WO2016101081A1 - Nano partículas a base de quitosano para el transporte de péptidos con actividad en el sistema nervioso central - Google Patents

Nano partículas a base de quitosano para el transporte de péptidos con actividad en el sistema nervioso central Download PDF

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WO2016101081A1
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nps
tpp
tdp
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Carlos Guillermo Von Plessing Rossel
Eileen Valeska CASTILLO QUIROGA
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Universidad De Concepcion
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    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the technology described is intended for the health and pharmaceutical sector, since it includes the generation of a chitosan-based nanoparticulate system for the transport of peptides with activity in the central nervous system.
  • This technology can be an alternative treatment to a series of diseases where the neuroinflammatory cascade generates alterations in the blood brain barrier.
  • the blood brain barrier represents an obstacle for pharmacological treatments due to the difficult penetration of drugs through it into the brain tissue, still administered intravenously, these reach very low concentrations at the level of the central nervous system (CNS) .
  • This barrier prevents the passage of substances into the cerebral interstitium with selective criteria, so that many drugs useful in the treatment of systemic disorders are ineffective with respect to similar CNS disorders, due to their inability to cross the barrier: neuropeptides, Proteins and antineoplastic agents are important examples of therapeutic agents that have difficulty crossing this barrier. Due to this, in the market, drugs are found that, to reach acceptable concentrations in the brain, are administered in high doses, with the consequence of, often, developing severe adverse effects on peripheral organs.
  • Tumor necrosis factor alpha is a cytokine involved in systemic inflammation and is a member of a group of cytokines that stimulate the acute phase reaction. It is produced mainly by activated macrophages, although it can be produced by other cell types.
  • the main function of TNF is the regulation of immune cells.
  • TNF- ⁇ which is an endogenous pyrogen, is capable of inducing fever, to induce cell death by apoptosis, and inducing sepsis (through ILl and the production of IL-6), in turn, can induce cachexia, induce inflammation, and inhibit tumorigenesis and viral replication
  • Deregulation of TNF production has been associated with a variety of human diseases, including Alzheimer's disease, where neuronal damage caused by neurotoxic factors initiated from inflammatory responses is related to cognitive and motor impairment, which contributes At the rupture of BHE, this allows leukocytes to enter the brain that serves to accelerate a neuroinflammatory cascade.
  • the TNF- ⁇ Etanercept (El) blocker molecule is a soluble fusion protein consisting of 2 identical chains of TNF-R2 linked to the Fe domain of a human IgG immunoglobulin.
  • Etanercept competitively inhibits TNF-a by preventing it from binding to its membrane receptors.
  • Etanercept is used to relieve the symptoms of autoimmune disorders such as: rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, juvenile idiopathic arthritis, ankylosing spondylitis and chronic plaque psoriasis.
  • nanoparticles is an alternative transport of neuropeptides and drugs, since they are pharmaceutical formulations that have the ability to be directed to a white site, protect the drug from physiological conditions that could alter its physicochemical properties, allowing dose reduction and, therefore, some of the adverse effects.
  • This type of transport can be used as vehicles with the objective of increasing the bioavailability of molecules with pharmacological effect on the CNS, increasing the selectivity for a target and reducing the toxicity of the drug, among others.
  • nanoparticulate systems for the encapsulation of drugs can favor the transport of these to the place of therapeutic action, to the increase of their half-life and their controlled release over time.
  • small particles they have a high surface-volume ratio.
  • the nanoparticles in particular, have aroused great interest as modified drug delivery systems, especially for alternative routes of administration to the oral, such as those that require injection or deposition on mucous surfaces such as the nasal. These are defined as those particles whose size is less than bpm, this being one of the factors that most affect and determine their internalization in mucous membranes, epithelial tissues and their transport within cells.
  • the surface charge of the nanoparticles determines their mucoadhesive properties, and both characteristics can be controlled by varying certain conditions and variables of the process of obtaining.
  • Chitosan is one of the most studied biopolymers for use in modified release systems, in addition to one of the most abundant in nature, obtained from chitin, the latter, is part of the support structure of many living organisms, such as arthropods (crustaceans and insects), mollusks and fungi. Due to its cationic character and its gelling and filmogenic properties, chitosan constitutes a vehicle for encapsulation of the drug, protecting and releasing them in a controlled manner, in addition to promoting their absorption through the epithelium, likewise, chitosan has properties necessary for use in this industry, such as its biodegradability, biocompatibility and low toxicity. In recent years, the study of chitosan has focused mainly on improving the release and absorption of so-called therapeutic biomolecules, such as proteins and DNA, as well as drugs such as corticosteroids, antipsychotics, etc.
  • TPP is a non-toxic agent (recognized as GRAS by the FDA) that is capable of forming gels by binding with chitosan by ionic interaction.
  • the formulation of nanoparticles by ionic interaction between chitosan and TPP is relatively simple because it involves the mixing of two aqueous phases, at room temperature and without the use of organic solvents, the latter is a great advantage when climbing processes at higher production levels, compared to other methods and polymers used to make nanoparticles.
  • chitosan constitutes a vehicle for encapsulating the drug, protecting and releasing them in a controlled manner, as well as promoting their absorption through the epithelium.
  • Chitosan can be degraded by enzymes such as; glucosamine-glucosamine hydrolase, glucosamine-N-acetyl-glucosamine hydrolase and N-acetyl-glucosamine-N-acetyl-glucosamine hydrolase.
  • chitinases have been identified in humans, three of which have shown enzymatic activity, these three forms are: acidic mammalian chitinase (AMCase), di-N-acetylquitobiase and chitotriosidase.
  • AMCase acidic mammalian chitinase
  • di-N-acetylquitobiase di-N-acetylquitobiase
  • chitotriosidase eight chitinases have been identified in humans, three of which have shown enzymatic activity, these three forms are: acidic mammalian chitinase (AMCase), di-N-acetylquitobiase and chitotriosidase.
  • BHE In neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, BHE represents an obstacle to pharmacological treatments due to the difficult penetration of drugs through it into brain tissue, still administered intravenously, these reach very low concentrations at the level of the central nervous system (SNC).
  • SNC central nervous system
  • the transport of substances through the BHE is done in three ways; diffusion of lipophilic substances; specific transport of water-soluble substances by means of facilitated transport with and without energy expenditure; and through ion channels.
  • specific transporters for vitamins an example of this is thiamine, for which there are transporters, of a protein nature, that allow their passage from the blood to the brain.
  • the first of the transporters is high affinity and interacts with thiamine and acetylcholine (OCT-3), and the second a low affinity transporter that only interacts with thiamine (ThTRl).
  • TDP Thiamine pyrophosphate
  • Figure 1 Chitosan / TPP NPs obtained by the optimized method, analyzed by TEM.
  • Figure 2 Optimization of the manufacturing process of chitosan NPs / TDP / TPP analyzed by TEM.
  • FIG. 3 Dynamic light scattering analysis (A) Chitosan NPP / TPP suspension, (B) Chitosan NPs / TDP / TPP suspension.
  • FIG. 4 Analysis of zeta potential
  • A Suspension of chitosan NPs / TPP
  • B Suspension chitosan NPs / TDP / TPP.
  • Figure 5 FT-IR spectrum corresponding to matrix TPP, chitosan NP / TPP and matrix chitosan respectively.
  • Figure 6 FT-IR spectrum corresponding to matrix TDP, chitosan NPs / TDP / TPP and matrix chitosan respectively.
  • Figure 7 Size evaluation chart in a study of stability at accelerated conditions (25 ° C ⁇ 3 ° C) of chitosan NPs suspensions.
  • Figure 8 Polydispersion evaluation graph in a study of stability at accelerated conditions (25 ° C ⁇ 3 ° C) of chitosan NP suspensions.
  • Figure 9 Size evaluation chart in a long-term stability study (5 ° C ⁇ 3 ° C) of chitosan NPs suspensions.
  • Figure 10 Polydispersion evaluation graph in long-term stability study (5 ° C ⁇ 3 ° C) of chitosan NPs suspensions.
  • Figure 11 MTT of chitosan and chitosan / thiamine NPs compared to the respective solutions.
  • Figure 12 Comparison of cell viability between chitosan / TPP NPs and chitosan solution at the same concentration.
  • Figure 13 Comparison of cell viability between the chitosan / TDP / TPP NPs and the chitosan / TDP solution at the same concentration.
  • Figure 14 Effect of the chitosan, chitosan / TDP solution and the chitosan NPs in a concentration equivalent to 50 pg / ml on the TEE of the Caco-2 cell monolayers.
  • Figure 15 Effect of the chitosan, chitosan / TDP solution and the chitosan NPs in a concentration equivalent to 100 pg / ml on the TEER of the Caco-2 cell monolayers.
  • the technology corresponds to a chitosan-based nanoparticulate system for the transport of peptides with activity in the central nervous system.
  • This system would allow the arrival of these peptides to the CNS, in order to control the integrity of the BHE and generate an alternative treatment to a series of neurodegenerative diseases where the neuroinflammatory cascade generates alterations in the barrier.
  • the process for developing this nanoparticulate system allows the formation of chitosan NPs by the ionic gelation method using sodium tripolyphosphate (TPP) as a crosslinking agent and as a signaling agent thiamine pyrophosphate (TDP).
  • TPP sodium tripolyphosphate
  • TDP thiamine pyrophosphate
  • Chitosan / TDP / TPP NPs made with the optimal formulation had an average submicron diameter of 75.7 ⁇ 2.5 nm, irregularly shaped, smooth surface, presenting a positive zeta potential 26.2 ⁇ 0.45 mV this quality It allows NPs to be stable for a prolonged period of time, the formulation being highly reproducible.
  • the NPs obtained have a stability at 5 ° C ⁇ 3 ° C of 6 months without the incorporation of any stabilizing agent in the medium, where the samples did not suffer large variations in size and polydispersion, unlike those obtained at higher temperatures where a 7-day stability was observed at 25 ° C ⁇ 2 ° C with 60% ⁇ 5% relative humidity.
  • the optimal mass ratio between chitosan / TDP / TPP which corresponds to 3: 3: 1 evidenced by a smaller size of NPs of single mode dispersion at 79.28 nm ⁇ 2.5 nm, with a polydispersion index of 0.111 ⁇ 0.025.
  • Table 1 Optimum conditions for obtaining chitosan NPs / TDP / TPP.
  • the proposed mechanism for the formation of chitosan-TPP nanoparticles states that the ionic gelation of chitosan occurs by electrostatic interactions between products of TPP dissociation in aqueous solution with NH3 + groups of chitosan in acidic medium.
  • This mechanism of elaboration involves a high-speed manufacturing process which enhances the obtaining of NPs of a size below 100 nm.
  • the NPs are capable of producing a modification in the narrow junctions that occur when the monolayer of the cells is fully formed and it is also possible to determine that this modification in the narrow junctions is reversible by recovering in the case of the NP solutions of Q / TDP / TPP 93%, this recovery is dependent on the concentration used, since the higher the concentration of the NPs the lower the recovery percentage.
  • the proposed NPs allow the encapsulation of different molecules or peptides of pharmacological interest, for which the molecules are incorporated into the chitosan / TDP solution of 25% w / v, where the loading of the molecules corresponds to 5% of the total mass of the NPs.
  • the solutions were allowed to react by magnetic stirring at 200 rpm for 2 hours, after this time the NPs were elaborated and characterized by dynamic light scattering analysis.
  • the NPs loaded with the active molecules have a hydrodynamic diameter of 80 ⁇ 6 nm, with a Z potential of 26.1 ⁇ 0.97 mV, and a polydispersion that did not exceed 0,150 PDI.
  • This encapsulation method has an encapsulation efficiency (% EE) of 31.24 ⁇ 2.8 and percentage of active ingredient load (% Load) of 0.65 ⁇ 0.03.
  • the size of the NPs determines their load capacity, which can be drastically modified if the size of the NPs is increased.
  • NPs of size at 250 nm ⁇ 10.5nm which resulted in a% load equivalent to 4.38% ⁇ 1.8.
  • the ideal is to have NPs with a size less than 100 nm if an intravenous administration is sought, but with a size less than 300, a good intranasal administration of the NPs can be achieved thereby increasing the percentage of charge of the molecules in the NPs by therefore it is dependent on the route of administration.
  • Example 1 Obtaining NPs of Chitosan / TPP
  • Example 2 Optimization of the process of obtaining the chitosan NPs / TDP / TPP.
  • NPs were identified irregularly, of size that oscillated between 79 and 86 nm, for the purposes of in vivo studies, NPs below 100 nm can be used for BHE transfer studies.
  • Table 2 Summary of size and polydispersion of the suspensions of NPs obtained, in different mass proportions.
  • Table 3 Summary of size and polydispersion of the NP suspensions obtained at different pH.
  • NPs were developed by high-speed agitation with the Ultraturrax® method, tests were carried out with 3 speeds, where it varied between 8000 and 13500 rpm.
  • the suspensions of resulting NPs were analyzed by dynamic light scattering, where their size and polydispersion were analyzed.
  • Table 4 Evaluation of agitation speed in chitosan NPs / TDP / TPP.
  • Table 4 shows a minimal effect in relation to the average diameter of the NPs when changing the stirring speed during the manufacturing process, so it was decided to establish as a processing parameter a speed of 8000 rpm resulting in NPs Chitosan / TDP / TPP irregularly shaped, smooth surface, With this agitation speed smaller sizes are achieved, with less energy delivered to the system thus favoring the stability of the suspension.
  • TDP yielded an inclusion percentage of 78% ⁇ 4.8 according to the analyzes performed for the indirect determination of this in the suspension of NPs, the interaction that occurs between the TDP and the TPP is mediated by the formation of peers ionic that are formed between the positive charges of chitosan and the negative charges presented by TDP.
  • Chitosan / TPP and chitosan / TDP / TPP NP were analyzed to have a comparison of their characteristics.
  • the nanoparticle observation was performed by depositing a drop of filtered suspension in a 0.45 pm nylon filter on a copper grid covered by a carbon film, which was allowed to dry at room temperature for approximately 12 hours In them, the presence of microparticles, nanoparticles and dispersed polymer present in the suspension was evaluated.
  • both suspensions of NPs obtained by the optimized method only NPs were found without the presence of dispersed polymer as can be seen in Figures 1 NPs of chitosan / TPP and Figure 2 NPs of chitosan / TDP / TPP.
  • This dynamic light scattering analysis was performed with the Zetasizer ZS90 equipment to determine size (mean diameter), size distribution and quantity of particles of the NPs suspension.
  • the suspensions were irradiated by a laser and product of the Brownian movement of the particles and the laser dispersion, the team can interpret these signals as the sizes of the NPs present.
  • the samples were deposited in a polystyrene cuvette and analyzed in triplicate, at a temperature of 25 ° C and at an angle of 90 °.
  • the Zeta Potential of the NPs was studied to verify the stability of the suspensions, the analysis was performed with the Zetasizer ZS90 equipment, the principle of this measurement is the application of an electric field to a cell, in this case a special polycarbonate tray which has conductive cells.
  • the zeta potential measurement is performed by Doppler laser electrophoresis. Samples of the suspensions were measured directly and diluted in a 10: 1 ratio, from the conduction cells. Each analysis was performed in triplicate at 25 ° C.
  • a positive zeta potential was identified of 32.6 ⁇ 3.9 mV in the chitosan / TPP NPs and 26.2 ⁇ 0.45 mV in the chitosan / TDP / TPP NPs, this quality allows the NP to be stable for a period of time dragged on.
  • This analysis served to verify the position of the matrix components in the NPs, since the external position of the chitosan with respect to the TPP in the NPs has a positive indication, another property that can be inferred from the analysis, is the property of the NPs to adhere to the tissues.
  • Figure 4 shows the analysis performed on the Zetasizer equipment at both NPs suspensions.
  • chitosan, TDP and TPP were analyzed separately (chitosan, TDP and TPP), a small amount of these were placed in an agate mortar next to an excess of KBr, the mixture It was crushed and finally placed on a support to generate an analysis tablet.
  • the suspensions of chitosan / TPP and chitosan / TDP / TPP NPs were subjected to a lyophilization process for 24 hours, the resulting solid was pulverized and subjected to the same process described previously in order to obtain the NP spectrum and generate the comparison between the individual matrix components and the respective NPs.
  • the spectrum of the chitosan / TPP NPs is shown different from that of the chitosan matrix.
  • the vibration corresponding to the NH 2 flex at 1579 cm "1 decreases; instead, two new peaks 1638 cm “ 1 and 1700 cm ' 1 appear ; this, probably, due to the protonation of the NH 2 groups that are now NH3 ions and the formation of the hydrogen bond between the O-TPP and the H of the free amino groups.
  • NPs suspension was prepared in triplicate of chitosan / TPP and chitosan / TDP / TPP, a 4 ml aliquot of the respective suspensions were stored in penicillin bottles and sealed under pressure, each of these bottles corresponded to a sample in a certain period of time.
  • a fourth sample was stored and corresponds to a 1: 1 dilution of the respective NPs suspensions with 0.9% NaCl w / v.
  • the samples were analyzed by dynamic light scattering, where their size and polydispersion were analyzed and the results were analyzed by a two-way ANOVA.
  • Caco-2 cells were used for the determination of all studies involving an epithelial model, these were obtained after 7 days of incubation at 37 ° C with 5% C0 2 with DMEM culture medium supplemented with 10% of SFB, the culture medium was changed once a day for 7 days of incubation, the results obtained were reproducible every time the cell line was needed with an average viability of 97.5%.
  • MTT (4,5 dimethyl-2-thiazoyl) -2,5-diphenyltetrazole bromide) is captured by the cells and reduced by the mitochondrial succinic dehydrogenase enzyme to its insoluble formazan form, the reaction product is retained in the cells and can be released by solubilization with SDS (sodium lauryl sulfate).
  • the plates were analyzed by spectrophotometry at a wavelength that fluctuated between 540 nm and 570 nm, the stimulation index (IE) was calculated to then determine the% of cell viability considering the IE corresponding to each sample x and the corresponding IEo to Caco-2 cells without exposure to external agents.
  • IE stimulation index
  • Equation 1 Calculation of itx stimulation index
  • Equation 2 Calculation% of cell viability
  • Figure 12 shows in greater detail the difference that occurs between the chitosan / TPP NPs and the chitosan solution at the same concentrations, obtaining a decrease in the average cell viability no greater than 20% in all chitosan concentrations. analyzed according to the concentration of 100 ug / ml, which can be explained to some extent because in that well of the plaque a greater number of cells may have been sown, resulting in less deterioration.
  • the control which corresponded to a saline medium in which the chitosan NPs are inserted, did not generate any damage, so the effect on cell viability is 100% attributed to the chitosan / TPP NPs or to the solution of chitosan If a comparison is made between the effect on the cell viability of the chitosan / TPP NPs vs the chitosan solution it can be seen that the chitosan solution generates less damage at the same concentration as the chitosan / TPP NPS, this is It may be due to the fact that TPP is present in the chitosan / TPP NPs, a molecule that can also affect the cell viability of Caco-2 cells when directly exposed to them.
  • Figure 13 shows in greater detail the difference that occurs between the chitosan / TDP / TPP NPs and the chitosan / TDP solution at the same concentrations, obtaining a decrease in the average cell viability not greater than 15% in the case of the chitosan / TDP / TPP NPs in all the chitosan concentrations analyzed, in relation to the chitosan / TDP solution where an effect on the greater and concentration-dependent cell viability was appreciated, since at higher concentrations of chitosan (400 -600 -800 and 1000 pg / ml) a cellular damage is observed that borders 30%, this can be explained in a certain way since in the case of chitosan NPs / TDP / TPP the TDP is is internalized in the NPs and the pH of the suspensions is close to 5.0, while in the case of the chitosan / TDP suspension the TDP is free in the solution and the pH is 4.5, so it
  • TEER For the determination of the TEER, 24-well Transwell plates with a membrane diameter of 0.33 cm 2 were used , the plates were seeded with an equivalent volume of 200,000 cells / well which were seeded after the cells were with 7 days of confluence. The TEER was measured daily until a resistance value remained constant (300 ⁇ ).
  • the culture medium was removed from the plate and replaced by a suspension of chitosan / TPP NPs and chitosan / TDP / TPP NPs, in DMEM 10% SFB culture medium, evaluating TEER values at time 0-0.5-1-1.5-2-4-6-8 and 10 hrs, after exposure with the NPs the culture medium was removed, the cells were washed with sterile PBS and the medium was replaced DMEM 10% SFB culture, free of external agents, reassessing the TEER at 12 and 24 hrs after replacing the culture medium.
  • Equation 3 TEER calculation The variation of TEER in Caco-2 cell monolayers was monitored in order to study the effect of chitosan in solution and in chitosan / TPP NPs or chitosan / TDP / TPP NPs on tight junction integrity .
  • Figure 14 shows that both the NPs and the chitosan and chitosan / TDP solution caused a significant reduction (p ⁇ 0.05) of the TEER of the monolayers with respect to the initial TEER and with respect to the control.
  • the effect of chitosan solution on TEER was significantly less than that of nanoparticles (p ⁇ 0.05).
  • the chitosan NPs are capable of producing a modification in the tight junctions that occur when the monolayer of the caco-2 cells is fully formed is confirmed and also it is possible to determine that this modification in the narrow junctions is reversible by recovering 94 and 93% of the integrity of the membrane in the case of chitosan and chitosan / TDP solutions, and in the case of Q / TPP NPs and NPs of Q / TDP / TPP 90 and 93% respectively.
  • the movement of ions through the monolayer is restricted due to the proper functioning of the tight junction, there is a gradient of electrical potential on both sides of it.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • Figure 15 shows that the recovery of TEER is dependent on the concentration of chitosan to which the Caco-2 cell monolayer was exposed, since at higher concentrations although the same effect of reducing TEER is achieved, After the cells are exposed to chitosan solutions and NPs, the recovery of the monolayer is lower, obtaining percentages of membrane integrity recovery close to 70%.
  • Example 7 Encapsulation of TNF- ⁇ blocker molecule (El: Etanercept).
  • the process of obtaining El was performed according to the following protocol: a) 500 ⁇ of the sample (chitosan NPs with the encapsulation) were centrifuged at 14000 rpm for 20 min at a temperature of 20 ° C using Amicon® Ultra-0.5 centrifugation filters.
  • the amount of encapsulation was expressed with the parameters of percentage of encapsulation efficiency (% EE) and percentage of active ingredient load (% Load), which is expressed in equation 4 and 5.
  • Equation 4 Calculation percentage encapsulation efficiency
  • The% of encapsulation load is less than 1%, this is mainly due to the fact that the size of the chitosan NPs used is less than 100 nm, which greatly affects the load capacity that can be reached. chitosan NPs, this value can be drastically modified if the size of chitosan NPs is increased.
  • Example 8 Identification of the presence of NPs in the CNS.
  • a first step 250 mg of chitosan was dissolved in 25 ml of nanopure water and 10 mg of fluorescein thiocyanate (FiTC) were dissolved in 1 ml of ethanol. Both solutions were mixed, with permanent magnetic stirring for 24 hours in a dark piece tempered at 37 ° C. The resulting conjugate was purified by dialysis, for 72 hours, (using 12 KDa pore size dialysis tubes), changing the medium every 24 hours. The isolated Chitosan-RTC solution was frozen at -55 ° C in an ethanol bath, and subsequently lyophilized, to completely extract the residual solvent.
  • FiTC fluorescein thiocyanate
  • the polysorbate 80 Due to the surface characteristics granted by the polysorbate 80 to the NPs, with respect to its incorporation into the SNC, it was included as a coating agent, for the intravenous administration NPs.
  • the chitosan-FiTC was dissolved in nanopure water and its pH was adjusted to 4.5.
  • the TPP solution was mixed together with polysorbate 80 (1% v / v) for 24 hours, then proceed with the preparation of the NPs, the process described in example 1 and 2.
  • the suspensions obtained were analyzed by dynamic light scattering to determine their average diameter (Table 7).
  • polysorbate 80 FiTC NPs whose average diameters fluctuated between 75 and 130 nm were evidenced, in the presence or absence of polysorbate 80, respectively. With these NPs the following tests were performed to verify their transfer to the CNS.
  • Table 8 Formulations administered in vivo study.
  • a fixative solution composed of 4% paraformaldehyde and 1M phosphate buffered saline (PBS).
  • the union may be responsible for the orientation of NPs at the brain level, this binding can lead to mimic low-density lipoproteins (LDL), and thus force LDL receptors present in vascular endothelial cells of the brain to recognize them as such and trigger their absorption, through an endocytosis mechanism followed by transcytosis through the endothelium and subsequent reuptake by neurons in the brain parenchyma.
  • LDL low-density lipoproteins
  • the size of the NP being what controls the rate of endocytosis through the endothelial cells of the capillaries of the brain, because its size is similar to that of the LDL, associated with the presence of polysorbate 80 on its surface of the NPs , which triggers the recognition of specific receptors thus favoring the internalization of these through the BHE.

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Abstract

La tecnología corresponde a nanopartículas a base de quitosano para el transporte de péptidos con actividad en el sistema nervioso central, las que están compuestas por: (a) quitosano, como base; (b) tripolifosfato sódico (TPP), como agente entrecruzante; y (c) pirofosfato de tiamina (TDP), como agente señalizador. Estas nanopartículas se utilizan para fabricar un medicamento útil en afecciones del sistema nervioso central, el cual puede ser administrado de forma intravenosa o intranasal.

Description

NANOPARTÍCULAS A BASE DE QUITOSANO PARA EL TRANSPORTE DE PÉPTIDOS CON ACTIVIDAD EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL.
SECTOR TECNICO
La tecnología que se describe está destinada al sector salud y farmacéutico, ya que comprende la generación de un sistema nanoparticulado a base de quitosano para el transporte de péptidos con actividad en el sistema nervioso central. Esta tecnología puede ser alternativa de tratamiento a una serie de enfermedades donde la cascada neuroinflamatoria genera alteraciones en la barrera hematoencefálica.
TECNICA ANTERIOR
La barrera hematoencefálica (BHE) representa un obstáculo para los tratamientos farmacológicos debido a la difícil penetración de los fármacos a través de ella hacia el tejido cerebral, aún administradas por vía intravenosa, estos alcanzan concentraciones muy bajas a nivel del sistema nervioso central (SNC). Esta barrera, impide el paso de sustancias al intersticio cerebral con criterio selectivo, por lo que muchos fármacos útiles en el tratamiento de trastornos sistémicos resultan ineficaces con respecto a trastornos similares del SNC, debido a su incapacidad para cruzar la barrera: los neuropéptidos, las proteínas y los antineoplásicos son ejemplos importantes de agentes terapéuticos que tienen dificultad para traspasar esta barrera. Debido a esto, en el mercado, se encuentran fármacos que, para alcanzar concentraciones aceptables en el cerebro, son administrados en altas dosis, con la consecuencia de, muchas veces, desarrollar severos efectos adversos en órganos periféricos.
El factor de necrosis tumoral alpha (TNF-α) es una citoquina implicada en la inflamación sistémica y es miembro de un grupo de citoquinas que estimulan la reacción de fase aguda. Es producida principalmente por los macrófagos activados, aunque puede ser producido por otros tipos de células. La función principal de TNF es la regulación de las células inmunes. TNF-α, que es un pirógeno endógeno, es capaz de inducir la fiebre, para inducir la muerte celular por apoptosis, e inducir la sepsis (a través de ILl y la producción de IL-6), a su vez, puede inducir a la caquexia, inducir inflamación, e inhibir la tumorigénesis y la replicación viral.
La desregulación de la producción de TNF se ha asociado a una variedad de enfermedades humanas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, en donde el daño neuronal causado por factores neurotóxicos iniciados a partir de respuestas inflamatorias se relacionan con el deterioro cognitivo y motor, lo que contribuye a la ruptura de la BHE, esto permite la entrada de los leucocitos al cerebro que sirve para acelerar una cascada neuroinflamatoria.
La molécula bloqueadora de TNF-α Etanercept (El) es una proteína soluble de fusión que consiste en 2 cadenas idénticas del TNF-R2 unidas al dominio Fe de una inmunoglobulina IgG humana. Etanercept inhibe de forma competitiva el TNF-a impidiendo que se una a sus receptores de membrana. El etanercept se usa para aliviar los síntomas de trastornos autoinmunes tales como: la artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil, espondilitis anquilosante y psoriasis en placa crónica.
De particular relevancia son los resultados obtenidos después de la administración periespinal de etanercept en pacientes con enfermedad de Alzheimer, en estas personas se observan mejorías notables en el aprendizaje, memoria y fluidez verbal desde los primeros minutos después de la inyección periespinal. Los efectos clínicos sugieren que este abordaje de tratamiento, además de su utilidad para otras formas de enfermedad de Alzheimer, puede ser útil para los pacientes con demencia fronto temporal y frontal variante de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo la forma de administración del principio activo es uno de los puntos limitantes para su utilización por lo que su posible incorporación a un sistema nanoparticulado favorecería la administración de etanercept disminuyendo el riesgo asociado para los pacientes.
De ahí la importancia de regular la presencia del TNF-α mediante sistemas de control que sean capaces de llegar al SNC y poder controlar el daño generado a nivel cerebral como es el caso de los sistemas nanoparticulados.
El desarrollo de nanopartículas es una alternativa de transporte de neuropéptidos y fármacos, ya que son formulaciones farmacéuticas que tienen la capacidad de ser dirigidas a un sitio blanco, proteger el fármaco de las condiciones fisiológicas que pudieran alterar sus propiedades fisicoquímicas, permitiendo disminuir las dosis y, por ende, algunos de los efectos adversos. Este tipo de transporte puede ser usado como vehículos con el objetivo de aumentar la biodisponibilidad de moléculas con efecto farmacológico en el SNC, aumentar la selectividad por un blanco y disminuir la toxicidad del fármaco, entre otras.
El uso de sistemas nanoparticulados para la encapsulación de fármacos puede favorecer el transporte de éstos al lugar de acción terapéutica, al incremento de su vida media y su liberación controlada en el tiempo. Además, al ser partículas pequeñas, presentan una alta relación superficie-volumen.
Las nanopartículas, en especial, han suscitado un gran interés como sistemas de liberación modificada de fármacos, sobre todo para vías de administración alternativas a la oral, como aquellas que requieren inyección o deposición en superficies mucosas como la nasal. Estas se definen como aquellas partículas cuyo tamaño es inferior a lpm, siendo este uno de los factores que más afectan y determinan la internalización de las mismas en mucosas, tejidos epiteliales y su transporte dentro de las células. La carga superficial de las nanopartículas determina sus propiedades mucoadhesivas, y ambas características pueden ser controladas variando ciertas condiciones y variables del proceso de obtención.
Una de las ventajas más importantes de estos sistemas es su capacidad para cruzar barreras biológicas, un requerimiento básico para que estos polímeros puedan ser utilizados en humanos o animales es que sean moléculas biodegradables, biocompatibles y sin toxicidad para el ambiente biológico. Por esta razón, un muy limitado número de moléculas pueden ser utilizadas para preparar materiales biodegradables.
El quitosano es uno de los biopolímeros más estudiados para su utilización en sistemas de liberación modificada, además uno de los más abundantes en la naturaleza, obteniéndose a partir de la quitina, esta última, forma parte de la estructura de soporte de numerosos organismos vivos, tales como artrópodos (crustáceos e insectos), moluscos y hongos. Debido a su carácter catiónico y a sus propiedades gelificantes y filmogénicas, el quitosano, constituye un vehículo para la encapsulación del fármaco, protegiéndolos y liberándolos de forma controlada, además de promover su absorción a través del epitelio, así mismo, el quitosano presenta propiedades necesarias para su uso en esta industria, como son su biodegradabilidad, biocompatibilidad y baja toxicidad. En los últimos años, el estudio del quitosano se ha centrado sobre todo en mejorar la liberación y la absorción de las llamadas biomoléculas terapéuticas, como proteínas y ADN, además de fármacos como corticoides, antipsicóticos, etc.
El conjunto de todas estas características que acompañan a las nanopartículas preparadas a partir de quitosano es lo que lo hace un producto apetecible para la industria farmacéutica tanto nacional como internacional. En nuestro país, el desarrollo de nuevas formas farmacéuticas es un área de la industria farmacéutica que se ha ido potenciado con el transcurso de los años debido al crecimiento de la industria y la utilización de materias primas de origen nacional. De ahí la importancia, junto con el aumento considerable de enfermedades neurodegenerativas, y la búsqueda de nuevos tratamientos ya sea para controlar la enfermedad o restablecer la integridad de la BHE, hacen que la implementación de un vehículo capaz de generar un tratamiento adecuado para estas patologías se trasforma en un punto crítico y de creciente estudio en el área de la nanomedicina.
Calvo et al {1997) describió la preparación de nanopartículas de quitosano por gelificación iónica de éste y tripolifosfato sódico (TPP), estas presentan una serie de interesantes características que las hacen ser vehículos prometedores para la liberación de macromoléculas, tales como proteínas y ADN. Algunas de estas propiedades son su obtención por un proceso que no requiere de la incorporación de altas cantidades de energía ni solventes orgánicos, su tamaño ajustable dependiendo de los parámetros de obtención, la modulación de su carga positiva y su capacidad de asociación a péptidos, proteínas, oligonucleótidos y plásmidos.
El TPP es un agente no tóxico (reconocido como GRAS por la FDA) que es capaz de formar geles al unirse con el quitosano por interacción iónica. La formulación de nanopartículas por interacción iónica entre el quitosano y el TPP es relativamente sencilla porque implica la mezcla de dos fases acuosas, a temperatura ambiente y sin el uso de solventes orgánicos, esta última es una gran ventaja al momento de escalar procesos a mayores niveles de producción, en comparación a otros métodos y polímeros utilizados para elaborar nanopartículas.
Debido a su carácter catiónico y a sus propiedades gelificantes y filmogénicas, el quitosano, constituye un vehículo para la encapsulación del fármaco, protegiéndolos y liberándolos de forma controlada, además de promover su absorción a través del epitelio. El quitosano puede ser degradado por enzimas como; glucosamina- glucosamina hidrolasa, glucosamina-N-acetil-glucosamina hidrolasa y la N-acetil- glucosamina-N-acetil-glucosamina hidrolasa. Sin embargo, se han identificado ocho quitinasas en el humano, tres de las cuales han mostrado actividad enzimática, estas tres formas son: quitinasa mamífera acida (AMCase), la di-N-acetilquitobiasa y la quitotriosidasa.
En las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer la BHE representa un obstáculo para los tratamientos farmacológicos debido a la difícil penetración de los fármacos a través de ella hacia el tejido cerebral, aún administradas por vía intravenosa, estos alcanzan concentraciones muy bajas a nivel del sistema nervioso central (SNC). Esta barrera, impide el paso de sustancias al intersticio cerebral con criterio selectivo, por lo que muchos fármacos útiles en el tratamiento de trastornos sistémicos resultan ineficaces con respecto a trastornos similares del SNC, debido a su incapacidad para cruzar la barrera
El Transporte de sustancias a través de la BHE se realiza de tres formas; difusión de sustancias lipófilas; transporte específico de sustancias hidrosolubles mediante transporte facilitado con y sin gasto de energía; y a través de canales iónicos. Por otro lado en la BHE también existen transportadores específicos para vitaminas, un ejemplo de esto es la tiamina, para la cual existen transportadores, de naturaleza proteica, que permiten su paso desde la sangre hacía el cerebro. El primero de los transportadores, es de alta afinidad he interactúa con tiamina y acetilcolina (OCT-3), y el segundo un transportador de baja afinidad que sólo interactúa con tiamina (ThTRl).
El pirofosfato de tiamina (TDP), es utilizado como agente señalizador en el proceso de fabricación de las NP por su capacidad de unirse a los receptores de tiamina en la BHE. Corresponde a un derivado de la vitamina Bl, la cual juega un rol esencial como cofactor en reacciones claves del metabolismo de carbohidratos, también está involucrado en el metabolismo de aminoácidos de cadenas ramificadas, puede tener roles de coenzima en células nerviosas, y es de vital importancia para el suministro de energía a la células. Su principal característica estructural es la presencia de grupos fosfatos, los que le otorgan la capacidad de formar sales con los grupos aminos del quitosano, ayudando a aumentar la solubilidad en agua de este último.
A pesar de todo lo mencionado, aun es necesario contar con tecnologías que permitan el transporte efectivo de sustancias o péptidos hacia el SNC, que logren atravesar la BHE sin afectar su integridad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: NPs de quitosano/TPP obtenidas por el método optimizado, analizadas mediante TEM.
Figura 2: Optimización del proceso de fabricación de NPs de quitosano/TDP/TPP analizadas por TEM.
Figura 3: Análisis de dispersión dinámica de la luz (A) Suspensión de NPs quitosano/TPP, (B) Suspensión NPs quitosano/TDP/TPP.
Figura 4: Análisis de potencial zeta (A) Suspensión de NPs quitosano/TPP, (B) Suspensión NPs quitosano/TDP/TPP.
Figura 5: Espectro FT-IR correspondiente a TPP matriz, NP de quitosano/TPP y quitosano matriz respectivamente.
Figura 6: Espectro FT-IR correspondiente a TDP matriz, NPs de quitosano/TDP/TPP y quitosano matriz respectivamente.
Figura 7: Gráfico de evaluación de tamaño en estudio de estabilidad a condiciones aceleradas (25°C ± 3°C) de las suspensiones de NPs de quitosano.
Figura 8: Gráfico de evaluación de polidispersión en estudio de estabilidad a condiciones aceleradas (25°C ± 3°C) de las suspensiones de NPs de quitosano.
Figura 9: Gráfico de evaluación de tamaño en estudio de estabilidad a largo plazo (5°C ± 3°C) de las suspensiones de NPs de quitosano.
Figura 10: Gráfico de evaluación de polidispersión en estudio de estabilidad a largo plazo (5°C ± 3°C) de las suspensiones de NPs de quitosano. Figura 11: MTT de NPs de quitosano y quitosano/tiamina en comparación con las soluciones respectivas.
Figura 12: Comparación de la viabilidad celular entre las NPs de quitosano/TPP y la solución de quitosano a igual concentración.
Figura 13: Comparación de la viabilidad celular entre las NPs de quitosano/TDP/TPP y la solución de quitosano/TDP a igual concentración.
Figura 14: Efecto de la solución de quitosano, quitosano/TDP y las NPs de quitosano en concentración equivalente a 50 pg/ml sobre la TEE de las monocapas de células Caco-2.
Figura 15: Efecto de la solución de quitosano, quitosano/TDP y las NPs de quitosano en concentración equivalente a 100 pg/ml sobre la TEER de las monocapas de células Caco-2.
DIVULGACION DE LA INVENCIÓN
La tecnología corresponde a un sistema nanoparticulado a base de quitosano para el transporte de péptidos con actividad en el sistema nervioso central. Este sistema permitiría la llegada de estos péptidos al SNC, con el fin de controlar la integridad de la BHE y generar una alternativa de tratamiento a una serie de enfermedades neurodegenerativas donde la cascada neuroinflamatoria genera alteraciones en la barrera.
El proceso para elaborar este sistema nanoparticulado permite la formación de NPs de quitosano mediante el método de gelificación iónica utilizando el tripolifosfato sódico (TPP) como agente entrecruzante y como agente señalizador el pirofosfato de tiamina (TDP).
Durante el proceso de formación de las NPs se analizó la influencia de distintos parámetros como la relación en masa quitosano/TPP/TDP, pH, temperatura del proceso, tiempo, velocidad, tipo de agitación y la incorporación de TDP en las NPs desarrolladas. En forma paralela, se realizó la comparación entre las NPs obtenidas a partir de quitosano/TPP y quitosano/TPP/TDP. Las condiciones de obtención de las NPs de quitosano/TDP/TPP optimizado se describen en la tabla 1.
Las NPs de quitosano/TDP/TPP elaboradas con la formulación óptima tuvieron un diámetro medio submicrométrico de 75,7 ± 2,5 nm, con forma irregular, superficie lisa, presentando un potencial zeta positivo 26,2 ± 0,45 mV esta cualidad les permite a las NP ser estables por un periodo de tiempo prolongado siendo la formulación altamente reproducible. Las NPs obtenidas presentan una estabilidad a 5°C ± 3°C de 6 meses sin la incorporación de ningún agente estabilizante en el medio, donde las muestras no sufrieron grandes variaciones en cuanto a tamaño y polidispersión, a diferencia de lo obtenido a temperaturas mayores donde se observó una estabilidad de 7 días a 25°C ± 2°C con un 60% ±5% de humedad relativa. La relación en masa óptima entre el quitosano/TDP/TPP, la cual corresponde a 3:3:1 evidenciada por un menor tamaño de NPs de dispersión monomodal a los 79,28 nm ± 2,5 nm, con un índice de polidispersión de 0,131 ± 0,025.
Tabla 1: Condiciones óptimas de obtención de las NPs de quitosano/TDP/TPP.
Figure imgf000009_0001
El mecanismo propuesto para la formación de nanopartículas de quitosano-TPP plantea que la gelificación iónica del quitosano ocurre por interacciones electrostáticas entre productos de la disociación del TPP en solución acuosa con los grupos NH3+ del quitosano en medio ácido. Este mecanismo de elaboración planteado involucra un proceso de fabricación a alta velocidad lo que potencia la obtención de NPs de un tamaño inferior a los 100 nm.
El hecho que en las NPs de quitosano/TDP/TPP el TDP se encuentra internalizado y que el pH de las suspensiones sea cercano a 5,0, implica que el microambiente al cual se exponen las células en contacto con las NPs sea más inocuo, no toxico y no afecte la viabilidad de estas.
Las NPs son capaces de producir una modificación en las uniones estrechas que se producen cuando la monocapa de las células está completamente formada y además se logra determinar que esta modificación en las uniones estrechas es reversible recuperando en el caso de las soluciones de NPs de Q/TDP/TPP un 93%, esta recuperación es dependiente de la concentración utilizada, ya que entre más alta la concentración de las NPs menor es el porcentaje de recuperación.
Las NPs propuestas permiten la encapsulación de diferentes moléculas o péptidos de interés farmacológico, para lo cual las moléculas son incorporadas a la solución de quitosano/TDP de 25% p/v, donde la carga de las moléculas corresponde al 5 % de la masa total de las NPs. Las soluciones se dejaron reaccionar mediante agitación magnética a 200 rpm por 2 horas, una vez trascurrido este tiempo las NPs fueron elaboradas y caracterizadas mediante análisis de dispersión dinámica de la luz.
Las NPs cargadas con las moléculas activas presentan un diámetro hidrodinámico de 80 ± 6 nm, con un potencial Z de 26,1 ± 0,97 mV, y una polidispersión que no superó los 0,150 PDI.
Este método de encapsulación presenta una eficiencia de encapsulación (%EE) de 31,24 ± 2,8 y porcentaje de carga de principio activo (% Carga) de 0,65 ± 0,03.
El tamaño de las NPs condiciona su capacidad de carga, el cual puede ser modificado drásticamente si se aumenta el tamaño de las NPs. Utilizando el mismo L2015/000067 protocolo se obtuvieron NPs de tamaño a 250 nm ± 10,5nm lo que arrojó como resultado un % de carga equivalente al 4,38 % ± 1,8.
Lo ideal es tener NPs con un tamaño inferior a los 100 nm si se busca una administración intravenosa, pero con un tamaño inferior a 300 se puede lograr una buena administración intranasal de las NPs aumentando así el porcentaje de carga de las moléculas en las NPs por lo tanto es dependiente de la vía de administración.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1: Obtención NPs de quitosano/TPP
El método de obtención de NPs de quitosano/TPP optimizado se describe a continuación:
• Agitación: Ultraturrax®
• Velocidad de agitación: 8000 rpm
• Tiempo total de agitación: 2 minutos
• Temperatura del proceso: 25°C ± 1°C
• Temperatura de las soluciones: 25 °C ± 1 °C
• Concentración estándar TPP: 0,1 % p/v
• Concentración estándar quitosano: 0,25 % p/v
• pH solución TPP: 3,0
• pH solución quitosano: 5,5
• Incorporación: TPP sobre quitosano
• Relación en masa: 3:1
Ejemplo 2: Optimización del proceso de obtención de las NPs de quitosano/TDP/TPP.
2.1 Relación en masa entre quitosano/TDP/TPP
Se decidió probar la incorporación de TDP de forma directa en la formulación de NPs, para ello se prepararon diferentes soluciones que contenían una concentración fija de quitosano 0,25 % p/v y concentraciones variables de TDP generando diferentes 2015/000067 relaciones en masa entre los componentes de la matriz, a estas soluciones se les incorporo de forma directa 4,0 mi de una solución de TPP 0,1 % p/v. Las suspensiones de NPs fueron desarrolladas con los parámetros establecidos luego del análisis multirrespuesta.
Se elaboraron las NPs de Quitosano/TDP/TPP realizadas en un principio, bajo las modificaciones realizadas por Rojanarata et al, donde el TDP se disolvió previamente y posteriormente el quitosano fue disuelto en esa misma solución.
Tras la mezcla de las soluciones de quitosano/TDP y TPP se observó una suspensión transparente, las suspensiones resultantes fueron analizadas por TEM, y analizadas a través de dispersión dinámica de la luz, se identificaron NP de forma irregular, de tamaño que oscilo entre los 79 y 86 nm, para los propósitos de estudios in vivo las NPs bajo los 100 nm se pueden utilizar para estudios de traspaso de la BHE.
Tabla 2: Resumen de tamaño y polidispersión de las suspensiones de NPs obtenidas, en distintas proporciones de masa.
Relación en masa Tamaño
Polidispersión
Quitosano/TDP/TPP (nm)
3:3:1 79,28 0,131
3:3,6:1 80,64 0,157
3:4,2:1* 85,58 0,132
* Análisis de muestra detecta la presencia de polímero disperso en la suspensión
Tras los análisis por dispersión dinámica de la luz, de las suspensiones de NPs observados en la tabla 2, se evidenció la relación en masa óptima entre el quitosano/TDP/TPP, la cual corresponde a 3:3:1 evidenciada por un menor tamaño de NPs de dispersión monomodal a los 79,28 nm, con un índice de polidispersión de 0,131.
2.2 pH de la solución de quitosano/TDP
Establecida la relación en masa óptima para la nueva formulación de NPs de quitosano/TDP y TPP se realizó un estudio de pH de la solución de quitosano/TDP con el fin de obtener NP con un tamaño inferior a los 80 nm. Para ello se estudiaron 4 valores de pH que fueron ajustados una vez preparada la solución que contenía TDP, en primera instancia y una vez disuelto este se procedió a incorporar el quitosano a la misma solución, el pH resultante sin ajuste fue de 2,6, con esta solución se obtuvieron NPs con un tamaño cercano a los 120 nm. En la tabla 3 se aprecian los valores obtenidos luego del análisis a través de dispersión dinámica de la luz.
Tabla 3: Resumen de tamaño y polidispersión de las suspensiones de NP obtenidas a diferentes pH.
pH Solución Tamaño
Polidispersión
Quitosano/TDP (nm)
4,0 86,45 0,135
4,5 72,42 0,147
5,0 90,10 0,146
5,5 103,2 0,174
Se decidió trabajar con un pH de la solución de quitosano/TDP de 4,5 ya que a este pH se logro obtener IMPs con un tamaño de 72,42 nm valor que nos permite utilizar estas NPs para el transporte de fármacos a través de la BHE.
2.3 Determinación de la velocidad de agitación óptima en la formulación de NP de quitosano/TDP/TPP.
Buscando optimizar el tamaño de las NP de quitosano/TDP/TPP se decidió reevaluar la velocidad de agitación utilizada para la fabricación de las NP, manteniendo los valores de los parámetros analizados anteriormente fijos. Para ello se desarrollaron NPs mediante agitación a alta velocidad con el método de Ultraturrax®, se realizaron ensayos con 3 velocidades, donde esta vario entre los 8000 y 13500 rpm. Las suspensiones de NPs resultantes fueron analizadas por dispersión dinámica de la luz, donde se analizó su tamaño y polidispersión.
Tabla 4: Evaluación de velocidad de agitación en NPs de quitosano/TDP/TPP.
Velocidad de Tamaño
Polidispersión
agitación (rpm) (nm)
8000 72,42 0,147
9500 87,72 0,160
13500 83,86 0,130 En la tabla 4 se puede apreciar un efecto mínimo en relación al diámetro medio de las NPs al cambiar la velocidad de agitación durante el proceso de fabricación, por lo que se decidió establecer como parámetro de elaboración una velocidad de 8000 rpm que da como resultado NPs de quitosano/TDP/TPP de forma irregular, superficie lisa, Con esta velocidad de agitación se alcanzan menores tamaños, con una menor energía entregada al sistema favoreciendo así la estabilidad de la suspensión.
2.4 Determinación de porcentaje de inclusión de TDP en la formulación
Se determinó la cantidad de TDP incluido en la formulación de forma indirecta cuantificando por espectrofotometría UV el sobrenadante de la suspensión de NPs. Para ello las suspensiones de NPs, fueron traspasadas a tubos de centrifugación y se centrifugaron por 25 minutos a 19000 a 15 °C. Posteriormente se realizó una curva de calibración de TDP (λνν= 246,9 nm). Las concentraciones de los estándares variaron entre 1x10-5 y 5x10-5 M (pH de 4,5). Las soluciones de los sobrenadantes de la centrifugación se diluyeron y se cuantifico el TDP presente.
La determinación de TDP arrojó un porcentaje de inclusión del 78% ± 4,8 según los análisis realizados para la determinación indirecta de este en la suspensión de NPs, la interacción que se produce entre el TDP y el TPP esta mediado por la formación de pares iónicos que se forman entre las cargas positivas del quitosano y las cargas negativas que presenta el TDP.
Ejemplo 3: Caracterización de las NP de quitosano/TDP/TPP
Las NP se caracterizaron en cuanto a su tamaño, forma, distribución de tamaños, espectroscopia infrarroja y potencial Zeta. Se analizaron NP de quitosano/TPP y quitosano/TDP/TPP, para tener una comparación de sus características.
3.1 Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
La observación de nanopartículas se realizó depositando una gota de suspensión filtrada en un filtro de nylon de 0,45 pm sobre una grilla de cobre cubierta por una película de carbón, la que se dejó secar a temperatura ambiente durante aproximadamente 12 horas. En ellas, se evaluó la presencia de micropartículas, nanopartículas y polímero disperso presente en la suspensión. En ambas suspensiones de NPs obtenidas por el método optimizado, solamente se encontraron NPs sin presencia de polímero disperso como se puede apreciar en las figuras 1 NPs de quitosano/TPP y figura 2 NPs de quitosano/TDP/TPP.
3.2 Dispersión dinámica de la luz
Este análisis, de dispersión dinámica de la luz, se realizó con el equipo Zetasizer ZS90 para determinar tamaño (diámetro medio), distribución de tamaño y cantidad de partículas de la suspensión de NPs. Las suspensiones fueron irradiadas por un láser y producto del movimiento browniano de las partículas y la dispersión del láser, el equipo puede interpretar estas señales como los tamaños de las NPs presentes. Las muestras fueron depositadas en una cubeta de poliestireno y analizadas por triplicado, a una temperatura de 25°C y en un ángulo de 90°.
El análisis de las NPs de quitosano/TPP y quitosano/TDP/TPP por dispersión dinámica de la luz luego de la optimización del proceso de fabricación arrojó en ambas suspensiones la presencia de NPs con un diámetro medio de 64,5 ± 1,8 nm y 75,7 ± 2,5 nm respectivamente (figura 3), con características unimodales, sin la presencia de polímero disperso ni agregados en la formulación. La obtención de NPs con tamaños inferiores a los 100 nm en ambas formulaciones finales favorece los estudios posteriores de internalización de las NPs a nivel cerebral, esto ya que se necesita de un tamaño uniforme e inferior a 100 nm para que las NPs sean capaces de internalizarse en el cerebro y así atravesar la BHE.
3.3 Potencial Zeta.
El Potencial Zeta de las NPs se estudió para verificar la estabilidad de las suspensiones, el análisis se realizó con el equipo Zetasizer ZS90, el principio de esta medición es la aplicación de un campo eléctrico a una celda, en este caso una cubeta especial de policarbonato que posee celdas conductoras. La medición del potencial zeta se realiza por electroforesis de láser Doppler. Las muestras de las suspensiones fueron medidas directamente y diluidas en proporción 10:1, desde las celdas de conducción. Cada análisis se realizó por triplicado a 25 °C. Se identifico un potencial zeta positivo de 32,6 ±3,9 mV en las NP de quitosano/TPP y de 26,2 ± 0,45 mV en las NPs de quitosano/TDP/TPP, esta cualidad les permite a las NP ser estables por un periodo de tiempo prolongado. Este análisis sirvió para verificar la posición de los componentes de la matriz en la NPs, al tener una carga positiva índica la posición externa del quitosano respecto al TPP en la NPs, otra propiedad que se puede inferir del análisis, es la propiedad de las NPs para adherirse a los tejidos. En la figura 4 se muestra el análisis realizado en el equipo Zetasizer a ambas suspensiones de NPs.
3.4 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR)
Para el análisis de espectroscopia FT-IR se analizaron todos los componentes de la matriz de las NPs por separado (quitosano, TDP y TPP), una pequeña cantidad de estos fue colocada en un mortero de ágata junto a un exceso de KBr, la mezcla fue triturada y finalmente colocada en un soporte para generar una pastilla de análisis. Las suspensiones de NPs de quitosano/TPP y quitosano/TDP/TPP fueron sometidas a un proceso de liofilización por 24 horas, el sólido resultante fue pulverizado y sometido al mismo proceso descrito con anterioridad con el fin de obtener el espectro de las NP y generar la comparación entre los componentes de la matriz individuales y las NPs respectivas.
A partir de los espectros FT-IR analizados se toma como banda característica a la localizada a 1320 cnr1, y como referencia la banda a 1420 cnr1. Se realizaron las espectroscopias FT-IR de las NP liofilizadas de quitosano/TPP (figura 5) y quitosano/TDP/TPP (figura 6). En el espectro FT-IR al analizar el espectro de quitosano se observan tres picos característicos, uno en 3365 cm"1 correspondiente a la banda (OH), 1153 cm"1 para la banda (COC) y 1579 cnr1 para la banda (NH2).
El espectro de las NPs de quitosano/TPP se muestra diferente al de quitosano matriz. En el caso de las NPs de quitosano/TPP la vibración correspondiente a la flexión NH2 a los 1579 cm"1 disminuye; en cambio, aparecen dos nuevos picos 1638 cm"1 y 1700 cm'1; esto, probablemente, debido a la protonación de los grupos NH2 que ahora son iones NH3 y a la formación del enlace hidrógeno entre los O-TPP y los H de los grupos amino libres.
Al analizar el espectro de quitosano una banda a 3482 cm"1 indica la presencia del grupo OH (vibración de estiramiento). En las NPs de quitosano/TDP/TPP se observó un cambio desde 3482 cm"1 a 3449 cnr1 observándose una disminución del ancho de la banda, lo que indica la reducción de enlaces de hidrógeno. La cantidad reducida de enlaces de hidrógeno en los complejos de NPs reticuladas se debe a la estructura más abierta que resulta de la reticulación con el TPP y el TDP presentes en la matriz.
Otra alteración en los espectros FT-IR que indican la formación de NPs es el cambio de las bandas 1657 y 1576 cm"1 a 1643 y 1536 cm'1 en el espectro de las NPs, lo que representa los grupos CONH2 y NH2, respectivamente. El desplazamiento de estas dos bandas y una mayor intensidad de la banda NH2 banda también fue observado por otros investigadores, lo que sugiere la interacción iónica entre los grupos amino cargados positivamente del quitosano y con los grupos fosfato cargados negativamente del TPP.
3.5 Estudio de estabilidad para NPs de quitosano/TPP y quitosano/TDP/TPP
Para el desarrollo del estudio de estabilidad de la suspensión de NPs de quitosano se decidió utilizar la metodología presente tanto en la norma ICH Q-1A y la guía de estabilidad del instituido de salud pública (ISP), para formas farmacéuticas destinadas a ser conservadas en refrigeración, se trabajó en condiciones aceleradas y a largo plazo, las condiciones de trabajo se pueden apreciar en la tabla 5. El análisis de las muestras incluye los datos de 3 lotes de producción y la evaluación estadística de un dato cuantitativo que cambie con el tiempo se establece con un límite de confianza unilateral del 95% para el promedio del criterio de aceptación.
Se evaluaran los siguientes cambios como significativos en los parámetros de estabilidad:
• Disminución del 5% en la valoración del parámetro de medida (tamaño, polidispersión y cantidad de partículas) comparado con el tiempo cero.
• Presencia de productos de degradación.
• No cumplimiento de criterios de aceptación por cambios en la apariencia. Tabla 5: Condiciones para el estudio de estabilidad de las NPs de quitosano/TPP y quitosano/TDP/TPP.
Condiciones de Tiempo de Frecuencia de
Estudio
almacenamiento análisis evaluación
1,15, 45 días y
Tiempo real 5°C ± 3°C 6 meses
mensual
Tiempo 25°C ± 2°C Los 3 primeros días
30 días
acelerado 60% HR ± 5% HR y luego cada 2 días
Para el estudio se preparó una cantidad adecuada de suspensión de NPs por triplicado de quitosano/TPP y quitosano/TDP/TPP, una alícuota de 4 mi de las respectivas suspensiones fueron almacenadas en frascos de penicilina y selladas a presión, cada uno de estos frascos correspondía a una muestra en un determinado periodo de tiempo. Una cuarta muestra fue almacenada y corresponde a una dilución 1:1 de las respectivas suspensiones de NPs con NaCI 0,9 % p/v. Las muestras fueron analizadas por dispersión dinámica de la luz, donde se analizó su tamaño y polidispersión y los resultados fueron analizados por una ANOVA de dos vías.
Dentro de una formulación farmacéutica una de las propiedades mas importantes tiene relación con la estabilidad de la formulación, sobre todo en el caso de las NPs de quitosano ya que características tales como el tamaño de la suspensión en solución se transforman en un punto critico cuando estas son almacenadas durante largos períodos de tiempo.
En el caso de las suspensiones almacenadas a 25°C (ver Figuras 7 y 8) el estudio debió ser suspendido luego de 7 días de almacenamiento de las muestras debido a la presencia de hongos en la formulación lo que altero de sobremanera el medio acuoso en el que se encontraban las formulaciones tanto de NPs de quitosano/TPP como de NPs de quitosano/TDP/TPP, este se debió principalmente a que las condiciones de almacenamiento preestablecidas de las materias primas como es el caso del quitosano (Protasan®) es bajo refrigeración, si estos criterios no se cumplen como es el caso de el almacenamiento a 25°C el medio de la suspensión de NPs se desestabiliza debido a la degradación que sufren las NPs de quitosano modificando el medio acuoso y facilitando la proliferación de microorganismos como es el caso de los hongos y bacterias. Las muestras a simple vista arrojaron turbidez y la presencia de sedimentos, lo que se debió a la presencia de hongos y por otro lado puede deberse a la hinchazón sustancial de las NPs de quitosano debido a su almacenamiento a 25°C lo que se explica ya que la turbidez se asocia con un crecimiento de tamaño de las partícula en el medio, debido a la entrada de agua en las NPs por osmosis debido a la presencia del TPP. Lo que genera que las NPs se expandan y el quitosano que forma la matriz de las NPs se fracture.
El análisis estadístico evaluó si ambas formulaciones generan el mismo efecto en el tamaño de las NPs en relación a todos los tiempos analizados, lo que se desestimo con un valor p > 0,05 ya que el tipo de formulación no influye de forma directa en la variación de tamaño si se evalúa cada tiempo analizado, a su vez se analizo cual de las dos formulaciones tiene un mayor efecto en cuanto a la variabilidad del tamaño en las nanopartículas, sin embargo en este caso el efecto es considerado no significativo con un valor p > a 0,05 por lo tanto no hay una formulación que se imponga sobre la otra y finalmente se evaluó si el tiempo afecta o no a cada formulación y se determino que si afecta a las formulaciones pero de manera no tan relevante con un valor p = 0,0528.
En el caso del análisis de la polidispersión el tipo de formulación y el tiempo de almacenamiento tienen un efecto extremadamente significativo con un valor p < 0,05 en cuanto a la influencia sobre la variabilidad que presentan ambas formulaciones de la polidispersión.
En las suspensiones almacenadas a 5°C el estudio se completo en un 100% completando los 120 días de estudio, las muestras no sufrieron grandes variaciones en cuanto a su análisis de tamaño y polidispersión (ver Figuras 9 y 10), esto se debió en gran medida a que se respetaron las condiciones de almacenamiento preestablecidas de las materias primas (Protasan®). El análisis estadístico evaluó si ambas formulaciones generan el mismo efecto en el tamaño de las NPs en relación a todos los tiempos analizados, si las formulaciones tiene alguna incidencia en la variación del tamaño de las NPs a y finalmente se evaluó si el tiempo afecta o no a cada formulación los resultados arrojaron que cada parámetro evaluado estadísticamente es altamente significativo en cuanto a generar variaciones de tamaño en las formulaciones de NPs con un valor p < 0,05. En el caso del análisis de la polidispersión el tipo de formulación y el tiempo de almacenamiento no tienen un efecto directo que influya en la polidispersión de las suspensiones de NPs de quitosano.
Ejemplo 5: Estudio de viabilidad celular
Las células Caco-2 fueron utilizadas para la determinación de todos los estudios que involucran un modelo epitelial, estas fueron obtenidas luego de 7 días de incubación a 37 °C con un 5% de C02 con medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de SFB, el medio de cultivo fue cambiado una vez al día durante 7 días de incubación, los resultados obtenidos fueron reproducibles cada vez que se necesito la línea celular con una viabilidad promedio de un 97,5%.
5.1. Preparación de reactivos para test MTT (Bromuro de 3(4,5 dimetil-2- tiazoil)-2,5- difeniltetrazólico)
Para el desarrollo del estudio de viabilidad celular se utilizo el test de MTT, este método es simple y se usa para determinar la viabilidad celular, dada por el número de células presentes en el cultivo lo cual es capaz de medirse mediante la formación de un compuesto coloreado, debido a una reacción que tiene lugar en las mitocondrias de las células viables. El MTT (Bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5- difeniltetrazólico), es captado por las células y reducido por la enzima succínico deshidrogenasa mitocondrial a su forma insoluble formazán, el producto de la reacción queda retenido en las células y puede ser liberado mediante la solubilización con SDS (lauril sulfato de sodio).
5.2 Preparación de células y sembrado de placas de cultivo
Para realizar el análisis con MTT se utilizaron placas de 48 pocilios, células Caco-2 con 7 días de confluencia con una viabilidad celular mayor al 95%, estas fueron colocadas en las placas de 48 pocilios en una cantidad equivalente a 200.000 células/pocilio las que fueron luego colocadas en cámaras de cultivo a 37°C y 5 % C02 por 24 horas, una vez transcurrido este tiempo se realizo el estudio de MTT con el siguiente protocolo: a) Eliminación completa del medio de cultivo de las placas de 48 pocilios. b) Colocar NPs con medio de cultivo en concentraciones equivalentes de 50 -100- 200-400-600-800 y 1000 pg/ml de quitosano.
c) Tiempo de exposición de las células con las NPs 3 horas a 37°C y 5 % C02. d) Trascurridas las 3 hrs se elimino por completo el medio de cultivo DMEM 10% SFB que contenía las NPs, las células fueron lavadas con PBS estéril, se incorporan 100 μΙ de medio RPMI (libre de rojo fenol) y se agregaron finalmente 10 μΙ de reactivo MTT, las placas fueron dejadas en cultivo a 37°C y 5% C02 por 2 horas.
e) Transcurridas las 2 hrs se incorporó a cada pocilio 100 μΙ de SDS, dejando las placas en cultivo por un periodo máximo de 16 hrs con el fin de disolver los cristales de formazan que se produjeron por la reacción del MTT.
f) Las placas fueron analizadas mediante espectrofotometría a una longitud de onda que fluctuó entre 540 nm y 570 nm, se calculó el índice de estimulación (IE) para determinar luego el % de viabilidad celular considerando los IE correspondientes a cada muestra x y el IEo correspondiente a las células Caco-2 sin exposición a agentes externos.
Absorbancia Muestra - Absortando. Blanca
Έ =
Absorbencia B ¡taraco
Ecuación 1: Cálculo índice de estimulación itx
Viabilidad ceMer -— x 100
IEo
Ecuación 2: Cálculo % de viabilidad celular
Los análisis fueron realizados por octuplicado y se evaluó el efecto sobre la viabilidad celular de los siguientes agentes externos:
1- Solución de quitosano
2- Solución de quitosano/TDP
3- NPs de quitosano/TPP
4- NPs de quitosano/TPP/TDP
Junto con esto se evaluó el efecto de los respectivos controles, un control de medio DMEM 10% SFB libre de agentes externos, un control de solvente equivalente a una solución de NaCI 50 mM y un control positivo que correspondió a SDS en alta concentración.
En la determinación de viabilidad celular se identifico que las células Caco-2 expuestas a NPs de quitosano tienen una citotoxicidad inferior al 20% como se puede apreciar en la figura 11, sin embargo las soluciones de quitosano generan un mayor daño a nivel celular, si lo comparamos con las NPs de quitosano.
En la figura 12 se puede apreciar con mayor detalle la diferencia que se produce entre las NPs de quitosano/TPP y la solución de quitosano a las mismas concentraciones obteniéndose una disminución de la viabilidad celular promedio no mayor al 20 % en todas las concentraciones de quitosano analizadas a acepción de la concentración de 100 ug/ml, lo que se puede explicar en cierta medida debido a que en ese pocilio de la placa se puede haber sembrado una mayor numero de células, generando como consecuencia un deterioro menor. Por otro lado el control, que correspondió a medio salino en el que están insertas las NPs de quitosano no genero ningún daño por lo que el efecto sobre la viabilidad celular es atribuido en un 100 % a las NPs de quitosano/TPP o a la solución de quitosano. Si se realiza una comparación entre el efecto sobre la viabilidad celular de las NPs de quitosano/TPP vs la solución de quitosano se puede apreciar que la solución de quitosano genera un daño menor a la misma concentración que las NPS de quitosano/TPP, esto se puede deber a que en las NPs de quitosano/TPP se encuentra presente el TPP, molécula que igual puede afectar la viabilidad celular de las células Caco-2 cuando se exponen de forma directa sobre ellas.
En la figura 13 se puede apreciar con mayor detalle la diferencia que se produce entre las NPs de quitosano/TDP/TPP y la solución de quitosano/TDP a las mismas concentraciones obteniéndose una disminución de la viabilidad celular promedio no mayor al 15 % en el caso de las NPs de quitosano/TDP/TPP en todas las concentraciones de quitosano analizadas, en relación con la solución de quitosano/TDP en donde se aprecio un efecto sobre la viabilidad celular mayor y dependiente de la concentración, ya que a concentraciones mayores de quitosano (400 -600 -800 y 1000 pg/ml) se observa un daño a nivel celular que bordea el 30 %, esto se puede explicar en cierta manera ya que en el caso de las NPs de quitosano/TDP/TPP el TDP se encuentra internalizado en la NPs y el pH de las suspensiones es cercano a 5,0, mientras que en el caso de la suspensión de quitosano/TDP el TDP se encuentra libre en la solución y el pH es de 4,5, por lo que se puede dilucidar que el pH al cual se encuentra el agente externo al cual se exponen las células Caco-2 es considerado un factor importante de daño a nivel celular, lo que explicaría la gran diferencia que se produce al exponer las células Caco-2 tanto a las NPs de quitosano/TDP/TPP y a la solución de quitosano/TDP.
Ejemplo 6. Determinación de la resistencia transepitelial (TEER)
6.1 Determinación de la variabilidad de la TEER en presencia de las NPs de quitosano/TPP y NPs de quitosano/TDP/TPP
Para la determinación de la TEER se utilizaron placas Transwell de 24 pocilios con un diámetro de membrana de 0,33 cm2, las placas fueron sembradas con un volumen equivalente de 200.000 células/pocilio las que fueron sembradas luego de que las células estuvieran con 7 días de confluencia. La TEER fue medida diariamente hasta alcanzar un valor de resistencia que permaneciera constante (300 Ω). Una vez obtenido este valor se removió el medio de cultivo de la placa y se reemplazo por una suspensión de NPs de quitosano/TPP y NPs de quitosano/TDP/TPP, en medio de cultivo DMEM 10% SFB, evaluando los valores de TEER al tiempo 0-0,5-1-1,5-2-4-6-8 y 10 hrs, luego de la exposición con las NPs se elimino el medio de cultivo, las células fueron lavadas con PBS estéril y se repuso el medio de cultivo DMEM 10% SFB, libre de agentes externos, volviendo a evaluar la TEER a las 12 y 24 hrs después de repuesto el medio de cultivo. Junto con las NPs de quitosano fueron evaluadas las respectivas soluciones de quitosano, TPP y TDP acompañadas de un control de medio DMEM 10% SFB libre de agentes externos y un control de solvente equivalente a una solución de NaCI 50 mM, para todos los análisis se utilizaron concentraciones equivalentes a 50 pg/ml y 100 pg/ml de quitosano, estos fueron realizados por triplicado y los resultados se analizaron por ANOVA de una vía.
TEER = (fl Monoc pa -R Blanco) X Area de Membrana
Ecuación 3: Cálculo de TEER Se realizó un seguimiento de la variación de la TEER en monocapas de células Caco-2 con el fin de estudiar el efecto del quitosano en solución y en NPs de quitosano/TPP o NPs de quitosano/TDP/TPP sobre la integridad de las uniones estrechas. En la figura 14 se observa que, tanto las NPs como la solución de quitosano y quitosano/TDP provocaron una reducción significativa (p<0,05) de la TEER de las monocapas con respecto a la TEER inicial y con respecto al control. Además, el efecto de la solución de quitosano sobre la TEER fue significativamente menor que el de las nanopartículas (p<0,05).
El descenso de la TEER se observó tanto con las soluciones de quitosano y quitosano/TDP como con las NPs de Q/TPP y Q/TDP/TPP, aunque el efecto fue más pronunciado en el caso de las NPs. Esto puede ser debido al efecto de la carga superficial positiva, que resultó más alta en las NPs, lo que favorece la mucoadhesion de las NPs sobre las membranas celulares. Una mayor cantidad de cargas positivas provoca una interacción más fuerte con las cargas negativas de las membranas celulares. Por tanto, esto puede hacer que el efecto sobre la apertura de las uniones estrechas sea más prominente.
Al analizar los valores de TEER obtenidos una vez expuestas las NPs se confirma el echo de que las NPs de quitosano son capaces de producir una modificación en las uniones estrechas que se producen cuando la monocapa de las células caco-2 esta completamente formada y además se logra determinar que esta modificación en las uniones estrechas es reversible recuperando en el caso de las soluciones de quitosano y quitosano/TDP un 94 y un 93% de la integridad de la membrana, y en el caso de las NPs de Q/TPP y NPs de Q/TDP/TPP un 90 y 93% respectivamente. Cuando el movimiento de iones a través de la monocapa está restringido debido al correcto funcionamiento de la unión estrecha, existe un gradiente de potencial eléctrico a ambos lados de la misma. Por ello, la integridad y la madurez de las uniones estrechas se suele determinar midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), que es inversamente proporcional a la permeabilidad, en este caso se logro establecer que el quitosano tiene la habilidad para alterar la permeabilidad de forma reversible favoreciendo así el transporte de diferentes sustancias a través de diferentes epitelios. Con el fin de evaluar si el efecto de las soluciones de quitosano, quitosano/TP y las NPs de Q/TPP y Q/TDP/TPP era dependiente de la concentración de quitosano se evaluó el efecto de las mismas a una concentración mayor (100 g/ml) sobre una monocapa de células Caco-2. En la figura 15 se observa que la recuperación de la TEER es dependiente de la concentración de quitosano a la cual fue expuesta la monocapa de células Caco-2, ya que a concentraciones mayores si bien se logra el mismo efecto de reducción de la TEER, luego se ser expuestas las células a las soluciones y NPs de quitosano, la recuperación de la monocapa es menor obteniendo porcentajes de recuperación de integridad de membrana cercanos al 70%.
Ejemplo 7: Encapsulación de molécula bloqueadora de TNF-α (El: Etanercept).
Para la encapsulación de la molécula se toma una alícuota de El previamente purificada la cual se incorporó en una solución de quitosano de 0,25 % p/v y una solución de quitosano/TDP de 0,25 % p/v equivalente al 5 % de carga de la masa de solido presente en las NPs elaboradas, las soluciones se dejaron reaccionar mediante agitación magnética a 200 rpm por 2 horas, una vez trascurrido este tiempo, fueron incorporados de forma directa 4 ml_ de la solución de TPP 0,1 % p/v. las NPs fueron elaboradas y caracterizadas mediante análisis de dispersión dinámica de la luz.
Para determinar la cantidad de El encapsulada en las NPs se utilizó el método de BCA, el proceso de obtención de El se realizó de acuerdo al siguiente protocolo: a) 500 μΙ de la muestra (NPs de quitosano con El encapsulado) fueron centrifugados a 14000 rpm durante 20 min a temperatura de 20 °C utilizando filtros de centrifugación Amicon® Ultra-0,5.
b) El sobrenadante retenido en el portafiltro es retirado inmediatamente y el filtro es traspasado a otro portafiltro pero en posición invertida para recibir el pellet formado.
c) El pellet retenido es obtenido luego de centrifugar el filtro a 1000 rpm por 2 min.
d) Al pellet obtenido agregar 1 mL de ácido acético 0,2 N.
e) Agitar por 5 min en vortex. f) Sonicar durante 10 min.
g) Diluir lo necesario para obtener una concentración dentro del rango de la curva de calibración por el método de BCA.
La cantidad de El encapsulada fue expresada con los parámetros de porcentaje de eficiencia de encapsulación (%EE) y porcentaje de carga de principio activo (% Carga), lo que se expresa en la ecuación 4 y 5.
Masa El total
Ecuación 4: Cálculo porcentaje eficiencia de encapsulación
Masa El wncapsulada
% Carga = — X 100
Masa polímero total
Ecuación 5: Cálculo porcentaje de carga de El
Se logró encapsular El en NPs de quitosano/TPP y NPs de quitosano/TDP/TPP, las NPs resultantes obtuvieron un diámetro hidrodinámico de 73,2 ± 2,5 nm y 83,1 ± 4,5 nm respectivamente, con un potencial Z de 30,1 ± 0,58 mV y 26,1 ± 0,97 mV en ambas formulaciones la polidispersión no supero los 0,150 PDI. En la tabla 6 se pueden apreciar los valores de eficiencia de encapsulación (%EE) y de % de carga logrado luego del proceso de encapsulación de BSA en las NPs. Cabe señalar que el balance de masa equivale al 101 y 105 % respectivamente.
Tabla 6: Resultados de encapsulación de BSA en NPs de Q/TPP y NPs de Q/TDP/TPP.
Formulación % EE % Carga
NPs Q/TPP 35,67 ± 2,4 0,61 ± 0,02
NPs Q/TDP/TPP 31,24 ± 2,8 0,65 ± 0,03
Si bien se logró encapsular El el % de carga de la encapsulación es inferior al 1 % esto se debe principalmente a que el tamaño de las NPs de quitosano utilizadas es inferior a los 100 nm lo que condiciona de sobremanera la capacidad de carga que pueden alcanzar las NPs de quitosano, este valor puede ser modificado drásticamente si se aumenta el tamaño de las NPs de quitosano. Utilizando el mismo protocolo de obtención de NPs de quitosano/TPP se decidió aumentar su tamaño a 250 nm ± 10,5nm lo que arrojó como resultado un % de carga equivalente al 4,38 % ± 1,8, demostrando así que el factor mas importante que limita la carga de las NPs con El es el tamaño.
Ejemplo 8: Identificación de la presencia de NPs en el SNC.
8.1 Incorporación del marcador fluorescente.
En un primer paso, se disolvió 250 mg de quitosano en 25 mi de agua nanopura y 10 mg de tiocianato de fluoresceína (FiTC) fueron disueltos en 1 ml_ de etanol. Ambas soluciones fueron mezcladas, con agitación magnética permanente por 24 horas en una pieza oscura temperada a 37°C. El conjugado resultante fue purificado por diálisis, durante 72 horas, (empleando tubos de diálisis de tamaño de poro 12 KDa), cambiando el medio cada 24 horas. La solución aislada de Quitosano- RTC, fue congelada a -55 °C en un baño de etanol, y posteriormente liofilizada, para extraer completamente el solvente residual.
8.2 Elaboración de NPs fluorescentes recubiertas de polisorbato 80.
Debido a las características de superficie que otorga el polisorbato 80 a las NPs, respecto a su incorporación al SNC, éste fue incluido como agente de recubrimiento, para las NPs de administración intra venosa. Para ello el quitosano-FiTC fue disuelto en agua nanopura y su pH fue ajustado a 4,5. La solución de TPP fue mezclada junto con el polisorbato 80 (1% v/v) por 24 horas, para luego, proceder con la elaboración de las NPs, proceso descrito en el ejemplo 1 y 2.
Las suspensiones obtenidas fueron analizadas por dispersión dinámica de la luz para conocer su diámetro medio (Tabla 7).
Tabla 7: Distribución de tamaños de NP marcadas con FiTC.
Diámetro promedio
Composición de NP PDI
± DS [nm].
Quitosano/TPP/ sin
131 ± 13 0,231 ± 0,108
polisorbato 80
Quitosano/TPP/ con
75 ± 11 0,463 ± 0,125
polisorbato 80 Se evidenciaron NPs de FiTC cuyos diámetros medios fluctuaron entre 75 y 130 nm, en presencia o no de polisorbato 80, respectivamente. Con estas NPs se realizaron las siguientes pruebas para verificar su traspaso al SNC.
8.3 Ensayos in vivo.
Una vez caracterizadas las NPs, y con el objetivo de verificar el traspaso a través de la BHE por parte de las NPs se realizaron ensayos in vivo. Estos ensayos se efectuaron según el protocolo de uso de animales de la Universidad de Concepción. Para ello se emplearon 5 ratas de raza Sprague Dawley, machos y hembras de peso entre los 250 y 450 gramos. La suspensión de NPs marcadas fue administrada por vía intravenosa (IV). Las tablas 8 y 9 resumen las condiciones del estudio:
Tabla 8: Formulaciones administradas en estudio in vivo.
Formulación Composición NP Recubrimiento
polisorbato 80
N°l NPs-RTC No
N°2 NPs-FiTC Si-
Control NaCI 0,9 % p/v. No
Tabla 9: Estudio in vivo
Figure imgf000028_0001
3 - 4 300 2o IV 60
5 300 Control IV 60
*Los volúmenes inyectados fueron calculados de acuerdo al peso de cada rata. La concentración de la suspensión estaba bajo la DL50 de todos los componentes de la formulación.
Una vez sacrificados los animales, se procedió a extraer su cerebro, hígado y bazo. Se depositaron en una solución de fijador, compuesta por paraformaldehído al 4 % y buffer fosfato salino (PBS) 1 M. Posteriormente éstos se cortaron para mejorar la penetración del fijador y se guardaron por 24 horas a temperatura ambiente. Los cortes histológicos de los diferentes órganos se realizaron con un vibratomo. Los cortes de cerebro tuvieron un espesor entre los 50-60 pm, 40 pm para hígado y 30 pm para bazo. Los cortes de cerebro fueron teñidos mediante tinción Dapi, por inmersión durante 30 minutos (1/1000 en PBS). Posteriormente los cortes fueron observados por microscopía confocal y microscopía confocal espectral.
En el análisis histológico del hígado de la rata control se pudo apreciar escases de fluorescencia (Fig. 16A), a diferencia de aquel obtenido de ratas que recibieron la suspensión de NPs N°l (Fig. 16B) o la suspensión de NPs N°2 (Fig. 16C), donde es posible observar a las NPs dentro de los hepatocitos, además de una mayor fluorescencia en los vasos de este órgano. La llegada de la formulación al hígado, da cuenta de éste como parte del sistema reticular, siendo el depurador de sustancias que ingresan al torrente sanguíneo. Esto además permitió comprobar la eficacia del recubrimiento para ayudar a las NPs a sortear este órgano del sistema reticular.
En el análisis del bazo de las ratas (Fig. 17) órgano que también pertenece al sistema reticular, se pudo observar en los cortes histológicos realizados una alta fluorescencia basal del tejido (A), la cual aumenta al inyectarse las suspensiones de NPs fluorescentes N°l y N°2 (B y C respectivamente). Dado que el análisis del bazo de las ratas sin la incorporación de NPs arrojo fluorescencia basal debido a la presencia de componentes de metabolización, no se puede aseverar en un 100 % que la presencia de fluorescencia en éste sea atribuible a la presencia de NPs, dificultando el análisis de este órgano en particular.
En el análisis del cerebro de las ratas se pudo observar una escasa fluorescencia verde cerca de los núcleos de las neuronas del hipocampo, tras administrar el control (A), sin embargo en (B) correspondiente al hipocampo de las ratas que fueron inyectadas con NPs recubiertas con polisorbato 80, se observó que las NPs se encontraban presentes en el vaso de la microcirculación cerebral, y en las zonas cercanas a ellas, también se encontraron puntos fluorescentes cercanos a los núcleos de las neuronas (flechas). El mecanismo de especificidad cerebral de las NPs recubiertas con polisorbato 80 no se conoce totalmente, pero se cree que las NPs recubiertas con polisorbato 80 se unen con la apolipoproteína E presente en el plasma. La unión puede ser responsable de la orientación de las NPs a nivel cerebral, esta unión puede llevar a imitar a las lipoproteínas de baja densidad (LDL), y así obligar a los receptores de LDL presentes en las células endoteliales vasculares del cerebro a reconocerlas como tal y desencadenar su absorción, a través de un mecanismo de endocitosis seguido por transcitosis a través del endotelio y la posterior recaptación por las neuronas en el parénquima cerebral. Siendo el tamaño de las NP lo que controla la tasa de endocitosis a través de las células endoteliales de los capilares del cerebro, debido a que su tamaño es similar al de las LDL, asociado a la presencia de polisorbato 80 en su superficie de las NPs, lo que desencadena el reconocimiento de los receptores específicos favoreciendo así la internalización de estas a través de la BHE.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Nanopartículas a base de quitosano para el transporte de péptidos con actividad en el sistema nervioso central CARACTERIZADAS porque está compuesto por: a. quitosano, como base;
b. tripolifosfato sódico (TPP), como agente entrecruzante; y
c. pirofosfato de tiamina (TDP), como agente señalizador.
2. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque los componentes quitosano/TDP/TPP están en una relación en masa de 3:3:1.
3. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque poseen un diámetro medio de 80 ± 6 nm.
4. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque poseen un diámetro medio de 250 ± 10,5nm
5. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque presentan un potencial zeta positivo 26,2 ± 0,45 mV.
6. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque presentan una estabilidad a 5°C ± 3°C de 6 meses sin la incorporación de ningún agente estabilizante en el medio.
7. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque presentan un índice de pol ¡dispersión de 0,131 ± 0,02.
8. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque presentan una eficiencia de encapsulación de 31,24 ± 2,8.
9. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1 y 3, CARACTERIZADAS porque presentan un porcentaje de carga de principio activo de 0,65 ± 0,03%.
10. Nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1 y 4, CARACTERIZADAS porque presentan un porcentaje de carga de principio activo de 4,38 % ± 1,8%.
11. Uso de nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 1, CARACTERIZADO porque se utiliza para fabricar un medicamento útil en afecciones del sistema nervioso central.
12. Uso de nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 11 y 9 CARACTERIZADO porque se utiliza para fabricar un medicamento de administración intravenosa.
13. Uso de nanopartículas a base de quitosano, según reivindicación 11 y 10 CARACTERIZADO porque se utiliza para fabricar un medicamento de administración intranasal.
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