WO2016097663A1 - Procédé et dispositif optique de suivi d'objets en temps réel - Google Patents

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WO2016097663A1
WO2016097663A1 PCT/FR2015/053684 FR2015053684W WO2016097663A1 WO 2016097663 A1 WO2016097663 A1 WO 2016097663A1 FR 2015053684 W FR2015053684 W FR 2015053684W WO 2016097663 A1 WO2016097663 A1 WO 2016097663A1
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objects
medium
photons
hyper
scattering intensity
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/053684
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English (en)
Inventor
Jean-Michel Vaca
Pierre François BREVET
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon 1
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Publication date
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon 1, Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Universite Claude Bernard Lyon 1
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/636—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited using an arrangement of pump beam and probe beam; using the measurement of optical non-linear properties

Definitions

  • the present invention relates to a method and an optical device for tracking objects in real time.
  • Said objects are typically of biological origin such as: DNA, enzymes, proteins, or of chemical origin, such as molecular aggregates, macromolecules (in particular polymers), functionalized or non-functionalized nanoparticles.
  • biological processes depend on molecular interactions that can be represented as the interaction between two objects of the same nature or of different nature. These interactions are at the heart of intensive investigations in biopharmaceutical laboratories, cosmetics, agribusiness, etc. seeking to track and characterize the interaction, for example in terms of anchoring molecules to their target for therapeutic treatment, conformational change, polymerization, etc.
  • the optical methods are poorly adapted when the desired length scales become well below the wavelength of the incident light, which is of the order of half a micrometer in the visible range.
  • the process (1) can be coherent, still called coherent SHG, and in this case dependent on N 2 where N is the number of objects participating in the process, or incoherent, and in this case depending on N only.
  • This last process is usually called Hyper Rayleigh scattering (or HRS).
  • HRS Hyper Rayleigh scattering
  • the Rayleigh scattering is an incoherent process in the electric dipole approximation, the intensity varies linearly with the number of scattering elements (ie the molecules for a liquid), and the diffusion process has a non-zero angular radiation pattern in the whole space of 4 ⁇ radians.
  • a sample is excited by means of a light beam at the fundamental frequency and the photons resulting from this excitation are collected towards a detector. It is customary to use an incident excitation beam at right angles to the collection direction of the scattered light in order to reduce light pollution on the detector by the incident beam.
  • This configuration also makes it possible to intentionally introduce an approach beyond the electrical dipole approximation, in particular to the next order called the electric quadrupole order, to obtain additional information on the organization on a short scale, much less than the wavelength, macromolecules or liquid.
  • the maximum number of parameters is six, called the six invariants, but in a right-angle configuration this number is limited and reduced to four: these parameters correspond to the intensities I w> IVH > I45V and I H H where V and H indicate the vertical polarization (V), at 45 ° or horizontal (H), the first letter designating the incident beam and the second letter the harmonic light scattered, being reminded that one places oneself in the benchmark of the laboratory.
  • the fundamental beam incident at frequency ⁇ is preferably derived from a femtosecond laser to maintain high peak power while reducing thermal effects using low energy.
  • the direction of propagation is oriented along the Z axis and the polarization of the laser is carried out in the (X, Y) plane with an angle ⁇ . Only linear polarization will be used here, but the change to circular, azimuth or radial polarization - or, more generally, elliptic - according to the studied system makes it possible to extend the number of determined invariants.
  • the collection direction is made at a right angle of the Z direction, in the Y direction.
  • a monochromator is placed after a filter to remove the linearly scattered incident photons and a photomultiplier type detector allows the detection of the hyper Rayleigh photons. .
  • the signal is generally weak and may require a photon counting regime where appropriate.
  • WO 2009/125148 discloses a method and a device for measuring the shape of a particle or the spatial configuration of a molecule in a macromolecule which implements two excitation beams having different incidence directions, preferably perpendicular.
  • the collection of light is in a direction which is the same as the direction of incidence of one of the beams and which is perpendicular to the direction of incidence of the other beam.
  • the assembly implements a light collection at 90 ° and 180 ° with respect to the incident beams. The use of these two angles makes it possible to enrich the analysis and to characterize more precisely the shape of the particles or the spatial conformation of molecules within macro-molecules.
  • An object of the invention is to design a device and an optical method for real-time tracking of objects that is easy and inexpensive to implement, while allowing accurate tracking of objects or interactions between objects.
  • an optical method for real-time tracking of objects comprising: the dispersion of said objects in a medium defining an optically centrosymmetric matrix
  • the determination in real time based on said diffusion intensity, of at least one information on the structure of the objects and / or on an interaction between objects.
  • Real-time information on the structure of objects means any information relating to the concentration, size, spatial conformation of an object and / or interaction of an object with another object (identical or different), whatever the cause of a possible evolution of these; for example molecule-molecule interaction, polymerization, chemical kinetics, etc.
  • an objective is placed on the path of the incident excitation beam and the scattered beam so that the focal point of said objective is located in the matrix.
  • the focal point of the objective is moved in the array and the hyper Rayleigh scattering intensity is determined for each position of said focal point.
  • a plurality of samples each formed of a medium defining a matrix and of objects dispersed in said medium are obtained and the objects of each sample are excited simultaneously with the incident light beam.
  • a plurality of samples, each formed of a matrix and of objects dispersed in said medium, is obtained and the samples are excited successively by displacing the incident light beam.
  • the volume of the matrix is between 0.1 ⁇ and 100 ⁇ .
  • the size of the objects is less than 200 nm.
  • said objects comprise proteins, liposomes and / or functionalized nanoparticles and the information determined from the hyper Rayleigh scattering intensity comprises information on the interactions between said objects.
  • said objects are proteins and the information determined from the hyper Rayleigh scattering intensity comprises information on the conformation of said proteins.
  • said objects are proteins and the information determined from the hyper Rayleigh scattering intensity comprises information on the polymerization of said proteins.
  • the optical signature of the detected photons is analyzed by implementing an electric dipole approximation or a higher order approximation and information about the size and / or conformation of the objects is deduced therefrom.
  • Another object relates to a device for real-time tracking of objects comprising:
  • a support capable of supporting or containing at least one volume of a medium defining an optically centrosymmetric matrix in which said objects to be followed are dispersed
  • a device for detecting photons of light diffused by at least one object present in said medium said detection device being arranged on an optical path of photons diffused by said object in the same direction as that of the incident beam but in the opposite direction beam audit,
  • a computing device configured to determine the Hyper-Rayleigh scattering intensity of the photons detected by the detection device and to determine in real time, from said scattering intensity, at least one information relating to the structure of the objects and / or an interaction between objects.
  • FIG. 1 is a schematic view of a conventional conventional Rayleigh arrangement, in which the excitation direction and the collection direction are at right angles,
  • FIG. 2 is a diagrammatic view of a Rayleigh scattering assembly implemented in the invention, in which the direction of the excitation beam is identical to the direction of the scattered beam but of opposite direction (retro-reflection). ,
  • Figure 3 is a schematic view of a tracking device according to one embodiment of the invention.
  • the invention implements a frequency doubling process which consists of converting two photons at the frequency of the laser source used ( ⁇ ) into a photon at the harmonic frequency (2 ⁇ ).
  • the Rayleigh scattering technique (HRS) used makes it possible to generate an optical signature radiated in the space of the object in solution and to follow the evolution of the object and / or the evolution of its environment, including the interactions between identical or different objects.
  • the invention makes it possible to probe nanoscale objects dispersed in a matrix, without marking said objects being necessary.
  • the invention implements an excitation and a collection in the same direction but in opposite directions (retro-reflection).
  • the hyper Rayleigh intensity diffused throughout the space is given by:
  • I H RS is the fundamental intensity
  • N the number of diffusing macromolecules
  • ⁇ the hyperpolarizability of these macromolecules
  • G a constant defined by: where c is the speed of light, ⁇ 0 is the permittivity of the vacuum, ⁇ is the fundamental wavelength and ⁇ 2 ⁇ is the optical index of the liquid phase at the harmonic frequency.
  • the brackets take into account the averaging procedure on all orientations of macromolecules in the liquid taking into account the isotropy of the latter.
  • the six different parameters of the intensity introduced in (3) are:
  • WY.HRS L V COS 2 Y + c v sin 2 Y (6a) for the polarization V of the scattered harmonic photons, and
  • n - Geometry in retro-reflection
  • FIG. 2 illustrates a hyper Rayleigh scattering assembly according to the invention and in which, contrary to the arrangement of FIG. 1, where the directions of the incident beam and the scattered beam are at right angles, the direction of the incident beam is identical to the direction of the scattered beam but of opposite direction.
  • the beam is incident in the Z direction and is linearly polarized in the plane
  • the scattered photons are collected in the same direction. For that they are separated from the incident photons using a dichroic mirror before being collected and detected according to the same principle as the previous montage.
  • an elliptical polarization of the incident beam including in particular a circular, azimuthal or radial polarization and generally elliptical according to the studied system in order to extend the number of determined invariants.
  • WY.HRS L V COS 2 Y + c v sin 2 Y (8a)
  • IHY.HRS C V COS 2 Y + a v sin 2 Y (8b) that is to say two dipolar graphs turned of ⁇ / 2 relative to each other. The same depolarization coefficient is obtained in (7), which gives this geometry the same advantages as the right-angle geometry for an analysis in the electric dipole approximation.
  • the objects to follow may be of biological origin, such as DNA, enzymes, proteins, or of chemical origin, such as molecular aggregates, macromolecules (in particular polymers), functionalized or non-functionalized nanoparticles.
  • the objects are distinct from the molecules constituting the medium defining the matrix.
  • the size of said objects is typically less than 200 nm, although a larger size is accessible if it is not limited to the quadrupole approximation but is implemented a treatment, multipolar, for example, more complete. There is in principle no lower limit for objects. In general, it can be considered that the size of the objects is between 0.1 and 200 nm.
  • the method does not require marking of the objects, even if objects marked with a probe can be followed by the method according to the invention.
  • the objects are dispersed in a medium defining an optically centrosymmetric matrix.
  • the medium is furthermore at least partially transparent to the (fundamental and harmonic) frequencies of the incident and scattered light beams.
  • Said medium may be a liquid, a gel, a centrosymmetric solid, or even a gas.
  • the medium defining the matrix may be chosen from: aqueous or organic solvents (among which: alcohol, chloroform, isopropanol, etc.); gels (gelatin, polyacrylamide, etc.), glass.
  • FIG. 3 is a schematic view of an object tracking device implementing a retro-reflection hyper-Rayleigh scattering assembly.
  • the device 1 comprises a coherent excitation light source, for example a femtosecond laser source 10.
  • the properties of said source may be for example a frequency of the order of 80 MHz, a power of the order of 100 mW and a duration of the pulses of the order of 140 fs.
  • a mirror deflects the beam from the source at 90 ° to an objective of a microscope.
  • the characteristics (magnification, aperture) of the lens are chosen arbitrarily.
  • a reflective objective (Cassegrain type) may be used to collect a harmonic wave with a wavelength of less than 400 nm (near UV).
  • numerical aperture for excitation and collection does not obey particular constraints; in this context, it is preferable to limit the numerical aperture excitation with a low aperture lens, and also limit the collection to a small aperture. Indeed, this configuration allows a better definition without recourse to corrections to account for the finished solid angles.
  • the retro-reflection geometry implemented in the invention it is preferable to choose a large numerical aperture, for example with a high-aperture microscope objective, in order to favor the observation of the delayed effects, including included for the weakest objects if necessary.
  • the numerical aperture also has an amplifying effect making it possible to collect more scattered photons.
  • Sample 2 containing the objects to be characterized is placed on a support 3.
  • the objective 30 is located under the support 3, which requires the support 3 to be transparent to the wavelength of the incident beam and the backscattered beam.
  • the objective may be above the sample or on the side thereof, the medium may then be transparent or not at the excitation wavelength.
  • the sample is preferably in the form of a micro-volume or nano-volume, that is to say that it has a volume typically between 0.1 ⁇ and 100 ⁇ . This makes it possible to concentrate samples containing a very small number of objects (of the order of 1 picomole).
  • the sample 2 is in the form of a droplet deposited on the surface of a glass plate forming the support 3.
  • the sample may be in one or more wells made in a plate (for example, a 96-well plate as conventionally used in biological assay methods).
  • the sample may be in a microfluidic circuit.
  • the tracking device has the advantage, thanks to its unique measuring arm (excitation and collection) to be compact and in particular to easily access the known supports described above.
  • the measuring arm can be positioned as close as possible to the sample, which allows to collect a greater intensity.
  • a right-angle, two-armed device can generally not be placed so close to the sample in a convenient manner.
  • the objective 30 is positioned such that the focal point is located in the volume of the sample 3.
  • the objective and the support are movable relative to each other, which makes it possible to scan with the incident beam a plurality of samples.
  • the objective can be configured to simultaneously excite all samples.
  • the objective can be controlled so as to move the focal point in the volume of the sample, which makes it possible to scan said volume and to make several measurements in the same volume.
  • a dichroic mirror 40 is arranged to let the incident beam pass and to deflect the backscattered beam to a detector 50. Between the dichroic mirror 40 and the detector 50 are successively arranged a filter 41 blocking the fundamental wavelength and a monochromator or photomultiplier 42.
  • the detector makes it possible to determine the intensity of hyper Rayleigh scattering.
  • a processor makes it possible, from said intensity, to determine at least one information on the structure of the objects.
  • Structural information (not only on the scale of the object as a whole but also at the level of a part of the object), called hyperpolarizability of objects, is proportional to the coefficients a, b, c in the formulas above for the different polarizations (the hyperpolarizability is a tensor whose configuration in polarization input and output allows to deduce the elements, as shown by the formulas presented above).
  • this structural information can be provided in real time, that is to say that it accounts for the evolution of a population of objects during the time. It is thus possible to follow chemical kinetics for a duration that is typically, but not only, between 1 minute and a few minutes.
  • a hyper Rayleigh scattering assembly assembled in retro-reflective geometry can be used for tracking macromolecules.
  • Such a geometry makes it possible to reach the same physical parameters of the macromolecules studied.
  • the sample can be irradiated along the six axes perpendicular to the walls of a cell with parallel faces. Any incidence is however possible depending on the geometry of the support.
  • the applications that result from the invention relate in particular to the biological and chemical objects that make up the material of pharmaceutical research, to identify and select the objects for clinical tests.
  • objects of biological origin such as proteins, peptides, RNA, DNA, complex macromolecules but also chemical objects such as polymers, molecular aggregates, nanoparticles, colloids, gels, etc.
  • biochemical tests are generally performed in large quantities to test interactions in very low volumes of the order of 1 to 10 ⁇ .
  • An application of the invention aims to monitor molecular interactions.
  • the objects are molecules or biomolecules such as proteins, liposomes and / or functionalized nanoparticles.
  • the method makes it possible to monitor in real time the kinetics of the interactions between said objects, and in particular to determine the kinetic constant and the affinity.
  • liposomes are therapeutic vectors that make it possible to encapsulate molecules or proteins.
  • the interaction between the molecule or protein and the surface of the liposome, as well as the maintenance of the function and activity of the molecule or protein are critical factors to monitor.
  • solvent optimization conditions are key to ensuring the stability of the protein structure.
  • the method according to the invention makes it possible to carry out non-destructive measurements of the structural stability and the aggregation of the proteins.
  • the method allows polymerization monitoring by following the evolution of size and conformation without marking.
  • the conformational change of a protein is a critical parameter but is difficult to follow directly.
  • the invention makes it possible to follow the conformation of a protein without marking it.
  • the invention also allows the tracking of the evolution of the size and shape of an object over time.

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Abstract

L'invention concerne un procédé optique de suivi en temps réel d'objets, comprenant : • - la dispersion desdits objets dans un milieu (2) définissant une matrice optiquement centrosymétrique, • - l'excitation d'au moins un desdits objets par un unique faisceau (10) lumineux d'excitation polarisé focalisé, ledit faisceau pénétrant dans le milieu (2) selon une unique direction d'incidence, • - la détection en optique non linéaire des photons de lumière Hyper Rayleigh diffusés par au moins un des objets dispersés dans ledit milieu (2), dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau, • - la détermination de l'intensité de diffusion Hyper Rayleigh résolue en polarisation desdits photons détectés, • - la détermination en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, d'au moins une information sur la structure des objets et/ ou sur une interaction entre objets.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF OPTIQUE DE SUIVI D'OBJETS EN TEMPS REEL
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé et un dispositif optique de suivi d'objets en temps réel. Lesdits objets sont typiquement d'origine biologique comme : l'ADN, des enzymes, des protéines, ou d'origine chimique comme les agrégats moléculaires, les macromolécules (notamment les polymères), les nanoparticules fonctionnalisées ou non. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION
La structure et la dynamique d'objets tels que des macromolécules en solution est d'une importance essentielle dans un grand nombre de domaines d'études, de la physique et la chimie à la biologie.
Notamment, les processus biologiques dépendent d'interactions moléculaires qui peuvent être représentées comme l'interaction entre deux objets de même nature ou de différente nature. Ces interactions sont au cœur d'investigations intensives dans les laboratoires biopharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires, etc. qui cherchent à suivre et à caractériser l'interaction, par exemple en termes d'ancrage de molécules à leur cible à des fins de traitement thérapeutique, de changement de conformation, de polymérisation, etc.
Différentes techniques expérimentales ont été proposées pour ces études comme les méthodes de spectroscopie (absorption infra-rouge ou Raman, fluorescence) ou de diffusion de rayonnements (rayons X, neutrons).
Combinées à des simulations, notamment par dynamique moléculaire, ces méthodes se sont révélées bien adaptées bien qu'elles présentent toutes des défauts, conceptuels ou de mise en œuvre.
Généralement, les méthodes optiques sont mal adaptées dès lors que les échelles de longueur recherchées deviennent bien inférieures à la longueur d'onde de la lumière incidente, qui est de l'ordre du demi-micromètre dans le domaine visible.
C'est dans ce contexte que les méthodes optiques non linéaires quadratiques présentent une alternative remarquable. En effet, les processus non linéaires d'ordre pair sont interdits dans les milieux possédant un centre d'inversion comme les fluides, gaz ou liquides dans l'approximation dipolaire électrique. Ainsi, toute déviation de la symétrie du milieu étudié à cette centrosymétrie est un milieu source pour un processus non linéaire d'ordre pair, en particulier pour le premier d'entre eux, l'ordre deux.
Plusieurs processus optiques non linéaires peuvent être utilisés pour la caractérisation de la matière à partir d'un même faisceau d'excitation. Les processus les plus régulièrement utilisés sont : (1 ) la génération de seconde harmonique (ou SHG, acronyme du terme anglo-saxon Second Harmonie Génération) ;
(2) la fluorescence à deux photons (ou TPEF, acronyme du terme anglo-saxon Two- Photon Excited Fluorescence) ;
(3) la diffusion hyper Raman (HR).
Ces processus se distinguent cependant par leurs propriétés :
- le processus (1 ) peut être cohérent, appelé encore SHG cohérent, et dans ce cas dépendant de N2 où N est le nombre d'objets participant au processus, ou incohérent, et dans ce cas dépendant de N seulement. Ce dernier processus est usuellement appelé diffusion hyper Rayleigh (ou HRS, acronyme anglo-saxon pour Hyper Rayleigh Scattering). Ces deux processus SHG et HRS sont très sensibles à la symétrie de l'organisation spatiale et temporelle des N objets. En particulier, le processus HRS est très sensible aux effets de corrélation à courte distance (ici entendu comme bien inférieure à la longueur d'onde) entre les N objets,
- les processus (3) et (4) sont des processus incohérents peu sensibles aux effets de cohérence et plutôt utilisés pour déterminer la densité locale d'objets (notamment pour la TPEF) ou obtenir des informations internes sur les objets (le plus souvent vibrationnelles pour des molécules).
Dans le processus HRS, deux photons de même fréquence sont convertis en un seul photon de fréquence double. Ce processus provient, dans un liquide isotrope, des fluctuations d'orientation instantanées qui s'y produisent. Qu'elles soient d'origine naturelle (liée à l'agitation thermique par exemple), ou provoquée par une action extérieure comme des interactions moléculaires, ces fluctuations conduisent à un signal mesurable.
La diffusion hyper Rayleigh étant un processus incohérent dans l'approximation dipolaire électrique, l'intensité varie linéairement avec le nombre d'éléments diffusants (i.e. les molécules pour un liquide), et le processus de diffusion possède un diagramme de rayonnement angulaire non nul dans tout l'espace des 4π radians.
A cet effet, on excite un échantillon au moyen d'un faisceau lumineux à la fréquence fondamentale et l'on collecte vers un détecteur les photons résultant de cette excitation. Il est usuel d'utiliser un faisceau d'excitation incident à angle droit de la direction de collection de la lumière diffusée afin de diminuer la pollution lumineuse sur le détecteur par le faisceau incident. Cette configuration permet aussi d'introduire à dessein une approche au-delà de l'approximation dipolaire électrique, notamment à l'ordre suivant appelé l'ordre quadripolaire électrique, pour obtenir des informations supplémentaires sur l'organisation à courte échelle, bien inférieure à la longueur d'onde, des macromolécules ou du liquide. Le nombre maximal de paramètres est de six, appelés les six invariants, mais dans une configuration à angle droit ce nombre est limité et réduit à quatre : ces paramètres correspondent aux intensités lw> IVH> I45V et IHH où V et H indiquent la polarisation verticale (V), à 45° ou horizontale (H), la première lettre désignant le faisceau incident et la seconde la lumière harmonique diffusée, étant rappelé que l'on se place dans le repère du laboratoire.
La géométrie usuelle à angle droit d'un montage de diffusion hyper Rayleigh est illustrée de manière schématique sur la figure 1 .
Le faisceau fondamental incident à la fréquence ω est de préférence issu d'un laser femtoseconde pour conserver une puissance crête élevée tout en réduisant les effets thermiques en utilisant une énergie faible. La direction de propagation est orientée selon l'axe Z et la polarisation du laser est réalisée dans le plan (X, Y) avec un angle γ. On utilisera ici uniquement la polarisation linéaire mais le passage à une polarisation circulaire, azimutale ou radiale - ou, plus généralement, elliptique - selon le système étudié permet d'étendre le nombre d'invariants déterminés. La direction de collection est réalisée à angle droit de la direction Z, selon la direction Y. Un monochromateur est placé à la suite d'un filtre pour supprimer les photons incidents linéairement diffusés et un détecteur de type photomultiplicateur permet la détection des photons hyper Rayleigh. Le signal est généralement faible et peut nécessiter un régime de comptage de photons le cas échéant.
Le document WO 2009/125148 décrit un procédé et un dispositif pour mesurer la forme d'une particule ou la configuration spatiale d'une molécule dans une macromolécule qui met en œuvre deux faisceaux d'excitation présentant des directions d'incidence différentes, de préférence perpendiculaires. La collection de la lumière se fait dans une direction qui est la même que la direction d'incidence de l'un des faisceaux et qui est perpendiculaire à la direction d'incidence de l'autre faisceau. En d'autres termes, le montage met en œuvre une collection de la lumière à 90° et à 180° par rapport aux faisceaux incidents. L'utilisation de ces deux angles permet d'enrichir l'analyse et de caractériser plus précisément la forme des particules ou la conformation spatiale de molécules au sein de macro-molécules.
Cependant, ce montage implique la mise en œuvre de deux chemins optiques incidents et est donc relativement complexe à réaliser. Un tel montage se prête donc difficilement à une mise en œuvre industrielle.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
Un but de l'invention est de concevoir un dispositif et un procédé optique de suivi en temps réel d'objets qui soit aisé et peu onéreux à mettre en œuvre, tout en permettant un suivi précis des objets ou d'interactions entre objets.
Conformément à l'invention, il est proposé un procédé optique de suivi en temps réel d'objets, comprenant : - la dispersion desdits objets dans un milieu définissant une matrice optiquement centrosymétrique,
- l'excitation d'au moins un desdits objets par un unique faisceau lumineux d'excitation polarisé, ledit faisceau pénétrant dans ledit milieu selon une unique direction d'incidence,
- la détection en optique non linéaire des photons de lumière Hyper Rayleigh diffusés par au moins un des objets dispersés dans ledit milieu, dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau,
- la détermination de l'intensité de diffusion Hyper Rayleigh résolue en polarisation desdits photons détectés,
- la détermination en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, d'au moins une information sur la structure des objets et/ou sur une interaction entre objets.
Par « information en temps réel sur la structure des objets », on entend toute information relative à la concentration, à la taille, à la conformation spatiale d'un objet et/ou à une interaction d'un objet avec un autre objet (identique ou différent), quelle que soit la cause d'une éventuelle évolution de celles-ci ; par exemple interaction molécule- molécule, polymérisation, cinétique chimique, etc.
Selon un mode de réalisation, on place un objectif sur le trajet du faisceau d'excitation incident et du faisceau diffusé de telle sorte que le point focal dudit objectif soit situé dans la matrice.
De manière optionnelle, on déplace le point focal de l'objectif dans la matrice et on détermine l'intensité de diffusion hyper Rayleigh pour chaque position dudit point focal.
Selon une forme d'exécution du procédé, on obtient une pluralité d'échantillons formés chacun d'un milieu définissant une matrice et d'objets dispersés dans ledit milieu et on excite simultanément les objets de chaque échantillon avec le faisceau lumineux incident.
Selon une variante, on obtient une pluralité d'échantillons formés chacun d'une matrice et d'objets dispersés dans ledit milieu et on excite successivement les échantillons en déplaçant le faisceau lumineux incident.
De manière avantageuse, le volume de la matrice est compris entre 0,1 μΙ et 100 μΙ.
De manière avantageuse, la taille des objets est inférieure à 200 nm.
Selon une application de l'invention, lesdits objets comprennent des protéines, des liposomes et/ou des nanoparticules fonctionnalisées et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur les interactions entre lesdits objets.
Selon une application de l'invention, lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la conformation desdites protéines. Selon une application de l'invention, lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la polymérisation desdites protéines.
De manière avantageuse, on analyse la signature optique des photons détectés en mettant en œuvre une approximation dipolaire électrique ou une approximation d'ordre supérieur et l'on en déduit une information sur la taille et/ou la conformation des objets.
Un autre objet concerne un dispositif de suivi en temps réel d'objets comprenant :
- un dispositif d'émission d'un faisceau de lumière cohérente,
- un dispositif de polarisation dudit faisceau de lumière cohérente,
- un support apte à supporter ou contenir au moins un volume d'un milieu définissant une matrice optiquement centrosymétrique dans lequel lesdits objets à suivre sont dispersés,
- un dispositif de détection de photons de lumière diffusés par au moins un objet présent dans ledit milieu, ledit dispositif de détection étant agencé sur un trajet optique de photons diffusés par ledit objet dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau,
- un objectif agencé sur le trajet du faisceau incident et sur le trajet des photons diffusés dans le sens opposé audit faisceau,
- un dispositif de calcul configuré pour déterminer l'intensité de diffusion Hyper- Rayleigh des photons détectés par le dispositif de détection et pour déterminer en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, au moins une information relative à la structure des objets et/ou à une interaction entre objets.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
la figure 1 est une vue schématique d'un montage hyper Rayleigh conventionnel, dans lequel la direction d'excitation et la direction de collecte sont à angle droit,
- la figure 2 est une vue schématique d'un montage de diffusion hyper Rayleigh mis en œuvre dans l'invention, dans lequel la direction du faisceau d'excitation est identique à la direction du faisceau diffusé mais de sens opposé (rétro-réflexion),
la figure 3 est une vue schématique d'un dispositif de suivi selon un mode de réalisation de l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention met en œuvre un processus de doublage de fréquence qui consiste à convertir deux photons à la fréquence de la source laser utilisée (ω) en un photon à la fréquence harmonique (2ω). La technique de diffusion hyper Rayleigh (HRS) utilisée permet de générer une signature optique rayonnée dans l'espace de l'objet en solution et de suivre l'évolution de l'objet et/ou l'évolution de son environnement, incluant les interactions entre objets identiques ou différents.
L'invention permet de sonder les objets à l'échelle nanométrique dispersés dans une matrice, sans qu'un marquage desdits objets ne soit nécessaire.
Contrairement au montage connu dans lequel l'excitation et la collection sont à angle droit, l'invention met en œuvre une excitation et une collection dans la même direction mais dans des sens opposés (rétro-réflexion).
Dans un premier temps, on rappelle la théorie pour une géométrie à angle droit, puis on expose la théorie relative à la rétro-réflexion.
Théorie pour la géométrie à angle droit
Dans la description qui suit, on considère la caractérisation de macromolécules dispersées dans un liquide.
L'intensité hyper Rayleigh diffusée dans tout l'espace est donnée par :
Figure imgf000008_0001
où IHRS est l'intensité fondamentale, N le nombre de macromolécules diffusantes, β l'hyperpolarisabilité de ces macromolécules et G une constante définie par : où c est la vitesse de la lumière, ε0 est la permittivité du vide, λ est la longueur d'onde fondamentale et η2ω est l'indice optique de la phase liquide à la fréquence harmonique. Dans (1 ) les crochets tiennent compte de la procédure de moyennage sur toutes les orientations de macromolécules dans le liquide compte tenu de l'isotropie de ce dernier. Pour des mesures de diffusion hyper Rayleigh résolues en polarisation, les éléments du tenseur de la première hyperpolarisabilité des macromolécules doivent être introduits. Ces éléments sont décrits dans le repère (O, X, Y, Z) du laboratoire. On a : j.HRs = CLTCOS4Y + bTcos2y sin2Y + cT sirây (3) où Γ désigne la polarisation H ou la polarisation V.
Les six paramètres différents de l'intensité introduite en (3) sont :
av = 6ΝΙ2(β2 χχ) (4a) bv = ΟΝΙ2(4β2 χγ + 2βχχχβχγγ) (4b) cv = 6ΝΙ2(β2 γγ) (4c)
Figure imgf000008_0002
b» = ΟΝΙ2(4β2 χγ + 2βζχχβζγγ) (4e) cH = 6ΝΙ2(βζ 2 γγ) (4f) Pour une réponse purement locale, c'est-à-dire pour des macromolécules non centrosymétriques et sans mode collectif, les relations suivantes peuvent être obtenues par raison de symétrie :
bv = av + cv (5a) bH = aH + cH (5b) b" = 2aH = 2cH (5c) aH = cH (5d)
Toute déviation de ces égalités indiquera ainsi la nécessité de discuter des résultats au-delà de l'approximation dipolaire électrique et donc dans l'approximation quadripolaire électrique pour introduire des effets retardés à travers des effets collectifs par exemple. Avec les relations (5a)-(5d), on obtient :
WY.HRS = LVCOS2Y + cvsin2Y (6a) pour la polarisation V des photons harmoniques diffusés, et
Figure imgf000009_0001
pour la polarisation H de ces photons harmoniques. Ainsi, seuls deux paramètres sont accessibles et, en ne considérant pas une mesure absolue de l'intensité, difficile par ailleurs à mettre en œuvre, on obtient un coefficient de dépolarisation caractérisant les macromolécules :
n =— Géométrie en rétro-réflexion
La figure 2 illustre un montage de diffusion hyper Rayleigh selon l'invention et dans lequel, contrairement au montage de la figure 1 où les directions du faisceau incident et du faisceau diffusé sont à angle droit, la direction du faisceau incident est identique à la direction du faisceau diffusé mais de sens opposé.
Le faisceau est incident selon la direction Z et est polarisé linéairement dans le plan
(X, Y). Les photons diffusés sont collectés selon la même direction. Pour cela ils sont séparés des photons incidents à l'aide d'un miroir dichroïque avant d'être collectés et détectés selon le même principe que le montage précédent.
Au lieu d'une polarisation linéaire, on peut choisir une polarisation elliptique du faisceau incident, incluant notamment une polarisation circulaire, azimutale ou radiale et de manière générale elliptique selon le système étudié afin d'étendre le nombre d'invariants déterminés.
Théorie pour la géométrie en rétro-réflexion
Dans ce cas, et en utilisant les expressions ci-dessus, on peut montrer que l'on obtient :
WY.HRS = LVCOS2Y + cvsin2Y (8a) IHY.HRS = CVCOS2Y + avsin2Y (8b) c'est-à-dire deux graphes dipolaires tournés de ττ/2 l'un par rapport à l'autre. Le même coefficient de dépolarisation est obtenu qu'en (7), ce qui confère à cette géométrie les mêmes avantages que la géométrie à angle droit pour une analyse dans l'approximation dipolaire électrique.
On notera que l'obtention de ce résultat n'était pas prévisible. En effet, comme indiqué à la page 25 de la thèse de Julien Duboisset, la configuration à 90° permet d'obtenir plus d'information qu'à 0° ou 180°. On aurait donc pu s'attendre qu'une configuration uniquement à 0° ne donne pas suffisamment d'information pour qu'un suivi des objets puisse être mis en œuvre. L'article d'A. Maurice et al confirme également que la configuration en rétro-réflexion est moins favorable en termes de collecte de l'intensité réfléchie.
On peut donc mettre en œuvre, dans la mesure en rétro-réflexion (0°) selon l'invention, une analyse de la signature optique des photons détectés utilisant une approximation dipolaire électrique ou une approximation d'ordre supérieur (quadripolaire par exemple). On peut ainsi obtenir, en plus d'une information qualitative sur la structure des objets et/ou sur les interactions entre objets, une information sur la taille et/ou sur la conformation des objets, c'est-à-dire une information quantitative ou semi-quantitative.
Suivi des objets
Objets
Les objets à suivre peuvent être d'origine biologique comme l'ADN, des enzymes, des protéines, ou d'origine chimique comme les agrégats moléculaires, les macromolécules (notamment les polymères), les nanoparticules fonctionnalisées ou non.
Les objets sont distincts des molécules constituant le milieu définissant la matrice. La taille desdits objets est typiquement inférieure à 200 nm, bien qu'une taille plus grande soit accessible si on ne se limite pas à l'approximation quadripolaire mais qu'on met en œuvre un traitement, multipolaire par exemple, plus complet. Il n'existe a priori pas de limite inférieure pour les objets. D'une manière générale, on peut considérer que la taille des objets est comprise entre 0,1 et 200 nm.
Le procédé ne nécessite pas de marquage des objets, même si des objets marqués avec une sonde peuvent être suivis par le procédé selon l'invention.
Matrice
Pour mettre en œuvre le procédé, on disperse les objets dans un milieu définissant une matrice optiquement centrosymétrique. Ledit milieu est en outre au moins partiellement transparent aux fréquences (fondamentale et harmoniques) des faisceaux lumineux incident et diffusé.
Ledit milieu peut être un liquide, un gel, un solide centrosymétrique, voire un gaz. Par exemple, le milieu définissant la matrice peut être choisie parmi : les solvants aqueux ou organiques (parmi lesquels : alcool, chloroforme, isopropanol, etc.) ; les gels (gélatine, polyacrylamide, etc.), le verre.
Dispositif de suivi
La figure 3 est une vue schématique d'un dispositif de suivi d'objets mettant en œuvre un montage de diffusion hyper-Rayleigh par rétro-réflexion.
Le dispositif 1 comprend une source lumineuse cohérente d'excitation, par exemple une source laser femtoseconde 10. Les propriétés de ladite source pourront être par exemple une fréquence de l'ordre de 80 MHz, une puissance de l'ordre de 100 mW et une durée des impulsions de l'ordre de 140 fs.
Un miroir 20 défléchit le faisceau provenant de la source 10 à 90° vers un objectif 30 d'un microscope. Les caractéristiques (grossissement, ouverture) de l'objectif sont choisies arbitrairement. On pourra notamment choisir un objectif réflectif (type Cassegrain) pour collecter une onde harmonique de longueur d'onde inférieure à 400 nm (proche UV).
Entre la source 10 et le miroir 20 sur le trajet du faisceau incident sont agencés successivement une lame h/2 et un filtre bloquant la fréquence harmonique.
Dans la géométrie à angle droit, l'ouverture numérique pour l'excitation et la collection n'obéit pas à des contraintes particulières ; dans ce contexte, il est préférable de limiter l'ouverture numérique en excitation avec un objectif à faible ouverture, et de limiter de même la collection à une faible ouverture. En effet, cette configuration permet une meilleure définition sans recours à des corrections pour tenir compte des angles solides finis. En revanche, dans la géométrie en rétro-réflexion mise en œuvre dans l'invention, il est préférable de choisir une grande ouverture numérique, par exemple avec un objectif de microscope à forte ouverture, afin de favoriser l'observation des effets retardés, y compris pour les objets les plus faibles si cela s'avère nécessaire. L'ouverture numérique a en effet aussi un effet amplificateur permettant de collecter davantage de photons diffusés.
L'échantillon 2 contenant les objets à caractériser est mis en place sur un support 3. Dans la configuration illustrée sur la figure 3, l'objectif 30 est situé sous le support 3, ce qui impose au support 3 d'être transparent à la longueur d'onde du faisceau incident et du faisceau rétro-diffusé. Cependant, dans d'autres configurations, l'objectif peut être au- dessus de l'échantillon ou sur le côté de celui-ci, le support pouvant être alors transparent ou non à la longueur d'onde d'excitation.
L'échantillon se présente de préférence sous la forme d'un micro-volume ou nano- volume, c'est-à-dire qu'il présente un volume typiquement compris entre 0,1 μΙ et 100 μΙ. Ceci permet de concentrer des échantillons contenant un très faible nombre d'objets (de l'ordre de 1 picomole). Dans l'exemple illustré à la figure 3, l'échantillon 2 se présente sous la forme d'une gouttelette déposée à la surface d'une plaque de verre formant le support 3.
De manière alternative, l'échantillon peut se trouver dans un ou plusieurs puits réalisés dans une plaque (par exemple, une plaque à 96 puits telle qu'utilisée conventionnellement dans les méthodes d'analyses biologiques).
De manière alternative, l'échantillon peut se trouver dans un circuit micro-fluidique.
Ces différents supports de l'échantillon sont bien connus dans le domaine des analyses biologiques.
Le dispositif de suivi présente l'avantage, grâce à son unique bras de mesure (excitation et collecte) d'être peu encombrant et notamment d'accéder aisément aux supports connus décrits ci-dessus.
En particulier, le bras de mesure peut être positionné le plus près possible de l'échantillon, ce qui permet de collecter une intensité plus importante. Un dispositif à deux bras à angle droit ne peut en général être placé aussi près de l'échantillon de manière commode.
L'objectif 30 est positionné de tel sorte que le point focal soit localisé dans le volume de l'échantillon 3.
Avantageusement, l'objectif et le support sont mobiles l'un par rapport à l'autre, ce qui permet de balayer avec le faisceau incident une pluralité d'échantillons.
De manière alternative, l'objectif peut être configuré pour exciter simultanément l'ensemble des échantillons.
Avantageusement, l'objectif peut être contrôlé de sorte à déplacer le point focal dans le volume de l'échantillon, ce qui permet de balayer ledit volume et de faire plusieurs mesures dans un même volume.
Entre le miroir 20 et l'objectif 30 sur le trajet du faisceau incident, un miroir dichroïque 40 est agencé de sorte à laisser passer le faisceau incident et à dévier le faisceau rétro-diffusé vers un détecteur 50. Entre le miroir dichroïque 40 et le détecteur 50 sont agencés successivement un filtre 41 bloquant la longueur d'onde fondamentale et un monochromateur ou photomultiplicateur 42.
Le détecteur permet de déterminer l'intensité de diffusion hyper Rayleigh.
Un processeur permet, à partir de ladite intensité, de déterminer au moins une information sur la structure des objets.
L'information structurale (non seulement à l'échelle de l'objet dans sa globalité mais aussi au niveau d'une partie de l'objet), appelée hyperpolarisabilité des objets, est proportionnelle aux coefficients a, b, c dans les formules ci-dessus pour les différentes polarisations (l'hyperpolarisabilité est un tenseur dont la configuration en polarisation entrée et sortie permet d'en déduire les éléments, comment le montrent les formules présentées plus haut). Comme mentionné plus haut, la collecte du signal étant réalisée en continu, cette information structurale peut être fournie en temps réel, c'est-à-dire qu'elle rend compte de l'évolution d'une population d'objets au cours du temps. On peut ainsi suivre des cinétiques chimiques pendant une durée typiquement, mais pas seulement, comprise entre 1 minute et quelques minutes.
En conclusion, un montage de diffusion hyper Rayleigh assemblé selon une géométrie en rétro-réflexion peut être utilisé pour le suivi de macromolécules. Une telle géométrie permet en effet d'atteindre les mêmes paramètres physiques des macromolécules étudiées. Elle possède cependant une grande facilité de mise en œuvre, l'échantillon pouvant être irradié selon les six axes perpendiculaires aux parois d'une cellule à faces parallèles. Une incidence quelconque est cependant possible selon la géométrie du support.
Applications
Les applications qui découlent de l'invention concernent notamment les objets biologiques et chimiques qui constituent le matériel de la recherche pharmaceutique, pour identifier et sélectionner les objets pour des tests cliniques. On peut citer parmi ceux- ci les objets d'origine biologique tels que les protéines, les peptides, l'ARN, l'ADN, les macromolécules complexes mais également les objets chimiques tels que les polymères, les agrégats moléculaires, les nanoparticules, les colloïdes, les gels, etc .. Ces tests biochimiques sont généralement effectués en grandes quantités afin de tester des interactions dans des volumes très faibles de l'ordre de 1 à 10ΟμΙ.
Suivi d'interactions moléculaires
Une application de l'invention vise le suivi d'interactions moléculaires.
Dans ce cas, les objets sont des molécules ou biomolécules comme des protéines, des liposomes et/ou des nanoparticules fonctionnalisées.
Le procédé permet de suivre en temps réel la cinétique des interactions entre lesdits objets, et notamment de déterminer la constante cinétique et l'affinité.
Par exemple, les liposomes sont des vecteurs thérapeutiques qui permettent d'encapsuler des molécules ou des protéines. L'interaction entre la molécule ou la protéine et la surface du liposome, ainsi que le maintien de la fonction et de l'activité de la molécule ou de la protéine sont des facteurs critiques à surveiller.
Stabilité d'un produit pharmaceutique
L'utilisation croissante des anticorps monoclonaux pose des problèmes de stabilité du produit, notamment dus aux fortes concentrations desdits anticorps.
Durant le développement du produit, les conditions d'optimisation du solvant sont clés pour assurer la stabilité de la structure des protéines.
Le procédé selon l'invention permet de réaliser des mesures non destructives de la stabilité structurale et de l'agrégation des protéines. Suivi de polymérisation
Le suivi de la polymérisation de monomères dans différentes conditions est au cœur du développement de certains traitements du cancer. Le procédé permet un suivi de polymérisation en suivant l'évolution de la taille et de la conformation sans marquage.
Lien entre la conformation et l'activité d'une protéine
Le changement de conformation d'une protéine est un paramètre critique mais qui est difficile à suivre de manière directe.
L'invention permet de suivre la conformation d'une protéine sans marquage de celle-ci.
Analyse et détermination de la taille d'un objet
L'invention permet également le suivi de l'évolution de la taille et de la forme d'un objet au cours du temps.
REFERENCES WO 2009/125148
Julien Duboisset, Génération de second harmonique de biomolécules : des acides aminés aux protéines, Chapitre 1 , Thèse soutenue le 2 octobre 2009
Anthony Maurice et al, Hyper Rayleigh and Hyper Raman from Neat Water, Proc. of SPIE Vol. 9171 (2014)

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé optique de suivi en temps réel d'objets, comprenant :
- la dispersion desdits objets dans un milieu définissant une matrice optiquement centrosymétrique,
- l'excitation d'au moins un desdits objets par un unique faisceau lumineux d'excitation polarisé focalisé, ledit faisceau pénétrant dans le milieu selon une unique direction d'incidence,
- la détection en optique non linéaire des photons de lumière Hyper Rayleigh diffusés par au moins un des objets dispersés dans ledit milieu, dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau,
- la détermination de l'intensité de diffusion Hyper Rayleigh résolue en polarisation desdits photons détectés,
- la détermination en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, d'au moins une information sur la structure des objets et/ou sur une interaction entre objets.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel on place un objectif sur le trajet du faisceau d'excitation incident et du faisceau diffusé de telle sorte que le point focal dudit objectif soit situé dans le milieu.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel on déplace le point focal de l'objectif dans le milieu et on détermine l'intensité de diffusion hyper Rayleigh pour chaque position dudit point focal.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel on obtient une pluralité d'échantillons formés chacun d'un milieu définissant une matrice optiquement centrosymétrique et d'objets dispersés dans ledit milieu et on excite simultanément les objets de chaque échantillon avec le faisceau lumineux incident.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel on obtient une pluralité d'échantillons formés chacun d'une matrice et d'objets dispersés dans ladite matrice et on excite successivement les échantillons en déplaçant le faisceau lumineux incident.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le volume du milieu est compris entre 0,1 μΙ et 100 μΙ.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la taille des objets est inférieure à 200 nm.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel lesdits objets comprennent des protéines, des liposomes et/ou des nanoparticules fonctionnalisées et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur les interactions entre lesdits objets.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la conformation desdites protéines.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la polymérisation desdites protéines.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel on analyse la signature optique des photons détectés en mettant en œuvre une approximation dipolaire électrique ou une approximation d'ordre supérieur et l'on en déduit une information sur la taille et/ou la conformation des objets.
12. Dispositif (1 ) de suivi en temps réel d'objets comprenant :
- un dispositif (10) d'émission d'un faisceau de lumière cohérente focalisée,
- un dispositif (20) de polarisation dudit faisceau de lumière cohérente,
- un support (3) apte à supporter ou contenir au moins un volume d'un milieu (2) définissant une matrice optiquement centrosymétrique dans laquelle lesdits objets à suivre sont dispersés,
- un dispositif de détection de photons de lumière Hyper Rayleigh diffusés par au moins un objet présent dans ledit milieu, ledit dispositif de détection étant agencé sur un trajet optique de photons diffusés par ledit objet dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau,
- un objectif agencé sur le trajet du faisceau incident et sur le trajet des photons diffusés dans le sens opposé audit faisceau,
- un dispositif de calcul configuré pour déterminer l'intensité de diffusion Hyper-Rayleigh résolue en polarisation des photons détectés par le dispositif de détection et pour déterminer en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, au moins une information relative à la structure des objets et/ou à une interaction entre objets.
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