WO2016120515A1 - Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón Download PDF

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kir
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interferon
seq
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Antonio RIVERO ROMÁN
Rafael GONZÁLEZ FERNÁNDEZ
Ángela María CAMACHO ESPEJO
Antonio RIVERO JUÁREZ
Mario FRÍAS CASAS
José PEÑA MARTÍNEZ
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology and clinical medicine. Specifically, it refers to a method of obtaining useful data to predict or predict the development of drug-induced thrombocytopenia, and even more specifically it refers to a method of obtaining useful data to predict or predict the development of drug-induced thrombocytopenia, during treatment with pegylated interferon alfa in individuals with hepatitis C virus (HCV) infection.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV infection is a global health problem that affects more than 170 million people (Hanafiah et al., 2013. Hepatology 57: 1333-42). After a first acute phase, 75% of patients will develop chronic infection, producing progressive liver fibrosis that, between 4-24% of these patients will evolve to liver cirrhosis, and a proportion that ranges between 0.7-23% ( In the context of the present invention, the coma is used to separate the whole number from its decimal part) will develop a hepatocarcinoma (Westbrook and Dusheiko, 2014. J. Hepatol. 61: S58-68].
  • Chronic HCV infection is a priority, since it reduces the incidence of liver decompensations and associated mortality (Morgan et al., 2013. Hepatology 52: 833-44).
  • IFN-Peg pegylated interferon
  • RBV ribavirin
  • FAD direct-acting antiviral drugs
  • Natural killer cell receptors Natural killer cell receptors (Natural NK Killers) (KIR receptors, Killer Immunoglobulin-like Receptors) are receptors on their surface associated with either the activation of these cells (S-KIR) or their inhibition (L-KIR) (Borrego et ai, 2002. Mol. Immunol. 38: 637-60).
  • S-KIR Natural NK Killers
  • L-KIR Low-KIR receptors
  • the presence of several KIR receptors (2DL2, 2DL3, 2DS1 2DS2 and 3DL1) has been associated with the degree of efficiency of HCV virus treatment (Suppiah et al., 201 1. PLoS Medicine 8: e1001092).
  • thrombocytopenia is any disorder in which there is an abnormally low amount of platelets. This condition is sometimes associated with abnormal bleeding.
  • the 3 main causes of thrombocytopenia are (Weksler, 2009. Alimentar / Pharmacology &Therapeutics; 26 (Suppl. 1): 13-19):
  • Thrombocytopenia is a disease contemplated in orphanet, a portal dedicated to information on rare diseases and orphan drugs.
  • HCV Hepatitis C virus
  • a first aspect of the invention relates to the use of the KIR 2DL2 gene or the expression product of said gene, for obtaining useful data to predict or predict the development of interferon-induced thrombocytopenia, preferably alpha interferon, more preferably pegylated interferon.
  • alpha where the expression product of said gene is understood as the amino acid sequence that has a degree of identity with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 of, at least 85%, typically of, at least 90%, preferably of, at least 95%, more preferably, at least 98%, even more preferably, at least 99% or a nucleotide sequence encoding any of said amino acid sequences.
  • the KIR 2DL2 gene or the expression product of said gene is used in combination with the KIR 2DS2 gene, where by product of expression of said gene means an amino acid sequence that has a degree of identity with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably, at least 98%, even more preferably, at least 99% or a nucleotide sequence encoding any of said amino acid sequences.
  • a second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the development of thrombocytopenia induced by treatment with interferon, preferably interferon alpha, and optionally an antiviral drug, hereinafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from an individual, preferably blood, more preferably whole or peripheral blood; and b) detecting the expression or absence of expression of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 gene in the isolated sample (a), more preferably detecting the expression or absence of expression of the KIR 2DL2 gene and the KIR 2DS2 gene in the isolated sample (to). Where the expression or absence of expression of the KIR 2DL2 gene and / or of the KIR 2DS2 gene is determined through the detection of its expression products as defined in claims 1 and 2.
  • a third aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the development of thrombocytopenia induced by interferon treatment, preferably alpha interferon, more preferably pegylated interferon alpha, and optionally an antiviral drug, hereinafter second method of the invention.
  • step (a) which comprises steps (a) and (b) of the first method of the invention, and also comprises: c) classifying the individual from step (a), in the group of individuals with a relative risk at least 3 times greater to develop interferon-induced thrombocytopenia compared with the risk of said individual developing thrombocytopenia with an interferon-free treatment, if said individual exhibits the absence of expression of the KIR 2DL2 gene and / or the absence of expression of the KIR 2DS2 gene, preferably if said individual it presents the absence of expression of the KIR 2DL2 gene and the absence of expression of the KIR 2DS2 gene.
  • the interferon is pegylated interferon alpha.
  • a combination of drugs is administered, one of them being pegylated interferon alpha and at least one antiviral, preferably ribavirin.
  • a direct-acting antiviral drug is administered.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is a whole or peripheral blood sample.
  • the individual is infected by the hepatitis C virus, preferably genotype 1
  • step (b) is performed by PCR.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit or device, hereafter kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the expression products of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 genes, as these have been defined in the first aspect of the invention.
  • the kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID No 1 and / or SEQ ID No 3 as well. as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes, for subsequent amplification. by PCR. More preferably the sequences of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes are the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or against amino acid sequences presenting a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98%, even more preferably of at less than 99%
  • a fifth aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or mRNA of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 genes. More preferably the sequences of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes are the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • a sixth aspect of the invention relates to a protein microarray, hereafter referred to as a protein microarray of the invention, comprising antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98 %, even more preferably, of at least 99%.
  • the probes are antibodies fixed to glass slides and the targets are samples of serum or tissue.
  • a seventh aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention, the microarray, or the microarray of the invention, for obtaining useful data to predict or predict the development of interferon-induced thrombocytopenia, preferably interferon alpha, more preferably pegylated interferon alfa, and optionally an antiviral drug.
  • An eighth aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions for making a computer carry out the process according to any of the methods of the invention.
  • a ninth aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • a tenth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • Figure 3 Influence of KIR 2DL2 / 2DS2 in platelet descent during treatment.
  • Figure 4. Survival curve for the development of thrombocytopenia.
  • a first aspect of the invention relates to the use of the KIR 2DL2 gene or the expression product of said gene, for obtaining useful data to predict or predict the development of interferon-induced thrombocytopenia, preferably interferon alpha, where Expression product of said gene means the amino acid sequence that has a degree of identity with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95 %, more preferably, at least 98%, even more preferably, at least 99% or a nucleotide sequence encoding any of said amino acid sequences.
  • the KIR 2DL2 gene or the expression product of said gene is used in combination with the KIR 2DS2 gene, where the expression product of said gene is understood as the amino acid sequence having a degree of identity with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 of, at least 85%, typically of, at least 90%, preferably of, at least 95%, more preferably of, at least 98%, even more preferably of at least 99% or a nucleotide sequence encoding any of said amino acid sequences.
  • the drug administered is pegylated interferon alfa.
  • the individual has been administered a combination of drugs, one of them being pegylated interferon alpha and at least one antiviral, preferably ribavirin.
  • another direct acting antiviral drug is administered.
  • expression product also called “gene product” refers to the biochemical material, either RNA or protein, resulting from the expression of a gene. Sometimes a measure of the amount of gene product is used to infer how active a gene is.
  • a second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the development of thrombocytopenia induced by interferon treatment, preferably alpha interferon, more preferably pegylated alpha interferon and optionally an antiviral drug, hereinafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample from an individual, preferably blood, more preferably whole or peripheral blood; and b) detecting the expression or absence of expression of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 gene in the isolated sample (a), more preferably detecting the expression or absence of expression of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 gene in the isolated sample (a ).
  • Cox regression analysis only the absence of expression of the 2DS2 / 2DL2 KIRs was associated with thrombocytopenia development time (HR: 3,641; 95% CI: 1, 418-9,348).
  • the expression of both the KIR 2DL2 gene, and the KIR 2DS2 gene is detected simultaneously, to obtain useful data to predict or predict the development of drug-induced thrombocytopenia, the detection of the expression of any of them is informative.
  • the drug administered is pegylated interferon alfa.
  • the individual has been administered a combination of drugs, one of them being pegylated interferon alpha and at least one antiviral, preferably ribavirin.
  • another direct acting antiviral drug is administered.
  • a third aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting the development of thrombocytopenia induced by interferon treatment, preferably alpha interferon, more preferably alpha pegylated interferon and optionally an antiviral drug, hereinafter second method of The invention, which comprises steps (a) and (b) of the first method of the invention, and further comprises: c) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a relative risk at least 3 times higher of developing interferon-induced thrombocytopenia compared to the risk of said individual developing thrombocytopenia with an interferon-free treatment, if said individual exhibits the absence of expression of the KIR 2DL2 gene and / or the absence of expression of the KIR 2DS2 gene, preferably if said individual exhibits the absence of expression of the KIR 2DL2 gene and the absence of expression of the KIR 2DS2 gene.
  • individuals in whom the expression of the KIR 2DL2 gene and the KIR 2DS2 gene are not detected present a relative risk throughout the follow-up greater than 3 times the risk of the rest of patients , and more preferably at least 3.5 times higher (Cox regression).
  • individuals in whom the expression of 2DS2 / 2DL2 KIRs was not detected present a risk of at least 5 times greater, and more preferably at least 6 times greater than individuals in which it was detected.
  • individuals in whom the expression of 2DS2 / 2DL2 KIRs was not detected present a relative risk between 2 and 8 times higher than other individuals.
  • the gene expression product is present at a detectable level.
  • detectable level it is understood that the gene expression product can be detected using one of the standard laboratory methodologies, such as, but not limited to, PCR, blotting or FACS analysis.
  • a gene is considered to be expressed in a sample of the invention if the expression can be reasonably detected after 30 cycles of PCR.
  • the comparison between the level of expression of a gene in a sample of the invention, and the level of expression of the same gene in another sample, such as for example a positive or negative control, can preferably be carried out by comparing the two types of samples.
  • the interferon is pegylated interferon alpha.
  • a combination of drugs is administered, one of them being pegylated interferon alpha and at least one antiviral, preferably ribavirin.
  • a direct-acting antiviral drug is administered.
  • Interferon alfa IFN- ⁇
  • Pegylated IFN or IFN-Peg is obtained by the physicochemical binding of polyethylene glycol (PEG) to recombinant interferon alfa (peginterferon a-2a and a-2b), which increases its permanence in the blood requiring a lower frequency of injections.
  • peginterferon alfa-2a (Pegasys®, Roche) and peginterferon alfa-2b (Pegintron®, Schering-Plow). These two products are similar with respect to their efficacy and safety but their dosage regimens differ slightly.
  • Ribavirin ⁇ - ⁇ -D-ribofuranosyl-I Hl, 2,4-triazol-3-carboxamide
  • Ribavirin is a synthetic nucleotide analogous to guanidine, with antiviral properties and immunoregulatory activity. It was one of the first drugs that demonstrated its effectiveness in reducing the ability to reproduce viruses.
  • ribavirin derivatives, prodrugs or analogs of ribavirin are viramidine and levovirin.
  • Viramidine is a prodrug of RBV, in the liver it is converted to RBV by the action of hepatic adenosinedeaminase.
  • RBV and viramidine are rapidly eliminated, their molecules and metabolites are excreted by the kidney and have a Tmax of 1, 5-3 h.
  • hepatic retention of RBV derived from an oral dose of viramidine is 3 times higher than oral RBV.
  • the concentration of RBV phosphates in red blood cells is much lower, hence a more stable hemoglobin concentration can be maintained. It is a safe drug and is well tolerated.
  • the adverse effects with doses of 200, 600 and 1,200 mg were: 0, 26 and 50%, respectively; mostly mild and disappeared without sequelae.
  • Levovirin is the L-enantiomer of RBV and does not cause hemolytic anemia. It has an immunomodulatory activity similar to RBV, but it has no direct antiviral activity.
  • Ribavirin alone is not effective against HCV, but when combined with interferon, viral eradication rates are much better compared to those achieved only with interferon.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is a whole or peripheral blood sample.
  • the individual is infected by the hepatitis C virus, preferably genotype 1.
  • the hepatitis C virus belongs to group IV (single-stranded positive RNA virus), to the Flaviviridae family and to the genus Hepacivirus.
  • the detection of step (b) is performed by PCR.
  • the detection of the presence or absence of genotype expression can be performed by any means known in the state of the art.
  • KI Rs is understood as the immunoglobulin receptors of NK cells (in English, Killer Immunoglobulin-like Receptor, KI R).
  • the KI Rs are a family of cell surface proteins of the NK cells of the immune system. These receptors regulate the killer function of NK cells by interacting with MHC class I molecules. Most KI Rs are inhibitory, while very few are activators.
  • the KI R genes are polymorphic and highly homologous and are found in a cluster on chromosome 19q13.4. KI R molecules are highly polymorphic, so that individuals possess different sets of KI R genes.
  • the KIR2DL2 gene encodes a two domain KI R receptor with a long cytoplasmic tail.
  • the diseases associated with KIR2DL2 are recurrent respiratory papillomatosis and hematopoietic progenitor transplantation.
  • the LILRB4 gene is a paralog of the KIR2DL2 gene.
  • KIR2DL2 is a receptor in NK cells for allotypes HLA-Cw1, 3, 7 and 8. This receptor inhibits the activity of NK cells thus preventing cell lysis.
  • the KIR2DS2 gene encodes a two domain KI R receptor with a short cytoplasmic tail.
  • Diseases associated with KIR2DS2 include type I diabetes mellitus and cytomegalovirus infection.
  • KI R2DS2 is a receptor in N K cells for HLA-C alleles. This receptor does not inhibit the activity of NK cells.
  • KIR2DS2 KIR receiver 2 100132285 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
  • the KIR2DL2 and KIR2DS2 genes are also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the proteins collected respectively in Table 1, said proteins being the expression product of each of the genotypes identified in the table. Additionally, the present invention comprises several variants from each of the sequences identified in Table 1.
  • variants of the sequences associated with the KIR2DL2 gene comprise: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose chain complementary hybrid with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with a Identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2 shown in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids has the activity and structural characteristics of the KIR2DL2 proteins.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 1 indicated in Table 1.
  • variants of the sequences associated with the KIR2DL2 gene comprise: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 listed in Table 1. b) nucleic acid molecules whose chain complementary hybrid with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 4 collected in the Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KIR2DS2 proteins.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 3 indicated in Table 1.
  • thrombocytopenia is understood as any situation of decrease in the amount of circulating platelets in the bloodstream below normal levels, that is, with a platelet count of less than 100,000 / mm 3 . In general terms, normal values are between 150,000 / mm 3 and 450,000 / mm 3 platelets per cubic millimeter.
  • Thrombocytopenia can be caused by 3 mechanisms: decreased platelet production or abnormal platelet production, excessive accumulation of platelets in the spleen, decreased platelet survival.
  • drugs-induced thrombocytopenia drug-induced thrombocytopenia, idiopathic thrombocytopenic purpura and thrombocytopenic thrombotic purpura.
  • the therapeutic approach to thrombocytopenia is related to the type of thrombocytopenia.
  • steps (b) and / or (c) of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in step (b) or the computerized classification in the step (c).
  • drug refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • the disease is caused by infection of the hepatitis C virus.
  • An "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample is peripheral blood.
  • the term “individual” in this report is synonymous with “patient”, and is not intended to be limiting in any way, and may be of any age, sex and physical condition.
  • another aspect of the invention relates to a method for assigning a human individual with hepatitis C to one of two groups, hereinafter third method of the invention, in which group 1 comprises subjects identifiable by the first or second method of the invention (they have a higher relative risk of having thrombocytopenia in response to IFN treatment); and in which group 2 represents the rest of the subjects.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a drug other than IFN, preferably a direct acting drug, for use in the treatment of an individual with hepatitis C identifiable by the first or second method of the invention, or alternatively, to the use of a pharmaceutical composition comprising a drug other than IFN, preferably a direct acting drug, for the preparation of a medicament for the treatment of an individual with hepatitis C identifiable by the method according to the first or second method of the invention.
  • Drugs that can be used for the treatment of hepatitis C other than interferon are, but are not limited to, ribavirin, telaprevir, boceprevir, sofosbuvir, daclatasvir, or any combination thereof.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit or device, hereinafter kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the expression or absence of expression products of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 genes , as defined in the first aspect of the invention.
  • the kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID No 1 and / or SEQ ID No 3 as well. as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes, for subsequent amplification. by PCR. More preferably, the sequences of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes are the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • the kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or against amino acid sequences presenting a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98%, even more preferably of at less than 99%
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the oligonucleotide (s) are immobilized in spots on a (preferably solid) surface.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 gene. More preferably the sequences of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes are the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • a fifth aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or mRNA of the KIR 2DL2 and / or KIR 2DS2 genes. More preferably the sequences of the KIR 2DL2 and KIR 2DS2 genes are the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • a sixth aspect of the invention relates to a protein microarray, hereafter referred to as a protein microarray of the invention, comprising antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4o against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at least 98% , even more preferably, of at least 99%.
  • the probes are antibodies fixed to glass slides and the targets are samples of serum or tissue.
  • a seventh aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention, the microarray, or the microarray of the invention, for obtaining useful data to predict or predict the development of interferon-induced thrombocytopenia, preferably interferon alpha, and optionally an antiviral drug.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can implement the methods of the invention.
  • Such programs may have the form of source code, object code, an intermediate source of code and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in the implementation of the processes according to the invention .
  • Computer programs also cover cloud applications based on that procedure.
  • an eighth aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions to make a computer carry out the process according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be constituted by said cable or other device or means.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be incorporated into a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk Lasted.
  • a storage medium such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk Lasted.
  • the programs could be supported on a transmissible carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • a ninth aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • a tenth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit probe degradation; or as junction points for detectable debris or screening debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more modified, non-standard, derivatized base moieties, including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -tert-butyl-benzyl-adenine, imidazole, Substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5- chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylamino, dihydroxymethylamino, dihydroxymethylaminomethyl D- galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1- methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methylladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methyl
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar moieties including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinous, xylulose, and a hexose.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • the present invention means biologically active variant or fragment, those variants or fragments of the indicated peptides that have the same physiological, metabolic or immunological effect, or have the same utility as those described. That is, they are functionally equivalent. Such effects can be determined by conventional methods.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN, and FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
  • Subjects of study Patients co-infected with HIV / HCV, who receive a first treatment against HCV with INF-Peg / RBV. A common treatment and follow-up protocol is applied to these patients, in which samples are collected for HCV-RNA determination at weeks 1, 2, 4, 12, at the end of the treatment, and 24 weeks after the end of the treatment. . Additionally, a whole blood sample is collected, which is kept frozen at -80 ° C for genetic determinations.
  • HIV infection diagnosed by ELISA and Western-Blot or PCR 1. HIV infection diagnosed by ELISA and Western-Blot or PCR.
  • Exclusion criteria 1. Concomitant systemic disease.
  • Thrombocytopenia development defined as a total platelet count of less than 130,000 platelets / ml.
  • the degree of liver fibrosis will be determined by histological study of liver biopsy using the METAVIR scale. In those patients in whom liver biopsy was not indicated or rejected, the degree of liver fibrosis will be determined by determining liver stiffness by transient liver elastometry using FibroScan ® (Echosens, Paris). The determinations will be made by the same explorer, following the criteria of validity for the determinations. Absence of significant fibrosis (F0-F1 in METAVIR scale) will be considered a liver stiffness value less than 7.2 kPa, while a value greater than or equal to 7.2 kPa will be considered as significant fibrosis (F2-F4). Hepatic cirrhosis will be defined as a value of F4 in liver biopsy or a value greater than 14.5 kPa of liver stiffness.
  • the DNA was isolated by an automatic method (MaxwelITM 16 DNA purification KIT) following the manufacturer's instructions in the MaxwelITM 16 instrument (cat: AS1000).
  • KIR genotyping For the KIR genotyping, a PCR-SSP technique (KIR Genotyping Kit, Dynal Biotech, Pel-Freez Clinical Systems, Brown Deer, Wl, USA) was used. The kit was designed to identify 14 KIR genes (2DL1, 2DL2, 3DL1, 2DL4, 2DL5, 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5, 3DL1, 3DL2, 3DL3, 3DS1), 2 pseudogenes (2DP1 and 3DP1) and variants of KIR2DL5 (KIR2DL5A, KIR2DL5B), the KIR2DS4 alleles (* 001/002 and * 003) and KIR3DP1 alleles (* 001/002 and * 003).
  • Genotyping will be done following the manufacturer's instructions; Briefly, 25 ⁇ of DNA at a concentration of 75-125 ng / ⁇ with a ratio> 1.5 will be mixed with 150 ⁇ of PCR Buffer, 2.4 ⁇ of Taq polymerase and 85 ⁇ of distilled water. 8 ⁇ of this mixture is added to each of the plate cones containing the lyophilized primers except for the contamination control where the mixture without DNA is added. The genotyping will be carried out by the Immunology service of the Reina Sof ⁇ a University Hospital.
  • the PCR was performed under the following conditions:
  • Genotyping HLA Generic typing of HLA-A, B and Cw was performed by a PCR-SSO technique (Dynal RELITM SSO HLA-A, B or Cw Typing Kit from Dynal Biotech, Invitrogen, Bromborough, Wirral, United Kingdom).
  • the protocol suggested by the manufacturer and the reagents (initiators, buffer and enzyme) included in the commercial kit will be used. Briefly: 15 ⁇ of DNA (from a concentration of 13-15 ng / ml) are added to 30 ⁇ of master mix and 15 ⁇ of MgCI2.
  • the PCR conditions are as follows:
  • the amplification products were hybridized with pre-set probes in nylon strips (SSO-reverse) and subsequently this hybridization was developed by a color development reaction. Allelic allocation is based on the interpretation of the hybridization pattern with specific software. If this method did not allow us to discriminate between the two alleles or the generic typing was ambiguous, the high-resolution typing of the locus in question was carried out in these cases: "High resolution SSP Unitray, Dynal Biotech, Pelnal Freez Clinical Systems, Brown Deer, Wl , USES)". Genotyping was performed in the Immunology service of the Reina Sof ⁇ a University Hospital.
  • INF-Peg a2a or INF-Peg a2b All patients included in the cohort have been treated with INF-Peg a2a or INF-Peg a2b at a dose of 180 ⁇ g or 1.5 ⁇ g / kg per week respectively, in combination with oral weight-adjusted ribavirin (1000 mg / day for ⁇ 75Kg , 1200 mg / day for ⁇ 75 kg). Following international guidelines, patients with genotypes 1 received 48 weeks of treatment.
  • a specific database will be developed that includes as fields the primary variables and the rest of the variables that will be analyzed in the study.
  • a descriptive analysis of the data was carried out using exploration and analysis techniques of frequencies Continuous variables will be expressed as median (interquartile range) or mean ( ⁇ standard deviation), and categorical variables as cases (percentage).
  • the influence of the different KIRs and their ligands on platelet descent during treatment will be determined as well as the development of thrombocytopenia and time to the event.
  • a bivariate analysis was initially performed. In the bivariate analysis, the continuous variables will be compared using the Student's t test or the Mann-Whitney U test, if they do not follow a normal distribution or the variables are not similar. The categorical variables will be compared using the Chi-square test or the Fisher test, if any of the cells has an expected frequency of less than 5%.
  • a binary logistic regression model was performed to find variables potentially related to the development of thrombocytopenia.
  • the statistical package SPSS vs 18 (IBM Corporation, Somers, NY, USA) and GraphPad Prism version 6 (Mac OS X version; GraphPad Software; San Diego, California, USA) was used for the analysis.

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Abstract

Uso del gen KIR 2DL2y/o KIR 2DS2o de sus productos de expresión para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón, preferiblemente interferón pegilado alfa tras el tratamiento con dicho fármaco en individuos infectados por el virus de la hepatitis C, preferiblemente genotipo 1.

Description

Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la medicina clínica. Específicamente, se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por fármacos, y aún más específicamente se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por fármacos, durante el tratamiento con interferón pegilado alfa en individuos con infección por el virus de la hepatitis C (VHC).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La infección por el VHC es un problema de salud mundial que afecta a más de 170 millones de personas (Hanafiah et al., 2013. Hepatology 57: 1333-42). Tras una primera fase aguda, un 75% de los pacientes desarrollarán infección crónica, produciendo una fibrosis hepática progresiva que, entre el 4-24% de estos pacientes evolucionará hasta cirrosis hepática, y una proporción que oscila entre 0,7-23% (en el contexto de la presente invención la coma se utiliza para separar el numero entero de su parte decimal) desarrollará un hepatocarcinoma (Westbrook y Dusheiko, 2014. J. Hepatol. 61 : S58-68]. Por lo tanto, el tratamiento de la infección crónica por VHC es prioritario, ya que reduce la incidencia de descompensaciones hepáticas y la mortalidad asociada a ésta (Morgan et al., 2013. Hepatology 52: 833-44). Actualmente, se dispone de un gran arsenal terapéutico para el tratamiento de la infección crónica por VHC, constituido por interferón pegilado (IFN-Peg), ribavirina (RBV) y 6 fármacos antivirales de acción directa (FAD) (Recomendaciones para el tratamiento y manejo de la infección crónica por el Virus de la Hepatitis C de la Asociación Americana para el Estudio del Hígado (AASL) 2015. Disponible en http://www.hcvguidelines.org). Las guías de tratamiento contemplan el uso de diferentes combinaciones terapéuticas, incluyendo: IFN-Peg+RBV, IFN- Peg+RBV+FAD, y combinaciones de FAD libres de IFN-Peg (Recomendaciones para el tratamiento y manejo de la infección crónica por el Virus de la Hepatitis C de la Asociación Americana para el Estudio del Hígado (AASL). Última actualización del 9 de Enero del 2015. Disponible en http://www.hcvguidelines.org; Recomendaciones para el tratamiento y manejo de la infección crónica por el Virus de la Hepatitis C de la Asociación Europea para el Estudio de Enfermedades Hepáticas (EASLD) 2014. Disponible en http://files.easl.eu/easl- recommendations-on-treatment-of-hepatitis-C/index.html). La elección del régimen terapéutico depende de varios factores clínicos (genotipo viral y grado de fibrosis hepática) así como del coste y de la eficacia esperada. Los regímenes que incluyen interferón presentan mayor tasa de efectos adversos que provocan la retirada del tratamiento en una proporción no despreciable de pacientes (Mandorfer et al., 2014. Liver International 34: 69-77). Entre éstos destaca el desarrollo de trombocitopenia, un efecto adverso de manejo clínico complejo (Mann et al., 2014. J. Hepatology 61 : 482-91). Por lo tanto, la identificación de pacientes con mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia permitiría individualizar el tratamiento del VHC y evitaría la aparición de un efecto adverso potencialmente grave.
El empleo de marcadores genéticos para la toma de decisiones clínicas basadas en la eficacia terapéutica está ampliamente extendido en la actualidad. En este sentido, en el ámbito del tratamiento frente al VHC se han identificado varios genes asociados con la respuesta al tratamiento (IL28B, KIR 3DS1 , LDLr... ) (Rivero-Juarez, A. et al., 2012. J. Antimicrob. Chemother. 67: 202-5; Rivero-Juarez et al., 2012. AIDS 26: 1009-15; Rivero-Juarez et al., 2013. PLoS ONE 1 6; 8(4):e61992). Los receptores de las células asesinas naturales (NK del inglésNatural Killer) (receptores KIR del inglés, Killer Immunoglobulin-like Receptor) son receptores que se encuentran en su superficie asociados ya sea con la activación de estas células (S-KIR) o con su inhibición (L-KIR) (Borrego et ai, 2002. Mol. Immunol. 38: 637-60). La presencia de varios receptores KIR (2DL2, 2DL3, 2DS1 2DS2 y 3DL1) se ha asociado con el grado de eficiencia del tratamiento del virus VHC (Suppiah et al., 201 1. PLoS Medicine 8: e1001092). Así, la expresión de S-KIR en la superficie de la célula NK promueve la citolisis y la producción de IFN-gamma contra células diana que expresan específicamente ligandos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Borrego et al., 2002. Mol. Immunol. 38: 637- 60).
Hasta el momento, no se han identificado variaciones genéticas asociadas con la aparición de efectos adversos del INF. Por ello, el objetivo de nuestro estudio fue el evaluar variaciones genéticas relacionadas con la respuesta inmunológica innata (estimulada por INF) potencialmente asociadas con la aparición de trombocitopenia. La trombocitopenia es cualquier trastorno en el cual hay una cantidad anormalmente baja de plaquetas. Esta afección algunas veces se asocia con sangrado anormal. Las 3 causas principales de trombocitopenia son (Weksler, 2009. Alimentar/ Pharmacology & Therapeutics; 26 (Suppl. 1): 13-19):
1. Producción insuficiente de plaquetas en la médula ósea debido a: anemia aplásica, cáncer de médula ósea, deficiencia en folato, infecciones en médula ósea (poco común), síndrome mielodisplásico y/o deficiencia de vitamina B12.
2. Incremento de la descomposición de las plaquetas en el torrente sanguíneo.
3. Incremento de la descomposición de las plaquetas en el bazo o en el hígado. El uso de ciertos fármacos también puede llevar a una producción baja de plaquetas en la médula ósea. Algunos trastornos como la coagulación intra-vascular diseminada (CID), trombocitopenia inmunitaria o no inmunitaria inducida por medicamentos, hiperesplenismo, púrpura trombocitopénica inmunitaria (PTI) y púrpura trombocitopénica trombótica podrían aumentar la descomposición de las plaquetas. (Abrams CS. 201 1. Thrombocytopenia. In: Goldman L, Schafer Al, eds. Goldman's Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Saunders; chap. 175; Wong EY. 2012. Why does my patient have thrombocytopenia? Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 26: 231-252).
La trombocitopenia es una enfermedad contemplada en orphanet, un portal dedicado a la información sobre enfermedades raras y medicamentos huérfanos.
Los resultados de la presente invención permiten optimizar el tratamiento frente al virus de la Hepatitis C (VHC), permitiendo identificar dos grupos de pacientes:
1) Pacientes con un perfil genético asociado al desarrollo de trombocitopenia durante el tratamiento con interferón pegilado alfa; y 2) Pacientes con un perfil genético no asociado al desarrollo de trombocitopenia durante el tratamiento con interferón pegilado alfa.
La realización del genotipado de los genes KIRs 2DL2 y 2DS2 previa al inicio del tratamiento frente al VHC permite identificar pacientes con una alta probabilidad de efectos adversos al tratamiento con interferón, por lo que en este subgrupo de pacientes estaría recomendado el tratamiento basado en fármacos de acción directa frente al VHC libre de interferón. Este avance científico tiene aplicación en la práctica clínica en el campo de la "Medicina Predictiva y Personalizada".
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la invención se refiere al uso del gen KIR 2DL2 o del producto de expresión de dicho gen, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón, preferiblemente interferón alfa, ,más preferiblemente interferón pegilado alfa, donde por producto de expresión de dicho gen se entiende la secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoácidica SEQ ID NO: 2 de, al menos el 85%, típicamente de, al menos el 90%, preferiblemente de, al menos el 95%, más preferiblemente de, al menos el 98%, aún más preferiblemente de, al menos el 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el gen KIR 2DL2 o el producto de expresión de dicho gen se usa en combinación con el gen KIR 2DS2, donde por producto de expresión de dicho gen se entiende una secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoácidica SEQ ID NO: 4 de, al menos el 85%, típicamente de, al menos el 90%, preferiblemente de, al menos el 95%, más preferiblemente de, al menos el 98%, aún más preferiblemente de, al menos el 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por tratamiento con interferón, preferiblemente interferón alfa, y opcionalmente un fármaco antiviral, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, preferiblemente sangre, más preferiblemente sangre total o periférica; y b) detectar la expresión o la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2 en la muestra aislada (a), más preferiblemente detectar la expresión o la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y del gen KIR 2DS2 en la muestra aislada (a). Donde la expresión o ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o del gen KIR 2DS2 se determina a través de la detección de sus productos de expresión tal y como se han definido estos en las reivindicaciones 1 y 2.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por tratamiento con interferón, preferiblemente interferón alfa, más preferiblemente interferón pegilado alfa, y opcionalmente un fármaco antiviral, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención, y además comprende: c) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con un riesgo relativo al menos 3 veces mayor de desarrollar trombocitopenia inducida por interferón en comparación con el riesgo de que dicho individuo desarrolle trombocitopenia con un tratamiento libre de interferón, si dicho individuo presenta la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o la ausencia de expresión del gen KIR 2DS2, preferiblemente si dicho individuo presenta la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y la ausencia de expresión del gen KIR 2DS2. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el interferón es el interferón pegilado alfa.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, se administra una combinación de fármacos, siendo uno de ellos el interferón pegilado alfa y al menos un antiviral, preferiblemente ribavirina. En otra realización preferida, se administra un fármaco antiviral de acción directa.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de sangre total o periférica. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo (a) está infectado por el virus de la hepatitis C, preferiblemente genotipo 1
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los productos de expresión de los genes KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2, tal y como se han definido estos en el primer aspecto de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprende sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID No 1 y/o SEQ ID No 3 así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2, para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2 son las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:3, respectivamente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2. Más preferiblemente las secuencias de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2 son las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:3, respectivamente. Un sexto aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, la micromatriz, o el microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón, preferiblemente interferón alfa, más preferiblemente interferón pegilado alfa, y opcionalmente un fármaco antiviral.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Un décimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Influencia de KIR2DL2 en descenso plaquetario durante el tratamiento. Figura 2. Influencia de KIR2DS2 en descenso plaquetario durante el tratamiento.
Figura 3. Influencia de KIR 2DL2/2DS2 en descenso plaquetario durante el tratamiento. Figura 4. Curva de supervivencia para el desarrollo de trombocitopenia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han estudiado la importancia de los genes KIR en el desarrollo de trombocitopenia inducida por fármaco, específicamente inducida por interferón, preferiblemente interferón alfa, más preferiblemente interferón pegilado alfa.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso del gen KIR 2DL2 o del producto de expresión de dicho gen, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón, preferiblemente interferón alfa, donde por producto de expresión de dicho gen se entiende la secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoácidica SEQ ID NO: 2 de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el gen KIR 2DL2 o el producto de expresión de dicho gen se usa en combinación con el gen KIR 2DS2, donde por producto de expresión de dicho gen se entiende la secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoácidica SEQ ID NO: 4 de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas.
El uso combinado de ambos genes tiene un mayor poder predictivo, sin embargo, el uso independiente cualquiera de ellos podría ser suficiente para la predicción o pronóstico del desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el fármaco administrado es el interferón pegilado alfa.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, al individuo se le ha administrado una combinación de fármacos, siendo uno de ellos el interferón pegilado alfa y al menos un antiviral, preferiblemente ribavirina. En otra realización preferida se administra otro fármaco antiviral de acción directa.
El término "producto de expresión", también denominado "producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultando de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por tratamiento con interferón, preferiblemente interferón alfa, más preferiblemente interferón pegilado alfa y opcionalmente un fármaco antiviral, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, preferiblemente sangre, más preferiblemente sangre total o periférica; y b) detectar la expresión o la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2 en la muestra aislada (a), más preferiblemente detectar la expresión o la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y KIR 2DS2 en la muestra aislada (a).
Donde la expresión o ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o del gen KIR 2DS2 se determina a través de la detección de sus productos de expresión tal y como se han definido estos en los párrafos precedentes, en particular en las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO:4.
Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, en los individuos incluidos en el estudio con ausencia de expresión de los genes KIRs 2DL2/2DS2, el tiempo de desarrollo de trombocitopenia fue inferior (7,5 semanas; IC 95%: 5,7 semanas- 9,43 semanas) que aquellos que presentaron al menos expresión de 1 de estos KIRs (10,3 semanas; IC 95%: 9,05 semanas-1 1 ,71 semanas) (Long-rank: p = 0.008) (Figura 4). Mediante análisis de regresión de Cox, solo la ausencia de expresión de los KIRs 2DS2/2DL2 se asoció con tiempo de desarrollo de trombocitopenia (HR: 3,641 ; IC 95%: 1 ,418-9,348).
Aunque preferiblemente se detecta la expresión tanto del gen KIR 2DL2, como del gen KIR 2DS2 simultáneamente, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por fármaco la detección de la expresión de cualquiera de ellos resulta informativo.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el fármaco administrado es el interferón pegilado alfa.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, al individuo se le ha administrado una combinación de fármacos, siendo uno de ellos el interferón pegilado alfa y al menos un antiviral, preferiblemente ribavirina. En otra realización preferida se administra otro fármaco antiviral de acción directa.
Por tanto, un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por tratamiento con interferón, preferiblemente interferón alfa, más preferiblemente interferón pegilado alfa y opcionalmente un fármaco antiviral, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención, y además comprende: c) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con un riesgo relativo al menos 3 veces mayor de desarrollar trombocitopenia inducida por interferón en comparación con el riesgo de que dicho individuo desarrolle trombocitopenia con un tratamiento libre de interferón, si dicho individuo presenta la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o la ausencia de expresión del gen KIR 2DS2, preferiblemente si dicho individuo presenta la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y la ausencia de expresión del gen KIR 2DS2.
Tal como se indica en los ejemplos de la invención, los individuos en los que no se detecta la expresión del gen KIR 2DL2 y del gen KIR 2DS2, presentan un riesgo relativo a lo largo del seguimiento superior a 3 veces el riesgo del resto de pacientes, y más preferiblemente de al menos 3,5 veces superior (regresión Cox). Con respecto al análisis de regresión logística (a tiempo final), los individuos en los que no se detectó la expresión de KIRs 2DS2/2DL2 presentan un riesgo de al menos 5 veces mayor, y más preferiblemente de al menos 6 veces mayor que los individuos en los que se detectó. En otra realización más preferida, los individuos en los que no se detectó la expresión de KIRs 2DS2/2DL2 presentan un riesgo relativo de entre 2 y 8 veces superior al del resto de individuos.
Aunque preferiblemente se detecta la expresión o ausencia de expresión tanto del gen KIR 2DL2 como del gen KIR 2DS2 simultáneamente, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por fármaco, la detección de cualquiera de ellos resulta informativo.
En el contexto de la presente invención por expresión se entiende que el producto de expresión del gen esté presente a un nivel detectable. Por "nivel detectable" se entiende que el producto de expresión del gen se puede detectar usando una de las metodologías de laboratorio estándar, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, PCR, blotting o el análisis FACS. Un gen se considera que está expresado en una muestra de la invención si la expresión se puede detectar razonablemente después de 30 ciclos de PCR. La comparación entre el nivel de expresión de un gen en una muestra de la invención, y el nivel de expresión del mismo gen en otra muestra, tal como por ejemplo una control positivo o negativo, pueden llevarse a cabo preferentemente mediante la comparación de los dos tipos de muestras. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el interferón es el interferón pegilado alfa.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, se administra una combinación de fármacos, siendo uno de ellos el interferón pegilado alfa y al menos un antiviral, preferiblemente ribavirina. En otra realización preferida, se administra un fármaco antiviral de acción directa. El "interferón alfa" (IFN-α) es una citocina inmunomoduladora que posee actividad antiviral, propiedades antiangiogénicas y antiproliferativas. El IFN pegilado o IFN-Peg se obtiene mediante la unión fisicoquímica de polietilenglicol (PEG) al interferón alfa (peginterferón a-2a y a-2b) recombinante, lo que aumentan su permanencia en la sangre requiriendo menor frecuencia de inyecciones.
Actualmente existen dos tipos de interferones pegilados comerciales cuya aplicación se ha extendido: peginterferón alfa-2a (Pegasys®, Roche) y peginterferón alfa-2b (Pegintron®, Schering-Plough). Estos dos productos son semejantes con respecto a su eficacia y seguridad pero sus regímenes de dosificación difieren levemente. La ribavirina (Ι-β-D-ribofuranosil-I H-l , 2,4-triazol-3-carboxamida) es un nucleótido sintético análogo de la guanidina, con propiedades antivirales y actividad inmunorreguladora. Fue una de las primeras drogas que demostró su eficacia para reducir la capacidad de reproducción de virus. Está descrita en el índice Merck, compuesto N 0 8199, undécima edición. Su fabricación y formulación se describen en la patente de EE.UU. n. No. 4.211.771. La rápida captación eritrocitaria de la ribavirina y su fosforilación son responsables de la importante anemia hemolítica dependiente de la dosis. Con el fin de evitar este efecto indeseado, el diseño de los nuevos fármacos contempla que no sean captados o fosforilados por los eritrocitos o que sean captados rápidamente y fosforilados en el hígado. Ambos enfoques tienen la desventaja potencial de que pueden anular pasos fundamentales que contribuyen con la eficacia terapéutica de la ribavirina.
Otros derivados, profármacos o análogos de la ribavirina son la viramidina y la levovirina.
La viramidina es un profármaco de la RBV, en el hígado se convierte en RBV por acción de la adenosindeaminasa hepática. La RBV y viramidina son rápidamente eliminadas, sus moléculas y los metabolitos son excretados por el riñon y tienen una Tmáx de 1 ,5-3 h. Experimentalmente, la retención hepática de la RBV derivada de una dosis oral de viramidina es 3 veces mayor que la RBV oral. En cambio, la concentración de fosfatos de RBV en los hematíes es mucho menor, de ahí que se pueda mantener una concentración más estable de hemoglobina. Es un fármaco seguro y se tolera bien. Los efectos adversos con dosis de 200, 600 y 1.200 mg fueron: 0, 26 y 50%, respectivamente; la mayoría leves y desaparecieron sin secuelas.
La levovirina es la L-enantiomero de la RBV y no origina anemia hemolítica. Tiene una actividad inmunomoduladora similar a la RBV, pero no tiene actividad antiviral directa.
Otros posibles análogos se describen, por ejemplo, pero sin limitarnos a, en la patente WO 2010/135520. La ribavirina por sí sola no es eficaz contra el VHC, pero cuando se la combina con interferón, los índices de erradicación viral son mucho mejores comparados con aquellos logrados solamente con interferón.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de sangre total o periférica.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo (a) está infectado por el virus de la hepatitis C, preferiblemente genotipo 1 .
El virus de la hepatitis C pertenece al grupo IV (virus de ARN monocatenario positivo), a la familia Flaviviridae y al género Hepacivirus. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR.
La detección de la presencia o ausencia de expresión de los genotipos puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica.
En esta memoria se entiende por KI Rs, a los receptores tipo inmunoglobulinas de las células NK (en inglés, Killer Immunoglobulin-like Receptor, KI R). Los KI Rs son una familia de proteínas de la superficie celular de las células NK del sistema inmune. Estos receptores regulan la función asesina de las células NK mediante la interacción con moléculas del MHC de clase I. La mayoría de los KI R son inhibitorios, mientras muy pocos son activadores. Los genes KI R son polimórficos y altamente homólogos y se encuentran en un clúster en el cromosoma 19q13.4. Las moléculas KI R son altamente polimórficas, de manera que los individuos poseen diferentes conjuntos de genes KI R.
El gen KIR2DL2 codifica para un receptor KI R de dos dominios y de cola citoplasmática larga. Las enfermedades asociadas con KIR2DL2 son la papilomatosis respiratoria recurrente y en el trasplante progenitores hematopoyéticos. El gen LILRB4 es un parálogo del gen KIR2DL2. KIR2DL2 es receptor en las células NK para los alotipos HLA-Cw1 , 3, 7 y 8. Este receptor inhibe la actividad de las células NK evitando de esta manera la lisis celular.
Por otro lado, el gen KIR2DS2 codifica para un receptor KI R de dos dominios y de cola citoplasmática corta. Las enfermedades asociadas con KIR2DS2 incluyen la diabetes mellitus tipo I y la infección por citomegalovirus. KI R2DS2 es receptor en las células N K para los alelos HLA-C. Este receptor no inhibe la actividad de las células NK.
Tabla 1. Secuencias de la invención
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KIR2DL2 receptor KIR de 2 3803 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2
dominios y de cola
citoplasmática larga
KIR2DS2 receptor KIR de 2 100132285 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
dominios y de cola
citoplasmática corta
En el contexto de la presente invención, los genes KIR2DL2 y KIR2DS2 se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de las proteínas recogidas respectivamente en la Tabla 1 , siendo dichas proteínas el producto de expresión de cada uno de los genotipos identificados en la tabla. Adicionalmente la presente invención comprende diversas variantes procedentes de cada una de las secuencias identificadas en la tabla 1.
En este sentido, variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL2 comprenden: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ I D NO:2 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de las proteína KIR2DL2. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 1 indicada en la Tabla 1.
En este sentido, variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL2 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 4 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ I D NO:4 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de las proteína KIR2DS2. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO:3 indicada en la Tabla 1.
SEQ ID No 1 : cgcggccgcc tgtctgcaca gacagcacca tgtcgctcat ggtcgtcagc atggcgtgtg ttgggttctt cttgctgcag ggggcctggc cacatgaggg agtccacaga aaaccttccc tcctggccca cccaggtcgc ctggtgaaat cagaagagac agtcatcctg caatgttggt cagatgtcag gtttgagcac ttccttctgc acagagaagg gaagtttaag gacactttgc acctcattgg agagcaccat gatggggtct ccaaagccaa cttctccatc ggtcccatga tgcaagacct tgcagggacc tacagatgct acggttctgt tactcactcc ccctatcagt tgtcagctcc cagtgaccct ctggacatcg tcatcacagg tctatatgag aaaccttctc tctcagccca gccgggcccc acggttctgg caggagagag cgtgaccttg tcctgcagct cccggagctc ctatgacatg taccatctat ccagggaggg ggaggcccat gaatgtaggt tctctgcagg gcccaaggtc aacggaacat tccaggccga ctttcctctg ggccctgcca cccacggagg aacctacaga tgcttcggct ctttccgtga ctctccatac gagtggtcaa actcgagtga cccactgctt gtttctgtca caggaaaccc ttcaaatagt tggccttcac ccactgaacc aagctctaaa accggtaacc cccgacacct gcacattctg attgggacct cagtggtcat catcctcttc atcctcctct tctttctcct tcatcgctgg tgctccaaca aaaaaaatgc tgcggtaatg gaccaagagt ctgcagggaa cagaacagcg aatagcgagg actctgatga acaagaccct caggaggtga catacacaca gttgaatcac tgcgttttca cacagagaaa aatcactcgc ccttctcaga ggcccaagac acccccaaca gatatcatcg tgtacacgga acttccaaat gctgagtcca gatccaaagt tgtctcctgc ccatgagcac cacagtcagg ccttgagggc gtcttctagg gagacaacag ccctgtctca aaaccgggtt gccagctccc atgtaccagc agctggaatc tgaaggcatg agtctgcatc ttagggcatc gctcttcctc acaccacaaa tctgaatgtg cctctcactt gcttacaaat gtctaaggtc cccactgcct gctggagaaa aaacacactc ctttgcttag cccacagttc tccatttcac ttgacccctg cccacctctc caacctaact ggcttacttc ctagtctact tgaggctgca atcacactga ggaactcaca attccaaaca tacaagaggc tccctcttaa cgcagcactt agacacgtgt tgttccacct tccctcatgc tgttccacct cccctcagac tagctttcag tcttctgtca gcagtaaaac ttatatattt tttaaaataa cttcaatgta gttttccatc cttcaaataa acatgtctgc ccccatg
SEQ ID No 2: Met Ser Leu Met Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Phe Phe Leu Leu Gln Gly Ala Trp Pro His Glu Gly Val His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala His Pro Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Glu Thr Val lie Leu Gln Cys Trp Ser Asp Val Arg Phe Glu His Phe Leu Leu His Arg Glu Gly Lys Phe Lys Asp Thr Leu His Leu lie Gly Glu His His Asp Gly Val Ser Lys Ala Asn Phe Ser lie Gly Pro Met Met Gln Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp lie Val lie Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Ala Gly Glu Ser Val Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu Ser Arg Glu Gly Glu Ala His Glu Cys Arg Phe Ser Ala Gly Pro Lys Val Asn Gly Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg Asp Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro Arg His Leu His lie Leu lie Gly Thr Ser Val Val lie lie Leu Phe lie Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Ser Ala Gly Asn Arg Thr Ala Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Thr Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys lie Thr Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp lie lie Val Tyr Thr Glu Leu Pro Asn Ala Glu Ser Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro
SEQ I D No 3: ctggggcgcg gccgcctgtc tgcacagaca gcaccatgtc gctcatggtc gtcagcatgg cgtgtgttgg gttcttcttg ctgcaggggg cctggccaca tgagggagtc cacagaaaac cttccctcct ggcccaccca ggtcccctgg tgaaatcaga agagacagtc atcctgcaat gttggtcaga tgtcaggttt gagcacttcc ttctgcacag agaggggaag tataaggaca ctttgcacct cattggagag caccatgatg gggtctccaa ggccaacttc tccatcggtc ccatgatgca agaccttgca gggacctaca gatgctacgg ttctgttact cactccccct atcagttgtc agctcccagt gaccctctgg acatcgtcat cacaggtcta tatgagaaac cttctctctc agcccagccg ggccccacgg ttttggcagg agagagcgtg accttgtcct gcagctcccg gagctcctat gacatgtacc atctatccag ggagggggag gcccatgaac gtaggttctc tgcagggccc aaggtcaacg gaacattcca ggccgacttt cctctgggcc ctgccaccca cggaggaacc tacagatgct tcggctcttt ccgtgactct ccctatgagt ggtcaaactc gagtgaccca ctgcttgttt ctgtcacagg aaacccttca aatagttggc cttcacccac tgaaccaagc tccaaaaccg gtaaccccag acacctgcat gttctgattg ggacctcagt ggtcaaaatc cctttcacca tcctcctctt ctttctcctt catcgctggt gctccaacaa aaaaaatgct gctgtaatgg accaagagcc tgcagggaac agaacagtga acagcgagga ttctgatgaa caagaccatc aggaggtgtc atacgcataa ttggatcact gtgttttcac acagagaaaa atcactcgcc cttctgagag gcccaagaca cccccaacag ataccagcat gtacatagaa cttccaaatg ctgagcccag atccaaagtt gtcttctgtc cacgagcacc acagtcaggc cttgagggga tcttctaggg agacaacagc cctgtctcaa aaccgggttg ccagctccca tgtaccagca gctggaatct gaaggcatca gtcttcatct tagggcatcg ctcttcctca caccacgaat ctgaacatgc ctctctcttg cttacaaatg tctaaggtcc ccactgcctg ctggagagaa aacacactcc tttgcttagc ccacaattct ccatttcact tgacccctgc ccacctctcc aacctaactg gcttacttcc tagtctacct gaggctgcaa tcacactgag gaactcacaa ttccaaacat acaagaggct gcctcttaac acagcactta gacacgtgct gttccacctc ccttcagact atctttcagc cttctgccagcagtaaaact tataaatttt ttaaataatt tcaatgtagt tttcccgcct tcaaataaac atgtctgccc tcatgaaa
SEQ ID No 4: Met Ser Leu Met Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Phe Phe Leu Leu Gln Gly Ala Trp Pro His Glu Gly Val His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Glu Glu Thr Val lie Leu Gln Cys Trp Ser Asp Val Arg Phe Glu His Phe Leu Leu His Arg Glu Gly Lys Tyr Lys Asp Thr Leu His Leu lie Gly Glu His His Asp Gly Val Ser Lys Ala Asn Phe Ser lie Gly Pro Met Met Gln Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp lie Val lie Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Ala Gly Glu Ser Val Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu Ser Arg Glu Gly Glu Ala His Glu Arg Arg Phe Ser Ala Gly Pro Lys Val Asn Gly Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg Asp Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro Arg His Leu His Val Leu lie Gly Thr Ser Val Val Lys lie Pro Phe Thr lie Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala
En esta memoria se entiende por trombocitopenia a cualquier situación de disminución de la cantidad de plaquetas circulantes en el torrente sanguíneo por debajo de los niveles normales, es decir, con un recuento plaquetario inferior a 100.000/mm3. En términos generales, los valores normales se ubican entre 150.000/mm3 y 450.000/mm3 plaquetas por milímetro cúbico. La trombocitopenia puede producirse por 3 mecanismos: disminución de la producción de plaquetas o producción de plaquetas anómalas, acumulación excesiva de plaquetas en el bazo, disminución de la supervivencia de las plaquetas. Existen varios tipos de trombocitopenia: Trombocitopenia inducida por fármacos, púrpura trombocitopénica idiopática y púrpura trombótica trombocitopénica. El abordaje terapéutico de la trombocitopenia está relacionado con el tipo de trombocitopenia.
Los pasos (b) y/o (c) del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
El término "fármaco", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es producida por la infección del virus de la hepatitis C. Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es sangre periférica.
El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
USO MÉDICO EN UN GRUPO DE PACIENTES
Los autores de la presente invención han identificado, por tanto, un nuevo subgrupo de pacientes que se beneficiarán de un tratamiento alternativo a la hepatitis C que no comprenda interferón, sino que emplee otros fármacos de los denominados de acción directa.
Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo humano con hepatitis C a uno de dos grupos, de ahora en adelante tercer método de la invención, en el que el grupo 1 comprende sujetos identificables por el primer o segundo método de la invención (tienen un mayor riesgo relativo a tener trombocitopenia en respuesta al tratamiento con IFN); y en el que el grupo 2 representa el resto de los sujetos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco distinto del IFN, preferiblemente un fármaco de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con hepatitis C identificable por el primer o segundo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco distinto del IFN, preferiblemente un fármaco de acción directa ,para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con hepatitis C identificable por el método de acuerdo con el primer o segundo método de la invención. Fármacos que pueden emplearse para el tratamiento de la hepatitis C distintos del interferón son, entre otros, pero sin limitarnos a, ribavirina, telaprevir, boceprevir, sofosbuvir, daclatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.
KIT O DISPOSITIVO Y MICRO ARRAY DE LA INVENCIÓN
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los productos de expresión o ausencia de expresión de los genes KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2, tal y como se han definido estos en el primer aspecto de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleótidicas, que comprende sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID No 1 y/o SEQ ID No 3 así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2, para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2 son las secuencias nucleótidicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:3, respectivamente. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias del gen KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2. Más preferiblemente las secuencias de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2 son las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes KIR 2DL2 y/o KIR 2DS2. Más preferiblemente las secuencias de los genes KIR 2DL2 y KIR 2DS2 son las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ I D NO: 4o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, la micromatriz, o el microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón, preferiblemente interferón alfa, y opcionalmente un fármaco antiviral.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento. Por tanto, un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
Por tanto, un noveno aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Un décimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6- terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA).
Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. EJEMPLO DE LA INVENCIÓN
MATERIAL Y MÉTODOS
Diseño del estudio: Estudio piloto prospectivo de cohortes. Ámbito del estudio: Unidad de Enfermedades Infecciosas del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba y Unidad de Inmunología del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba.
Sujetos de estudio: Pacientes co-infectados por el VIH/VHC, que reciben un primer tratamiento frente a VHC con INF-Peg/RBV. A estos pacientes se les aplica un protocolo de tratamiento y seguimiento común, en el que se recogen muestras para determinación de ARN-VHC en las semanas 1 , 2, 4, 12, al finalizar del tratamiento, y 24 semanas después de finalizado el mismo. Adicionalmente, se recoge una muestra de sangre total, que se mantiene congelada a -80 °C para determinaciones genéticas.
Los pacientes en la cohorte han sido incluidos con los siguientes criterios de inclusión/exclusión: Inclusión:
1. Infección por el VIH diagnosticada mediante ELISA y Western-Blot o PCR.
2. Mayores de 18 años.
3. Infección confirmada por VHC genotipo 1.
4. ARN-VHC detectable en sangre periférica 5. No tratamiento previo para el VHC.
6. Recomendación de inicio de tratamiento según las guías de práctica clínica (Ghany MG., Strader DB., Thomas DL., Seeff LB. Diagnosis, Management and Treatment of hepatitis C: An update. AASLD Practice Guidelines. Hepatology 2009; 49; 1335-1374)
Criterios de exclusión: 1. Enfermedad sistémica concomitante.
2. Embarazo.
3. Presencia de HsAg positivo. 4. Realización previa de tratamiento para el VHC incluyendo interferón en monoterapia o en cualquier otro régimen.
Variables e instrumentos de medida:
Variable desenlace primaria: Desarrollo de trombocitopenia, definido como recuento plaquetario total inferior a 130.000 plaquetas/ml.
Variable desenlace secundaria: descenso plaquetario desde el momento basal de tratamiento hasta las semanas 1 , 2, 4, 8 y 12 de tratamiento.
Determinación de la cinética plaquetaria durante el tratamiento:
1. Determinación del recuento plaquetario: el recuento total plaquetario fue determinado por la Unidad de Hematología del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba siguiendo la técnica rutinaria.
2. Puntos de determinación del recuento plaquetario: En todos los pacientes, además de la determinación basal, se realizó la determinación del recuento plaquetario en las semanas 1 , 2, 4, 8 y 12 tras inicio del tratamiento, siguiendo práctica clínica habitual. 3. Determinación del descenso plaquetario: Se calculó el descenso plaquetario entre el recuento basal y el recuento en las semanas 1 , 2, 4, 8 y 12 tras inicio del tratamiento. Se expresó el descenso plaquetario como plaquetas/ml.
Criterios de determinación de las VARIABLES:
Determinación del grado de Fibrosis hepática: El grado de fibrosis hepática se determinará mediante estudio histológico de biopsia hepática mediante escala METAVIR. En aquellos pacientes en los que la biopsia hepática no estuviese indicada o rechazase, se determinará el grado de fibrosis hepática mediante la determinación de la rigidez hepática mediante elastometría hepática transitoria usando FibroScan® (Echosens, París). Las determinaciones serán realizadas por un mismo explorador, siguiendo los criterios de validez para las determinaciones. Se considerará ausencia de fibrosis significativa (F0-F1 en escala METAVIR) un valor de rigidez hepática inferior a 7,2 kPa, mientras que un valor superior o igual a 7,2 kPa se considerará como fibrosis significativa (F2-F4). Se definirá cirrosis hepática como un valor de F4 en biopsia hepática o un valor superior a 14,5 kPa de rigidez hepática.
Almacenaje de las muestras El almacenaje de las muestras, hasta la determinación de los receptores KIR y su ligando, se realizó en el Biobanco del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta realización del genotipado de los KIRs. Aislamiento de ADN
El ADN se aisló mediante un método automático (MaxwelITM 16 DNA purificación KIT) siguiendo las instrucciones del fabricante en el MaxwelITM 16 instrument (cat: AS1000).
Genotido de KIRs Para el genotipaje de KIR se usó una técnica de PCR-SSP (KIR Genotyping Kit, Dynal Biotech, Pel-Freez Clinical Systems, Brown Deer, Wl, USA). El kit fue diseñado para identificar 14 KIR genes (2DL1 , 2DL2, 3DL1 , 2DL4, 2DL5, 2DS1 , 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5, 3DL1 , 3DL2, 3DL3, 3DS1), 2 pseudogenes (2DP1 and 3DP1) y las variantes de KIR2DL5 (KIR2DL5A, KIR2DL5B), el KIR2DS4 alelos (*001/002 y *003) y KIR3DP1 alelos (*001/002 and *003). El genotipaje se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante; brevemente, 25 μΙ de DNA a una concentración de 75-125 ng/μΙ con ratio > 1 ,5 se mezclarán con 150 μΙ de PCR Buffer, 2,4 μΙ de Taq polimerasa y 85 μΙ de agua destilada. 8 μΙ de esta mezcla se añaden a cada uno de los conillos de la placa que contiene los primers liofilizados excepto para el control de contaminación donde se añade la mezcla sin ADN. El genotipado será realizado por el servicio de Inmunología del Hospital Universitario Reina Sofía.
La PCR se realizó bajo las siguientes condiciones:
- 1 minuto a 95°C
- 30 ciclos de: 20 segundos a 94°C # 20 segundos a 63°C # 90 segundos a 72°C.
- Al final se mantendrá una temperatura de 4 °C . - Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis (120 voltios durante 20 min) en un gel de agarosa al 2%.
- El resultado fue chequeado en un transiluminador UV y fotografiado. El tipaje fue interpretado mediante un software específico.
Genotipado HLA El tipaje genérico de HLA-A, B y Cw se realizó por una técnica de PCR-SSO (Dynal RELITM SSO HLA-A, B o Cw Typing Kit de Dynal Biotech, Invitrogen, Bromborough, Wirral, Reino Unido). Se empleará el protocolo sugerido por el fabricante, y los reactivos (iniciadores, tampón y enzima) incluidos en el kit comercial. Brevemente: 15 μί de ADN (de una concentración de 13-15 ng/ml) se añaden a 30 μΙ de master mix y 15 μΙ de MgCI2. Las condiciones de PCR son las siguientes:
- 35 ciclos: 15 segundos a 95 °C, 45 segundos a 60 °C, 15 segundos a 72 °C y - 5 min a 72 °C
- Se mantiene a 15 °C hasta su uso posterior.
Los productos de amplificación se hibridaron con sondas prefijadas en tiras de nylon (SSO- reverso) y posteriormente se procedió al revelado de esta hibridación por una reacción de desarrollo de color. La asignación alélica se basa en la interpretación del patrón de hibridación con un software específico. Si este método no nos permitió discriminar los dos alelos o el tipaje genérico resultó ambiguo se procedió en estos casos al tipaje de alta resolución del locus en cuestión: "High resolution SSP Unitray, Dynal Biotech, Pel-Freez Clinical Systems, Brown Deer, Wl, USA)". El genotipado se realizó en el servicio de Inmunología del Hospital Universitario Reina Sofía.
Régimen terapéutico:
Todos los pacientes incluidos en la cohorte han sido tratados con INF-Peg a2a o INF-Peg a2b a dosis de 180 μg o 1.5 μg/kg por semana respectivamente, en combinación con ribavirina oral ajustada al peso (1000 mg/día para <75Kg, 1200 mg/día para≥75 Kg). Siguiendo las guías internacionales, los pacientes con genotipos 1 recibieron 48 semanas de tratamiento.
Desde Mayo de 2012 todos los pacientes con Hepatitis crónica por VHC genotipo 1 pudieron ser tratados a juicio de su médico responsable recibir tratamiento con inhibidores de la proteasa NS3 del VHC (Telaprevir y Boceprevir) En estos casos los pacientes fueron tratados según los criterios y reglas de parada establecidos por el Ministerio de Sanidad (Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios. Criterios y recomendaciones generales para el tratamiento con boceprevir y telaprevir de la hepatitis crónica C [VHC] en pacientes monoinfectados.
Aspectos éticos:
Todos los pacientes incluidos en el estudio aceptaron su participación mediante firma de consentimiento informado específico y del estudio y del Biobanco del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. Posteriormente se recogieron las variables especificadas en el protocolo de estudio. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba.
Análisis de los datos obtenidos Se elaborará una base de datos específica que incluya como campos las variables primarias y el resto de las variables que se analizarán en el estudio. En primer lugar se efectuó una depuración de un análisis descriptivo de los datos usando técnicas de exploración y de análisis de frecuencias. Las variables continuas se expresarán como mediana (rango intercuartílico) o media (± desviación típica), y las variables categóricas como casos (porcentaje).
Se determinará la influencia de los diferentes KIRs y sus ligandos en el descenso plaquetario durante el tratamiento así como el desarrollo de trombocitopenia y tiempo al evento. Para el estudio del descenso plaquetario se realizó inicialmente un análisis bivariado. En el análisis bivariado las variables continuas se compararán mediante el test de la t de Student o de la U de Mann-Whitney, si no siguen una distribución normal o las variables no son similares. Las variables categóricas se compararán mediante el test de la Chi cuadrado o el test de Fisher, si alguna de las celdas tiene una frecuencia esperada inferior al 5 %. Se realizó un modelo de regresión logística binaria para encontrar variables potencialmente relacionadas con el desarrollo de trombocitopenia. Para el análisis de supervivencia/ tiempo al evento (trombocitopenia) se realizó un análisis de curvas de supervivencia (Kaplan-Meier), comparando los factores mediante prueba de Long-Rank (Mantel-Cox). Los genes KIRs potencialmente asociados con el tiempo a desarrollo de trombocitopenia fueron introducidos en un modelo de regresión de Cox. Se calcularon el Hazard ratio (HR) y Odd ratio (OR) para los modelos de Cox y Logística binaria, respectivamente, con su correspondiente intervalo de confianza al 95% (IC 95%). Ambos modelos de regresión fueron ajustados por edad, sexo, grado de fibrosis hepática y carga viral plasmática basal del VHC.
Para el análisis se utilizó el paquete estadístico SPSS vs 18 (IBM Corporation, Somers, NY, USA) y GraphPad Prism versión 6 (Mac OS X versión; GraphPad Software; San Diego, California, USA).
RESULTADOS
Se incluyeron en el estudio 58 pacientes coinfectados por el VIH/VHC que iniciaron un primer tratamiento frente al VHC con INF-Peg/RBV. Se identificó la ausencia de los KIRs 2DL2 (Figura 1) y 2DS2 (Figura 2) con un mayor descenso plaquetario durante el tratamiento. Del mismo modo, los pacientes con ausencia de los KIRs 2DL2 y 2DS2 presentaron un mayor descenso plaquetario durante todas las semanas de tratamiento que los pacientes que presentaron al menos uno de estos genes (Figura 3). Además, 13/24 (54,2%) de los pacientes que no presentaron ninguno de estos dos genes desarrollo trombocitopenia, comparado con los 7/34 (20,5%) de los pacientes que presentaron al menos 1 gen (p = 0,012). Mediante modelo de regresión logística se identificó la ausencia de KIRs 2DS2/2DL2 (OR: 6.31 ; IC 95%: 1.747- 22.799) y ausencia de cirrosis hepática (OR: 0,457; IC 95%: 0,217-0,963) como variables independientes asociadas con el desarrollo de trombocitopenia.
El tiempo a desarrollo de trombocitopenia fue inferior en aquellos pacientes con ausencia de KIRs 2DL2/2DS2 (7,5 semanas; IC 95%: 5,7 semanas- 9,43 semanas) que aquellos que presentaron al menos 1 de estos KIRs (10,3 semanas; IC 95%: 9,05 semanas-1 1 ,71 semanas) (Long-rank: p = 0.008) (Figura 4). Mediante análisis de regresión de Cox, solo la ausencia de los KIRs 2DS2/2DL2 se asoció con tiempo al desarrollo de trombocitopenia (HR: 3,641 ; IC 95%: 1 ,418-9,348). En conclusión, nuestros resultados muestran que la ausencia de los genes KIRs 2DL2/2DS2 está fuertemente asociado con la aparición de trombocitopenia en pacientes infectados por el VIH/VHC durante el tratamiento con INF-Peg. El procedimiento a seguir consiste en un simple análisis genético de los componentes KIR-2DL2 y KIR-2DS2 en muestras de sangre total.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Uso de la determinación de la expresión o ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 o del producto de expresión de dicho gen a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por el tratamiento con interferón de dicho sujeto, donde por producto de expresión de dicho gen se entiende la secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoácidica SEQ ID NO: 2 de al menos del 90% o una secuencia nucleotídica, preferiblemente mRNA, que codifique para una secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad de al menos el 90% con la SEQ ID NO:2.
2. - El uso según la reivindicación anterior, donde dicho uso además comprende la determinación de la expresión o ausencia de expresión del gen KIR 2DS2 o del producto de expresión de dicho gen, donde por producto de expresión del gen KIR 2DS2 se entiende la secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoácidica SEQ ID NO: 4 de al menos del 90% o una secuencia nucleotídica, preferiblemente mRNA, que codifique para una secuencia aminoacídica que presente un grado de identidad de al menos el 90% con la SEQ ID NO:4..
3. - Un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por tratamiento con interferón tras el tratamiento con dicho fármaco en individuos infectados por el virus de la hepatitis C, y opcionalmente un fármaco antiviral, que comprende: a) detectar la expresión o la ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o del gen KIR 2DS2 en una muestra biológica aislada de un individuo infectado por el virus de la hepatitis C, preferiblemente con carácter previo a que dicho individuo comience el tratamiento con el interferón; donde la expresión o ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o del gen KIR 2DS2 se determina a través de la detección de sus productos de expresión tal y como se han definido estos en las reivindicaciones 1 y 2.
4. - Un método para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por tratamiento con interferón tras el tratamiento con dicho fármaco en individuos infectados por el virus de la hepatitis C, que adicionalmente al paso de la reivindicación precedente comprende: b) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con un riesgo relativo al menos 3 veces mayor de desarrollar trombocitopenia inducida por interferón en comparación con el riesgo de que dicho individuo desarrolle trombocitopenia con un tratamiento libre de interferón, si dicho individuo presenta ausencia de expresión del gen KIR 2DL2 y/o ausencia de expresión del gen KIR 2DS2.
5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, donde el interferón es el interferón pegilado alfa.
6.- El método según la reivindicación 5, donde al individuo del paso (a) se le ha administrado una combinación de interferón pegilado alfa y un antiviral.
7. - El método según la reivindicación 6, donde el antiviral es ribavirina.
8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, donde la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de sangre total o periférica.
9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, donde el individuo del paso (a) está infectado por el virus de la hepatitis C del genotipo 1.
10. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde la determinación de la expresión del paso (a) se realiza mediante PCR.
1 1. - Un kit o dispositivo adecuado para amplificar secuencias nucleótidicas, que comprende sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ I D No 1 y/o SEQ ID No 3 así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
12. - Un kit o dispositivo adecuado para determinar la presencia o ausencia de expresión en una muestra de proteínas, donde dicho kit comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos el 85%.
13. - Un microarray que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de las secuencias nucleótidicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3.
14.- Un microarray de proteínas, donde dicho microarray comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos del 85%.
15.- Uso del kit o dispositivo tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 1-12 o de un microarray tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-14, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el desarrollo de trombocitopenia inducida por interferón, preferiblemente interferón alfa, y opcionalmente un fármaco antiviral.
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