WO2016121862A1 - 抗炎症剤及びその使用 - Google Patents

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茂弘 大戸
直哉 松永
彰夫 王子田
直哉 進藤
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-inflammatory agent and use thereof. More specifically, the present invention relates to anti-inflammatory agents, screening methods for anti-inflammatory agents, and novel compounds.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2015-14829 filed in Japan on January 28, 2015 and Japanese Patent Application No. 2015-176745 filed in Japan on September 8, 2015. Is incorporated herein by reference.
  • Inflammation is one of the symptoms observed in various diseases.
  • Examples of inflammation-related diseases include cancer.
  • Cancer is one of intractable diseases accompanied by inflammation. Cancer is the number one cause of death in Japan, and the number of deaths from cancer is increasing every year in the world.
  • liver cancer hepatocellular carcinoma
  • liver cancer hepatocellular carcinoma
  • the cause of liver cancer accounts for nearly 90% due to viral infection, and it develops after long-term chronic hepatitis such as hepatitis and cirrhosis starting after viral infection (see Non-Patent Document 1, for example).
  • chronic inflammation is known to promote the expression of cancer cells due to cellular gene mutations.
  • the cause of the development of liver cancer has not yet been clarified as to whether it is due to the virus itself or chronic inflammation (see, for example, Non-Patent Documents 2 and 3).
  • liver cancer a standard therapy for liver cancer has not been established because it is easy to show resistance to anticancer agents. Therefore, there is a demand for the establishment of innovative diagnostic agents and new treatment / prevention strategies for chronic hepatitis and liver cancer.
  • biological clocks are constituted by a feedback loop mechanism of transcription / translation by a series of genes called clock genes.
  • Various biological functions, sleep / wakefulness, body temperature, hormone secretion, metabolism, etc. are observed to have a fluctuation of about 24 hours (daily rhythm), and these are known to be regulated by the body clock mechanism.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 Regarding cancer, it has been pointed out that carcinogenesis, the nature of cancer cells, and the sensitivity to anticancer agents are influenced by the biological clock mechanism (for example, see Non-Patent Document 6).
  • Bosch FX et al.
  • Primary liver cancer worldwide incidence and trends., Gastroenterology, 127, S5-S16, 2004.
  • Portolani N et al., Early and late recurrence after liver resection for hepatocellular carcinoma: prognostic and therapeutic implications., Ann. Surg., 243, 229-235, 2006.
  • Freeman AJ et al., Estimating progression to cirrhosis in chronic hepatitis C virus infection., Hepatology, 134, 809-816, 2001.
  • Filipski E et al., Effects of light and food schedules on liver and tumor molecular clocks in mice., J. Nat. Cancer Inst., 97, 507-517, 2005.
  • the present invention aims to clarify whether or not a circadian clock mechanism is involved in inflammation and to provide a new anti-inflammatory agent.
  • the present invention includes the following aspects.
  • G0S2 inhibitor is a siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme or antisense nucleic acid against the G0S2 gene or the Hydroxysteroid (17- ⁇ ) Dehydrogenase 4 (Hsd17b4) gene.
  • the G0S2 inhibitor is a specific binding substance for G0S2 protein or Hsd17b4 protein.
  • R 1 represents a single bond or an alkylene group having a carbon number of 1 ⁇ 3
  • R 2 is (Wherein R 5 represents a halogenated alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 0 to 5)
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms
  • R 4 Represents a hydrogen atom or a carboxylate group.
  • n is an integer of 2 or more, a plurality of R 5 may be the same as or different from each other.
  • [5] The anti-inflammatory agent according to [4], wherein the G0S2 inhibitor has a binding ability to Hsd17b4.
  • [6] The anti-inflammatory agent according to any one of [1] to [5], which exhibits an analgesic action.
  • [7] A step of measuring the expression level of the G0S2 gene in the cell in the presence of the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the G0S2 gene in the cell in the absence of the test substance. And a step of determining that the test substance is an anti-inflammatory agent when the test substance has been reduced.
  • R 6 represents a single bond or an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 7 represents (Wherein R 10 represents a halogenated alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, m represents an integer of 0 to 5), R 8 represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and R 9 Represents a hydrogen atom or a carboxylate group.
  • R 8 is a hexyl group
  • m is an integer of 1 to 5
  • m is an integer of 2 or more
  • a plurality of R 10 may be the same or different from each other.
  • a new anti-inflammatory agent can be provided.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the process in which liver cancer develops.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding activity of NF- ⁇ B to NF- ⁇ B response element (NRE) in the liver of mice exposed to diethylnitrosamine (DEN) administered with siRNA against G0S2 or control siRNA in Experimental Example 3.
  • “*” indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • 4 is a pathological micrograph of the liver of a mouse in a control siRNA administration group (shown as “control siRNA” in the figure) in Experimental Example 3.
  • 6 is a photograph of a liver extracted from a mouse in a control siRNA administration group in Experimental Example 3.
  • FIG. 4 is a pathological micrograph of the liver of a mouse in a G0S2 siRNA administration group (shown as “G0S2 siRNA” in the figure) in Experimental Example 3.
  • 6 is a photograph of a liver extracted from a mouse in a G0S2 siRNA administration group in Experimental Example 3.
  • it is a graph which shows the measurement result of the expression level of mRNA of Ccl2 in the liver of the mouse
  • 10 is a graph showing the results of primary screening of a compound library in Experimental Example 5.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • compound no. 1 is a graph showing luciferase activity with respect to a concentration of 1.
  • compound no. 1 is a graph showing luciferase activity with respect to a concentration of 1.
  • compound no. 2 is a graph which shows the luciferase activity with respect to the density
  • “#” Indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5% as a result of the Scheffe test in comparison with the LPS administration group.
  • the control group 0.05% DMSO-saline
  • compound No. A significant difference was observed between the two administration groups.
  • “*” Indicates a result of Scheffe test with a risk rate of less than 5% and a control group (0.05% DMSO-saline) and Compound No.
  • compound no. 2 is a graph showing the survival rate (relative value) of NIH3T3 cells 24 hours after exposure to 2 and its derivative (10 ⁇ M).
  • compound no. 2 is a graph showing the results of comparing the IC 50 of 2 with the compound of Example 2 (NS-3-011) which is a derivative thereof.
  • 0.5 to 5 ⁇ M of Compound No. 2 is a graph showing the expression level of G0S2 mRNA in Hepa1-6 cells 48 hours after exposure to the compound of Example 2 (NS-3-011), which is a derivative of No.
  • “*” Indicates compound No. by Bonferroni-Dan test. As a result of comparison with the results of the same dose administration group of 2, it shows that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • “**” indicates compound No. by Bonferroni Dunn test. As a result of comparison with the results of the same dose administration group of 2, it shows that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1% as a result of comparison with the results of the DMSO administration group by the Scheffe test.
  • “**” indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%.
  • Example 17 it is a graph which shows the expression level of mRNA of Ccl2 in the liver of the hepatitis model mouse
  • Experimental example 19 it is a graph which shows the expression level of mRNA of Ccl2 in the liver of a control mouse
  • “*” indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • 6 is a graph showing the blood drug concentration of the compound of Example 1 in Experimental Example 19.
  • Experimental example 19 it is a graph which shows the expression level of the mRNA of (alpha) SMA in the liver of a control mouse
  • “*” indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • it is a graph which shows the expression level of the collagen type I alpha2 (Col1 alpha2) mRNA in the liver of a control mouse and the NASH model mouse which administered the compound of Example 1.
  • Experimental Example 21 it is a graph which shows the blood drug concentration of the compound of Example 1.
  • Experimental example 22 it is a graph which shows the influence of the compound of Example 10 on the serum ALT activity of the mouse hepatitis liver cancer onset model by DEN. The results after 8 weeks from the start of DEN drinking water are shown.
  • Experimental Example 25 a cell in which an expression vector in which a cDNA for luciferase was linked downstream of the transcriptional activity regulatory region of G0S2 was stably expressed was used.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • Compound No. It is a graph which shows the result of having measured the drug concentration in the blood of the mouse
  • Compound No. It is a graph which shows the result of having measured the drug concentration in the liver of the mouse
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a process in which liver cancer develops as an example of an inflammation-related disease.
  • liver cancers develop after long-term chronic hepatitis such as hepatitis and cirrhosis.
  • the influence of G0S2 and the inflammatory signal in the process shown in FIG. 1 has been clarified by the inventors this time, and details will be described later.
  • This experimental model is a useful experimental system for elucidating the mechanism of liver cancer development in humans.
  • the inventors analyzed the mechanism of hepatitis liver cancer onset by focusing on the molecular clock mechanism using the mouse hepatitis liver cancer onset model by DEN.
  • G0S2 G0 / G1 switch gene 2
  • G0S2 G0 / G1 switch gene 2
  • the present invention provides an anti-inflammatory agent comprising a G0 / G1 Switch 2 (G0S2) inhibitor as an active ingredient.
  • G0S2 inhibitor examples include compounds that suppress the transcription of G0S2, substances that inhibit the activity of G0S2, and the like.
  • inflammation-related diseases to be treated or prevented by the anti-inflammatory agent of this embodiment include hepatitis, enterocolitis, colitis (IBD), liver cancer, rheumatism, asthma, atherosclerosis, and multiple sclerosis. And Helicobacter pylori-related gastritis.
  • the anti-inflammatory agent of this embodiment may be siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme or antisense nucleic acid against the G0S2 gene (inhibiting G0S2 expression).
  • Hsd17b4 Hydroxysteroid (17- ⁇ ) Dehydrogenase 4
  • the substance that inhibits the expression of the Hsd17b4 gene is a G0S2 inhibitor. That is, a substance that inhibits the expression of the Hsd17b4 gene can be used as an anti-inflammatory agent.
  • the anti-inflammatory agent of this embodiment may be siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme or antisense nucleic acid against the Hsd17b4 gene.
  • SiRNA small interfering RNA
  • miRNA miRNA
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • sense strand and antisense strand oligonucleotides are respectively synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer and denatured in an appropriate annealing buffer at 90 to 95 ° C. for about 1 minute, and then 30 to 30 It can be prepared by annealing at 70 ° C. for about 1-8 hours.
  • ShRNA short hairpin RNA
  • shRNA is a hairpin RNA sequence used for gene silencing by RNA interference.
  • shRNA may be introduced into cells by a vector and expressed by U6 promoter or H1 promoter, or an oligonucleotide having shRNA sequence may be synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer and self-annealed in the same manner as siRNA. May also be prepared.
  • the shRNA hairpin structure introduced into the cell is cleaved into siRNA and binds to the RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to siRNA. This suppresses gene expression in a sequence-specific manner.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • MiRNA is RNA having a length of about 20 to 25 bases existing in cells, and is a kind of ncRNA (non-coding RNA) that is considered to have a function of regulating the expression of other genes. In recent years, it has become possible to knock down a target gene using an artificial miRNA.
  • Artificial miRNA may be expressed in mammalian cells from an expression vector using the Pol2 promoter.
  • the miRNA introduced into the cell binds to the RNA-induced silencing complex (RISC).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • This complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to miRNA. This suppresses gene expression in a sequence-specific manner.
  • Ribozyme is RNA having catalytic activity. Although some ribozymes have various activities, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for the purpose of site-specific cleavage of RNA.
  • the ribozyme may be a group I intron type, a size of 400 nucleotides or more such as M1 RNA contained in RNaseP, or may be about 40 nucleotides called a hammerhead type, a hairpin type, or the like.
  • An antisense nucleic acid is a nucleic acid complementary to a target sequence.
  • Antisense nucleic acid inhibits transcription initiation by triplex formation, suppresses transcription by hybridization with a site where an open loop structure is locally formed by RNA polymerase, inhibits transcription by hybridization with RNA that is being synthesized, Inhibition of splicing by hybridization at the junction of intron and exon, suppression of splicing by hybridization with spliceosome formation site, suppression of transition from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA, capping site and poly (A) addition site Suppression of splicing by hybridization with a protein, suppression of translation initiation by hybridization with a translation initiation factor binding site, suppression of translation by hybridization with a ribosome binding site near the initiation codon, translation region of mRNA and polysome binding site Hybridization outgrowth inhibitory peptide chain by the, by gene silencing due hybridization interaction site between a nucleic acid and a
  • siRNA, shRNA, ribozyme and antisense nucleic acid may contain various chemical modifications in order to improve stability and activity.
  • the phosphate residue may be substituted with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, and the like.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate phosphorodithionate
  • you may comprise at least one part with nucleic acid analogs, such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the anti-inflammatory agent of this embodiment may be a specific binding substance for G0S2 protein or Hsd17b4 protein.
  • the specific binding substance exhibits an anti-inflammatory effect by specifically binding to the G0S2 protein or the Hsd17b4 protein and inhibiting their function.
  • Examples of specific binding substances include antibodies, antibody fragments, aptamers, and low molecular compounds.
  • An antibody can be produced, for example, by immunizing an animal such as a mouse with an antigen. Alternatively, it can be prepared by screening an antibody library such as a phage library.
  • Antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like.
  • the above antibody or antibody fragment may be polyclonal or monoclonal.
  • the above antibody or antibody fragment may be one to which a compound such as polyethylene glycol is bound. By binding polyethylene glycol, for example, blood stability can be increased.
  • An aptamer is a substance having a specific binding ability to a labeling substance.
  • examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • Nucleic acid aptamers having specific binding ability to G0S2 protein or Hsd17b4 protein can be selected by, for example, systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • Peptide aptamers having specific binding ability to G0S2 protein or Hsd17b4 protein can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • the specific binding substance may be, for example, one that is screened from a compound library or the like using the binding property to the target substance as an index.
  • the onset of hepatitis and liver cancer can be suppressed by administering siRNA against G0S2 to mice of the mouse hepatitis liver cancer onset model by DEN. Therefore, it can also be said that the anti-inflammatory agent of this embodiment is a therapeutic or prophylactic agent for hepatitis or liver cancer.
  • the anti-inflammatory agent of this embodiment may be a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • R 1 represents a single bond or an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 represents (Wherein R 5 represents a halogenated alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 0 to 5), R 3 represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and R 4 Represents a hydrogen atom or a carboxylate group.
  • n is an integer of 2 or more, a plurality of R 5 may be the same as or different from each other.
  • the compound represented by the formula (1) may be a free form, a pharmaceutically acceptable salt, or a free form solvate. It may be a solvate of a pharmaceutically acceptable salt.
  • Examples of pharmaceutically acceptable salts include metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts, and the like. More specifically, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, hydrobromide, nitrate, phosphate, hydroiodide; acetate, mesylate, succinate, maleic acid Salt, fumarate, citrate, tartrate, benzoate, methanesulfonate, 2-hydroxyethanesulfonate, p-toluenesulfonate, trifluoroacetate, propanoate, oxalate, Organic acid salts such as malonate, glutarate, adipate, malate and mandelate; alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; aluminum Metal salts such as salts and zinc salts; ammonium salts such as ammonium salts and tetramethylammonium salts
  • the solvate is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable solvate, and examples thereof include hydrates and organic solvates.
  • the compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof may have a binding ability to Hsd17b4 (Peroxisomal multifunctional enzyme type 2).
  • Hsd17b4 is a protein known to exist in peroxisomes, and is an enzyme having an activity such as ⁇ -oxidation of fatty acids.
  • the Uniprot accession number of human Hsd17b4 is P51659 and the Uniprot accession number of mouse Hsd17b4 is P51660.
  • the anti-inflammatory agent of the present embodiment exhibits an analgesic action. Therefore, it can be said that the anti-inflammatory agent of this embodiment is an analgesic.
  • the anti-inflammatory agent of this embodiment may be administered per se, or may be administered as a pharmaceutical composition mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into an orally used dosage form such as a tablet, capsule, elixir, or microcapsule, for example, parenterally such as an injection, ointment, or patch. It may be formulated into a dosage form to be used.
  • the pharmaceutically acceptable carrier examples include solvents such as sterilized water and physiological saline; binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose; corn starch, gelatin, alginic acid and the like And the like.
  • the pharmaceutical composition may contain an additive.
  • Additives include lubricants such as magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose and saccharin; flavoring agents such as peppermint and red oil; stabilizers for benzyl alcohol and phenol; buffers such as phosphate and sodium acetate Agents; solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives; surfactants;
  • the pharmaceutical composition can be formulated by appropriately combining the above carriers and additives and mixing them in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice.
  • examples of the solvent for injection include isotonic solutions containing adjuvants such as physiological saline, glucose, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride. It is done. Solvents for injections may contain alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as polysorbate 80 (trademark) and HCO-50.
  • Administration of anti-inflammatory agents to patients is known to those skilled in the art, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally or orally. It can be done by a method.
  • the dose of the anti-inflammatory agent varies depending on the patient's symptoms and the like, but in the case of oral administration, for example, 5 to 20 mg / kg per day can be mentioned.
  • the dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method.
  • 10 to 25 mg / kg is administered once a day. To do. If the dose exceeds the above range, liver damage may occur.
  • the lethal dose in the case of intravenous injection is about 25 mg / kg.
  • the present invention comprises a step of measuring the expression level of a G0S2 gene in a cell in the presence of a test substance, and the expression level is a G0S2 gene in the cell in the absence of the test substance. And a step of determining that the test substance is an anti-inflammatory agent when the expression level is lower than the expression level of the anti-inflammatory agent.
  • anti-inflammatory agents can be screened by the screening method of the present embodiment.
  • test substance for example, a compound library can be used.
  • the test substance may be added to the cell culture medium, for example.
  • the method for measuring the expression level of the G0S2 gene is not particularly limited, and may be performed by, for example, real-time PCR, or may be performed at the protein level by, for example, Western blotting, ELISA, or the like.
  • test substance In the presence of the test substance, if the expression level of the G0S2 gene is reduced compared to the control (in the absence of the test substance), the test substance is an anti-inflammatory agent. Can be determined.
  • the present invention includes a step of measuring the activity of Hsd17b4 protein in the presence of a test substance, and the activity is decreased as compared to the activity of Hsd17b4 protein in the absence of the test substance.
  • a method for screening the anti-inflammatory agent comprising the step of determining that the test substance is an anti-inflammatory agent.
  • the test substance that decreases the activity of the Hsd17b4 protein is an inhibitor of G0S2. That is, it can be said that the test substance that decreases the activity of the Hsd17b4 protein is an anti-inflammatory agent.
  • the screening method of the present embodiment may be performed at the cell level, or may be performed in a test tube using purified Hsd17b4 protein.
  • the test substance the same substances as described above can be used.
  • the activity of the Hsd17b4 protein includes the activity of ⁇ -oxidizing fatty acids.
  • the activity of the Hsd17b4 protein can be measured, for example, by measuring the metabolic amount of 2-methyl-branched-chain fatty acids, bile acid intermediates, or very long chain fatty acids.
  • the inventors have clarified from the results of computer analysis that the activity of Hsd17b4 decreases as a result of binding of a compound such as NS-3-011 to the enzyme active site of Hsd17b4.
  • compounds other than NS-3-011 can also bind to Hsd17b4.
  • the present invention provides siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, or a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof:
  • the present invention provides a method for treating or preventing an inflammation-related disease, comprising a step of administering to a patient or patient in need of treatment.
  • R 1 represents a single bond or an alkylene group having a carbon number of 1 ⁇ 3
  • R 2 is (Wherein R 5 represents a halogenated alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 0 to 5), R 3 represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and R 4 Represents a hydrogen atom or a carboxylate group.
  • n is an integer of 2 or more, a plurality of R 5 may be the same as or different from each other.
  • the present invention provides siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, or a compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, against G0S2.
  • a method for treating or preventing pain comprising a step of administering to a patient or patient in need of treatment.
  • the present invention provides siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, or a compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, against G0S2.
  • the present invention provides a method for treating or preventing hepatitis or liver cancer, which comprises a step of administering to a patient or patient in need of treatment.
  • the present invention is represented by siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, or the above-mentioned formula (1) for G0S2 for the treatment or prevention of inflammation-related diseases or the treatment or prevention of pain. And a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the present invention relates to siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, or the above formula for G0S2 for the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for inflammation-related diseases, or a therapeutic or prophylactic agent for pain.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof is provided.
  • R 6 represents a single bond or an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 7 represents
  • R 10 represents a halogenated alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • m represents an integer of 0 to 5.
  • R 8 represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms
  • R 9 represents a hydrogen atom or a carboxylic acid ester group.
  • the compound represented by the formula (2) may be a free form, a pharmaceutically acceptable salt, or a free form, like the compound represented by the formula (1). It may be a solvate or a pharmaceutically acceptable salt solvate.
  • the pharmaceutically acceptable salts and solvates are the same as those described above.
  • the compound of the present embodiment exhibits a significantly higher G0S2 expression inhibitory effect than the compound represented by the following formula (3) (compound No. 2). Therefore, the compound of this embodiment can be utilized as an anti-inflammatory agent, for example.
  • the compound of the present embodiment may be formulated as a pharmaceutical composition in the same manner as the compound represented by the above formula (1).
  • the dosage form, administration method, and dosage of the pharmaceutical composition are the same as those described above.
  • a reporter assay using an NF- ⁇ B response element was performed.
  • Cells in which an expression cassette in which a luciferase gene was linked downstream of the NF- ⁇ B response element were stably expressed in NIH3T3, a mouse embryo-derived fibroblast cell line, were prepared.
  • 0, 12.5, 25, and 50 pmol of siRNA against G0S2 were added to the cell culture medium (capacity 500 ⁇ L), and allowed to stand for 48 hours.
  • a commercially available siRNA for G0S2 (Life Technologies, trade name “Stealth siRNA”, catalog number “# 1320001”, SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the antisense strand) was used.
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results. As a result, it was revealed that the activity of the NF- ⁇ B response element in NIH3T3 cells was reduced by adding siRNA against G0S2 to the medium.
  • G0S2 is a regulator of transcriptional activity of inflammatory signals.
  • mice (G0S2 knockdown) Mouse of hepatitis liver cancer development model by diethylnitrosamine (DEN) was divided into 2 groups, siRNA against G0S2 was administered to one (G0S2 siRNA administration group) and negative control siRNA was administered to the other (control siRNA administration group) .
  • Administration of siRNA to mice was performed by administering 1.6 nmol / mouse via the tail vein using a nucleic acid introduction reagent (trade name “LipoTrust (trademark) EX Oligo ⁇ in vivo>, Hokkaido System Science Co., Ltd.).
  • siRNA for G0S2 (Life Technologies, trade name “Stealth siRNA”, catalog number “# 1320001”, SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the antisense strand) was used.
  • siRNA (Life Technologies, SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of the antisense strand) was used as the control siRNA.
  • DEN was added to drinking water at a concentration of 80 mg / L one day after siRNA administration to mice. Three days after administration of siRNA to mice, the liver was collected and subjected to gel shift assay using a DNA fragment containing the NF- ⁇ B response element sequence to measure the amount of binding between NF- ⁇ B and the NF- ⁇ B response element.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement results.
  • FIG. 4A is a pathological micrograph of the liver of a mouse in a control siRNA administration group (shown as “control siRNA” in the figure), and FIG. 4B is a photograph of a liver extracted from a mouse in the control siRNA administration group.
  • the arrows in FIG. 4A indicate cancer cells, and the arrows in FIG. 4B indicate liver cancer that has developed.
  • FIG. 4C is a pathological micrograph of the liver of a mouse in the G0S2 siRNA-administered group (shown as “G0S2 siRNA” in the figure), and FIG. 4D is a photograph of the liver extracted from the mouse in the G0S2 siRNA-administered group. is there.
  • FIG. 5 is a graph showing the measurement results of the expression level of Ccl2 mRNA in the liver of each group of mice.
  • the * mark in the figure means that there is a significant difference when the risk rate is less than 5%.
  • mice of the G0S2 siRNA administration group shown as “G0S2 siRNA” in the figure
  • Ccl2 expression was compared to the mice in the control siRNA administration group (shown as “control siRNA” in the figure).
  • control siRNA was found to be significantly suppressed.
  • FIG. 6B shows the result of the secondary screening. As a result, there were almost no compounds that significantly reduced cell viability. Therefore, 50 compounds that do not affect cell viability and lower the luciferase activity of the O-4000E cell line to less than 1/10 in the primary screening were selected as candidate compounds.
  • the inventors' research suggests that the clock gene is also involved in the expression of the nuclear receptor RAR ⁇ that regulates the transcription of the G0S2 gene. Therefore, in order to exclude compounds that affect the clock gene in normal cells, studies were performed using a MEF cell line in which an expression cassette having a luciferase gene linked downstream of the Bmal1 promoter was stably expressed. The result is shown in FIG. 7B.
  • FIG. 8A it was revealed that the mRNA expression level of the G0S2 gene was reduced to about half in any compound.
  • the expression level of the nuclear receptor RAR ⁇ which is known to be involved in the transcriptional control of G0S2 is determined according to Compound No. 1 and compound no. 2 did not change, but compound No. 2 3 showed a significant decrease.
  • the mRNA expression levels of Ccl2 and interleukin (IL) -6 which are downstream factors of NF- ⁇ B signal to which G0S2 contributes as a regulator, are determined by the exposure of any compound. There was also a significant decrease. From these results, compound no. 3 was removed from the candidates and compound no. 1 and compound no. 2 was a candidate compound.
  • the Ccl2 mRNA expression increased by exposure to LPS or TNF ⁇ was found to be compound No. 1 2 was significantly suppressed by exposure.
  • 25 ⁇ g of LPS was administered to the mouse from the tail vein to prepare a hepatitis model.
  • Compound No. 30 minutes after administration of LPS. 2 (5 mg / kg) was administered via the tail vein, and the liver was sampled at 6 hours.
  • the expression level of liver Ccl2 mRNA was significantly increased compared to the control group (saline-administered group). In the group administered with 2, the expression was significantly suppressed.
  • LPS (10 ⁇ g / animal) was administered to the ICR male mice via the tail vein to form an LPS administration group.
  • a mouse administered with physiological saline instead of LPS was prepared and used as a control group.
  • the LPS administration group was divided into two groups, and one group was divided into Compound No. 1 after 1 hour from the administration of LPS. 2 was administered subcutaneously to the back so as to be 5 mg / kg, and LPS + No. Two administration groups were used.
  • Compound No. Five hours after the administration of 2 mice of each group were killed and livers were collected.
  • FIG. 11A is a graph showing the results of quantification of G0S2 protein.
  • the expression of G0S2 was significantly increased in the LPS administration group compared to the control group. Furthermore, the expression of G0S2 was compared to LPS + No. It was significantly suppressed in the 2 administration groups.
  • FIG. 11B is a graph showing the results of quantification of p65 protein.
  • the amount of p65 protein in the nucleus was significantly increased in the LPS administration group compared to the control group. Furthermore, the abundance of p65 protein in the nucleus is lower than that of the LPS administration group by LPS + No. It decreased significantly in the 2 administration groups.
  • FIG. 11C is a graph showing the results of quantification of the expression level of Ccl2 mRNA.
  • the expression level of Ccl2 mRNA was significantly increased in the LPS administration group compared to the control group. Furthermore, the expression level of Ccl2 mRNA was lower than that of the LPS administration group. It decreased significantly in the 2 administration groups.
  • Example 13 (Synthesis of compounds) The compounds of Example 1 and Example 2 were synthesized according to the following scheme.
  • Compound 2 was obtained by reacting thiourea (Compound 1) with di-tert-butyl dicarbonate in the presence of sodium hydride. Subsequently, after conversion of compound 2 to compound 3 (see Yin B, et al., Tetrahedron Lett., 49, 3687, 2008.), compound 4a is obtained by condensation with hexylamine in the presence of water-soluble carbodiimide ( Poss MA, et al., Tetrahedron Lett., 33, 5933, 1992.), and condensation with dodecylamine gave compound 4b in 93% and 94% yields, respectively. By allowing a hydrogen chloride ether solution to act on compound 4a, the compound of Example 1 (Compound No.
  • Example 3 represented by the following formula (4) was also synthesized.
  • Example 4 represented by the following formula (5) was also synthesized.
  • Example 5 represented by the following formula (6) was also synthesized.
  • Example 6 represented by the following formula (7) was also synthesized.
  • Example 7 represented by the following formula (8) was also synthesized.
  • Example 8 represented by the following formula (9) was also synthesized.
  • Example 9 represented by the following formula (10) was also synthesized.
  • Example 10 represented by the following formula (11) was also synthesized.
  • Example 14 (Creation of compound No. 2 derivative and evaluation of drug efficacy) Compound No. Seven derivatives of Example 2 (Examples 2, 4 to 9) were exposed to Hepa1-6 cells at 10 ⁇ M, and the effect on the expression level of G0S2 mRNA after 24 hours was evaluated. As a result, as shown in FIG. 13A, in the compounds of Example 4 (NS-3-005) and Example 6 (NS-3-013), Compound No. An effect of reducing the expression level of G0S2 mRNA to the same level as 2 was observed.
  • Example 6 when the drug effect on human HepG2 cells was evaluated at the mRNA level, a significant decrease was observed with the compound of Example 6 (NS-3-013), and Example 2 (NS-3- Compound No. 011) The same effect as 2 was confirmed.
  • Example 2 which showed a common medicinal effect on mouse hepatoma-derived cell Hepa1-6 cells and human hepatoma-derived cell HepG2 cells, and Example 2 in which cell death was observed at 10 ⁇ M.
  • the efficacy of the compound (NS-3-011) was evaluated at a concentration of less than 10 ⁇ M.
  • Example 2 As a result, as shown in FIG. 2, the compounds of Example 2 (NS-3-011) and Example 6 (NS-3-013) were exposed at 2.5 and 5 ⁇ M for 48 hours. 2 was 5 ⁇ M, and the compound of Example 2 (NS-3-011) and Example 6 (NS-3-013) significantly decreased the expression level of G0S2 mRNA when exposed to both 5 ⁇ M and 2.5 ⁇ M. Furthermore, the compound of Example 2 (NS-3-011) is compound No. 5 at any concentration. 2 and 5 ⁇ M exposure group, a significant decrease in G0S2 mRNA expression level was observed.
  • Example 15 Comparison of efficacy of compound No. 2 and compound of Example 2 From the examination so far, a medicinal effect at less than 10 ⁇ M has been confirmed.
  • Compound No. The IC 50 was calculated for the G0S2 promoter activity of the compound 2 and the compound of Example 2 (NS-3-011). As a result, as shown in FIG. 2 had an IC 50 of 2.31 ⁇ M, whereas the compound of Example 2 (NS-3-011) had an IC 50 of 0.21 ⁇ M, indicating an equivalent efficacy in an amount of about 1/10. I understood.
  • the compound of Example 2 (NS-3-011) had a compound No. in the range of 1 to 2.5 ⁇ M. The effect was significantly higher than 2.
  • FIG. 14D when the cell viability at this time was evaluated by ATP assay, a significant decrease in cell viability was observed when the compound of Example 2 (NS-3-011) was exposed to 5 ⁇ M. . However, at a concentration of 1 ⁇ M of the compound of Example 2 (NS-3-011), no decrease in cell viability was observed, and at 1 ⁇ M, compound no. Thus, the compound of Example 2 (NS-3-011) was found to be compound No. 2 It was suggested that the compound is more useful than 2.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of real-time PCR. As a result, it was revealed that the expression level of G0S2 and Ccl2 mRNA was decreased in the cells in which G0S2 was knocked down as compared with the control cells.
  • Example 17 (Evaluation of drug efficacy) LPS 10 ⁇ g was intraperitoneally administered to mice to prepare a hepatitis model. One hour after LPS administration, the compound of Example 2 (NS-3-011), the compound of Example 3 (NS-3-054) and the compound of Example 10 (NS-3-086) were subcutaneously administered to the back. . Five hours after administration of each compound, livers were collected from each mouse, and the expression level of Ccl2 was quantified by real-time PCR.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of real-time PCR.
  • vehicle represents a mouse that did not receive LPS
  • control represents a mouse that received physiological saline instead of the compound.
  • Example 18 (Identification of target protein of compound of Example 2) Mouse liver cells were homogenized to extract proteins from the cytoplasm and nucleus respectively. Thereafter, the compound (# 142) obtained by pegbiotinylation of the compound of Example 2 (NS-3-011) that suppresses the expression of G0S2, or the compound of Example 1 (NS-3-060) that does not suppress the expression of G0S2. The pegylated biotinylated compound (# 151) was mixed with the above protein and incubated. The chemical formulas of compounds # 142 and # 151 are shown in the following formulas (13) and (14), respectively.
  • avidin beads magnetic beads labeled with avidin (hereinafter sometimes referred to as “avidin beads”), and the compound and protein bound to the avidin beads were subjected to acrylamide gel electrophoresis.
  • the acrylamide gel after electrophoresis was negatively stained, a protein band specifically bound to compound # 142 was cut out, and the protein was identified by LC / MS / MS analysis.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of acrylamide gel electrophoresis. As a result of analyzing a protein band of about 75 kDa indicated by an arrow in the figure, it was revealed that it was Hsd17b4 (Peroxisomal multifunctional type 2, Uniprot accession number: P51660).
  • Example 19 Evaluation of the efficacy of the compound of Example 1 using a non-alcoholic hepatitis model mouse
  • NASH non-alcoholic hepatitis
  • a feed for producing a NASH model type “A06071302”, Research Diet
  • the compound of Example 1 was orally administered at 19:00 on consecutive days from the start of feeding.
  • mice fed with normal feed and orally administered with water supplemented with 0.5% DMSO in the same volume as the compound were used.
  • ⁇ SMA collagen type I ⁇ 2
  • collagen type I ⁇ 1 are markers that serve as indices of liver fibrosis.
  • FIG. 18A is a graph showing the expression level of Ccl2 in the liver of a NASH model mouse. As shown in FIG. 18A, it was revealed that the expression level of Ccl2 is decreased by administration of the compound.
  • FIG. 18B is a graph showing the blood drug concentration of the compound of Example 1. As shown in FIG. 18B, the average blood concentration of the compound of Example 1 was 32 nM.
  • 18C, 18D, and 18E are graphs showing the results of quantifying the expression levels of ⁇ SMA, collagen type I ⁇ 2 (Col1 ⁇ 2), and collagen type I ⁇ 1 (Col1 ⁇ 1) gene, respectively.
  • FIG. 18C, FIG. 18D, and FIG. 18E in the group administered with the compound of Example 1 at 5 mg / kg, the expression levels of ⁇ SMA, collagen type I ⁇ 2, and collagen type I ⁇ 1 gene are significantly decreased. It became.
  • mice of Example 1 were orally administered to mice at 19:00 every day. Blood was collected 21 days after the start of compound administration, and the blood concentration of the compound 24 hours after drug administration was measured using LC / MS / MS. As a control, mice fed with normal feed and orally administered with water supplemented with 0.5% DMSO in the same volume as the compound were used.
  • FIG. 19 is a graph showing the blood drug concentration of the compound of Example 1. As shown in FIG. 19, the average blood concentration of the compound of Example 1 was 0.8 nM.
  • Example 21 Measurement of blood concentration of the compound of Example 1.
  • the compound of Example 1 (15 mg / kg) was subcutaneously administered to the back of ICR mice. Blood was collected 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, and 24 hours after administration of the compound, and the blood concentration of the compound was measured using LC / MS / MS. 20 is a graph showing the blood drug concentration of the compound of Example 1.
  • Example 22 (Investigation of the effect of compounds on serum ALT activity in mouse hepatitis liver cancer model by DEN)
  • a solution obtained by dissolving diethylnitrosamine (DEN) in water at a concentration of 80 mg / L as drinking water was administered to ICR mice to cause chronic inflammation in the liver.
  • DEN diethylnitrosamine
  • a group was prepared in which the compound of Example 10 (NS-3-086) was administered at a dose of 15 mg / kg immediately after the start of DEN drinking water administration.
  • a control group a group given tap water as drinking water was used.
  • ALT activity was measured using a commercially available kit (type “Transaminase CII-Test Wako”). , Manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • FIG. 21A and FIG. 21B are graphs showing ALT activity in serum after 8 weeks (FIG. 21A) and 12 weeks (FIG. 21B) from the start of DEN drinking water administration.
  • “Vehicle” indicates the result of the control group
  • “DEN” indicates the result of the DEN administration group
  • “DEN + Example 10” indicates that of the group to which DEN and the compound of Example 10 were administered. Results are shown.
  • each cell was collected after 48 hours, and total RNA was extracted. Subsequently, the expression level of the Hsd17b4 gene was quantified by real-time PCR.
  • FIG. 22A is a graph showing the results of real-time PCR. As a result, it was confirmed that the expression of Hsd17b4 was suppressed by transfection of siRNA against Hsd17b4.
  • Compound No. Hepa1-6 cells were transfected with siRNA against Hsd17b4 or control siRNA in the presence (10 ⁇ M) or absence (denoted as “DMSO” in FIG. 22B). Subsequently, after 48 hours, each cell was collected and total RNA was extracted. Subsequently, the expression level of the G0S2 gene was quantified by real-time PCR.
  • FIG. 22B is a graph showing the results of real-time PCR.
  • Compound No. In the presence of 2, it became clear that the expression level of the G0S2 gene was significantly reduced. Further, by transfection of siRNA against Hsd17b4, compound no. It was revealed that the effect of lowering the expression level of the G0S2 gene by 2 disappeared.
  • Compound No. 2 was found to regulate the expression of the G0S2 gene via the Hsd17b4 protein.
  • Hepa1-6 cells which are mouse liver cancer-derived cells, were transfected with an Hsd17b4 expression vector (Hsd17b4-pcDNA3.1) or an empty vector (pcDNA3.1).
  • each cell was collected after 48 hours, and total RNA was extracted. Subsequently, the expression level of Hsd17b4 gene or G0S2 gene was quantified by real-time PCR.
  • FIG. 23A and FIG. 23B are graphs showing the results of real-time PCR.
  • FIG. 23A shows the result of quantifying the expression level of the Hsd17b4 gene
  • FIG. 23B shows the result of quantifying the expression level of the G0S2 gene.
  • FIG. 23A it was confirmed that the expression level of the Hsd17b4 gene was significantly increased by transfection of the expression vector of Hsd17b4. Further, as shown in FIG. 23B, it was revealed that the expression level of the G0S2 gene was significantly increased by transfection of the expression vector of Hsd17b4.
  • Compound No. 10 having a final concentration of 10 ⁇ M was added to the medium of each cell. 2 or DMSO (control) was added. Subsequently, the cells were collected after 24 hours, and luciferase activity was measured.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of measuring the luciferase activity of each cell. As a result, when the STAT5 / 6 binding region present in the G0S2 transcriptional activity regulatory region is eliminated, It was clarified that the effect of suppressing the expression of luciferase by addition of 2 is reduced.
  • Compound No. 2 was considered to act via transcription of STAT5 or STAT6.
  • NIH3T3 cells which are mouse fibroblasts, were transfected with an expression vector in which a luciferase cDNA was linked downstream of the transcriptional activity regulatory region of G0S2, and a STAT5 expression vector or an empty vector (pcDNA3.1, control). Subsequently, the cells were collected after 24 hours, and luciferase activity was measured.
  • FIG. 25A is a diagram showing the structure of the transcriptional activity regulatory region of G0S2.
  • FIG. 25B is a graph showing the results of measuring luciferase activity. As a result, it was revealed that cells transfected with the STAT5 expression vector showed significantly higher luciferase activity compared to the control group.
  • FIG. 26 is a graph showing the results of Western blotting. As a result, compared with the control, Compound No. In cells to which 2 was added, compound no. The abundance of nuclear STAT5 protein decreased in a dose-dependent manner.
  • FIG. 27A shows compound No. in blood. 2 is a graph showing the density of 2; In addition, FIG. 2 is a graph showing the density of 2; As a result, compound no. The concentration of No. 2 reached its maximum at 15 minutes after administration, and compound No. It was revealed that the concentration of 2 reached the highest concentration 5 minutes after administration.
  • Example 29 (Examination of the effects of compounds on the liver of mouse hepatitis liver cancer development model by DEN) A solution obtained by dissolving diethylnitrosamine (DEN) in water at a concentration of 80 mg / L as drinking water was administered to ICR mice to cause chronic inflammation and liver cancer in the liver.
  • DEN diethylnitrosamine
  • a group was prepared in which the compound of Example 10 (NS-3-086) was administered at a dose of 15 mg / kg immediately after the start of DEN drinking water administration.
  • a control group a group given tap water as drinking water was used.
  • FIG. 28A, FIG. 28B and FIG. 28C are photographs of the liver 14 weeks after the start of DEN drinking water administration.
  • FIG. 28A is a representative photograph of the liver of a mouse in the control group (shown as “Vehicle” in the figure), and FIG. 28B shows the liver of a mouse in the DEN drinking group (shown as “DEN” in the figure).
  • FIG. 28C is a representative photograph of a liver of a mouse in a group to which DEN and the compound of Example 10 were administered (shown as “DEN + Example 10” in the figure).
  • liver sclerosis As a result, as compared with the control group, a large number of tumors were observed in the liver of mice in the DEN drinking group, and hardening of the liver was observed. On the other hand, in the livers of the mice of the group administered with DEN and the compound of Example 10, tumor formation was suppressed and liver sclerosis was also suppressed. Table 1 below shows the number of tumors in the liver of each group of mice.
  • a new anti-inflammatory agent can be provided.

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Abstract

　Ｇ０／Ｇ１　Ｓｗｉｔｃｈ　２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤は、新たな抗炎症剤として有用である。

Description

抗炎症剤及びその使用
　本発明は、抗炎症剤及びその使用に関する。より具体的には、抗炎症剤、抗炎症剤のスクリーニング方法及び新規化合物に関する。本願は、２０１５年１月２８日に日本に出願された特願２０１５－１４８２９号、及び２０１５年９月８日に日本に出願された特願２０１５－１７６７４５号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
　炎症は様々な疾患に認められる症状の一つである。現在、炎症を抑制する医薬品は数多く存在するが、炎症関連疾患には、未だアンメットメディカルニーズの高い疾患が存在する。炎症関連疾患としては、例えば、癌が挙げられる。癌は炎症を伴う難治性疾患の一つである。癌は日本における死因第１位の疾患であり、世界中でも癌による死者数は年々増加し問題視されている。
　癌は多くの臓器で認められるが、中でも肝臓癌（肝細胞癌）は死亡率や再発率の高い癌種である。肝臓癌の原因はウイルス感染によるものが９０％近くを占め、ウイルス感染後から始まる肝炎、肝硬変という長期間の慢性肝炎の病態を経て発癌する（例えば、非特許文献１を参照。）。その病態の中で、慢性炎症は、細胞の遺伝子変異による癌細胞の発現を促進することが知られている。しかしながら肝臓癌発症の原因は、ウイルス自体によるものか慢性的な炎症によるものか、未だ明らかとされていない状況にある（例えば、非特許文献２、３を参照。）。また、肝臓癌に対する化学療法は、抗癌剤に抵抗性を示しやすい等の理由から、肝臓癌に対する標準的な療法が確立されていないのが現状である。そのため、慢性肝炎及び肝臓癌の画期的な診断薬や新たな治療・予防戦略の構築が求められている。
　ところで、地球上の多くの生物には、体内時計と呼ばれる生体恒常性維持に重要な機能システムが備わっている。これら体内時計は、時計遺伝子と呼ばれる一連の遺伝子群による転写・翻訳のフィードバックループ機構によって構成されている。様々な生体機能、睡眠覚醒、体温、ホルモン分泌、代謝等に約２４時間周期の変動（日周リズム）が認められるが、これらは体内時計機構により調節されていることが知られている。
　近年、体内時計機構の変容が、様々な疾患、例えば生活習慣病として糖尿病、高血圧、痛風等の発症に関わることが明らかにされている（例えば、非特許文献４、５を参照）。また、癌に関しても、発癌や癌細胞の性質、抗癌剤に体する感受性が、体内時計機構により影響を受けることが指摘されている（例えば、非特許文献６を参照。）。
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　しかしながら、炎症と体内時計機構との関連性には未解明な点が多い。そこで、本発明は、炎症に体内時計機構が関与しているか否かを明らかにし、新たな抗炎症剤を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｇ０／Ｇ１　Ｓｗｉｔｃｈ　２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
［２］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２遺伝子又はＨｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７－β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　４（Ｈｓｄ１７ｂ４）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸である、［１］に記載の抗炎症剤。
［３］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質である、［１］に記載の抗炎症剤。
［４］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物である、［１］に記載の抗炎症剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （ここで、Ｒ５は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
［５］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤がＨｓｄ１７ｂ４に対する結合能を有する、［４］に記載の抗炎症剤。
［６］鎮痛作用を示す、［１］～［５］のいずれかに記載の抗炎症剤。
［７］被検物質の存在下で細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定する工程と、前記発現量が、前記被検物質の非存在下における前記細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
［８］被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
［９］下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （ここで、Ｒ１０は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。Ｒ８がヘキシル基である場合、ｍは１～５の整数であり、ｍが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
　本発明によれば、新たな抗炎症剤を提供することができる。
肝臓癌が発症する過程を示す模式図である。 実験例２において、５００μＬ培地中に、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを、０、１２．５、２５及び５０ｐｍｏｌ添加した細胞におけるＮＦ－κＢ応答エレメントの活性を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりｓｉＲＮＡ非投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例３において、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを投与したジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）暴露マウスの肝臓における、ＮＦ－κＢ応答エレメント（ＮＲＥ）へのＮＦ－κＢの結合活性を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照ｓｉＲＮＡ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例３における、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真である。 実験例３における、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。 実験例３における、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真である。 実験例３における、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。 実験例４において、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群のマウス及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。 実験例５における、化合物ライブラリーの一次スクリーニングの結果を示すグラフである。細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＧ０Ｓ２プロモーター（－２０３０→－１３７８）活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。 実験例５における、化合物ライブラリーの二次スクリーニングの結果を示すグラフである。細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＡＴＰ活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。 実験例６における、化合物のスクリーニングの結果を示すグラフである。細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＧ０Ｓ２プロモーター（－２０３０→＋１０）活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。 実験例６において、細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＢｍａｌ１プロモーター活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。 実験例６において、細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＰｅｒ２プロモーター活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。各化合物投与群とＤＭＳＯ投与群におけるＰｅｒ２プロモーター活性（相対値）に有意な差は認められなかった。 実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１～Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＧ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１～Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＲＡＲα遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１～Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＣｃｌ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１～Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＩＬ－６遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例８において、化合物Ｎｏ．１の濃度に対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 実験例８において、化合物Ｎｏ．２の濃度に対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 実験例９において、化合物Ｎｏ．２を投与したマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡの一過性発現プロファイルを示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～５）を示す。２ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ解析の結果、危険率１％未満で対照群と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意な差が認められた。「＊＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例９において、化合物Ｎｏ．２を投与したマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質の一過性発現プロファイルを示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により対照群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１０において、化合物Ｎｏ．２（１０μＭ）及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）の暴露から１２時間目のＨｅｐａ１－６細胞におけるＣｃｌ２　ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＬＰＳ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１０において、化合物Ｎｏ．２（１０μＭ）及びＴＮＦα（２００ｎｇ／ｍＬ）の暴露から１２時間目のＨｅｐａ１－６細胞におけるＣｃｌ２　ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＬＰＳ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１０において、ＬＰＳを尾静脈投与した後６時間目のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２　ｍＲＮＡの発現に対する、化合物Ｎｏ．２（５ｍｇ／Ｋｇ、尾静脈投与）の影響を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＬＰＳ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１１において、対照群、ＬＰＳ投与群、ＬＰＳ＋化合物Ｎｏ．２投与群のマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質の定量結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～５）を示す。「＊＊」は、対照群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ＬＰＳ投与群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１１において、対照群、ＬＰＳ投与群、ＬＰＳ＋化合物Ｎｏ．２投与群のマウスの肝臓におけるｐ６５タンパク質の核内存在量の定量結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～５）を示す。「＊＊」は、対照群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ＬＰＳ投与群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１１において、対照群、ＬＰＳ投与群、ＬＰＳ＋化合物Ｎｏ．２投与群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の定量結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～５）を示す。「＊」は、対照群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＃」は、ＬＰＳ投与群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例１２において、担癌１４日目のマウスにおける化合物Ｎｏ．２（１５ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水の腹腔内投与後のＰＷＴのタイムコースを示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝６）を示す。２ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ解析の結果、危険率１％未満で対照群（０．０５％ＤＭＳＯ－生理食塩水）と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意な差が認められた。「＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率５％未満で対照群（０．０５％ＤＭＳＯ－生理食塩水）と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意差があることを示す。「＊＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で対照群（０．０５％ＤＭＳＯ－生理食塩水）と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意差があることを示す。「ａａ」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で、０．０５％ＤＭＳＯ－生理食塩水投与前と０．０５％ＤＭＳＯ－生理食塩水投与後との間に有意差があることを示す。「ｂｂ」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で、化合物Ｎｏ．２投与前と化合物Ｎｏ．２投与後との間に有意差があることを示す。 実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（１０μＭ）の暴露から２４時間目のＨｅｐａ１－６細胞におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（１０μＭ）の暴露から２４時間目のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（１０μＭ）の暴露から２４時間目のＨｅｐＧ２細胞におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（２．５又は５μＭ）の暴露から４８時間目のＨｅｐａ１－６細胞におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の５μＭ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１５において、化合物Ｎｏ．２とその誘導体である実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）とのＩＣ５０を比較した結果を示すグラフである。各化合物の暴露後２４時間目のＯ－４０００Ｅ細胞のＧ０Ｓ２プロモーター活性（相対値）を示す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 実験例１５において、０．５～５μＭの化合物Ｎｏ．２とその誘導体である実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）の暴露から４８時間目のＨｅｐａ１－６細胞におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１５において、０．５～５μＭの化合物Ｎｏ．２とその誘導体である実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）の暴露から４８時間目のＨｅｐａ１－６細胞におけるＣｃｌ２　ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１５において、各化合物（１又は５μＭ）の暴露から２４時間目のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～６）を示す。「＊＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１６において、対照細胞と、Ｇ０Ｓ２ノックダウン細胞におけるＧ０Ｓ２及びＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照細胞の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例１７において、実施例２、実施例３、実施例１０の化合物を投与した肝炎モデルマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。「ベヒクル」はＬＰＳを投与しなかったマウスを表し、「対照」は化合物の代わりに生理食塩水を投与したマウスを表す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～５）を示す。シェッフェ検定によりベヒクル群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例１８において、実施例２の化合物の標的タンパク質を同定するプルダウンアッセイにおける、アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。 実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８～９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例１９における、実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～５）を示す。「Ｐ＝０．１４」は、スチューデントｔ検定により対照細胞の結果と比較した結果、危険率１４％未満で有意差があることを示す。 実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓における、αＳＭＡのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８～９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓における、コラーゲン　タイプＩ　α２（Ｃｏｌ１α２）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８～９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓における、コラーゲン　タイプＩ　α１（Ｃｏｌ１α１）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８～９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「Ｐ＝０．０６７３」は危険率６．７３％未満で有意差があることを示す。 実験例２０において、実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３～１０）を示す。「Ｐ＝０．０５２２」は、スチューデントｔ検定により対照マウスの結果と比較した結果、危険率５．２２％未満で有意差があることを示す。 実験例２１において、実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝５）を示す。 実験例２２において、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの血清中ＡＬＴ活性に及ぼす実施例１０の化合物の影響を示すグラフである。ＤＥＮの飲水投与開始から８週間後の結果を示す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８～１０）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。また、シェッフェ検定によりＤＥＮ投与群の結果と比較した結果、「＄」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例２２において、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの血清中ＡＬＴ活性に及ぼす実施例１０の化合物の影響を示すグラフである。ＤＥＮの飲水投与開始から１２週間後の結果を示す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝７～８）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊＊」及び「＃＃」は危険率１％未満で有意差があることを示す。また、シェッフェ検定によりＤＥＮ投与群の結果と比較した結果、「＄＄」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例２３において、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡを用いてＨｓｄ１７ｂ４遺伝子をノックダウンした結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照ｓｉＲＮＡ投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例２３において、化合物Ｎｏ．２の存在下又は非存在下（図中、「ＤＭＳＯ」と示す。）において、細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、化合物Ｎｏ．２の非存在下における結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。 実験例２４において、細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクター（Ｈｓｄ１７ｂ４－ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションし、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションした結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例２４において、細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクター（Ｈｓｄ１７ｂ４－ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションし、リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションした結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例２５において、Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターを安定発現させた細胞を用いて、化合物Ｎｏ．２の存在下又は非存在下（図中、「ＤＭＳＯ」と示す。）でルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、化合物Ｎｏ．２の非存在下における結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 Ｇ０Ｓ２転写活性調節領域の構造を示す図である。 実験例２６において、Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターと、ＳＴＡＴ５発現ベクター又は空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、対照）とを共発現させた細胞のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、対照と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例２７において、培地に化合物Ｎｏ．２を添加した細胞の核内ＳＴＡＴ５タンパク質の存在量をウエスタンブロッティングにより測定した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、対照又は２．５μＭ添加群と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。 実験例２８において、化合物Ｎｏ．２を経口投与したマウスの血液中の薬物濃度を測定した結果を示すグラフである。 実験例２８において、化合物Ｎｏ．２を経口投与したマウスの肝臓中の薬物濃度を測定した結果を示すグラフである。 実験例２９における、対照群のマウスの肝臓の代表的な写真である。 実験例２９における、ＤＥＮ飲水群のマウスの肝臓の代表的な写真である。 実験例２９における、ＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群のマウスの肝臓の代表的な写真である。
　図１は、炎症関連疾患の一例として、肝臓癌が発症する過程を示す模式図である。肝臓癌の９割は肝炎、肝硬変という長期間の慢性肝炎の病態を経て発癌する。なお、図１に示す過程におけるＧ０Ｓ２及び炎症シグナルの影響は、発明者らが今回明らかにしたものであり、詳細は後述する。
　ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を飲水に投与することにより、動物に慢性肝炎、肝硬変、肝臓癌発症に至る過程を再現することができる。この実験モデルは、ヒトにおける肝臓癌発症機構を解明する有用な実験系である。発明者らは、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルを用い、分子時計機構に着目した肝炎肝臓癌発症の機構を解析した。その結果、肝炎肝臓癌発症に細胞周期調節因子であるＧ０Ｓ２（Ｇ０／Ｇ１　ｓｗｉｔｃｈ　ｇｅｎｅ　２）が関与していることを見出した。
［抗炎症剤］
　１実施形態において、本発明は、Ｇ０／Ｇ１　Ｓｗｉｔｃｈ　２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤を提供する。Ｇ０Ｓ２阻害剤としては、例えばＧ０Ｓ２の転写を抑制する化合物、Ｇ０Ｓ２の活性を阻害する物質等が挙げられる。
　本実施形態の抗炎症剤が治療又は予防の対象とする炎症関連疾患としては、例えば肝炎、小腸炎、大腸炎（ＩＢＤ）、肝臓癌、リウマチ、喘息、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、ヘリコバクター・ピロリ関連胃炎等が挙げられる。
　本実施形態の抗炎症剤は、Ｇ０Ｓ２遺伝子に対する（Ｇ０Ｓ２の発現を阻害する）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸であってもよい。
　また、実施例において後述するように、発明者らは、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現が、Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７－β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　４（Ｈｓｄ１７ｂ４）タンパク質を介して制御されていることが明らかにした。すなわち、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現の上流でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質が作用していることを明らかにした。
　したがって、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現を阻害する物質は、Ｇ０Ｓ２阻害剤であるということもできる。すなわち、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現を阻害する物質は、抗炎症剤として使用することができる。
　したがって、本実施形態の抗炎症剤は、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸であってもよい。
　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０～９５℃で約１分程度変性させた後、３０～７０℃で約１～８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
　ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する長さ２０から２５塩基程度のＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）の一種である。近年、人工的なｍｉＲＮＡを用いて標的遺伝子のノックダウンを行うことが可能となっている。
　人工的なｍｉＲＮＡは、哺乳動物の細胞中で発現ベクターからＰｏｌ２プロモーターにより発現させるとよい。細胞内に導入されたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｍｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
　アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
　本実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
　本実施形態の抗炎症剤は、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質であってもよい。上記の特異的結合物質は、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に特異的に結合してそれらの機能を阻害することにより、抗炎症効果を発揮する。
　特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に抗原を免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。
　抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。また、上記の抗体又は抗体断片は、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したものであってもよい。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。
　アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
　特異的結合物質は、上記の他にも、例えば、対象物質に対する結合性を指標として、化合物ライブラリー等からスクリーニングしたものであってもよい。
　実施例において後述するように、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルのマウスに、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを投与することにより、肝炎及び肝臓癌の発症を抑制することができる。したがって、本実施形態の抗炎症剤は、肝炎又は肝臓癌の治療又は予防剤であるということもできる。
　本実施形態の抗炎症剤は、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　（ここで、Ｒ５は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。
　本実施形態の抗炎症剤において、上記式（１）で表される化合物は、フリー体であってもよく、薬学的に許容される塩であってもよく、フリー体の溶媒和物であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。
　薬学的に許容される塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ヨウ化水素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
　溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
　上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物は、Ｈｓｄ１７ｂ４（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｙｐｅ　２）に対する結合能を有するものであってもよい。
　実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物がＨｓｄ１７ｂ４に特異的に結合することを明らかにした。Ｈｓｄ１７ｂ４は、ペルオキシソーム等に存在することが知られるタンパク質であり、脂肪酸をβ酸化する等の活性を有する酵素である。ヒトＨｓｄ１７ｂ４のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号はＰ５１６５９であり、マウスＨｓｄ１７ｂ４のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号はＰ５１６６０である。
　実施例において後述するように、本実施形態の抗炎症剤は、鎮痛作用を示す。したがって、本実施形態の抗炎症剤は鎮痛剤であるということもいえる。
［医薬組成物］
　本実施形態の抗炎症剤は、それ自体を投与してもよいし、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。
　医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
　薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
　医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
　医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
　抗炎症剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
　抗炎症剤の投与量は、患者の症状等により差異はあるが、経口投与の場合、１日あたり、例えば５～２０ｍｇ／ｋｇ等が挙げられる。また、非経口的に投与する場合、その投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば皮下投与の場合には、例えば１０～２５ｍｇ／ｋｇを１日あたり１回投与することが挙げられる。投与量が上記範囲を超えると、肝障害が生じる場合がある。また、静脈注射の場合の致死量は約２５ｍｇ／ｋｇである。
［抗炎症剤のスクリーニング方法］
　１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下で細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定する工程と、前記発現量が、前記被検物質の非存在下における前記細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態のスクリーニング方法により、抗炎症剤をスクリーニングすることができる。
　被検物質としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。被検物質は、例えば細胞の培地中に添加すればよい。Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量の測定方法は特に制限されず、例えばリアルタイムＰＣＲにより行ってもよいし、例えばウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等によりタンパク質レベルで行ってもよい。
　あるいは、Ｇ０Ｓ２プロモーターの下流に、例えばルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターを遺伝子導入した細胞等を用いたレポーターアッセイにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定してもよい。
　被検物質の存在下で、対照（被検物質の非存在下）と比較してＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合には、前記被検物質は抗炎症剤であると判定することができる。
　１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らは、Ｇ０Ｓ２の上流でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質が機能していることを明らかにした。したがって、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を低下させる被検物質は、Ｇ０Ｓ２の阻害剤であるということができる。すなわち、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を低下させる被検物質は、抗炎症剤であるということができる。
　本実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで行ってもよいし、精製したＨｓｄ１７ｂ４タンパク質を用いて試験管内で行ってもよい。被検物質としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
　Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性としては、脂肪酸をβ酸化する活性が挙げられる。Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性は、例えば、２－ｍｅｔｈｙｌ－ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｃｈａｉｎ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ、胆汁酸中間体、又は超長鎖脂肪酸の代謝量を測定すること等により測定することができる。なお、発明者らは、コンピューター解析結果より、Ｈｓｄ１７ｂ４の酵素活性部位にＮＳ－３－０１１等の化合物が結合する結果、Ｈｓｄ１７ｂ４の活性が低下することを明らかにした。また、Ｈｓｄ１７ｂ４にはＮＳ－３－０１１以外の化合物も結合し得る。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、又は下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、炎症関連疾患の治療又は予防方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （ここで、Ｒ５は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
　１実施形態において、本発明は、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、又は上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、疼痛の治療又は予防方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、又は上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、肝炎又は肝臓癌の治療又は予防方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、炎症関連疾患の治療若しくは予防、又は疼痛の治療若しくは予防のための、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、若しくは上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を提供する。
　１実施形態において、本発明は、炎症関連疾患の治療剤若しくは予防剤、又は疼痛の治療剤若しくは予防剤を製造するための、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、若しくは上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物の使用を提供する。
［新規化合物］
　発明者らはまた、下記式（２）で表される化合物を見出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　ここで、Ｒ１０は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。Ｒ８がヘキシル基である場合、ｍは１～５の整数であり、ｍが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。
　上記式（２）で表される化合物は、上記式（１）で表される化合物と同様に、フリー体であってもよく、薬学的に許容される塩であってもよく、フリー体の溶媒和物であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。薬学的に許容される塩及び溶媒和物としては上述したものと同様である。
　後述するように、本実施形態の化合物は、下記式（３）で表される化合物（化合物Ｎｏ．２）と比較して、顕著に高いＧ０Ｓ２の発現抑制効果を奏する。したがって、本実施形態の化合物は、例えば抗炎症剤として利用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　本実施形態の化合物は、上記式（１）で表される化合物と同様に医薬組成物として製剤化してもよい。この場合、医薬組成物の剤型、投与方法、投与量は、上述したものと同様である。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（Ｇ０Ｓ２の同定）
　ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルを対象に、体内時計機構の変容を観察した。その結果、Ｇ０Ｓ２（Ｇ０／Ｇ１　ｓｗｉｔｃｈ　ｇｅｎｅ　２）の発現リズムに変容が認められた。マウスＧ０Ｓ２の塩基配列を配列番号１に示し、ヒトＧ０Ｓ２の塩基配列を配列番号２に示す。
［実験例２］
（Ｇ０Ｓ２の機能解析）
　培養細胞におけるＧ０Ｓ２をノックダウンし、炎症性シグナルにより活性化される転写因子であるＮＦ－κＢに対する影響を検討した。
　まず、ＮＦ－κＢ応答エレメントを用いたレポーターアッセイを行った。マウス胎仔由来線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３に、ＮＦ－κＢ応答エレメントの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させた細胞を作製した。続いて、この細胞の培地（容量５００μＬ）に、０、１２．５、２５及び５０ｐｍｏｌのＧ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを添加し、４８時間静置した。Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡとしては、市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、商品名「Ｓｔｅａｌｔｈ　ｓｉＲＮＡ」、カタログ番号「＃１３２０００１」、配列番号３にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。
　続いて各細胞を回収して破砕し、発光基質（商品名「Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒ）　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ」、プロメガ社製）を反応させて発光量を計測し、ＮＦ－κＢ応答エレメントの活性を測定した。図２は、測定結果を示すグラフである。その結果、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを培地に添加することにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＦ－κＢ応答エレメントの活性が低下することが明らかとなった。
　以上の結果から、Ｇ０Ｓ２は炎症性シグナルの転写活性の調節因子であることが明らかとなった。
［実験例３］
（Ｇ０Ｓ２のノックダウン）
　ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）によるマウス肝炎肝臓癌発症モデルのマウスを２群に分け、一方にＧ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを投与し（Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群）、他方に陰性対照のｓｉＲＮＡを投与した（対照ｓｉＲＮＡ投与群）。マウスへのｓｉＲＮＡの投与は、核酸導入試薬（商品名「ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（商標）ＥＸ　Ｏｌｉｇｏ＜ｉｎ　ｖｉｖｏ＞、北海道システム・サイエンス社）を用いて、１．６ｎｍｏｌ／匹を尾静脈投与することにより行った。Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡとしては、市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、商品名「Ｓｔｅａｌｔｈ　ｓｉＲＮＡ」、カタログ番号「＃１３２０００１」、配列番号３にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。対照ｓｉＲＮＡとしては市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、配列番号４にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。
　マウスへのｓｉＲＮＡの投与の１日後からＤＥＮを８０ｍｇ／Ｌの濃度で飲水に添加した。マウスへのｓｉＲＮＡの投与３日後に肝臓を採取し、ＮＦ－κＢ応答エレメント配列を含むＤＮＡ断片を用いたゲルシフトアッセイを行い、ＮＦ－κＢとＮＦ－κＢ応答エレメントとの結合量を測定した。
　図３は、測定結果を示すグラフである。その結果、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを投与することにより、マウス肝炎肝臓癌発症モデルの肝臓におけるＮＦ－κＢ応答エレメント（ＮＲＥ）へのＮＦ－κＢの結合活性が低下することが明らかとなった。
　続いて、上記と同様のＧ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスを用意した。マウスへのｓｉＲＮＡの投与の１日後からＤＥＮを８０ｍｇ／Ｌの濃度で飲水に添加し、１４週間飼育した後にと殺し、解析を行った。その結果、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群のマウスにおいては肝臓癌の発症が抑制された。これに対し、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスにおいては、肝臓癌の発症が認められた。
　図４Ａは、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真であり、図４Ｂは、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。図４Ａ中の矢印は癌細胞を示し、図４Ｂ中の矢印は発症した肝臓癌を示す。
　また、図４Ｃは、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真であり、図４Ｄは、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。
［実験例４］
（Ｃｃｌ２の発現量の検討）
　実験例３のＧ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群のマウス及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの肝臓において、ケモカインＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ法により測定した。図５は、各群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。図中の＊印は、危険率５％未満で有意差があることを意味する。
　その結果、Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２　ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスにおいては、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスと比較して、Ｃｃｌ２の発現が有意に抑制されていることが明らかとなった。
［実験例５］
（化合物ライブラリーを用いた一次、二次スクリーニング）
　Ｇ０Ｓ２遺伝子転写抑制薬を探索した。探索するにあたり、東京大学創薬オープンイノベーションセンターから９６００化合物からなる化合物ライブラリー（Ｃｏｒｅ　ｌｉｂｒａｒｙ）の提供を受けた。この化合物ライブラリーを対象に３８４　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用いてルシフェラーゼ活性への影響を評価することにより、一次スクリーニングを行った。Ｇ０Ｓ２プロモーター（－２０３０→－１３７８）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させた細胞株を用いて、各化合物（終濃度１０μＭ）について薬効評価を３回ずつ検討し、すべての検討でルシフェラーゼ活性を１／４未満に低下させた化合物を抽出した結果、１７５個の化合物がヒットした。図６Ａに一次スクリーニングの結果を示す。
　次に、これらの化合物（終濃度１０μＭ）が、マウス線維芽細胞由来の細胞であるＯ－４０００Ｅ細胞株の生存率に与える影響を、細胞内のＡＴＰ存在量を指標に評価することにより二次スクリーニングを行った。図６Ｂに二次スクリーニングの結果を示す。その結果、細胞生存率を有意に低下させる化合物はほとんど存在しなかった。そこで、細胞生存率に影響を与えず、かつ一次スクリーニングでＯ－４０００Ｅ細胞株のルシフェラーゼ活性を１／１０未満まで下げる５０個の化合物を候補化合物とした。
［実験例６］
（Ｇ０Ｓ２プロモーターに対する選択性によるスクリーニング）
　より肝臓での環境に近づけるため、マウス肝癌由来の細胞であるＨｅｐａ１－６細胞に、Ｇ０Ｓ２プロモーター（－２０３０→＋１０）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させた細胞を作製した。この細胞を使用して、上述した一次スクリーニング時と同様に候補化合物のルシフェラーゼ活性に対する影響を評価した。図７Ａにスクリーニングの結果を示す。
　さらに、ヒット化合物の転写抑制作用がＧ０Ｓ２プロモーターに対する選択性を有するものかどうかを検討するため、生体において多くの遺伝子発現に関与し生体の恒常性維持に関わる時計遺伝子群に着目し検討を行った。
　発明者らの研究より、時計遺伝子が、Ｇ０Ｓ２遺伝子の転写制御を行う核内受容体ＲＡＲαの発現にも関与していることが示唆されている。そこで、正常な細胞における時計遺伝子に影響を及ぼす化合物を除外するため、Ｂｍａｌ１プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させたＭＥＦ細胞株を用いた検討を行った。結果を図７Ｂに示す。
　その結果、多くの化合物で有意にＢｍａｌ１のプロモーター活性を抑制する可能性が示唆された。そこで、Ｂｍａｌ１プロモーター活性に有意な変化がなく、Ｇ０Ｓ２プロモーター（－２０３０→＋１０）の活性を１／２未満まで低下させる化合物を抽出した結果、化合物Ｎｏ．１、化合物Ｎｏ．２及び化合物Ｎｏ．３の３つの化合物が候補として残った。下記式（１２）、（３）及び（１３）に、それぞれ化合物Ｎｏ．１、化合物Ｎｏ．２（以下、「ＮＳ－３－００８」という場合がある。）及び化合物Ｎｏ．３の化学式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　そこで更にＰｅｒ２プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させたＭＥＦ細胞株を用いて、この３つの化合物の薬効評価を行った結果、残ったヒット化合物の３つはいずれもＰｅｒ２プロモーター活性に影響を与えなかった。結果を図７Ｃに示す。
［実験例７］
（ヒット化合物の内因性ｍＲＮＡ発現への影響）
　これまでに抽出された３つの化合物について、Ｇ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を評価した。Ｈｅｐａ１－６細胞を播種して２４時間後に、ヒット化合物を１０μＭで暴露し、２４時間後にサンプリング及び全ＲＮＡの抽出を行った。続いて、ｑＲＴ－ＰＣＲ法によりＧ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量変化を測定した。
　その結果、図８Ａに示すように、いずれの化合物においてもＧ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量が約半分まで低下していることが明らかとなった。さらに、図８Ｂに示すように、Ｇ０Ｓ２の転写制御に関与することが知られている核内受容体ＲＡＲαの発現量は、化合物Ｎｏ．１と化合物Ｎｏ．２では変化がなかったが、化合物Ｎｏ．３で有意な減少が認められた。また、図８Ｃ及び図８Ｄに示すように、Ｇ０Ｓ２が調節因子として寄与しているＮＦ－κＢシグナルの下流因子であるＣｃｌ２及びインターロイキン（ＩＬ）－６のｍＲＮＡ発現量は、いずれの化合物の暴露によっても有意な減少が認められた。これらの結果より、化合物Ｎｏ．３を候補から外し、化合物Ｎｏ．１及び化合物Ｎｏ．２を候補化合物とした。
［実験例８］
（ヒット化合物のＩＣ５０の算出）
　ヒット化合物である化合物Ｎｏ．１及びＮｏ．２の薬効評価のため、ＩＣ５０の算出を行った。Ｏ－４０００Ｅ細胞株を播種し、化合物Ｎｏ．１及びＮｏ．２をそれぞれ終濃度０．１５６２５μＭ～１０μＭとなるよう８段階に段階希釈して暴露した。暴露から２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、カーブフィッティングを行ってＩＣ５０を算出した。その結果、図８Ｅに示すように化合物Ｎｏ．１のＩＣ５０は５．００μＭであり、図８Ｆに示すように化合物Ｎｏ．２のＩＣ５０は２．２５μＭと算出された。
［実験例９］
（正常マウスに対する化合物Ｎｏ．２の薬効評価）
　ＩＣ５０がより低値を示した化合物Ｎｏ．２について、正常マウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響について検討を行った。ＩＣＲ雄性マウスに対し１５ｍｇ／ｋｇで化合物Ｎｏ．２を背部皮下投与し、投与後３０分、１、２、４、６、１２、２４時間目の肝臓におけるＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果、図９Ａに示すように、投与から４時間目においてＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量が約半分にまで低下する傾向が認められ、２時間目および１２時間目で、有意に減少していることが分かった。さらに、図９Ｂに示すように、投与後２時間目から１２時間目の肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質発現量を測定したところ、投与後４時間目と６時間目の化合物Ｎｏ．２投与群で有意な低下が認められた。
［実験例１０］
（化合物Ｎｏ．２の炎症シグナルへの拮抗作用の評価１）
　次に、生体内での効果が認められた化合物Ｎｏ．２が炎症シグナルの活性化に拮抗する作用を持つか否かの検討を行った。Ｇ０Ｓ２タンパク質が調節因子として働くＮＦ－κＢを活性化させるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はＴＮＦαをＨｅｐａ１－６細胞に暴露すると同時に化合物Ｎｏ．２を１０μＭで暴露した。図１０Ａ、図１０Ｂに示すように、暴露から１２時間後に細胞を回収しＣｃｌ２　ｍＲＮＡ発現量を測定したところ、ＬＰＳ又はＴＮＦαの暴露によって増大したＣｃｌ２　ｍＲＮＡ発現が化合物Ｎｏ．２の暴露によって有意に抑制された。また、マウスにＬＰＳ　２５μｇを尾静脈より投与し、肝炎モデルを作製した。ＬＰＳ投与３０分後に化合物Ｎｏ．２（５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈投与し、６時間目に肝臓をサンプリングした。その結果、図１０Ｃに示すように、肝臓のＣｃｌ２　ｍＲＮＡ発現量は、対照群（生理食塩水投与群）と比較し有意に発現量が増加したが、化合物Ｎｏ．２を投与した群ではその発現は有意に抑制された。
［実験例１１］
（化合物Ｎｏ．２の炎症シグナルへの拮抗作用の評価２）
　実験例１０とは異なる条件下で、インビボにおいて化合物Ｎｏ．２が炎症シグナルの活性化に拮抗する作用を持つか否かの検討を行った。
　ＩＣＲ雄性マウスにＬＰＳ（１０μｇ／匹）を尾静脈投与し、ＬＰＳ投与群とした。また、ＬＰＳの代わりに生理食塩水を投与したマウスを用意し、対照群とした。続いて、ＬＰＳ投与群を２つに分け、一方の群に、ＬＰＳの投与から１時間後に化合物Ｎｏ．２を５ｍｇ／ｋｇとなるよう背部皮下投与し、ＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群とした。続いて、化合物Ｎｏ．２の投与から５時間後に、各群のマウスをと殺し肝臓を採取した。
　続いて、得られた各群のマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により定量した。図１１Ａは、Ｇ０Ｓ２タンパク質の定量結果を示すグラフである。
　その結果、Ｇ０Ｓ２の発現は、対照群と比較してＬＰＳ投与群で有意に上昇した。さらに、Ｇ０Ｓ２の発現は、ＬＰＳ投与群と比較してＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群で有意に抑制された。
　また、各群のマウスの肝臓について、ＮＦ－κＢの構成タンパク質の１つであるｐ６５タンパク質の核内存在量をウエスタンブロット法により定量した。図１１Ｂは、ｐ６５タンパク質の定量結果を示すグラフである。
　その結果、ｐ６５タンパク質の核内存在量は、対照群と比較してＬＰＳ投与群で有意に上昇した。さらに、ｐ６５タンパク質の核内存在量は、ＬＰＳ投与群と比較してＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群で有意に低下した。
　また、各群のマウスの肝臓について、ＮＦ－κＢの標的遺伝子であるＣｃｌ２のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した。図１１Ｃは、Ｃｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の定量結果を示すグラフである。
　その結果、Ｃｃｌ２のｍＲＮＡの発現量は、対照群と比較してＬＰＳ投与群で有意に上昇した。さらに、Ｃｃｌ２のｍＲＮＡの発現量は、ＬＰＳ投与群と比較してＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群で有意に低下した。
　以上の結果は、化合物Ｎｏ．２がｉｎ　ｖｉｖｏにおいて炎症シグナルに拮抗し、ＮＦ－κＢを介したケモカインの発現亢進を抑制する作用を持つことを更に支持するものである。
［実験例１２］
（化合物Ｎｏ．２の神経障害性疼痛への薬効評価）
　炎症モデルで効果が認められた化合物Ｎｏ．２が神経障害性疼痛に拮抗する作用を持つか否かの検討を行った。癌移植による神経障害性疼痛モデルはＮＦ－κＢを活性化させる。そこで癌移植後２週間目にボンフェロニーテストを行い、疼痛強度を測定し疼痛が惹起されていることを確認したモデルマウスに、化合物Ｎｏ．２を１５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。図１２に示すように、投与後経時的に疼痛強度を測定した結果、４、６、８時間目に有意に化合物Ｎｏ．２投与群で痛みが緩和された。また、坐骨神経部分損傷モデルマウスにおいても同様な効果が認められた。
［実験例１３］
（化合物の合成）
　下記スキームにしたがって、実施例１及び実施例２の化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　まず、水素化ナトリウム存在下チオ尿素（化合物１）と二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルとの反応により化合物２を得た。続いて、化合物２を化合物３に変換したのち（Yin B, et al., Tetrahedron Lett., 49, 3687, 2008. を参照。）、水溶性カルボジイミド存在下ヘキシルアミンとの縮合によって化合物４ａを（Poss MA, et al., Tetrahedron Lett., 33, 5933, 1992. を参照。）、ドデシルアミンとの縮合によって化合物４ｂをそれぞれ収率９３％及び９４％で得た。化合物４ａに対し塩化水素エーテル溶液を作用させることで、実施例１の化合物（化合物Ｎｏ．２）が収率６７％で得られた。
（化合物Ｎｏ．２）
　１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．１０（１Ｈ，ｂｓ），７．７９（１Ｈ，ｂｓ），７．５６（２Ｈ，ｂｓ），７．４１－７．２７（５Ｈ，ｍ），４．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），３．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５１－１．４１（２Ｈ，ｍ），１．３２－１．２１（６Ｈ，ｍ），０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）。
　また、化合物４ｂをジクロロメタン中トリフルオロ酢酸と反応させることで、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）が定量的に得られた。
（ＮＳ－３－０１１）
　１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．９９（１Ｈ，ｂｓ），７．６６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．５０（２Ｈ，ｂｓ），７．４２－７．３５（２Ｈ，ｍ），７．３３－６．２６（３Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．１４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５３－１．４１（３Ｈ，ｍ），１．３２－１．１６（１７Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
　また、下記式（４）で表される実施例３の化合物（ＮＳ－３－０５４）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （ＮＳ－３－０５４）
　１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），８．０７（１Ｈ，ｓ），８．０１（２Ｈ，ｓ），７．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｂｓ），４．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５０－１．３８（２Ｈ，ｍ），１．２９－１．１２（６Ｈ，ｍ），０．８４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
　また、下記式（５）で表される実施例４の化合物（ＮＳ－３－００５）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （ＮＳ－３－００５）
　１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３８－７．２８（５Ｈ，ｍ），４．４８（２Ｈ，ｂｓ），３．１５（２Ｈ，ｂｓ），１．６２－１．４８（１１Ｈ，ｍ），１．３５－１．１６（６Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）。
　また、下記式（６）で表される実施例５の化合物（ＮＳ－３－０１０）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （ＮＳ－３－０１０）
　１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７７（１Ｈ，ｂｓ），７．４５（２Ｈ，ｂｓ），７．４２－７．３７（３Ｈ，ｍ），７．３４－７．２８（３Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．４７－３．３７（１Ｈ，ｍ），１．８６－１．７７（２Ｈ，ｍ），１．７３－１．６５（２Ｈ，ｍ），１．６１－１．５３（１Ｈ，ｍ），１．３５－１．０８（５Ｈ，ｍ）。
　また、下記式（７）で表される実施例６の化合物（ＮＳ－３－０１３）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （ＮＳ－３－０１３）
　１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５０－７．４１（２Ｈ，ｍ），７．３７（２Ｈ，ｂｓ），７．３４－７．２９（２Ｈ，ｍ），７．２８－７．２１（３Ｈ，ｍ），３．４３－３．３５（２Ｈ，ｍ），３．０９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４８－１．３８（２Ｈ，ｍ），１．３４－１．２０（６Ｈ，ｍ），０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
　また、下記式（８）で表される実施例７の化合物（ＮＳ－３－０１４）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （ＮＳ－３－０１４）
　１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ９．６６（１Ｈ，ｂｓ），８．０３－７．９０（１Ｈ，ｍ），７．７１（２Ｈ，ｂｓ），７．４８－７．４１（２Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），３．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５９－１．４８（２Ｈ，ｍ），１．３９－１．２２（６Ｈ，ｍ），０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
　また、下記式（９）で表される実施例８の化合物（ＮＳ－３－０１５）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （ＮＳ－３－０１５）
　１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．４１－７．３４（２Ｈ，ｍ），７．３１（２Ｈ，ｂｓ），３．１１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．７６－１．５８（５Ｈ，ｍ），１．５４－１．４１（３Ｈ，ｍ），１．３６－１．０７（９Ｈ，ｍ），０．９６－０．８２（５Ｈ，ｍ）。
　また、下記式（１０）で表される実施例９の化合物（ＮＳ－３－０１６）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （ＮＳ－３－０１６）
　１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．９４－７．８４（１Ｈ，ｍ），７．４８７．３５（５Ｈ，ｍ），７．３５－７．２７（３Ｈ，ｍ），４．８７－４．７８（１Ｈ，ｍ），３．１８－３．０３（２Ｈ，ｍ），１．５０－１．３４（５Ｈ，ｍ），１．３１－１．１３（６Ｈ，ｍ），０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
　また、下記式（１１）で表される実施例１０の化合物（ＮＳ－３－０８６）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （ＮＳ－３－０８６）
　１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．０９（１Ｈ，ｂｓ），８．０７（１Ｈ，ｓ），８．００（２Ｈ，ｓ），７．７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．５６（２Ｈ，ｂｓ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），１．４８－１．３８（２Ｈ，ｍ），１．３２－１．１０（１８Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
　また、下記式（１２）で表される比較例１の化合物（ＮＳ－３－０６０）も合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （ＮＳ－３－０６０）
　１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．８３（１Ｈ，ｂｓ），７．５２（１Ｈ，ｂｓ），７．４５（２Ｈ，ｂｓ），７．４１－７．３６（２Ｈ，ｍ），７．３４７．２７（３Ｈ，ｍ），４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），４．３８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１９－３．１０（２Ｈ，ｍ），１．７５－１．６６（１Ｈ，ｍ），１．５５－１．３７（３Ｈ，ｍ），１．３６－１．２３（２Ｈ，ｍ）。
［実験例１４］
（化合物Ｎｏ．２の誘導体の創製と薬効評価）
　化合物Ｎｏ．２の誘導体７種（実施例２、４～９）をＨｅｐａ１－６細胞に１０μＭで暴露し、２４時間後のＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量への影響を評価した。その結果、図１３Ａに示すように、実施例４（ＮＳ－３－００５）及び実施例６（ＮＳ－３－０１３）の化合物において、化合物Ｎｏ．２と同等程度までＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量を低下させる作用が認められた。
　また、図１３Ｂに示すように、これらの化合物についてＡＴＰ　ａｓｓａｙにより細胞生存率に対する影響を評価したところ、実施例２（ＮＳ－３－０１１）の化合物でのみ有意な低下が認められた。
　また、図１３Ｃに示すように、ヒトＨｅｐＧ２細胞に対する薬効をｍＲＮＡレベルで評価したところ、実施例６（ＮＳ－３－０１３）の化合物で有意な低下が認められ、実施例２（ＮＳ－３－０１１）の化合物において化合物Ｎｏ．２と同程度の効果が確認された。
　そこで、マウス肝癌由来細胞Ｈｅｐａ１－６細胞とヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２細胞で共通して薬効が認められた実施例６（ＮＳ－３－０１３）の化合物と１０μＭでは細胞死が認められた実施例２（ＮＳ－３－０１１）の化合物について、１０μＭ未満の濃度での薬効評価を行った。
　その結果、図１３Ｄに示すように、Ｈｅｐａ１－６細胞に対し化合物Ｎｏ．２、実施例２（ＮＳ－３－０１１）、実施例６（ＮＳ－３－０１３）の化合物を２．５及び５μＭで４８時間暴露したところ、化合物Ｎｏ．２は５μＭ、実施例２（ＮＳ－３－０１１）、実施例６（ＮＳ－３－０１３）の化合物は５μＭと２．５μＭ暴露の両方でＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量が有意に低下した。更に、実施例２（ＮＳ－３－０１１）の化合物は、いずれの濃度においても化合物Ｎｏ．２の５μＭ暴露群と比較してＧ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量の有意な低下が認められた。
［実験例１５］
（化合物Ｎｏ．２と実施例２の化合物の薬効比較）
　これまでの検討から１０μＭ未満での薬効が認められ、化合物Ｎｏ．２以上の効果が期待される実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）について、低濃度での詳細な薬効評価を行った。まず、Ｏ－４０００Ｅ細胞を用いて、化合物Ｎｏ．２及び実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）のＧ０Ｓ２プロモーター活性に対するＩＣ５０の算出を行った。その結果、図１４Ａに示すように、化合物Ｎｏ．２ではＩＣ５０が２．３１μＭであったのに対し、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）ではＩＣ５０が０．２１μＭとなり、約１０分の１の量で同等の薬効を示すことが分かった。
　そこで、Ｈｅｐａ１－６細胞に対し０．５～５μＭの範囲で化合物Ｎｏ．２及び実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）を暴露し４８時間後の内因性Ｇ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量への影響を評価した。その結果、図１４Ｂに示すように、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）は、１～５μＭの範囲で化合物Ｎｏ．２よりも有意に高い作用を示し、ＩＣ５０は約１μＭであった。
　また、同様にＣｃｌ２　ｍＲＮＡ発現量の評価を行ったところ、図１４Ｃに示すように、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）は、１～２．５μＭの範囲で化合物Ｎｏ．２よりも有意に高い効果を示した。また、図１４Ｄに示すように、この際の細胞生存率をＡＴＰ　ａｓｓａｙによって評価したところ、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）の５μＭ暴露時には有意に細胞生存率の低下が認められた。しかし、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）の１μＭの濃度においては細胞生存率の低下は認められず、かつ１μＭで化合物Ｎｏ．２よりも強い作用を示したことから、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）は、化合物Ｎｏ．２よりも有用な化合物であることが示唆された。
［実験例１６］
（ｍｉＲＮＡによるＧ０Ｓ２のノックダウン）
　配列番号５及び６に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を合成し、ハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡ断片を形成した。続いて、形成した２本鎖ＤＮＡ断片を、ｍｉＲＮＡ用発現ベクター（商品名「ＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）Ｐｏｌ　ＩＩ　ｍｉＲ　ＲＮＡｉ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔｓ」、インビトロジェン社製）に連結した。続いて、作製した発現ベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後に、リアルタイムＰＣＲによりＧ０Ｓ２及びＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を定量した。
　図１５は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、対照の細胞と比較して、Ｇ０Ｓ２をノックダウンした細胞では、Ｇ０Ｓ２及びＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量が低下したことが明らかとなった。
［実験例１７］
（化合物の薬効評価）
　ＬＰＳ　１０μｇをマウスに腹腔内投与し、肝炎モデルを作製した。ＬＰＳ投与から１時間後に、実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）、実施例３の化合物（ＮＳ－３－０５４）及び実施例１０の化合物（ＮＳ－３－０８６）を背部皮下投与した。各化合物の投与から５時間後に各マウスから肝臓を採取し、リアルタイムＰＣＲによりＣｃｌ２の発現量を定量した。
　図１６は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図中、「ベヒクル」はＬＰＳを投与しなかったマウスを表し、「対照」は化合物の代わりに生理食塩水を投与したマウスを表す。
　その結果、対照群のマウスと比較して、化合物投与群のマウスはＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量が低下したことが明らかとなった。いずれの化合物についてもＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の低下が認められた。
［実験例１８］
（実施例２の化合物の標的タンパク質の同定）
　マウス肝臓細胞をホモジナイズして、細胞質及び核からそれぞれタンパク質を抽出した。その後、Ｇ０Ｓ２の発現を抑制する実施例２の化合物（ＮＳ－３－０１１）をペグビオチン化した化合物（＃１４２）、又はＧ０Ｓ２の発現を抑制しない比較例１の化合物（ＮＳ－３－０６０）をペグビオチン化した化合物（＃１５１）を、上記のタンパク質と混合し、インキュベーションした。化合物＃１４２及び＃１５１の化学式を、それぞれ下記式（１３）及び（１４）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　その後、アビジンを標識したマグネットビーズ（以下、「アビジンビーズ」という場合がある。）でプルダウンアッセイを行い、アビジンビーズに結合した化合物及びタンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のアクリルアミドゲルは、ネガティブ染色し、化合物＃１４２に特異的に結合したタンパク質のバンドを切り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によりタンパク質を同定した。
　図１７は、アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。図中の矢印で示す約７５ｋＤａのタンパク質のバンドを解析した結果、Ｈｓｄ１７ｂ４（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｙｐｅ　２、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５１６６０）であることが明らかとなった。
［実験例１９］
（非アルコール性肝炎モデルマウスを用いた実施例１の化合物の薬効評価）
　非アルコール性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルの初期炎症に及ぼす化合物の影響を確認するために、ＮＡＳＨモデル作製用飼料（型式「Ａ０６０７１３０２」、リサーチダイエット社）を１週間摂食させた。摂食開始日から連日１９時に実施例１の化合物（２．５、５．０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。対照としては、通常の飼料を与え、０．５％ＤＭＳＯを添加した水を化合物と同容量経口投与したマウスを使用した。
　摂食開始から１週間後に肝臓を採取し、Ｃｃｌ２、αＳＭＡ、コラーゲン　タイプＩ　α２、コラーゲン　タイプＩ　α１遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。なお、αＳＭＡ、コラーゲン　タイプＩ　α２、コラーゲン　タイプＩ　α１は、肝臓の線維化の指標となるマーカーである。
　また、摂食開始から１週間後に血液を採取し、薬物投与２時間後の血中薬物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い測定した。
　図１８ＡはＮＡＳＨモデルマウスの肝臓におけるＣｃｌ２の発現量を示すグラフである。図１８Ａに示すように、化合物の投与によりＣｃｌ２の発現量が低下することが明らかとなった。
　図１８Ｂは実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。図１８Ｂに示すように、実施例１の化合物の平均血中濃度は、３２ｎＭであった。
　図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅは、それぞれ、αＳＭＡ、コラーゲン　タイプＩ　α２（Ｃｏｌ１α２）、コラーゲン　タイプＩ　α１（Ｃｏｌ１α１）遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅに示すように、実施例１の化合物を５ｍｇ／ｋｇ投与した群において、αＳＭＡ、コラーゲン　タイプＩ　α２、コラーゲン　タイプＩ　α１遺伝子の発現量が有意に低下することが明らかとなった。
［実験例２０］
（実施例１の化合物の連日投与実験）
　連日１９時にマウスに実施例１の化合物（５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。化合物の投与開始から２１日後に血液を採取し、薬物投与から２４時間後の化合物の血中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い測定した。対照としては、通常の飼料を与え、０．５％ＤＭＳＯを添加した水を化合物と同容量経口投与したマウスを使用した。
　図１９は実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。図１９に示すように、実施例１の化合物の平均血中濃度は、０．８ｎＭであった。
［実験例２１］
（実施例１の化合物の血中濃度の測定）
　ＩＣＲマウスに実施例１の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ）を背部皮下投与した。化合物の投与から０．５、１、２、４、６、１２及び２４時間後に血液を採取し、化合物の血中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。図２０は実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。
［実験例２２］
（ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの血清中ＡＬＴ活性に及ぼす化合物の影響の検討）
　ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を８０ｍｇ／Ｌの濃度で水に溶解したものを飲水として、ＩＣＲマウスに飲水投与し、肝臓に慢性的な炎症を起こした。また、ＤＥＮの飲水投与開始直後より実施例１０の化合物（ＮＳ－３－０８６）を１５ｍｇ／ｋｇ飲水投与させた群を用意した。対照群としては、飲水として水道水を与えた群を使用した。
　続いて、ＤＥＮの飲水投与開始から８週間後及び１２週間後に各群のマウスから尾採血し、血清中アラニン・アミノトランスフェーラーゼ（ＡＬＴ）活性を市販のキット（型式「トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー」、和光純薬工業社製）を用いて測定した。
　図２１Ａ及び図２１Ｂは、ＤＥＮの飲水投与開始から８週間後（図２１Ａ）及び１２週間後（図２１Ｂ）の血清中ＡＬＴ活性を示すグラフである。図２１Ａ及び図２１Ｂ中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は対照群の結果を示し、「ＤＥＮ」はＤＥＮ投与群の結果を示し、「ＤＥＮ＋実施例１０」は、ＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群の結果を示す。
　その結果、対照群と比較して、ＤＥＮ飲水群はＡＬＴ活性が有意に高いことが明らかとなった。また、ＤＥＮ飲水による血清中ＡＬＴ活性の上昇は、実施例１０の化合物を同時に投与することにより抑制されたことが明らかとなった。
　以上の結果は、ＤＥＮによる肝臓の炎症が、実施例１０の化合物の投与により抑制されたことを示す。
［実験例２３］
（Ｇ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量及び化合物の薬効に及ぼすＨｓｄ１７ｂ４ノックダウンの影響の検討）
　マウス肝癌由来細胞であるＨｅｐａ１－６細胞を２つに分け、一方にＨｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡを、他方に対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示す。また、対照ｓｉＲＮＡとしては市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、配列番号４にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。
　続いて、４８時間後に各細胞を回収し、全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量を定量した。
　図２２ＡはリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現が抑制されたことが確認された。
　続いて、化合物Ｎｏ．２の存在下（１０μＭ）又は非存在下（図２２Ｂ中、「ＤＭＳＯ」と示す。）において、Ｈｅｐａ１－６細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。続いて、４８時間後に各細胞を回収し、全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した。
　図２２ＢはリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、化合物Ｎｏ．２の存在下において、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量が有意に低下することが明らかとなった。更に、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、化合物Ｎｏ．２によるＧ０Ｓ２遺伝子の発現量の低下の効果が消失したことが明らかとなった。
　以上の結果より、化合物Ｎｏ．２は、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質を介してＧ０Ｓ２遺伝子の発現を制御していることが明らかとなった。
［実験例２４］
（Ｇ０Ｓ２　ｍＲＮＡ発現量に及ぼすＨｓｄ１７ｂ４遺伝子の過剰発現の影響の検討）
　マウス肝癌由来細胞であるＨｅｐａ１－６細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクター（Ｈｓｄ１７ｂ４－ｐｃＤＮＡ３．１）又は空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションした。
　続いて、４８時間後に各細胞を回収し、全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子又はＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した。
　図２３Ａ及び図２３ＢはリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２３ＡはＨｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量を定量した結果を示し、図２３ＢはＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した結果を示す。
　その結果、図２３Ａに示すように、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクターのトランスフェクションにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量が有意に上昇したことが確認された。また、図２３Ｂに示すように、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクターのトランスフェクションにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量が有意に上昇したことが明らかとなった。
　以上の結果より、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量は、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質を介して制御されていることが明らかとなった。
［実験例２５］
（Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域に及ぼす化合物の影響の検討）
　図２４に示すように、各長さのＧ０Ｓ２転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターを作製した。続いて、これらの発現ベクターをマウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼの安定発現細胞を作製した。
　続いて、各細胞の培地に、終濃度１０μＭの化合物Ｎｏ．２又はＤＭＳＯ（対照）を添加した。続いて、２４時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
　図２４は、各細胞のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｇ０Ｓ２転写活性調節領域に存在するＳＴＡＴ５／６結合領域がなくなると、化合物Ｎｏ．２の添加によるルシフェラーゼの発現抑制効果が低減することが明らかとなった。
　以上の結果より、化合物Ｎｏ．２は、ＳＴＡＴ５又はＳＴＡＴ６の転写を介して作用している可能性が考えられた。
［実験例２６］
（Ｇ０Ｓ２の転写活性に及ぼすＳＴＡＴ５の影響の検討）
　Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターと、ＳＴＡＴ５発現ベクター又は空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、対照）とを、マウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。続いて、２４時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
　図２５Ａは、Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の構造を示す図である。また、図２５Ｂは、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。その結果、対照群と比較して、ＳＴＡＴ５発現ベクターをトランスフェクションした細胞は、有意に高いルシフェラーゼ活性を示すことが明らかとなった。
　以上の結果より、Ｇ０Ｓ２遺伝子の転写活性は、ＳＴＡＴ５により直接制御されていることが明らかとなった。
［実験例２７］
（核内ＳＴＡＴ５タンパク質の存在量に及ぼす化合物の影響の検討）
　マウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞の培地に終濃度２．５、５、１０μＭの化合物Ｎｏ．２又はＤＭＳＯ（対照）を添加した。続いて、２４時間後に細胞を回収し、核内タンパク質を調製し、ウエスタンブロッティングによりＳＴＡＴ５タンパク質の存在量を測定した。
　図２６は、ウエスタンブロッティングの結果を示すグラフである。その結果、対照と比較して、化合物Ｎｏ．２を添加した細胞では、化合物Ｎｏ．２の用量依存的に核内ＳＴＡＴ５タンパク質の存在量が低下した。
　以上の結果より、化合物Ｎｏ．２は、核内ＳＴＡＴ５の存在量を調節することにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現を制御していることが明らかとなった。
［実験例２８］
（化合物Ｎｏ．２の血中及び肝臓中濃度の測定）
　マウスに化合物Ｎｏ．２（１５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。化合物Ｎｏ．２の投与から０分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間及び１２時間後に血液を採取し、化合物の血中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。また、化合物Ｎｏ．２の投与から０分、５分、１５分、３０分、１時間及び６時間後に肝臓を採取し、化合物の肝臓中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。
　図２７Ａは血液中の化合物Ｎｏ．２の濃度を示すグラフである。また、図２７Ｂは肝臓中の化合物Ｎｏ．２の濃度を示すグラフである。その結果、血液中の化合物Ｎｏ．２の濃度は投与後１５分目に最高濃度になり、肝臓中の化合物Ｎｏ．２の濃度は投与後５分目に最高濃度になることが明らかとなった。
［実験例２９］
（ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの肝臓に及ぼす化合物の影響の検討）
　ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を８０ｍｇ／Ｌの濃度で水に溶解したものを飲水として、ＩＣＲマウスに飲水投与し、肝臓に慢性的な炎症及び肝癌を発症させた。また、ＤＥＮの飲水投与開始直後より実施例１０の化合物（ＮＳ－３－０８６）を１５ｍｇ／ｋｇ飲水投与させた群を用意した。対照群としては、飲水として水道水を与えた群を使用した。
　続いて、ＤＥＮの飲水投与開始から１４週間後に各群のマウスをと殺し、肝臓を摘出して解析した。図２８Ａ、図２８Ｂ及び図２８Ｃは、ＤＥＮの飲水投与開始から１４週間後の肝臓の写真である。
　図２８Ａは対照群（図中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」と示す。）のマウスの肝臓の代表的な写真であり、図２８ＢはＤＥＮ飲水群（図中、「ＤＥＮ」と示す。）のマウスの肝臓の代表的な写真であり、図２８ＣはＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群（図中、「ＤＥＮ＋実施例１０」と示す。）のマウスの肝臓の代表的な写真である。
　その結果、対照群と比較して、ＤＥＮ飲水群のマウスの肝臓には、多数の腫瘍が認められ、また、肝臓の硬化が認められた。一方、ＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群のマウスの肝臓では、腫瘍の形成が抑制され、また、肝臓の硬化も抑制された。下記表１に、各群のマウスの肝臓中の腫瘍の数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　以上の結果は、ＤＥＮによる肝臓の癌化及び硬化が、実施例１０の化合物の投与により抑制されたことを示す。
　本発明によれば、新たな抗炎症剤を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　Ｇ０／Ｇ１　Ｓｗｉｔｃｈ　２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
  2. 　前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２遺伝子又はＨｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７－β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　４（Ｈｓｄ１７ｂ４）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸である、請求項１に記載の抗炎症剤。
  3. 　前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質である、請求項１に記載の抗炎症剤。
  4. 　前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の抗炎症剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ここで、Ｒ５は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
  5. 　前記Ｇ０Ｓ２阻害剤がＨｓｄ１７ｂ４に対する結合能を有する、請求項４に記載の抗炎症剤。
  6. 　鎮痛作用を示す、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
  7. 　被検物質の存在下で細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定する工程と、
    　前記発現量が、前記被検物質の非存在下における前記細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
  8. 　被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、
    　前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
  9. 　下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （ここで、Ｒ１０は炭素数１～３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは０～５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１～１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。Ｒ８がヘキシル基である場合、ｍは１～５の整数であり、ｍが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
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