WO2016135363A1 - Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical, la cronificación y/o el aclaramiento del virus de la hepatitis c - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical, la cronificación y/o el aclaramiento del virus de la hepatitis c Download PDF

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hepatitis
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Ángeles RUIZ EXTREMERA
Esther José PAVÓN CASTILLERO
Javier SALMERÓN ESCOBAR
Paloma MUÑOZ DE RUEDA
José Antonio MUÑOZ GÁMEZ
Jorge CASADO RUIZ
Ángeles CARAZO GALLEGO
Rosa QUILES PÉREZ
Ana GILA MEDINA
Josefa LEÓN LÓPEZ
Ana B. MARTÍN ÁLVAREZ
Sergio JIMÉNEZ RUIZ
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Universidad de Granada
Servicio Andaluz de Salud
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Universidad de Granada
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is within the field of Molecular Biology and Clinical Medicine. Specifically, it refers to an in vitro method of obtaining useful data to predict or predict the vertical transmission of hepatitis C virus (HCV) and / or its inheritance and / or its chronification and / or clearance in the offspring.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV TV rate is low, 1-8% in non-coinfected mothers and around 20% in coinfected women (HIV), it should be borne in mind that 90% of infected children have acquired the virus by transmission vertical. It is also known that in the first months of life children can spontaneously clear up the virus. On the other hand, of those who persist with intermittent viremias, 53% will be chronically infected [Ruiz-Extremera A, et al., 201 1; 53 (6): 1830-8]. Despite the numerous published studies, the only factors that have scientific evidence related to an increased risk of TV are the high viral load in the mother and co-infection with HIV.
  • the object of the invention is related to the study of the genes involved in the immunological response against HCV: the HLA class I, class II molecules and the NK cell immunoglobine type receptors (KIRs), which can help clarify some of These mechanisms.
  • the first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk that a mother carrying the hepatitis C virus (RNA-HCV (+)) transmits the virus vertically to his offspring, or that an individual whose mother is a carrier of the hepatitis C virus, inherits and / or chronicles and / or clarifies, if it is spread, the hepatitis C virus, which comprises a) obtaining an isolated biological sample from the mother, and b) determining the genotype of the HLA and KIR genes in the sample isolated from step (a).
  • RNA-HCV (+) RNA-HCV (+)
  • the invention focuses on the following aspects:
  • a second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of a mother HCV-RNA (+) transmitting the hepatitis C virus vertically to its offspring, hereafter referred to as the first method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from the pregnant mother, and b) determining the genotype of the HLA-C and KIR genes in the sample isolated from step (a).
  • the genotype of the KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, and KIR2DS4 genes is determined
  • a third aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the vertical transmission of the hepatitis C virus to offspring, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) and (b) of the first method of the invention and further comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability at least 5 times greater, and preferably 6 times greater, of transmitting the hepatitis C virus vertically to its offspring if it presents the HLA-C2 genotype, compared to a mother who does not present it.
  • step (a2) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability at least 3 times greater, and preferably 3.9 times greater, of transmitting hepatitis C virus vertically to her offspring if she presents the genotype HLA-C2 in homozygosis (HLA-C2C2), compared to a mother who has another genotype.
  • c3) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability of at least 9 times greater, and preferably 10.7 times greater, of transmitting vertically Hepatitis C virus to its offspring if it presents the homozygous HLA-C2 genotype (HLA-C2C2) in combination with the KIR2DL2 and KIR2DL3 genotype, compared to a mother who does not present such genotypes.
  • c4) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability at least 5 times greater, and preferably 6 times greater, of transmitting the hepatitis C virus vertically to her offspring if she presents the HLA genotype.
  • step (a) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability at least 4 times greater, and preferably 5 times greater, of not transmitting the hepatitis C virus vertically to her offspring if she presents the HLA genotype -C1 or HLA-C1 in homozygosis (HLA-C1 C1), compared to a mother who does not present it.
  • step (a) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability at least 2 times greater, and preferably 2.5 times greater, of not transmitting the hepatitis C virus vertically to her offspring if she presents the HLA genotype
  • step (a) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a probability at least 3 times greater, and preferably 3.3 times greater, of not transmitting the hepatitis C virus vertically to her offspring if she presents the HLA-C1 genotype in combination with KIR2DS4, compared to a mother who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter the first kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 and / or KIR2DS4 genotypes.
  • the kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the genotypes HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 and / or KIR2DS4, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to the SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 and / or SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), SEQ ID NO : 8 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 and / or SEQ ID NO: 14 (KIR2DS4).
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the first kit or device of the invention for obtaining useful data to predict or predict the vertical transmission of the hepatitis C virus.
  • a sixth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of infection by vertical transmission of the hepatitis C virus of an individual with an RNA-HCV (+) mother, hereafter third method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from the individual, and b) detecting the genotype of the HLA-C and KIR genes in the sample isolated from step (a).
  • step (b) the genotype of the KIR2DL2, KIR2DL3, and KIR2DS3 genes is determined
  • a seventh aspect of the invention relates to a method for predicting or forecasting the risk of infection by vertical transmission of the hepatitis C virus of an individual with an RNA-HCV (+) mother, hereinafter the fourth method of the invention. , which comprises steps (a) and (b) according to the third method of the invention, and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a probability at least 3 times greater, and preferably 3.3 times greater, of be infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the homozygous HLA-C2 genotype (HLA-C2C2) compared to an individual who does not present it c2) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a probability at least 4 times greater, preferably 4.2 times greater, of being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the HLA-C2 genotype
  • KIR2DL2 / 2DL2 compared to an individual who does not present it.
  • c3) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a probability at least 13 times greater, and preferably 14 times greater, of being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the HLA genotype.
  • step (KIR2DL3 / 2DL3) compared to an individual who does not present it.
  • step (a) classify the individual of step (a), in the group of individuals with a probability at least 13 times greater, and preferably 14.3 times greater, of not being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the KIR2DS3 genotype, compared to an individual who does not present it.
  • step (a) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a probability at least 3 times greater, and preferably 3.3 times greater, of not being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the HLA-C1 genotype, compared to an individual who does not present it.
  • step (c6) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a probability at least 4 times greater, and preferably 5 times greater than not being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the HLA genotype.
  • the biological sample isolated from the individual in step (a) is a blood sample.
  • kits or devices hereafter second kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the HLA-C and KIR2DL2, KIR2DL3, and / or KIR2DS3 genotype.
  • the elements necessary to determine the HLA-C genotype and all KIR genes Preferably it comprises the elements necessary to determine the HLA-C genotype and all KIR genes.
  • the second kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, and / or KIR2DS3 genotypes, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), and / or SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3 );
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and
  • 500 base pairs which have an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, still much more preferably of at least 98%, and particularly of a 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), and / or SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a ninth aspect of the invention relates to the use of the first or second kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the vertical transmission of hepatitis C virus.
  • a tenth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the event that it is infected by vertical transmission, of hereinafter fifth method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from a pregnant mother, and b) determining the genotype of the HLA-DQA1, HLA-B and KIR genes in the sample isolated from step (a) .
  • step (b) the genotype of the KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL1 genes is determined.
  • An eleventh aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the timing of hepatitis C in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, hereafter referred to as the sixth method of the invention, which comprises steps (a) and (b) according to the fifth method of the invention, and also and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classify to the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the genotype HLADQA-01, in the group of individuals with a probability at least 1.5 times greater, and preferably 2 times higher, to chronicize hepatitis C, in comparison with an individual with a mother who does not present it.
  • c2) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the KIR2DS1 genotype, in the group of individuals with a probability at least 6 times greater, and preferably 7 times greater than chronicising hepatitis C, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • c3) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the KIR3DS1 genotype, in the group of individuals with a probability of at least 12 times greater, and preferably 13 times greater than chronicising hepatitis C, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • c4) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother presents the KIR3DL1 genotype in combination with KIR3DS1, in the group of individuals with a probability at least 12 times greater, and preferably 13 times greater than chronicizing hepatitis C , compared to an individual with a mother who does not present it.
  • c5) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the HLA-Bw6 genotype, in the group of individuals with a probability at least 14 times older, and preferably 15.6 times higher than chronic hepatitis C, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • a twelfth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter third kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the genotypes HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 and / or KIR3DL1 .
  • the third kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the genotypes HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 and / or KIR3DL1, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and
  • 500 base pairs which have an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, still much more preferably of at least 98%, and particularly of a 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO : 24 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a thirteenth aspect of the invention relates to the use of the third kit or device of the invention for obtaining useful data to predict or predict the risk of a individual with a mother RNA-HCV (+) chronic hepatitis C in the case that is infected by vertical transmission.
  • a fourteenth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the likelihood of an individual with an RNA-HCV (+) mother clearing up HCV in the event that it is infected by vertical transmission, now hereinafter the seventh method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from a pregnant mother, and b) determining the genotype of the HLA-B and KIR genes in the sample isolated from step (a).
  • step (b) the genotype of the KIR3DL1 gene is determined.
  • a fifteenth aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the clearance of HCV in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, hereafter referred to as the eighth method of the invention.
  • the eighth method of the invention which comprises steps (a) and (b) according to the seventh method of the invention, and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classify the individual with a mother pregnant women of step (a), if said mother presents the KIR3DL1 genotype in homozygosis, in the group of individuals with a probability at least 12 times greater, and preferably 12.5 times greater to clear the hepatitis C virus, compared with a individual with a mother who does not present it.
  • step (c2) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother presents the HLA-Bw4 genotype in homozygosis (HLA-Bw4-Bw4), in the group of individuals with a probability at least 16 times greater, and preferably 16 , 7 times greater than clearing up the hepatitis C virus, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • a sixteenth aspect of the invention relates to a kit or device, hereafter referred to as the fourth kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the HLA-B and / or KIR3DL1 genotypes.
  • the fourth kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the HLA-B and / or KIR3DL1 genotypes, and where: - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a seventeenth aspect of the invention relates to the use of the fourth kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the likelihood that an individual with an RNA-HCV (+) mother will clear the HCV in the event that be infected by vertical transmission.
  • An eighteenth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the likelihood of an individual with an RNA-HCV (+) mother clearing up HCV in the event that it is infected by vertical transmission, now hereinafter the ninth method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from an individual, and b) determining the genotype of the HLA-DQ and KIR genes in the isolated sample from step (a).
  • step (b) the genotype of the KIR2DS3 genes is determined.
  • a nineteenth aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the clearance of HCV in an individual with an RNA-HCV (+) mother, if it is infected by vertical transmission, hereafter referred to as the tenth method of the invention, which comprises steps (a) and (b) according to the ninth method of the invention, and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially c1) classify the individual from step (a) if he presents the genotype HLA-DQ * 03, in the group of individuals with a probability at least 18 times greater, and preferably 20 times greater to clarify the virus Hepatitis C, comparison with an individual who does not present it.
  • step (c2) classify the individual from step (a), if he presents the KIR2DS3 genotype, in the group of individuals with a probability at least 1.5 times greater, and preferably 2 times greater to clear up the hepatitis C virus, compared with a individual who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • a twentieth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter the fifth kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the HLA-DQ and / or KIR2DS3 genotypes.
  • the fifth kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the HLA-DQ and / or KIR2DS3 genotypes, and where: - the primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and even more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80 %, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) and / or SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
  • the primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and even more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80 %, more preferably at
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 27 (HLA-DQ) and / or SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) and / or SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a twenty-first aspect of the invention relates to the use of the fifth kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the probability that an individual with an RNA-HCV (+) mother will clear the HCV in the event that be infected by vertical transmission.
  • a twenty-second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the event that it is infected by vertical transmission, of hereinafter eleventh method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from an individual and another biological sample isolated from its pregnant mother, and b) determining the genotype of the HLA-A, HLA-B, HLA- genes C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 and HLA-DPB1 in the samples isolated from step (a).
  • a twenty-third aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the chronicity of hepatitis C in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, hereafter twelfth method of the invention, which comprises steps (a) and (b) according to the eleventh method of the invention, and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially c1) classifying the individual from the step (a), if it has at least 60% allelic corcondance in the HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and HLA genes -DPB1, and preferably at least 65.60% allelic agreement in said genes, with the pregnant mother of step (a), in the group of individuals with a probability at least 2 times greater, and preferably 3 times greater than chronify hepatitis C, compared to an individual who does
  • step (c2) classify the individual from step (a), if he has at least 50% allelic corcondance in the HLA-A, HLA-B and HLA-C genes, and preferably at least 58.40% allelic agreement in said genes, with the pregnant mother of step (a), in the group of individuals with a probability at least 1, 1 times greater, and preferably 1.9 times greater than chronifying hepatitis C, compared to an individual not presenting allelic agreement with his mother.
  • step (c3) classify the individual from step (a), if he has at least 70% allelic corcondance in the HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1 genes, and preferably at least 75% allelic agreement in said genes, with the pregnant mother of step (a), in the group of individuals with a probability of at least 1, 1 times greater, and preferably 1, 6 times higher of chronicising hepatitis C , in comparison with an individual who does not present allelic agreement with his mother.
  • the biological sample isolated from the individual of step (a) is a blood sample and the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • a twenty-fourth aspect of the invention relates to a kit or device, hereafter sixth kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the genotypes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 , HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and / or HLA-DPB1.
  • the sixth kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the genotypes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1 , HLA-DPA 1 and / or HLA-DPB1, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 ( HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) and / or SEQ ID NO: 47
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1 ), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) and / or SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).
  • HLA-A
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C) , SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) and / or SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1).
  • SEQ ID NO: 32 HLA-A
  • SEQ ID NO: 26 HLA-B
  • SEQ ID NO: 2 HLA-C
  • SEQ ID NO: 36 HLA-DRB1
  • SEQ ID NO: 18 HLA-DQA1
  • SEQ ID NO: 38 HLA-DQB1
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a twenty-fifth aspect of the invention relates to the use of the sixth kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the case that is infected by vertical transmission.
  • the methods or procedures for obtaining previously described useful data can be executed by computer means, whereby the invention also comprises the following aspects:
  • a twenty-sixth aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions to make, once the sample is taken and the corresponding genotypes determined, a computer to carry out the procedure according to any of the methods of the invention.
  • a twenty-seventh aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • a twenty-eighth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • Fig. 1 Diagnostic performance curves (ROC) for allelic concordance (All HLA, HLA-class I and HLA-class II).
  • vertical transmission means the transmission of an infection or other disease, in particular the transmission of the hepatitis C virus, from the mother to her child or offspring immediately before and after delivery during the perinatal period. Therefore, the transmissibility of a pathogen refers to its ability to transmit vertically. Vertical transmission is considered to have occurred when detected. Equivalently by “inheriting” means that the mother transmits the disease vertically to her offspring.
  • vertical transmission is understood as the transmission of any infectious agent from the mother to her child, intra-uterus, in childbirth or in the postnatal period either by breastfeeding or by intimate contact of the mother and the child.
  • Agents capable of transmitting intrauterine have the capacity to produce chorioamnionitis and alteration of the placental barrier related to abortions or malformations.
  • hepatitis B and C viruses the moment of maximum risk is childbirth and no transmission has been reported by breastfeeding.
  • the diagnosis of infection in children is made by the presence of positive HCV-RNA in at least two consecutive blood samples or by the presence of positive anti-HCV after 18 months of life. Chronization of HCV infection is the presence of HCV-RNA permanently. In this study children were determined HCV-RNA at birth, at 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 and 24 months and annually until 6 years.
  • hepatitis C virus refers to viruses classified in group IV (positive single-stranded RNA virus), from the Flaviviridae family and from the genus Hepacivirus.
  • the HLA-C gene belongs to the major heavy chain class I histocompatibility complex. This molecule is a heterodimer consisting of a heavy chain and a light chain (beta-2-microglobulin). The heavy chain is anchored in the membrane. Class I molecules play a central role in the immune system by presenting peptides derived from lumen of the endoplasmic reticulum. They are expressed in almost all cells. The heavy chain is approximately 45 kDa and its gene contains 8 exons.
  • Exon one encodes the domain of the leader peptide
  • exons 2 and 3 encode the alfal and alpha2 domains, both bind to the peptide
  • exon 4 encodes the alpha 3 domain
  • exon 5 encodes the transmembrane region
  • exons 6 and 7 encode the cytoplasmic tail.
  • the polymorphisms in exon 2 and exon 3 are responsible for the specificity of peptide binding of each class of a molecule. The study of these polymorphisms is performed routinely for bone marrow and kidney transplantation. More than a hundred HLA-C alleles have been described.
  • KIR genes belong to the killer cell immunoglobulin (KIR) type receptors, they are transmembrane glycoproteins expressed by cells and subsets of natural killer T cells. KIR genes are polymorphic and highly homologous and are found in a group on chromosome 19q13.4 in the 1 Mb leukocyte receptor complex (LRC). The gene content of the KIR gene cluster varies among haplotypes, although several "framework" genes are found in all haplotypes (KIR3DL3, KIR3DP1, KIR3DL4, KIR3DL2). KIR proteins are classified by the number of extracellular immunoglobulin domains (2D or 3D) and if they have a long (L) or short (S) cytoplasmic domain.
  • 2D or 3D extracellular immunoglobulin domains
  • KIR proteins with the long cytoplasmic domain transduce inhibitory signals after binding through an inhibitory motif based on an immune tyrosine ligand (ITIM), while KIR proteins with the short cytoplasmic domain lack the ITIM motif and instead of associating with TYRO protein tyrosine kinase binding protein to transduce activation signals.
  • ITIM immune tyrosine ligand
  • the ligands for various KIR proteins are subsets of HLA class I molecules; therefore, it is believed that KIR proteins play an important role in the regulation of the immune response.
  • genotype means the genetic information that a particular organism possesses, in the form of DNA. Normally the genome of a species includes numerous variations or polymorphisms in many of its genes. Genotyping is used to determine what specific variations exist in the individual. Specifically, the genotype can be defined as the set of genes of an organism, and even more specifically the "genotype of a gene” as the set of genetic information for that particular gene.
  • each kit or device described in the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • oligonucleotide (s) designed from a known sequence or an mRNA of the genes employed in the described methods, and / or capable of hybridizing with the sequences of said genes are immobilized in spots on a surface (preferably solid).
  • RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • Said custom matrix will preferably comprise fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less.
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • an “isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample is peripheral blood.
  • the term "individual”, as used in the description, refers to animals, preferably mammals, and more preferably, humans.
  • the term “individual” in this report is synonymous with "patient”, and is not intended to be limiting in any way, and may be of any age, sex and physical condition.
  • drug refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • the disease is caused by infection of the hepatitis C virus.
  • a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five biologically occurring bases (adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) and / or bases other than those five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit probe degradation; or as junction points for detectable debris or screening debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more modified, non-standard, derivatized base moieties, including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -tert-butyl-benzyl-adenine, imidazole, Substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5- chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylamino, dihydroxymethylamino, dihydroxymethylaminomethyl D- galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1- methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methylladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methyl
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar moieties including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinous, xylulose, and a hexose.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence referring to polymeric forms of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • the present invention means biologically active variant or fragment, those variants or fragments of the indicated peptides that have the same physiological, metabolic or immunological effect, or have the same utility as those described. That is, they are functionally equivalent. Such effects can be determined by conventional methods.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the technical, and include, but not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN , and FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410. In preferred embodiments of the invention, genotype determination is performed by PCR. In another preferred embodiment, the detection further comprises the use of Luminex technology.
  • Luminex xMAP technology is based on the use of 5.6 micron polystyrene beads (beads), each internally dyed / colored with a unique combination of red and infrared dye. The combination of different intensities of the two dyes allows the identification of each pearl by its unique characteristic when stimulated by a laser beam. This allows to analyze up to 100 parameters simultaneously in a single tube.
  • the chemistry of the surface of the spheres allows them to be chemically coated with a number of different objects, including HLA DNA sequences and HLA antigens.
  • the spheres can therefore be used to determine the presence or absence of specific analytes in the samples.
  • the Luminex platform uses the principles of flow cytometry to align the spheres and pass them through a pair of lasers. A red laser is used to stimulate and thus identify specific spheres and a green laser is used to stimulate and thus detect any dye associated with the spheres during the test. Since the identification of the beads and the associated fluorescence captured by the spheres is performed on each individual bead, a multiplexed system can be developed with, normally, up to 100 spheres.
  • HLA typing using Luminex requires a previous step that involves amplification by PCR (PCR) of specific regions within the MHC class I or II with specific primer groups (primers), with specific oligonucleotides or probes. sequences (PCR-SSO) followed by an amplicon probing process with Luminex spheres, each covered with probes of sequence specific oligonucleotides to identify the presence or absence of specific alleles. The HLA type assignment is then based on the observed standard reaction, and the sequence is compared with different known patterns.
  • PCR PCR-SSO
  • the primers / primers used for amplification are biotinylated.
  • the amplification can be symmetric, which therefore requires a denaturation step to create two single strands or it can be asymmetric to generate an excess of a single strand.
  • the only braided product is then hybridized by a thermocycler at 60 ° C and subsequently with a multiplex of up to 100 beads, they can be identified by their internal staining selectively, since they are coated with specific oligonucleotide sequences.
  • the amplified DNA hybridizes the complementary DNA probed in the spheres. Next, the methodology requires several washing stages.
  • the bound amplicon is detected by labeling with a streptavidin-phycoerythrin (SAPE) conjugate, with biotin-binding streptavidin used to label the initiators and phycoerythrin serving as the associated dye for the presence of bound amplicon. Again a washing step may be necessary depending on the kit in use. Finally the samples are passed to a plate for reading in the Luminex through the use of specific software, and are subsequently determined with the appropriate program that will be the one that generates the complete typing.
  • SAPE streptavidin-phycoerythrin
  • the first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of a mother carrying the hepatitis C virus (RNA-HCV (+)) transmitting vertically the virus to its offspring, or that an individual whose mother is a carrier of the hepatitis C virus, inherits and / or chronifies and / or clarifies, if it is spread, the hepatitis C virus, which comprises: a) obtain an isolated biological sample from the mother, and b) determine the genotype of the HLA and KIR genes in the isolated sample from step (a).
  • RNA-HCV (+) hepatitis C virus
  • the authors of the present invention have studied the importance of the HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4 and KIR2DS3 markers in the probability that an RNA-HCV (+) mother transmits vertically the Hepatitis C virus at its offspring and / or, in the probability of infection by vertical transmission of hepatitis C virus from an individual with a mother RNA-HCV (+).
  • a second aspect of the invention relates to a method, first method of the invention, of obtaining useful data to predict or predict the risk of a mother RNA-HCV (+) transmitting hepatitis C virus vertically to their offspring, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from the pregnant mother, and b) detecting the genotype of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4) in the sample isolated from step (a).
  • a third aspect of the invention relates to a method, hereafter second method of the invention, of obtaining useful data to predict or predict the vertical transmission of hepatitis C virus, which comprises steps (a) and ( b) according to the first method of the invention, and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classifying the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 5 times greater, preferably at least 6 times greater, and even more preferably 6.2 times greater than transmitting hepatitis C virus vertically to its offspring if it has the HLA-C2 genotype, compared to A mother who doesn't present it.
  • step (a2) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 2 times greater, preferably at least 3 times greater, and even more preferably 3.9 times greater than transmitting the virus vertically Hepatitis C to his offspring if he presents the HLA-C2 genotype in homozygosis (HLA-C2C2), compared to a mother who does not present it.
  • step (a) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 9 times greater, preferably at least 10 times greater, and even more preferably 10.7 times greater than transmitting the virus vertically Hepatitis C at his offspring if he presents the homozygous HLA-C2 genotype (HLA-C2C2) in combination with KIR2DL2 and KIR2DL3, compared to a mother who does not present it.
  • HLA-C2C2 homozygous HLA-C2 genotype
  • step (a) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 4 times greater, preferably at least 5 times greater, and even more preferably 6 times greater to transmit hepatitis virus vertically C to its offspring if it presents the HLA-C2 genotype in combination with KIR2DL1 or HLA-C2 in combination with KIR2DS4, compared to a mother who does not present it.
  • step (a) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 3 times greater, preferably at least 4 times greater, and even more preferably 5 times greater than not transmitting vertically the virus of the Hepatitis C at his offspring if he presents the HLA-C1 or HLA-C1 genotype in homozygosis (HLA-C1 C1), compared to a mother who does not present it.
  • c6) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 2 times greater, and even more preferably 2.5 times greater than not transmitting the hepatitis C virus vertically to her offspring if it presents the HLA-C1 genotype in combination with KIR2DL3, compared to a mother who does not present it.
  • c7) classify the mother of step (a), in the group of mothers with a greater probability, at least 2 times greater, preferably at least 3 times greater, and even more preferably 3.3 times greater than not transmitting the virus vertically of hepatitis C to its offspring if it presents the HLA-C1 genotype in combination with KIR2DS4, compared to a mother who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • Steps (b) and / or (c) of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in step (b) or the computerized classification in step (c).
  • step (b) is performed by PCR.
  • the detection further comprises the use of Luminex technology.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter the first kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the genotype of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), as defined by the first method of the invention.
  • the first kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 and / or SEQ ID NO: 13, as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), for subsequent PCR amplification. More preferably the sequences of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as for example , but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a digoxigenin molecule
  • the first kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the genotypes HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 and / or KIR2DS4, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 and / or SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO:
  • the kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically at least 90%, preferably at least 95% , more preferably, at least 98%, even more preferably, at least 99%.
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • FITC Fluorescein
  • PE Tetramethylrodamine
  • PE Phycoerythrin
  • PerCP PerCP
  • Cy5 Texas
  • allophycocyanin or any combination thereof.
  • Another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the HLA-C and / or KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3 , KIR2DL1, KIR2DS4).
  • sequences of the HLA-C and / or KIR are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the first kit or device. of the invention, for obtaining useful data to predict or predict the vertical transmission of hepatitis C virus.
  • a sixth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of infection by vertical transmission of the hepatitis C virus of an individual with an RNA-HCV (+) mother, hereafter third method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from the individual, and b) detecting the genotype of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3) in the sample isolated from step (a).
  • a seventh aspect of the invention relates to a method, fourth method of the invention, of obtaining useful data to predict or predict the risk of infection by vertical transmission of hepatitis C virus of an individual with an RNA-HCV mother ( +), which comprises steps (a) and (b) of the third method of the invention, and also comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classifying the individual from the step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 3 times greater, preferably 4 times greater, and even more preferably 4.2 times greater than being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus if it presents the HLA-C2 homozygous genotype (HLA-C2C2) in combination with the homozygosis of KIR2DL2 (KIR2DL2 / 2DL2), compared to an individual who does not present it.
  • HLA-C2C2 HLA-C2 homozygous genotype
  • step (c2) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 13 times greater, preferably 13.5 times greater, and even more preferably 14 times greater than being infected by vertical transmission by the virus of hepatitis C if it presents the homozygous HLA-C2 genotype (HLA-C2C2) in combination with the homozygosis of KIR2DL3 (KIR2DL3 / 2DL3), compared to an individual who does not present it.
  • c3) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 13 times greater, preferably 14 times greater, and even more preferably 14.3 times greater than not being infected by vertical transmission by the Hepatitis C virus does have the KIR2DS3 genotype, compared to an individual who does not present it.
  • c4) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 2 times greater, preferably 3 times greater, and even more preferably 3.3 times greater if not infected by vertical transmission by the Hepatitis C virus does have the HLA-C1 genotype, compared to an individual who does not present it.
  • step (a) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 4 times greater, preferably 4.5 times greater, and even more preferably 5 times greater if not infected by vertical transmission by the Hepatitis C virus does have the HLA-C1 genotype in combination with KIR2DL3, compared to an individual who does not present it.
  • the biological sample isolated from the individual of step (a) is a blood sample.
  • steps (b) and / or of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in the step (b) or the computerized classification in the step (c ).
  • An eighth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter second kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the genotype of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3) , as defined by the third method of the invention.
  • the second kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 15, as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the second kit or device of the invention may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the HLA-C genes. and KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), for subsequent PCR amplification. More preferably the sequences of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, for example, but without limiting our to, nucleotides that have any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • the second kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 16 or against amino acid sequences having a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of , at least 98%, even more preferably, at least 99%.
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the second kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, and / or KIR2DS3 genotypes, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KI R2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), and / or SEQ ID NO: 15 ( KIR2DS3); - the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO:
  • KIR2DL3 KIR2DL3
  • KIR2DS3 SEQ ID NO: 16
  • Another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3 ). More preferably the sequences of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • a ninth aspect of the invention relates to the use of the second kit or device of the invention, in order to obtain useful data to predict or predict the risk of infection by vertical transmission of the hepatitis C virus of a child with an RNA-HCV mother. (+).
  • the authors of the present invention have studied the importance of the markers HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA- DRB 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1 in the likelihood of an individual chronizing hepatitis C and the likelihood of clearing up the hepatitis C virus.
  • a tenth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the event that it is infected by vertical transmission.
  • fifth method of the invention comprising: a) obtaining an isolated biological sample from a pregnant mother, and b) determine the genotype of the HLA-DQA1, HLA-B and KIR genes in the sample isolated from step (a).
  • step (b) the genotype of the KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL1 genes is determined.
  • An eleventh aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the timing of hepatitis C in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, henceforth the sixth method of The invention, which comprises steps (a) and (b) according to the fifth method of the invention, and further comprises one or more of the following steps, preferably all of them and more preferably all of them sequentially: c1) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the genotype HLADQA-01, in the group of individuals with a greater probability, at least 1.5 times greater, and preferably 2 times greater than chronizing hepatitis C, in comparison with an individual with a mother who does not present it.
  • c2) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the KIR2DS1 genotype, in the group of individuals with a greater probability, at least 6 times greater, and preferably 7 times greater than chronizing hepatitis C, in comparison with an individual with a mother who does not present it.
  • c3) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the KIR3DS1 genotype, in the group of individuals with a greater probability, at least 12 times greater, and preferably 13 times greater than chronizing hepatitis C, in comparison with an individual with a mother who does not present it.
  • c4) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother presents the KIR3DL1 genotype in combination with KIR3DS1, in the group of individuals with a greater probability, at least 12 times greater, and preferably 13 times greater than chronifying the hepatitis C, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • c5) classify the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother has the HLA-Bw6 genotype, in the group of individuals with a greater probability, at least 14 times greater, and preferably 15.6 times greater than chronifying the hepatitis C, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • Steps (b) and / or (c) of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in step (b) or the computerized classification in step (c).
  • step (b) is performed by PCR.
  • the detection further comprises the use of Luminex technology.
  • a twelfth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter third kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the genotypes HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 and / or KIR3DL1 .
  • the third kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 and / or SEQ ID NO: 25, as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the HLA-DQA1, HLA-B and KIR genes. (KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL1), for subsequent PCR amplification. More preferably the sequences of the HLA-DQA1, HLA-B and KIR genes (KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL1), are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as for example, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • the third kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the genotypes HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 and / or KIR3DL1, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to the SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B) .
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO : 24 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
  • the kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26, or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably, at least 98%, even more preferably, at least 99%.
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the HLA-DQA1 genes, HLA-B and KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL1). More preferably the sequences of the HLA-DQA1, HLA-B and KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL1) are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a thirteenth aspect of the invention relates to the use of the third kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the case that is infected by vertical transmission.
  • chronicification of hepatitis C in children is understood as the presence of positive HCV-RNA in at least two consecutive blood samples or the presence of positive anti-HCV after 18 months of life. Chronization of HCV infection is the presence of HCV-RNA permanently.
  • the study in children consists in determining the HCV-RNA at birth, at 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 and 24 months and annually until 6 years.
  • INF-alpha is a therapeutic proposal with a safety and ef Reasonable icacia for the treatment of chronic hepatitis C in children.
  • the combined treatment with ribavirin Wirth S, Hepatology 2002 Nov; 36 (5): 1280-4) has also been tested, improving the previous results, since the response rate 61% virological, although the presence of serious adverse effects is 21%.
  • the effectiveness of IFN-Peg plus ribavirin is unknown.
  • hepatitis C virus refers to viruses classified in group IV (positive single-stranded RNA virus), from the Flaviviridae family and from the genus Hepacivirus.
  • a fourteenth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the likelihood of an individual with an RNA-HCV (+) mother clearing up HCV in the event that it is infected by vertical transmission, now hereinafter the seventh method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from a pregnant mother, and b) determining the genotype of the HLA-B and KIR genes in the sample isolated from step (a).
  • step (b) the genotype of the KIR3DL1 gene is determined.
  • a fifteenth aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the clearance of HCV in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, hereafter referred to as the eighth method of the invention.
  • the eighth method of the invention which comprises steps (a) and (b) according to the seventh method of the invention, and also comprises: c1) classifying the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother presents the KIR3DL1 genotype in homozygosis, in the group of individuals with a greater probability, at least 12 times greater, and preferably 12.5 times greater to clear up the hepatitis C virus, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • the eighth method of the invention comprises: c2) classifying the individual with a pregnant mother from step (a), if said mother presents the HLA-Bw4 genotype in homozygosis (HLA-Bw4-Bw4), in the group of individuals with a higher probability, at least 16 times higher, and preferably 16.7 times higher to clear up the hepatitis C virus, compared to an individual with a mother who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • the steps (b) and / or of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in the step (b) or the computerized classification in the step (c ).
  • a sixteenth aspect of the invention relates to a kit or device, hereafter referred to as the fourth kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the HLA-B and / or KIR3DL1 genotypes.
  • the fourth kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 , as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the fourth kit or device of the invention may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the HLA-B genes. and KIR (KIR3DL1), for subsequent PCR amplification. More preferably the sequences of the HLA-B and KIR genes (KIR3DL1), are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • the fourth kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26 or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98%, even more preferably of, at least 99%
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the fourth kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the HLA-B and / or KIR3DL1 genotypes, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, even more preferably of at least one 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 23 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) and / or SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
  • the fourth kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the HLA-B and KIR genes (KIR3DL1) . More preferably the sequences of the HLA-B and KIR genes (KIR3DL1) are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a seventeenth aspect of the invention relates to the use of the fourth kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the likelihood that an individual with an RNA-HCV (+) mother will clear the HCV in the event that be infected by vertical transmission.
  • RNA- HCV negative RNA- HCV negative.
  • the study in children consists in determining the HCV-RNA at birth, at 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 and 24 months (or until hospital discharge).
  • An eighteenth aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the likelihood of an individual with an RNA-HCV (+) mother clearing up HCV in the event that it is infected by vertical transmission, now hereinafter the ninth method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from an individual, and b) determining the genotype of the HLA-DQ and KIR genes in the isolated sample from step (a). In a preferred embodiment of this aspect of the invention, in step (b) the genotype of the KIR2DS3 genes is determined.
  • a nineteenth aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the clearance of HCV in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, hereinafter the tenth method of the invention. , which comprises steps (a) and (b) according to the ninth method of the invention, and also comprises: c1) classifying the individual from step (a) if he presents the genotype HLA-DQ * 03, in the group of individuals with a greater probability, at least 18 times greater, and preferably 20 times greater to clear up the hepatitis C virus, compared to an individual who does not present it.
  • the tenth method of the invention comprises: c2) classifying the individual from step (a), if he has the KIR2DS3 genotype, in the group of individuals with a greater probability, at least 1.5 times greater, and preferably 2 times greater than clearing up the hepatitis C virus, compared to an individual who does not present it.
  • the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • a twentieth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter the fifth kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the HLA-DQ and / or KIR2DS3 genotypes.
  • the fifth kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 15 , as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the fifth kit or device of the invention may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the HLA-DQ genes. and KIR (KIR2DS3), for subsequent PCR amplification. More preferably the sequences of the HLA-DQ and KIR genes (KIR2DS3), are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • the fifth kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 16 or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98%, even more preferably of, at least 99%
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the fifth kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the HLA-DQ and / or KIR2DS3 genotypes, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) and / or SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 27 (HLA-DQ) and / or SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) and / or SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
  • the fifth kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the oligonucleotide (s) are immobilized in spots on a (preferably solid) surface. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the HLA-DQ and KIR genes (KIR2DS3) . More preferably the sequences of the HLA-DQ and KIR genes (KIR2DS3) are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a twenty-first aspect of the invention relates to the use of the fifth kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the probability that an individual with an RNA-HCV (+) mother will clear the HCV in the event that be infected by vertical transmission.
  • a twenty-second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the event that it is infected by vertical transmission, of hereinafter eleventh method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from an individual and another biological sample isolated from its pregnant mother, and b) determine the genotype of the HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 and HLA-DPB1 genes in the samples isolated from step (a) .
  • a twenty-third aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the chronicity of hepatitis C in an individual with an RNA-HCV (+) mother in the event that it is infected by vertical transmission, hereafter twelfth method of The invention, which comprises steps (a) and (b) according to the eleventh method of the invention, and further comprises: c1) classifying the individual from step (a), if it presents allelic agreement in the HLA-A, HLA- genes B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1, at least 60% allelic matching, and preferably at least 65.60% allelic agreement in said genes, with the pregnant mother of step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 2 times greater, and preferably 3 times greater than chronizing hepatitis C, compared to an individual who does not present concordance Allelic with his mother.
  • the twelfth method of the invention comprises: c2) classifying the individual from step (a), if he has allelic agreement in the genes in the HLA-A, HLA-B and HLA-C genes, at least 50 % allelic corcondance, and preferably at least 58.40% allelic agreement in said genes, with the pregnant mother of step (a), in the group of individuals with a greater probability, at least 1, 1 times greater, and preferably 1.9 times greater than chronic hepatitis C, compared to an individual not presenting allelic agreement with his mother.
  • the twelfth method of the invention comprises: c3) classifying the individual from step (a), if he has allelic agreement in the HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 genes and HLA-DPB1, at least 70% allelic corcondance, and preferably at least 75% allelic concordance in said genes, with the pregnant mother of step (a), in the group of individuals with a higher probability, at least 1, 1 times greater, and preferably 1, 6 times greater than chronizing hepatitis C, compared to an individual who does not show allelic agreement with his mother.
  • the biological sample isolated from the individual of step (a) is a blood sample and the biological sample isolated from the pregnant mother of step (a) is a blood sample.
  • the steps (b) and / or of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in the step (b) or the computerized classification in the step (c ).
  • a twenty-fourth aspect of the invention relates to a kit or device, hereafter sixth kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the genotypes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 , HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA1 and / or HLA-DPB1.
  • the sixth kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 25 , SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 or SEQ ID NO: 47, as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the fifth kit or device of the invention may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the HLA-A genes. , HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1, for subsequent PCR amplification. More preferably the sequences of the genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1, are the nucleotide sequences indicated for each gene in Table 1.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • the sixth kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 48 or front to amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98%, even more preferably, at least 99%.
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the sixth kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the genotypes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1 , HLA-DPA1 and / or HLA-DPB1, and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 ( HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) and / or SEQ ID NO: 47
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1 ), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) and / or SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).
  • HLA-A
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C) , SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) and / or SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1).
  • the sixth kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the oligonucleotide (s) are immobilized in spots on a (preferably solid) surface.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the HLA-A, HLA-B genes, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1. More preferably the sequences of the HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA1 and / or HLA-DPB1 genes are the nucleotide sequences indicated for each gene in table 1.
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological screening.
  • a twenty-fifth aspect of the invention relates to the use of the sixth kit or device of the invention to obtain useful data to predict or predict the risk of an individual with an RNA-HCV (+) mother chronizing hepatitis C in the case that is infected by vertical transmission.
  • the HLA-A, HLA-B and HLA-C genes belong to the major heavy chain class I histocompatibility complex. These molecules are heterodimers consisting of a heavy chain and a light chain (beta-2-microglobulin). The heavy chain is anchored in the membrane. Class I molecules play a central role in the immune system by presenting peptides derived from lumen of the endoplasmic reticulum. They are expressed in almost all cells. The heavy chain is approximately 45 kDa and its gene contains 8 exons.
  • Exon one encodes the domain of the leader peptide
  • exons 2 and 3 encode the alfal and alpha2 domains, both bind to the peptide
  • exon 4 encodes the alpha 3 domain
  • exon 5 encodes the transmembrane region
  • exons 6 and 7 encode the cytoplasmic tail.
  • the polymorphisms in exon 2 and exon 3 are responsible for the specificity of peptide binding of each class of a molecule. The study of the polymorphisms of these genes is performed routinely for bone marrow and kidney transplantation. More than a hundred HLA-A, HLA-B and HLA-C alleles have been described.
  • HLA-DQA1 genes belong to the class II alpha and beta chain HLA.
  • the class II molecule is a heterodimer consisting of an alpha (DQA) and a beta chain (DQB), both anchored in the membrane. It plays a central role in the immune system by presenting peptides derived from extracellular proteins. Class II molecules are expressed in antigen presenting cells (APC: B lymphocytes, dendritic cells, macrophages).
  • APC antigen presenting cells
  • the alpha chain is approximately 33-35 kDa.
  • both the alpha chain and the beta chain contain polymorphisms that specify peptide binding specificities, resulting in up to four different molecules. The determination of these polymorphisms is performed routinely for bone marrow transplantation.
  • HLA-DRB1 belongs to the HLA class II of the beta chain.
  • the class II molecule is a heterodimer consisting of an alpha (DRA) and a beta chain (DRB), both anchored to the membrane.
  • the beta chain is approximately 26-28 kDa. It is encoded by 6 exons. Exon one encodes the leader peptide; exons 2 and 3 encode the two extracellular domains; exon 4 encodes the transmembrane domain; and exon 5 encodes the cytoplasmic tail. Within the DR molecule the beta chain contains all polymorphisms that specify the specificities of peptide binding. Hundreds of DRB1 alleles have been described and typing of these polymorphisms is performed routinely for bone marrow and kidney transplantation.
  • DRB1 is expressed at a level five times higher than its DRB3, DRB4 and DRB5 paralogs. DRB1 is present in all individuals. Allelic variants of DRB1 are linked to either or one of the DRB3, DRB4 and DRB5 genes. There are 4 related pseudogenes: DRB2, DRB6, DRB7, DRB8 and DRB9. HLA-DPA1 and HLA-DPB1 belong to the HLA class II alpha and beta chain. This class II molecule is a heterodimer consisting of an alpha (DPA) and a beta chain (DPB), both anchored in the membrane. It plays a central role in the immune system by presenting peptides derived from extracellular proteins.
  • DPA alpha
  • DRB beta chain
  • Class II molecules are expressed in antigen presenting cells (APC: B lymphocytes, dendritic cells, macrophages).
  • the alpha chain is approximately 33-35 kDa and its gene contains 5 exons. Exon one encodes the leader peptide, exons 2 and 3 encode the two extracellular domains, exon 4 encodes the transmembrane domain and the cytoplasmic tail. Within the DP molecule both the alpha chain and the beta chain contain polymorphisms that specify peptide binding specificities, resulting in a maximum of 4 different molecules.
  • KIR genes belong to the immunoglobulin-like receptors of killer cells ( KIR), are transmembrane glycoproteins expressed by cells and subsets of natural killer T cells.
  • KIR genes are polymorphic and highly homologous and are found in a group on chromosome 19q13.4 in the 1 Mb leukocyte receptor complex (LRC).
  • LRC 1 Mb leukocyte receptor complex
  • the gene content of the KIR gene cluster varies among haplotypes, although several "framework" genes are found in all haplotypes (KIR3DL3, KIR3DP1, KIR3DL4, KIR3DL2).
  • KIR proteins are classified by the number of immunoglobulin domains extracellular (2D or 3D) and if they have a long (L) or short (S) cytoplasmic domain.
  • KI R proteins with the long cytoplasmic domain transduce inhibitory signals after binding through an inhibitory motif based on an immune tyrosine ligand (ITIM), while KI R proteins with the short cytoplasmic domain lack the ITIM motif and instead of Associate with the TYRO protein tyrosine kinase binding protein to transduce activation signals.
  • ITIM immune tyrosine ligand
  • the ligands for various KIR proteins are subsets of HLA class I molecules; therefore, it is believed that KI R proteins play an important role in the regulation of the immune response.
  • HLA-B Complex greater than 3106 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 histocompatibility
  • HLA-DQB3 Complex greater than 3121 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 histocompatibility
  • HLA-A Complex greater than 3105 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 histocompatibility
  • HLA-DRB1 Complex greater than 3123 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 histocompatibility
  • HLA-DQB1 Complex greater than 31 19 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, histocompatibility, SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 Class II, DQ beta 1
  • HLA-DPA1 Complex greater than 31 13 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, histocompatibility, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, Class II, DP alpha 1 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46
  • HLA-DPB1 Complex greater than 31 15 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 histocompatibility
  • SEQ ID NO: 20 MSLTVVSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHR EGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMKQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSEPLDIVILY KPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGTKVNGTFQANFPLGP ATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLHVLIGTS VVKIPFWLDQDNDVQDNVDWJVRDVDJVDJVDJDJRKJDJDVDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDJDKDJDVDJDJDJDKJDKJDVDJDJDJDKJDKJDKDJDVDJDJDJDKJDKJDK
  • SEQ ID NO: 22 MLLMVVSMACVGLFLVQRAGPHMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNNFMLY KEDRIHVPIFHGRIFQEGFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPMVRVPGGNPMHRIM SLLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEWISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGSMMRA LAGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGLYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRSSYD MYHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPLLV SVTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNLRHLHILIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKKCCCNGPRAC REQK
  • SEQ ID NO: 26 MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSD AASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMYG CDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEG ECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQT QDTELVETRPAGDRTFQKWAAWVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSTVPIVGIV AGLAVLAWVIGAWAAVMCRRKSSGGKGGSYSQAACSDSAQGSDVSLTA
  • the genes HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4 and KIR2DS3 are also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the proteins collected respectively in Table 1, being said proteins the expression product of each of the genes identified in the table. Additionally, the present invention comprises several variants from each of
  • variants of the sequences associated with the HLA-C gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said acids Nucleic possesses the activity and structural characteristics of the HLA-C protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 1 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DL2 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at minus 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 4 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the Structural characteristics of the KIR2DL2 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 3 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DL3 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at minus 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 6 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and The structural characteristics of the KIR2DL3 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 5 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DL1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at minus 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 8 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the structural characteristics of the KIR2DL1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 7 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DS4 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 listed in Table 1.
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KIR2DS4 protein.
  • SEQ ID NO: 9 nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DS3 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of al minus 80%, 90%, 95%, one
  • the genes HLA-DQA 1, KIR KIR2DS1, KIR3DS1 and KIR3DL 1, KIR2DS3
  • HLA-B HLA-DQB3 are also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the proteins collected respectively in Table 1, said proteins being the expression product of each of the genes identified in the table.
  • the present invention comprises several variants from each of the sequences identified in Table 1.:
  • variants of the sequences associated with the HLA-DQA 1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 set forth in Table 1. b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 18 collected in Table 1, respectively, and in which The polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-DQA1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 17 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DS1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 20 listed in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and Structural characteristics of the KIR2DS1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 19 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR3DS1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, one 98% or 99% with SEQ ID NO: 22 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KIR3DS1 protein.
  • nucleic acid molecules are the collection in SEQ ID NO: 21 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR3DL1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of the SEQ ID NO: 24 listed in Table 1.
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the code genetic, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 24 collected in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KIR3DL1 protein.
  • SEQ ID NO: 23 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-B gene include: a) nucleic acid molecule that encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 26 collected in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the structural characteristics of the HLA-B protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 25 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-DQB3 gene include: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a) c) acid molecules nucleic whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95 %, 98% or 99% with SEQ ID NO: 28 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-DQB3 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 27 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the KIR2DS3 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 16 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and Structural characteristics of the KIR2DS3 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 15 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-A gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 32 collected in the Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-A protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 33 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-C gene include: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2 listed in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the structural characteristics of the HLA-C protein.
  • nucleic acid molecules are the collection in SEQ ID NO: 1 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-DRB1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 listed in Table 1.
  • nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to degeneration of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 36 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-DRB1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 35 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-DQB1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 40 listed in Table 1. b) molecules of nucleic acid whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 40 listed in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-DQB1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 39 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-DPA 1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46 collected in the Table 1.
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46 collected in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-DPA1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 45 indicated in Table 1.
  • Variants of the sequences associated with the HLA-DPB1 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 48 collected in Table 1, respectively, and in which The polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HLA-DRB1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 47 indicated in Table 1.
  • another aspect of the invention relates to a method for assigning an RNA-HCV (+) mother to one of two groups, in which the first group comprises mothers identifiable by the first or second method of the invention (they have an approximate probability of 6.2, 3.9, 10.7 or 6 times higher of transmitting the hepatitis C virus vertically to its offspring); and in which the second group represents the rest of the mothers.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for use in the treatment of an RNA-HCV (+) mother with a greater probability of transmitting hepatitis C virus vertically to its offspring identifiable by the first or second method of the invention, or alternatively, to the use of a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for the preparation of a medicament for the treatment of a mother RNA-HCV (+ ) most likely to transmit the virus vertically hepatitis C at its offspring identifiable by the method according to the first or second method of the invention.
  • Antiviral drugs that can be used for the treatment of a mother RNA-HCV (+) with a higher probability of transmitting the hepatitis C virus vertically are, among others, but not limited to, pegylated interferon, ribavirin, telaprevir, boceprevir, simeprevir , sofusbuvir, declatasvir, or any combination thereof.
  • Another aspect of the invention relates to a method for assigning an individual with an RNA-HCV (+) mother to one of two groups, in which the first group comprises individuals with an RNA-HCV (+) mother identifiable by the third or fourth method of the invention (they are 3.3, 4.2 or 14 times more likely to be infected by vertical transmission by the hepatitis C virus); and in which the second group represents the rest of the individuals with an RNA-HCV (+) mother.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for use in the treatment of an individual with an RNA-HCV (+) mother with a higher probability of being infected by vertical transmission.
  • an antiviral drug preferably of direct action
  • a pharmaceutical composition comprising antiviral drug, preferably of direct action, for the preparation of a medicament for the treatment of an individual with a mother RNA-HCV (+) with the XXXX probability of being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus identifiable by the method according to the third or fourth method of the invention.
  • Antiviral drugs that can be used for the treatment of an individual with an RNA-HCV (+) mother with a higher probability of being infected by vertical transmission by the hepatitis C virus are, among others, but not limited to, pegylated interferon , ribavirin, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, or any combination thereof.
  • Another aspect of the invention relates to a microarray, hereinafter the first microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or mRNA of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3 , KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DS3). More preferably the sequences of the HLA-C and KIR genes (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DS3) are the corresponding nucleotide sequences indicated in Table 1.
  • Another aspect of the invention relates to a protein microarray, hereinafter the first protein microarray of the invention, comprising antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 or against amino acid sequences that present a degree of identity with said amino acid sequences from, at least 85%, typically from, at least 90%, preferably from, at least 95%, more preferably from, at least 98%, even more preferably from, at least 99%.
  • the probes are antibodies fixed to glass slides and the targets are samples of serum or tissue.
  • Another aspect of the invention relates to a method for assigning an individual with an RNA-HCV (+) mother to one of two groups, in which group 1 comprises individuals identifiable by the first or sixth method of the invention (they are approximately 2, 7, 13 or 15.6 times more likely to chronicize hepatitis C if they are infected by vertical transmission); and in which group 2 represents the rest of individuals.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for use in the treatment of an individual who is more likely to chronicize hepatitis C in the event that it is infected by vertical, identifiable transmission.
  • a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for the preparation of a medicament for the treatment of an individual with a greater probability of chronicising hepatitis C in the case that it is infected by vertical transmission, identifiable by the method according to the fifth or tenth method of the invention.
  • Antiviral drugs that can be used for the treatment of an individual with a higher probability of chronic hepatitis C in the case that is infected by vertical transmission are, among others, but not limited to, pegylated interferon, ribavirin, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, or any combination thereof.
  • another aspect of the invention relates to a method for assigning an individual with an RNA-HCV (+) mother to one of two groups, in which group 3 comprises individuals identifiable by the seventh or twelfth method of the invention (they are approximately 12.5 or 16.7 times more likely to clear up the hepatitis C virus if they are infected by vertical transmission); and in which group 4 represents the rest of individuals.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for use in the treatment of an individual who is more likely not to clear up the hepatitis C virus if it is infected by vertical transmission, identifiable by the seventh or twelfth method of the invention, or alternatively, to the use of a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for the preparation of a medicament for the treatment of an individual with a greater probability not clear the hepatitis C virus if it is infected by vertical transmission, identifiable by the method according to the seventh or twelfth method of the invention.
  • Antiviral drugs that can be used for the treatment of an individual with a higher probability of not clearing up the hepatitis C virus in the case that it is spread by vertical transmission are, among others, but not limited to, pegylated interferon, ribavirin, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, or any combination thereof.
  • another aspect of the invention relates to a method for assigning an individual with an RNA-HCV (+) mother to one of two groups, in which the first group comprises individuals identifiable by the ninth or fourteenth method of the invention (they are approximately 2 or 20 times more likely to clear up the hepatitis C virus if they are infected by vertical transmission); and in which the second group represents the rest of individuals.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for use in the treatment of an individual who is more likely not to clear up the hepatitis C virus if it is infected by vertical transmission, identifiable by the seventh or twelfth method of the invention, or alternatively, to the use of a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for the preparation of a medicament for the treatment of an individual with a greater probability not clear up hepatitis C virus in the case that it is infected by vertical transmission, identifiable by the ninth or fourteenth method of the invention.
  • Antiviral drugs that can be used for the treatment of an individual with a higher probability of not clearing up the hepatitis C virus in the case that it is spread by vertical transmission are, among others, but not limited to, pegylated interferon, ribavirin, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, or any combination thereof.
  • another aspect of the invention relates to a method for assigning an individual with an RNA-HCV (+) mother to one of two groups, in which the first group comprises individuals identifiable by the eleventh or sixteenth method of the invention (they are approximately 3, 1, 9, or 1, 6 times more likely to chronize hepatitis C if they are infected by vertical transmission); and in which the second group represents the rest of individuals.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for use in the treatment of an individual with a greater probability of chronicizing hepatitis C in the event that it is infected by identifiable vertical transmission by the eleventh or sixteenth method of the invention, or alternatively, to the use of a pharmaceutical composition comprising an antiviral drug, preferably of direct action, for the preparation of a medicament for the treatment of an individual with a greater probability of chronicizing hepatitis C in the case that is infected by identifiable vertical transmission by the eleventh or sixteenth method of the invention.
  • Antiviral drugs that can be used for the treatment of an individual with a higher probability of chronic hepatitis C in the case that is infected by vertical transmission are, among others, but not limited to, pegylated interferon, ribavirin, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, or any combination thereof.
  • Another aspect of the invention relates to a microarray, hereinafter second microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or mRNA of the HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1 genes , HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 and HLA-DPB1.
  • sequences of the genes HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 and HLA- DPB1 are the corresponding nucleotide sequences indicated in Table 1.
  • Another aspect of the invention relates to a protein microarray, hereinafter second protein microarray of the invention, comprising antibodies or fragments of the same specific against any of the sequences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 48 or against amino acid sequences having a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at less than 98%, even more preferably, at least 99%.
  • the probes are antibodies fixed to glass slides and the targets are samples of serum or tissue.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the second microarray of the invention, in order to obtain useful data to predict or predict the risk that an individual with an RNA-HCV (+) mother will chronify hepatitis C in case it is infected by vertical transmission.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the second microarray of the invention, to predict or predict the probability that an individual with an RNA-HCV (+) mother will clear the HCV if it is infected by vertical transmission.
  • the methods or procedures for obtaining previously described useful data can be executed by computer means, whereby the invention also comprises the following aspects:
  • the twenty-sixth aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions to make, once the sample is taken and the corresponding genotypes determined, a computer to carry out the procedure according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs that may be in the form of source code, object code or intermediate code between source code and object code, such as partially compiled form, or in any other form suitable for use in the implementation of the processes according to the invention.
  • computer programs also encompass cloud applications that implement the method of the invention.
  • carrier medium can be any entity or device capable of carrying the program.
  • the carrier medium It may be constituted by said cable or other device or means.
  • the carrier means could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be incorporated into a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a hard drive
  • a storage medium such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a hard drive
  • the programs could be supported on a transmissible carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • the twenty-seventh aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • the twenty-eighth aspect of the invention refers to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • Table 2 Significant results of HLA and Kl for TV. Bonferroni correction of the HLA. Absolute values with percentages in parentheses. cOR: Ratio of gross probability (Odds crude ratio), Cl: confidence interval, Pe, Correction of P by Bonferroni, p- value ⁇ 0.05
  • HLA type C1 ligands are related to protection against infection by the virus and those of type C2 would be in favor of vertical transmission. We observe the same effect when these ligands bind to KIR receptors.
  • KIR2DS1 8 (33) 5 (63) 3 (18) 7.2 1.1-48.5 0.042 - KIR3DS1 9 (38) 6 (75) 3 (19) 13.0 1.7-99.4 0.013 -
  • HLA-DQB1 69 ⁇ 9, 1 59 ⁇ 5.0 ns
  • HLA-DPA1 100 ⁇ 0.0 84 ⁇ 5.9 0.082
  • HLA-DPB1 75 ⁇ 9.4 67 ⁇ 6.3 ns
  • Figure 1 shows the following areas under the curve: 1.- HLA-All percentage: 0.828
  • HLA class I For HLA class I, of 100% of infected children whose allelic agreement with their mother is greater than 58.4%, 65% of them will chronify the disease.
  • HLA class 1 0.78 58.40% 75% 81% 65% 87%
  • HLA class II 0.78 75% 62.50% 81% 62% 82%
  • Table 8 Table of data from the ROC curves For the study of diagnostic test of individual alleles, because the child can only have 50% concordance with the mother or 100%, it is considered a positive test when the concordance It is 100% and a negative test when it is 50%. In this case we cannot perform ROC curves because we have two qualitative variables because we can only have two situations: 100% or 50% concordance (since each individual only has two alleles of each type). We have considered a condordancia of 100% for a positive test and a concordance of 50% for a negative test. Sensitivity and specificity will be calculated from the contingency tables.
  • HLA-Bw ligands will be related to the chronicization of the hepatitis C virus in children.
  • allelic agreement between mother / child is vital to know the evolution of the disease in the child, while this factor has no relation to the vertical transmission of the virus.

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Abstract

La presente invención, se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C (VHC) y/o cronificacion y/o aclaramiento en el descendiente mediante el análisis de la presencia de HLA-C1, HLA-C2, HLA-DQAO1, HLA-Bw4, HLA-Bw6, HLA-DQ *03, KIR2DS3 KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1 KIR2DL2, KIR2DL3 y KIR2DL1 en la madre o el hijo, o la concordancia alélica de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA- DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y HLA-DPB 1 entre ambos.

Description

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA PREDECIR O PRONOSTICAR LA
TRANSMISIÓN VERTICAL, LA CRONIFICACIÓN Y/O EL ACLARAMIENTO DEL VIRUS DE
LA HEPATITIS C
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biología Molecular y la Medicina Clínica. Específicamente, se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C (VHC) y/o su herencia y/o su cronificación y/o aclaramiento en el descendiente. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se calculan 170 millones de personas infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC) en todo el mundo. En Estados Unidos y Europa, la prevalencia está entre 1-2%, pero puede ser del 8% en algunos países en vías de desarrollo [Arshad et al., 201 1. J. Viral. Hepat. 18: 229 -236, Zahran et al., 2010. Int. J. Gynaecol. Obstet. 11 1 : 171 -174] y entre un 0,05%-5% en los niños [Schwimmer et al., 2000. Semin. Liver Dis. 20:37-46]. En España, su prevalencia en gestantes es del 0,5% al 1 ,4% [Ruiz Extremera A, et al., 2005. Am J Obstet Gynecol. 193 (6):2010-6, Muñoz-Almagro C, et al., 2002. Med Clin (Barc) 1 18(12):452-4], semejante a la de la población general.
En la transmisión vertical (TV) del VIH, VHB y del VHC el momento de mayor riesgo de transmisión es el parto y se acepta que las madres sin viremia no transmiten la infección.
Aunque la tasa de TV del VHC es baja, 1-8% en madres no coinfectadas y en torno a 20% en las coinfectadas (VIH), hay que tener en cuenta que el 90% de los niños infectados han adquirido el virus por transmisión vertical. También se conoce que en los primeros meses de vida los niños pueden aclarar espontáneamente el virus. Por otro lado, de los que persisten con viremias intermitentes, un 53% quedarán crónicamente infectados [Ruiz-Extremera A, et al., 201 1 ; 53(6): 1830-8]. A pesar de los numerosos estudios publicados, los únicos factores que tienen evidencia científica, relacionados con un mayor riesgo de TV son la alta carga viral en la madre y la coinfección con el VIH.
Los resultados del grupo europeo para el estudio de la TV del VHC [Pembrey L et al., 2005. J Hepatol 43:515-25] son parecidos y no han conseguido implicar a otros factores como el tipo de parto, horas de bolsa rota, drogadicción materna, procedimientos obstétricos y lactancia materna. No obstante, a medida que aumenta el conocimiento sobre el VHC y la importancia de los factores inmunogenéticos del hospedador, es posible profundizar en los factores que l influyen en que unos niños se infecten y otros no, ante iguales condiciones de carga viral materna o intervenciones obstétricas.
Aunque la prevención farmacológica de la TV del VHC no era posible con el tratamiento convencional de interferón pegilado alfa y la ribavirina porque están contraindicados en el embarazo y durante el período neonatal, la situación ha cambiado con el desarrollo de agentes antivirales de acción directa, que han mostrado su elevada eficacia en bajar y negativizar la carga viral del VHC de forma relativamente rápida y sin necesidad de añadir interferón pegilado y ribavirina, de otro lado, por la experiencia en el tratamiento de adultos con estos fármacos se sabe que cuentan con muy pocos efectos adversos y parecen bastante seguros. La profilaxis de dicha transmisión va a ser posible, como ha sucedido con la TV del VIH, al aplicar los antivirales en la última etapa de la gestación e incluso con la administración al recién nacido.
Se necesitarán ensayos clínicos y posiblemente pruebas diagnósticas para conocer que niños tienen mayor riesgo de infectarse por el VHC y/o cronificar la infección ya que el coste de estos fármacos es muy elevado y la tasa de transmisión baja.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención está relacionado con el estudio de los genes implicados en la respuesta inmunológica frente al VHC: las moléculas HLA clase I, clase II y los receptores tipo inmunoglobinas de las células NK (KIRs), que pueden ayudar a aclarar algunos de estos mecanismos.
Estos nuevos marcadores genéticos permiten conocer que madre gestante con VHC tiene mayor probabilidad de transmitir el virus a su hijo, así como la probabilidad de que puede tener su hijo de cronificar el virus si se infecta, basándonos en el análisis de los distintos genotipos de la madre y/o hijo. Empleando estos marcadores, las madres con mayor riesgo de transmisión podrían ser tratadas con antivirales directos para impedir la transmisión a su hijo en el parto, como por ejemplo ocurre en la transmisión vertical del VIH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre portadora del virus de la hepatitis C (ARN- VHC (+)) transmita verticalmente el virus a su descendencia, o de que un individuo cuya madre es portadora del virus de la hepatitis C, herede y/o cronifique y/o aclare, en caso de que sea contagiado, el virus de la hepatitis C, que comprende a) obtener una muestra biológica aislada de la madre, y b) determinar el genotipo de los genes HLA y KIR en la muestra aislada del paso (a).
Transmisión Vertical
En cuanto a la transmisión vertical del VHC de una madre portadora a sus descendientes, la invención se centra en los siguientes aspectos:
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de la madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-C y KIR en la muestra aislada del paso (a). En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, y KIR2DS4
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 5 veces mayor, y preferiblemente 6 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2, en comparación con una madre que no lo presente. c2) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,9 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2), en comparación con una madre que presente otro genotipo. c3) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad de al menos 9 veces mayor, y preferiblemente 10,7 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con el genotipo KIR2DL2 y KIR2DL3, en comparación con una madre que no presente dichos genotipos. c4) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 5 veces mayor, y preferiblemente 6 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DL1 , o el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente; c5) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 4 veces mayor, y preferiblemente 5 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 o HLA-C1 en homocigosis (HLA-C1 C1), en comparación con una madre que no lo presente. c6) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 2,5 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-
C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente; c7) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA- C1 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante primer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4.
En una realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 8 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ I D NO: 14 (KIR2DS4). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del primer kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR en la muestra aislada del paso (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DL2, KIR2DL3, y KIR2DS3
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el tercer método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en comparación con un individuo que no lo presente c2) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 4 veces mayor, preferiblemente 4,2 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL2
(KIR2DL2/2DL2), en comparación con un individuo que no lo presente. c3) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 13 veces mayor, y preferiblemente 14 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL3
(KIR2DL3/2DL3), en comparación con un individuo que no lo presente. c4) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 13 veces mayor, y preferiblemente 14,3 veces mayor, de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo KIR2DS3, en comparación con un individuo que no lo presente. c5) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA- C1 , en comparación con un individuo que no lo presente. c6) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 4 veces mayor, y preferiblemente 5 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con un individuo que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante segundo kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo HLA-C y KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3. Preferiblemente comprende los elementos necesarios para determinar el genotipo HLA-C y todos los genes KIR.
En una realización preferida de este aspecto el segundo kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3);
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y
500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3). En otra realización preferida de este aspecto los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso del primer o segundo kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.
Cronificación y Aclaramiento del VHC Un décimo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante quinto método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1.
Un undécimo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante sexto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el quinto método de la invención, y además y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLADQA-01 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR2DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 6 veces mayor, y preferiblemente 7 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c3) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c4) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en combinación con KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c5) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw6, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 14 veces mayor, y preferiblemente 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Un duodécimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante tercer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1.
En una realización preferida, el tercer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y
500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un decimotercer aspecto de la invención se refiere al uso del tercer kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Un decimocuarto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante séptimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo del gen KIR3DL1.
Un decimoquinto aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante octavo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el séptimo método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en homocigosis, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 12,5 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw4 en homocigosis (HLA-Bw4-Bw4), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 16 veces mayor, y preferiblemente 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
Un decimosexto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante cuarto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1.
En una realización preferida, el cuarto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1, y donde: - los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un decimoséptimo aspecto de la invención se refiere al uso del cuarto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Un decimoctavo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante noveno método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQ y KIR en la muestra aislada del paso (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS3.
Un decimonoveno aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante décimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el noveno método de la invención, y y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial c1) clasificar al individuo del paso (a) si presenta el genotipo HLA-DQ*03, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 18 veces mayor, y preferiblemente 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente. c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta el genotipo KIR2DS3, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Un vigésimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante quinto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3.
En una realización preferida, el quinto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3, y donde: - los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un vigesimoprimer aspecto de la invención se refiere al uso del quinto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Un vigesimosegundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante undécimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo y otra muestra biológica aislada de su madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y HLA-DPB1 en las muestras aisladas del paso (a).
Un vigesimotercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante duodécimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el undécimo método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial c1) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 60% de corcondancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA- DPA 1 y HLA-DPB1, y preferiblemente al menos un 65,60% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 3 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 50% de corcondancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C, y preferiblemente al menos un 58,40% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,1 veces mayor, y preferiblemente 1.9 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. c3) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 70% de corcondancia alélica en los genes HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, y preferiblemente al menos un 75% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 , 1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre y la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Un vigesimocuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante sexto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y/o HLA-DPB1.
En una realización preferida, el sexto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y/o HLA-DPB1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA- DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un vigesimoquinto aspecto de la invención se refiere al uso del sexto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Implementación de los métodos de la invención
Una vez obtenida la muestra y determinados los genotipos correspondientes, los métodos o procedimientos para la obtención de datos útiles previamente descritos pueden ejecutarse mediante medios informáticos, por lo que la invención también comprende los siguientes aspectos:
Un vigesimosexto aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que, una vez tomada la muestra y determinados los correspondientes genotipos, un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
Un vigesimoséptimo aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Un vigesimoctavo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig.1. Curvas de rendimiento diagnóstico (ROC) para las concordancias alélicas (Todos HLA, HLA-clase I y HLA-clase II).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y consideraciones generales
En esta memoria se entiende por "transmisión vertical" la transmisión de una infección u otra enfermedad, en particular la transmisión del virus de la hepatitis C, de la madre a su hijo o descendiente inmediatamente antes y después del parto durante el período perinatal. Por tanto, la transmisibilidad de un agente patógeno se refiere a su capacidad para transmitirse vertical mente. Se considera que ha ocurrido transmisión vertical cuando se detectan. Equivalentemente por "heredar" se entiende que la madre transmite verticalmente la enfermedad a su descendiente.
Preferiblemente, en esta memoria se entiende por transmisión vertical la transmisión de cualquier agente infeccioso de la madre a su hijo, intraútero, en el parto o en el periodo postnatal bien por lactancia materna o por el contacto intimo de la madre y el hijo. Los agentes capaces de transmitirse intraútero tienen capacidad de producir corioamnionitis y alteración de la barrera placentaria relacionándose con abortos o malformaciones. Para los virus de la hepatitis B y C el momento de máximo riesgo es el parto no habiéndose comunicado transmisión por lactancia materna. El diagnóstico de infección en los niños se efectúa por la presencia de ARN-VHC positivo en al menos dos muestras de sangre consecutivas o por la presencia de anti-VHC positivo después de los 18 meses de vida. La cronificación de la infección por VHC es la presencia de ARN-VHC de forma permanente. En este estudio a los niños se les determinó el ARN-VHC al nacer, a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses y anualmente hasta los 6 años.
En esta memoria se entiende como "virus de la hepatitis C" a los virus clasificados en el grupo IV (virus de ARN monocatenario positivo), de la familia Flaviviridae y del género Hepacivirus.
El gen HLA-C pertenece al complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de cadena pesada. Esta molécula es un heterodímero que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera (beta-2-microglobulina). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I juegan un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de lumen del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exón uno codifica el dominio del péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios alfal y alfa2, ambos se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa 3, el exón 5 codifica la región transmembrana, y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplásmica. Los polimorfismos en el exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión de péptidos de cada clase de una molécula. El estudio de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para la médula ósea y el trasplante de riñon. Se han descrito más de un centenar de alelos HLA-C. Los genes KIR pertenecen a los receptores de tipo inmunoglobulina de las células asesinas (KIR), son glicoproteínas transmembranales expresadas por células y subconjuntos de células T asesinas naturales. Los genes KIR son polimórficos y altamente homólogos y se encuentran en un grupo en el cromosoma 19q13.4 en el complejo receptor de leucocitos 1 Mb (LRC). El contenido de genes de la agrupación de genes KIR varía entre los haplotipos, aunque varios genes "marco" se encuentran en todos los haplotipos (KIR3DL3, KIR3DP1 , KIR3DL4, KIR3DL2). Las proteínas KIR se clasifican por el número de dominios de inmunoglobulina extracelulares (2D o 3D) y por si tienen un dominio citoplásmico largo (L) o corto (S). Las proteínas KIR con el dominio citoplásmico largo transducen señales inhibidoras tras la unión a través de un motivo inhibidor basado en un ligando tirosina inmune (ITIM), mientras que las proteínas KIR con el dominio citoplásmico corto carecen del motivo ITIM y en lugar de asociarse con la proteína tirosina quinasa TYRO proteína de unión para transducir señales de activación. Los ligandos para varias proteínas KIR son subconjuntos de moléculas HLA de clase I; por lo tanto, se cree que las proteínas KIR desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta inmune.
En esta memoria se entiende por "genotipo" a la información genética que posee un organismo en particular, en forma de ADN. Normalmente el genoma de una especie incluye numerosas variaciones o polimorfismos en muchos de sus genes. El genotipado se usa para determinar qué variaciones específicas existen en el individuo. Específicamente, el genotipo puede definirse como el conjunto de genes de un organismo, y aún más concretamente el "genotipo de un gen" como el conjunto de información genética para ese gen concreto.
Con carácter general, cada kit o dispositivo descrito en la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes empleados en los métodos descritos, y/o capaces de hibridar con la secuencias de dichos genes, estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida).
Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. Dicha matriz personalizada comprenderá preferentemente cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos.
A modo de ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es sangre periférica. El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
El término "fármaco", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es producida por la infección del virus de la hepatitis C.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6- terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi uracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410. En realizaciones preferidas de la invención, la determinación de genotipos se realiza mediante PCR. En otra realización preferida, la detección además comprende el uso de la tecnología Luminex.
La tecnología xMAP de Luminex está basada en el uso de microesferas de poliestireno (perlas) de 5,6 micrones, cada una internamente teñida/coloreada con una combinación única de tinte rojo e infrarrojo. La combinación de diferentes intensidades de los dos tintes permite la identificación de cada perla por su característica única cuando estimulados por un rayo láser. Esto permite analizar hasta 100 parámetros simultáneamente en un solo tubo.
La química de la superficie de las esferas (o perlas) les permite recubrirse químicamente con un número de diferentes objetos, incluyendo secuencias de ADN de HLA y antígenos HLA. Las esferas por lo tanto pueden utilizarse para determinar en la muestras la presencia o ausencia de analitos específicos. La plataforma de Luminex utiliza los principios de citometría de flujo para alinear las esferas y pasarlas por un par de láseres. Se utiliza un láser rojo para estimular e identificar así esferas específicas y se utiliza un láser verde para estimular y así detectar cualquier tinte asociado a las esferas durante el ensayo. Por cuanto la identificación de la perlas y la fluorescencia asociada capturada por las esferas se realiza en cada perla individual, un sistema multiplexado puede desarrollarse con, normalmente, hasta 100 esferas. Las sondas utilizadas para recubrir las 100 perlas son cuidadosamente seleccionadas de modo que los analitos individuales de interés pueden identificarse mediante los patrones de reacción única de las perlas. El tipaje de HLA utilizando Luminex requiere un paso previo que implica una amplificación mediante PCR (PCR - polymerase chain reaction) de regiones específicas dentro de la clase de MHC I o II con grupos de cebadores (primers) específicos, con oligonucleótidos o sondas específicas de secuencias (PCR-SSO) seguidos por un proceso de sondeo del amplicón con esferas de Luminex, cada una cubierta con probes de oligonucleótidos específicos de secuencia para identificar la presencia o ausencia de alelos específicos. La asignación del tipo HLA se basa entonces en la reacción patrón observado, y se compara la secuencia con diferentes patrones conocidos.
Los cebadores/primers utilizados para la amplificación son biotinilados. La amplificación puede ser simétrica, que por lo tanto requiere un paso de desnaturalización para crear dos hebras de cadena simple/single strands o puede ser asimétrica para generar un exceso de una sola hebra. El único producto trenzado es entonces hibridado mediante un termociclador a 60 °C y posteriormente con un múltiplex de hasta 100 perlas, pueden ser identificados por su tinción interna de forma selectiva, ya que están recubiertos con secuencias de oligonucleótidos específicos. El ADN amplificado híbrida el ADN complementario sondeado en las esferas. A continuación la metodología requiere varias etapas de lavado. El amplicon enlazado es detectado por el marcado con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (SAPE), con estreptavidina vinculante a la biotina utilizado para etiquetar los iniciadores y ficoeritrina sirviendo como el tinte asociado para la presencia de amplicon enlazado. Otra vez un paso de lavado puede ser necesario según el kit en uso. Finalmente las muestras se pasan a una placa para su lectura en el Luminex mediante el uso del software específico, y son determinadas posteriormente con el programa adecuado que será el que nos genera el tipaje completo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Método de la invención En este contexto, el primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre portadora del virus de la hepatitis C (ARN-VHC (+)) transmita verticalmente el virus a su descendencia, o de que un individuo cuya madre es portadora del virus de la hepatitis C, herede y/o cronifique y/o aclare, en caso de que sea contagiado, el virus de la hepatitis C, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de la madre, y b) determinar el genotipo de los genes HLA y KIR en la muestra aislada del paso (a).
Transmisión Vertical
En un primer conjunto de realizaciones particulares, los autores de la presente invención han estudiado la importancia de los marcadores HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4 y KIR2DS3 en la probabilidad de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia y/o, en la probabilidad de contagio mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+). Así, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método, primer método de la invención, de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de la madre gestante, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4) en la muestra aislada del paso (a).
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante segundo método de la invención, de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C, que comprende los pasos (a) y (b) según el primer método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 5 veces mayor, preferiblemente al menos 6 veces mayor, y aún más preferiblemente 6,2 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2, en comparación con una madre que no lo presente. c2) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, preferiblemente al menos 3 veces mayor, y aún más preferiblemente 3,9 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2), en comparación con una madre que no lo presente. c3) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 9 veces mayor, preferiblemente al menos 10 veces mayor, y aún más preferiblemente 10,7 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con KIR2DL2 y KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente. c4) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 4 veces mayor, preferiblemente al menos 5 veces mayor, y aún más preferiblemente 6 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DL1 o HLA-C2 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente. c5) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 3 veces mayor, preferiblemente al menos 4 veces mayor, y aún más preferiblemente 5 veces mayor de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 o HLA-C1 en homocigosis (HLA- C1 C1), en comparación con una madre que no lo presente. c6) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, y aún más preferiblemente 2,5 veces mayor de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente. c7) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, preferiblemente al menos 3 veces mayor, y aún más preferiblemente 3,3 veces mayor de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR. En otra realización preferida, la detección además comprende el uso de la tecnología Luminex.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante primer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), tal y como se han definido el primer método de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el primer kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 1 1 y/o SEQ ID NO: 13, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. Así pues, el primer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID
NO: 6 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 8 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ I D NO: 14 (KIR2DS4).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones. Otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleotidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-C y/o KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4). Más preferiblemente las secuencias de los HLA-C y/o KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del primer kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3) en la muestra aislada del paso (a). Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método, cuarto método de la invención, de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), que comprende los pasos (a) y (b) del tercer método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 3 veces mayor, preferiblemente 4 veces mayor, y aún más preferiblemente 4,2 veces mayor de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL2 (KIR2DL2/2DL2), en comparación con individuo que no lo presente. c2) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 13 veces mayor, preferiblemente 13,5 veces mayor, y aún más preferiblemente 14 veces mayor de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL3 (KIR2DL3/2DL3), en comparación con un individuo que no lo presente. c3) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 13 veces mayor, preferiblemente 14 veces mayor, y aún más preferiblemente 14,3 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo KIR2DS3, en comparación con un individuo que no lo presente. c4) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, preferiblemente 3 veces mayor, y aún más preferiblemente 3,3 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 , en comparación con un individuo que no lo presente. c5) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 4 veces mayor, preferiblemente 4,5 veces mayor, y aún más preferiblemente 5 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con un individuo que no lo presente.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre.
Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante segundo kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), tal y como se han definido el tercer método de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el segundo kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 15, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el segundo kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el segundo kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 16 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de este aspecto el segundo kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KI R2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), y/o SEQ I D NO: 15 (KIR2DS3); - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID
NO: 6 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
Otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.
Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso del segundo kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un niño con una madre ARN-VHC (+).
Cronificación y/o aclaramiento del VHC
En otro conjunto de realizaciones particulares, los autores de la presente invención han estudiado la importancia de los marcadores HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA- B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1 en la probabilidad de que un individuo cronifique la hepatitis C y en la probabilidad de que aclare el virus de la hepatitis C.
Así, un décimo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante quinto método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1. Un undécimo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificacion de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante sexto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el quinto método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLADQA-01 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR2DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 6 veces mayor, y preferiblemente 7 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c3) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c4) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en combinación con KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c5) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw6, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 14 veces mayor, y preferiblemente 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR. En otra realización preferida, la detección además comprende el uso de la tecnología Luminex.
Un duodécimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante tercer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el tercer kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ I D NO: 21 , SEQ ID NO: 23 y/o SEQ ID NO: 25, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
En una realización preferida, el tercer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones. El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1). Más preferiblemente las secuencias de los HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un decimotercer aspecto de la invención se refiere al uso del tercer kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
En esta memoria se entiende por "cronificación" de la hepatitis C en niños a la presencia de ARN-VHC positivo en al menos dos muestras de sangre consecutivas o por la presencia de anti-VHC positivo después de los 18 meses de vida. La cronificación de la infección por VHC es la presencia de ARN-VHC de forma permanente. Preferiblemente, el estudio en los niños consiste en determinar el ARN-VHC al nacer, a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses y anualmente hasta los 6 años.
Se acepta que los hijos de madres positivas pueden aclarar el virus en los primeros meses del nacimiento (Ceci O, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2001 Nov; 33(5): 570-5), hasta en el 75% de los casos. Los niños que se infectan y quedan crónicamente infectados, suelen estar asintomáticos, pero presentan elevación de transaminasas entre los seis y doce meses de vida (Bortolotti F, J. Pediatr. 1997; 130: 990-993). El curso clínico de la infección es aparentemente leve y no existe consenso en cuanto al momento de tratarlos. La terapéutica en niños con infección crónica no está bien definida, lo que indica que es necesario investigar sobre la epidemiología, curso clínico y tratamiento del VHC en los niños (Joñas MM. Hepatology 2002 Nov;36 (5 Suppl 1):S173-8. Estudios recientes demuestran que en las biopsias hepáticas de niños con infección crónica por VHC existe una actividad inflamatoria moderada, sin embargo, hay una tendencia importante a la fibrosis y la evolución de la misma puede ser grave aunque la duración de la infección sea corta (Badizadegan K, Hepatology 1998 Nov 28(5): 1416-23. En un metanalisis Jacobson KR, (J Pediatr Gastroenterol Nutr 2002 Jan;34(1):52-8), que incluye a 366 niños tratados con INF y 105 no tratados, la respuesta virológica fue del 36% para el grupo tratado y del 5% para el grupo control. La respuesta fue más favorable en el genotipo no-1 (70%) que el genotipo 1 (27%). Estos datos sugieren que el INF-alfa es una propuesta terapéutica con una seguridad y eficacia razonable para el tratamiento de la hepatitis C crónica en niños. También se ha ensayado el tratamiento combinado con ribavirina Wirth S, Hepatology 2002 Nov;36(5): 1280-4), mejorando los resultados anteriores, ya que la tasa de respuesta virologica del 61 %, aunque la presencia de efectos adversos graves es del 21 %. Se desconoce la efectividad del IFN-Peg más ribavirina.
En esta memoria se entiende como "virus de la hepatitis C" a los virus clasificados en el grupo IV (virus de ARN monocatenario positivo), de la familia Flaviviridae y del género Hepacivirus.
Un decimocuarto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante séptimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo del gen KIR3DL1.
Un decimoquinto aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante octavo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el séptimo método de la invención, y además comprende: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en homocigosis, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 12,5 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida, el octavo método de la invención comprende: c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw4 en homocigosis (HLA-Bw4-Bw4), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 16 veces mayor, y preferiblemente 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c). Un decimosexto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante cuarto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cuarto kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cuarto kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el cuarto kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida, el cuarto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
El cuarto kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un decimoséptimo aspecto de la invención se refiere al uso del cuarto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
En esta memoria se entiende por "aclaramiento" del virus de la hepatitis C la presencia de ARN-VHC positivo en al menos dos muestras o alguna más, de sangre consecutivas, y en todos los demás controles, hasta el alta hospitalaria, presentarán ARN-VHC negativo. Preferiblemente, el estudio en los niños consiste en determinar el ARN-VHC al nacer, a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses (o hasta alta hospitalaria).
Un decimoctavo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante noveno método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQ y KIR en la muestra aislada del paso (a). En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS3.
Un decimonoveno aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante décimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el noveno método de la invención, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a) si presenta el genotipo HLA-DQ*03, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 18 veces mayor, y preferiblemente 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente. En otra realización preferida, el décimo método de la invención comprende: c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta el genotipo KIR2DS3, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c). Un vigésimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante quinto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 15, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 16 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida, el quinto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3). - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
El quinto kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un vigesimoprimer aspecto de la invención se refiere al uso del quinto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Un vigesimosegundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante undécimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo y otra muestra biológica aislada de su madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y HLA-DPB1 en las muestras aisladas del paso (a).
Un vigesimotercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante duodécimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el undécimo método de la invención, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a), si presenta concordancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, al menos un 60% de corcondancia alélica, y preferiblemente al menos un 65,60% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 3 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. En otra realización preferida, el duodécimo método de la invención comprende: c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta concordancia alélica en los genes en los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C, al menos un 50% de corcondancia alélica, y preferiblemente al menos un 58,40% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 , 1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,9 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo no que presente concordancia alélica con su madre.
En otra realización preferida, el duodécimo método de la invención comprende: c3) clasificar al individuo del paso (a), si presenta concordancia alélica en los genes HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, al menos un 70% de corcondancia alélica, y preferiblemente al menos un 75% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 ,1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre y la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
Un vigesimocuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante sexto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA1 y/o HLA-DPB1.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el sexto kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 31 , SEQ I D NO: 25, SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 17, SEQ I D NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ I D NO: 43, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el sexto kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida, el sexto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y/o HLA-DPB1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA- DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1). El sexto kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-A, HLA- B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA- DPA1 y/o HLA-DPB1 son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
Un vigesimoquinto aspecto de la invención se refiere al uso del sexto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C pertenecen al complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de cadena pesada. Estas moléculas son heterodímeros que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera (beta-2-microglobulina). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I juegan un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de lumen del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exon uno codifica el dominio del péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios alfal y alfa2, ambos se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa 3, el exón 5 codifica la región transmembrana, y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplásmica. Los polimorfismos en el exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión de péptidos de cada clase de una molécula. El estudio de los polimorfismos de estos genes se realiza de forma rutinaria para la médula ósea y el trasplante de riñon. Se han descrito más de un centenar de alelos HLA-A, HLA-B y HLA-C.
Los genes HLA-DQA1 , HLA-DQB1 , pertenecen a los HLA de clase II de cadena alfa y beta. La molécula de clase II es un heterodímero que consiste en un alfa (DQA) y una cadena beta (DQB), ambas ancladas en la membrana. Desempeña un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de proteínas extracelulares. Las moléculas de clase II se expresan en células presentadoras de antígeno (APC: B linfocitos, células dendríticas, macrófagos). La cadena alfa es de aproximadamente 33-35 kDa. Está codificado por los exones 5; el exón 1 codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dos dominios extracelulares, y el exón 4 codifica el dominio transmembrana y la cola citoplásmica. Dentro de la molécula de DQ, tanto la cadena alfa y la cadena beta contienen los polimorfismos que especifican las especificidades de unión de péptidos, lo que resulta en hasta cuatro moléculas diferentes. La determinación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para el trasplante de médula ósea. HLA-DRB1 pertenece a los HLA de clase II de la cadena beta. La molécula de clase II es un heterodímero que consiste en un alfa (DRA) y una cadena beta (DRB), ambas anclada sen la membrana. Desempeña un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de proteínas extracelulares. Las moléculas de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC: los linfocitos B, células dendríticas, macrófagos). La cadena beta es de aproximadamente 26-28 kDa. Se está codificada por 6 exones. Exon uno codifica el péptido líder; los exones 2 y 3 codifican los dos dominios extracelulares; exón 4 codifica el dominio transmembrana; y el exón 5 codifica la cola citoplásmica. Dentro de la molécula DR la cadena beta contiene todos los polimorfismos que especifican las especificidades de unión de péptidos. Cientos de alelos DRB1 se han descrito y tipificación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para la médula ósea y el trasplante de riñon. DRB1 se expresa a un nivel cinco veces más alto que sus paralogs DRB3, DRB4 y DRB5. DRB1 está presente en todos los individuos. Las variantes alélicas de DRB1 están vinculados ya sea con ninguno o uno de los genes DRB3, DRB4 y DRB5. Hay 4 pseudogenes relacionadas: DRB2, DRB6, DRB7, DRB8 y DRB9. HLA-DPA1 y HLA-DPB1 pertenecen a los HLA de clase II cadena alfa y beta. Esta molécula de clase II es un heterodímero que consiste en un alfa (DPA) y una cadena beta (DPB), ambas ancladas en la membrana. Desempeña un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de proteínas extracelulares. Las moléculas de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC: los linfocitos B, células dendríticas, macrófagos). La cadena alfa es de aproximadamente 33-35 kDa y su gen contiene 5 exones. Exon uno codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dos dominios extracelulares, el exón 4 codifica el dominio transmembrana y la cola citoplásmica. Dentro de la molécula DP tanto la cadena alfa y la cadena beta contienen los polimorfismos que especifican las especificidades de unión de péptidos, lo que resulta en un máximo de 4 moléculas diferentes Los genes KIR pertenecen a los receptores de tipo inmunoglobulina de las células asesinas (KIR), son glicoproteínas transmembranales expresadas por células y subconjuntos de células T asesinas naturales. Los genes KIR son polimórficos y altamente homólogos y se encuentran en un grupo en el cromosoma 19q13.4 en el complejo receptor de leucocitos 1 Mb (LRC). El contenido de genes de la agrupación de genes KIR varía entre los haplotipos, aunque varios genes "marco" se encuentran en todos los haplotipos (KIR3DL3, KIR3DP1 , KIR3DL4, KIR3DL2). Las proteínas KIR se clasifican por el número de dominios de inmunoglobulina extracelulares (2D o 3D) y por si tienen un dominio citoplásmico largo (L) o corto (S). Las proteínas KI R con el dominio citoplásmico largo transducen señales inhibidoras tras la unión a través de un motivo inhibidor basado en un ligando tirosina inmune (ITIM), mientras que las proteínas KI R con el dominio citoplásmico corto carecen del motivo ITIM y en lugar de asociarse con la proteína tirosina quinasa TYRO proteína de unión para transducir señales de activación. Los ligandos para varias proteínas KIR son subconjuntos de moléculas HLA de clase I ; por lo tanto, se cree que las proteínas KI R desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta inmune.
Tabla 1. Secuencias de la invención
Figure imgf000045_0001
dominios y de cola
citoplasmática larga, 1
HLA-B Complejo mayor de 3106 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 histocompatibilidad,
Clase I, B
HLA-DQB3 Complejo mayor de 3121 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 histocompatibilidad,
Clase II, DQ beta 3
HLA-A Complejo mayor de 3105 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 histocompatibilidad,
Clase I, A
HLA-DRB1 Complejo mayor de 3123 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 histocompatibilidad,
Clase II, DR beta 1
HLA-DQB1 Complejo mayor de 31 19 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, histocompatibilidad, SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 Clase II, DQ beta 1
HLA-DPA1 Complejo mayor de 31 13 SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, histocompatibilidad, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, Clase II, DP alfa 1 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46
HLA-DPB1 Complejo mayor de 31 15 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 histocompatibilidad,
Clase II, DP beta 1
SEQ ID NO: 1 :
TCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTCCCCAGTCACCCACCCGGACTCACATTCTCCCCAGA GGCCGAGATGCGGGTCATGGCGCCCCGAGCCCTCCTCCTGCTGCTCTCGGGAGGCCT GGCCCTGACCGAGACCTGGGCCTGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTC CCGGCCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACG CAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCGCGGGCGCC GTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCG CCAGGCACAGGCTGACCGAGTGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAG CGAGGACGGGTCTCACACCCTCCAGAGGATGTCTGGCTGCGACCTGGGGCCCGACGGGC GCCTCCTCCGCGGGTATGACCAGTCCGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTG AACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCCGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCAGCGC AAGTTGGAGGCGGCCCGTGCGGCGGAGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGC GTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCGCAGAA CCCCCAAAGACACACGTGACCCACCACCCCCTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGC TGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGG AGGACCAGACCCAGGACACCGAGCTTGTGGAGACCAGGCCAGCAGGAGATGGAACCT TCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAAGAGCAGAGATACACGTGCCA TATGCAGCACGAGGGGCTGCAAGAGCCCCTCACCCTGAGCTGGGAGCCATCTTCCCAG CCCACCATCCCCATCATGGGCATCGTTGCTGGCCTGGCTGTCCTGGTTGTCCTAGCTGTC CTTGGAGCTGTGGTCACCGCTATGATGTGTAGGAGGAAGAGCTCAGGTGGAAAAGGA GGGAGCTGCTCTCAGGCTGCGTGCAGCAACAGTGCCCAGGGCTCTGATGAGTCTCTCA TCACTTGTAAAGCCTGAGACAGCTGCCTGTGTGGGACTGAGATGCAGGATTTCTTCACA CCTCTCCTTTGTGACTTCAAGAGCCTCTGGCATCTCTTTCTGCAAAGGCACCTGAATGT GTCTGCGTTCCTGTTAGCATAATGTGAGGAGGTGGAGAGACAGCCCACCCCCGTGTCCAC CGTGACCCCTGTCCCCACACTGACCTGTGTTCCCTCCCCGATCATCTTTCCTGTTCC AGAGAGGTGGGGCTGGATGTCTCCATCTCTGTCTCAAATTCATGGTGCACTGAGCTGCA ACTTCTTACTTCCCTAATGAAGTTAAGAACCTGAATATAAATTTGTGTTCTCAAATATTTG CTATGAAGCGTTGATGGATTAATTAAATAAGTCAATTCCTAGAAGTTGAGAGAGCAAATA AAGACCTGAGAACCTTCCAGAA
SEQ ID NO: 2:
MRVMAPRALLLLLSGGLALTETWACSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRF DSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHT LQRMSGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAE QLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITL TWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAWVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLS WEPSSQPTIPIMGIVAGLAVLWLAVLGAVVTAMMCRRKSSGGKGGSCSQAACSNSAQGS DESLITCKA
SEQ ID NO: 3:
CGCGGCCGCCTGTCTGCACAGACAGCACCATGTCGCTCATGGTCGTCAGCATGGCGTG TGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCACAGAAAACCT TCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAAT GTTGGTCAGATGTCAGGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAAGGGAAGTTTAAGGAC ACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTCTCCAAAGCCAACTTCTCCATCGG TCCCATGATGCAAGACCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTACTCACTCCC CCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATCGTCATCACAGGTCTATATGAG AAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCT TGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAGGGGGAGGC CCATGAATGTAGGTTCTCTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTC CTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACTC TCCATACGAGTGGTCAAACTCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTT CAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCTAAAACCGGTAACCCCCGACACCTG CACATTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTT CATCGCTGGTGCTCCAACAAAAAAAATGCTGCGGTAATGGACCAAGAGTCTGCAGGGA ACAGAACAGCGAATAGCGAGGACTCTGATGAACAAGACCCTCAGGAGGTGACATACAC ACAGTTGAATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTCAGAGGCCCA AGACACCCCCAACAGATATCATCGTGTACACGGAACTTCCAAATGCTGAGTCCAGATCC AAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGCGTCTTCTAGGGAG ACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCT GAAGGCATGAGTCTGCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACAAATCTGAATGTG CCTCTCACTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAAAAAACACACT CCTTTGCTTAGCCCACAGTTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAAC TGGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAAC ATACAAGAGGCTCCCTCTTAACGCAGCACTTAGACACGTGTTGTTCCACCTTCCCTCAT GCTGTTCCACCTCCCCTCAGACTAGCTTTCAGTCTTCTGTCAGCAGTAAAACTTATATAT TTTTTAAAATAACTTCAATGTAGTTTTCCATCCTTCAAATAAACATGTCTGCCCCCATG
SEQ ID NO: 4:
MSLMWSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLL HREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVI GLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQ ADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPR HLHILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQL NHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP
SEQ ID NO: 5:
AGCTGGGGCGCGGCCGCCTGTCTGCACAGACAGCACCATGTCGCTCATGGTCGTCAG CATGGTGTGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCAC AGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCCCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCAT CCTGCAATGTTGGTCAGATGTCAGGTTTCAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAAGGGAAGT TTAAGGACACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTC TCCATCGGTCCCATGATGCAAGACCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTAC TCACTCCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATCGTCATCACAGGTC TATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAG CGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAG GGGGAGGCCCATGAACGTAGGTTCTCTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAGG CCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCTTT CCGTGACTCTCCATACGAGTGGTCAAACTCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAG GAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCGAAACCGGTAACCCC AGACACCTGCATGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCATCCTCCTCCTC TTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTGCAACAAAAAAAATGCTGTTGTAATGGACCAAGAG CCTGCAGGGAACAGAACAGTGAACAGGGAGGACTCTGATGAACAAGACCCTCAGGAGG TGACATATGCACAGTTGAATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTC AGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATATCATCGTGTACACGGAACTTCCAAATGCTGAG CCCTGATCCAAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTT CTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACTGGGTTGCCAGCTCCAATGTACCAGCAGC TGGAATCTGAAGGCGTGAGTCTGCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACAAATC TGAACGTGCCTCTCCCTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAA AACACACTCCTTTGCTTAGCCCACAATTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCC AACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAA TTCCAAACATACAAGAGGCTCCCTCTTAACACGGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCT TCCCTCATGCTGTTCCACCTCCCCTCAGACTAGCTTTCAGCCTTCTGTCAGCAGTAAAAC TTATATATTTTTTAAAATAATTTCAATGTAGTTTTCCCTCCTTCAAATAAACATGTCTGCCC TCA SEQ ID NO: 6:
MSLM WSM VCVGFFLLQGAWPH EGVH RKPSLLAH PGPLVKSEETVI LQCWSDVRFQH FLL HREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVI TGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQ ADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPR
5 HLHVLIGTSWIILFILLLFFLLHRWCCNKKNAWMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYA QLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAEP
SEQ ID NO: 7:
GAGCTCGGTCGCGGCTGCCTGTCTGCTCCGGCAGCACCATGTCGCTCTTGGTCGTCAG CATGGCGTGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCAC AGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCA TCCTGCAGTGTTGGTCAGATGTCATGTTTGAACACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGATG TTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAGAACACCATGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTT CTCCATCAGTCGCATGACGCAAGACCTGGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTA CTCACTCCCCCTATCAGGTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATCGTGATCATAGGT CTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCTGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGA ATGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAA GGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAG GCTGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTT TCCATGACTCTCCATACGAGTGGTCAAAGTCAAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACA GGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCC CCGACACCTGCACATTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCATCCTCCTCTT CTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCAACAAAAAAAATGCTGCGGTAATGGACCAAGAGT CTGCAGGAAACAGAACAGCGAATAGCGAGGACTCTGATGAACAAGACCCTCAGGAGGT GACATACACACAGTTGAATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTCA GAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATATCATCGTGTACACGGAACTTCCAAATGCTGAGT CCAGATCCAAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGCGTCTT CTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGC TGGAATCTGAAGGCGTGAGTCTGCATCTTAGGGCATCGATCTTCCTCACACCACAAATC TGAATGTGCCTCTCTCTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAAAA AACACACTCCTTTGCTTAACCCACAGTTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCC AACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAA TTCCAAACATACAAGAGGCTCCCTCTTAACGCAGCACTTAGACACGTGTTGTTCCACCTT CCCTCATGCTGTTCCACCTCCCCTCAGACTAGCTTTCAGTCTTCTGTCAGCAGTAAAACT TATATATTTTTTAAAATAACTTCAATGTAGTTTTCCATCCTTCAAATAAACATGTCTGCCCC CATGGT SEQ ID NO: 8:
MSLLWSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLH REGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVII GLYEKPSLSAQLGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQA DFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHILIGTSWIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLN HCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP SEQ ID NO: 9:
TGTAAACTGCATGGGCAGGGCGCCAAATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGG GGCGCGGCCGCCTGTCTGCACCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCATCATGGCG TGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACAGGAGGGAGTCCACAGAAAAC CTTCCTTCCTGGCCCTCCCAGGTCACCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAA TGTTGGTCGGATGTCATGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGAAGTTTAACAA CACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTTTCCAAGGCCAACTTCTCCATTG GTCCCATGATGCCTGTCCTTGCAGGAACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCC CCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATGGTGATCATAGGTCTATATGA GAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCAGGCAGGAGAGAATGTGACC TTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAAGGGGAGG CCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTT TCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGAC GCTCCCTACGAGTGGTCAAACTCGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGAAACCC TTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACC TACATGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTC TCCTTCATCGCTGGTGCTCCGACAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCA GGGAACAGAACAGTGAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCAT ACGCATAATTGGATCACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTGAGAGG CCCAAGACACCCCCAACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAG ATCCAAAGTTGTCTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGG GAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAA TCTGAAGGCATCAGTCTTCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACGAATCTGAAC ATGCCTCTCTCTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAAAACAC ACTCCTTTGCTTAGCCCACAATTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCT AACTGGCTTACTTCCTAGTCTACCTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCC AAACATACAAGAGGCTGCCTCTTAACACAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTCCCT TCAGACTATCTTTCAGCCTTCTGCCAGCAGTAAAACTTATAAATTTTTTAAATAATTTCAAT GTAGTTTTCCCGCCTTCAAATAAACATGTCTGCCCTCATGG SEQ ID NC O:
MSLMVIIMACVGFFLLQGAWPQEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLH REGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMVII GLYEKPSLSAQPGPTVQAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAVRSINGTFQA DFPLGPATHGGTYRCFGSFRDAPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSDKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA
SEQ ID NO: 11 :
TGTAAACTGCATGGGCAGGGCGCCAAATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGG GGCGCGGCCGCCTGTCTGCACCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCATCATGGCG TGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACAGGAGGGAGTCCACAGAAAAC CTTCCTTCCTGGCCCTCCCAGGTCACCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAA TGTTGGTCGGATGTCATGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGAAGTTTAACAA CACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTTTCCAAGGCCAACTTCTCCATTG GTCCCATGATGCCTGTCCTTGCAGGAACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCC CCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATGGTGATCATAGGTCTATATGA GAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCAGGCAGGAGAGAATGTGACC TTGTCCTGCAGCTCCATCTATCCAGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGC AGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCAC GGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACGCTCCCTACGAGTGGTCAAACT CGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCC ACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACCTACATGTTCTGATTGGGACCTC AGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCGA CAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGTGAACAGC GAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGTGT TTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTGAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATA CCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTTCTGTCCA CGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAA AACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCTGAAGGCATCAGTCTTCATC TTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACGAATCTGAACATGCCTCTCTCTTGCTTACAAAT GTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAAAACACACTCCTTTGCTTAGCCCACAATT CTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTAC CTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAACATACAAGAGGCTGCCTCTT AACACAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTCCCTTCAGACTATCTTTCAGCCTTCTGC CAGCAGTAAAACTTATAAATTTTTTAAATAATTTCAATGTAGTTTTCCCGCCTTCAAATAAA CATGTCTGCCCTCATGG
SEQ ID NO: 12:
MSLMVIIMACVGFFLLQGAWPQEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLH REGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMVII GLYEKPSLSAQPGPTVQAGENVTLSCSSIYPGKGRPMNVGSLQCAASTEHSRPTFLWALPP TEGPTDASALSVTLPTSGQTRVIHCLFPSQETLQIVGLHPLNQAPKPVTPDTYMF
SEQ ID NO: 13:
TGTAAACTGCATGGGCAGGGCGCCAAATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGG GGCGCGGCCGCCTGTCTGCACCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCATCATGGCG TGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACAGGAGGGAGTCCACAGAAAAC CTTCCTTCCTGGCCCTCCCAGGTCACCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAA TGTTGGTCGGATGTCATGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGAAGTTTAACAA CACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTTTCCAAGGCCAACTTCTCCATTG GTCCCATGATGCCTGTCCTTGCAGGAACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCC CCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATGGTGATCATAGGTCTATATGA GAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCAGGCAGGAGAGAATGTGACC TTGTCCTGCAGCTCCATCTATCCAGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGC AGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCAC GGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACGCTCCCTACGAGTGGTCAAACT CGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGTAACCCCAGACACCTACATGTTCTGATT GGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGG TGCTCCGACAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGT GAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATC ACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTGAGAGGCCCAAGACACCCCCA ACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTTC TGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCCTG TCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCTGAAGGCATCAGTC TTCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACGAATCTGAACATGCCTCTCTCTTGCTT ACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAAAACACACTCCTTTGCTTAGCCC ACAATTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACTGGCTTACTTCCTA GTCTACCTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAACATACAAGAGGCTG CCTCTTAACACAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTCCCTTCAGACTATCTTTCAGCC TTCTGCCAGCAGTAAAACTTATAAATTTTTTAAATAATTTCAATGTAGTTTTCCCGCCTTC AAATAAACATGTCTGCCCTCATGG
SEQ ID NO: 14:
MSLMVIIMACVGFFLLQGAWPQEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLH REGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMVII GLYEKPSLSAQPGPTVQAGENVTLSCSSIYPGKGRPMNVGSLQCAASTEHSRPTFLWALPP TEGPTDASALSVTLPTSGQTRVIHCLFPSQVTPDTYMF
SEQ ID NO: 15:
CCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCAGCATGGCATGTGTTGGGTTCTTCTGGCT GCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGATTCCGCAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCA GGTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCATGTT TGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAG AGCACATTGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGACCT GGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCCCCCTATCAGTTTTCAGCTC CCAGTGACCCTCTGGACATCGTGATCACAGGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCC CAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCTGG AGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCACGGAGGGGGAGGCCCATGAACGTAGGTTCT CTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCAC CCAAGGAGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCATGACTCTCCCTACGAGTGGTCAA AGTCAAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCAC CCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACCTACACGTTCTGATTGGGACC TCAGTGGTCAAACTCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCC GACAAAAAAAATGCATCTGTAATGGACCAAGGGCCTGCGGGGAACAGAACAGTGAACA GGGAGGATTCTGACGAACAGGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGT GTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCCCCCTTCTCAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGA TAGCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGTCCAGATCCAAAGCTGTCTTCTGTCC ACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCT
SEQ ID NO: 16:
MSLMVISMACVGFFWLQGAWPHEGFRRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLL HREGTFNDTLRLIGEHIDGVSKANFSIGRMRQDLAGTYRCYGSVPHSPYQFSAPSDPLDIVIT GLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSWSSYDMYHLSTEGEAHERRFSAGPKVNGTFQA DFPLGPATQGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHVLIGTSVVKLPFTILLFFLLHRWCSDKKNASVMDQGPAGNRTVNREDSDEQDHQEVSYA
SEQ ID NO: 17:
ACAATTACTCTACAGCTCAGAACACCAACTGCTGAGGCTGCCTTGGGAAGAGGATGATC CTAAACAAAGCTCTGCTGCTGGGGGCCCTCGCTCTGACCACCGTGATGAGCCCCTGTG GAGGTGAAGACATTGTGGCTGACCACGTTGCCTCTTGTGGTGTAAACTTGTACCAGTTT TACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGCAGTTCTACGTGGA CCTGGAGAGGAAGGAGACTGCCTGGCGGTGGCCTGAGTTCAGCAAATTTGGAGGTTTT GACCCGCAGGGTGCACTGAGAAACATGGCTGTGGCAAAACACAACTTGAACATCATGAT TAAACGCTACAACTCTACCGCTGCTACCAATGAGGTTCCTGAGGTCACAGTGTTTTCCA AGTCTCCCGTGACACTGGGTCAGCCCAACACCCTCATTTGTCTTGTGGACAACATCTTT CCTCCTGTGGTCAACATCACATGGCTGAGCAATGGGCAGTCAGTCACAGAAGGTGTTTC TGAGACCAGCTTCCTCTCCAAGAGTGATCATTCCTTCTTCAAGATCAGTTACCTCACCTT CCTCCCTTCTGCTGATGAGATTTATGACTGCAAGGTGGAGCACTGGGGCCTGGACCAG CCTCTTCTGAAACACTGGGAGCCTGAGATTCCAGCCCCTATGTCAGAGCTCACAGAGAC TGTGGTCTGTGCCCTGGGGTTGTCTGTGGGCCTCATGGGCATTGTGGTGGGCACTGTC TTCATCATCCAAGGCCTGCGTTCAGTTGGTGCTTCCAGACACCAAGGGCCATTGTGAAT CCCATCCTGGAAGGGAAGGTGCATCGCCATCTACAGGAGCAGAAGAATGGACTTGCTA AATGACCTAGCACTATTCTCTGGCCCGATTTATCATATCCCTTTTCTCCTCCAAATATTTC TCCTCTCACCTTTTCTCTGGGACTTAAGCTGCTATATCCCCTCAGAGCTCACAAATGCCT TTACATTCTTTCCCTGACCTCCTGATTTTTTTTTTCTTTTCTCAAATGTTACCTACAAAGAC ATGCCTGGGGTAAGCCACCCGGCTACCTAATTCCTCAGTAACCTCCATCTAAAATCTCC AAGGAAGCAATAAATTCCTTTTATGAGATCTATGTCAAATTTTTCCATCTTTCATCCAGGG CTGACTGAAACTATGGCTAATAATTGGGGTACTCTTATGTTTCAATCCAATTTAACCTCAT TTCCCAGATCATTTTTCATGTCCAGTAACACAGAAGCCACCAAGTACAGTATAGCCTGAT AATATGTTGATTTCTTAGCTGACATTAATATTTCTTGCTTCCTTGTGTTCCCACCCTTGGC ACTGCCACCCACCCCTCAATTCAGGCAACAATGAAATTAATGGATACCGTCTGCCCTTG GCCCAGAATTGTTATAGCAAAAATTTTAGAACCAAAAAATAAGTCTGTACTAATTTCAATG TGGCTTTTAAAAGTATGACAGAGAAATAAGTTAGGATAAAGGAAATTTGAATCTCA
SEQ ID NO: 18:
MILNKALLLGALALTTVMSPCGGEDIVADHVASCGVNLYQFYGPSGQYTHEFDGDEQFYVD LERKETAWRWPEFSKFGGFDPQGALRNMAVAKHNLNIMIKRYNSTAATNEVPEVTVFSKSP VTLGQPNTLICLVDNIFPPWNITWLSNGQSVTEGVSETSFLSKSDHSFFKISYLTFLPSADEI YDCKVEHWGLDQPLLKHWEPEIPAPMSELTETVVCALGLSVGLMGIVVGTVFIIQGLRSVGA SRHQGPL
SEQ ID NO: 19:
CACCGGCAGCACCATGTCGCTCACGGTCGTCAGCATGGCGTGTGTTGGGTTCTTCTTGCT GCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCACAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAG GTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCATGTTTGA ACACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGATGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAGAACAC CATGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCAGTCGCATGAAGCAAGACCTGGCAGGG ACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTACTCACTCCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACC CTCTGGACATCGTGATCATAGGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCC CACGGTTCTGGCAGGAGAGAATGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACAT GTACCATCTATCCAGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGGGACCAAGG TCAACGGAACATTCCAGGCCAACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCATGGAGGGACCTACA GATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACTCTCCATACGAGTGGTCAAAGTCAAGTGACCCACTGCT TGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCGAA ACCGGTAACCCCAGACACCTACATGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCA CCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCGACAAAAAAAATGCTGCTGTAATG GACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGTGAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCAT CAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCC CTTCTGAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGC TGAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGAT CTTCTAGGGAGA
SEQ ID NO: 20: MSLTVVSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHR EGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMKQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVIIGLYE KPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGTKVNGTFQANFPLGP ATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLHVLIGTS VVKIPFTILLFFLLHRWCSDKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA
SEQ ID NO: 21 : CCGGCAGCACCATGTTGCTCATGGTCGTCAGCATGGCGTGTGTTGGGTTGTTCTTGGTCC AGAGGGCCGGTCCACACATGGGTGGTCAGGACAAGCCCTTCCTGTCTGCCTGGCCCAGC GCTGTGGTGCCTCGCGGAGGACACGTGACTCTTCGGTGTCACTATCGTCATAGGTTTAAC AATTTCATGCTATACAAAGAAGACAGAATCCACGTTCCCATCTTCCATGGCAGAATATTCCA GGAGGGCTTCAACATGAGCCCTGTGACCACAGCACATGCAGGGAACTACACATGTCGGGG TTCACACCCACACTCCCCCACTGGGTGGTCGGCACCCAGCAACCCCATGGTGATCATGGT CACAGGAAACCACAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCCCCTGGTGAAATCAGG AGAGAGAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATATCATGTTTGAGCACTTCTTTCTGCACAAAG AGTGGATCTCTAAGGACCCCTCACGCCTCGTTGGACAGATCCATGATGGGGTCTCCAAGG CCAATTTCTCCATCGGTTCCATGATGCGTGCCCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTC TGTTACTCACACCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGATCCCCTGGACATCGTGGTCACA GGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCAAGGTTCAGGCAGGAGAG AGCGTGACCTTGTCCTGTAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAG GGGGGAGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAAGGTCAACAGAACATTCCAGGC AGATTTCCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCG TCACTCTCCCTACGAGTGGTCAGACCCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAAC CCTTCAAGTAGTTGGCCTTCACCCACAGAACCAAGCTCCAAATCTGGTAACCTCAGACACC TGCACATTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTC CTTCATCGCTGGTGCTCCAACAAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCAGGG AACAGAAGTGAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAA TTGGAACACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTCAGAGGCCCAAGACAC CCCCAACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAGATCCAAAGTTGT CTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCC TGTCTCAAAACTGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCTGAAGGCATCAGTC TTCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACAAATCTGAATGTGCCTCTCACTTGCTTAC AAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAAAAAACACACTCCTTTGCTTAGCCCACAG TTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTAC TTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCACACATACAAGAGGCTCCGTCTTAA CGCAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTTCCCTCATGCTG
SEQ ID NO: 22: MLLMVVSMACVGLFLVQRAGPHMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNNFMLY KEDRIHVPIFHGRIFQEGFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPMVIMVTGNHRKP SLLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEWISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGSMMRA LAGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGLYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRSSYD MYHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPLLV SVTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNLRHLHILIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKKCCCNGPRAC REQK
SEQ ID NO: 23:
ATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGGGGCGCAGCCGCCTGTCTGCACCGGCAG CACCATGTCGCTCATGGTCGTCAGCATGGCGTGTGTTGGGTTGTTCTTGGTCCAGAGGGC CGGTCCACACATGGGTGGTCAGGACAAACCCTTCCTGTCTGCCTGGCCCAGCGCTGTGGT GCCTCGAGGAGGACACGTGACTCTTCGGTGTCACTATCGTCATAGGTTTAACAATTTCATG CTATACAAAGAAGACAGAATCCACATTCCCATCTTCCATGGCAGAATATTCCAGGAGAGCT TCAACATGAGCCCTGTGACCACAGCACATGCAGGGAACTACACATGTCGGGGTTCACACC CACACTCCCCCACTGGGTGGTCGGCACCCAGCAACCCCGTGGTGATCATGGTCACAGGAA ACCACAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCCCCTGGTGAAATCAGGAGAGAGAG TCATCCTGCAATGTTGGTCAGATATCATGTTTGAGCACTTCTTTCTGCACAAAGAGGGGATC TCTAAGGACCCCTCACGCCTCGTTGGACAGATCCATGATGGGGTCTCCAAGGCCAATTTCT CCATCGGTCCCATGATGCTTGCCCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTACTCA CACCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGATCCCCTGGACATCGTGGTCACAGGTCCATAT GAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCAAGGTTCAGGCAGGAGAGAGCGTGAC CTTGTCCTGTAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAGGGGGGAGC CCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAAGGTCAACAGAACATTCCAGGCAGATTTCCC TCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTCACTCTCC CTACGAGTGGTCAGACCCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAGT AGTTGGCCTTCACCCACAGAACCAAGCTCCAAATCTGGTAACCCCAGACACCTGCACATTC TGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCA
TCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCTCTGGTGCTCCAACAAAAAAAATGCTGCTGTAATG GACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGCCAACAGCGAGGACTCTGATGAACAAGACCCT GAGGAGGTGACATACGCACAGTTGGATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCC CTTCTCAGAGGCCCAAGACACCCCCTACAGATACCATCTTGTACACGGAACTTCCAAATGC TAAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGACGT CTTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGAGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAG CTGGAATCTGAAGGCGTGAGTCTTCATCTTAGGGCATCGCTCCTCCTCACGCCACAAATCT GGTGCCTCTCTCTTGCTTACAAATGTCTAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAAAGAAAACACAC TCCTTTGCTTAGCCCACAGTTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACT GGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAACATA CAAGAGGCTCCCTCTTGACGTGGCACTTACCCACGTGCTGTTCCACCTTCCCTCATGCTGT TTCACCTTTCTTCGGACTATTTTCCAGCCTTCTGTCAGCAGTGAAACTTATAAAATTTTTTGT GATTTCAATGTAGCTGTCTCCTCTTCAAATAAACATGTCTGCCCTCAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA SEQ ID NO: 24:
MSLMVVSMACVGLFLVQRAGPHMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNNFMLY KEDRIHIPIFHGRIFQESFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPWIMVTGNHRKPS LLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEGISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGPMMLAL AGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGPYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRSSYDM YHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPLLVS VTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNPRHLHILIGTSWIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAG NRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSC P SEQ ID NO: 25:
AGTTCTAAAGTCCCCACGCACCCACCCGGACTCAGAGTCTCCTCAGACGCCGAGATGCTG GTCATGGCGCCCCGAACCGTCCTCCTGCTGCTCTCGGCGGCCCTGGCCCTGACCGAGAC CTGGGCCGGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCG GGGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACA GCGACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCC GGAGTATTGGGACCGGAACACACAGATCTACAAGGCCCAGGCACAGACTGACCGAGAGA GCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCAG AGCATGTACGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGCATGACCAGTA CGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCCG CGGACACGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGAGGCGGAGCA GCGGAGAGCCTACCTGGAGGGCGAGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACG GGAAGGACAAGCTGGAGCGCGCTGACCCCCCAAAGACACACGTGACCCACCACCCCATC TCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGTTTCTACCCTGCGGAGATCACA CTGACCTGGCAGCGGGATGGCGAGGACCAAACTCAGGACACTGAGCTTGTGGAGACCAG ACCAGCAGGAGATAGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAAGA GCAGAGATACACATGCCATGTACAGCATGAGGGGCTGCCGAAGCCCCTCACCCTGAGATG GGAGCCGTCTTCCCAGTCCACCGTCCCCATCGTGGGCATTGTTGCTGGCCTGGCTGTCCT AGCAGTTGTGGTCATCGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGTAGGAGGAAGAGTTCAGG TGGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCGTGCAGCGACAGTGCCCAGGGCTCTGATG TGTCTCTCACAGCTTGAAAAGCCTGAGACAGCTGTCTTGTGAGGGACTGAGATGCAGGATT TCTTCACGCCTCCCCTTTGTGACTTCAAGAGCCTCTGGCATCTCTTTCTGCAAAGGCACCT GAATGTGTCTGCGTCCCTGTTAGCATAATGTGAGGAGGTGGAGAGACAGCCCACCCTTGT GTCCACTGTGACCCCTGTTCCCATGCTGACCTGTGTTTCCTCCCCAGTCATCTTTCTTGTTC CAGAGAGGTGGGGCTGGATGTCTCCATCTCTGTCTCAACTTTACGTGCACTGAGCTGCAA CTTCTTACTTCCCTACTGAAAATAAGAATCTGAATATAAATTTGTTTTCTCAAATATTTGCTAT GAGAGGTTGATGGATTAATTAAATAAGTCAATTCCTGGAATTTGAGAGAGCAAATAAAGACC TGAGAACCTTCCAGAAAAAAAA
SEQ ID NO: 26: MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSD AASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMYG CDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEG ECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQT QDTELVETRPAGDRTFQKWAAWVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSTVPIVGIV AGLAVLAWVIGAWAAVMCRRKSSGGKGGSYSQAACSDSAQGSDVSLTA
SEQ ID NO: 27:
GGGAACTTGTGGTCGCGCGGGCTGTTCCACAGCTCCGGGCCGGGTCAGGGTGGCGGCT GCGGGGGCGGACGGGCTGGGCCGCACTGACTGGCCGGTGATTCCTCGCAGAGGATTTC GTGTACCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGTCTTGTG AGCAGAAGCATCTATAACCGAGAAGAGATCGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTC CGGCGCGGTGACGCTGCTGGGGCTGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACA TCCTGGAGAGGAAACGGGCGGCGGTGGACAGGGTGTGCAGACACAACTACCAGTTGGAG CTCCGCACGACCTTGCAGCGGCGAGGTGAGCGGCGTCGCCCTCTGCGAGGCCCACCCTT GGCCCCAAGTCTCTGCGCCAGGAGGGGGCAAGGGTCGTGGCCTCTGAACCTGAGCCCCG TTTGTTCCACCCC
SEQ ID NO: 28:
DFVYQFKGMCYFTNGTERVRLVSRSIYNREEIVRFDSDVGEFRRGDAAGAACRRVLEQPEGH PGEETGGGGQGVQTQLPVGAPHDLAAA SEQ ID NO: 29:
CCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCAGCATGGCATGTGTTGGGTTCTTCTGGCTGC AGGGGGCCTGGCCACATGAGGGATTCCGCAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGT CGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCATGTTTGAGC ACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAGAGCACAT TGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGACCTGGCAGGGAC CTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCCCCCTATCAGTTTTCAGCTCCCAGTGACCCT CTGGACATCGTGATCACAGGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCC ACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCTGGAGCTCCTATGACATG TACCATCTATCCACGGAGGGGGAGGCCCATGAACGTAGGTTCTCTGCAGGGCCCAAGGTC AACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCAAGGAGGAACCTACAGA TGCTTCGGCTCTTTCCATGACTCTCCCTACGAGTGGTCAAAGTCAAGTGACCCACTGCTTG TTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAAC CGGTAACCCCAGACACCTACACGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAACTCCCTTTCACC ATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCGACAAAAAAAATGCATCTGTAATGGA CCAAGGGCCTGCGGGGAACAGAACAGTGAACAGGGAGGATTCTGACGAACAGGACCATC AGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCCCCC
TTCTCAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATAGCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCT GAGTCCAGATCCAAAGCTGTCTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATC TTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCT SEQ ID NO: 30:
MSLMVISMACVGFFWLQGAWPHEGFRRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHR EGTFNDTLRLIGEHIDGVSKANFSIGRMRQDLAGTYRCYGSVPHSPYQFSAPSDPLDIVITGLYE KPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSWSSYDMYHLSTEGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGP ATQGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLHVLIGTS VVKLPFTILLFFLLHRWCSDKKNASVMDQGPAGNRTVNREDSDEQDHQEVSYA
SEQ ID NO: 31
GAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTCGCTGTTCTAAAGCCCGCACGCACCCACCGGGA
CTCAGATTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCCTCCTGCT
ACTCTCGGGGGCCCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCATGAGGTATT TCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTAC GTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCC GCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAAT GTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAA CCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCATCCAGATAATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGA CGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCC TGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGC AAGTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGGCACGTGCGT GGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACCCCC CCAAGACACATATGACCCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGG CCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAG ACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTG GGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATG AGGGTCTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCTGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCA TCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCG CTGCCGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGTTACACTCAGGCTG CAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCCCTCACAGCTTGTAAAGTGTGAGACA GCTGCCTTGTGTGGGACTGAGAGGCAAGAGTTGTTCCTGCCCTTCCCTTTGTGACTTGAAG AACCCTGACTTTGTTTCTGCAAAGGCACCTGCATGTGTCTGTGTTCGTGTAGGCATAATGT GAGGAGGTGGGGAGACCACCCCACCCCCATGTCCACCATGACCCTCTTCCCACGCTGAC CTGTGCTCCCTCCCCAATCATCTTTCCTGTTCCAGAGAGGTGGGGCTGAGGTGTCTCCATC TCTGTCTCAACTTCATGGTGCACTGAGCTGTAACTTCTTCCTTCCCTATTAAAATTAGAACC TTAGTATAAATTTACTTTCTCAAATTCTTGCCATGAGAGGTTGATGAGTTAATTAAAGGAGAA GATTCCTAAAATTTGAGAGACAAAATAAATGGAAGACATGAGAACCTTCCAGAGTCCAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 32:
MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSD AASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYG CDVGSDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHEAEQLRAYLDG TCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQ TQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVWPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIVGII AGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV
SEQ ID NO: 33:
TCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTCCCCAGTCACCCACCCGGACTCACATTCTCCCCAGAGG CCGAGATGCGGGTCATGGCGCCCCGAGCCCTCCTCCTGCTGCTCTCGGGAGGCCTGGCC CTGACCGAGACCTGGGCCTGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTCCCGG CCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGT GCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAG CAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGG CTGACCGAGTGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACGGGTCT CACACCCTCCAGAGGATGTCTGGCTGCGACCTGGGGCCCGACGGGCGCCTCCTCCGCGG GTATGACCAGTCCGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTC CTGGACCGCCGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTTGGAGGCGGCCCGT GCGGCGGAGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATA CCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCGCAGAACCCCCAAAGACACACGTGACCC ACCACCCCCTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTG CGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACCGAGCTT GTGGAGACCAGGCCAGCAGGAGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCC TTCTGGACAAGAGCAGAGATACACGTGCCATATGCAGCACGAGGGGCTGCAAGAGCCCCT CACCCTGAGCTGGGAGCCATCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCATGGGCATCGTTGCTGG CCTGGCTGTCCTGGTTGTCCTAGCTGTCCTTGGAGCTGTGGTCACCGCTATGATGTGTAG GAGGAAGAGCTCAGGTGGAAAAGGAGGGAGCTGCTCTCAGGCTGCGTGCAGCAACAGTG CCCAGGGCTCTGATGAGTCTCTCATCACTTGTAAAGCCTGAGACAGCTGCCTGTGTGGGA CTGAGATGCAGGATTTCTTCACACCTCTCCTTTGTGACTTCAAGAGCCTCTGGCATCTCTTT CTGCAAAGGCACCTGAATGTGTCTGCGTTCCTGTTAGCATAATGTGAGGAGGTGGAGAGA CAGCCCACCCCCGTGTCCACCGTGACCCCTGTCCCCACACTGACCTGTGTTCCCTCCCCG ATCATCTTTCCTGTTCCAGAGAGGTGGGGCTGGATGTCTCCATCTCTGTCTCAAATTCATG GTGCACTGAGCTGCAACTTCTTACTTCCCTAATGAAGTTAAGAACCTGAATATAAATTTGTG TTCTCAAATATTTGCTATGAAGCGTTGATGGATTAATTAAATAAGTCAATTCCTAGAAGTTGA GAGAGCAAATAAAGACCTGAGAACCTTCCAGAA
SEQ ID NO: 34:
MRVMAPRALLLLLSGGLALTETWACSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDS DAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHTLQRM SGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAYLE GTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGED QTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVWPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEPSSQPTIPIM GIVAGLAVLVVLAVLGAWTAMMCRRKSSGGKGGSCSQAACSNSAQGSDESLITCKA
SEQ ID NO: 35:
CCTATAACTTGGAATGTGGGTGGAGGGGTTCATAGTTCTCCCTGAGTGAGACTTGCCTGCT TCTCTGGCCCCTGGTCCTGTCCTGTTCTCCAGCATGGTGTGTCTGAAGCTCCCTGGAGGC TCCTGCATGACAGCGCTGACAGTGACACTGATGGTGCTGAGCTCCCCACTGGCTTTGTCT GGGGACACCCGACCACGTTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGTGTCATTTCTTCAATGGG ACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTCCGTGCGCTTC GACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGACGCTGAGT ACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGCAGGCGCGGGCCGCGGTGGACACCTACTGC AGACACAACTACGGGGTTGTGGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGAGTCCAACCTAAGGTG ACTGTATATCCTTCAAAGACCCAGCCCCTGCAGCACCACAACCTCCTGGTCTGCTCTGTGA GTGGTTTCTATCCAGGCAGCATTGAAGTCAGGTGGTTCCTGAACGGCCAGGAAGAGAAGG CTGGGATGGTGTCCACAGGCCTGATCCAGAATGGAGACTGGACCTTCCAGACCCTGGTGA TGCTGGAAACAGTTCCTCGAAGTGGAGAGGTTTACACCTGCCAAGTGGAGCACCCAAGCG TGACAAGCCCTCTCACAGTGGAATGGAGAGCACGGTCTGAATCTGCACAGAGCAAGATGC TGAGTGGAGTCGGGGGCTTTGTGCTGGGCCTGCTCTTCCTTGGGGCCGGGCTGTTCATCT ACTTCAGGAATCAGAAAGGACACTCTGGACTTCAGCCAACAGGATTCCTGAGCTGAAATGC AGATGACCACATTCAAGGAAGAACTTTCTGCCCCGGCTTTGCAGGATGAAAAGCTTTCCTG CTTGGCAGTTATTCTTCCACAAGAGAGGGCTTTCTCAGGACCTGGTTGCTACTGGTTCGGC AACTGCAGAAAATGTCCTCCCTTGTGGCTTCCTCAGCTCCTGCCCTTGGCCTGAAGTCCCA GCATTGATGGCAGCGCCTCATCTTCAACTTTTGTGCTCCCCTTTGCCTAAACCGTATGGCC TCCCGTGCATCTGTATTCACCCTGTATGACAAACACATTACATTATTAAATGTTTCTCAAAGA TGGAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 36:
MVCLKLPGGSCMTALTVTLMVLSSPLALSGDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYN QEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVVESFTVQRRV QPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQT LVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKM LSGVGGFVLGLLFLGAGLFIY FRNQKGHSGLQPTGFLS
SEQ ID NO: 37:
TTTTTATTCTTTCTGCCAGGTACATCAGATCCATCAGGTCCGAGCTGTGTTGACTACCACTG CTTTTCCCTTCGTCTCAGTTATGTCTTGGAAGAAGGCTTTGCGGATCCCCGGAGACCTTCG GGTAGCAACTGTCACCTTGATGCTGGCGATGCTGAGCTCCCTACTGGCTGAGGGCAGAGA CTCTCCCGAGGATTTCGTGTTCCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGA GCGCGTGCGTCTTGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGACAG CGACGTGGGGGTGTACCGCGCGGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGG AACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACA CAACTACGAGGTGGCGTTCCGCGGGATCTTGCAGAGGAGAGTGGAGCCCACAGTGACCA TCTCCCCATCCAGGACAGAGGCCCTCAACCACCACAACCTGCTGGTCTGCTCGGTGACAG ATTTCTATCCAGGCCAGATCAAAGTCCGGTGGTTTCGGAATGATCAGGAGGAGACAGCCG GCGTTGTGTCCACCCCCCTTATTAGGAATGGTGACTGGACTTTCCAGATCCTGGTGATGCT GGAAATGACTCCCCAGCGTGGAGATGTCTACACCTGCCACGTGGAGCACCCCAGCCTCCA GAGCCCCATCACCGTGGAGTGGCGGGCTCAGTCTGAATCTGCCCAGAGCAAGATGCTGA GTGGCGTTGGAGGCTTCGTGCTGGGGCTGATCTTCCTTGGGCTGGGCCTTATCATCCGTC AAAGGAGTCAGAAAGGGCTTCTGCACTGACTCCTGAGACTATTTTAACTAGGATTGGTTAT CACTCTTCTGTGATGCCTGCTTATGCCTGCCCAGAATTCCCAGCTGCCTGTGTCAGCTTGT CCCCCTGAGATCAAAGTCCTACAGTGGCTGTCACGCAGCCACCAGGTCATCTCCTTTCATC CCCACCCCAAGGCGCTGGCTGTGACTCTGCTTCCTGCACTGACCCAGAGCCTCTGCCTGT GCATGGCCAGCTGCGTCTACTCAGGTCCCAAGGGGTTTCTGTTTCTATTCTTTCCTCAGAC TGCTCAAGAGAAGCACATGAAAAACATTACCTGACTTTAGAGCTTTTTTACATAATTAAACAT GATCCTGAGTTATCTGTATTCTGAACTTTCTTAATTGAGAAGAGGCAGGAAATCACTGCAGA ATGAAGGAACATCCCTTGAGGTGACCCAGCAAACCTGTGGCCAGAAGGAGGATTGTACCT TGAAAAGACACTGAAAGCATTTTGGGGTGTGAAGTAAGGGTGGGCAGAGGAGGTAGAAAA TAATTCAATTGTCGCATCATTCATGGTTCTTTAATACTGATGCTCAGTGCATTGGCCTTAGA ATATCCCAGCCTCTCTTCTGGTTTGGTGAGTGCTGTGTAAATAAGCATGGTAGAATTGTTTG GAGACATATATAGTGATCCTTGGTCACTGGTGTTTCAAACATTCTGGAAAGTCACATCGATC AAGAATATTTTTTATTTTTAAGAAAGCATAACCAGCAATAAAAATACTATTTTTGAGTCTAAAT GAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 38:
MSWKKALRIPGDLRVATVTLMLAMLSSLLAEGRDSPEDFVFQFKGMCYFTNGTERVRLVTRYI YNREEYARFDSDVGVYRAVTPQGRPDAEYWNSQKEVLEGTRAELDTVCRHNYEVAFRGILQR RVEPTVTISPSRTEALNHHNLLVCSVTDFYPGQIKVRWFRNDQEETAGWSTPLIRNGDWTFQI LVMLEMTPQRGDVYTCHVEHPSLQSPITVEWRAQSESAQSKM LSGVGGFVLGLIFLGLGLIIRQ RSQKGLLH
SEQ ID NO: 39:
TTTTTATTCTTTCTGCCAGGTACATCAGATCCATCAGGTCCGAGCTGTGTTGACTACCACTG CTTTTCCCTTCGTCTCAGTTATGTCTTGGAAGAAGGCTTTGCGGATCCCCGGAGACCTTCG GGTAGCAACTGTCACCTTGATGCTGGCGATGCTGAGCTCCCTACTGGCTGAGGGCAGAGA CTCTCCCGAGGATTTCGTGTTCCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGA GCGCGTGCGTCTTGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGACAG CGACGTGGGGGTGTACCGCGCGGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGG AACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACA CAACTACGAGGTGGCGTTCCGCGGGATCTTGCAGAGGAGAGTGGAGCCCACAGTGACCA TCTCCCCATCCAGGACAGAGGCCCTCAACCACCACAACCTGCTGGTCTGCTCGGTGACAG ATTTCTATCCAGGCCAGATCAAAGTCCGGTGGTTTCGGAATGATCAGGAGGAGACAGCCG GCGTTGTGTCCACCCCCCTTATTAGGAATGGTGACTGGACTTTCCAGATCCTGGTGATGCT GGAAATGACTCCCCAGCGTGGAGATGTCTACACCTGCCACGTGGAGCACCCCAGCCTCCA GAGCCCCATCACCGTGGAGTGGCGGGCTCAGTCTGAATCTGCCCAGAGCAAGATGCTGA GTGGCGTTGGAGGCTTCGTGCTGGGGCTGATCTTCCTTGGGCTGGGCCTTATCATCCGTC AAAGGAGTCAGAAAGGACCTCAAGGGCCTCCACCAGCAGGGCTTCTGCACTGACTCCTGA GACTATTTTAACTAGGATTGGTTATCACTCTTCTGTGATGCCTGCTTATGCCTGCCCAGAAT TCCCAGCTGCCTGTGTCAGCTTGTCCCCCTGAGATCAAAGTCCTACAGTGGCTGTCACGC AGCCACCAGGTCATCTCCTTTCATCCCCACCCCAAGGCGCTGGCTGTGACTCTGCTTCCT GCACTGACCCAGAGCCTCTGCCTGTGCATGGCCAGCTGCGTCTACTCAGGTCCCAAGGG GTTTCTGTTTCTATTCTTTCCTCAGACTGCTCAAGAGAAGCACATGAAAAACATTACCTGAC TTTAGAGCTTTTTTACATAATTAAACATGATCCTGAGTTATCTGTATTCTGAACTTTCTTAATT GAGAAGAGGCAGGAAATCACTGCAGAATGAAGGAACATCCCTTGAGGTGACCCAGCAAAC CTGTGGCCAGAAGGAGGATTGTACCTTGAAAAGACACTGAAAGCATTTTGGGGTGTGAAGT AAGGGTGGGCAGAGGAGGTAGAAAATAATTCAATTGTCGCATCATTCATGGTTCTTTAATA CTGATGCTCAGTGCATTGGCCTTAGAATATCCCAGCCTCTCTTCTGGTTTGGTGAGTGCTG TGTAAATAAGCATGGTAGAATTGTTTGGAGACATATATAGTGATCCTTGGTCACTGGTGTTT CAAACATTCTGGAAAGTCACATCGATCAAGAATATTTTTTATTTTTAAGAAAGCATAACCAGC AATAAAAATACTATTTTTGAGTCTAAATGA
SEQ ID NO: 40:
MSWKKALRIPGDLRVATVTLMLAMLSSLLAEGRDSPEDFVFQFKGMCYFTNGTERVRLVTRYI YNREEYARFDSDVGVYRAVTPQGRPDAEYWNSQKEVLEGTRAELDTVCRHNYEVAFRGILQR RVEPTVTISPSRTEALNHHNLLVCSVTDFYPGQIKVRWFRNDQEETAGWSTPLIRNGDWTFQI LVMLEMTPQRGDVYTCHVEHPSLQSPITVEWRAQSESAQSKM LSGVGGFVLGLIFLGLGLIIRQ RSQKGPQGPPPAGLLH
SEQ ID NO: 41 :
GCTGTCGAAGCGCGCGAACTCCTCCCGGTTGTAGATGTATCTCTCCAGGAAGCGCTGTGT CCCATTAAACGCGTAGCATTCCTGCCGTCCCTGGAAAAGTCATCAATTATAGACCCCACAA CATGCGCCCTGAAGACAGAATGTTCCATATCAGAGCTGTGATCTTGAGAGCCCTCTCCTTG GCTTTCCTGCTGAGTCTCCGAGGAGCTGGGGCCATCAAGGCGGACCATGTGTCAACTTAT GCCGCGTTTGTACAGACGCATAGACCAACAGGGGAGTTTATGTTTGAATTTGATGAAGATG AGATGTTCTATGTGGATCTGGACAAGAAGGAGACCGTCTGGCATCTGGAGGAGTTTGGCC AAGCCTTTTCCTTTGAGGCTCAGGGCGGGCTGGCTAACATTGCTATATTGAACAACAACTT GAATACCTTGATCCAGCGTTCCAACCACACTCAGGCCACCAACGATCCCCCTGAGGTGAC CGTGTTTCCCAAGGAGCCTGTGGAGCTGGGCCAGCCCAACACCCTCATCTGCCACATTGA CAAGTTCTTCCCACCAGTGCTCAACGTCACGTGGCTGTGCAACGGGGAGCTGGTCACTGA GGGTGTCGCTGAGAGCCTCTTCCTGCCCAGAACAGATTACAGCTTCCACAAGTTCCATTAC CTGACCTTTGTGCCCTCAGCAGAGGACTTCTATGACTGCAGGGTGGAGCACTGGGGCTTG GACCAGCCGCTCCTCAAGCACTGGGAGGCCCAAGAGCCAATCCAGATGCCTGAGACAAC GGAGACTGTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTAGTCGGCATCATCGTGGGCA CCGTCCTCATCATAAAGTCTCTGCGTTCTGGCCATGACCCCCGGGCCCAGGGGACCCTGT GAAATACTGTAAAGGTGACAAAATATCTGAACAGAAGAGGACTTAGGAGAGATCTGAACTC CAGCTGCCCTACAAACTCCATCTCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTGAAAACTACTCCAGTG GCTGACTGAATTGCTGACCCTTCAAGCTCTGTCCTTATCCATTACCTCAAAGCAGTCATTCC TTAGTAAAGTTTCCAACAAATAGAAATTAATGACACTTTGGTAGCACTAATATGGAGATTATC CTTTCATTGAGCCTTTTATCCTCTGTTCTCCTTTGAAGAACCCCTCACTGTCACCTTCCCGA GAATACCCTAAGACCAATAAATACTTCAGTATTTCAGAGCGGGGAGACTCTGAGTCATTCTT ACTGGAAGTCTAGGACCAGGTCACATGTGAATACTATTTCTTGAAGGTGTGGTTTCAACCT CTGTTGCCGATGTGGTTACTAAAGGTTCTGATCCCACTTGAACGGAAAGGTCTGAGGATAT TGATTCAGTCCTGGGTTTTTCCCTAACTACAGGATAGGGTGGGGTAGAGAAAGGATATTTG GGGGAAATTTTACTTGGATGAAGATTTTCTTGGATGTAGTTTGAAGACTGCAGTGTTTGAAG TCTCTGAGGGAAGAGATTTGGTCTGTCTGGATCAAGATTTCAGGCAGATTAGGATTCCATT CACAGCCCCTGAGCTTCCTTCCCAAGGCTGTATTGTAATTATAGCAATATTTCATGGAGGAT TTTTCTACATGATAAACTAAGAGCCAAGAAATAAAATTTTTAAAATGCCCTAAAAAAAAAAAA AAAAAA
SEQ ID NO: 42:
MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEFDEDEMFY VDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFPKEPV ELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSAEDFYD CRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHDPRAQ GTL
SEQ ID NO: 43:
GCTGTCGAAGCGCGCGAACTCCTCCCGGTTGTAGATGTATCTCTCCAGGAAGCGCTGTGT CCCATTAAACGCGTAGCATTCCTGCCGTCCCTGGAAAAGTGCTAGAGGCCCACAGTTTCA GTCTCATCTGCCTCCACTCGGCCTCAGTTCCTCATCACTGTTCCTGTGCTCACAGTCATCA ATTATAGACCCCACAACATGCGCCCTGAAGACAGAATGTTCCATATCAGAGCTGTGATCTT GAGAGCCCTCTCCTTGGCTTTCCTGCTGAGTCTCCGAGGAGCTGGGGCCATCAAGGCGGA CCATGTGTCAACTTATGCCGCGTTTGTACAGACGCATAGACCAACAGGGGAGTTTATGTTT GAATTTGATGAAGATGAGATGTTCTATGTGGATCTGGACAAGAAGGAGACCGTCTGGCATC TGGAGGAGTTTGGCCAAGCCTTTTCCTTTGAGGCTCAGGGCGGGCTGGCTAACATTGCTA TATTGAACAACAACTTGAATACCTTGATCCAGCGTTCCAACCACACTCAGGCCACCAACGA TCCCCCTGAGGTGACCGTGTTTCCCAAGGAGCCTGTGGAGCTGGGCCAGCCCAACACCCT CATCTGCCACATTGACAAGTTCTTCCCACCAGTGCTCAACGTCACGTGGCTGTGCAACGG GGAGCTGGTCACTGAGGGTGTCGCTGAGAGCCTCTTCCTGCCCAGAACAGATTACAGCTT CCACAAGTTCCATTACCTGACCTTTGTGCCCTCAGCAGAGGACTTCTATGACTGCAGGGTG GAGCACTGGGGCTTGGACCAGCCGCTCCTCAAGCACTGGGAGGCCCAAGAGCCAATCCA GATGCCTGAGACAACGGAGACTGTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTAGTCG GCATCATCGTGGGCACCGTCCTCATCATAAAGTCTCTGCGTTCTGGCCATGACCCCCGGG CCCAGGGGACCCTGTGAAATACTGTAAAGGTGACAAAATATCTGAACAGAAGAGGACTTAG GAGAGATCTGAACTCCAGCTGCCCTACAAACTCCATCTCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTG AAAACTACTCCAGTGGCTGACTGAATTGCTGACCCTTCAAGCTCTGTCCTTATCCATTACCT CAAAGCAGTCATTCCTTAGTAAAGTTTCCAACAAATAGAAATTAATGACACTTTGGTAGCAC TAATATGGAGATTATCCTTTCATTGAGCCTTTTATCCTCTGTTCTCCTTTGAAGAACCCCTCA CTGTCACCTTCCCGAGAATACCCTAAGACCAATAAATACTTCAGTATTTCAGAGCGGGGAG ACTCTGAGTCATTCTTACTGGAAGTCTAGGACCAGGTCACATGTGAATACTATTTCTTGAAG GTGTGGTTTCAACCTCTGTTGCCGATGTGGTTACTAAAGGTTCTGATCCCACTTGAACGGA AAGGTCTGAGGATATTGATTCAGTCCTGGGTTTTTCCCTAACTACAGGATAGGGTGGGGTA GAGAAAGGATATTTGGGGGAAATTTTACTTGGATGAAGATTTTCTTGGATGTAGTTTGAAGA CTGCAGTGTTTGAAGTCTCTGAGGGAAGAGATTTGGTCTGTCTGGATCAAGATTTCAGGCA GATTAGGATTCCATTCACAGCCCCTGAGCTTCCTTCCCAAGGCTGTATTGTAATTATAGCAA TATTTCATGGAGGATTTTTCTACATGATAAACTAAGAGCCAAGAAATAAAATTTTTAAAATGC CCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 44:
MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEFDEDEMFY VDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFPKEPV ELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSAEDFYD CRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHDPRAQ GTL
SEQ ID NO: 45 ATTTCCAGTGCTAGAGGCCCACAGTTTCAGTCTCATCTGCCTCCACTCGGCCTCAGTTCCT CATCACTGTTCCTGTGCTCACAGTCATCAATTATAGACCCCACAACATGCGCCCTGAAGAC AGAATGTTCCATATCAGAGCTGTGATCTTGAGAGCCCTCTCCTTGGCTTTCCTGCTGAGTC TCCGAGGAGCTGGGGCCATCAAGGCGGACCATGTGTCAACTTATGCCGCGTTTGTACAGA CGCATAGACCAACAGGGGAGTTTATGTTTGAATTTGATGAAGATGAGATGTTCTATGTGGA TCTGGACAAGAAGGAGACCGTCTGGCATCTGGAGGAGTTTGGCCAAGCCTTTTCCTTTGA GGCTCAGGGCGGGCTGGCTAACATTGCTATATTGAACAACAACTTGAATACCTTGATCCAG CGTTCCAACCACACTCAGGCCACCAACGATCCCCCTGAGGTGACCGTGTTTCCCAAGGAG CCTGTGGAGCTGGGCCAGCCCAACACCCTCATCTGCCACATTGACAAGTTCTTCCCACCA GTGCTCAACGTCACGTGGCTGTGCAACGGGGAGCTGGTCACTGAGGGTGTCGCTGAGAG CCTCTTCCTGCCCAGAACAGATTACAGCTTCCACAAGTTCCATTACCTGACCTTTGTGCCCT CAGCAGAGGACTTCTATGACTGCAGGGTGGAGCACTGGGGCTTGGACCAGCCGCTCCTC AAGCACTGGGAGGCCCAAGAGCCAATCCAGATGCCTGAGACAACGGAGACTGTGCTCTGT GCCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTAGTCGGCATCATCGTGGGCACCGTCCTCATCATAAAG TCTCTGCGTTCTGGCCATGACCCCCGGGCCCAGGGGACCCTGTGAAATACTGTAAAGGTG ACAAAATATCTGAACAGAAGAGGACTTAGGAGAGATCTGAACTCCAGCTGCCCTACAAACT CCATCTCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTGAAAACTACTCCAGTGGCTGACTGAATTGCTGA CCCTTCAAGCTCTGTCCTTATCCATTACCTCAAAGCAGTCATTCCTTAGTAAAGTTTCCAAC AAATAGAAATTAATGACACTTTGGTAGCAC
TAATATGGAGATTATCCTTTCATTGAGCCTTTTATCCTCTGTTCTCCTTTGAAGAACCCCTCA CTGTCACCTTCCCGAGAATACCCTAAGACCAATAAATACTTCAGTATTTCAGAGCGGGGAG ACTCTGAGTCATTCTTACTGGAAGTCTAGGACCAGGTCACATGTGAATACTATTTCTTGAAG GTGTGGTTTCAACCTCTGTTGCCGATGTGGTTACTAAAGGTTCTGATCCCACTTGAACGGA AAGGTCTGAGGATATTGATTCAGTCCTGGGTTTTTCCCTAACTACAGGATAGGGTGGGGTA GAGAAAGGATATTTGGGGGAAATTTTACTTGGATGAAGATTTTCTTGGATGTAGTTTGAAGA CTGCAGTGTTTGAAGTCTCTGAGGGAAGAGATTTGGTCTGTCTGGATCAAGATTTCAGGCA GATTAGGATTCCATTCACAGCCCCTGAGCTTCCTTCCCAAGGCTGTATTGTAATTATAGCAA TATTTCATGGAGGATTTTTCTACATGATAAACTAAGAGCCAAGAAATAAAATTTTTAAAATGC CCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 46:
MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEFDEDEMFY VDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFPKEPV ELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSAEDFYD CRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHDPRAQ GTL
SEQ ID NO: 47 GTCACAGAAGACTACTTGGGTTCATGGTCTCTAATATTTCAAACAGGAGCTCCCTTTAGCG AGTCCTTCTTTTCCTGACTGCAGCTCTTTTCATTTTGCCATCCTTTTCCAGCTCCATGATGG TTCTGCAGGTTTCTGCGGCCCCCCGGACAGTGGCTCTGACGGCGTTACTGATGGTGCTGC TCACATCTGTGGTCCAGGGCAGGGCCACTCCAGAGAATTACCTTTTCCAGGGACGGCAGG AATGCTACGCGTTTAATGGGACACAGCGCTTCCTGGAGAGATACATCTACAACCGGGAGG AGTTCGCGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCG GCCTGCTGCGGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGGAGAAGCGGGCAGTGC CGGACAGGATGTGCAGACACAACTACGAGCTGGGCGGGCCCATGACCCTGCAGCGCCGA GTCCAGCCTAGGGTGAATGTTTCCCCCTCCAAGAAGGGGCCCTTGCAGCACCACAACCTG CTTGTCTGCCACGTGACGGATTTCTACCCAGGCAGCATTCAAGTCCGATGGTTCCTGAATG GACAGGAGGAAACAGCTGGGGTCGTGTCCACCAACCTGATCCGTAATGGAGACTGGACCT TCCAGATCCTGGTGATGCTGGAAATGACCCCCCAGCAGGGAGATGTCTACACCTGCCAAG TGGAGCACACCAGCCTGGATAGTCCTGTCACCGTGGAGTGGAAGGCACAGTCTGATTCTG CCCGGAGTAAGACATTGACGGGAGCTGGGGGCTTCGTGCTGGGGCTCATCATCTGTGGA GTGGGCATCTTCATGCACAGGAGGAGCAAGAAAGTTCAACGAGGATCTGCATAAACAGGG TTCCTGAGCTCACTGAAAAGACTATTGTGCCTTAGGAAAAGCATTTGCTGTGTTTCGTTAGC ATCTGGCTCCAGGACAGACCTTCAACTTCCAAATTGGATACTGCTGCCAAGAAGTTGCTCT GAAGTCAGTTTCTATCATTCTGCTCTTTGATTCAAAGCACTGTTTCTCTCACTGGGCCTCCA ACCATGTTCCCTTCTTCTTAGCACCACAAATAATCAAAACCCAACATGACTGTTTGTTTTCCT TTAAAAATATGCACCAAATCATCTCTCATCACTTTTCTCTGAGGGTTTTAGTAGACAGTAGG AGTTAATAAAGAAGTTCATTTTGGTTTAAACATAGGAAAGAAGAGAACCATGAAAATGGGGA TATGTTAACTATTGTATAATGGGGCCTGTTACACATGACACTCTTCTGAATTGACTGTATTTC AGTGAGCTGCCCCCAAATCAAGTTTAGTGCCCTCATCCATTTATGTCTCAGACCACTATTCT TAACTATTCAATGGTGAGCAGACTGCAAATCTGCCTGATAGGACCCATATTCCCACAGCAC TAATTCAACATATACCTTACTGAGAGCATGTTTTATCATTACCATTAAGAAGTTAAATGAACA TCAGAATTTAAAATCATAAATATAATCTAATACACTTTAACCATTTTCTTTGTGTGCCATCACA AATACTCCTTAACCAAATACGGCTTGGACTTTTGAATGCATCCAATAGACGTCATTTGTCGT CTAAGTCTGCATTCATCCACCAGCCTAGGCCTCCTGTCTTAATTTTCATACAGACAGAAATG ACTCCCCACTGGGGAAAGAGCAAAGCAATACATGTAGCACTCTTTTTCAAACACTGGTCTT TTTTTTTTTCTTAACAATCCAACATTGTTATGTGTTTTGCGTCTCATATTGACACCTTTTGGTC AAGGTAGAGGACATGTTTGTTGTAAGCTTTCTTTTTCGTGTAGAGGATGGATTCTTCACTCC TGATACACACAATCAGTGCACAGCAGCTCTCTTATACATCCAGTTGATGCCTTCAGTCTCCC TGGCTTCTTACAAGCATCTTCTGGGCCTTGTGTGTCCCTGGGCACCTGTCCCTGGTCAATT CCCGAAAGCTACTGTGCTCCTCTTGCCCATCTCCCCTTGCAAATAATATCTTCCATCGGGG GACCGGCTTCCTCCAATTTCAGGAGAGGTGGGGCTGAAGGCACAGACTTGGGCGTCACTG GCACAGATATAAGTAAATACAGCTGGAGTCTGCAGAGAGGCTGGACTGAGTCAGGGAGTC AGGAAAGAGAAGCCACACACAAGGACAACCAATCATGTTTCTCATAATCTTCTTAACCTAG GGAATAGGACACAATCATTTTTTCTTTTTAAAACATCTTTATCCCTGATCAGCCTCATTTCCT CAAAAACTATAAAGGAAAATGCTGCTGACTTGTTTTTGCGTAGTAATTTCAGCTGTCACATA ATAAGCTAAGGAAGACAGTATATAGTAAATAAGGACCCTTTATCTGTCTTATTTTCCCTTTTG GCTTCACAGGAAACTTGTGAGAAACCTATGCAGCATAAAATTAATATGATTTCAATCCAGGG ATTCAACGATGGAAGGAGGTCATGAGAATAGCAGAAAGTCTTCAAATCGAGATCATTATGA AATCCTCAGACCCAGAGCACATAAATCCTACCCTCAGAGTCACTGAGCAGTTAACATTACA AATTACAAACCATATCCAGTCAGAGTCATTCTCTTTCCTGCTTGTCTCCTGTACTCATGTTAC AGGTTAGGGCAGTACCCCGAGTGGAGTGAACAATCTCTGGACTAACACTTGTCAGGATCA GAAGCTGAGGTATCTGCACCCACATTACAGGAACAGGATATGTGCTCCTAGGGAACTGAG GGTGTCAGGAGATGAGGAATGTCCCTGGAGTCACAGAAAGAAGGTATCAGATGTGTCTCA CTCTGACATATGCAGGTGTTTATGAAACTCTGGGATTTCTAAGGAAGGATGCAGTGCAGAG ACAGGTCCCAGAGGAGACAAGAGCTGAGAGACCATCCAAACTGGGACCACCTTGTCACTA GACTTCAAATTTTCAATATTGATAGAGTGTTTTCTAAGAGTCAGGCCCTTTGCTGAGTGCTA TGTGCAGCAGGATCAAAGGCAG
CCAGGAGGTAGAGGAGTCTTGAGGTACATCAGTCATTGGAGTTGAAGAGCAGAGATTCAA AGGAAAGTTGGAACTGGAGCTTTAAAGGAGATGTGAAGTGGGTGACTCAACCTCTGACTCA GAAAAATTGATACCTGCAGAAGAAAAAACCCGGCGGGCTTAGGACTCCCAGCTGAGTGTT GTATCCTCCATCCCTTTCCACCTGGTCCCTTCATTTTCTACCCCTCACAGTTCCCTAACGAG AAGGTGGTCCACCCAACAGACAACACTGCCTCAGATGGTTATCAAGGGGTACCCTAAGAA GAAATCATCTCACCCTCTCTTTGTCCCCATTTGTCAAGTAGCAGTGAGGCCGAGCCAGGGG ATGGTGAAAGTGGAAGGAGGTGGGAGTTGGGCATCGGGTGTGAAGATGCTCTTGAAAGG GGTTTTAATAACCACTTGCTACCAGGCCAGTGAACACTTACCATAGTTGATGCCTTTTGAGC ATGTTGCATTGTAAACTGTCCCTGAAATTACTGTGCACTTGGCTTATGGGATGAAACATCCT CCTAGTTCTTTTGTCTCTCAGCTTCTCTGAAGTCTCATTGAGCACCTTCTCTTCAATTTCTTT TACACAGTAAGAATAGGATCAGCTGTGCTAAACTAACAAATACCCAGATATCCAGGTTTGG CTCATGTTACACGTCCAAAGTAAGTCATGCAGGAAGCTCTGCTCATCATCGTACTCAGGAA GTCAGGCTGACAGTCTTTCTCCTGCACATCTGCTCCCAGAACCTCCCCAGCAGAATGAAG GGAACCTAAGAATTTATTCACTGGCTTTTAATGATCCCTCCTAGAAAGAACACACTTCTCGC ATTTCATTTTCCAATGTAAATCATATGGCTGCAACTAACTTCAAATAAGTGGGAATACTTGAA GGTGGAAAACATTTAAGAAGTACACACTAAATAAATAATAAAATACTTCTACAAGAGA SEQ ID NO: 48:
MMVLQVSAAPRTVALTALLMVLLTSWQGRATPENYLFQGRQECYAFNGTQRFLERYIYNREE FARFDSDVGEFRAVTELGRPAAEYWNSQKDILEEKRAVPDRMCRHNYELGGPMTLQRRVQP RVNVSPSKKGPLQHHNLLVCHVTDFYPGSIQVRWFLNGQEETAGVVSTNLIRNGDWTFQILVM LEMTPQQGDVYTCQVEHTSLDSPVTVEWKAQSDSARSKTLTGAGGFVLGLIICGVGIFMHRRS KKVQRGSA En el contexto de la presente invención, los genes HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4 y KIR2DS3 se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de las proteínas recogidas respectivamente en la Tabla 1 , siendo dichas proteínas el producto de expresión de cada uno de los genes identificados en la tabla. Adicionalmente la presente invención comprende diversas variantes procedentes de cada una de las secuencias identificadas en la tabla 1 :
En este sentido, variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-C comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-C. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 1 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL2 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 4 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DL2. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 3 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 6 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DL3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 5 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 8 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DL1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 7 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS4 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS4. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 9,
SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 indicadas en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 16 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un
98% o un 99% con la SEQ I D NO: 16 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 15 indicada en la Tabla 1. En el contexto de la presente invención, los genes HLA-DQA 1, KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL 1, KIR2DS3), HLA-B y HLA-DQB3 se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de las proteínas recogidas respectivamente en la Tabla 1 , siendo dichas proteínas el producto de expresión de cada uno de los genes identificados en la tabla. Adicionalmente la presente invención comprende diversas variantes procedentes de cada una de las secuencias identificadas en la tabla 1. :
En este sentido, variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DQA 1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 18 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 18 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DQA1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 17 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 20 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 20 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 19 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR3DS1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 22 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 22 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR3DS1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 21 indicada en la Tabla 1. Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR3DL1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 24 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 24 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR3DL1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 23 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-B comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 26 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 26 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-B. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 25 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DQB3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 28 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 28 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DQB3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 27 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 16 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 16 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 15 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-A comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 32 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 32 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-A. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 33 indicada en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-C comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-C. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 1 indicada en la Tabla 1. Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DRB1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 36 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 36 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DRB1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 35 indicada en la Tabla 1. Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DQB1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de las SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40 recogidas en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40 recogidas en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DQB1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en las SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 39 indicadas en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DPA 1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de las SEQ ID NO: 42, SEQ I D NO: 44 o SEQ ID NO: 46 recogidas en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46 recogidas en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DPA1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en las SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 45 indicadas en la Tabla 1.
Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DPB1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 48 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 48 recogidas en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DRB1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 47 indicada en la Tabla 1.
USO MÉDICO EN UN GRUPO DE PACIENTES
Los autores de la presente invención han identificado nuevos subgrupos de pacientes que se beneficiarán de determinados tratamientos: Transmisión Vertical del VHC
Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a una madre ARN- VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende madres identificables por el primer o segundo método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 6,2, 3,9, 10,7 ó 6 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia); y en el que el segundo grupo representa el resto de las madres.
Nos referimos a antivirales directos frente al VHC con capacidad de negativizar la viremia del VHC de forma aislada o en asociación de otros antivirales de acción directa que no precisan del interferón o ribavirina, previa autorización tras ensayos clínicos en gestantes en el último trimestre de gestación y/o administración a los recién nacidos en las mismas condiciones previas.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de una madre ARN-VHC (+) con probabilidad mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia identificable por el primer o segundo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una madre ARN-VHC (+) con probabilidad mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia identificable por el método de acuerdo con el primer o segundo método de la invención.
Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de una madre ARN-VHC (+) con una probabilidad mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende individuos con una madre ARN-VHC (+) identificables por el tercer o cuarto método de la invención (tienen una probabilidad 3,3, 4,2 ó 14 veces mayor de ser contagiados mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C); y en el que el segundo grupo representa el resto de los individuos con una madre ARN-VHC (+).
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con una madre ARN-VHC (+) con una probabilidad mayor de ser contagiados mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C identificable por el tercer o cuarto método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con una madre ARN-VHC (+) con el XXXX probabilidad de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C identificable por el método de acuerdo con el tercer o cuarto método de la invención.
Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una madre ARN-VHC (+) con una probabilidad 3 mayor de ser contagiados mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante primer microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DS3). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DS3) son las secuencias nucleotídicas correspondientes indicadas en la tabla 1.
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante primer microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+).
Cronificación y/o aclaramiento
También se han determinado nuevos subgrupos de pacientes que se beneficiarán de tratamientos asociados a antivirales directos frente al VHC con capacidad de negativizar la viremia del VHC de forma aislada o en asociación de otros antivirales de acción directa que no precisan del interferon o ribavirina, previa autorización tras ensayos clínicos en gestantes en el último trimestre de gestación y/o administración a los recién nacidos en las mismas condiciones previas. Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende individuos identificables por el primer o sexto método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 2, 7, 13 ó 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el grupo 2 representa el resto de individuos. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el quinto o décimo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el método de acuerdo con el quinto o décimo método de la invención. Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones. Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el grupo 3 comprende individuos identificables por el séptimo o duodécimo método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 12,5 ó 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el grupo 4 representa el resto de individuos. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el séptimo o duodécimo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el método de acuerdo con el séptimo o duodécimo método de la invención.
Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.
Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende individuos identificables por el noveno o decimocuarto método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 2 ó 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el segundo grupo representa el resto de individuos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el séptimo o duodécimo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el noveno o decimocuarto método de la invención.
Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.
Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende individuos identificables por el undécimo u decimosexto método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 3, 1 ,9, ó 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el segundo grupo representa el resto de individuos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical identificable por el undécimo u decimosexto método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical identificable por undécimo u decimosexto método de la invención.
Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante segundo microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes HLA-DQA01 , KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1 son las secuencias nucleotídicas correspondientes indicadas en la tabla 1.
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante segundo microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 18, SEQ I D NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, SEQ I D NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ I D NO: 44, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del segundo microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del segundo microarray de la invención, para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
Implementación de los métodos de la invención
Una vez obtenida la muestra y determinados los genotipos correspondientes, los métodos o procedimientos para la obtención de datos útiles previamente descritos pueden ejecutarse mediante medios informáticos, por lo que la invención también comprende los siguientes aspectos:
El vigesimosexto aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que, una vez tomada la muestra y determinados los correspondientes genotipos, un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
La invención abarca programas de ordenador que pueden estar en forma de código fuente, de código objeto o en un código intermedio entre código fuente y código objeto, tal como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para usar en la implementación de los procesos de acuerdo con la invención. En particular, los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube que implementen el procedimiento de la invención.
Estos programas pueden estar dispuestos sobre o dentro de un soporte apto para su lectura, en adelante, "medio portador" o "portador". El medio portador puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de portar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, el medio portador puede estar constituido por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, el medio portador podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.
A modo de ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
En este sentido, el vigesimoséptimo aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Finalmente, el vigesimoctavo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Transmisión vertical del VHC
PACIENTES Y METODOS
El estudio se realizó en 98 madres ARN-VHC (+) y sus 120 hijos. De los 24 niños infectados: 16 aclararon el virus y 8 presentaron cronificación. Se determinaron los HLA clasel (A, B, Cw), y clasell (DRB1 , DQA1 , DQB1 , DPA1 , DPB1). El valor de p fue corregido por Bonferroni (Pe). También se determinaron 16 los receptores KIRs de las células NK, 14 genes (KIR2DL1 , 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5, 3DL1 , 3DL2, 3DL3, 2DS1 , 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5 y 3DS1), y 2 psudogenes (KIR2DP1 , 3DP1). Métodos LABType SSO Typing Test y Genotyping PCR kit (One Lambda Inc., Canoga Park, USA), para la tecnología xMAP de Luminex. RESULTADOS
Estudio de la TV: Los niños con KIR2DL3 tienen menor riesgo de infección (OR: 0,07,
P=0,019). La presencia en la madre de Cw*06 (OR: 5,8, P=0,007, Pc=0,07), Cw*0602 (OR:
5,7, P=0,007, Pc=0,08) aumenta el riesgo de infección de su hijo (este caso es únicamente una "tendencia" ya que la Pe no llega a ser menor o igual a 0.05). Por tanto este dato se podría quitar para evitar confusión). Respecto a los ligandos C1 y C2, la presencia de HLA-C1 en las madres y/o en los niños muestran menor riesgo de infección (madres: OR: 0,2, P=0,009, niños: OR: 0,3, P=0,042), mientras que los que tienen el ligando HLA-C2, tienen mayor riesgo de infección (madres: OR: 6,2, P=0,019, niños: 0R:3,3, P=0,042). En el estudio de los fenotipos KIR así como la unión con su ligando, de todas las combinaciones encontradas estadísticamente significativas, hay que resaltar que cuando el KIR está unido al ligando C1 , es protector frente a la TV y si la unión se produce al ligando C2 favorece la TV. En las madres: KIR2DL2/2DL3-C2C2 (OR: 10,7, P=0,045), KIR2DL1-C2 (OR: 6, 1 , P=0,020), KIR2DS4-C2 (OR: 6,2, P=0,019), KIR2DL3-C1 (OR: 0,4, P=0,05). En los niños: KIR2DL2/2DL2 (OR: 14,6, P=0,019), KIR2DL2/2DL3 (OR: 0,4, P=0,049), KIR2DL3/2DL3-C2C2 (OR: 0,2, P=0,009).
Figure imgf000083_0001
- DRB1*04 25 (25) 2(8) 23 (31) 0,2 0,04-0,9 0,040 ns
- DRBT13 35 (35) 13 (54) 22 (29) 2,8 1,1-7,2 0,033 ns
- DQA1*03 24 (24) 2(8) 22 (29) 0,2 0,05-1,0 0,049 ns
Niño (n=99)
- DPB1*02 32 (32) 12 (50) 20 (27) 2,7 1,0-7,0 0,041 ns
KIR Genotyping children, n(%)
KIR2DL3 93 (95) 20 (83) 73 (99) 0,07 0,01-0,6 0,019 —
Tabla 2: Resultados significativos de A elos HLA y Kl para la TV. Corrección por Bonferroni de los HLA. Valores absolutos con porcentajes entre paréntesis. cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p- valor< 0,05
TRANSMISIÓN VERTICAL (solo madres RNA-VHC(+)
No
KIR/LIGANDS Total Infectados p- infectados cOR Cl
MADRES (n=98) (n=24) valor
(n=74)
- HLA-C1 75 (78) 14 (58) 61 (85) 0,2 0,09-0,7 0,009
- HLA-C2 68 (71) 22 (92) 46 (64) 6,2 1,4-28,6 0,019
- HLA-Cw
- HLA-C1C1 28 (29) 2(8) 26 (36) 0,2 0,04-0,7 0,019
- HLA-C1C2 47 (49) 12 (50) 35 (49) — — ns
- HLA-C2C2 21 (22) 10 (42) 11 (15) 3,9 1,4-11,1 0,009
-2DL2/2DL2-C1C1 2(2) 0(0) 2(3) — — ns
-2DL2/2DL2-C1C2 6(6) 1 (14) 5(7) — — ns
-2DL2/2DL2-C2C2 1 O) 1 (4) 0(0) — — ns
-2DL2/2DL3-C1C1 11 (12) 1 (4) 10 (14) — — ns
-2DL2/2DL3-C1C2 29 (31) 9 (39) 20 (28) — — ns
-2DL2/2DL3-C2C2 4(4) 3 (13) 1 O) 10,7 1,1-108 0,045
-2DL3/2DL3-C1C1 15 (16) 1 (4) 14 (19) — — ns
-2DL3/2DL3-C1C2 11 (12) 1 (4) 10 (14) — — ns
-2DL3/2DL3-C2C2 16 (17) 6 (26) 10 (14) — — ns
-2DL1-C2 67 (71) 22 (92) 45 (64) 6,1 1,3-28,1 0,020
-2DL2-C1 48 (51) 11 (48) 37 (51) — — ns
-2DL3-C1 67 (70) 13 (54) 54 (75) 0,4 0,1-1,0 0,050
Figure imgf000085_0001
con porcentajes entre paréntesis, cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p-valor< 0,05 MULTIVARIANTE FINAL TV:
Figure imgf000086_0001
Tabla 4. Modelo final de multivariante: Las variables introducidas en el estudio han sido: CV madre en el parto, Genotipo viral, tipo de parto, lactancia y ligando HLA-C1 y C2 de la madre. aOR: Relación de probabilidad ajustada (Adjusted Odds Ratio). Cl: Intervalo de confianza. Grupo de referencia: ligandos HLA, no presencia; CV<600.000 lU/mL, genotipo no-1. La aOR es la probabilidad de que exista TV en presencia del alelo con respecto a la no presencia. P- valor≤0.05.
Se puede concluir que los estudios de factores genéticos de madres y recién nacidos son necesarios para entender los procesos mediante los cuales se producen la TV y las posibilidades de infección crónica en el RN. Es posible afirmar que los ligandos HLA tipo C1 están relacionados con la protección frente a la infección por el virus y los de tipo C2 estarían a favor de la transmisión vertical. Observamos el mismo efecto cuando estos ligandos se unen a los receptores KIR.
Cronificación y aclaramiento del VHC
PACIENTES Y METODOS El estudio se realizó en 98 madres ARN-VHC (+) y sus 120 hijos. De los 24 niños infectados: 16 aclararon el virus y 8 presentaron cronificación. Se determinaron los HLA clasel (A, B, Cw), clasell (DRB1 , DQA1 , DQB1 , DPA1 , DPB1). El valor de p corregido por Bonferroni (Pe) y 16 receptores KIRs de las células NK (KIR2DL1 , 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5, 3DL1 , 3DL2, 3DL3, 2DS1 , 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5 y 3DS1). Métodos LABType SSO Typing Test y Genotyping PCR kit (One Lambda Inc., Canoga Park, USA), para la tecnología xMAP de Luminex.
RESULTADOS Cronificación: La presencia en la madre de DQA1*01 (RR: 2,1 , P=0,009, Pc=0,036), KIR2DS1 (OR: 7,2, P=0,042), KIR3DS1 (OR: 13, P=0,013) favorece la cronificación de la infección en el niño. La presencia en el niño del alelo DQB1*03 (OR:0,05, P=0,012, Pc=0,048) y del KIR2DS3 (RR:0,5, P=0,013) se relaciona con el aclaramiento viral, así como la homocigosis del KIR3DL1/3DL1 (OR:0,08, P=0,0013) y del ligando HLA-Bw4/Bw4 (OR:0,06, P=0,022), mientras que la unión del KIR3DS1-Bw4 (OR=7,2, P=0,042), KIR2DS1-C2 (OR=7,2, P=0,042) así como la heterocigosis del KIR3DL1/3DS1 (OR: 13, P=0.013), favorecen la cronificación del virus. Concordancia alélica madre/hijo: Al realizar el análisis conjunto de todos los HLA, fue mayor entre los niños con infección crónica que en aquellos que habían aclarado el virus (74% ± 3.8 vs 60% ± 1 ,4, P=0,008). También existe relación con la cronificación cuando agrupamos los alelos en clase I (63% ± 2.7 vs 53% ± 1 ,7, P=0,009) y en clase II (81 % ± 5.8 vs 65% ± 2.6, P=0,024), Cuando analizamos por alelos de forma individual existen diferencias significativas en el HLA-DRB1 (81 % ± 9.1 vs. 56% ± 4.2, P=0,013), y en el HLA-DQA1 (81 % ± 9.1 vs. 59% ± 5.0, P=0,036).
CRONIFICACIÓN
Todos Crónico Aclaramiento
HLA/KIR (n=24) cOR Cl p- Pe
(n=8) (n=16) valor
Tipaje genómico de alta resolución
de HLA
Madre, n(%)
DQA1*0101 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
DQB1*0604 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
Hijo, n(%)
B*0801 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
DRB1*0301 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
DQA1*0501 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
DQB1*0201 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
Tipaje genómicc > de baja
resolución de H _A
Madre, n(%)
DRB1*13 13 (54) 7 (88) 6 (38) 1 1 ,7 1 , 1-1 19,5 0,039 ns
DQA1*01 15 (63) 8 (100) 7 (44) 2, 1 n/a 0,009 0,036
DQB1*06 13 (54) 7 (88) 6 (38) 1 1 ,7 1 , 1-1 19,5 0,039 ns
Hijo, n(%)
B*08 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
DRB1*03 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns
DRB1*04 6 (25) 0 (0) 6 (38) 0,6 n/a 0,06 ns
DQA1*03 6 (25) 0 (0) 6 (38) 0,6 n/a 0,06 ns
DQB1*03 13 (54) 1 (13) 12 (75) 0,05 0,004-0,5 0,012 0,048
Genotipado KIR
Madre, n(%)
KIR2DS1 8 (33) 5 (63) 3 (18) 7.2 1.1-48.5 0,042 — KIR3DS1 9 (38) 6 (75) 3 (19) 13.0 1.7-99.4 0,013 —
Hijo, n(%)
KIR2DS3 7 (29) 0 (0) 7 (44) 0.5** n/a 0,054 —
Tabla 5. Alelos HLA y Kl R "solos" relacionados con la cronificacion de la enfermedad.
Valores absolutos con porcentajes entre paréntesis. cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p-valor< 0,05
Figure imgf000088_0001
Tabla 6. Ligandos HLA-Bw y su unión a los receptores KIR "relacionados con la cronificacion de la enfermedad.Valores absolutos con porcentajes entre paréntesis. cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p-valor< 0,05
CRONIFICACION
% Concordancia Crónico
Aclaramiento(n=16) p-valor
alélica madre/hijo (n=8)
Tipaje genómico de baja resolución de HLA
TODOS LOS HLA 74 ± 3,8 60 ± 1 ,4 0,008
HLA CLASE 1 63 ± 2,7 53 ± 1 ,7 0,009
HLA CLASE II 81 ± 5,8 65 ± 2,6 0,024
HLA-A 56 ± 6,3 50 ± 0,0 ns
HLA-B 63 ± 8,2 56 ± 4,2 ns
HLA-Cw 69 ± 9, 1 53 ± 3, 1 0,058
HLA-DRB1 81 ± 9, 1 56 ± 4,2 0,013
HLA-DQA1 81 ± 9, 1 59 ± 5,0 0,036
HLA-DQB1 69 ± 9, 1 59 ± 5,0 ns
HLA-DPA1 100 ± 0,0 84 ± 5,9 0,082
HLA-DPB1 75 ± 9,4 67 ± 6,3 ns
KIR 84 ± 4,0 85 ± 3,5 ns
Tabla 7. Porcentajes de las concordancias alélicas madre/hijo para la cronificación
Se ha realizado el análisis mediante curvas de rendimiento diagnóstico (ROC) para estas concordancias alélicas obteniendo los siguientes resultados (ver figura 1).
En la figura 1 se observan las siguientes áreas bajo la curva: 1.- Porcentaje HLA-Todos: 0,828
2. - Porcentaje HLA-clase I: 0,781
3. - Porcentaje HLA-clase II: 0,781
Si se considera la concordancia alélica como un test diagnóstico para la cronificación del VHC en el niño, se puede decir que la determinación de la misma teniendo en cuenta Todos los HLA es una buena prueba diagnóstica, según los datos, ya que realizando la curva ROC, se obtiene un área bajo la curva de 0,828. El mejor punto de corte es 65,6% que corresponde a la concordancia alélica. La sensibilidad obtenida es del 75% y la especificidad del 87%. VPP=74% y VPN=87%.
Por tanto para el total de Todos los HLA, podemos decir que para el 100% de niños infectados, cuya concordancia alélica con su madre sea mayor al 65,6%, el 74% de ellos va a cronificar la enfermedad.
Para los HLA clase I, del 100% de niños infectados cuya concordancia alélica con su madre sea mayor al 58.4%, el 65% de ellos va a cronificar la enfermedad.
En el caso de los HLA clase II, del 100% de niños infectados cuya concordancia alélica con su madre sea mayor al 75%, el 62% de ellos va a cronificar la enfermedad.
El mejor test en este caso sería por tanto el que engloba al total de alelos HLA. % Concordancia alélica madre/hijo para la cronificación
Area bajo Punto de
Test diagnostico Sensibilidad Especificidad VPP VPN la curva corte
Todos los HLA 0,828 65,60% 75% 87% 74% 87%
HLA clase 1 0,78 58,40% 75% 81 % 65% 87%
HLA clase II 0,78 75% 62,50% 81 % 62% 82%
Tabla 8. Tabla de datos procedentes de las curvas ROC Para el estudio de test diagnóstico de alelos individuales, debido a que el hijo puede tener únicamente un 50% de concordancia con la madre o un 100%, se considera un test positivo cuando la concordancia es del 100% y un test negativo cuando es del 50%. En este caso no podemos realizar curvas ROC porque tenemos dos variables cualitativas debido a que solo podemos tener dos situaciones: 100% o 50% de concordancia (puesto que cada individuo solo tenemos dos alelos de cada tipo). Hemos considerado una condordancia del 100% para un test positivo y una concordancia del 50% para un test negativo. La sensibilidad y la especificidad se calcularán a partir de las tablas de contingencia.
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Tabla 9. Test diagnóstico para alelos individuales significativos
Por tanto (tabla 9) para el HLA-DRB1 , del 100% de niños infectados, cuya concordancia alélica con su madre sea del 100%, el 71 % va a cronificar la enfermedad Para el HLA-DQA1 , del 100% de niños infectados, cuya concordancia alélica con su madre sea del 100%, el 62% va a cronificar la enfermedad
Por tanto, los estudios de factores genéticos de madres y recién nacidos son necesarios para entender los procesos mediante los cuales se producen la TV y las posibilidades de infección crónica en el RN. Los ligandos HLA-Bw estarán relacionados con la cronificación del virus de la hepatitis C en niños. Además se puede afirmar que el porcentaje de concordancia alélica entre madre/hijo es vital para conocer la evolución de la enfermedad en el niño, mientras que este factor no tiene ninguna relación con la transmisión vertical del virus.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre portadora del virus de la hepatitis C (ARN-VHC (+)) transmita verticalmente el virus a su descendencia, o de que un individuo cuya madre es portadora del virus de la hepatitis C sea infectado, o, herede y/o cronifique y/o aclare, en caso de que sea contagiado, el virus de la hepatitis C, que comprende a) obtener una muestra biológica aislada de la madre, y b) determinar el genotipo de los genes HLA y KIR en la muestra aislada del paso (a)
2. - El método según la reivindicación 1 para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre gestante ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia, caracterizado porque en el paso b) se determina el genotipo de los genes HLA-C y KIR en la muestra aislada en el paso (a).
3. - El método según la reivindicación anterior, donde en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, y KIR2DS4.
4.- Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, y además comprende: c1) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 5 veces mayor, y preferiblemente 6 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2, en comparación con una madre que no lo presente.
5. - Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos según reivindicaciones 2 a 4 y además comprende: c2) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,9 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA- C2C2), en comparación con una madre que no lo presente.
6. - Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos según reivindicaciones 2 a 5 y además comprende: c3) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad de al menos 9 veces mayor, y preferiblemente 10,7 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA- C2C2) en combinación con el genotipo KIR2DL2 y KIR2DL3, en comparación con una madre que no presente dichos genotipos.
7.- Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos según reivindicaciones 2 a 5 y además comprende: c4) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 5 veces mayor, y preferiblemente 6 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DL1, o el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente;
8.- Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos según reivindicaciones 2 a 7 y además comprende: c5) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 4 veces mayor, y preferiblemente 5 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 o HLA-C1 en homocigosis (HLA-C1 C1), en comparación con una madre que no lo presente.
9. - Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos según reivindicaciones 2 a 8 y además comprende: c6) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 2,5 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente;
10. - Un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, que comprende los pasos según reivindicaciones 2 a 9 y además comprende: c7) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente.
1 1. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
12.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4.
13. - Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y
22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 8 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ I D NO: 14 (KIR2DS4).
14. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
15. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
16. - Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 12 a 15, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.
17. - Un método según reivindicación 1 para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN- VHC (+), que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR en la muestra aislada del paso (a).
18.- El método según la reivindicación anterior, donde en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DL2, KIR2DL3, y KIR2DS3
19. - Un método para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), que comprende los pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en comparación con un individuo que no lo presente;
20. - El método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN- VHC (+), que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 y además comprende: c2) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 4 veces mayor, preferiblemente 4,2 veces mayor de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL2 (KIR2DL2/2DL2), en comparación con un individuo que no lo presente.
21.- El método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN- VHC (+), que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 y además comprende: c3) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 13 veces mayor, y preferiblemente 14 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL3 (KIR2DL3/2DL3), en comparación con un individuo que no lo presente.
22.- El método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN- VHC (+), que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 y además comprende: c4) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 13 veces mayor, y preferiblemente 14,3 veces mayor, de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo KIR2DS3, en comparación con un individuo que no lo presente.
23.- El método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN- VHC (+), que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 y además comprende: c5) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA- C1 , en comparación con un individuo que no lo presente.
24. - El método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN- VHC (+), que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23 y además comprende: c6) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 4 veces mayor, y preferiblemente 5 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con un individuo que no lo presente.
25. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, donde la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre.
26. - Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo HLA-C y, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3.
27.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KI R2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), y/o SEQ I D NO: 15 (KIR2DS3);
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
28. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 26 o 27, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
29. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
30. - Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 26 a 29, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.
31. - Método según reivindicación 1 para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, caracterizado porque en el paso b) determina el genotipo de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).
32.- El método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, donde en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1.
33.- Un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32, y además comprende: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLADQA-01 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
34.- Un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, y además comprende: c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR2DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 6 veces mayor, y preferiblemente 7 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
35. - Un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, y además comprende: c3) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
36. - Un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, y además comprende: c4) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en combinación con KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
37. - Un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, y además comprende: c5) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw6, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 14 veces mayor, y preferiblemente 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
38.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 37, donde la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
39.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1.
40.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
41. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 39 o 40, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
42. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 , que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
43.- Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 39 a 42, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
44.- Método de obtención de datos útiles según la reivindicación 1 , para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical caracterizado porque en el paso b) determina el genotipo de los genes HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).
45.- El método de obtención de datos útiles, según reivindicación 1 , para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, donde en el paso (b) se determina el genotipo del gen KIR3DL1.
46. - Un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 44 o 45, y además comprende: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en homocigosis, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 12,5 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
47. - El método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, y además comprende: c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw4 en homocigosis (HLA-Bw4-Bw4), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 16 veces mayor, y preferiblemente 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.
48. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
49. - Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1.
50. - Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1, y donde: - los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).
51. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 49 o 50, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
52. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51 , que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
53. - Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 49 a 52, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
54. - El método de obtención de datos útiles según la reivindicación 1 , para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQ y KIR en la muestra aislada del paso (a).
55.- El método de obtención de datos útiles según la reivindicación 1 , para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, donde en el paso (b) se determina el genotipo del gen KIR2DS3.
56.- Un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 54 a 55, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a) si presenta el genotipo HLA-DQ*03, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 18 veces mayor, y preferiblemente 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente.
57.- El método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 54 a 56. c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta el genotipo KIR2DS3, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente.
58. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 54 a 57, donde la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre.
59. - Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3.
60. - Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3). - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).
61.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 59 o 60, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
62.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 59-61 , que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
63.- Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 59-62, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
64.- El método de obtención de datos útiles según la reivindicación 1 , para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo y otra muestra biológica aislada de su madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1 en las muestras aisladas del paso (a).
65.- Un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos (a) y (b) según la reivindicación anterior, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 60% de corcondancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA- DPA 1 y HLA-DPB1, y preferiblemente al menos un 65,60% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 3 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre.
66.- El método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según reivindicaciones64 o 65 y además comprende: c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 50% de corcondancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C, y preferiblemente al menos un 58,40% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 , 1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,9 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre.
67.- El método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, que comprende los pasos según reivindicaciones 64 o 65 y además comprende: c3) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 70% de corcondancia alélica en los genes HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, y preferiblemente al menos un 75% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 , 1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre.
68.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 64 a 67, donde la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre y la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.
69.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y/o HLA-DPB1.
70.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y/o HLA-DPB1, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA- DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1).
71.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 69 o 70, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
72.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 69-71 , que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
73.- Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 69-72, para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.
PCT/ES2016/070115 2015-02-23 2016-02-23 Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical, la cronificación y/o el aclaramiento del virus de la hepatitis c Ceased WO2016135363A1 (es)

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