WO2016080442A1 - 品質評価方法及び品質評価装置 - Google Patents

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菅沼　寛
拓也 奥野
麻子 本村
静香 秋枝
真奈美 辻
由奈 翁
陽子 五十嵐
一博 餐庭
劉　莉
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住友電気工業株式会社
株式会社サイフューズ
株式会社幹細胞イノベーション研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a cell mass quality evaluation method and a quality evaluation apparatus.
  • Patent Document 1 discloses a configuration in which a time series image of a cell mass is acquired and evaluated for the purpose of determining the maturity of the cell mass.
  • Patent Document 2 discloses a configuration in which a fluorescent image is taken after fluorescent staining of a cell mass, and evaluation is performed based on the fluorescent image.
  • Patent Documents 1 and 2 have not been studied for nondestructive evaluation of cell mass quality such as cell mass activity and activity.
  • the present invention has been made in view of the above, and an object thereof is to provide a quality evaluation method and a quality evaluation apparatus capable of nondestructively evaluating the quality of a cell mass.
  • a quality evaluation method includes: (1) An acquisition step of acquiring spectral data relating to transmitted light or diffuse reflected light from the cell mass by irradiating the cell mass with measurement light including near infrared light; An evaluation step for evaluating the quality of the cell mass based on the spectrum data of the cell mass obtained in the obtaining step; Is a quality evaluation method.
  • spectrum data is data composed of light intensities at a plurality of wavelengths.
  • the quality evaluation apparatus includes: (2) a light source for irradiating measurement light including near infrared light to a cell mass; A light receiving unit for obtaining spectrum data relating to the cell mass by receiving transmitted light or diffuse reflected light from the cell mass emitted by irradiation of the measurement light from the light source; Based on the spectral data received in the light receiving unit, an analysis unit for evaluating the quality of the cell mass, It is a quality evaluation apparatus provided with.
  • a quality evaluation method and a quality evaluation apparatus capable of nondestructively evaluating the quality of a cell mass are provided.
  • SVM support vector machine
  • the quality evaluation method of this application is (1) An acquisition step of acquiring spectrum data relating to transmitted light or diffuse reflected light from the cell mass by irradiating the cell mass with measurement light including near infrared light, and acquired in the acquisition step And an evaluation step for evaluating the quality of the cell mass based on the spectrum data of the cell mass.
  • a quality evaluation method in order to obtain spectrum data relating to transmitted light or diffuse reflected light and evaluate the quality of the cell mass based on the spectrum data, the quality of the cell mass is evaluated nondestructively. Is possible.
  • the quality of the plurality of cell masses can be evaluated based on the variation in spectrum data of the plurality of cell masses acquired in the acquisition step.
  • the spectral data of a plurality of cell clusters vary, and based on this, the quality of the cell clusters for each culture vessel can be evaluated with higher accuracy.
  • the quality of the cell mass is evaluated by comparing the spectrum data of the cell mass acquired in the acquisition step with the reference spectrum data acquired separately from the acquisition step. It can be. Evaluation with high accuracy is possible by evaluating the quality of the cell mass by comparison with the reference spectrum data.
  • the evaluation step by comparing the intensity of transmitted light or diffuse reflection light at a specific wavelength included in the spectrum data of the cell mass acquired in the acquisition step with a preset threshold value, It can be set as the aspect which evaluates quality. When the quality is evaluated by comparing with the threshold value, the quality can be evaluated more easily.
  • a plurality of spectrum data related to transmitted light or diffuse reflected light related to the cell mass are acquired over time, and in the evaluation step, a plurality of spectrums of the cell mass acquired in the acquisition step
  • the quality of the cell mass can be evaluated on the basis of the change with time of the data. In such a configuration, since the time-dependent change of the cell mass can be confirmed from the spectrum data, the quality can be accurately evaluated.
  • the evaluation step for the spectrum data of the cell mass acquired in the acquisition step, by using multi-variate analysis using reference spectrum data having a quality obtained separately from the acquisition step, It can be set as the aspect which evaluates the quality of a cell mass. By using multivariate analysis, quality can be evaluated with high accuracy.
  • the quality evaluation device of the present application is (9) receiving a light source that irradiates the cell mass with measurement light including near-infrared light, and receiving transmitted light or diffusely reflected light from the cell mass that is emitted by irradiation of the measurement light from the light source. And a light receiving unit that acquires spectrum data related to the cell mass, and an analysis unit that evaluates the quality of the cell mass based on the spectrum data received by the light receiving unit.
  • the quality of the cell mass is evaluated nondestructively. Is possible.
  • the quality evaluation apparatus 100 is an apparatus that evaluates the quality of the cell mass 3 placed on the moving stage 2.
  • the cell mass 3 includes various forms of cells such as a single cell, a one-dimensional mass, a two-dimensional mass, and a three-dimensional mass. It includes cells collected, stem cells prepared based on them, or cells obtained by differentiating stem cells, and those in which a plurality of cell types are mixed. Further, “quality” evaluated by the quality evaluation apparatus 100 indicates “activity”, “activity”, or “safety in the body” of a cell.
  • the quality evaluation apparatus 100 receives the transmitted light emitted from the cell mass 3 by irradiating the cell mass 3 with measurement light, which is near infrared light, and acquires spectrum data (acquisition process). Based on the data, the quality of the cell mass 3 is evaluated (evaluation step). For this reason, the quality evaluation apparatus 100 includes a light source 10, a detection unit 20, and an analysis unit 30 (evaluation unit).
  • the quality evaluation apparatus 100 includes a light source 10, a detection unit 20, and an analysis unit 30 (evaluation unit).
  • near infrared light is used for spectroscopic measurement will be described. However, at least a part of near infrared light may be included as measurement light, and light in other wavelength ranges may be used. It may be used for measurement.
  • the light source 10 irradiates measurement light including near infrared light toward a predetermined area provided on the moving stage 2.
  • the wavelength range of the measurement light irradiated by the light source 10 is appropriately selected depending on the cell mass 3.
  • the measurement light specifically, light having a wavelength range of 800 nm to 2500 nm is used, and in particular, light having a wavelength of 1000 nm to 2300 nm is used. Since near-infrared light in these wavelength regions has vibration absorption (overtones and coupled sounds) of substances, the characteristics of the cell mass 3 that is the measurement object can be obtained by combining them.
  • near-infrared measurement light it is possible to perform measurement using light in a wavelength range different from the absorption band of water.
  • spectral data acquired using light in a wavelength range of 1500 nm to 1900 nm may be used for evaluation.
  • this embodiment demonstrates the light source 10 which consists of a halogen lamp, the kind of light source 10 is not specifically limited.
  • the light source 10 generates measurement light L1 including near infrared light and emits it toward the opening 2A of the moving stage 2 where the cell mass 3 is provided.
  • the light source 10 may include a waveguide optical system such as an optical fiber for irradiating the cell mass 3 with measurement light.
  • the measurement light L1 output from the light source 10 passes through the cell mass 3 accommodated in the container 3A on the opening 2A. A part of the light enters the detection means 20 as transmitted light L2.
  • the detection means 20 has a function as a hyperspectral sensor that acquires a hyperspectral image by a sensor arranged in two dimensions.
  • the hyperspectral image in this embodiment is demonstrated using FIG.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the outline of the hyperspectral image.
  • the hyperspectral image is an image composed of N unit regions P 1 to P N.
  • FIG. 2 specifically shows two unit regions P n and P m as an example of them.
  • the unit areas P n and P m include spectral information S n and S m each including a plurality of intensity data.
  • the intensity data is data indicating a spectral intensity at a particular wavelength (or wavelength band), 2, 15 intensity data has been held as the spectral information S n and S m, superposition of these It is shown in the state.
  • the hyperspectral image H has a plurality of intensity data for each unit region constituting the image, so that a three-dimensional image having both a two-dimensional element as an image and an element as spectral data. It is data of a typical structure.
  • the hyperspectral image H refers to an image having intensity data in at least five wavelength bands per unit area.
  • the cell mass 3 is also shown. That, Pn in FIG. 2 is a unit area of the captured cell mass 3, the P m is a unit area on the background (e.g., container 3A).
  • the detection means 20 acquires not only the cell mass 3 but also an image obtained by imaging the background.
  • the detection means 20 includes an objective lens 21, a slit 22, a spectroscopic element 23, and a light receiving unit 24.
  • a lens barrel 25 is provided between the objective lens 21 and the slit 22.
  • the slit 22 is provided with an opening in one direction (direction intersecting the paper surface).
  • the transmitted light L 2 that has passed through the lens barrel 25 from the objective lens 21 of the detection means 20 and entered the slit 22 enters the spectroscopic element 23.
  • the spectroscopic element 23 splits the transmitted light L2 in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the slit 22.
  • the light split by the spectroscopic element 23 is received by the light receiving unit 24.
  • the light receiving unit 24 includes a light receiving surface in which a plurality of light receiving elements are two-dimensionally arranged, and each light receiving element receives light. Thereby, in the area
  • the light receiving elements arranged in the direction to receive light respectively receive light.
  • Each light receiving element outputs a signal corresponding to the intensity of received light as information on a two-dimensional planar point composed of a position and a wavelength.
  • a signal output from the light receiving element of the light receiving unit 24 is sent from the detecting unit 20 to the analyzing unit 30 as spectral data for each unit region related to the hyperspectral image.
  • the analyzing means 30 acquires the spectrum data of the transmitted light L2 from the input signal, and evaluates the cell mass 3 using the spectrum data.
  • the analysis means 30 includes a CPU (Central Processing Unit), a main memory RAM (Random Access Memory) and ROM (Read Only Memory), a communication module that performs communication with other devices such as the detection means 20, In addition, it is configured as a computer including hardware such as an auxiliary storage device such as a hard disk. And the function as the analysis means 30 is exhibited when these components operate
  • CPU Central Processing Unit
  • main memory RAM Random Access Memory
  • ROM Read Only Memory
  • the above-described quality evaluation apparatus 100 can acquire a so-called one-dimensional spectrum image of a region along the extending direction of the slit by one imaging. Therefore, by moving the moving stage 2 on which the cell mass 3 is placed, or moving the imaging region by the quality evaluation apparatus 100, the spectrum data for the entire cell mass 3 can be acquired.
  • the analysis means 30 separately from the measurement of the spectrum data related to the cell mass 3, an incident light spectrum related to the incident light without the cell mass 3 is acquired in advance, and the incident light spectrum and the transmitted light L ⁇ b> 2 of the cell mass 3 are obtained. From the difference from the spectrum data, the spectrum data (transmission spectrum) related to the transmitted light derived from the cell mass 3 can be obtained. The cell mass 3 is evaluated using this transmission spectrum.
  • a plurality of cell masses 3 are accommodated in one plate (culture vessel). Therefore, when evaluating the quality of a cell mass, rather than evaluating each cell mass one by one, a plurality of cell masses accommodated in one plate (culture container) are collectively evaluated.
  • Such an evaluation method is often employed in the field of regenerative medicine. In the following description of the evaluation method, both the evaluation method in units of 3 cell clusters and the evaluation method in plate units will be described.
  • non-defective product and “defective product”
  • quality evaluation a case where the cell mass to be evaluated is classified into two parts.
  • the evaluation When the evaluation is performed for each cell mass 3, by performing processing such as averaging with respect to a plurality of transmission spectra acquired for one cell mass 3, it is compared with the good spectrum data acquired as a reference spectrum. It is possible to evaluate whether the product is good or defective.
  • the reference spectrum for the intensity of transmitted light at a specific wavelength included in the spectrum data.
  • a threshold value may be set in advance for the intensity of transmitted light at a specific wavelength included in spectrum data, and the quality of the cell mass may be evaluated based on the threshold value. . In this case, since the reference spectrum is not used, the evaluation can be performed more easily.
  • a transmission spectrum of the cell mass 3 is acquired every elapsed time (for example, about 36 to 48 hours every 6 to 10 hours), and the cell mass 3 It can also be set as the structure which evaluates quality.
  • the quality can be accurately evaluated.
  • it since there are various methods for evaluating the quality based on the transmission spectrum of the cell mass 3, it can be appropriately selected according to the type and state of the cell mass to be evaluated.
  • the first method after measuring the spectrum related to the plurality of cell clusters 3 accommodated in the same plate and obtaining the transmission spectra, respectively, after performing processing such as averaging, One spectrum data used for evaluation is calculated. And quality can be evaluated using the method similar to evaluation for every above-mentioned cell mass 3, such as a method of comparing the spectrum data with a reference spectrum, for example.
  • spectrum data relating to a plurality of cell masses 3 accommodated in the same plate is acquired and transmission spectra are obtained, and then evaluation is performed using these.
  • a method of determining whether or not the product is a non-defective product based on whether or not the transmission spectrum variation (standard deviation) of the plurality of cell masses 3 accommodated in the same plate is within a predetermined threshold is used. Can do.
  • FIG. 3 is a diagram showing variations in transmission spectra for a plurality of cell cluster 3 plates including only non-defective products and a plurality of cell cluster 3 plates including defective products.
  • the spectrum was measured by the method shown in the above embodiment for each of eight cell clusters in the plate (culture vessel), and the average and standard deviation of the transmission spectrum were obtained for each plate with respect to the obtained transmission spectrum.
  • FIG. 3 shows average spectra, + ⁇ and ⁇ for each of the non-defective product plate and the defective product plate.
  • the integrated standard deviation of the transmission spectrum obtained by measuring the cell mass of the non-defective plate was 1.1, whereas The integrated standard deviation of the transmission spectrum obtained by measuring the cell mass was 11.1.
  • the integrated standard deviation of the transmission spectrum obtained by measuring the cell mass was 11.1.
  • the spectrum data used for evaluation is prepared from one or more spectrum data concerning one cell mass 3.
  • the spectrum data used for evaluation is prepared from one or more spectrum data concerning the cell cluster of the target plate.
  • the reference spectral data used for multivariate analysis is a plurality of spectral data acquired from cell masses of known quality. For example, when it is desired to determine whether the product is non-defective / defective, spectral data of good and defective products is prepared. Thus, reference spectrum data is prepared according to the quality to be evaluated. Examples of multivariate analysis include, but are not limited to, principal component analysis, regression analysis, factor analysis, and the like.
  • principal component analysis is performed using reference spectrum data to identify one or more principal components that are affected by quality, and each principal component corresponding to the quality is identified. Specify the component score range. That is, by performing principal component analysis, spectrum data of cell masses having different qualities can be classified according to the score value of the principal component. Thereafter, for the spectrum data relating to the cell mass to be evaluated, the score of each principal component is calculated, and based on the calculated score value of the principal component, it is possible to determine the quality of the cell mass to be evaluated it can.
  • FIG. 4 is a result of plotting each spectrum data based on the score of each principal component, with the first principal component obtained as a result of the principal component analysis as the horizontal axis and the second principal component as the vertical axis. As shown in FIG.
  • a non-defective product / defective product can also be determined by calculating the score of the first principal component for the evaluation target cell mass whose quality is unknown.
  • FIG. 5 is a result of plotting each spectrum data based on the score of each principal component, with the first principal component obtained as a result of the principal component analysis on the horizontal axis and the third principal component on the vertical axis. As shown in FIG.
  • the scores of the first principal component and the third principal component change according to the culture period after induction. Specifically, it was confirmed that the score of the first principal component is biased depending on whether it is 5 weeks or 2.3 weeks. In addition, it was confirmed that the scores of the third main component were biased between 2 weeks and 3 weeks. Therefore, for the cells to be evaluated (cell mass) whose culture period is unknown, the culture period as quality can be estimated by calculating the scores of the first principal component and the third principal component.
  • FIG. 6 is a result of plotting each spectrum data based on the score of each principal component, with the first principal component obtained as a result of the principal component analysis on the horizontal axis and the third principal component on the vertical axis. As shown in FIG. 6, it was confirmed that there was a bias in the score of the first main component according to the life or death of the cells. Therefore, it is possible to discriminate between life and death by calculating the score of the first principal component for cells (cell mass) whose life and death are unknown.
  • the spectrum data used for evaluation is prepared from one or more spectrum data concerning one cell mass 3.
  • the spectrum data used for evaluation is prepared from one or more spectrum data concerning the cell cluster of the target plate.
  • the reference spectrum data used for machine learning pattern recognition is a plurality of spectrum data acquired from cell masses of known quality as in the case of multivariate analysis. For example, when it is desired to determine whether the product is non-defective / defective, spectral data of good and defective products is prepared. Thus, reference spectrum data is prepared according to the quality to be evaluated.
  • machine learning pattern recognition include, but are not limited to, a support vector machine (SVM), a kernel method, a Bayesian network method, and the like.
  • a standard for classifying different qualities is calculated using reference spectrum data.
  • the identification surface is a reference for classification.
  • a new space for quality evaluation may be defined and a standard in the space may be defined.
  • FIG. 7 shows the result of plotting the score (distance from the identification plane) related to the reference spectrum data as a histogram. As shown in FIG. 7, it was confirmed that the score varied depending on the culture period after induction. Therefore, the estimation of the culture period as the quality can be performed by calculating the feature amount of the cell (cell mass) to be evaluated whose culture period is unknown.
  • spectrum data relating to transmitted light or diffuse reflected light obtained by irradiating the cell mass 3 with measurement light including near-infrared light is used.
  • a configuration for performing quality evaluation based on this it is possible to perform quality evaluation of a cell mass in a non-destructive and non-invasive manner.
  • near-infrared light it is possible to obtain the characteristics of the composition by a combination of vibration absorption (overtone, coupled sound) of the substance, etc., and to capture the concentration change. Therefore, quality evaluation with high accuracy can be realized.
  • the quality evaluation apparatus and the quality evaluation method according to the present invention are not limited to the above embodiment.
  • the spectroscopic measurement apparatus is not limited to the configuration including the light source 10, the detection unit 20, and the analysis unit 30 as in the above embodiment, and the configuration can be changed as appropriate.
  • the quality evaluation apparatus 100 assigns wavelength information to the pixels in which a plurality of two-dimensionally arranged pixels are arranged in the first direction, and the second orthogonal to the first direction.
  • a so-called hyperspectral image can be obtained in which the pixel arrayed in the direction of each is assigned with the position information of the measurement object, and the spectrum data of each unit region along the second direction can be obtained.

Abstract

　品質評価方法は、細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射することにより、当該細胞塊からの透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを取得する取得工程と、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する評価工程と、を有する。

Description

品質評価方法及び品質評価装置
　本発明は、細胞塊の品質評価方法及び品質評価装置に関する。
　細胞の培養状態を評価する方法は種々検討されている。例えば、特許文献１では、細胞塊の成熟度を判定することを目的として、細胞塊の時系列画像を取得して評価を行う構成が示されている。また、特許文献２では、細胞塊を蛍光染色した後に蛍光画像を撮影して、これに基づいて評価を行う構成が示されている。
国際公開第２０１１／０１３３１９号 特開２０１３－２７３６８号公報
　しかしながら、上記の特許文献１，２に記載の方法では、細胞塊の活性や活性度といった細胞塊の品質を非破壊で評価することについては検討されていなかった。
　本発明は上記を鑑みてなされたものであり、細胞塊の品質を非破壊で評価することが可能な品質評価方法及び品質評価装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る品質評価方法は、
（１）　細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射することにより、当該細胞塊からの透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを取得する取得工程と、
　前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する評価工程と、
　を有する品質評価方法
である。ここで、「スペクトルデータ」とは、複数の波長における光の強度からなるデータのことである。
　また、本発明の一形態に係る品質評価装置は、
（２）細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射する光源と、
　前記光源からの前記測定光の照射によって出射される前記細胞塊からの透過光又は拡散反射光を受光することで当該細胞塊に係るスペクトルデータを取得する受光部と、
　前記受光部において受光された前記スペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する分析部と、
　を備える品質評価装置
である。
　本発明によれば、細胞塊の品質を非破壊で評価することが可能な品質評価方法及び品質評価装置が提供される。
本実施形態に係る品質評価装置の概略構成図である。 ハイパースペクトル画像について説明する図である。 品質の差に由来するスペクトル形状の変化について説明する図である。 主成分解析を用いた分析例を示す図である。 主成分解析を用いた分析例を示す図である。 主成分解析を用いた分析例を示す図である。 サポートベクタマシン（ＳＶＭ）を用いた分析例を示す図である。
［本願発明の実施形態の説明］
　最初に本願発明の実施態様を列記して説明する。
　本願の品質評価方法は、
（１）細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射することにより、当該細胞塊からの透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを取得する取得工程と、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する評価工程と、を有する。このような品質評価方法によれば、透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを取得して当該スペクトルデータに基づいて細胞塊の品質を評価するため、細胞塊の品質を非破壊で評価することが可能となる。
（２）前記取得工程において、培養容器に収容された複数の細胞塊からの透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータをそれぞれ取得し、前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記複数の細胞塊のスペクトルデータに基づいて、前記複数の細胞塊の品質を前記培養容器毎に評価する態様とすることができる。この場合、培養容器毎に細胞塊の品質評価が可能となる。
（３）前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記複数の細胞塊のスペクトルデータのばらつきに基づいて、前記複数の細胞塊の品質を評価する態様とすることができる。品質に問題がある場合、複数の細胞塊のスペクトルデータにばらつきがあるため、これに基づいて、培養容器毎の細胞塊の品質の評価をより高い精度で行うことができる。
（４）前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータと、前記取得工程とは別に取得された参照スペクトルデータとを比較することで前記細胞塊の品質を評価する態様とすることができる。参照スペクトルデータとの比較により細胞塊の品質を評価することで、高い精度での評価が可能となる。
（５）前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに含まれる特定波長における透過光又は拡散反射光の強度を予め設定された閾値と比較することによって前記細胞塊の品質を評価する態様とすることができる。閾値との比較を行うことにより品質の評価を行う場合、より簡単に品質の評価を行うことができる。
（６）前記取得工程において、前記細胞塊に係る透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを経時的に複数取得し、前記評価工程において、前記取得工程において取得された複数の前記細胞塊のスペクトルデータの経時変化に基づいて、前記細胞塊の品質を評価する態様とすることができる。このような構成とした場合、細胞塊の経時変化をスペクトルデータから確認することができるため、品質の評価を精度よく行うことができる。
（７）前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに対して、前記取得工程とは別に得た品質が既知の参照スペクトルデータを用いて、多変量解析によって、前記細胞塊の品質を評価する態様とすることができる。多変量解析を用いることで、品質の評価を精度よく行うことができる。
（８）前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに対して、前記取得工程とは別に得た品質が既知の参照スペクトルデータを用いて、機械学習パターン認識によって、前記細胞塊の品質を評価する態様とすることができる。機械学習パターン認識を用いることで、品質の評価を精度よく行うことができる。
　また、本願の品質評価装置は、
（９）細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射する光源と、前記光源からの前記測定光の照射によって出射される前記細胞塊からの透過光又は拡散反射光を受光することで当該細胞塊に係るスペクトルデータを取得する受光部と、前記受光部において受光された前記スペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する分析部と、を備える。このような品質評価装置によれば、透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを取得して当該スペクトルデータに基づいて細胞塊の品質を評価するため、細胞塊の品質を非破壊で評価することが可能となる。
［本願発明の実施形態の詳細］
　本発明に係る品質評価方法及び品質評価装置の具体例を、以下に図面を参照しつつ説明する。なお、本発明はこれらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
　本実施形態に係る品質評価装置１００について図１を用いて説明する。品質評価装置１００は、移動ステージ２上に載置された細胞塊３の品質を評価する装置である。本明細書において細胞塊３とは、細胞単体、一次元状の塊、二次元状の塊、三次元状の塊など細胞のさまざまな形態を含むものであり、細胞塊３は動物又はヒトから採取した細胞、それらを元に作製した幹細胞、或いは、幹細胞を分化した細胞で構成されているもので、複数の細胞種が混在するものも含んでいる。また、品質評価装置１００により評価される「品質」とは、細胞の「活性」、「活性度」、又は「体内での安全性」を示すものである。これらは、細胞の増殖などのライフサイクルを維持する能力、凝集能力、特定の組織細胞になる能力、細胞としての必要な機能を維持する能力、細胞塊の凝集能力、動物又はヒトの体内での組織再生能力に関連する指標である。
　品質評価装置１００は、近赤外光である測定光を細胞塊３に対して照射することにより細胞塊３から出射される透過光を受光してスペクトルデータを取得し（取得工程）、そのスペクトルデータに基づいて細胞塊３の品質の評価を行う（評価工程）。このため、品質評価装置１００は、光源１０、検出手段２０、及び分析手段３０（評価手段）を備える。なお、以下の実施形態では近赤外光を分光測定に使用する場合について説明するが、測定光として、少なくとも近赤外光が一部含まれていればよく、例え他の波長範囲の光を測定に用いてもよい。また、透過光のスペクトルデータに替えて拡散反射光のスペクトルデータを取得して評価を行う構成としてもよい。
　光源１０は、近赤外光が含まれる測定光を、移動ステージ２上に設けられた所定の領域へ向けて照射する。光源１０が照射する測定光の波長範囲は、細胞塊３によって適宜選択される。測定光としては、具体的には、波長範囲が８００ｎｍ～２５００ｎｍの光が用いられ、特に１０００ｎｍ～２３００ｎｍの光が用いられる。これらの波長域の近赤外光は、物質の振動吸収（倍音、結合音）があるので、それらの組み合わせにより、測定対象物となる細胞塊３の特徴を得ることができる。近赤外光の測定光を用いる場合、水の吸収帯とは異なる波長範囲の光を用いた測定を行うことができ、例えば、１５００ｎｍ～１８００ｎｍ（特に１６５０ｎｍ～１７５０ｎｍ）、２０００ｎｍ～２３００ｎｍの波長範囲の光を用いることができる。また、１５００ｎｍ～１９００ｎｍ（特に１５３０ｎｍ～１８５０ｎｍ）の波長範囲の光を用いて取得されたスペクトルデータを評価に用いる構成とすることもできる。なお、本実施形態では、ハロゲンランプからなる光源１０について説明するが、光源１０の種類は特に限定されない。
　光源１０は、近赤外光を含む測定光Ｌ１を発生させて細胞塊３が設けられる移動ステージ２の開口２Ａへ向けて出射する。なお、光源１０は、細胞塊３に対して測定光を照射するための光ファイバ等の導波光学系等を含んでいてもよい。
　光源１０から出力された測定光Ｌ１は、開口２Ａ上の容器３Ａ内に収容された細胞塊３を透過する。そして、その一部が、透過光Ｌ２として検出手段２０に入射する。
　検出手段２０は、２次元に配置されたセンサによってハイパースペクトル画像を取得するハイパースペクトルセンサとしての機能を有する。ここで、本実施形態におけるハイパースペクトル画像について図２を用いて説明する。図２は、ハイパースペクトル画像についてその概略を説明する図である。図２に示すように、ハイパースペクトル画像とは、Ｎ個の単位領域Ｐ１～ＰＮにより構成されている画像である。図２ではそのうちの一例として２個の単位領域Ｐｎ及びＰｍについて具体的に示している。単位領域Ｐｎ及びＰｍには、それぞれ複数の強度データからなるスペクトル情報Ｓｎ及びＳｍが含まれている。この強度データとは、特定の波長（又は波長帯域）におけるスペクトル強度を示すデータであり、図２では、１５個の強度データがスペクトル情報Ｓｎ及びＳｍとして保持されていて、これらを重ね合わせた状態で示している。このように、ハイパースペクトル画像Ｈは、画像を構成する単位領域毎に、それぞれ複数の強度データを持つという特徴から、画像としての二次元的要素と、スペクトルデータとしての要素をあわせ持った三次元的構成のデータである。なお、本実施形態では、ハイパースペクトル画像Ｈとは、１単位領域あたり少なくとも５つの波長帯域における強度データを保有している画像のことをいう。
　図２では細胞塊３もあわせて示している。すなわち、図２においてＰｎは細胞塊３を撮像した単位領域であり、Ｐｍは背景（例えば、容器３Ａ）上の単位領域である。このように、検出手段２０では、細胞塊３だけでなく背景を撮像した画像も取得される。
　図１に戻り、本実施形態に係る検出手段２０は、対物レンズ２１と、スリット２２と、分光素子２３と、受光部２４と、を備える。対物レンズ２１とスリット２２との間には鏡筒２５が設けられる。
　スリット２２は、一の方向（紙面に対して交差する方向）に開口が設けられる。検出手段２０の対物レンズ２１から鏡筒２５内を通過し、スリット２２に入射した透過光Ｌ２は、分光素子２３へ入射する。
　分光素子２３は、スリット２２の長手方向に対して垂直な方向に透過光Ｌ２を分光する。分光素子２３により分光された光は、受光部２４によって受光される。
　受光部２４は、複数の受光素子が２次元に配列された受光面を備え、各受光素子が光を受光する。これにより、受光部２４が移動ステージ２上のスリット２２の延在方向に沿った領域において、細胞塊３を透過した透過光Ｌ２の各波長の光を、スリット２２の延在方向に対して直交する方向に配列された受光素子において、それぞれ受光することとなる。各受光素子は、受光した光の強度に応じた信号を位置と波長とからなる二次元平面状の一点に関する情報として出力する。この受光部２４の受光素子から出力される信号が、ハイパースペクトル画像に係る単位領域毎のスペクトルデータとして、検出手段２０から分析手段３０に送られる。
　分析手段３０は、入力された信号により透過光Ｌ２のスペクトルデータを取得し、このスペクトルデータを用いて、細胞塊３に係る評価を行う。
　この分析手段３０は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）、主記憶装置であるＲＡＭ（Random　Access　Memory）及びＲＯＭ（Read　Only　Memory）、検出手段２０等の他の機器との間の通信を行う通信モジュール、並びにハードディスク等の補助記憶装置等のハードウェアを備えるコンピュータとして構成される。そして、これらの構成要素が動作することにより、分析手段３０としての機能が発揮される。
　上記の品質評価装置１００は、一度の撮像によって、スリットの延在方向に沿った領域についての所謂１次元のスペクトル画像を取得することができる。したがって、細胞塊３が載置された移動ステージ２を移動するか、又は、品質評価装置１００による撮像領域を移動させることによって、細胞塊３全体についてのスペクトルデータを取得することができる。
　分析手段３０では、細胞塊３に係るスペクトルデータの測定とは別に、細胞塊３がない状態での入射光に係る入射光スペクトルを予め取得し、入射光スペクトルと細胞塊３の透過光Ｌ２のスペクトルデータとの差分から細胞塊３に由来する透過光に係るスペクトルデータ（透過スペクトル）を求めることができる。この透過スペクトルを用いて細胞塊３の評価が行われる。
　一般的に、細胞塊３は、１つのプレート（培養容器）に複数収容されている。そのため、細胞塊の品質を評価する場合、細胞塊１つずつの評価を行うのではなく、１つのプレート（培養容器）に収容された複数の細胞塊を纏めて評価を行う。このような評価方法は、再生医療の分野において採用されることが多い。以下の評価方法に係る説明では、細胞塊３単位での評価方法と、プレート単位での評価方法との両方について説明する。
　なお、以下の説明では、「品質評価」として、評価対象の細胞塊を「良品」「不良品」の２つに分類する場合について説明するが、例えば、３つ以上に分類する構成としてもよい。その場合には、分類先の数に応じて分類するための基準が複数設定される。
　細胞塊３毎に評価を行う場合、１つの細胞塊３について取得された複数の透過スペクトルに関して平均化等の処理を行った後に、参照スペクトルとして取得された良品のスペクトルデータと比較をすることにより良品であるか不良品であるかの評価を行うことができる。この際に、参照スペクトルと、測定対象物である細胞塊３の透過スペクトルとについて、スペクトル形状の比較を行う方法のほかに、スペクトルデータに含まれる特定の波長における透過光の強度についての参照スペクトルとの差分についての閾値を予め設定しておき、差分が閾値を超えた場合には不良品と判定する方法を用いることができる。また、参照スペクトルを利用せずに、スペクトルデータに含まれる特定の波長における透過光の強度に関して閾値を予め設定しておき、当該閾値に基づいて細胞塊の品質を評価する構成とすることもできる。この場合には、参照スペクトルを用いないため、より簡便に評価をすることができる。
　また、他の評価方法として、細胞塊３の透過スペクトルを経過時間毎（例えば６～１０時間毎に３６～４８時間程度）に取得し、時間によるスペクトルデータの経時変化に基づいて細胞塊３の品質を評価する構成とすることもできる。この場合には、細胞塊の経時変化をスペクトルデータから確認することができるため、品質の評価を精度よく行うことができる。このように、細胞塊３の透過スペクトルに基づいて、その品質を評価する方法は種々存在するので、評価対象の細胞塊の種類や状態等に応じて適宜選択することができる。
　一方、プレート毎に複数の細胞塊の品質を評価する場合には、同一のプレートに収容された複数の細胞塊３に係る透過スペクトルを１つ算出し、これに基づいて評価する第１の方法と、同一のプレートに収容された複数の細胞塊３のそれぞれに係る複数の透過スペクトルを算出してこれらに基づいて評価する第２の方法と、が挙げられる。
　第１の方法の場合、同一のプレートに収容された複数の細胞塊３に係るスペクトルを測定してそれぞれ透過スペクトルを求めた後、平均化等の処理を行った上で当該プレートの細胞塊の評価に用いられる１つのスペクトルデータを算出する。そして当該スペクトルデータを例えば参照スペクトルと比較する方法等、上述の細胞塊３毎の評価と同様の方法を用いて品質を評価することができる。
　一方、第２の方法の場合、同一のプレートに収容された複数の細胞塊３に係るスペクトルデータを取得してそれぞれ透過スペクトルを求めた後、これらを用いて評価を行う。具体的には、同一のプレートに収容された複数の細胞塊３の透過スペクトルのばらつき（標準偏差）が所定の閾値以内であるか否かに基づいて良品か否かを判定する方法を用いることができる。
　上記の第２の方法で評価を行うことについて、図３を参照しながら説明する。図３は、良品のみで構成された複数の細胞塊３のプレートと、不良品を含む複数の細胞塊３のプレートと、についての透過スペクトルのばらつきを示す図である。プレート（培養容器）内の細胞塊をそれぞれ８個ずつ上記実施形態で示した方法でスペクトルを測定し、得られた透過スペクトルに関して、プレート毎に透過スペクトルの平均及び標準偏差を求めた。図３では、良品プレート及び不良品プレートのそれぞれに関して、平均スペクトル、＋σ及び－σを示している。１５５０ｎｍ～１７５０ｎｍの波長範囲において、６ｎｍ間隔毎に透過強度の標準偏差を積算した結果、良品プレートの細胞塊を測定した透過スペクトルの積算標準偏差は１．１であるのに対し、不良品プレートの細胞塊を測定した透過スペクトルの積算標準偏差は１１．１であった。このように、良品プレートと不良品プレートとの間で積算標準偏差について約１０倍の差があったので、積算標準偏差に基づいて品質評価を行う（良品／不良品の判定を行う）ことが可能であることが確認された。
　さらに、細胞塊の評価を行う場合の他の方法として、対象となる細胞塊について取得されたスペクトルデータについて、規格化等の前処理を行った後に、参照スペクトルデータを利用して、多変量解析によって細胞塊の品質を評価する方法が挙げられる。この方法は、品質評価の対象となる細胞塊の単位毎に１つのスペクトルデータを準備すればよい。したがって、細胞塊３毎に評価を行う場合には、１つの細胞塊３に係る１以上のスペクトルデータから評価に用いるスペクトルデータを準備する。また、プレート毎に細胞塊の評価を行う場合には、対象のプレートの細胞塊に係る１以上のスペクトルデータから評価に用いるスペクトルデータを準備する。
　多変量解析に用いる参照スペクトルデータは、品質が既知の細胞塊から取得された複数のスペクトルデータである。例えば、良品／不良品の判定を行いたい場合には、良品及び不良品のスペクトルデータを準備する。このように、評価したい品質に応じて参照スペクトルデータを準備する。また、多変量解析としては、例えば主成分分析、回帰分析、因子分析等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　主成分分析を用いて細胞塊の品質評価を行う場合、まず、参照スペクトルデータを用いて主成分分析を行い、品質の影響を受ける１以上の主成分を特定すると共に、品質に応じた各主成分のスコアの範囲を特定する。すなわち、主成分分析を行うことで、互いに異なる品質の細胞塊のスペクトルデータが主成分のスコア値に応じて分類可能となる。その後、評価対象の細胞塊に係るスペクトルデータについて、各主成分のスコアを算出し、算出された主成分のスコア値に基づいて、評価対象の細胞塊がどの品質であるかを判断することができる。
　多変量解析を用いた品質評価の例を、以下３例説明する。まず、細胞塊の良品／不良品を分類する例について、図４を参照しながら説明する。良品／不良品の何れかに属する細胞塊に係る吸光度スペクトルからなるスペクトルデータを複数取得し、それぞれ規格化等の前処理を行った。その後、１５３０ｎｍ～１８５０ｎｍの波長範囲のスペクトルデータを用いて主成分分析を行った。図４は、主成分分析の結果得られた第１主成分を横軸とし、第２主成分を縦軸として、各スペクトルデータを各主成分のスコアに基づいてプロットした結果である。図４に示すように、良品と不良品との間で第１主成分のスコアに偏りがあることが確認された。したがって、品質が未知の評価対象の細胞塊についても、第１主成分のスコアを算出することで、良品／不良品の判定を行うことができる。
　次に、細胞塊の培養期間を分類する例について、図５を参照しながら説明する。具体的には、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の誘導から２週間後、３週間後及び５週間後の細胞を準備し、それぞれの吸光度スペクトルからなるスペクトルデータを複数取得し、それぞれ規格化等の前処理を行った。その後、１５３０ｎｍ～１８５０ｎｍの波長範囲のスペクトルデータを用いて主成分分析を行った。図５は、主成分分析の結果得られた第１主成分を横軸とし、第３主成分を縦軸として、各スペクトルデータを各主成分のスコアに基づいてプロットした結果である。図５に示すように、誘導後の培養期間に応じて、第１主成分及び第３主成分のスコアが変化することが確認された。具体的には、５週間であるか２・３週間であるかに応じて第１主成分のスコアに偏りがあることが確認された。また、２週間と３週間との間で第３主成分のスコアに偏りがあることが確認された。したがって、培養期間が未知の評価対象の細胞（細胞塊）についても、第１主成分及び第３主成分のスコアを算出することで、品質としての培養期間の推定を行うことができる。
　次に、細胞（細胞塊）の生死を分類（判別）する例について、図６を参照しながら説明する。生死が明らかなマウス繊維芽細胞に係る吸光度スペクトルからなるスペクトルデータを複数取得し、それぞれ規格化等の前処理を行った。その後、１５３０ｎｍ～１８５０ｎｍの波長範囲のスペクトルデータを用いて主成分分析を行った。図６は、主成分分析の結果得られた第１主成分を横軸とし、第３主成分を縦軸として、各スペクトルデータを各主成分のスコアに基づいてプロットした結果である。図６に示すように、細胞の生死に応じて、第１主成分のスコアの偏りがあることが確認された。したがって、生死が不明な細胞（細胞塊）についても、第１主成分のスコアを算出することで、生死の判別を行うことができる。
　また、細胞塊の評価を行う場合の他の方法として、対象となる細胞塊について取得されたスペクトルデータについて、規格化等の前処理を行った後に、参照スペクトルデータを利用した機械学習パターン認識によって細胞塊の品質を評価する方法が挙げられる。この方法は、品質評価の対象となる細胞塊の単位毎に１つのスペクトルデータを準備すればよい。したがって、細胞塊３毎に評価を行う場合には、１つの細胞塊３に係る１以上のスペクトルデータから評価に用いるスペクトルデータを準備する。また、プレート毎に細胞塊の評価を行う場合には、対象のプレートの細胞塊に係る１以上のスペクトルデータから評価に用いるスペクトルデータを準備する。
　機械学習パターン認識に用いる参照スペクトルデータは、多変量解析の場合と同様に品質が既知の細胞塊から取得された複数のスペクトルデータである。例えば、良品／不良品の判定を行いたい場合には、良品及び不良品のスペクトルデータを準備する。このように、評価したい品質に応じて参照スペクトルデータを準備する。また、機械学習パターン認識としては、例えばサポートベクタマシン（ＳＶＭ）、カーネル法、ベイジアンネットワーク法等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　機械学習パターン認識を用いて細胞塊の品質評価を行う場合、まず、参照スペクトルデータを用いて、互いに異なる品質（例えば良品／不良品）を分別するための基準を算出する。ＳＶＭの場合は識別面が分別するための基準となる。解析方法によっては、品質評価を行うための空間を新たに定義し、その空間内での基準を定義する場合もある。次に、評価対象の細胞塊に係るスペクトルデータについて、学習データに基づいて作られた分別基準に基づいて、評価対象の細胞塊がどの品質であるかを判断することができる。
　多変量解析を用いた品質評価の例を説明する。細胞塊の品質として、細胞塊の培養期間を分類する例について、図７を参照しながら説明する。具体的には、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の誘導から２週間後及び３週間後の細胞を準備し、それぞれの透過スペクトルからなるスペクトルデータを複数取得し、それぞれ規格化等の前処理を行った。その後、１５３０ｎｍ～１８５０ｎｍの波長範囲のスペクトルデータを参照スペクトルデータとして、この参照スペクトルデータに基づく学習を行い、２週間後及び３週間後の細胞を区別するための識別面を求めた。図７は、参照スペクトルデータに係るスコア（識別面からの距離）をヒストグラムとしてプロットした結果である。図７に示すように、誘導後の培養期間によってスコアが変化することが確認された。したがって、培養期間が未知の評価対象の細胞（細胞塊）についても、特徴量を算出することで、品質としての培養期間の推定を行うことができる。
　このように、本発明に係る品質評価装置及び品質評価方法によれば、細胞塊３に対して近赤外光を含む測定光を照射して得られる透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータに基づいて品質評価を行う構成とすることで、非破壊・非侵襲で細胞塊の品質評価を行うことができる。近赤外光を用いることで、物質の振動吸収（倍音、結合音）等の組み合わせで組成の特徴を得ることができると共に、濃度変化を捉えることも可能である。したがって、高い精度での品質評価を実現することができる。
　なお、本発明に係る品質評価装置及び品質評価方法は上記実施形態に限定されない。例えば、上記実施形態のように分光測定装置が光源１０、検出手段２０及び分析手段３０を備えている構成には限定されず、その構成は適宜変更することができる。
　また、上記実施形態では、品質評価装置１００において、２次元配置された複数の画素が第１の方向に配列する画素についてはそれぞれ波長情報を割り当てると共に、第１の方向に対して直交する第２の方向に配列する画素についてはそれぞれ測定対象物の位置情報を割り当てて、第２の方向に沿った各単位領域のスペクトルデータをそれぞれ取得する態様とすることができる、所謂ハイパースペクトル画像を取得する構成について説明したが、他の装置構成であってもよい。
　２…移動ステージ、３…細胞塊、１０…光源、２０…検出手段、３０…分析手段、１００…品質評価装置。
 

Claims (9)

  1. 　細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射することにより、当該細胞塊からの透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを取得する取得工程と、
    　前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する評価工程と、
    　を有する品質評価方法。
  2. 　前記取得工程において、培養容器に収容された複数の細胞塊からの透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータをそれぞれ取得し、
    　前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記複数の細胞塊のスペクトルデータに基づいて、前記複数の細胞塊の品質を前記培養容器毎に評価する請求項１記載の品質評価方法。
  3. 　前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記複数の細胞塊のスペクトルデータのばらつきに基づいて、前記複数の細胞塊の品質を評価する請求項２記載の品質評価方法。
  4. 　前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータと、前記取得工程とは別に取得された参照スペクトルデータとを比較することで前記細胞塊の品質を評価する請求項１又は２に記載の品質評価方法。
  5. 　前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに含まれる特定波長における透過光又は拡散反射光の強度を予め設定された閾値と比較することによって前記細胞塊の品質を評価する請求項１又は２に記載の品質評価方法。
  6. 　前記取得工程において、前記細胞塊に係る透過光又は拡散反射光に係るスペクトルデータを経時的に複数取得し、
    　前記評価工程において、前記取得工程において取得された複数の前記細胞塊のスペクトルデータの経時変化に基づいて、前記細胞塊の品質を評価する請求項１又は２に記載の品質評価方法。
  7. 　前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに対して、前記取得工程とは別に得た品質が既知の参照スペクトルデータを用いて、多変量解析によって、前記細胞塊の品質を評価する請求項１又は２に記載の品質評価方法。
  8. 　前記評価工程において、前記取得工程において取得された前記細胞塊のスペクトルデータに対して、前記取得工程とは別に得た品質が既知の参照スペクトルデータを用いて、機械学習パターン認識によって、前記細胞塊の品質を評価する請求項１又は２に記載の品質評価方法。
  9. 　細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射する光源と、
    　前記光源からの前記測定光の照射によって出射される前記細胞塊からの透過光又は拡散反射光を受光することで当該細胞塊に係るスペクトルデータを取得する受光部と、
    　前記受光部において受光された前記スペクトルデータに基づいて、前記細胞塊の品質を評価する分析部と、
    　を備える品質評価装置。
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