WO2016137275A2 - 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 억제 활성 증진 방법 - Google Patents

골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 억제 활성 증진 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2016137275A2
WO2016137275A2 PCT/KR2016/001932 KR2016001932W WO2016137275A2 WO 2016137275 A2 WO2016137275 A2 WO 2016137275A2 KR 2016001932 W KR2016001932 W KR 2016001932W WO 2016137275 A2 WO2016137275 A2 WO 2016137275A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mdsc
cells
composition
tgf
bone marrow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2016/001932
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2016137275A3 (ko
Inventor
박성규
이초롱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gwangju Institute of Science and Technology
Original Assignee
Gwangju Institute of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gwangju Institute of Science and Technology filed Critical Gwangju Institute of Science and Technology
Publication of WO2016137275A2 publication Critical patent/WO2016137275A2/ko
Publication of WO2016137275A3 publication Critical patent/WO2016137275A3/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Definitions

  • the present invention was made by the task number HI14C1466 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research and management institution of the task is the Korea Health Industry Development Institute, the research project name is “advanced medical technology development”, the research title is "autoimmune disease cell therapy Development of MDSC differentiation technology for hematopoietic stem cell-derived function ”, Gwangju Institute of Science and Technology, research period is October 10, 2014 ⁇ September 30, 2016.
  • the present invention provides a composition for enhancing the immunosuppressive activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC), including immune regulatory T cells and / or transforming growth factor- ⁇ , and bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) using the same.
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • the present invention relates to a method for enhancing immune suppression activity, and an immunosuppressive composition comprising MDSC subpopulation differentiated by treatment of immune regulatory T cells and / or TGF- ⁇ .
  • MDSC Myeloid derived suppressor cells
  • CD11b + Gr1 + in mice CD11b + Gr1 + cells are usually present in small numbers in the bone marrow and spleen of healthy mice, but accumulate in the spleen, blood and lymph nodes in cancer and inflammatory diseases.
  • MDSC negatively regulates the immune response in tumor progression, inflammation, and bacterial or parasitic infections.
  • the morphological heterogeneity of MDSCs is distinguished by two antigenic epitopes recognized by Gr1 specific antibodies, Ly6G and Ly6C.
  • MDSCs are divided into two different subsets of Granulocytic MDSCs (Gr-MDSC; CD11b + Ly6G high Ly6C low ) and Monocytic MDSCs (Mo-MDSC; CD11b + Ly6G dim Ly6C high ), which have different distributions.
  • Gr-MDSC Granulocytic MDSC
  • Mo-MDSC Monocytic MDSCs
  • Gr-MDSC and Mo-MDSC of MDSC use different mechanisms to inhibit T cell proliferation.
  • Gr-MDSC expresses high levels of arginase 1 (ARG1) and produces free radicals (ROS), whereas Mo-MDSC is characterized by low levels of ARG1 and high levels of nitric oxide (NO).
  • ARG1 arginase 1
  • ROS free radicals
  • Mo-MDSC is characterized by low levels of ARG1 and high levels of nitric oxide (NO).
  • MDSC's inhibitory ability is in principle associated with the intracellular metabolism of L-arginine, which induces nitric oxide-inducible nitric oxide synthase (iNOS) and L-arginine to urea and L.
  • iNOS nitric oxide-inducible nitric oxide synthase
  • ARG1 which converts to ornithine, acts as a substrate for both enzymes.
  • ARG1-dependent immune regulatory mechanisms include a decrease in CD3z chain expression of T cells and induction of T cell arrest in the G0-G1 cell cycle.
  • NO produced in MDSC by iNOS involves disruption of the T cell active pathway through the IL-2 receptor.
  • are metabolized with by the two enzymes, mainly superoxide (O 2 -) and the by-product hydrogen peroxide (H 2 O 2) and hydrogen peroxide nitrite (ONOO -) is associated with the generation of free radicals that appear in the form of, such Free radicals can induce apoptosis of T cells.
  • the present inventors made an intensive research effort to develop a composition for enhancing immunosuppressive activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) and thereby bone marrow-derived suppressor cells with enhanced immunosuppressive activity.
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • the present invention was completed by elucidating that the immune suppressive activity of bone marrow-derived suppressor cells can be effectively enhanced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for enhancing immune suppression activity of bone marrow-derived suppressor cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing bone marrow-derived suppressor cells with enhanced immunosuppressive activity.
  • Another object of the present invention to provide an anti-inflammatory composition.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease (IBD).
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the present invention provides a method for treating bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) comprising at least one selected from immune regulatory T cells and transforming growth factor- ⁇ as active ingredients.
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • a composition for enhancing immunosuppressive activity is provided.
  • the present inventors made diligent research efforts to develop a composition for enhancing immune suppression activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC). As a result, it has been found that when one or more selected from immune regulatory T cells and TGF- ⁇ is treated with bone marrow-derived suppressor cells (MDSC), the immunosuppressive activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) can be effectively enhanced.
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • MDSC myeloid derived suppressor cell
  • various cells such as macrophages, granulocytes, dendritic cells, and precursors of bone marrow cells are mixed at an early stage of differentiation.
  • MDSC is defined as CD11b + Gr1 + in mice.
  • CD11b + Gr1 + cells are usually present in small numbers in the bone marrow and spleen of healthy mice, but accumulate in the spleen, blood and lymph nodes in cancer and inflammatory diseases.
  • Bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) of the present invention are known to play an important role in the regulation of immune responses in cancer or inflammatory conditions, and are known to play an important role in the differentiation and function of immune regulatory T cells (Treg cells).
  • Treg cells immune regulatory T cells
  • the role of immune regulatory T cells in the differentiation and function of conventional bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) has not been reported.
  • the “transforming growth factor- ⁇ ” of the present invention is a protein that regulates proliferation, cell differentiation and other functions in most cells. During the inflammatory response, immune regulatory T cells produce anti-inflammatory cytokines such as TGF- ⁇ and IL-10 for the regulation of immune responses.
  • the "immune regulatory T cells” of the present invention are subpopulations of T cells that control the immune system and are used for protection from autoimmunity through maintenance of self-tolerance and inhibition of self-reactive cells. It is known to play an important role, and it is known that immune regulatory T cells derived from thymus (tTreg cells; CD4 + CD25 + Foxp3 + Nrp1 + ) and peripherally derived immune regulatory T cells (pTreg cells; CD4 + CD25 + Foxp3 + Nrp1 ⁇ There are two main types of). tTreg cells are derived from the thymus, and pTreg cells are derived from peripheral CD4 + CD25-T cells in the presence of IL-2 and TGF- ⁇ . The immune regulatory T cells express surface markers such as CD4 and CD25, and together with Foxp3, a specific transcription factor.
  • the present inventors have confirmed that in vitro and in vivo conditions, immune regulatory T cells or TGF- ⁇ enhance the immunosuppressive activity of MDSC.
  • the enhancement of the immunosuppressive activity of the present invention is by regulating the subpopulation differentiation of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC).
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • the morphological heterogeneity of MDSC is distinguished by two antigenic epitopes recognized by Gr1 specific antibodies, Ly6G and Ly6C.
  • This antigenic determinant site distinguishes MDSCs into two different subgroup Granulocytic MDSCs (Gr-MDSC; CD11b + Ly6G high Ly6C low ) and Monocytic MDSCs (Mo-MDSC; CD11b + Ly6G dim Ly6C high ), Has the function.
  • Gr-MDSC and Mo-MDSC which are subpopulations of MDSC, use different mechanisms to inhibit T cell proliferation.
  • Gr-MDSC expresses high levels of arginase 1 (ARG1) and produces free radicals (ROS), while Mo-MDSC is characterized by low levels of ARG1 and high levels of nitric oxide (NO).
  • ARG1 arginase 1
  • ROS free radicals
  • NO nitric oxide
  • the subpopulation differentiation control of the present invention is an increase regulation of Mo-MDSC (monocytic MDSC).
  • Mo-MDSC monocytic MDSC
  • any one or more treatments selected from immunoregulatory T-cells and TGF- ⁇ affect the subpopulation differentiation of the MDSC population as described above. It was found to be enhanced.
  • Mo-MDSC plays an important role in order for MDSC to have enhanced immunosuppressive activity, and in MDSC in which TGF- ⁇ derived from immunoregulatory T cells, more specifically, immunoregulatory T cells, is totally differentiated It was found to significantly increase the ratio of Mo-MDSC.
  • TGF- ⁇ was found to be able to significantly increase the production of molecules such as iNOS, TGF- ⁇ , IL-10 involved in the immune suppression produced by Mo-MDSC.
  • the composition of the invention increases the PD-L1 surface expression of Mo-MDSC.
  • PD-L1 programmed death-ligand 1
  • PD-L1 is known to play an important role in suppressing immunity in disease states such as pregnancy, autoimmune diseases and hepatitis, and is known as an important surface molecule in the regulation of MDSC-mediated immune regulation.
  • composition of the present invention may include any suitable carrier and / or additive known in the art.
  • suitable carrier for example, sterile water, saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants, surfactants, suspending agents, isotonic agents, preservatives, and the like can be included.
  • organic materials such as biopolymers, inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers and chemical derivatives thereof, and mixed compositions thereof may be used. However, it is not limited thereto.
  • dextran 40 methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, sodium metasulfate, etc.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbic acid palmitate, and L-ascorbic acid.
  • Chelating agents such as acid stearate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triacyl gallate, propyl gallate or sodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate and sodium metaphosphate can be used.
  • the suspending agent may be, for example, methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragantmal, sodium carboxymethylcellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate and the like.
  • the isotonic agent for example, D-mannitol, sorbitol and the like can be used.
  • the preservative for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol and the like can be used.
  • the present invention comprises the steps of treating any one or more selected from immune regulatory T cells (Treg cells) and TGF- ⁇ (transforming growth factor- ⁇ ) to bone marrow-derived suppressor cells (MDSC)
  • Treg cells immune regulatory T cells
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • the "treatment" of the present invention in the environment in which bone marrow cells capable of differentiating into bone marrow-derived suppressor cells (MDSCs) differentiate into MDSCs, adds one or more selected from immune regulatory T cells and TGF- ⁇ or is immune to differentiated MDSCs.
  • TGF- ⁇ any one or more selected from regulatory T cells and TGF- ⁇ , for example, MDSC differentiation condition medium of bone marrow cells, storage and / or culture medium of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC)
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • immune regulatory T cells and TGF- ⁇ it can be carried out by adding any one or more selected from immune regulatory T cells and TGF- ⁇ , and it is also possible to include immune regulatory T cells and / or TGF- ⁇ in the medium in advance.
  • Immune regulatory T cells produce TGF- ⁇ , are involved in the regulation of subpopulation differentiation of MDSCs, and produce TGF- ⁇ educated Mo-MDSCs.
  • the term “educated” used herein to refer to Mo-MDSC treated with TGF- ⁇ refers to a change that enhances the immunosuppressive activity of Mo-MDSC by contacting Mo-MDSC with TGF- ⁇ , Specifically, the transition to a state where increased production of molecules such as iNOS, TGF- ⁇ , IL-10, and increased surface expression of PD-L1 (programmed death-ligand 1) in Mo-MDSC is observed. it means.
  • Mo-MDSC trained in TGF- ⁇ may be described briefly as "Mo-MDSC / TGF- ⁇ " herein.
  • Mo-MDSC / TGF- ⁇ has a significantly increased immunosuppressive activity compared to normal Mo-MDSC.
  • bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) of the present invention are cells in which bone marrow cells isolated from mammalian animals are differentiated by in vitro culture. Methods for separating bone marrow cells from mammals and differentiating bone marrow cells separated by in vitro culture into bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) can be used without limitation.
  • the treatment of the invention is carried out in vitro .
  • the storage and / or culture medium of the bone marrow-derived suppressor cells can be carried out by additionally adding any one or more selected from immune regulatory T cells and TGF- ⁇ . It is also possible to include immune regulatory T cells and / or TGF- ⁇ in the medium in advance.
  • the method of enhancing immune suppression activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC) of the present invention is a method of using immunomodulatory T cells and / or TGF- ⁇ which is an active ingredient of the composition for enhancing immunosuppressive activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC).
  • overlapping contents will be omitted in order to avoid excessive complexity of the description of the present specification.
  • the present invention provides a composition for immunosuppression comprising a bone marrow-derived inhibitory cell (MDSC) subpopulated by treatment of any one or more of immune regulatory T cells and TGF- ⁇ as an active ingredient. to provide.
  • MDSC bone marrow-derived inhibitory cell
  • Small group differentiation of the present invention is an increased differentiation of Mo-MDSC (monocytic MDSC) as described above in another aspect of the present invention. Since the composition of the present invention relates to a composition comprising the above-described composition for enhancing the MDSC immunosuppressive activity or a small-group differentiated MDSC prepared using the immunosuppressive activity-promoting method described above as an active ingredient, Omitted to avoid excessive complexity of the description herein.
  • Mo-MDSC monocytic MDSC
  • the present invention provides a composition for immunosuppression comprising an immunomodulatory T-cell or TGF- ⁇ -educated Mo-MDSC as an active ingredient.
  • the term “educated” used herein to refer to Mo-MDSC treated with immune regulatory T cells or TGF- ⁇ is referred to by the contact of Mo-MDSC with 'immune regulatory T cells or TGF- ⁇ '. Changes that enhance the immunosuppressive activity of Mo-MDSC, specifically, for example, increased production of molecules such as iNOS, TGF- ⁇ , IL-10, and PD-L1 (programmed death-ligand 1) in Mo-MDSC Transition to a state in which increased surface expression or the like is observed.
  • Mo-MDSCs which have been trained in immunoregulatory T cells, are understood to be Mo-MDSCs that have been trained in TGF- ⁇ substantially derived from immunoregulatory T cells, and are simply referred to as Mo-MDSCs that have been trained in TGF- ⁇ . In the case of description, it means both treated with immune regulatory T cells or directly treated with TGF- ⁇ .
  • Mo-MDSC trained in TGF- ⁇ may be described briefly as "Mo-MDSC / TGF- ⁇ " herein. Mo-MDSC / TGF- ⁇ has a significantly increased immunosuppressive activity compared to normal Mo-MDSC.
  • Mo-MDSC trained of the immunoregulatory T cells or TGF- ⁇ of the present invention has increased PD-L1 surface expression compared to untrained Mo-MDSC.
  • PD-L1 programmed death-ligand 1
  • the immunosuppressive composition comprising the present invention, an immunomodulatory T-cell or TGF- ⁇ -educated Mo-MDSC as an active ingredient, may be any of the above-described immunomodulatory T-cells and TGF- ⁇ .
  • an immunosuppressive composition comprising, as an active ingredient, bone marrow-derived suppressor cells (MDSCs) that have been subpopulated by one or more treatments, among the subpopulations of MDSCs, particularly Mo- trained immune modulator T cells or TGF- ⁇ .
  • MDSCs bone marrow-derived suppressor cells
  • the present invention relates to an immunosuppressive composition including MDSC as an active ingredient, and overlapping contents thereof will be omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides an anti-inflammatory composition comprising the above-described immunosuppressive composition as an active ingredient.
  • Inflammatory diseases to which the anti-inflammatory composition of the present invention can be applied include multiple sclerosis, asthma, eczema, psoriasis, allergy, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, atopic dermatitis, psoriasis, acne, atopic rhinitis, allergic dermatitis,
  • Inflammatory skin diseases including chronic sinusitis and seborrheic dermatitis, osteoarthritis, gastritis, gout, gouty arthritis, ulcers, chronic bronchitis, acute lung injury, pneumonia, airway hypersensitivity, Crohn's disease and ulcerative colitis
  • Acute or chronic inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease, ankylosing spondylitis, pneumonia, pulmonary shock, vasculitis and bursitis; Atherosclerosis; osteoporosis; Cancer, including
  • the present invention is any one or more prophylactic or therapeutic pharmaceutical selected from the group consisting of inflammatory bowel disease (IBD), multiple sclerosis and arthritis comprising the above-described immunosuppressive composition as an active ingredient
  • IBD inflammatory bowel disease
  • Inflammatory bowel disease refers to ulcerative diseases that develop in the colon and distal small intestine. It causes chronic inflammation that causes various symptoms in the intestine, and inflammation can affect other organs as well as the gut. Symptoms appear and disappear repeatedly and are known to last a lifetime.
  • Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease that damages the area around the fatty myelin around the axons of the brain and spinal cord, resulting in dehydration and scarring.
  • arthritis that can be prevented or treated by the immunosuppressive composition of the present invention means inflammatory arthritis, and specifically includes, for example, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and gouty arthritis, which are a kind of acute or chronic inflammatory disease.
  • the inflammatory bowel disease of the present invention is Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • Crohn's disease and ulcerative colitis are related diseases.
  • Crohn's disease in the present invention is a disease that can occur in the entire area of the intestine, from the mouth to the anus, and most commonly occurs in the lower part of the small intestine (the intestine) and the colon.
  • Ulcerative colitis in the present invention occurs confined to the colon (colon), in particular a thin layer inside the colon wall. Inflammation begins at the bottom of the colon (the rectum) and continues to expand upwards.
  • the composition of the present invention it is possible to effectively prevent or treat the above-described inflammatory bowel disease.
  • the anti-inflammatory composition and the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease may include a pharmaceutically acceptable carrier and / or additives and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, sterile water, saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants, surfactants, suspending agents, isotonic agents, preservatives, and the like can be included.
  • organic materials such as biopolymers, inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers and chemical derivatives thereof, and mixed compositions thereof may be used. However, it is not limited thereto.
  • dextran 40 methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, sodium metasulfate, etc.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbic acid palmitate, and L-ascorbic acid.
  • Chelating agents such as acid stearate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triacyl gallate, propyl gallate or sodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate and sodium metaphosphate can be used.
  • the suspending agent may be, for example, methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragantmal, sodium carboxymethylcellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate and the like.
  • the isotonic agent for example, D-mannitol, sorbitol and the like can be used.
  • the preservative for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol and the like can be used.
  • composition of the present invention may be parenterally administered, specifically, for example intravenously.
  • the composition of the invention should be formulated in a formulation suitable for intravenous injection.
  • the composition of the present invention is preferably dissolved in a pharmaceutically acceptable aqueous solution or frozen in solution. Specifically, for example, it may be dissolved in distilled water, saline or PBS, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention may contain a stabilizer or an adsorption agent, may include a analgesic agent capable of reducing pain upon injection, and a suitable device may be used if necessary.
  • the form of cell therapy using the composition of the present invention may be in the form of a final injection in a syringe or device, in the form of a cryoial, which can be frozen, or a pyrogen-free glass bottle and rubber field, an aluminum cap that can contain liquid medicine. It can be filled in the form.
  • a syringe, a multi-syringe, or the like may be used, and a device including a needle of a size suitable for intravenous injection of a composition containing cells may be appropriately selected and used.
  • Suitable dosages of the compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. have.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.0001-100 mg / kg (body weight) per day.
  • the anti-inflammatory composition and the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease include the immunosuppressive composition, which is another embodiment of the present invention, as an active ingredient, and the overlapping content is excessively complex as described in the present specification. Omit to avoid.
  • the present invention provides an anti-inflammatory agent comprising bone marrow-derived suppressor cells (MDSCs) subpopulated by treatment of at least one selected from immune regulatory T cells and TGF- ⁇ as active ingredients.
  • MDSCs bone marrow-derived suppressor cells
  • a method for preventing or treating an inflammatory disease comprising treating the composition with a subject having an inflammatory disease.
  • the subpopulation differentiation of the present invention is increased differentiation of Mo-MDSC (monocytic MDSC).
  • the method of the present invention corresponds to a method of using the anti-inflammatory composition, which is another aspect of the present invention, the overlapping content will be omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention is to treat an anti-inflammatory composition comprising an immunomodulatory T-cell or TGF- ⁇ -Educated Mo-MDSC as an active ingredient to a subject with an inflammatory disease It provides a method for preventing or treating an inflammatory disease comprising the step of.
  • the educated Mo-MDSC of the present invention is an increased PD-L1 surface expression compared to the untrained Mo-MDSC.
  • the method of the present invention corresponds to a method of using the anti-inflammatory composition of another embodiment of the present invention described above, the overlapping content will be omitted to avoid excessive complexity of the description.
  • the present invention provides an inflammatory bowel disease comprising administering a pharmaceutical composition comprising the above-described immunosuppressive composition as an active ingredient to a subject having inflammatory bowel disease (IBD).
  • a pharmaceutical composition comprising the above-described immunosuppressive composition as an active ingredient to a subject having inflammatory bowel disease (IBD).
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the inflammatory bowel disease of the present invention is Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • the method of the present invention corresponds to a method of using the composition for the prevention or treatment of inflammatory bowel disease (IBD), which is another aspect of the present invention, the overlapping description will be omitted to avoid excessive complexity of the present specification. .
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the present invention provides a composition for enhancing immune suppression activity of bone marrow-derived suppressor cells (MDSC).
  • MDSC bone marrow-derived suppressor cells
  • the present invention provides a method for enhancing immune suppression activity of bone marrow-derived suppressor cells.
  • the present invention provides an immunosuppressive composition comprising MDSC with enhanced immunosuppressive activity.
  • the present invention provides an anti-inflammatory composition or a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease (IBD).
  • IBD inflammatory bowel disease
  • composition for enhancing MDSC immunosuppressive activity of the present invention or the method for enhancing immunosuppressive activity, it is possible to effectively enhance the immunosuppressive activity of MDSC.
  • FIG. 1A shows that Pdk1 gene knockout mice showing enteritis show an increased frequency of rectal prolapse when compared to wild-type sibling mice grown in the same cage.
  • FIG. 1B shows pictures of severe intestinal inflammation in the intestine of Pdk1 gene knockout mice 10 weeks of age or older .
  • 1C, 1D and 1E show that the CD11b + Gr1 + MDSC population gradually increases as the intestinal inflammation intensifies as the mouse ages.
  • Pdk1 Similar ratios of MDSC populations were found in the spleen and lymph nodes of genetic knockout mice and wild type sibling mice, but in older mice (10+ weeks of age) Pdk1.
  • gene knockout mice showed a sharp increase in the MDSC population in the spleen and lymph nodes.
  • FIGS. 2A and 2B show 10 week old Pdk1 flox / flox with or without adoptive transfer of wild type Treg cells ; Cd4 - Cre (A) Pictures of the colon and (b) histological grades of mice (flox / flox) and litter offspring controls are shown.
  • 2C shows Pdk1 flox / + with or without adoptive transfer of wild type Treg cells; CD4- Cre (flox / +) and Pdk1 flox / flox ; Flow cytometry analysis of MDSC subpopulations in CD4-Cre (flox / flox) mice is shown.
  • 2D shows body weight change (%) after adoptive delivery of MDSC on the last day of DSS injected mice (mouse population n per group is 7-10).
  • 2E shows colon length measured at day 11 in DSS treated mice after adoptive delivery of MDSC.
  • FIG. 2F and 2G show colon pictures (FIG. 2F) and histological grade (FIG. 2G) of experimental colitis of DSS induction after delivery of the indicated MDSCs (mouse population n per group is 5).
  • 2H shows the measurement of cytokine levels in colon fragments from DSS treated mice (mouse population n per group is 3). Results are expressed as mean ⁇ SD. *, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01 (Student's t test).
  • 3A and 3B show the relative mRNA levels of (a) TGF- ⁇ and (b) IL-10 in Treg cells after activation with anti-CD3 and anti-CD28.
  • 3C shows Pdk1 flox / + ; CD4- Cre (flox / +) and Pdk1 flox / flox ; Relative mRNA levels of iNOS in Mo-MDSC from the spleen of CD4- Cre (flox / flox) mice are shown.
  • 3D shows Pdk1 flox / + ; CD4- Cre (flox / +) and Pdk1 flox / flox ; Relative mRNA levels of ARG1 in Mo-MDSC and Gr-MDSC from the spleen of CD4- Cre (flox / flox) mice are shown.
  • 3E shows Pdk1 flox / + ; CD4- Cre (flox / +) and Pdk1 flox / flox ; Flow cytometry analysis of PD-L1 expression on MDSC subpopulation in the spleen of CD4- Cre (flox / flox) mice is shown.
  • 3F shows Pdk1 flox / + ; CD4- Cre (flox / +) and Pdk1 flox / flox ;
  • Flow cells of in vitro -induced Treg cells (iTreg) after stimulation with anti-CD3, anti-CD28, and TGF- ⁇ with Mo-MDSC and Gr-MDSC from the spleen of CD4- Cre (flox / flox) mice Indicates an analysis. Results are expressed as mean ⁇ SD. *, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01 (Student's t test).
  • FIG. 4A shows flow cytometry of bone marrow cells cultured in the absence of GM-CSF, IL-4 and 2-ME with or without Treg cells.
  • 4B shows flow cytometry of differentiated bone marrow derived suppressor cells (MDSCs) in the presence of Treg cells and GM-CSF, IL-4 and 2-ME with or without anti-TGF- ⁇ .
  • MDSCs differentiated bone marrow derived suppressor cells
  • 4C shows flow cytometry of bone marrow derived suppressor cells (MDSC) with or without treatment with Treg cell associated cytokines TGF- ⁇ and IL-10.
  • MDSC bone marrow derived suppressor cells
  • 4D shows the number of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) with or without Treg cell associated cytokines TGF- ⁇ and IL-10.
  • 4E shows the cell numbers of each subpopulation of bone marrow-derived suppressor cells (MDSCs) either untreated or treated with TGF- ⁇ .
  • 4F shows flow cytometry analysis of proliferation of CFSE-labeled bone marrow derived Mo-MDSC or Gr-MDSC either untreated or treated with TGF- ⁇ .
  • 5A shows flow cytometry analysis of mature myeloid markers on or without treatment with TGF- ⁇ and differentiated on differentiated bone marrow derived suppressor cells (MDSC).
  • MDSC differentiated bone marrow derived suppressor cells
  • FIG. 5B shows Wright-Giemsa staining results of differentiated bone marrow-derived suppressor cells (MDSC), either untreated or treated with TGF- ⁇ .
  • MDSC differentiated bone marrow-derived suppressor cells
  • 5C, 5D and 5E show iNOS (FIG. 5C), TGF- ⁇ (FIG. 5D) and IL-10 (FIG. 5) in bone marrow-derived Mo-MDSCs treated with or without TGF- ⁇ after LPS stimulation. Relative mRNA levels of 5e).
  • 5F shows the relative mRNA levels of ARG1 in bone marrow derived Mo-MDSC and Gr-MDSC, either untreated or treated with TGF- ⁇ .
  • 5G shows ARG1 activity in bone marrow derived Mo-MDSC and Gr-MDSC either untreated or treated with TGF- ⁇ .
  • FIG. 5H shows PD- on subpopulations of bone marrow derived suppressor (MDSC) subpopulations differentiated by treatment with LPS, GM-CSF + IL-4 or GM-CSF + IL-4 + LPS, either untreated or treated with TGF- ⁇ .
  • MDSC bone marrow derived suppressor
  • 6F shows flow cytometry analysis of Treg cells in the spleen of DSS treated mice after adoptive delivery of bone marrow derived Mo-MDSC or Mo-MDSC / TGF- ⁇ .
  • 6G shows a flow cytometry analysis of proliferation of CFSE-labeled tTreg cells after stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 in the presence of bone marrow derived Mo-MDSC or Mo-MDSC / TGF- ⁇ . Results are expressed as mean ⁇ SD. *, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01 (Student's t test).
  • FIG. 9 shows a DSS-induced enteritis model for testing the function of bone marrow-derived Mo-MDSC or bone marrow-derived Mo-MDSC / TGF- ⁇ .
  • FIG. 10 shows photographs of the colon from a DSS-induced enteritis model for testing the function of bone marrow-derived Mo-MDSC or bone marrow-derived Mo-MDSC / TGF- ⁇ .
  • FIG. 11 shows Treg population analysis from DSS-induced enteritis model to test the function of bone marrow-derived Mo-MDSC or bone marrow-derived Mo-MDSC / TGF- ⁇ .
  • Splenocytes were extracted from mice displaying Treg cells (CD4 + CD25 + Foxp3 + ), tTreg cells (CD4 + CD25 + Foxp3 + Nrp1 + ), and pTreg cells (CD4 + CD25 + Foxp3 + Nrp1 ⁇ ) Analyzed by analysis.
  • Pdk1 flox / flox mice were bred with CD4 - Cre transgenic mice, and descendants were Pdk1 flox / flox ; CD4 - Cre and Pdk1 flox / + ; Breeding with Pdk1 flox / flox mice to obtain CD4 - Cre . All mice were maintained in certain pathogen-free conditions at the GIST animal care facility. MDSCs were stained with MDSC-specific surface markers and isolated by FACSAria III equipment (BD Bioscience).
  • Example 2 of MDSCs from Bone Marrow In vitro differentiation
  • Bone marrow cells were isolated from C57BL / 6 mice and cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 10 ng / ml GM-CSF, 10 ng / ml IL-4 and 50 ⁇ M 2-ME. Cultures were stored in 24-well plates at 37 ° C., 5% CO 2 humidity environment. Cells were collected at 3-5 days and analyzed by flow cytometry.
  • FBS fetal bovine serum
  • 10 ng / ml GM-CSF 10 ng / ml IL-4 and 50 ⁇ M 2-ME.
  • Cultures were stored in 24-well plates at 37 ° C., 5% CO 2 humidity environment. Cells were collected at 3-5 days and analyzed by flow cytometry.
  • CD4 + CD25 + lymph node cells from CD4 - Cre mice were stained with fluorochrome-conjugated anti-mouse CD4 and anti-mouse CD25 antibodies and then sorted on FACSAria III instrument (BD Bioscience).
  • Tregs were obtained from CD4 + CD25 ⁇ T-cells from C57BL / 6 mice by stimulation with plate-attached anti-CD3 and anti-CD28 for 54 hours in the presence of TGF- ⁇ (1 ng / ml).
  • Wild-type Treg cells (CD4 + CD25 +) were isolated from the lymph nodes of C57BL / 6 mice by FACSAria III equipment (BD Bioscience). Pdk1 flox / flox ; CD4 - Cre or Pdk1 flox / + ; CD4-Cre mice were injected intravenously 2-3 times with isolated wild-type Treg cells.
  • Isolated or differentiated cells were stained with labeled antibodies and analyzed on FACS CantoII instrument (BD Biosciences) or Guava instrument (Millipore). Living cells were formed with inlets by front and side scatter. For intracellular staining for Foxp3, cells were fixed and permeated Foxp3 staining buffer (eBioscience). Data was analyzed using FlowJo software.
  • ARG1 activity was measured on cell lysates.
  • Cells were lysed with 100 ⁇ l of 0.1% Triton X-100 for 30 minutes.
  • 100 ⁇ l of 25 mM Tris-HCl and 10 ⁇ l of 10 mM MnCl 2 were then added and the enzyme was activated by heating at 56 ° C. for 10 minutes.
  • Arginine hydrolysis was performed by incubating the lysate at 37 ° C. for 2 hours with 100 ⁇ l of 0.5 M L-arginine (pH 9.7).
  • the reaction was stopped using 900 ⁇ l of H 2 SO 4 (96%) / H 3 PO 4 (85%) / H 2 O (1/3/7, v / v / v).
  • Urea concentrations were measured at 540 nm after heating at 95 ° C. for 30 minutes after addition of 40 ⁇ l of ⁇ -isonitrosopropiophenone (dissolved in 100% ethanol).
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • CFSE eBiocsience
  • mice After the sacrifice of mice, colons were removed and segments of colon tissue normalized to 1 cm ⁇ 1 cm were washed in penicillin and streptomycin (Gibco) supplemented cold PBS. The segments were incubated in 24-well flat-bottom culture plates in serum-free RPMI 1640 medium (HyClone) supplemented with penicillin and streptomycin. After 24 hours, supernatants were collected to measure production of IFN- ⁇ , IL-17A and IL-10 using Cytometric Bead Array kits (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions. Standard curves were obtained using lyophilized recombinant murine cytokines, respectively.
  • Scoring of observed epithelial damage was defined as follows: 0, no infiltration by normal or neutrophils; 1, rare epithelial lesions (focal surface area or rare cryptitis); 2, foci of glanditis, including rare glands and crypt abscess; 3, multiple glands and boils and / or lesion ulceration; And 4, extensive ulcers.
  • MDSC is T cell specific Pdk1 Increased in naturally induced enteritis induced mice with genes removed.
  • PDK1 plays an essential role in CD4 T cell activity through CD28 co-receptor signal transduction that induces NF-kB activity. Therefore, T cell specific Pdk1 gene deficiency by CD4 - Cre weakens CD4 T cell activity and decreases immune regulatory T cell function. Functional deficiency in fact, such an immunomodulatory T cell Pdk1 Since it does not regulate the activity of TCR ⁇ + T cells that have not been removed, they induce enteritis naturally in Pdk1 gene knockout mice. Pdk1 gene knockout mice showing enteritis showed an increased frequency of rectal escape compared to wild type sibling mice grown in the same cage (see FIG. 1A). Severe intestinal inflammation was observed in the intestine of Pdk1 gene knockout mice 10 weeks of age or older (see FIG. 1B).
  • MDSC Affects the subpopulation of Pdk1 It improves the immunomodulatory function of MDSC in gene knockout mice.
  • DSS dextran sodium sulfate
  • immune regulatory T cells produce anti-inflammatory cytokines such as TGF- ⁇ and IL-10 for the regulation of immune responses.
  • cytokines such as TGF- ⁇ and IL-10 for the regulation of immune responses.
  • Previous reports have shown a decrease in the production of anti-inflammatory cytokines in immunoregulatory T cells lacking PDK1.
  • PDK1 deficiency dramatically reduces the production of TGF- ⁇ (Fig. 3a) and IL-10 (Fig. 3b) mediated by anti-CD3 and anti-CD28 of immune regulatory T cells. It was confirmed.
  • MDSC also produces effector molecules such as iNOS and ARG1 for regulating T cell activity.
  • Pdk1 INOS expression in Mo-MDSC see FIG.
  • PD-L1 is a ligand of the inhibitory co-receptor (Programmed cell death 1) compared to wild type sibling mice, Pdk1 It was confirmed that the gene knockout mice were reduced in Mo-MDSC and Gr-MDSC (see FIG. 3E).
  • Programmed cell death 1 (PD-1) is an inhibitory co-receptor of immune cells and is essential for self-tolerance. Therefore, PD-L1 in MDSC plays an important role in inhibiting T cell activation and expansion and cytokine production.
  • MDSC In gene knockout mice, MDSC was found to have reduced activity regulating immune responses compared to wild type sibling mice. In addition to direct immune response regulation through the production of these immunomodulatory molecules of MDSC, MDSCs can indirectly affect immune responses by participating in the differentiation of regulatory immune T cells known to modulate immune responses. In vitro Under the conditions, MDSCs are used in iTreg cells ( in vitro Induces immune regulatory T cells). In our data Pdk1 MDSCs in Gene Knockout Mice in vitro Compared with wild-type sibling mice at, the ability to differentiate iTreg cells was reduced (see FIG. 3F).
  • TGF- ⁇ derived from T cells affects the differentiation of MDSCs derived from bone marrow cells.
  • Bone marrow cells can be differentiated into MDSC by incubating for 3-5 days with GM-CSF, IL-4 and 2-mercaptoethanol (2-ME) under in vitro conditions. MDSCs produced under in vitro conditions also have two subpopulations, Mo-MDSC and Gr-MDSC. To confirm the effect on the differentiation of MDSC subpopulation of immunoregulatory T cells, bone marrow cells were identified by differentiation into MDSC according to the presence or absence of immunoregulatory T cells in the presence or absence of GM-CSF, IL-4, and 2-ME. Addition of immune regulatory T cells did not differentiate into CD11b + Gr1 + MDSC in the absence of cytokines (FIG. 4A).
  • TGF- ⁇ decreased the ratio of Gr-MDSC and increased the ratio of Mo-MDSC in total differentiated MDSCs.
  • the absolute number of Gr-MDSCs did not decrease significantly because the number of total differentiated MDSCs increased (see FIGS. 4D and 4E). Instead, the total number of Mo-MDSCs was found to increase significantly in differentiated MDSCs (see Figure 4E).
  • TGF- ⁇ is involved in the expansion of Mo-MDSC, which was confirmed by confirming the proliferation of each population for TGF- ⁇ .
  • TGF- ⁇ plays an important role in increasing the immunosuppressive function of MDSC.
  • MDSCs Derived from myeloid progenitors (CMP), MDSCs do not completely differentiate into mature macrophages and dendritic cells.
  • CMP myeloid progenitors
  • Mo-MDSC derived from bone marrow cells produced molecules such as iNOS, TGF- ⁇ and IL-10, which are involved in immune suppression, and ARG1 was expressed in both Mo-MDSC and Gr-MDSC.
  • TGF- ⁇ is expressed as iNOS (see FIG. 5C), TGF- ⁇ (see FIG. 5D), IL-10 (see FIG. 5E), ARG1 (see FIG. 5F, 5G). It was confirmed that it can significantly increase the production of effector molecules, including.
  • PD-L1 was also identified as an important surface molecule in MDSC-mediated immune regulation, which is also expressed in MDSC derived from bone marrow cells, especially Gr-MDSC (see FIG. 5H). Surface expression of this PD-L1 was further increased in Mo-MDSC by TGF- ⁇ , whereas Gr-MDSC was not significantly affected (see FIG. 5H). It is presumably because PD-L1 expression in Gr-MDSC differentiated in vitro is already high.
  • Transplantation of TGF- ⁇ -trained Mo-MDSCs inhibits the production of cytokines such as IL-10, IL-17A, and IFN-g using supernatants from intestinal tissue cultures more than Mo-MDSC transplantation.
  • cytokines such as IL-10, IL-17A, and IFN-g
  • Immune modulating T cells during the inflammatory response in the intestine play an important role in controlling the inflammatory response.
  • a mouse model of enteritis that induced a population of immune regulatory T cells with DSS.
  • CD4 + Foxp3 + was confirmed that the population is reduced in the immune regulatory T cells, when transplanted Mo-MDSC trained in the Mo-MDSC and TGF- ⁇ derived from bone marrow cells, CD4 + Foxp3 + after DSS treatment It was confirmed that the population of immune regulatory T cells was increased compared to the control group treated with DSS (see FIGS. 6F and 11).
  • TGF- ⁇ -trained Mo-MDSC significantly increased the percentage of total immune regulatory T cells in the spleen compared to the transplantation of Mo-MDSC (see FIGS. 6F and 11).
  • TTreg (CD4 + Foxp3 + Nrp1 + ) cells in the population of immunoregulatory T cells significantly increased when transplanted with TGF- ⁇ -trained Mo-MDSC compared to the DSS-treated control group, whereas Mo-MDSC There was no significant increase in tTreg cells in the spleen when transplanted (see FIGS. 6F and 11).
  • Mo-MDSCs, trained in TGF- ⁇ were more capable of expanding immune regulatory T cells.
  • TGFbeta1 and Treg cells alliance for tolerance.
  • Elevated myeloid-derived suppressor cells in pancreatic, esophageal and gastric cancer are an independent prognostic factor and are associated with significant elevation of the Th2 cytokine interleukin-13. Cancer Immunol Immunother 60, 1419-1430.
  • CD49d is a new marker for distinct myeloid-derived suppressor cell subpopulations in mice. Journal of immunology 185, 203-210.
  • Myeloid-derived suppressor cells in inflammatory bowel disease a new immunoregulatory pathway. Gastroenterology 135, 871-881, 881 e871-875.
  • Gr-1 + CD115 + immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer research 66, 1123-1131.
  • the immunosuppressive tumour network myeloid-derived suppressor cells, regulatory T cells and natural killer T cells. Immunology 138, 105-115.
  • Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4 (+) Foxp3 (+) Treg expansion. Am J Transplant 13, 3123-3131.
  • Oxidative stress by tumor26 derived macrophages suppresses the expression of CD3 zeta chain of T-cell receptor complex and antigen-specific T-cell responses. Proceedings of the National 1 Academy of Sciences of the United States of America 93, 13119-13124.
  • Immune stimulatory receptor CD40 is required for T-cell suppression and T regulatory cell activation mediated by myeloid-derived suppressor cells in cancer. Cancer Res 70, 99-108.
  • T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity 33, 791-803.
  • the kinase PDK1 integrates T cell antigen receptor and CD28 coreceptor signaling to induce NF-kappaB and activate T cells. Nat Immunol 10, 158-166.
  • gammadelta T17 cells promote the accumulation and expansion of myeloid-derived suppressor cells in human colorectal cancer. Immunity 40, 785-800.

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 면역 조절 T세포(Treg cell) 및/또는 TGF-β(transforming growth factor-β)를 포함하는 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물, 이를 이용한 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진 방법, 및 면역 조절 T세포 및/또는 TGF-β의 처리에 의해 소집단(subpopulation) 분화된 MDSC를 포함하는 면역 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 면역 억제 활성이 증진된 MDSC를 얻을 수 있고, 이를 이용하여 면역 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 억제 활성 증진 방법
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI14C1466에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 “첨단의료기술개발”, 연구과제명은 “자가면역질환 세포치료를 위한 조혈줄기세포 유래 기능강화 MDSC분화 기술개발”, 주관기관은 광주과학기술원, 연구기간은 2014. 10. 01 ~ 2016. 9. 30이다.
본 특허출원은 2015년 2월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0027415호, 2015년 2월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2015-0027416호 및 2015년 2월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2015-0027417호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 면역 조절 T세포(Treg cell) 및/또는 TGF-β(transforming growth factor-β)를 포함하는 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물, 이를 이용한 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진 방법, 및 면역 조절 T세포 및/또는 TGF-β의 처리에 의해 소집단(subpopulation) 분화된 MDSC를 포함하는 면역 억제용 조성물에 관한 것이다.
골수 유래 억제 세포(Myeloid derived suppressor cell, MDSC)는 분화 초기 단계의 대식세포, 과립구, 수지상세포, 골수세포들의 전구체들로 구성되는 다양한 세포들의 혼합된 구성(population)이다. MDSC는 마우스에서 CD11b+Gr1+로 정의 되어진다. CD11b+Gr1+ 세포는 보통 건강한 마우스의 골수와 비장에서 적은 수로 존재하지만, 암이나 염증 질환에서는 비장, 혈액, 림프절에 축적된다. MDSC는 종양 진행, 염증, 박테리아나 기생충 감염 상태에서 면역 반응을 음성적으로 조절한다. MDSC의 형태학적 이질성은 Gr1 특이적 항체에 의해 인식되는 두 개의 항원 결정 부위(epitope), Ly6G와 Ly6C에 의해구별되어진다. 이러한 항원 결정 부위에 의해 MDSC를 2개의 다른 부분집합 Granulocytic MDSC(Gr-MDSC; CD11b+Ly6GhighLy6Clow)와 Monocytic MDSC(Mo-MDSC; CD11b+Ly6GdimLy6Chigh)로 구분하며, 이들은 서로 다른 분포와 기능을 가진다.
MDSC의 Gr-MDSC와 Mo-MDSC는 T 세포 증식을 억제하는 서로 다른기작을 사용한다. Gr-MDSC는 높은 수준의 아르기네이즈1(ARG1)을 발현하고 활성산소(ROS)를 생성하는 반면, Mo-MDSC는 낮은 수준의 ARG1과 높은 수준의 산화질소(NO)로 특징지어진다. MDSC의 억제 능력은 원칙적으로 L-아르지닌의 세포 내부 물질대사와 관련이 있는데, L-아르지닌은 산화질소를 생성하는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 L-아르지닌을 urea(요소)와 L-오르니틴으로 바꾸는 ARG1, 두 효소의 기질로서 작용한다. ARG1-의존적 면역 조절 기작은 T 세포의 CD3z 체인 발현의 감소와 G0-G1세포 주기의 T 세포 정지를 유도를 포함한다. 대조적으로iNOS에 의해 MDSC에서 생성된 NO는 IL-2 수용체를 통한 T 세포 활성 경로의 혼란을 포함한다. 게다가 두 효소에 의한 아르지닌 물질대사는 주로 초과산화물(O2 -)와 그 부산물인 과산화수소(H2O2)와 과산화아질산염 (ONOO-)의 형태로 나타나는 활성산소의 생성과 관련이 있으며, 이러한 활성산소는 T 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이에 의하여 면역 억제 활성이 증진된 골수 유래 억제 세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 면역 조절 T세포 및/또는 TGF-β를 골수 유래 억제 세포에 처리하는 경우, 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 억제 활성이 증진된 골수 유래 억제 세포의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 억제 활성이 증진된 골수 유래 억제 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 장질환(IBD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역 조절 T세포(Treg cell) 및 TGF-β(transforming growth factor-β) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 골수 유래 억제 세포(MDSC)에 처리하는 경우, 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 규명하였다.
본 명세서 상의 용어 “골수 유래 억제 세포(Myeloid derived suppressor cell, MDSC)”는 분화 초기 단계의 대식세포, 과립구, 수지상세포, 골수 세포들의 전구체 등 다양한 세포들이 혼합된 집단(population)을 의미한다. MDSC는 마우스에서는 CD11b+Gr1+로 정의된다. CD11b+Gr1+세포는 보통 건강한 마우스의 골수와 비장에서 적은 수로 존재하지만, 암이나 염증 질환에서는 비장, 혈액, 림프절에 축적된다.
본 발명의 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 암이나 염증 상태에서 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 면역 조절 T세포(Treg cell)의 분화와 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 종래 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 분화와 기능에 있어서의 면역 조절 T세포의 역할은 보고된 바 없었다.
본 발명의 “TGF-β(transforming growth factor-β)”는 대부분의 세포들에서의 증식, 세포 분화 및 다른 기능들을 조절하는 단백질이다. 염증반응 동안에 면역 조절 T세포(Treg cell)가 면역 반응 조절을 위한 TGF-β, IL-10 과 같은 항염증성 싸이토카인을 생산한다.
본 발명의 “면역 조절 T세포(Treg cell)”는 면역 시스템을 제어하는 T세포의 소집단(subpopulation)으로서 자기관용 유지와 자기 인식 세포(self-reactive cell)의 억제를 통한 자가면역으로부터의 보호에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 흉선에서 유래된 면역 조절 T세포(tTreg 세포; CD4+CD25+Foxp3+Nrp1+)와 말초에서 유래된 면역 조절 T세포(pTreg 세포; CD4+CD25+Foxp3+Nrp1-)의 두 주요 타입이 존재한다. tTreg 세포는 흉선에서 유래되며, pTreg 세포는 IL-2와 TGF-β가 존재할 때 말초에 있는 CD4+CD25- T 세포에서 유래된다. 상기 면역 조절 T세포는 CD4와 CD25와 같은 표면 마커를 발현하며, 이와 함께 특이적 전사인자인 Foxp3를 발현한다.
본 발명자들은 면역 조절 T세포 또는 TGF-β가 MDSC의 면역 억제 활성을 증진시킴을 in vitro 조건 및 in vivo 조건에서 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 면역 억제 활성 증진은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 소집단(subpopulation) 분화 조절에 의한 것이다. MDSC의 형태학적 이질성은 Gr1 특이적 항체에 의해 인식되는 두 개의 항원 결정 부위(epitope), Ly6G와 Ly6C에 의해 구별되어진다. 이러한 항원 결정 부위에 의해 MDSC를 2개의 다른 소집단 Granulocytic MDSC(Gr-MDSC; CD11b+Ly6GhighLy6Clow)와 Monocytic MDSC(Mo-MDSC; CD11b+Ly6GdimLy6Chigh)로 구분하며, 이들은 서로 다른 분포와 기능을 가진다. 기본적으로 MDSC의 소집단인 Gr-MDSC와 Mo-MDSC는 서로 다른 기작을 사용하여 T세포 증식을 억제한다. Gr-MDSC는 높은 수준의 arginase 1(ARG1)을 발현하고 활성산소(ROS)를 생성하는 반면, Mo-MDSC는 낮은 수준의 ARG1과 높은 수준의 산화질소(NO)로 특징지어진다. 본 발명자들은 MDSC에 대한 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 처리가 MDSC의 소집단인 Gr-MDSC와 Mo-MDSC로의 분화 양상을 조절하여 면역 억제 활성을 증진시킴을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 소집단 분화 조절은 Mo-MDSC(monocytic MDSC)의 증가 조절이다. 본 발명자들은 상술한 바와 같이 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 처리가 MDSC 집단(population)의 소집단 분화 양상에 영향을 끼친다는 사실을 규명하였고, 이를 통해 MDSC의 면역 억제 활성을 증진시킴을 규명하였다. 특히 본 발명자들은 MDSC가 증진된 면역 억제 활성을 갖기 위해서는 Mo-MDSC가 중요한 역할을 함을 규명하였고, 면역 조절 T세포, 더욱 구체적으로 면역 조절 T세포에서 유래한 TGF-β가 전체 분화되는 MDSC에서 Mo-MDSC의 비율을 현저히 증가시킴을 밝혀내었다. 또한 TGF-β는 Mo-MDSC가 생산하는 면역 억제에 관여하는 iNOS, TGF-β, IL-10과 같은 분자의 생산을 유의미하게 증가시킬 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 Mo-MDSC의 PD-L1 표면 발현을 증가시킨다. 본 발명자들은 상술한 바와 같이 TGF-β가 iNOS, TGF-β, IL-10과 같은 분자의 생산을 유의미하게 증가시키는 외에도 Mo-MDSC에서의 PD-L1(programmed death-ligand 1)의 표면 발현을 증가시킴을 확인하였다. PD-L1은 임신, 자가면역 질환 및 간염과 같은 질병 상태에서 면역을 억제하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, MDSC가 매개하는 면역 조절에서 중요한 표면 분자로 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 종래 알려진 적절한 담체 및/또는 첨가물 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제, 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 또한, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그 화학적 유도체, 그리고 이들의 혼합조성물을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 안정제로는 예를 들어, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 상기 산화방지제로는 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤,L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨,갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 사용할 수 있다. 상기 현탁제는 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 사용할 수 있다. 상기 등장화제로는 예를 들어, D-만니톨, 소르비톨 등을 사용할 수 있다. 상기 보존제로는 예를 들어, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역 조절 T세포(Treg cell) 및 TGF-β(transforming growth factor-β) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 골수 유래 억제 세포(MDSC)에 처리하는 단계를 포함하는, 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진 방법을 제공한다. 본 발명의 “처리”는 골수 유래 억제 세포(MDSC)로 분화 가능한 골수 세포가 MDSC로 분화하는 환경에서, 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가하거나, 분화된 MDSC에 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 접촉시키는 것에 의해 실시할 수 있고, 예를 들면, 골수 세포의 MDSC 분화 조건 배지, 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 보관 및/또는 배양용 배지에 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 넣어주어 실시할 수 있으며, 배지에 미리 면역 조절 T세포 및/또는 TGF-β를 포함시키는 것도 가능하다. 면역 조절 T세포는 TGF-β를 생성하고, MDSC의 소집단 분화 조절에 관여하며, TGF-β에 의해 교육을 받은(TGF-β educated) Mo-MDSC를 생산하게 된다. 본 명세서 상에서 TGF-β를 처리한 Mo-MDSC를 나타내기 위하여 사용한 용어 “교육을 받은(educated)”은 Mo-MDSC와 TGF-β의 접촉에 의해 Mo-MDSC의 면역 억제 활성을 증진시키는 변화, 구체적으로 예를 들어 iNOS, TGF-β, IL-10과 같은 분자의 생산의 증가, Mo-MDSC에서의 PD-L1(programmed death-ligand 1)의 표면 발현 증가 등이 관찰되는 상태로의 전환을 의미한다. TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC는 본 명세서 상에서 "Mo-MDSC/TGF-β"와 같이 간략하게 기재될 수 있다. Mo-MDSC/TGF-β는 일반적인 Mo-MDSC에 비하여 유의하게 증가된 면역 억제 활성을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 포유류 동물로부터 분리된 골수 세포를 in vitro 배양에 의해 분화시킨 세포이다. 골수 세포를 포유 동물로부터 분리하는 방법 및 in vitro 배양에 의해 분리된 골수 세포를 골수 유래 억제 세포(MDSC)로 분화 시키는 방법은 종래 공지된 방법을 제한없이 이용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 처리는 In vitro에서 이루어진다. 구체적으로 예를 들면, 상술한 바와 같이, 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 보관 및/또는 배양용 배지에 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 넣어주어 실시할 수 있으며, 배지에 미리 면역 조절 T세포 및/또는 TGF-β를 포함시키는 것도 가능하다.
본 발명인 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진 방법은 상술한 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물의 유효성분인 면역 조절 T세포 및/또는 TGF-β를 이용하는 방법에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중 어느 하나 이상의 처리에 의해 소집단(subpopulation) 분화된 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 유효 성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 소집단 분화는 본 발명의 다른 일 양태에서 상술한 바와 같이 Mo-MDSC(monocytic MDSC)가 증가된 분화이다. 본 발명의 조성물은 상술한 MDSC 면역 억제 활성 증진용 조성물을 처리하거나, 상술한 면역 억제 활성 증진 방법을 이용하여 제조된 소집단 분화된 MDSC를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 교육을 받은(educated) Mo-MDSC를 유효 성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물을 제공한다.
본 명세서 상에서 면역 조절 T세포 또는 TGF-β를 처리한 Mo-MDSC를 나타내기 위하여 사용한 용어 “교육을 받은(educated)”은 Mo-MDSC와 ‘면역 조절 T세포 또는 TGF-β’의 접촉에 의해 Mo-MDSC의 면역 억제 활성을 증진시키는 변화, 구체적으로 예를 들어 iNOS, TGF-β, IL-10과 같은 분자의 생산의 증가, Mo-MDSC에서의 PD-L1(programmed death-ligand 1)의 표면 발현 증가 등이 관찰되는 상태로의 전환을 의미한다. 면역 조절 T세포의 교육을 받은 Mo-MDSC는 실질적으로 면역 조절 T세포로부터 유래한 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC인 것으로 이해되며, 간단히 “TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC”라고 기재하는 경우에는 면역 조절 T세포를 처리하였거나 또는 TGF-β를 직접 처리한 것 모두를 의미한다.
TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC는 본 명세서 상에서 "Mo-MDSC/TGF-β"와 같이 간략하게 기재될 수 있다. Mo-MDSC/TGF-β는 일반적인 Mo-MDSC에 비하여 유의하게 증가된 면역 억제 활성을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC는 교육을 받지 않은 Mo-MDSC에 비하여 PD-L1 표면 발현이 증가된 것이다. 본 발명자들은 상술한 바와 같이 TGF-β가 iNOS, TGF-β, IL-10과 같은 분자의 생산을 유의미하게 증가시키는 외에도 Mo-MDSC에서의 PD-L1(programmed death-ligand 1)의 표면 발현을 증가시킴을 확인하였다.
본 발명인 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 교육을 받은(educated) Mo-MDSC를 유효 성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물은, 상술한 본 발명의 다른 양태인 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중 어느 하나 이상의 처리에 의해 소집단(subpopulation) 분화된 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 유효 성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물에 있어서, MDSC의 소집단 중 특히 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC를 유효성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물에 관한 것이고, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 면역 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다. 본 발명인 항염증용 조성물이 적용될 수 있는 염증성 질환은 다발성 경화증, 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 아토피성 비염, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염 및 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)을 포함하는 염증성 피부질환, 골관절염, 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 급성 폐손상, 폐염증, 기도 과민반응, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 폐혈증, 폐혈성 쇼크, 맥관염 및 활액낭염 같은 급성 또는 만성 염증 질환; 동맥경화증; 골다공증; 고형암을 포함하는 암; 알쯔하이머병; 엡스타인-바 바이러스, 거대세포 바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus), HIV 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스 감염증; 모세혈관 확장성 운동실조증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 면역 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환(IBD), 다발성 경화증 및 관절염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 염증성 장질환은 결장 및 원위 소장에서 발병하는 궤양성 질환을 의미한다. 장관에서의 다양한 증상을 유발하는 만성염증을 일으키는 원인이 되며, 염증이 장 뿐만 아니라 다른 기관에도 영향을 줄 수 있다. 증상이 나타났다가 사라지기를 반복하면서 평생 계속되는 질환으로 알려져 있다. 다발성 경화증은 만성 염증성 질환으로서, 뇌와 척수의 축삭 주변의 지방성 미엘린을 감싸는 부분이 손상을 입어서 탈수질환과 흉터형성으로 이어지는 염증질환이다. 한편, 본 발명의 면역 억제용 조성물에 의해 예방 또는 치료가 가능한 관절염은 염증성 관절염을 의미하고, 구체적으로 예를 들면 급성 또는 만성 염증 질환의 일종인 류마티스 관절염, 건선 관절염 및 통풍 관절염을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 결장염이다. 크론병과 궤양성 결장염을 서로 관련된 질환이다. 본 발명에서의 크론병은 입에서부터 항문에 이르기까지 장관의 전 영역에서 발생할 수 있는 질병으로서, 특히 소장(회장)의 하부와 결장에서 가장 흔하게 발생한다. 본 발명에서의 궤양성 결장염은 대장(결장), 특히 대장 벽 안쪽의 얇은 층에 한정되어 발생한다. 염증은 결장의 가장 밑 부분(직장)에서 시작되어 위쪽으로 지속적으로 확대된다. 본 발명인 조성물을 이용하면, 상술한 염증성 장질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
상술한 항염증용 조성물 및 염증성 장질환(IBD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가물 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제, 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 또한, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그 화학적 유도체, 그리고 이들의 혼합조성물을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 안정제로는 예를 들어, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 상기 산화방지제로는 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤,L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨,갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 사용할 수 있다. 상기 현탁제는 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 사용할 수 있다. 상기 등장화제로는 예를 들어, D-만니톨, 소르비톨 등을 사용할 수 있다. 상기 보존제로는 예를 들어, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여, 구체적으로 예를 들어, 정맥 투여할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 정맥 주사에 적당한 제형으로 조제되어야 한다. 이를 위해서는 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 수용액 중에 용해되어 있거나 또는 용액 상태에서 동결된 것이 바람직하다. 구체적으로 예를 들면, 증류수, 생리식염수 또는 PBS에 용해되어 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 안정화제나 흡착방지제를 함유할 수 있고, 주사시 통증을 감소시킬 수 있는 무통화제를 포함할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 디바이스를 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용한 세포치료제의 형태는 주사기나 디바이스에 담겨진 최종 주입 형태, 냉동이 가능한 크라이오바이알(cryovial)의 형태, 또는 액상의약품을 담을 수 있는 파이로젠이 없는 유리병과 고무전, 알루미늄 캡형태로 충진될 수 있다.
디바이스의 형태로는 주사기, 멀티실린지 등이 사용될 수 있으며 세포를 포함하는 조성물을 정맥 주사하는데 적합한 크기의 바늘을 포함하는 디바이스를 적절히 선택하여 사용 가능하다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.
상술한 항염증용 조성물 및 염증성 장질환(IBD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 본 발명의 다른 양태인 면역 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하며, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 처리에 의해 소집단(subpopulation) 분화된 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 염증성 질환을 갖는 대상(subject)에 처리하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 소집단 분화는 Mo-MDSC(monocytic MDSC)가 증가된 분화이다.
본 발명의 방법은 상술한 본발명의 다른 일 양태인 항염증용 조성물을 이용하는 방법에 해당하므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 교육을 받은(educated) Mo-MDSC를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 염증성 질환을 갖는 대상(subject)에 처리하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 교육을 받은 Mo-MDSC는 교육을 받지 않은 Mo-MDSC에 비하여 PD-L1 표면 발현이 증가된 것이다.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 항염증용 조성물을 이용하는 방법에 해당하므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 면역 억제용 조성물을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 염증성 장질환(IBD)을 갖는 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(IBD)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 결장염이다.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 염증성 장질환(IBD)의 예방 또는 치료용 조성물을 이용하는 방법에 해당하므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진 방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 면역 억제 활성이 증진된 MDSC를 포함하는 면역 억제용 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명은 항염증용 조성물 또는 염증성 장질환(IBD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
(e) 본 발명의 MDSC 면역 억제 활성 증진용 조성물 또는 면역 억제 활성 증진 방법을 이용하면 MDSC의 면역 억제 활성을 효과적으로 증진시킬 수 있다.
(f) 본 발명의 면역 억제 활성이 증진된 MDSC를 포함하는 면역 억제용 조성물을 이용하면 효과적으로 면역 반응을 억제시킬 수 있다.
도 1a는 장염을 보이는 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스는 같은 우리에서 자란 야생형의 형제 마우스와 비교하였을 때, 직장 탈출의 빈도수가 증가하는 양상을 보이는 결과를 나타낸다.
도 1b는 10주령 이상의 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 장에서 심각한 장의 염증 증세를 관찰한 사진을 나타낸다.
도 1c, 1d 및 1e는 CD11b+Gr1+ MDSC 집단(population)이 마우스가 나이가 들어감에 따라 장의 염증이 심화될 때, 점차 증가되는 결과를 나타낸다. 어린 나이의 마우스에서는(6령-8주령) Pdk1 유전자 녹아웃 마우스와 야생형의 형제 마우스의 비장과 림프절에서 유사한 비율의 MDSC population을 보였으나, 나이가 든 마우스에서는(10주령 이상의 마우스) Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 야생형의 형제 마우스와 비교하였을 때, 비장과 림프절에서 MDSC population의 급격한 증가를 보였다.
도 2a 및 2b는 야생형 Treg 세포의 입양 전달을 하거나 하지 않은 10주령의 Pdk1 flox/flox ; Cd4 - Cre 마우스(flox/flox) 및 한배 자손 대조군의 (a) 결장의 사진 및 (b) 조직학적 등급을 나타낸다.
도 2c는 야생형 Treg 세포의 입양 전달을 하거나 하지않은 Pdk1 flox /+; CD4 -Cre(flox/+) 및 Pdk1 flox / flox; CD4-Cre(flox/flox) 마우스에서의 MDSC 소집단의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 2d는 DSS 주입 마우스(그룹당 마우스 개체수 n은 7-10)의 마지막 날의 MDSC의 입양 전달 후의 체중 변화(%)를 나타낸다.
도 2e는 MDSC의 입양전달 후의 DSS 처리 마우스에서의 11일째에 측정된 결장 길이를 나타낸다.
도 2f 및 도 2g는 표시한 MDSC의 전달 후에 DSS 유도의 실험적 결장염의 결장 사진(도 2f) 및 조직학적 등급(도 2g)을 나타낸다(그룹당 마우스 개체수 n은 5).
도 2h는 DSS 처리 마우스로부터의 콜론 절편에서의 싸이토카인 수준의 측정을 나타낸다(그룹당 마우스 개체수 n은 3). 결과들은 평균±SD로 나타내었다. *, P<0.05; **, P<0.01(스튜던트 t 검정).
도 3a 및 3b는 항-CD3 및 항-CD28로 활성화한 후의 Treg 세포에서의 (a) TGF-β 및 (b) IL-10의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다.
도 3c는 Pdk1 flox /+; CD4 -Cre(flox/+) 및 Pdk1 flox / flox; CD4 -Cre(flox/flox) 마우스의 비장으로부터의 Mo-MDSC 내 iNOS의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다.
도 3d는 Pdk1 flox /+; CD4 -Cre(flox/+) 및 Pdk1 flox / flox; CD4 -Cre(flox/flox) 마우스의 비장으로부터의 Mo-MDSC 및 Gr-MDSC 내 ARG1의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다.
도 3e는 Pdk1 flox /+; CD4 -Cre(flox/+) 및 Pdk1 flox / flox; CD4 -Cre(flox/flox) 마우스의 비장에서의 MDSC 소집단(subpopulation) 상의 PD-L1 발현의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 3f는 Pdk1 flox /+; CD4 -Cre(flox/+) 및 Pdk1 flox / flox; CD4 -Cre(flox/flox) 마우스의 비장으로부터의 Mo-MDSC 및 Gr-MDSC를 갖는 항-CD3, 항-CD28, 및 TGF-β로 자극한 후의 in vitro-유발 Treg 세포(iTreg)의 유동 세포 분석을 나타낸다. 결과들은 평균±SD로서 나타내었다. *, P<0.05; **, P<0.01(스튜던트 t 검정).
도 4a는 Treg 세포를 처리하거나 처리하지 않은 GM-CSF, IL-4 및 2-ME의 부재하에서 배양된 골수 세포의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 4b는 Treg 세포 및 항-TGF-β로 처리하거나 처리하지 않은 GM-CSF, IL-4 및 2-ME의 존재하에서의 분화된 골수 유래 억제세포(MDSC)의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 4c는 Treg 세포 연관 싸이토카인 TGF-β 및 IL-10으로 처리하거나 처리하지 않은 골수 유래 억제세포(MDSC)의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 4d는 Treg 세포 연관 싸이토카인 TGF-β 및 IL-10으로 처리하거나 처리하지 않은 골수 유래 억제세포(MDSC)의 수를 나타낸다.
도 4e는 TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 억제세포(MDSC)의 각각의 소집단의 세포 수를 나타낸다.
도 4f는 TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 CFSE-표지된 골수 유래 Mo-MDSC 또는 Gr-MDSC의 증식의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 5a는 TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 억제세포(MDSC)상에서의 성숙한 골수 세포(myeloid) 마커의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 5b는 TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 억제세포(MDSC)의 Wright-Giemsa 염색 결과를 나타낸다.
도 5c, 5d 및 5e는 LPS 자극후에, TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 Mo-MDSC 내에서의 iNOS(도 5c), TGF-β(도 5d) 및 IL-10(도 5e)의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다.
도 5f는 TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 Mo-MDSC 및 Gr-MDSC 내에서의 상대적인 ARG1의 mRNA 수준을 나타낸다.
도 5g는 TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 Mo-MDSC 및 Gr-MDSC 내에서의 ARG1 활성도를 나타낸다.
도 5h는 LPS, GM-CSF+IL-4 또는 GM-CSF+IL-4+LPS로 처리한 후에, TGF-β로 처리하지 않았거나 처리하여 분화된 골수 유래 억제세포(MDSC) 소집단 상의 PD-L1 발현의 유동 세포 분석을 나타낸다. 결과들은 평균±SD로서 나타내었다. *, P<0.05; **, P<0.01(스튜던트 t 검정).
도 6a는 DSS 처리의 0일 및 6일째에 골수 유래 Mo-MDSC 또는 Mo-MDSC/TGF-β의 입양 전달 후의 체중 변화(%)를 나타낸다(그룹당 마우스 개체수 n=9-12).
도 6b는 Mo-MDSC 또는 Mo-MDSC/TGF-β의 입양 전달 후의 DSS 처리 마우스의 11일째에 측정한 결장 길이를 나타낸다(그룹당 마우스 개체수 n=3).
도 6c 및 6d는 골수 유래 Mo-MDSC 또는 Mo-MDSC/TGF-β의 입양 전달 후 0일 및 6일째의 DSS-처리 마우스의 결장 사진 및 조직학적 등급을 나타낸다(그룹당 마우스 개체수 n=4).
도 6e는 골수 유래 Mo-MDSC 또는 Mo-MDSC/TGF-β의 입양 전달 후 DSS 처리 마우스로 부터의 결장 절편의 싸이토카인 수준의 측정을 나타낸다(그룹당 마우스 개체수 n=3).
도 6f는 골수 유래 Mo-MDSC 또는 Mo-MDSC/TGF-β의 입양 전달 후 DSS 처리 마우스의 비장 에서의 Treg 세포의 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 6g는 골수 유래 Mo-MDSC 또는 Mo-MDSC/TGF-β의 존재 하에서의 항-CD3 및 항-CD28을 처리하여 자극한 후의 CFSE-표지된 tTreg 세포의 증식의 유동 세포 분석을 나타낸다. 결과들은 평균±SD로서 나타내었다. *, P<0.05; **, P<0.01(스튜던트 t 검정).
도 7은 Pdk1 flox / flox; CD4 - Cre 또는 야생형 Treg 세포로 주사한 Pdk1 flox / flox; CD4 -Cre(flox/flox) 마우스의 비장으로부터 추출한 MDSC의 기능을 테스트하기 위한 DSS 유발 장염 모델을 나타낸다.
도 8은 Pdk1 flox / flox; CD4 - Cre 또는 야생형 Treg 세포로 주사한 Pdk1 flox / flox; CD4 -Cre(flox/flox) 마우스의 비장으로부터 추출한 MDSC의 기능을 테스트하기 위한 DSS 유발 장염 모델로부터의 결장의 사진을 나타낸다.
도 9는 골수 유래 Mo-MDSC 또는 골수 유래 Mo-MDSC/TGF-β의 기능을 시험하기 위한 DSS 유발 장염 모델을 나타낸다.
도 10은 골수 유래 Mo-MDSC 또는 골수 유래 Mo-MDSC/TGF-β의 기능을 시험하기 위한 DSS 유발 장염 모델로부터의 결장의 사진을 나타낸다.
도 11은 골수 유래 Mo-MDSC 또는 골수 유래 Mo-MDSC/TGF-β의 기능을 시험하기 위한 DSS 유발 장염 모델로부터의 Treg 집단(population) 분석을 나타낸다. 비장 세포를 표시한 마우스로부터 추출하였고, Treg 세포(CD4+CD25+Foxp3+), tTreg 세포(CD4+CD25+Foxp3+Nrp1+), 및 pTreg 세포(CD4+CD25+Foxp3+Nrp1-)를 유동세포 분석에 의해 분석하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 마우스 및 MDSC 분리
Pdk1 flox / flox 마우스를 CD4 - Cre 트랜스제닉 마우스와 함께 사육하고, 후손은 Pdk1 flox/flox; CD4 - Cre 및 Pdk1 flox /+; CD4 - Cre를 얻기 위해 Pdk1 flox / flox 마우스와 함께 사육하였다. 모든 마우스는 광주 과학 기술원(GIST) 동물 관리 시설의 소정의 무균(pathogen-free) 조건에서 유지시켰다. MDSCs는 MDSC-특이적 표면 마커로 세포를 염색한 뒤 FACSAriaⅢ 장비(BD Bioscience)로 분리하였다.
실시예 2: 골수 유래의 MDSCs의 In vitro 분화
골수 세포는 C57BL/6 마우스로부터 분리하였고, 10% 태아 소 혈청(FBS), 10 ng/ml GM-CSF, 10 ng/ml IL-4 및 50 μM 2-ME 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양물을 37℃, 5% CO2 습도 환경에서 24-웰 플레이트에 보존시켰다. 세포를 3-5일째에 수집하였고, 유동 세포 계측(flow cytometry)으로 분석하였다.
실시예 3: Treg 세포 분리 및 in vitro Treg 세포 분화
Pdk1 flox / flox; CD4 - Cre 또는 Pdk1 flox /+; CD4 - Cre 마우스로부터의 CD4+CD25+ 림프절 세포를 플루오로크롬-컨쥬게이션된 항-마우스 CD4 및 항-마우스 CD25 항체로 염색한 후에 FACSAriaⅢ 장비(BD Bioscience) 상에서 분류하였다. In vitro에서, TGF-β(1 ng/ml)의 존재하에서 54 시간 동안 플레이트 부착 항-CD3 및 항-CD28로 자극함으로써 Tregs를 C57BL/6 마우스로부터의 CD4+CD25- T-세포로부터 얻었다.
실시예 4: 조절 T-세포의 입양 전달(Adoptive transfer)
야생형(Wild-type) Treg 세포(CD4+CD25+)를 C57BL/6 마우스의 림프절로부터 FACSAriaⅢ 장비(BD Bioscience)로 분리하였다. Pdk1 flox / flox; CD4 - Cre 또는 Pdk1 flox/+; CD4-Cre 마우스를 분리된 야생형 Treg 세포로 2-3회 정맥 주사하였다.
실시예 5: 유동 세포 계측
분리 또는 분화된 세포를 표지된 항체로 염색하였고, FACS CantoⅡ 장비(BD Biosciences) 또는 Guava 장비(Millipore) 상에서 분석하였다. 살아있는 세포를 전면 및 측면 스캐터에 의해 입구를 형성시켰다. Foxp3에 대한 세포 내 염색을 위해, 세포를 고정시키고, Foxp3 염색 버퍼(eBioscience)를 투과시켰다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
실시예 6: ARG1 효소 활성 분석
ARG1 활성을 세포 용해물 상에서 측정하였다. 세포를 100 μl의 0.1% Triton X-100으로 30분 동안 용해시켰다. 이어서 100 μl의 25 mM Tris-HCl 및 10 μl의 10 mM MnCl2를 첨가하였고, 효소를 56℃에서 10 분간 가열함으로써 활성화시켰다. 용해물을 100 μl의 0.5 M L-아르기닌(pH 9.7)을 이용하여 37℃에서 2시간 동안 배양함으로써 아르기닌 가수분해를 수행하였다. 900 μl의 H2SO4(96%)/H3PO4(85%)/H2O(1/3/7, v/v/v)을 이용하여 반응을 정지시켰다. 요소(urea) 농도를, 40 μl의 α-이소나이트로소프로피오페논(100% 에탄올에 용해된)의 첨가 후에 95℃에서 30분간 가열시킨 후 540 nm에서 측정하였다.
실시예 7: 정량적 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)
총 RNA를 세포 펠릿으로부터 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 분리하고, 첫 번째 가닥 cDNA를 RT Drymix(Enzinomics)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 연속적으로 합성하였다. SYBR Premix(Takara)를 이용하여 real-time PCR(Agilent Technology)에 의해 각각의 mRNA의 총량을 측정하였다. 모든 실험들은 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하여 정규화시켰다.
실시예 8: DSS-유발의 실험상 대장염(experimental colitis)
C57BL/6 strain의 6-12주령의 마우스에 대하여 5일간 마시는 물의 2%(w/v)로 DSS[MP Biomedicals, MW=36,000-50,000 Da]의 경구 투여에 의해 대장염을 유도하였고, 정상의 마시는 물을 이어서 투여하였다. 마우스는 질병율(morbidity)에 대해 매일 확인하였고, 체중을 기록하였다. 마우스를 희생시키고, 결장(colon)을 적출하였으며, 결장 길이를 측정하였다.
실시예 9: Treg 세포 및 MDSC에 대한 증식 분석
세포들을 표면 마커 염색을 기초로 FACSAriaⅢ 장비(BD Bioscience)를 통해 분리하였다. 분리된 세포를 5 μM의 CFSE(eBiocsience)로 5분간 염색하였고, 10% FBS 보충된 RPMI 1640 배지의 첨가에 의해 라벨링을 중단하였다. 몇차례 세척 후, CFSE-표지된 세포를 48-72 시간 배양하였다.
실시예 10: 결장 조직 배양 및 사이토카인 측정
마우스를 희생시킨 후, 결장을 적출하고, 1 cm × 1 cm로 규격화된 결장 조직의 세그먼트를 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco) 보충된 cold PBS에서 세척하였다. 상기 세그먼트들을 페니실린 및 스트렙토마이신 보충된 혈청-프리 RPMI 1640 배지(HyClone) 내의 24-웰 플랫-바텀 배양 플레이트에서 배양하였다. 24시간 후, Cytometric Bead Array kits(BD Biosciences)를 이용하여 제조자의 지침에따라 IFN-γ, IL-17A 및 IL-10의 생성을 측정하기 위해, 상청액을 수집하였다. 각각 동결건조된 재조합 뮤린 사이토카인을 이용하여 표준곡선(standard curve)를 얻었다.
실시예 11: 조직학 및 스코어링
표본들을 4% 중성-버퍼화 포르말린으로 고정시키고, 파라핀에 침지시켰다. 섹션들을 절단하고, 탈파라핀화시켰으며, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 염색된 장의 섹션들을 블라인드 채점에 의해 점수를 부여하였다. 조직학적 점수 부여는 관찰된 염증(0-4) 및 관찰된 상피 손상(0-4)을 기초로 하였다. 관찰된 염증의 임상 점수는 다음과 같이 정의하였다: 0, 염증 없음; 1, 고유판(lamina propria) 내의 가볍게 증가되는 염증을 갖는 낮은 수준의 염증; 2, 고유판 내에서 보통 수준으로 증가하는 염증[다중 병소(multiple foci)]; 3, 염증에 의해 벽이 두꺼워지는 증거를 보이는 높은 수준의 염증; 및 4, 경벽의(transmural) 백혈구(leukocyte) 침투 및/또는 구조적 왜곡(distortion)을 갖는 심각한 염증. 관찰된 상피 손상의 점수 부여는 다음과 같이 정의하였다: 0, 정상이거나 호중구(neutrophil)에 의한 침투 없음; 1, 드문 상피 병변(lesion)[병소적이고(focal) 표면적이거나 드문 선와염(cryptitis)]; 2, 드문 선와 종기(crypt abscess)를 포함하는 선와염의 병소(foci); 3, 다중 선와 종기 및/또는 병소 궤양화; 및 4, 광범위한 궤양.
실험결과
1. MDSC는 T세포 특이적으로 Pdk1 유전자가 제거된 자연 발생적으로 장염이 유도된 마우스에서 증가한다.
PDK1은 NF-kB의 활성을 유도하는 CD28 공동 수용체 신호 전달을 통한 CD4 T세포 활성에 필수적인 역할을 한다. 그러므로 CD4 - Cre에 의한 T세포 특이적인 Pdk1 유전자 결핍은 CD4 T세포의 활성을 약화시키며, 면역 조절 T세포의 기능 또한 감소시킨다. 사실상 이러한 면역 조절 T세포의 기능 결핍은 Pdk1 유전자가 제거되지 않은 TCRγδ+ T세포의 활성을 조절 하지 못하기 때문에 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 자연발생적으로 장염을 유도시킨다. 장염을 보이는 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스는 같은 우리에서 자란 야생형의 형제 마우스와 비교하였을 때, 직장 탈출의 빈도수가 증가하는 양상을 보였다(참조: 도 1a). 그리고 10주령 이상의 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 장에서 심각한 장의 염증 증세를 관찰하였다(참조: 도 1b).
흥미롭게도, CD11b+Gr1+ MDSC 집단(population)이 마우스가 나이가 들어감에 따라 장의 염증이 심화될 때, 점차 증가된다. 어린 나이의 마우스에서는(6령-8주령) Pdk1 유전자 녹아웃 마우스와 야생형의 형제 마우스의 비장과 림프절에서 유사한 비율의 MDSC population을 보였다(참조: 도 1c, 1d 및 1e). 그러나 나이가 든 마우스에서는(10주령 이상의 마우스) Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 야생형의 형제 마우스와 비교하였을 때, 비장과 림프절에서 MDSC population의 급격한 증가를 보였다(참조: 도 1c, 1d 및 1e).
2. 야생형의 면역 조절 T세포의 선택적 이식(adoptive transfer)은 MDSC 의 subpopulation에 영향을 끼치며, Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 MDSC의 면역 조절성 기능을 개선한다.
Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서, 면역 조절 T세포의 기능은 급격하게 감소되어 자연 발생적인 장염을 유도한다. 그러나 이러한 장염은 야생형의 면역 조절 T세포를 이에 선택적으로 이식하게 되면 유도되지 않는다(참조: 도 2a 및 2b). 장염을 가지는 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 MDSC population, 특히 Gr-MDSC population이 Mo-MDSC에 비해 많이 증가하였다(참조: 도 2c). 우리의 데이터에서 MDSC population의 전체 빈도수는 야생형의 면역 조절 T세포의 이식에 의해 5일내에 크게 변하지 않았다(참조: 도 2c). 그러나 면역 조절 T세포의 선택적 이식은 Gr-MDSCs(CD11b+Ly6GhighLy6Clow)와 Mo-MDSCs(CD11b+Ly6GdimLy6Chi)와 같은 MDSC의 subpopulation에 영향을 끼쳤다. 도 2c에서 보듯이, Pdk1 유전자 녹아웃 마우스와 야생형의 형제 마우스에서 야생형의 면역 조절 T세포에 의해 전체 MDSC 중에서 Mo-MDSC가 증가하였고, 반면에 Gr-MDSC는 감소하였다. 이러한 데이터를 통해, 면역 조절 T세포가 MDSC의 subpopulation의 영향을 끼칠 수 있음을 확인하였다. 이로써, 우선적으로 면역 조절 T세포가 MDSC의 기능에 영향을 주는지 여부를 확인해보았다(참조: 도 7). In vivo에서 MDSC의 기능을 확인하기 위하여, DSS(dextran sodium sulfate)로 유도된 장염 모델을 이용하였다. DSS는 설치류의 염증성 장 질환 모델에서 화학적으로 급성 장 염증을 유도하는 데 상용되는 물질이다. DSS로 유도된 장염은 체중 감소, 혈리, 상피세포 손상, 면역세포 침투 등으로 특정 지어 질 수 있다. 본 발명의 데이터에서 DSS로 유도된 장염에 의한 체중감소는 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스로부터 분리한 MDSC의 선택적 이식에 의해 회복되어지지 않았다. 사실상 이러한 MDSC의 이식은 같은 용량의 PBS를 주사한 대조군 마우스보다 오히려 더 심한 체중 감소를 나타내었다(참조: 도 2d). 그러나 야생형의 면역 조절 T세포를 주사한 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 MDSC 이식은 DSS로 유도된 장염 모델에서 장염에 의한 체중 감소를 급격히 개선하였다(참조: 도 2d). 대장 길이는 장염의 유용한 지표로 증명되어 사용된다. 그러므로 DSS를 먹인 마우스를 11일 후에 장의 길이를 측정하였다. DSS를 먹인 마우스에서 DSS를 먹이지 않은 대조군에 비해 장이 유의하게 줄어드는 것을 확인하였다(참조: 도 2e 및 8). 이러한 DSS로 유도된 장염의 마우스에서 장의 길이 축소는 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 분리한 MDSC의 선택적 이식에 의해 회복되어지지 않았다(참조: 도 2e). 그러나 위의 데이터에서와 같이 면역 조절 T세포를 주사한 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 MDSC의 선택적 이식은 장 길이 축소를 회복시켰다(참조: 도 2e). 그리고 DSS로 유도된 장염의 체중 변화 뿐만 아니라 장의 염증과 손상 역시 면역 조절 T세포를 주사한 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 분리한 MDSC에 의해 개선되었다. 그러나 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 분리한 MDSC의 선택적 이식은 장의 염증 및 손상을 회복시키지 못하였다(참조: 도 2f, 2g). 흥미롭게도, DSS로 유도한 장염의 마우스에 야생형의 면역 조절 T세포를 주사한 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 MDSC 이식은 전체 면역 조절 T세포를 유의성 있게 증가시키며, 특히 tTreg 세포 (흉선에서 유래된 면역 조절 T세포) 의 확장에 영향을 미쳤다.
3. Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 MDSC 의 면역 조절 기능이 야생형의 형제 마우스의 MDSC 에 비해 감소된다 .
염증반응 동안에 면역 조절 T세포는 면역 반응 조절을 위한 TGF-β, IL-10 과 같은 항염증성 싸이토카인을 생산한다. 이전 보고에 따르면 PDK1이 결핍된 면역 조절 T세포에서 항 염증성 싸이토카인의 생산이 감소하는 것을 보았다. 본 발명의 데이터에서도 마찬가지로 PDK1 결핍이 면역 조절 T세포의 anti-CD3와 anti-CD28에 의해 매개되는 TGF-β(참조: 도 3a), IL-10(참조: 도 3b)의 생산을 급격히 감소시키는 것을 확인하였다. MDSC 역시 T세포 활성 조절을 위한 iNOS, ARG1과 같은 효과기 분자(effector molecule)들을 생산한다. 흥미롭게도, Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 Mo-MDSC에서 iNOS 발현(참조: 도 3c)과 Mo-MDSC와 Gr-MDSC에서 ARG1 발현(참조: 도 3d) 역시 감소되는 것을 확인하였다. PD-L1은 억제성 공동 수용체(Programmed cell death 1)의 리간드로서 야생형의 형제 마우스와 비교해 볼 때, Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 Mo-MDSC와 Gr-MDSC에서 감소되는 것을 확인하였다(참조: 도 3e). PD-1(Programmed cell death 1)은 면역세포의 억제성 공동 수용체로서 자기 관용(self-tolerance)에 필수적이다. 그러므로 MDSC에서 PD-L1은 T세포의 활성화와 확장 및 싸이토카인의 생산을 억제하는데 중요한 역할을 한다. 그리하여 본 발명의 데이터에서, Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 MDSC는 야생형의 형제 마우스와 비교하여 면역 반응을 조절하는 활성이 감소되는 것을 확인하였다. MDSC의 이러한 면역 조절 분자들의 생산을 통한 직접적인 면역반응조절 뿐 만 아니라 MDSC는 면역 반응을 조절한다고 알려진 조절 면역 T세포의 분화에 관여 함으로써 간접적으로도 면역 반응에 영향을 끼칠 수 있다. In vitro 조건에서 MDSC는 iTreg 세포(in vitro에서 유도된 면역 조절 T세포)를 증가시킬 수 있다. 우리의 데이터에서 Pdk1 유전자 녹아웃 마우스의 MDSC는 in vitro에서 야생형의 형제 마우스와 비교하였을 때, iTreg 세포를 분화시키는 능력이 감소되는 것을 확인하였다(참조: 도 3f).
4. 면역 조절 T세포에서 유래된 TGF-β는 골수세포에서 유래된 MDSC의 분화에 영향을 준다.
In vitro 조건에서 골수세포를 GM-CSF, IL-4, 2-머캅토에탄올(2-ME)과 함께 3-5일간 배양하여 MDSC로 분화시킬 수 있다. In vitro 조건에서 생성되는 MDSC 역시 Mo-MDSC와 Gr-MDSC와 같은 2가지의 subpopulation을 갖는다. 면역 조절 T세포의 MDSC의 subpopulation 분화에 대한 효과를 확인하기 위해, 골수세포를 GM-CSF, IL-4, 2-ME가 있거나 없을 경우 면역 조절 T세포의 유무에 따라 MDSC로 분화시켜 확인해 보았다. 면역 조절 T세포를 추가하였더라도 싸이토카인들이 없을 경우에는 CD11b+Gr1+ MDSC로 분화되어지지 않았다(참조: 도 4a). 그러나 면역 조절 T세포를 정상적으로 in vitro에서 MDSC로 분화시키는 조건에 추가할 경우, 정상 조건에 비해 Mo-MDSC로 편향되는 효과를 보였다(참조: 도 4b). 우리의 데이터에서 면역 조절 T세포는 in vivo에서도 MDSC의 subpopulation의 분화에 영향을 줄 수 있음을 확인하였다(참조: 도 2c). 그러므로 본 발명자들은 면역 조절 T세포가 MDSC의 subpopulation 분화에 영향을 미칠 수 있다고 결론 지었다. 면역 조절 T세포에서 생성되는 TGF-β와 IL-10과 같은 싸이토카인들은 면역 조절 T세포가 연관된 면역 조절에 중요한 역할을 한다. 위의 데이터에서 확인하였듯이, Pdk1 유전자 녹아웃 마우스에서 이들 싸이토카인의 발현이 대조군에 비해 급격히 감소되어짐을 확인하였다(참조: 도 3a 및 3b). 그러므로 면역 조절 T세포에서 유래된 이들 싸이토카인이 MDSC의 subpopulation에 아마 영향을 끼칠 것이라 예상하였다. 우리의 데이터에서 TGF-β를 중화시키는 항체를 추가할 경우 골수 세포에서 유래한 MDSC subpopulation에 대한 면역 조절 T세포의 효과가 사라지는 것을 확인하였다(참조: 도 4b). 이로써, 면역 조절 T세포에서 유래된 TGF-β가 MDSC의 subpopulation 분화를 조절하는 중요 매개자 임을 확인할 수 있었다. 이러한 내용을 명확히 하기 위하여, in vitro에서 MDSC를 분화시키는 조건에서 TGF-β를 직접 처리하여 보았다. 그 결과, TGF-β가 MDSC의 subpopulation 분화에 영향을 끼치는 반면, IL-10은 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(참조: 도 4c). 이러한 데이터에서 TGF-β는 전체 분화되는 MDSC에서 Gr-MDSC의 비율을 감소시키고, Mo-MDSC의 비율을 증가시켰다. 그러나 Gr-MDSC의 전체 숫자(absolute number)는 전체 분화된 MDSC의 숫자가 증가하였기 때문에 크게 감소되지 않았다(참조: 도 4d 및 4e). 대신에 Mo-MDSC의 전체 숫자는 분화된 MDSC에서 크게 증가하는 것을 확인하였다(참조: 도 4e). 이러한 데이터들을 통해, TGF-β가 Mo-MDSC의 확장에 관련이 있으며, 이러한 내용은 TGF-β에 대한 각각의 population의 증식을 확인하여 증명하였다. In vitro에서 분화되는 골수 세포에서 유래한 중간 단계의 Mo-MDSC와 Gr-MDSC를 분리한 후 세포들의 분열 정도를 분석하기 위해 CFSE(carboxyl fluorescein succinimidyl ester)를 세포에 표지하였다. 그 결과, TGF-β에 의해 Mo-MDSC의 세포 분열이 유의미하게 증가되는 반면, Gr-MDSC는 영향을 주지 않음을 확인하였다(참조: 도 4f).
5. TGF-β는 MDSC의 면역 억제 기능을 증가시키는 데 중요한 역할을 한다.
골수성 전구세포 (common myeloid progenitor, CMP)에서 유래되는 MDSC는 성숙한 대식세포와 수지상세포로 완전히 분화하지 않는다. In vitro에서 분화된 MDSC와 TGF-β의 교육을 받은 MDSC(MDSCs/TGF-β)를 자세히 살펴보기 전에, 우선적으로 분화된 세포들이 미성숙한 단계를 유지하는지 여부를 대식세포 마커인 F4/80와 수지상 세포의 마커인 CD11c 염색을 통해 확인하였다. 그 결과, population의 거의 대부분이 TGF-β 처리와 상관없이 성숙한 골수 세포로 분화 되지 않았다(참조: 도 5a). 추가적으로 이와 같이 분화된 소집단(subpopulation)이 MDSC의 각 소집단(subpopulation)과 일치하는지 여부를 확인하기 위해, 각각을 분리하여 Wright-Giemsa 염색을 한 후 이들의 형태를 현미경을 통해 관찰해 보았다. MDSC의 Wright-Giemsa 염색을 통해, Gr-MDSC에서는 다형핵의 백혈구 형태와 Mo-MDSC에서는 단핵 세포의 형태를 명확히 구분할 수 있었다(참조: 도 5b).
골수 세포에서 유래한 MDSC가 면역 억제 기능을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 면역 억제 기능을 가지는 효과기 분자들의 생산을 확인해 보았다. 골수 세포에서 유래되는 Mo-MDSC는 면역 억제에 관여하는 iNOS, TGF-β, IL-10과 같은 분자들을 생산하였고, ARG1의 경우 Mo-MDSC와 Gr-MDSC 모두에서 발현되어졌다. 흥미롭게도 본 발명의 데이터에서 TGF-β가 위에서 명시한 iNOS(참조: 도 5c), TGF-β(참조: 도 5d), IL-10(참조: 도 5e), ARG1(참조: 도 5f, 5g)을 포함한 효과기 분자들의 생산을 유의미하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다. PD-L1 또한 MDSC가 매개하는 면역 조절에서 중요한 표면 분자로서, 골수 세포에서 유래된 MDSC, 특히 Gr-MDSC에서 역시 발현되는 것을 확인하였다(참조: 도 5h). 이러한 PD-L1의 표면 발현은 TGF-β에 의해 Mo-MDSC에서 더욱 증가하는 반면, Gr-MDSC는 크게 영향 받지 않았다(참조: 도 5h). 아마도 in vitro에서 분화된 Gr-MDSC에서의 PD-L1 발현이 이미 높게 발현되고 있기 때문이라 추정되어진다.
6. TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC는 DSS로 유도된 장염모델에서 면역 억제 활성을 증대시킴.
In vivo에서, 골수세포에서 유래되는 MDSC의 기능을 조사하기 위해 DSS로 유도된 장염 모델을 사용하였다. 이러한 실험은 골수세포에서 유래된 Mo-MDSC와 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC를 각각 분리하여, DSS를 처리하는 0일과 6일의 마우스에 정맥 주사하였다(참조: 도 9). 그리고 장염의 심각 정도를 확인하기 위해 체중감소를 매일 측정하였다. 그 결과, 체중감소를 보이는 DSS를 처리한 마우스와 비교하여, 골수세포에서 유래되는 Mo-MDSC와 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC를 이식한 마우스에서 체중 감소가 완화되는 것을 확인하였다(참조: 도 6a). 그리고 체중의 회복이 Mo-MDSC와 비교하였을 때, TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC에 의해 훨씬 빨라지는 것 또한 확인 할 수 있었다(참조: 도 6a). 대조군의 마우스에서 장의 길이가 DSS에 의해 급격히 축소되는데, MDSC를 이식한 마우스에서는 장 길이 축소에 저항성을 보이며, 이는 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC의 경우 더욱 효과적이다(참조: 도 6b, 도 10). 체중변화 뿐만 아니라 장의 염증과 손상정도 역시 DSS로 유도된 장염 모델에서 Mo-MDSC 보다는 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC 이식에 의해 효과적으로 회복 되는 것을 확인할수 있었으며(참조: 도 6c 및 6d), TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC의 이식은 Mo-MDSC의 이식보다 장 조직의 배양으로부터 얻어낸 상층액을 이용한 IL-10, IL-17A, IFN-g과 같은 싸이토카인의 생산을 좀 더 효과적으로 억제할 수 있었다(참조: 도 6e).
장에서 염증반응 동안에 면역 조절 T세포는 염증반응 조절에 중요한 역할을 한다. 그리하여 본 발명자들은 면역 조절 T세포의 population을 DSS로 유도시킨 장염의 마우스 모델에서 확인하였다. 그 결과, DSS 처리 후에 CD4+Foxp3+면역 조절 T세포의 population이 감소되는 것을 확인하였으며, 골수세포에서 유래된 Mo-MDSC와 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC를 이식할 경우 CD4+Foxp3+면역 조절 T세포의 population이 DSS를 처리한 대조군에 비해 증가되는 것을 확인할 수 있었다(참조: 도 6f 및 도 11). 특히, TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC를 이식할 경우 Mo-MDSC를 이식할 때보다 비장에서 전체 면역 조절 T세포의 비율이 유의미하게 증가하였다(참조: 도 6f 및 도 11). 면역 조절 T세포의 population 중에서 tTreg(CD4+Foxp3+ Nrp1+) 세포의 경우, DSS를 처리한 대조군에 비해 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC를 이식할 경우 유의미하게 증가하는 반면, Mo-MDSC를 이식할 경우에는 비장에서 tTreg 세포가 유의미하게 증가하지는 않았다(참조: 도 6f 및 도 11). 그러므로 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC가 면역 조절 T세포를 확장 시키는 능력이 더 뛰어났다. 이러한 내용은 in vitro에서 면역조절 T세포의 증식을 실험하여 재확인 하였다. 그 결과, 골수 세포에서 유래된 Mo-MDSC와 TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC가 in vitro에서 면역조절 T세포의 증식을 증가 시킬 수 있었다(참조: 도 6g). 특히, TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC가 in vitro에서 면역조절 T세포의 증식을 유의미하게 증가시켰으며, 이를 통해 in vitro 에서 골수세포에서 유래시킨 Mo-MDSC가 in vivo에서도 면역 억제기능을 가질 수 있음을 확인하였다. 또한, TGF-β의 교육을 받은 Mo-MDSC가 in vivo에서 MDSC의 기능이 더 뛰어나다는 사실을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
Abbas, A.K., Benoist, C., Bluestone, J.A., Campbell, D.J., Ghosh, S., Hori, S., Jiang, S., Kuchroo, V.K., Mathis, D., Roncarolo, M.G., et al. (2013). Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nature immunology 14, 307-308.
Araki, A., Kanai, T., Ishikura, T., Makita, S., Uraushihara, K., Iiyama, R., Totsuka, T., Takeda, K., Akira, S., and Watanabe, M. (2005). MyD88-deficient mice develop severe intestinal inflammation in dextran sodium sulfate colitis. J Gastroenterol 40, 16-23.
Arihara, F., Mizukoshi, E., Kitahara, M., Takata, Y., Arai, K., Yamashita, T., Nakamoto, Y., and Kaneko, S. (2013). Increase in CD14+HLA-DR -/low myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients and its impact on prognosis. Cancer Immunol Immunother 62, 1421-1430.
Baumgart, D.C., and Sandborn, W.J. (2007). Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet 369, 1641-1657.
Bommireddy, R., and Doetschman, T. (2007). TGFbeta1 and Treg cells: alliance for tolerance.
Trends in molecular medicine 13, 492-501.
Bronte, V. (2009). Myeloid-derived suppressor cells in inflammation: uncovering cell subsets with enhanced immunosuppressive functions. European journal of immunology 39, 2670-2672.
Bronte, V., Serafini, P., De Santo, C., Marigo, I., Tosello, V., Mazzoni, A., Segal, D.M., Staib, C., Lowel, M., Sutter, G., et al. (2003). IL-4-induced arginase 1 suppresses alloreactive T cells in tumor20 bearing mice. Journal of immunology 170, 270-278.
Bronte, V., and Zanovello, P. (2005). Regulation of immune responses by L-arginine metabolism. Nature reviews. Immunology 5, 641-654.
Chen, W., Jin, W., Hardegen, N., Lei, K.J., Li, L., Marinos, N., McGrady, G., and Wahl, S.M. (2003).
Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. The Journal of experimental medicine 198, 1875-1886.
Delano, M.J., Scumpia, P.O., Weinstein, J.S., Coco, D., Nagaraj, S., Kelly-Scumpia, K.M., O'Malley, K.A., Wynn, J.L., Antonenko, S., Al-Quran, S.Z., et al. 1 (2007). MyD88-dependent expansion of an immature GR-1(+)CD11b(+) population induces T cell suppression and Th2 polarization in sepsis. The Journal of experimental medicine 204, 1463-1474.
Fontenot, J.D., Gavin, M.A., and Rudensky, A.Y. (2003). Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature immunology 4, 330-336.
Gabitass, R.F., Annels, N.E., Stocken, D.D., Pandha, H.A., and Middleton, G.W. (2011). Elevated myeloid-derived suppressor cells in pancreatic, esophageal and gastric cancer are an independent prognostic factor and are associated with significant elevation of the Th2 cytokine interleukin-13. Cancer Immunol Immunother 60, 1419-1430.
Gabrilovich, D.I., and Nagaraj, S. (2009). Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol 9, 162-174.
Haile, L.A., Gamrekelashvili, J., Manns, M.P., Korangy, F., and Greten, T.F. (2010). CD49d is a new marker for distinct myeloid-derived suppressor cell subpopulations in mice. Journal of immunology 185, 203-210.
Haile, L.A., von Wasielewski, R., Gamrekelashvili, J., Kruger, C., Bachmann, O., Westendorf, A.M., Buer, J., Liblau, R., Manns, M.P., Korangy, F., and Greten, T.F. (2008). Myeloid-derived suppressor cells in inflammatory bowel disease: a new immunoregulatory pathway. Gastroenterology 135, 871-881, 881 e871-875.
Hori, S., Nomura, T., and Sakaguchi, S. (2003). Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-1061.
Huang, B., Pan, P.Y., Li, Q., Sato, A.I., Levy, D.E., Bromberg, J., Divino, C.M., and Chen, S.H. (2006).
Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer research 66, 1123-1131.
Kang, J.A., Jeong, S.P., Park, D., Hayden, M.S., Ghosh, S., and Park, S.G. (2013). Transition from heterotypic to homotypic PDK1 homodimerization is essential for TCR-mediated NF-kappaB activation. J Immunol 190, 4508-4515.
Lindau, D., Gielen, P., Kroesen, M., Wesseling, 1 P., and Adema, G.J. (2013). The immunosuppressive tumour network: myeloid-derived suppressor cells, regulatory T cells and natural killer T cells. Immunology 138, 105-115.
Lohr, J., Knoechel, B., and Abbas, A.K. (2006). Regulatory T cells in the periphery. Immunological reviews 212, 149-162.
Luan, Y., Mosheir, E., Menon, M.C., Wilson, D., Woytovich, C., Ochando, J., and Murphy, B. (2013).
Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant 13, 3123-3131.
Maloy, K.J., and Kullberg, M.C. (2008). IL-23 and Th17 cytokines in intestinal homeostasis. Mucosal immunology 1, 339-349.
Marhaba, R., Vitacolonna, M., Hildebrand, D., Baniyash, M., Freyschmidt-Paul, P., and Zoller, M.(2007). The importance of myeloid-derived suppressor cells in the regulation of autoimmune effector cells by a chronic contact eczema. Journal of immunology 179, 5071-5081.
Marigo, I., Dolcetti, L., Serafini, P., Zanovello, P., and Bronte, V. (2008). Tumor-induced tolerance and immune suppression by myeloid derived suppressor cells. Immunological reviews 222, 162-179.
Mazzoni, A., Bronte, V., Visintin, A., Spitzer, J.H., Apolloni, E., Serafini, P., Zanovello, P., and Segal, D.M. (2002). Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. Journal of immunology 168, 689-695.
Nagaraj, S., and Gabrilovich, D.I. (2008). Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research 68, 2561-2563.
Ochoa, A.C., Zea, A.H., Hernandez, C., and Rodriguez, P.C. (2007). Arginase, prostaglandins, and myeloid-derived suppressor cells in renal cell carcinoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 13, 721s-726s.
Otsuji, M., Kimura, Y., Aoe, T., Okamoto, Y., and Saito, T. (1996). Oxidative stress by tumor26 derived macrophages suppresses the expression of CD3 zeta chain of T-cell receptor complex and antigen-specific T-cell responses. Proceedings of the National 1 Academy of Sciences of the United States of America 93, 13119-13124.
Pan, P.Y., Ma, G., Weber, K.J., Ozao-Choy, J., Wang, G., Yin, B., Divino, C.M., and Chen, S.H. (2010).
Immune stimulatory receptor CD40 is required for T-cell suppression and T regulatory cell activation mediated by myeloid-derived suppressor cells in cancer. Cancer Res 70, 99-108.
Park, S.G., Mathur, R., Long, M., Hosh, N., Hao, L., Hayden, M.S., and Ghosh, S. (2010). T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity 33, 791-803.
Park, S.G., Schulze-Luehrman, J., Hayden, M.S., Hashimoto, N., Ogawa, W., Kasuga, M., and Ghosh, S. (2009). The kinase PDK1 integrates T cell antigen receptor and CD28 coreceptor signaling to induce NF-kappaB and activate T cells. Nat Immunol 10, 158-166.
Rodriguez, P.C., Zea, A.H., Culotta, K.S., Zabaleta, J., Ochoa, J.B., and Ochoa, A.C. (2002). Regulation of T cell receptor CD3zeta chain expression by L-arginine. The Journal of biological chemistry 277, 21123-21129.
Rui, Y., Honjo, T., and Chikuma, S. (2013). Programmed cell death 1 inhibits inflammatory helper T-cell development through controlling the innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 16073-16078.
Sakaguchi, S., Ono, M., Setoguchi, R., Yagi, H., Hori, S., Fehervari, Z., Shimizu, J., Takahashi, T., and Nomura, T. (2006). Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunological reviews 212, 8-27.
Saurer, L., and Mueller, C. (2009). T cell-mediated immunoregulation in the gastrointestinal tract. Allergy 64, 505-519.
Serafini, P., Borrello, I., and Bronte, V. (2006). Myeloid suppressor cells in cancer: recruitment, phenotype, properties, and mechanisms of immune suppression. Seminars in cancer biology 16, 53-65.
Serafini, P., Mgebroff, S., Noonan, K., and Borrello, I. (2008). Myeloid-derived suppressor cells promote cross-tolerance in B-cell lymphoma by expanding regulatory T cells. Cancer Res 68, 5439-5449.
Shevach, E.M. (2009). Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression. Immunity 30, 636-645.
Solito, S., Marigo, I., Pinton, L., Damuzzo, V., Mandruzzato, S., and Bronte, V. (2014). Myeloid-derived suppressor cell heterogeneity in human cancers. Ann N Y Acad Sci 1319, 47-65.
Tazzari, M., Negri, T., Rini, F., Vergani, B., Huber, V., Villa, A., Dagrada, P., Colombo, C., Fiore, M., Gronchi, A., et al. (2014). Adaptive immune contexture at the tumour site and downmodulation of circulating myeloid-derived suppressor cells in the response of solitary fibrous tumour patients to anti-angiogenic therapy. Br J Cancer 111, 1350-1362.
Ugel, S., Delpozzo, F., Desantis, G., Papalini, F., Simonato, F., Sonda, N., Zilio, S., and Bronte, V. (2009). Therapeutic targeting of myeloid-derived suppressor cells. Current opinion in pharmacology 9, 470-481.
Vignali, D.A., Collison, L.W., and Workman, C.J. (2008). How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol 8, 523-532.
Wood, K.J., Bushell, A., and Hester, J. (2012). Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol 12, 417-430.
Wu, P., Wu, D., Ni, C., Ye, J., Chen, W., Hu, G., Wang, Z., Wang, C., Zhang, Z., Xia, W., et al. (2014).
gammadeltaT17 cells promote the accumulation and expansion of myeloid-derived suppressor cells in human colorectal cancer. Immunity 40, 785-800.
Youn, J.I., Nagaraj, S., Collazo, M., and Gabrilovich, D.I. (2008). Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. Journal of immunology 181, 5791-5802.
Zhang, R., Ito, S., Nishio, N., Cheng, Z., Suzuki, H., and Isobe, K.I. (2011). Dextran sulphate sodium increases splenic Gr1(+)CD11b(+) cells which accelerate recovery from colitis following intravenous transplantation. Clinical and experimental immunology 164, 417-427.

Claims (14)

  1. 면역 조절 T세포(Treg cell) 및 TGF-β(transforming growth factor-β) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역 억제 활성 증진은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 소집단(subpopulation) 분화 조절에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 소집단 분화 조절은 Mo-MDSC(monocytic MDSC)의 증가 조절인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 Mo-MDSC의 PD-L1 표면 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 면역 조절 T세포(Treg cell) 및 TGF-β(transforming growth factor-β) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 골수 유래 억제 세포(MDSC)에 처리하는 단계를 포함하는, 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 면역 억제 활성 증진 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 골수 유래 억제 세포(MDSC)는 포유류 동물로부터 분리된 골수 세포를 in vitro 배양에 의해 분화시킨 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 처리는 In vitro에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 면역 조절 T세포 및 TGF-β 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 처리에 의해 소집단(subpopulation) 분화된 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 유효 성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 소집단 분화는 Mo-MDSC(monocytic MDSC)가 증가된 분화인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 면역 조절 T세포 또는 TGF-β의 교육을 받은(educated) Mo-MDSC를 유효 성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 교육을 받은 Mo-MDSC는 교육을 받지 않은 Mo-MDSC에 비하여 PD-L1 표면 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 면역 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  13. 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 면역 억제용 조성물을 유효 성분으로 포함하는 염증성 장질환(IBD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 결장염인 것을 특징으로 하는 조성물.
PCT/KR2016/001932 2015-02-26 2016-02-26 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 억제 활성 증진 방법 Ceased WO2016137275A2 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20150027417 2015-02-26
KR10-2015-0027417 2015-02-26
KR20150027416 2015-02-26
KR10-2015-0027416 2015-02-26
KR10-2015-0027415 2015-02-26
KR20150027415 2015-02-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2016137275A2 true WO2016137275A2 (ko) 2016-09-01
WO2016137275A3 WO2016137275A3 (ko) 2016-10-20

Family

ID=56789715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/001932 Ceased WO2016137275A2 (ko) 2015-02-26 2016-02-26 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 억제 활성 증진 방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2016137275A2 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8951529B2 (en) * 2009-12-22 2015-02-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of using small compounds to enhance myeloid derived suppressor cell function for treating autoimmune diseases

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016137275A3 (ko) 2016-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Benoist et al. Treg cells, life history, and diversity
Blois et al. Dendritic cells: key to fetal tolerance?
Subramanian et al. Treg-mediated suppression of atherosclerosis requires MYD88 signaling in DCs
Du et al. Embryonic trophoblasts induce decidual regulatory T cell differentiation and maternal–fetal tolerance through thymic stromal lymphopoietin instructing dendritic cells
Kühl et al. Human peripheral γδ T cells possess regulatory potential
Lerret et al. Donor-specific CD8+ Foxp3+ T cells protect skin allografts and facilitate induction of conventional CD4+ Foxp3+ regulatory T cells
Ben-Ami et al. T cells from autoimmune patients display reduced sensitivity to immunoregulation by mesenchymal stem cells: role of IL-2
Diao et al. Immunostimulatory conventional dendritic cells evolve into regulatory macrophage-like cells
Tu et al. Interleukin-4 inhibits regulatory T cell differentiation through regulating CD103+ dendritic cells
WO2016048107A1 (ko) 인터페론-감마 또는 인터류킨-1베타를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
Hooper et al. Prostaglandin E2 inhibits Tr1 cell differentiation through suppression of c-Maf
Li et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells reduce lymphocytic infiltration in a rabbit model of induced autoimmune dacryoadenitis
Dewals et al. IL-4Rα-independent expression of mannose receptor and Ym1 by macrophages depends on their IL-10 responsiveness
Pereira et al. Effects of bone marrow mesenchymal stromal cell therapy in experimental cutaneous leishmaniasis in BALB/c mice induced by Leishmania amazonensis
Jadidi-Niaragh et al. Regulatory T-cell as orchestra leader in immunosuppression process of multiple sclerosis
WO2017146538A1 (ko) 조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019198995A1 (ko) 엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법
Yasmin et al. Pathogenesis and host immune response in leprosy
Lu et al. Dickkopf-3 contributes to the regulation of anti-tumor immune responses by mesenchymal stem cells
WO2019027214A2 (ko) 동종-중간엽 줄기세포 및 이의 용도
WO2016137275A2 (ko) 골수 유래 억제 세포의 면역 억제 활성 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 억제 활성 증진 방법
WO2015023147A1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
Kang et al. PLZF+ innate T cells support the TGF-β-dependent generation of activated/memory-like regulatory T cells
Poggi et al. Role of bone marrow stromal cells in the generation of human CD8+ regulatory T cells
WO2022131742A1 (ko) 소포체 스트레스 유발 물질로 처리된 세포 유래 엑소좀 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16755925

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16755925

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2