균 유래 세포밖 소포체에서 RNA를 분리하여 Bioanalyzer 2100 장비로 분석한 결과, 대부분의 16S rRNA와 23S rRNA가 제거되었으나, 여전히 소량의 16S rRNA가 리보뉴클레아제 처리 후에도 남아있음을 확인하였다.
또한, 리보뉴클레아제를 처리하거나 처리하지 않은 녹농균 또는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에서 얻은 RNA(1 ㎍)를 이용하여 실시예 1의 방법과 동일하게 cDNA 합성을 수행하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA 또는 포도상구균(Staphylococcus) 종 특이적인 16S rRNA의 존재 여부를 PCR을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 리보뉴클레아제를 처리하면 대부분의 16S rRNA가 제거되어 처리 전에 존재하는 16S rRNA에 비해 소량 존재함을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 녹농균 또는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 존재하는 16S rRNA는 대부분이 소포체 밖에 존재하여 리보뉴클레아제 처리에 의해 제거되나, 여전히 소포체 안에 소량의 16S rRNA가 존재하며 이들은 각각의 종 특이적인 프라이머에 의해 PCR을 통해 증폭 가능함을 확인하였다.
실시예 4. 리보뉴클레아제 처리 후 세포밖 소포체 내부에 존재하는 리보좀 RNA와 전사체 확인
실시예 3의 방법으로 녹농균 또는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 리보뉴클레아제를 처리하거나 처리하지 않은 후 상기 각각의 세균 유래 세포밖 소포체(10 ㎍ in proteins)를 95℃에서 10분 동안 배양하여 세포밖 소포체를 터트려 세포밖 소포체 안과 밖에 존재하는 모든 핵산이 나오도록 하였다. 이후 DNase를 처리하여 DNA를 제거한 뒤에 DNase 억제제 처리를 통해 DNase 활성을 저해한 후 실시예 1의 방법과 동일하게 cDNA 합성을 수행하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여 세균 공통적인 16S rRNA와 녹농균 또는 황색포도상구균 특이적인 전사체에 대한 실시간 PCR(Real-time PCR)을 수행하여 각 RNA 양의 변화를 확인하였다.
녹농균의 경우, 녹농균 특이적인 유전자로써 아실 캐리어 단백질(Acyl carrier protein; ACP)을 암호화하는 acpP 유전자, 알칼라인 프로테아제(Alkaline protease)를 암호화하는 aprA 유전자, 카탈라아제(Catalase)를 암호화하는 katB 유전자, DNA 리페어 단백질(DNA repair protein) RecN을 암호화하는 recN 유전자, 및 RNA 폴리머레이즈 시그마 팩터(RNA polymerase sigma factor) RpoD를 암호화하는 rpoD 유전자의 각 전사체 즉, 각 유전자의 전사를 통해 생성된 mRNA 양을 확인하였다.
그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 녹농균 유래 세포밖 소포체는 리보뉴클레아제 처리에 의해 16S rRNA는 Ct(threshold cycle) 값이 15 cycles 정도 뒤에 나오는 반면, 전사체(acpP, aprA, katB, recN, 그리고 rpoD)는 차이가 없거나 대부분 5 cycles 정도 뒤에 값이 나왔다. 상기 결과는 도 4c에 나타낸 바와 같이, 대부분의 16S rRNA는 바깥쪽에 존재하나 일부는 여전히 세포밖 소포체의 안쪽에 존재하고, 전사체 중 aprA는 리보뉴클레아제 영향을 받지 않았으므로 모두 세포밖 소포체 안쪽에 존재하며, acpP, katB, recN, 그리고 rpoD는 대부분 세포밖 소포체 안쪽에 존재하나 일부는 바깥쪽에 존재함을 의미한다.
황색포도상구균의 경우에는 황색포도상구균 특이적인 유전자로써 가수분해효소인 AtlA를 암호화하는 atlA 유전자와 clumping factor B(ClfB)를 암호화하는 clfB 유전자의 각 전사체 즉, mRNA의 양을 확인하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체는 리보뉴클레아제 처리에 의해 16S rRNA의 Ct(threshold cycle) 값이 10 cycles 정도 뒤에 나오는 반면, 전사체(atlA 그리고 clfB)는 cycle에 큰 차이가 없었다. 상기 결과는 도 5c에 나타낸 바와 같이, 대부분의 세균 공통적인 16S rRNA는 바깥쪽에 존재하나 일부는 여전히 안쪽에 존재하며, 전사체인 atlA와 clfB는 리보뉴클레아제 영향을 받지 않았으므로 대부분이 세포밖 소포체 안쪽에 존재함을 의미한다.
실시예 5. 마우스 동물모델에서 혈액과 소변에 존재하는 세포밖 소포체 유래 리보좀 RNA와 전사체 확인
마우스에 녹농균 유래 세포밖 소포체를 주입한 후 마우스의 혈액과 소변을 얻어 리보뉴클레아제를 처리하였을 때 세포밖 소포체 유래 리보좀 RNA와 전사체 확인을 통해 녹농균의 동정이 가능한지 검증하였다.
마우스(C57BL/6, male, 6-8주)에 녹농균 유래 세포밖 소포체(10 ㎍ in proteins)를 복강 주입하고 0, 0.5, 2, 6, 그리고 24시간 뒤에 혈액과 소변을 얻었다. 마우스 혈액과 소변에 리보뉴클레아제를 처리한 후, 별도의 세균 유래 세포밖 소포체의 분리 과정 없이 PowerMicrobiomeTM RNA 분리 키트(MoBio)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 마우스 혈액과 소변에서 얻은 RNA(1 ㎍)를 이용하여 실시예 1의 방법에 따라 cDNA 합성을 수행하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하여 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA 그리고 마우스 특이적인 18S rRNA의 존재 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 마우스 혈액에서 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA는 0.5시간부터 동정되기 시작하며 이후 24시간으로 갈수록 감소하는 경향성을 보이며, 마우스 특이적인 18S rRNA는 0.5시간에서만 동정되었다.
또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 마우스 소변에서는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 특이적인 16S rRNA는 2시간부터 동정되기 시작하며 이후 24시간으로 갈수록 감소하는 경향성을 보이며, 18S rRNA는 동정되지 않았다.
상기 결과를 통해 마우스 혈액과 소변에 존재하는 복강 주입한 녹농균 유래 세포밖 소포체의 바깥쪽에 존재하는 핵산, 특히 리보좀 RNA가 리보뉴클레아제 처리에 의해 전부 제거되어도 세포밖 소포체 안쪽에 존재하는 리보좀 RNA에 의해 녹농균 동정이 가능함을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법:
    (a) 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 단계;
    (b) 상기 세포밖 소포체에 뉴클레아제를 처리하는 단계;
    (c) 상기 뉴클레아제가 처리된 산물에 대하여 세균 종 특이적인 프라이머를 이용하여 핵산을 분석하는 단계; 및
    (d) 상기 분석 산물의 검출 유무에 따라 세균의 존재 여부를 판정하는 단계.
  2. 하기의 단계를 포함하는, 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균의 동정방법:
    (a) 샘플에 뉴클레아제를 처리하는 단계;
    (b) 상기 뉴클레아제가 처리된 샘플에서 세포밖 소포체를 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리된 세포밖 소포체에 대하여 세균 종 특이적인 프라이머를 이용하여 핵산을 분석하는 단계; 및
    (d) 상기 분석 산물의 검출 유무에 따라 세균의 존재 여부를 판정하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체를 분리하는 단계는 연속적인 원심분리, 초고속원심분리, 폴리머를 이용한 침전법(polymer-based precipitation), 및 겔 여과법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 (b) 및 (c) 단계 사이에 핵산을 분리 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 샘플은 혈액, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 콧물, 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 샘플은 먼지, 수돗물, 바닷물, 흙, 공기, 및 빗물로 이루어진 군으로부터 선택되는 주변 환경인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 샘플은 맥주, 된장, 간장, 김치, 요구르트, 및 요거트로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효식품인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 뉴클레아제는 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease) 또는 리보뉴클레아제(ribonuclease)인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 리보뉴클레아제는 RNase A, RNase H, RNase I, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V, RNase V1, Polynucleotide Phosphorylase, RNase PH, RNase R, RNase D, Oligoribonuclease, Exoribonuclease I, 및 Exoribonuclease Ⅱ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산은 16S rDNA, 16S rRNA, DNA, 또는 mRNA인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 프라이머는 세균 종 특이적인 16S rRNA, 16S rDNA; 또는 항생제 내성 유전자 또는 병원성 유전자에 대한 DNA 또는 RNA를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 핵산 분석은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), real time PCR, real- time RT-PCR, 및 FISH(fluorescence in situ hybridization)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
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