WO2016139771A1 - 糖類の製造方法、エタノールの製造方法 - Google Patents

糖類の製造方法、エタノールの製造方法 Download PDF

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祥平 沖野
真実 池應
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a saccharide production method for producing saccharides from biomass, and an ethanol production method for producing ethanol from saccharides obtained from biomass.
  • pre-treated biomass When pre-treated biomass is enzymatically saccharified to produce a sugar solution containing glucose as the main component, or when a pre-treated biomass is added together with a degrading enzyme and a fermentative fungus,
  • a technology for producing a high concentration (100 g / L or more) sugar solution and a technology for producing a high concentration (50 g / L or more) ethanol are required for commercialization.
  • the solid content concentration in the initial reaction tank is lowered, so that the fluidity of the slurry is maintained and the solid content is dissolved to some extent, and then the rest
  • the fluidity of the slurry is ensured over the entire period from the beginning to the end of the reaction.
  • the conventional sugar liquid and ethanol production methods require a large amount of degrading enzyme when biomass is enzymatically saccharified.
  • the reason is that in the method of adding an aqueous solution containing a sugar solution in advance to a slurry containing biomass, the initial sugar concentration is increased, the degrading enzyme is inhibited by the sugar, and the activity is reduced.
  • the initial decomposing enzyme concentration is lowered and the saccharification rate of the biomass is slowed.
  • Decomposing enzymes are very expensive, so the use of decomposing enzymes is reduced in order to put ethanol production methods that apply technology for producing sugar liquid from biomass or technology for simultaneous saccharification and fermentation of biomass to practical use. This is an essential requirement.
  • This invention is made
  • the method for producing saccharides of the present invention at least any one of cellulose and hemicellulose is added to a slurry containing biomass, and at least one of cellulose and hemicellulose contained in the biomass is decomposed by the decomposing enzyme.
  • a method for producing a saccharide comprising glucose as a main component, the slurry, the decomposing enzyme, and an adsorption inhibitor for preventing the decomposing enzyme from adsorbing to lignin contained in the biomass, wherein the concentration of at least one of the cellulose and hemicellulose is maintained at 75 g / L or less.
  • the entire amount of the decomposing enzyme is added at the beginning of the reaction, and the decomposing enzyme is not added during the reaction.
  • the method for producing ethanol of the present invention at least any one of cellulose and hemicellulose and a fermentation bacterium are added to a slurry containing biomass, and at least one of cellulose and hemicellulose contained in the biomass is decomposed.
  • a method of degrading with an enzyme to produce a saccharide mainly composed of glucose and producing ethanol from the saccharide, wherein the slurry, the degrading enzyme, the fermenting bacterium, and the lignin contained in the biomass In a mixed solution containing an adsorption inhibitor for preventing the degradation enzyme from adsorbing, the concentration of at least one of the cellulose and hemicellulose is maintained at 75 g / L or less.
  • the total amount of the decomposing enzyme is added at the beginning of the reaction, and the decomposing enzyme is not added during the reaction.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION while maintaining the fluidity
  • a method for producing ethanol that can be produced can be provided.
  • Method for producing saccharides of the present invention at least any one of cellulose and hemicellulose is added to a slurry containing biomass, and at least one of cellulose and hemicellulose contained in biomass is decomposed with a decomposing enzyme.
  • a method for producing a saccharide mainly composed of glucose, comprising a biomass slurry, a decomposing enzyme, a fermenting bacterium, and an adsorption inhibitor for preventing the decomposing enzyme from adsorbing to lignin contained in the biomass In the mixed solution containing, the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is maintained at 75 g / L or less.
  • biomass at least one of cellulose and hemicellulose
  • biomass is divided and added to this slurry in order to maintain the fluidity of the slurry containing biomass. That is, in the method for producing saccharides of the present invention, from the start to the end of the enzymatic saccharification step in which at least one of cellulose and hemicellulose in biomass is enzymatically saccharified by a degrading enzyme to obtain saccharides mainly composed of glucose.
  • the biomass saccharification reaction is carried out in a state where the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is maintained at 75 g / L or less in the mixed solution containing the slurry, the degradation enzyme, and the adsorption inhibitor.
  • the method for producing saccharides of the present embodiment first, with respect to biomass (tree or grass, or crop residue), at least one of cellulose and hemicellulose contained in biomass contained in biomass, and cellulose and hemicellulose A pretreatment for improving the contact efficiency with at least one of the degrading enzymes is performed.
  • “at least one of cellulose and hemicellulose contained in biomass” means “cellulose” or “a mixture of cellulose and hemicellulose”.
  • the “degrading enzyme of at least one of cellulose and hemicellulose” means “cellulose-degrading enzyme” or “degrading enzyme of cellulose and hemicellulose”.
  • Examples of the pretreatment include alkali treatment, biomass treatment, steam explosion treatment, and dilute sulfuric acid treatment for biomass. From the viewpoint of enzymatic saccharification yield and equipment cost, steam explosion treatment, alkali treatment, or dilute sulfuric acid treatment is preferable. Used for. As the alkali treatment, organic solvent treatment, dilute sulfuric acid treatment, and steam explosion treatment for biomass, known treatments are used.
  • biomass slurry a slurry containing biomass
  • concentration of the biomass slurry that is, the concentration of biomass in the biomass slurry is appropriately adjusted according to the type of biomass and the pretreatment method thereof, and the amount of at least one of cellulose and hemicellulose in the biomass slurry is 50 g / L to 75 g / L is preferable.
  • Water is mentioned as a solution (solvent) used for biomass slurry.
  • the concentration of biomass in the biomass slurry is within the above range, all the solution is not absorbed into the pores of the biomass, and there is a moderately free solution. You can move around freely. Moreover, since the stirring operation of the biomass slurry becomes easy, the reactivity between the degrading enzyme and at least one of cellulose and hemicellulose is improved. Further, if the amount of at least one of cellulose and hemicellulose in the biomass slurry is less than 50 g / L, the efficiency of producing saccharides mainly composed of glucose is too bad.
  • a biomass slurry, an aqueous solution (enzyme aqueous solution) containing an appropriate amount of cellulose and hemicellulose-degrading enzymes suitable for degrading cellulose contained in the biomass slurry, and a lignin-degrading enzyme contained in biomass An adsorption inhibitor for preventing the adsorption of the biomass slurry is put in a reaction vessel, and the biomass slurry, the aqueous enzyme solution, and the adsorption inhibitor are mixed, and the biomass slurry, the decomposing enzyme, and the adsorption inhibitor are mixed.
  • a mixed solution A-1 containing is prepared (mixing step).
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose in the mixed solution A-1 is adjusted to 75 g / L or less, preferably 35 g / L to 75 g / L.
  • the pH of the mixed solution A-1 is adjusted so that the pH of the mixed solution A-1 containing the biomass slurry, the decomposing enzyme, and the adsorption inhibitor is the most suitable pH condition for the decomposing enzyme to be used. .
  • the temperature of the reaction vessel is adjusted so that the temperature condition is most suitable for the degradation enzyme of at least one of cellulose and hemicellulose to be used.
  • the pH of the mixed solution A-1 is preferably adjusted so that the above-described degrading enzyme functions actively. Specifically, the pH of the mixed solution A-1 is adjusted to 4-6. It is preferable.
  • Cellulase is used as a degrading enzyme for decomposing biomass.
  • xylanase or mannanase as a degrading enzyme other than cellulase for decomposing hemicellulose.
  • the addition amount of degrading enzyme in protein mixture A-1 (based on the mass of the protein) is preferably 0.4 to 2 parts by mass, with 0.6 parts by mass assuming that the amount of biomass to be decomposed is 100 parts by mass. More preferably, the amount is from 1.5 to 1.5 parts by mass.
  • adsorption inhibitor examples include bovine serum albumin (BSA), cheese whey, and cereal protein.
  • BSA bovine serum albumin
  • the addition amount of the adsorption inhibitor in the mixed liquid A-1 is preferably 0.1 to 2 parts by mass, and 0.4 to 1.5 parts by mass, when the biomass to be decomposed is 100 parts by mass. More preferably, it is part by mass.
  • a stirring blade or the like is used for stirring the mixed solution A-1 and the mixed solution B-1 described later.
  • the mixed solution A-1 (mixed solution B-1 is gently added to the extent that the decomposing enzyme contained in the mixed solution A-1 (mixed solution B-1) is not excessively deactivated. ) Is stirred and mixed, whereby at least one of cellulose and hemicellulose in the biomass is efficiently enzymatically saccharified by a degrading enzyme to obtain a saccharide mainly composed of glucose (enzymatic saccharification step).
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is 75 g / L or less in the mixed solution A-1 containing the biomass slurry, the degradation enzyme, and the adsorption inhibitor. While holding, the biomass is sequentially added to the mixed solution A-1. That is, at least one of cellulose and hemicellulose is compensated for the amount reduced by saccharification due to degradation by a degrading enzyme, and the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is 75 g / L in the mixed solution A-1. The biomass is sequentially added to the mixed solution A-1 so as to maintain the following.
  • the entire amount of the above decomposing enzyme should be added to the mixed liquid A-1, and the above decomposing enzyme should not be added to the mixed liquid A-1 during the enzymatic saccharification reaction. Is preferred. In this way, in the mixed solution A-1, the enzyme concentration at the initial stage of the reaction is increased, and the biomass can be efficiently decomposed.
  • this enzymatic saccharification step it is preferable to adjust the temperature of the mixed solution A-1 so that the above enzyme functions actively, and specifically, it is preferably maintained at 40 ° C. to 60 ° C.
  • the enzymatic saccharification step even when saccharides mainly composed of glucose are produced, at least cellulose and hemicellulose in the mixed solution B-1 containing the biomass slurry, the degrading enzyme, the adsorption inhibitor, and the saccharides mainly composed of glucose are produced.
  • the concentration (addition amount) of the biomass slurry in the mixed solution B-1 is adjusted so that the concentration of either one is 75 g / L or less.
  • the addition amount of the biomass slurry in the mixed solution B-1 is adjusted by measuring the concentration (concentration) of saccharides containing glucose as a main component in the mixed solution B-1.
  • the amount of reduction (the amount converted to saccharide) of at least one of cellulose and hemicellulose. From the obtained reduction amount and the volume of the mixed solution B-1, the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose in the mixed solution B-1 is 75 g / L or less. The amount of biomass slurry added can be determined.
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is 75 g / L in the mixed solution A-1 and the mixed solution B-1 containing the biomass slurry, the degradation enzyme, and the adsorption inhibitor. Hold below. Therefore, a saccharide mainly composed of glucose at a high concentration (150 g / L or more) without using a large amount of degrading enzyme while maintaining the fluidity of the mixed solution A-1 or the mixed solution B-1 containing the biomass slurry. Can be manufactured.
  • Method for producing ethanol In the ethanol production method of the present embodiment, at least one of cellulose and hemicellulose and a fermenting bacterium are added to a slurry containing biomass, and at least one of cellulose and hemicellulose contained in the biomass is decomposed.
  • a concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is maintained at 75 g / L or less.
  • biomass (at least one of cellulose and hemicellulose) is dividedly added to the slurry in order to maintain the fluidity of the slurry containing biomass. That is, in the method for producing ethanol of the present invention, at least one of cellulose and hemicellulose in biomass is enzymatically saccharified by a degrading enzyme to obtain a saccharide mainly composed of glucose, and the glucose obtained by fermenting bacteria.
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose in the mixed solution containing slurry, degrading enzyme, fermentation bacteria and adsorption inhibitor Biomass enzymatic saccharification reaction is carried out in a state of being maintained at 75 g / L or less.
  • biomass is pretreated in the same manner as the sugar production method of the present embodiment described above.
  • biomass slurry a slurry containing biomass that has been pretreated (hereinafter also referred to as “biomass slurry”) is prepared in the same manner as in the sugar production method of the present embodiment described above.
  • a biomass slurry and an aqueous solution containing an appropriate amount of at least one of a cellulose-degrading enzyme and a hemicellulose-degrading enzyme suitable for degrading at least one of cellulose and hemicellulose contained in the biomass slurry
  • An aqueous solution containing a fermenting bacterium (fermenting bacterium aqueous solution) and an adsorption inhibitor for preventing the degradation enzyme from adsorbing to the lignin contained in the biomass are placed in a reaction tank, a biomass slurry, an enzyme aqueous solution, A fermenting bacterial aqueous solution and an adsorption inhibitor are mixed to prepare a mixed solution A-2 containing a biomass slurry, a degrading enzyme, a fermenting fungus, and an adsorption inhibitor (mixing step).
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose in the mixed solution A-2 is adjusted so as to be 75 g / L or less.
  • the pH of the mixed solution A-2 is adjusted so that the pH of the mixed solution A-2 containing the biomass slurry, the decomposing enzyme, the fermenting bacteria, and the adsorption inhibitor is the most suitable pH condition for the decomposing enzyme to be used. Adjust. Furthermore, the temperature of the reaction vessel is adjusted so that the temperature condition is most suitable for the degradation enzyme of at least one of cellulose and hemicellulose to be used. In this mixing step, it is preferable to adjust the pH of the mixed solution A-2 so that the above-described degrading enzymes and the fermenting bacteria function actively. Specifically, the pH of the mixed solution A-2 is adjusted to 4-6. It is preferable to adjust to. In this mixing step, it is preferable to adjust the temperature of the mixed solution A-2 so that the decomposing enzyme and the fermenting bacteria function actively. Specifically, the temperature of the mixed solution A-2 The temperature is preferably raised to 30 ° C. to 40 ° C.
  • the addition amount of degrading enzyme in the mixed solution A-2 (based on the mass of protein) is preferably 0.4 parts by mass to 2 parts by mass when the amount of biomass to be decomposed is 100 parts by mass, and 0.6 parts by mass. More preferably, the amount is from 1.5 to 1.5 parts by mass.
  • the addition amount of the fermenting bacteria in the mixed solution A-2 is more preferably 1 to 10 in turbidity.
  • Turbidity is an index representing the amount (concentration) of fermenting bacteria, and the higher the concentration, the more turbid the mixed solution is.
  • the adsorption inhibitor As the adsorption inhibitor, the same adsorption inhibitor as in the sugar production method of the present embodiment described above is used.
  • the addition amount of the adsorption inhibitor in the mixed solution A-2 is preferably 0.1 to 2 parts by mass, and 0.4 to 1.5 parts by mass, assuming that the amount of biomass to be decomposed is 100 parts by mass. More preferably, it is part by mass.
  • a stirring blade or the like is used for stirring the mixed liquid A-2 and the mixed liquid B-2 and the mixed liquid C-2 described later.
  • the mixed solution in the reaction vessel, the mixed solution is gently added to the extent that the decomposing enzyme and the fermentation bacteria contained in the mixed solution A-2 (mixed solution B-2, mixed solution C-2) are not excessively inactivated.
  • A-2 mixed solution B-2, mixed solution C-2
  • at least one of cellulose and hemicellulose in the biomass is efficiently enzymatically saccharified by a degrading enzyme, and glucose is the main component.
  • the saccharide containing the obtained glucose as a main component is converted into ethanol by the fermentation bacteria (simultaneous saccharification and fermentation step).
  • the process of simultaneously performing the enzymatic saccharification process and the fermentation process is referred to as a simultaneous saccharification and fermentation process.
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is 75 g in the mixed solution A-2 containing the biomass slurry, the degrading enzyme, the fermenting bacteria, and the adsorption inhibitor.
  • the biomass is sequentially added to the mixed solution A-2 while maintaining the pressure at / L or lower.
  • At least one of cellulose and hemicellulose is compensated for the amount reduced by saccharification due to degradation by a degrading enzyme, and the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose is 75 g / L in the mixed solution A-2.
  • Biomass is sequentially added to the mixed solution A-2 so as to maintain the following.
  • the entire amount of the above decomposing enzyme should be added to the mixed liquid A-2, and the above decomposing enzyme should not be added to the mixed liquid A-2 during the enzymatic saccharification reaction. Is preferred. In this way, in the mixed solution A-2, the enzyme concentration at the initial stage of the reaction is increased, and the biomass can be efficiently decomposed.
  • the temperature of the mixed solution A-2 it is preferable to adjust the temperature of the mixed solution A-2 so that the above-mentioned decomposing enzyme and the fermenting bacteria function actively. Specifically, the temperature is maintained at 30 to 40 ° C. It is preferable to do.
  • the concentration (addition amount) of the biomass slurry in the mixed solution B-2 is adjusted so that the concentration of at least one of hemicellulose is 75 g / L or less.
  • cellulose in the mixed liquid C-2 containing biomass slurry, decomposing enzyme, fermentation bacteria, adsorption inhibitor, saccharides and ethanol is also used.
  • the concentration (addition amount) of the biomass slurry in the mixed solution C-2 is adjusted so that the concentration of at least one of hemicellulose is 75 g / L or less.
  • the addition amount of the biomass slurry in the mixed solution B-2 or the mixed solution C-2 is adjusted by measuring the ethanol concentration (concentration) in the mixed solution B-2 or the mixed solution C-2.
  • the amount (production amount) of ethanol produced by fermentation of a saccharide composed mainly of glucose produced by saccharification of at least one of cellulose and hemicellulose can be calculated according to the following equation (2).
  • the fermentation yield of ethanol is a numerical value that varies depending on the performance of the fermenting bacteria, and is obtained in advance by experiments.
  • the concentration of at least one of cellulose and hemicellulose in the mixed liquid B-2 or the mixed liquid C-2 is 75 g / L.
  • the amount of biomass slurry added to the mixed solution B-2 or the mixed solution C-2 can be determined so as to become the following.
  • the temperature of the mixed solution A-2, mixed solution B-2 or mixed solution C-2 containing the fermenting bacteria is preferably maintained at 30 to 40 ° C.
  • the simultaneous saccharification and fermentation process is carried out until the fermentation of the saccharide mainly composed of glucose by the fermenting bacterium proceeds sufficiently and the reaction does not proceed any further. Fermentation is performed at 30 to 40 ° C. for about 1 to 5 days.
  • the mixed solution A-2, mixed solution B-2, or mixed solution C-2 containing the biomass slurry, decomposing enzyme, fermenting bacteria, and adsorption inhibitor at least cellulose and hemicellulose are used. Either concentration is kept at 75 g / L or less. Therefore, while maintaining the fluidity of the mixed liquid A-2, mixed liquid B-2 or mixed liquid C-2 containing the biomass slurry, a high concentration (50 g / L or more) of ethanol without using a large amount of degrading enzyme Can be manufactured.
  • the concentration of cellulose was adjusted to 38.4 g / L to 76.8 g / L.
  • the cellulose concentration in the mixed solution b-1 was calculated by measuring the cellulose concentration in the steam-explosive bagasse.
  • the mixed solution b-1 was kept at 50 ° C. for 20 days while gently shaking with a shaker to decompose the cellulose with a degrading enzyme.
  • the concentration of saccharides mainly composed of glucose obtained by enzymatic degradation of cellulose was measured by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • a mixed solution b-2-2 containing a biomass slurry and a decomposing enzyme.
  • the concentration of cellulose in the mixed solution b-2-2 was adjusted to 67.2 g / L.
  • the concentration of cellulose in the mixed solution b-2-1 and the mixed solution b-2-2 was calculated by measuring the cellulose concentration in the steam explosion bagasse.
  • Each of the mixed solution b-2-1 and the mixed solution b-2-2 was kept at 50 ° C. for 20 days while gently shaking with a shaker to decompose the cellulose with a degrading enzyme.
  • cellulase as a degrading enzyme is added to the mixed solution a-3 by 20 mg per 1 g-dry of biomass
  • bovine serum albumin (BSA) as an adsorption inhibitor is added at 10 mg per 1 g-dry of biomass
  • a mixed solution b-3-2 containing an enzyme and an adsorption inhibitor was prepared.
  • the concentration of cellulose in the mixed solution b-3-2 was adjusted to 60 g / L.
  • the concentration of cellulose in the mixed solution b-3-1 and the mixed solution b-3-2 was calculated by measuring the cellulose concentration in the steam explosion bagasse.
  • Each of the mixed solution b-3-1 and the mixed solution b-3-2 was kept at 50 ° C.
  • the concentration of saccharides mainly composed of glucose reached 115 g / L.
  • the concentration of saccharides mainly composed of glucose remained at 95 g / L.
  • Example 4 Steam explosion bagasse was mixed with an acetic acid buffer 50 mmol / L solution having a pH of 5, and as shown in Table 2, a mixed solution a-4 having a biomass slurry concentration of 8 w / v% to 16 w / v% was obtained. Prepared. Cellulase as a degrading enzyme is added to each mixed solution a-4 having different biomass slurry concentrations by 4 mg per 1 g-dry biomass, and bovine serum albumin (BSA) as an adsorption inhibitor is added by 10 mg per 1 g biomass.
  • BSA bovine serum albumin
  • yeast as a fermenting bacterium was added so as to have a turbidity of 3, and a mixed solution b-4 containing a biomass slurry, a degrading enzyme, an adsorption inhibitor and a fermenting bacterium was prepared.
  • the concentration of cellulose was adjusted to 38.4 g / L to 76.8 g / L.
  • the cellulose concentration in the mixed solution b-4 was calculated by measuring the cellulose concentration in the steam-explosive bagasse.
  • the mixed solution b-4 was held at 30 ° C.
  • the concentration of cellulose was adjusted to 67.2 g / L in the mixed solution b-5-1. Further, cellulase as a degrading enzyme and 4 mg per 1 g-dry of biomass are added to the mixed solution a-5, yeast as a fermenting bacterium is added so as to have a turbidity of 3, and a biomass slurry, decomposing enzyme and fermenting bacterium are added. A mixed solution b-5-2 containing was prepared. Thereby, the concentration of cellulose was adjusted to 67.2 g / L in the mixed solution b-5-2.
  • the cellulose concentration in the mixed solution b-5-1 and the mixed solution b-5-2 was calculated by measuring the cellulose concentration in the steam explosion bagasse.
  • Each of the mixed liquid b-5-1 and the mixed liquid b-5-2 was held at 50 ° C. for 20 days while gently shaking with a shaker, so that cellulose was decomposed by a degrading enzyme and glucose was a main component. And ethanol was produced from the saccharide containing glucose as a main component. Further, 5 days after the start of the reaction, steam explosion bagasse was added so that the concentration of cellulose in the mixed solution b-5-1 and the mixed solution b-5-2 was 70 g / L. During the simultaneous saccharification and fermentation reaction, the ethanol concentration was measured by high performance liquid chromatography (HPLC) every predetermined time. The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 3, the ethanol concentration reached 48 g / L in the mixed solution b-5-1 containing the adsorption inhibitor, but the ethanol concentration in the mixed solution b-5-2 not containing the adsorption inhibitor. Remained at 29 g / L.
  • cellulase as a degrading enzyme is added to the mixed solution a-6 by 20 mg per 1 g-dry of biomass, bovine serum albumin (BSA) as an adsorption inhibitor is added by 10 mg per 1 g of biomass, and yeast is used as a fermenting fungus.
  • BSA bovine serum albumin
  • yeast is used as a fermenting fungus.
  • the concentration of cellulose in the mixed solution b-6-2 was adjusted to 60 g / L.
  • the concentration of cellulose in the mixed solution b-6-1 and the mixed solution b-6-2 was calculated by measuring the cellulose concentration in the steam explosion bagasse.
  • Each of the mixed solution b-6-1 and the mixed solution b-6-2 was kept at 50 ° C. for 20 days while gently shaking with a shaker to decompose the cellulose with a degrading enzyme.
  • 3 days after the start of the reaction 5 g-dry of steam explosion bagasse was added to the mixed solution b-6-1 and the mixed solution b-6-2.
  • 20 mg of cellulase as a degrading enzyme per 1 g-dry of biomass was added to the mixed solution b-6-2.
  • the concentration of saccharides mainly composed of glucose obtained by enzymatic decomposition of cellulose was measured by high performance liquid chromatography (HPLC) every predetermined time.
  • the amount of decomposing enzyme used can be reduced, and a saccharide production method capable of producing a high concentration of saccharide and ethanol capable of producing a high concentration of ethanol. It relates to the manufacturing method.

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Abstract

バイオマスを含むスラリーの流動性を維持し、分解酵素の使用量を削減することができ、高濃度の糖類を製造できる糖類の製造方法および高濃度のエタノールを製造できるエタノールの製造方法を提供する。すなわち、本発明の糖類の製造方法は、バイオマスを含むスラリーに、セルロース分解酵素を添加し、バイオマスに含まれるセルロースを、セルロース分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造する方法であって、スラリーと、分解酵素と、バイオマスに含まれるリグニンへ分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、セルロースの濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持する。

Description

糖類の製造方法、エタノールの製造方法
本発明は、バイオマスから糖類を製造する糖類の製造方法、および、バイオマスから得られた糖類からエタノールを製造するエタノールの製造方法に関する。
　前処理を施したバイオマスを酵素糖化して、グルコースを主成分とする糖液を製造する場合や、前処理を施したバイオマスに分解酵素と発酵菌を一緒に添加し、同時糖化発酵して、エタノールを製造する場合、商業化するためには、高濃度（１００ｇ／Ｌ以上）の糖液の製造技術や、高濃度（５０ｇ／Ｌ以上）のエタノールの製造技術が必要となる。
　従来、セルロース系バイオマスを原料として、高濃度（１００ｇ／Ｌ以上）の糖液や、高濃度（５０ｇ／Ｌ以上）のエタノールを製造することは難しい。高濃度の糖液やエタノールを製造するためには、反応槽に充填するバイオマス量を増加させる必要がある。そうすると、反応槽内の固形分率（スラリー濃度）が高くなるため、バイオマスを含むスラリーの流動性が失われ、糖化や発酵の効率が著しく低下する。
　糖化や発酵の効率が低下する理由としては、固形分濃度が高いと遊離水量が少なくなり、分解酵素が効率的にバイオマス全体に行き渡らないことや、遊離水が少ない状況は発酵菌の生育環境としては適していないこと等が挙げられる。
　また、エタノール発酵は、発熱反応であり、反応熱の除去が必要になる。しかしながら、反応槽内のスラリー濃度が高い場合、熱伝導性が低下することに加えて、スラリーをポンプで循環させたり、反応槽内でスラリーを撹拌したりすることは困難となり、反応槽内を効率的に冷却することができない。
　このような課題を解決するために、従来、以下のような方法が提案されている。例えば、バイオマスを含むスラリーに、予め糖液を含む水溶液を添加して、バイオマススラリー中の固形分濃度を下げて、バイオマススラリーの流動性を確保する方法（例えば、特許文献１参照）や、バイオマスと分解酵素を分割して反応槽に添加する方法（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。バイオマスと分解酵素を分割して反応槽に添加する方法では、初期の反応槽中の固形分濃度が下がるため、スラリーの流動性が維持され、かつ、固形分がある程度溶解された後、残りのバイオマスと分解酵素を添加することにより、反応の初めから終わりまで、全期間にわたってスラリーの流動性を確保している。
特開２０１１－１８２７４１号公報
しかしながら、従来の糖液やエタノールの製造方法では、バイオマスを酵素糖化する時に多量の分解酵素が必要となる。その理由は、バイオマスを含むスラリーに、予め糖液を含む水溶液を添加する方法では、初期の糖濃度が高くなり、分解酵素は糖に阻害され、活性が低下する。また、バイオマスと分解酵素を分割して反応槽に添加する方法では、初期の分解酵素濃度が低くなり、バイオマスの糖化速度が遅くなる。分解酵素は非常に高価であるため、バイオマスから糖液を製造する技術、あるいは、バイオマスを同時糖化発酵する技術を適用したエタノールの製造方法を実用化するためには、分解酵素の使用量を削減することが必須要件となる。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、バイオマスを含むスラリーの流動性を維持しつつ、分解酵素の使用量を削減することができ、高濃度の糖類を製造することができる糖類の製造方法および高濃度のエタノールを製造することができるエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の糖類の製造方法は、バイオマスを含むスラリーに、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素を添加し、前記バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、前記分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造する方法であって、前記スラリーと、前記分解酵素と、前記バイオマスに含まれるリグニンへ前記分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、前記セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持することを特徴とする。
　本発明の糖類の製造方法において、反応初期に前記分解酵素を全量添加し、反応中に前記分解酵素を添加しないことが好ましい。
　本発明のエタノールの製造方法は、バイオマスを含むスラリーに、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素と発酵菌を添加し、前記バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、前記分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造し、当該糖類からエタノールを製造する方法であって、前記スラリーと、前記分解酵素と、前記発酵菌と、前記バイオマスに含まれるリグニンへ前記分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、前記セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持することを特徴とする。
　本発明のエタノールの製造方法において、反応初期に前記分解酵素を全量添加し、反応中に前記分解酵素を添加しないことが好ましい。
本発明によれば、バイオマスを含むスラリーの流動性を維持しつつ、分解酵素の使用量を削減することができ、高濃度の糖類を製造することができる糖類の製造方法および高濃度のエタノールを製造することができるエタノールの製造方法を提供することができる。
バイオマスの酵素糖化工程において、反応開始からの時間の経過に伴う、混合液（水溶液）中に含まれるグルコースの濃度を示すグラフである。 バイオマスの酵素糖化工程において、反応開始からの時間の経過に伴う、混合液（水溶液）中に含まれるグルコースの濃度を示すグラフである。 バイオマスの同時糖化発酵工程において、反応開始からの時間の経過に伴う、混合液（水溶液）中に含まれるアルコールの濃度を示すグラフである。 バイオマスの同時糖化発酵工程において、反応開始からの時間の経過に伴う、混合液（水溶液）中に含まれるアルコールの濃度を示すグラフである。
本発明の糖類の製造方法およびエタノールの製造方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
［糖類の製造方法］
　本発明の糖類の製造方法は、バイオマスを含むスラリーに、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素を添加し、バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造する方法であって、バイオマススラリーと、分解酵素と、発酵菌と、バイオマスに含まれるリグニンへ分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持する方法である。
　本発明の糖類の製造方法では、バイオマスを含むスラリーの流動性を維持するために、このスラリーに、バイオマス（セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方）を分割して添加する。すなわち、本発明の糖類の製造方法では、分解酵素により、バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を酵素糖化し、グルコースを主成分とする糖類を得る酵素糖化工程の開始から終了までの間、スラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持した状態で、バイオマスの酵素糖化反応を行う。
本実施形態の糖類の製造方法では、まず、バイオマス（木や草、あるいは、農作物の残渣）に対して、バイオマスに含まれるバイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方と、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素との接触効率を向上させる前処理を施す。本実施形態において、「バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方」とは、「セルロース」あるいは「セルロースとヘミセルロースの混合物」のことである。また、本実施形態において、「セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素」とは、「セルロース分解酵素」あるいは「セルロースとヘミセルロースの分解酵素」のことである。
前処理としては、バイオマスに対するアルカリ処理、有機溶剤処理、水蒸気爆砕処理、希硫酸処理等が挙げられるが、酵素糖化収率および設備コストの観点から、水蒸気爆砕処理、アルカリ処理または希硫酸処理が好適に用いられる。
バイオマスに対するアルカリ処理、有機溶剤処理、希硫酸処理、水蒸気爆砕処理としては、公知の処理が用いられる。
次に、前処理が施されたバイオマスを、溶液（溶媒）に分散させて、バイオマスを含むスラリー（以下、「バイオマススラリー」と言うこともある。）を調製する。
バイオマススラリーの濃度、すなわち、バイオマススラリーにおけるバイオマスの濃度は、バイオマスの種類やその前処理方法などに応じて適宜調整されるが、バイオマススラリー中のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の量が５０ｇ／Ｌ～７５ｇ／Ｌとなることが好ましい。
バイオマススラリーに用いられる溶液（溶媒）としては、水が挙げられる。
バイオマススラリーにおけるバイオマスの濃度が上記の範囲内であれば、全ての溶液がバイオマスの細孔内に吸収されることなく、遊離している溶液が適度に存在するので、分解酵素がバイオマススラリー中を自由に動き回ることができる。また、バイオマススラリーの撹拌操作が容易となるため、分解酵素とセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方との反応性が向上する。また、バイオマススラリー中のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の量が５０ｇ／Ｌ未満では、グルコースを主成分とする糖類が生成する効率が悪すぎて好ましくない。
次に、バイオマススラリーと、このバイオマススラリーに含まれるセルロースの分解に適した、適量のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素を含む水溶液（酵素水溶液）と、バイオマスに含まれるリグニンへ分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を、反応槽に入れて、バイオマススラリーと、酵素水溶液と、吸着抑制剤とを混合し、バイオマススラリーと、分解酵素と、吸着抑制剤と、を含む混合液Ａ－１を調製する（混合工程）。
この混合工程において、反応開始前、すなわち、バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、分解酵素で分解する前において、混合液Ａ－１におけるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下、好ましくは３５ｇ／Ｌ～７５ｇ／Ｌとなるように、混合液Ａ－１におけるバイオマススラリーの濃度（添加量）を調整する。
この混合工程において、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液Ａ－１のｐＨが、使用する分解酵素に最も適したｐＨ条件になるように、混合液Ａ－１のｐＨを調節する。さらに、使用するセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素に最も適した温度条件になるように、反応槽の温度を調節する。
この混合工程では、混合液Ａ－１のｐＨを、上記の分解酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、混合液Ａ－１のｐＨを４～６に調節することが好ましい。
また、この混合工程では、上記の混合液Ａ－１の温度を、上記の分解酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、混合液Ａ－１の温度を４０℃～６０℃に昇温することが好ましい。
バイオマスを分解するための分解酵素としては、セルラーゼが用いられる。
バイオマス中にヘミセルロースが多く含まれる場合、セルラーゼ以外にヘミセルロースを分解するための分解酵素として、キシラナーゼやマンナナーゼを添加することが好ましい。
混合液Ａ－１における分解酵素の添加量（タンパク質の質量基準）は、分解するバイオマス量を１００質量部とした場合、０．４質量部～２質量部であることが好ましく、０．６質量部～１．５質量部であることがより好ましい。
吸着抑制剤としては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、チーズホエーや穀物由来のタンパク質等が挙げられる。
混合液Ａ－１における吸着抑制剤の添加量は、分解するバイオマス量を１００質量部とした場合、０．１質量部～２質量部であることが好ましく、０．４質量部～１．５質量部であることがより好ましい。
また、混合液Ａ－１、および、後述する混合液Ｂ－１の攪拌には、攪拌翼などが用いられる。
本実施形態では、反応槽内にて、混合液Ａ－１（混合液Ｂ－１）に含まれる分解酵素が過度に失活しない程度に緩やかに、混合液Ａ－１（混合液Ｂ－１）を攪拌混合することにより、分解酵素により、バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を効率的に酵素糖化し、グルコースを主成分とする糖類を得る（酵素糖化工程）。
この酵素糖化工程において、バイオマススラリーの流動性を維持するため、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液Ａ－１において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持しつつ、混合液Ａ－１にバイオマスを逐次添加する。すなわち、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方が、分解酵素によって分解されて糖化することによって減少した量を補って、混合液Ａ－１において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持するように、混合液Ａ－１にバイオマスを逐次添加する。
酵素糖化反応初期、実際には、混合工程の初期に、混合液Ａ－１に上記の分解酵素を全量添加し、酵素糖化反応中に、混合液Ａ－１に上記の分解酵素を添加しないことが好ましい。このようにすれば、混合液Ａ－１において、反応初期の酵素濃度が高くなり、効率的にバイオマスを分解できる。
また、この酵素糖化工程では、混合液Ａ－１の温度を、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、４０℃～６０℃に保持することが好ましい。
酵素糖化工程において、グルコースを主成分とする糖類が生成した場合にも、バイオマススラリー、分解酵素、吸着抑制剤およびグルコースを主成分とする糖類を含む混合液Ｂ－１における、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下となるように、混合液Ｂ－１におけるバイオマススラリーの濃度（添加量）を調整する。
ここで、混合液Ｂ－１におけるバイオマススラリーの添加量は、混合液Ｂ－１におけるグルコースを主成分とする糖類の濃度（濃度）を測定することにより調整する。セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方が糖化して生成したグルコースを主成分とする糖類の量（生成量）は、下記の式（１）に従って算出することができる。
「セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方から生成したグルコースとキシロースの量（生成量）」（ｇ）＝「セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の減少量（糖類に転化した量）」（ｇ）×１．１　・・・（１）
すなわち、上記の式（１）を逆算することにより、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の減少量（糖類に転化した量）を算出することができる。得られた減少量と、混合液Ｂ－１の体積とから、混合液Ｂ－１における、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下となるための、混合液Ｂ－１におけるバイオマススラリーの添加量を決定することができる。
本実施形態の糖類の製造方法によれば、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液Ａ－１および混合液Ｂ－１において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持する。そのため、バイオマススラリーを含む混合液Ａ－１または混合液Ｂ－１の流動性を維持しつつ、多量の分解酵素を用いることなく、高濃度（１５０ｇ／Ｌ以上）のグルコースを主成分とする糖類を製造することができる。
［エタノールの製造方法］
本実施形態のエタノールの製造方法は、バイオマスを含むスラリーに、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素と発酵菌を添加し、バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造し、その糖類からエタノールを製造する方法であって、バイオマススラリーと、分解酵素と、発酵菌と、バイオマスに含まれるリグニンへ分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持する方法である。
本発明のエタノールの製造方法では、バイオマスを含むスラリーの流動性を維持するために、このスラリーに、バイオマス（セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方）を分割して添加する。すなわち、本発明のエタノールの製造方法では、分解酵素により、バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を酵素糖化し、グルコースを主成分とする糖類を得るとともに、発酵菌により、得られたグルコースを主成分とする糖類をエタノールに変換する酵素糖化工程の開始から終了までの間、スラリー、分解酵素、発酵菌および吸着抑制剤を含む混合液において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持した状態で、バイオマスの酵素糖化反応を行う。
本実施形態のエタノールの製造方法では、まず、上述の本実施形態の糖の製造方法と同様にして、バイオマスに対して前処理を施す。
次に、上述の本実施形態の糖の製造方法と同様にして、前処理が施されたバイオマスを含むスラリー（以下、「バイオマススラリー」と言うこともある。）を調製する。
次に、バイオマススラリーと、このバイオマススラリーに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解に適した、適量のセルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素の少なくともいずれか一方を含む水溶液（酵素水溶液）と、発酵菌を含む水溶液（発酵菌水溶液）と、バイオマスに含まれるリグニンへ分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を、反応槽に入れて、バイオマススラリーと、酵素水溶液と、発酵菌水溶液と、吸着抑制剤とを混合し、バイオマススラリーと、分解酵素と、発酵菌と、吸着抑制剤と、を含む混合液Ａ－２を調製する（混合工程）。
この混合工程において、反応開始前、すなわち、バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、分解酵素で分解する前において、混合液Ａ－２におけるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下となるように、混合液Ａ－２におけるバイオマススラリーの濃度（添加量）を調整する。
この混合工程において、バイオマススラリー、分解酵素、発酵菌および吸着抑制剤を含む混合液Ａ－２のｐＨが、使用する分解酵素に最も適したｐＨ条件になるように、混合液Ａ－２のｐＨを調節する。さらに、使用するセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素に最も適した温度条件になるように、反応槽の温度を調節する。
この混合工程では、混合液Ａ－２のｐＨを、上記の分解酵素および発酵菌が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、混合液Ａ－２のｐＨを４～６に調節することが好ましい。
また、この混合工程では、上記の混合液Ａ－２の温度を、上記の分解酵素および発酵菌が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、混合液Ａ－２の温度を３０℃～４０℃に昇温することが好ましい。
バイオマスを分解するための分解酵素としては、上述の本実施形態の糖の製造方法と同様の酵素が用いられる。
混合液Ａ－２における分解酵素の添加量（タンパク質の質量基準）は、分解するバイオマス量を１００質量部とした場合、０．４質量部～２質量部であることが好ましく、０．６質量部～１．５質量部であることがより好ましい。
発酵菌としては、酵母菌、大腸菌、Ｚｙｍｏｍｏｎｕｓ菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌などが用いられる。
混合液Ａ－２における発酵菌の添加量は、濁度１～１０であることがより好ましい。
濁度とは、発酵菌の量（濃度）を表わす指標であり、濃度が高いほど、混合液が濁るため、その濁り度合いで発酵菌の量を示す。
吸着抑制剤としては、上述の本実施形態の糖の製造方法と同様の吸着抑制剤が用いられる。
混合液Ａ－２における吸着抑制剤の添加量は、分解するバイオマス量を１００質量部とした場合、０．１質量部～２質量部であることが好ましく、０．４質量部～１．５質量部であることがより好ましい。
また、混合液Ａ－２、並びに、後述する混合液Ｂ－２および混合液Ｃ－２の攪拌には、攪拌翼などが用いられる。
本実施形態では、反応槽内にて、混合液Ａ－２（混合液Ｂ－２、混合液Ｃ－２）に含まれる分解酵素および発酵菌が過度に失活しない程度に緩やかに、混合液Ａ－２（混合液Ｂ－２、混合液Ｃ－２）を攪拌混合することにより、分解酵素により、バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を効率的に酵素糖化し、グルコースを主成分とする糖類を得るとともに、発酵菌により、得られたグルコースを主成分とする糖類をエタノールに変換する（同時糖化発酵工程）。ここで、酵素糖化工程と発酵工程を同時に行う工程を、同時糖化発酵工程と言う。
この同時糖化発酵工程において、バイオマススラリーの流動性を維持するため、バイオマススラリー、分解酵素、発酵菌および吸着抑制剤を含む混合液Ａ－２において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持しつつ、混合液Ａ－２にバイオマスを逐次添加する。すなわち、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方が、分解酵素によって分解されて糖化することによって減少した量を補って、混合液Ａ－２において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持するように、混合液Ａ－２にバイオマスを逐次添加する。
酵素糖化反応初期、実際には、混合工程の初期に、混合液Ａ－２に上記の分解酵素を全量添加し、酵素糖化反応中に、混合液Ａ－２に上記の分解酵素を添加しないことが好ましい。このようにすれば、混合液Ａ－２において、反応初期の酵素濃度が高くなり、効率的にバイオマスを分解できる。
また、この同時糖化発酵工程では、混合液Ａ－２の温度を、上記の分解酵素および発酵菌が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、３０℃～４０℃に保持することが好ましい。
同時糖化発酵工程において、グルコースを主成分とする糖類が生成した場合にも、バイオマススラリー、分解酵素、発酵菌、吸着抑制剤およびグルコースを主成分とする糖類を含む混合液Ｂ－２における、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下となるように、混合液Ｂ－２におけるバイオマススラリーの濃度（添加量）を調整する。
また、同時糖化発酵工程において、グルコースを主成分とする糖類およびエタノールが生成した場合にも、バイオマススラリー、分解酵素、発酵菌、吸着抑制剤、糖類およびエタノールを含む混合液Ｃ－２における、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下となるように、混合液Ｃ－２におけるバイオマススラリーの濃度（添加量）を調整する。
ここで、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２におけるバイオマススラリーの添加量は、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２におけるエタノール濃度（濃度）を測定することにより調整する。セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方が糖化して生成したグルコースを主成分とする糖類が発酵して生成したエタノールの量（生成量）は、下記の式（２）に従って算出することができる。
「セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方が糖化して生成したグルコースを主成分とする糖類が発酵して生成したエタノールの量（生成量）」（ｇ）＝「セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の減少量（糖類に転化した量）」（ｇ）×１．１×０．５１×（エタノールの発酵収率）　・・・（２）
エタノールの発酵収率は、発酵菌の性能によって異なる数値であり、予め実験により求めておく。
すなわち、上記の式（２）を逆算することにより、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の減少量（糖類に転化した量）を算出することができる。得られた減少量と、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２の体積とから、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２における、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度が７５ｇ／Ｌ以下となるための、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２におけるバイオマススラリーの添加量を決定することができる。
また、この同時糖化発酵工程では、発酵菌を含む混合液Ａ－２、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２の温度を、上記の発酵菌が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、３０℃～４０℃に保持することが好ましい。
同時糖化発酵工程は、発酵菌によるグルコースを主成分とする糖類の発酵が充分に進行して、それ以上反応が進行しなくなるまで行われるが、例えば、発酵菌によるグルコースを主成分とする糖類の発酵を、３０℃～４０℃にて１日～５日程度行う。
　本実施形態のエタノールの製造方法によれば、バイオマススラリー、分解酵素、発酵菌および吸着抑制剤を含む混合液Ａ－２、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２において、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持する。そのため、バイオマススラリーを含む混合液Ａ－２、混合液Ｂ－２または混合液Ｃ－２の流動性を維持しつつ、多量の分解酵素を用いることなく、高濃度（５０ｇ／Ｌ以上）のエタノールを製造することができる。
以下、実験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
「実験例１」
水蒸気爆砕バガスを、ｐＨが５の酢酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液と混合して、表１に示すように、バイオマススラリー濃度が８ｗ／ｖ％～１６ｗ／ｖ％の混合液ａ－１を、それぞれ調製した。
バイオマススラリー濃度が異なる、それぞれの混合液ａ－１に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加して、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液ｂ－１を調製した。これにより、表１に示すように、混合液ｂ－１において、セルロースの濃度を３８．４ｇ／Ｌ～７６．８ｇ／Ｌに調整した。ここで、水蒸気爆砕バガス中のセルロース濃度を測定することにより、混合液ｂ－１におけるセルロースの濃度を算出した。
混合液ｂ－１を、振盪機で穏やかに振盪させながら、５０℃にて２０日間保持して、セルロースを分解酵素により分解した。
セルロースの酵素分解によって得られたグルコースを主成分とする糖類の濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。また、セルロースがグルコースを主成分とする糖類になった割合（糖化率）をバイオマス中のセルロース量と糖化液中のグルコースの濃度により算出した。これらの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、混合液ｂ－１におけるセルロースの濃度が７５ｇ／Ｌ以下であれば、セルロースがセルラーゼによって分解され、グルコースを主成分とする糖類が生成することが確認された。一方、混合液ｂ－１におけるセルロースの濃度が７５ｇ／Ｌを超えると、セルロースがセルラーゼによって分解されないため、グルコースを主成分とする糖類が生成しないから、混合液ｂ－１が充分に液化しなかった。
「実験例２」
水蒸気爆砕バガスを、ｐＨが５の酢酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液と混合して、バイオマススラリー濃度が１４ｗ／ｖ％の混合液ａ－２を調製した。
混合液ａ－２に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加して、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液ｂ－２－１を調製した。これにより、混合液ｂ－２－１において、セルロースの濃度を６７．２ｇ／Ｌに調整した。
また、混合液ａ－２に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４ｍｇ添加して、バイオマススラリーおよび分解酵素を含む混合液ｂ－２－２を調製した。これにより、混合液ｂ－２－２において、セルロースの濃度を６７．２ｇ／Ｌに調整した。
ここで、水蒸気爆砕バガス中のセルロース濃度を測定することにより、混合液ｂ－２－１および混合液ｂ－２－２におけるセルロースの濃度を算出した。
混合液ｂ－２－１と混合液ｂ－２－２をそれぞれ、振盪機で穏やかに振盪させながら、５０℃にて２０日間保持して、セルロースを分解酵素により分解した。また、反応開始から５日後に、混合液ｂ－２－１および混合液ｂ－２－２におけるセルロースの濃度が７０ｇ／Ｌとなるように、水蒸気爆砕バガスを追加した。
酵素分解反応中、所定時間毎に、セルロースの酵素分解によって得られたグルコースを主成分とする糖類の濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。結果を図１に示す。
図１の結果から、吸着抑制剤を含む混合液ｂ－２－１では、グルコースを主成分とする糖類の濃度が１１８ｇ／Ｌに達したが、吸着抑制剤を含まない混合液ｂ－２－２では、グルコースを主成分とする糖類の濃度が７４ｇ／Ｌに留まった。
「実験例３」
水蒸気爆砕バガス５ｇ－ｄｒｙを、ｐＨが５の酢酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液と混合して、混合液ａ－３を調製した。
混合液ａ－３に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４０ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加して、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液ｂ－３－１を調製した。これにより、混合液ｂ－３－１において、セルロースの濃度を６０ｇ／Ｌに調整した。
また、混合液ａ－３に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり２０ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加して、バイオマススラリー、分解酵素および吸着抑制剤を含む混合液ｂ－３－２を調製した。これにより、混合液ｂ－３－２において、セルロースの濃度を６０ｇ／Ｌに調整した。
ここで、水蒸気爆砕バガス中のセルロース濃度を測定することにより、混合液ｂ－３－１および混合液ｂ－３－２におけるセルロースの濃度を算出した。
混合液ｂ－３－１と混合液ｂ－３－２をそれぞれ、振盪機で穏やかに振盪させながら、５０℃にて２０日間保持して、セルロースを分解酵素により分解した。また、反応開始から３日後に、混合液ｂ－３－１および混合液ｂ－３－２に、水蒸気爆砕バガス５ｇ－ｄｒｙを追加した。水蒸気爆砕バガスを追加する際、混合液ｂ－３－２には、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり２０ｍｇ添加した。
酵素分解反応中、所定時間毎に、セルロースの酵素分解によって得られたグルコースを主成分とする糖類の濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。結果を図２に示す。
図２の結果から、反応初期にセルラーゼを４０ｍｇ添加し、反応中にセルラーゼを添加しない混合液ｂ－３－１では、グルコースを主成分とする糖類の濃度が１１５ｇ／Ｌに達したが、反応初期にセルラーゼを２０ｍｇ添加し、反応中にセルラーゼを２０ｍｇ添加した混合液ｂ－３－２では、グルコースを主成分とする糖類の濃度が９５ｇ／Ｌに留まった。
「実験例４」
水蒸気爆砕バガスを、ｐＨが５の酢酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液と混合して、表２に示すように、バイオマススラリー濃度が８ｗ／ｖ％～１６ｗ／ｖ％の混合液ａ－４を、それぞれ調製した。
バイオマススラリー濃度が異なる、それぞれの混合液ａ－４に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加し、発酵菌として酵母菌を、濁度３となるように添加して、バイオマススラリー、分解酵素、吸着抑制剤および発酵菌を含む混合液ｂ－４を調製した。これにより、表２に示すように、混合液ｂ－４において、セルロースの濃度を３８．４ｇ／Ｌ～７６．８ｇ／Ｌに調整した。ここで、水蒸気爆砕バガス中のセルロース濃度を測定することにより、混合液ｂ－４におけるセルロースの濃度を算出した。
混合液ｂ－４を、振盪機で穏やかに振盪させながら、３０℃にて７日間保持して、セルロースを分解酵素により分解して、グルコースを主成分とする糖類を生成し、そのグルコースを主成分とする糖類からエタノールを生成した。ここで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、混合液ｂ－４におけるエタノールの濃度を算出した。これらの結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、混合液ｂ－４におけるセルロースの濃度が７５ｇ／Ｌ以下であれば、セルロースがセルラーゼによって分解され、グルコースを主成分とする糖類が生成し、そのグルコースを主成分とする糖類が酵母菌によって分解され、エタノールが生成することが確認された。一方、混合液ｂ－４におけるセルロースの濃度が７５ｇ／Ｌを超えると、セルロースがセルラーゼによって分解されないため、グルコースを主成分とする糖類が生成しないから、混合液ｂ－４が充分に液化しなかった。従って、エタノールが生成しなかった。
「実験例５」
水蒸気爆砕バガスを、ｐＨが５の酢酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液と混合して、バイオマススラリー濃度が１４ｗ／ｖ％の混合液ａ－５を調製した。
混合液ａ－５に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加し、発酵菌として酵母菌を、濁度３となるように添加して、バイオマススラリー、分解酵素、吸着抑制剤および発酵菌を含む混合液ｂ－５－１を調製した。これにより、混合液ｂ－５－１において、セルロースの濃度を６７．２ｇ／Ｌに調整した。
また、混合液ａ－５に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４ｍｇ添加し、発酵菌として酵母菌を、濁度３となるように添加して、バイオマススラリー、分解酵素および発酵菌を含む混合液ｂ－５－２を調製した。これにより、混合液ｂ－５－２において、セルロースの濃度を６７．２ｇ／Ｌに調整した。
ここで、水蒸気爆砕バガス中のセルロース濃度を測定することにより、混合液ｂ－５－１および混合液ｂ－５－２におけるセルロースの濃度を算出した。
混合液ｂ－５－１と混合液ｂ－５－２をそれぞれ、振盪機で穏やかに振盪させながら、５０℃にて２０日間保持して、セルロースを分解酵素により分解して、グルコースを主成分とする糖類を生成し、そのグルコースを主成分とする糖類からエタノールを生成した。また、反応開始から５日後に、混合液ｂ－５－１および混合液ｂ－５－２におけるセルロースの濃度が７０ｇ／Ｌとなるように、水蒸気爆砕バガスを追加した。
同時糖化発酵反応中、所定時間毎に、エタノールの濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。結果を図３に示す。
図３の結果から、吸着抑制剤を含む混合液ｂ－５－１では、エタノールの濃度が４８ｇ／Ｌに達したが、吸着抑制剤を含まない混合液ｂ－５－２では、エタノールの濃度が２９ｇ／Ｌに留まった。
「実験例６」
水蒸気爆砕バガス５ｇ－ｄｒｙを、ｐＨが５の酢酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液と混合して、混合液ａ－６を調製した。
混合液ａ－６に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり４０ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加し、発酵菌として酵母菌を、ＯＤ３となるように添加して、バイオマススラリー、分解酵素、吸着抑制剤および発酵菌を含む混合液ｂ－６－１を調製した。これにより、混合液ｂ－６－１において、セルロースの濃度を６０ｇ／Ｌに調整した。
また、混合液ａ－６に、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり２０ｍｇ添加し、吸着抑制剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり１０ｍｇ添加し、発酵菌として酵母菌を、ＯＤ３となるように添加して、バイオマススラリー、分解酵素、吸着抑制剤および発酵菌を含む混合液ｂ－６－２を調製した。これにより、混合液ｂ－６－２において、セルロースの濃度を６０ｇ／Ｌに調整した。
ここで、水蒸気爆砕バガス中のセルロース濃度を測定することにより、混合液ｂ－６－１および混合液ｂ－６－２におけるセルロースの濃度を算出した。
混合液ｂ－６－１と混合液ｂ－６－２をそれぞれ、振盪機で穏やかに振盪させながら、５０℃にて２０日間保持して、セルロースを分解酵素により分解した。また、反応開始から３日後に、混合液ｂ－６－１および混合液ｂ－６－２に、水蒸気爆砕バガス５ｇ－ｄｒｙを追加した。水蒸気爆砕バガスを追加する際、混合液ｂ－６－２には、分解酵素としてセルラーゼを、バイオマス１ｇ-ｄｒｙ当たり２０ｍｇ添加した。
酵素分解反応中、所定時間毎に、セルロースの酵素分解によって得られたグルコースを主成分とする糖類の濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。結果を図４に示す。
図４の結果から、反応初期にセルラーゼを４０ｍｇ添加し、反応中にセルラーゼを添加しない混合液ｂ－６－１では、エタノールの濃度が４６ｇ／Ｌに達したが、反応初期にセルラーゼを２０ｍｇ添加し、反応中にセルラーゼを２０ｍｇ添加した混合液ｂ－６－２では、エタノールの濃度が３７ｇ／Ｌに留まった。
バイオマスを含むスラリーの流動性を維持しつつ、分解酵素の使用量を削減することができ、高濃度の糖類を製造することができる糖類の製造方法および高濃度のエタノールを製造することができるエタノールの製造方法に関する。

Claims (4)

  1. 　バイオマスを含むスラリーに、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素を添加し、前記バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、前記分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造する方法であって、
    　前記スラリーと、前記分解酵素と、前記バイオマスに含まれるリグニンへ前記分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、前記セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持する糖類の製造方法。
  2. 　反応初期に前記分解酵素を全量添加し、反応中に前記分解酵素を添加しない請求項１に記載の糖類の製造方法。
  3. 　バイオマスを含むスラリーに、セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の分解酵素と発酵菌を添加し、前記バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方を、前記分解酵素で分解して、グルコースを主成分とする糖類を製造し、当該糖類からエタノールを製造する方法であって、
    前記スラリーと、前記分解酵素と、前記発酵菌と、前記バイオマスに含まれるリグニンへ前記分解酵素が吸着するのを防止するための吸着抑制剤と、を含む混合液において、前記セルロースおよびヘミセルロースの少なくともいずれか一方の濃度を７５ｇ／Ｌ以下に保持するエタノールの製造方法。
  4. 　反応初期に前記分解酵素を全量添加し、反応中に前記分解酵素を添加しない請求項３に記載のエタノールの製造方法。
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