WO2016080392A1 - ワクチン及びプライムブーストワクチン - Google Patents

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志保子 相澤
三男 本多
早川　智
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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine and a prime boost vaccine.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-232837 filed in Japan on November 17, 2014, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • BCG Calumet Guerin bacilli
  • cellular immunity is important for protection against infection with intracellular parasites such as Mycobacterium tuberculosis.
  • the inventors have antigen-specific T cells activated by immunization with a BCG vaccine mainly CD4 positive T cells (helper T cells), which are important for cellular immunity (CD8 positive T cells ( It was found that (cytotoxic T cells) are hardly activated.
  • an object of the present invention is to provide a vaccine capable of activating pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8-positive T cells.
  • the present invention is as follows.
  • a vaccine for activating CD8 T cells comprising BCG bacteria expressing a protein derived from a pathogenic microorganism as an active ingredient.
  • the vaccine according to any one of (1) to (4), wherein the protein is an Ag85B protein of Mycobacterium kansasii.
  • a vaccine capable of activating pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8-positive T cells can be provided.
  • 2 is a graph showing the proportion of interferon- ⁇ producing cells in all mononuclear cell groups.
  • 3 is a graph showing the presence ratio of interferon- ⁇ producing cells in a CD4 positive T cell removal group and a CD8 positive T cell removal group.
  • 3 is a graph showing the proportion of interferon- ⁇ producing cells in the CD4 positive T cell and CD8 positive T cell removal group. It is a figure which shows the structure of p3HA85B vector. It is a figure which shows the structure of pDNA85B vector. It is a photograph which shows the result of the western blotting which examined the expression of Ag85B protein. It is a photograph which shows the result of the western blotting of BCG bacteria.
  • FIG. 7A is made into a pie chart. It is a graph which shows the abundance ratio of the CD8 positive T cell which produces each cytokine. It is the graph which put together the result of intracellular cytokine analysis. It is the graph which put together the result of intracellular cytokine analysis. It is the graph which put together the result of intracellular cytokine analysis. It is the graph which put together the result of intracellular cytokine analysis.
  • the present invention provides a CD8 T cell activation vaccine comprising BCG bacteria expressing a protein derived from a pathogenic microorganism as an active ingredient.
  • pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8-positive T cells can be activated (induced).
  • Activation of CD8-positive T cells means that a living body that has been administered (immunized) with a vaccine forms CD8-positive T cells that produce specific cytokines when exposed to the above-mentioned proteins derived from pathogenic microorganisms. Therefore, it can be said that the vaccine of this embodiment is a CD8 positive T cell activator.
  • the cytokine include interferon- ⁇ , interleukin-2, TNF- ⁇ , MIP-1 ⁇ , and the like.
  • the vaccine of this embodiment can activate pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8-positive T cells, it can also be applied to pathogenic microorganisms for which it is difficult to obtain an effective vaccine.
  • the pathogenic microorganism may be a pathogenic microorganism for which it is difficult to obtain an effective vaccine, for example, Mycobacterium tuberculosis, Ebola hemorrhagic fever virus, which is a causative virus of Ebola, Crimea Congo virus that causes Crimea-Congo fever, South American hemorrhagic fever virus, Funin virus, Sabia virus, Ganarito virus, Machupo virus, etc.
  • Examples include Marburg virus, malaria parasite that is a causative microorganism of malaria, and related microorganisms of the above-mentioned pathogenic microorganisms such as attenuated strains.
  • proteins derived from pathogenic microorganisms to be expressed by BCG bacteria include proteins with high expression levels when the above-mentioned pathogenic microorganisms are infected. More specifically, Ag85B protein of Mycobacterium tuberculosis, Ag85B protein of Mycobacterium kansasii which is the same acid-fast bacterium as Mycobacterium tuberculosis, envelope glycoprotein of Ebola hemorrhagic fever virus, gp140 protein of HIV virus, malaria antigen protein of Plasmodium etc. Is mentioned.
  • vaccines against a wide variety of pathogenic microorganisms can be easily provided by changing the protein derived from pathogenic microorganisms expressed in BCG bacteria.
  • BCG bacteria expressing Mycobacterium kansasii Ag85B protein can be used as a tuberculosis vaccine capable of activating CD8 T cells.
  • BCG bacteria are used as a host for expressing a protein derived from a pathogenic microorganism. Since BCG bacteria have been inoculated as a vaccine for many years in humans and safety has been established, a safe vaccine can be easily provided by the vaccine of this embodiment.
  • a pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8-positive T cell can be activated by using a BCG bacterium expressing a protein derived from the pathogenic microorganism.
  • a BCG bacterium expressing a protein derived from the pathogenic microorganism.
  • the inventors of the present invention are able to activate CD8 positive T cells using BCG bacteria expressing proteins derived from pathogenic microorganisms. It is presumed that it is important that the protein is phagocytosed by phagocytic cells such as macrophages in the body, and the pathogenic microorganism-derived protein is subjected to appropriate processing in the cells and presented with the antigen.
  • the vaccine of this embodiment can induce CD8-positive T cells having the ability of one cell to produce a plurality of types of cytokines, that is, multifunctional. Since multi-functional T cells are excellent in infection protective ability, the vaccine of this embodiment can impart high infection protective ability.
  • Expression of a protein derived from a pathogenic microorganism using BCG bacteria as a host is preferably performed by introducing an expression vector of a gene encoding a protein derived from the pathogenic microorganism into BCG bacteria.
  • expression of a protein derived from a pathogenic microorganism can be easily performed using BCG bacteria as a host.
  • the expression level of the protein derived from a pathogenic microorganism can be increased by selecting an appropriate promoter or combining an enhancer.
  • the expression vector is not introduced into the genome of BCG bacteria but is maintained in the form of a plasmid in BCG bacteria.
  • the quality of the BCG bacterium expressing the protein derived from the pathogenic microorganism is stabilized, so that the quality control of the vaccine of this embodiment is facilitated.
  • promoters for expressing proteins in BCG bacteria include pAL5000 derived from Mycobacterium fortuitum.
  • the expression vector is more preferably an expression vector that can be expressed in both BCG bacteria and mammalian cells.
  • BCG bacteria administered in vivo are engulfed and destroyed by phagocytic cells such as macrophages. Therefore, if the expression vector released by the destruction of BCG bacteria can be expressed in both BCG bacteria and mammalian cells, the expression of the protein derived from the pathogenic microorganism is continued in cells such as macrophages. . As a result, more pathogenic microorganism-derived proteins are supplied into the living body, and immunity can be established more effectively.
  • the vaccine of this embodiment is preferably administered intradermally.
  • the dose may be appropriately adjusted depending on the administration subject. For example, in the case of a mouse, it may be about 2 ⁇ 10 6 colony forming units (CFU) per head.
  • CFU colony forming units
  • the present invention comprises a combination of the above vaccine and a DNA vaccine comprising as an active ingredient a protein expression vector expressed in BCG bacteria that is the active ingredient of the vaccine, and the first immunization is performed with the vaccine.
  • a prime boost vaccine characterized by being used for boosting with the above DNA vaccine is provided.
  • Primed boost vaccine means a combination of vaccines in which one or more booster immunizations are performed with a vaccine different from the vaccine used for the first immunization, or such a vaccine administration method.
  • a DNA vaccine is a vaccine that is translated into protein when administered in vivo, and that protein contributes to the establishment of immunity.
  • the prime boost vaccine of this embodiment is a first immunization with a recombinant BCG bacterium expressing an Ag85B protein, and a booster immunization with a DNA vaccine containing an expression vector of the Ag85B protein as an active ingredient.
  • Recombinant BCG bacteria are preferably administered intradermally.
  • the dose may be appropriately adjusted depending on the administration subject. For example, in the case of a mouse, about 2 ⁇ 10 6 CFU per head can be mentioned.
  • the DNA vaccine is injected intramuscularly.
  • the dose may be appropriately adjusted depending on the administration subject. For example, in the case of a mouse, about 100 ⁇ g per head can be mentioned.
  • the vaccine administration schedule may be appropriately adjusted.
  • the first booster with the DNA vaccine is performed 3 weeks after the initial immunization with the recombinant BCG bacteria, and the second booster with the DNA vaccine is performed 3 weeks later.
  • a schedule for performing the third booster with the DNA vaccine after 2 weeks, and the like can be mentioned.
  • the present invention provides a BCG bacterium expressing a protein derived from a pathogenic microorganism for activation of antigen-specific CD8 T cells derived from the pathogenic microorganism.
  • the present invention provides the use of a BCG bacterium expressing a protein derived from a pathogenic microorganism for producing a vaccine for activating an antigen-specific CD8 T cell derived from the pathogenic microorganism.
  • the present invention relates to a method for activating pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8 T cells, comprising administering an effective amount of a BCG bacterium expressing a protein derived from a pathogenic microorganism to a patient in need thereof.
  • a method for activating pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8 T cells comprising administering an effective amount of a BCG bacterium expressing a protein derived from a pathogenic microorganism to a patient in need thereof.
  • the present invention comprises a step of administering a vaccine containing BCG bacteria expressing a protein derived from a pathogenic microorganism as an active ingredient for initial immunization, and a DNA vaccine containing an expression vector for the protein as an active ingredient. And a method for activating the antigen-specific CD8 T cells derived from pathogenic microorganisms.
  • Example 1 Guinea pigs are immunized with BCG bacteria and examined whether purified tuberculosis (hereinafter sometimes referred to as “PPD”)-specific CD4-positive T cells and PPD-specific CD8-positive T cells are induced. did.
  • PPD purified tuberculosis
  • Guinea pigs Guinea pigs (Japan SLC Co., Ltd.) were intradermally administered 2 ⁇ 10 6 CFU / unit of BCG bacteria. Blood was collected and examined 12 weeks after immunization.
  • ELISPOT Detection of interferon- ⁇ producing cells by ELISPOT method
  • the collected blood was centrifuged by density gradient centrifugation using a blood cell separation solution (trade name “Rinhosepar”, Takara Bio Inc.), and peripheral blood mononuclear cells were collected. Subsequently, the ratio of interferon- ⁇ producing cells in the collected peripheral blood mononuclear cells was measured by a cell-based enzyme immunospot measurement method (ELISPOT).
  • the collected peripheral blood mononuclear cells were divided into four groups.
  • the first group total mononuclear cell group
  • the second group CD4 positive T cell removal group
  • CD4 positive T cells were removed and used for the next operation.
  • CD8 positive T cell removal group CD8 positive T cells were removed and used for the next operation.
  • CD4 positive T cells and CD8 positive T cell removal group CD4 positive T cells and CD8 positive T cells were removed and used for the next operation. Removal of CD4-positive T cells or removal of CD8-positive T cells was performed using a cell sorter.
  • PPD phosphate buffer
  • ConA concanavalin A
  • the medium and the cells of each group were added to a 96-well microtiter plate on the bottom of the PVDF membrane bound with anti-interferon- ⁇ antibody, and incubated for 5 hours.
  • the cell secretes interferon- ⁇
  • the secreted interferon- ⁇ binds to the anti-interferon- ⁇ antibody present in the vicinity of the cell.
  • the cells were washed away, and interferon- ⁇ bound on the membrane was detected by immunostaining.
  • spots indicating the presence of interferon- ⁇ were formed in the portion on the membrane where the interferon- ⁇ producing cells were present.
  • One spot corresponds to one interferon- ⁇ producing cell. Therefore, by measuring the number of spots, the abundance of interferon- ⁇ producing cells can be measured.
  • FIG. 1A is a graph showing the proportion of interferon- ⁇ producing cells in all mononuclear cell groups.
  • FIG. 1B is a graph showing the proportion of interferon- ⁇ producing cells in the CD4 positive T cell removal group and the CD8 positive T cell removal group.
  • FIG. 1C is a graph showing the proportion of interferon- ⁇ producing cells in the CD4 positive T cell and CD8 positive T cell removal group.
  • FIG. 1A it was shown that cells producing interferon- ⁇ were induced in all mononuclear cell groups when stimulated with PPD.
  • FIG. 1B it was shown that when CD4 positive T cells were removed, the number of cells that produced interferon- ⁇ was greatly reduced by PPD stimulation.
  • FIG. 1C it was shown that when CD4 positive T cells and CD8 positive T cells were removed, cells that produce interferon- ⁇ were significantly reduced by PPD stimulation.
  • PPD-specific interferon- ⁇ -producing cells induced as a result of immunization with BCG bacteria are mainly CD4-positive T cells, and PPD-specific interferon- ⁇ -producing CD8-positive T cells are less induced. It became clear that there was no.
  • P3HA85B vector an expression vector capable of expressing Ag85B protein in both BCG bacteria and mammalian cells.
  • p3HA85B has a pAL5000 promoter that is operable in BCG bacteria upstream of the gene encoding the Mycobacterium kansasii Ag85B protein (SEQ ID NO: 1), and operates in mammalian cells upstream of the pAL5000 promoter. It has the possible cytomegalovirus (CMV) promoter and HTLV-1 promoter. Furthermore, a polyA signal gene was incorporated downstream of the gene encoding the Ag85B protein.
  • FIG. 2A shows the structure of the p3HA85B vector.
  • PDNA85B vector an expression vector capable of expressing the Ag85B protein in mammalian cells.
  • pDNA85B has a cytomegalovirus (CMV) promoter operable in mammalian cells upstream of the gene encoding the Ag85B protein (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 2B shows the structure of the pDNA85B vector.
  • CMV cytomegalovirus
  • the expression vector p3HA85B was introduced into BCG bacteria by electroporation. Subsequently, using the kanamycin resistance as an index, a BCG bacterium into which p3HA85B was introduced was selected and cloned to prepare a BCG bacterium in which the Ag85B protein was expressed.
  • the electrophoresed protein was transferred to a PVDF membrane (life technologies) and immunostained with an anti-Ag85B antibody.
  • Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-rabbit IgG antibody (Cell Signaling Technology) was used as the secondary antibody.
  • An Amersham ECL Western Blotting Analysis System (GE Healthcare) was used for signal detection.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Western blotting. Lane 1 shows the results of the control BCG bacteria, and Lane 2 shows the results of the BCG bacteria expressing the Ag85B protein.
  • the anti-Ag85B antibody used here binds to both the Ag85B protein of BCG bacteria and the Ag85B protein of Mycobacterium kansasii.
  • P3HA85B was introduced into 293T cells, which are human embryonic kidney epithelial cells, using a gene transfer reagent (trade name “Lipofectamine 2000”, Life Technologies) and expressed.
  • FIG. 4A is a photograph showing the results of Western blotting of BCG bacteria as a positive control.
  • Lane 1 is the result of BCG bacteria as a positive control.
  • Lane 2 is the result of subjecting recombinant Ag85B protein to Western blotting.
  • Lane 3 is the result of subjecting recombinant MPB59 protein, which is widely known to cross-react, to Western blotting.
  • FIG. 4B is a photograph showing the results of Western blotting of 293T cells.
  • Lane 3 shows the results of 293T cells introduced with the expression vector p3HA85B.
  • Lane 4 is the result of 293T cells into which only the empty vector p3H8.3 was introduced as a negative control.
  • Lane 5 is the result of subjecting only PBS to negative blotting as a negative control.
  • Lanes 1 and 2 are the results of 293T cells into which pDNA85B prepared in Experimental Example 2 was introduced.
  • the Ag85B protein can be expressed in both BCG bacteria and mammalian cells by introducing the p3HA85B vector. It was also confirmed that the Ag85B protein can be expressed in mammalian cells with the pDNA85B vector.
  • mice (Oriental Yeast Co.) were intradermally administered 2 ⁇ 10 6 CFU / unit of BCG bacteria. Three weeks after immunization, dissection was performed for examination.
  • Spleen cells were isolated from the above immunized mice and antigen-stimulated for 6 hours in RPMI-1640 medium supplemented with fetal bovine serum 10 v / v%, 2-mercaptoethanol, DNase 1 U / mL, penicillin and streptomycin.
  • antigen 10 ⁇ g / mL PPD was used.
  • the cells were collected, and the cell surface was stained with an APC-labeled anti-CD3 antibody (BD biosciences), a PE-cy7-labeled anti-CD4 antibody (BioLegend), and a PerCP cy5.5-labeled anti-CD8 antibody (BD biosciences).
  • APC-labeled anti-CD3 antibody BD biosciences
  • PE-cy7-labeled anti-CD4 antibody BioLegend
  • a PerCP cy5.5-labeled anti-CD8 antibody BD biosciences.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of flow cytometry.
  • FIG. 6 is a graph showing the proportion of CD4 positive T cells that produce each cytokine.
  • Cells stimulated with phosphate buffer (PBS) instead of PPD were used as negative controls.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 7A is a graph showing the results of further detailed analysis of CD4-positive T cells producing each cytokine.
  • L represents interleukin-2
  • G represents interferon- ⁇
  • M represents MIP-1 ⁇
  • T represents TNF- ⁇ .
  • “+” represents positive and “ ⁇ ” represents negative.
  • FIG. 7B is a pie chart of the result of FIG. 7A.
  • FIG. 8 is a graph showing the abundance ratio of CD8 positive T cells producing each cytokine.
  • Cells stimulated with phosphate buffer (PBS) instead of PPD were used as negative controls. As a result, it was shown that CD8 positive T cells were hardly induced by immunization with BCG bacteria.
  • PBS phosphate buffer
  • CD4-positive T cells are induced by immunization with BCG bacteria, but CD8-positive T cells are hardly induced. Moreover, it was confirmed that the induced CD4-positive T cells are multifunctional.
  • mice were immunized with BCG bacteria or BCG bacteria into which the expression vector p3HA85B was introduced to examine whether multifunctional CD8-positive T cells were induced.
  • BALB / c mice (Oriental Yeast Co., Ltd.) were intradermally administered with 2 ⁇ 10 6 CFU / unit of BCG or BCG introduced with the expression vector p3HA85B. Three weeks after immunization, dissection was performed for examination.
  • Spleen cells were isolated from the above immunized mice and antigen-stimulated for 24 hours in RPMI-1640 medium supplemented with fetal bovine serum 10 v / v%, 2-mercaptoethanol, DNase 1 U / mL, penicillin and streptomycin.
  • As the antigen 10 ⁇ g / mL PPD was used.
  • As a negative control cells without antigen stimulation were used.
  • FIG. 9 is a graph summarizing the analysis results.
  • “recombinant BCG” means a group immunized with BCG bacteria introduced with the expression vector p3HA85B.
  • antigen stimulation was not performed, the presence of multifunctional CD4-positive T cells and multifunctional CD8-positive T cells was not observed.
  • the presence of multifunctional CD8-positive T cells was not observed in the group immunized with BCG bacteria, whereas from the group immunized with BCG bacteria into which the expression vector p3HA85B was introduced. The presence of multifunctional CD8 positive T cells was observed.
  • mice were immunized with prime boost vaccine in which primary immunization was performed with BCG bacteria into which the expression vector p3HA85B was introduced, and booster immunization was performed with the pDNA85B vector (DNA vaccine), and induction of multifunctional CD8 positive T cells was examined.
  • mice immunized with the pDNA85B vector alone were used.
  • BALB / c mice (Oriental Yeast Co., Ltd.) and C57BL / 6J mice (Oriental Yeast Co., Ltd.) were intradermally administered with 2 ⁇ 10 6 CFU of BCG bacteria into which the expression vector p3HA85B was introduced.
  • the first immunization was performed. Subsequently, after 3 weeks, 100 ⁇ g of pDNA85B vector was injected intramuscularly for 1st booster, and after 3 weeks, 100 ⁇ g of pDNA85B vector was injected intramuscularly for 2nd booster, Two weeks later, 100 ⁇ g of the pDNA85B vector was injected intramuscularly, and a third booster was performed. Three weeks after the third booster immunization, dissection was performed for examination.
  • a mouse immunized only with the pDNA85B vector was used. Specifically, initial immunization was performed by intramuscular injection of 100 ⁇ g of pDNA85B vector per head. Subsequently, after 3 weeks, 100 ⁇ g of pDNA85B vector was injected intramuscularly for 1st booster, and after 3 weeks, 100 ⁇ g of pDNA85B vector was injected intramuscularly for 2nd booster, Two weeks later, 100 ⁇ g of the pDNA85B vector was injected intramuscularly, and a third booster was performed. Three weeks after the third booster immunization, dissection was performed for examination.
  • FIG. 10A is a graph summarizing the analysis results of C57BL / 6J mice.
  • FIG. 10B is a graph summarizing the analysis results of BALB / c mice.
  • “recombinant BCG-DNA” means a group (prime boost immunized group) that was first immunized with BCG bacteria introduced with the expression vector p3HA85B and boosted with the pDNA85B vector.
  • “DNA” means a group immunized only with the pDNA85B vector.
  • mice when antigen stimulation was performed on spleen cells of C57BL / 6J mice, the number of multifunctional CD4-positive T cells was higher in mice boosted with prime boost than mice immunized with pDNA85B vector alone. (Pool 2, 5, 6 etc.).
  • mice with prime boost immunization had a higher proportion of multifunctional CD8-positive T cells than mice immunized with the pDNA85B vector alone. (Pool 2 etc.).
  • a vaccine capable of activating pathogenic microorganism-derived antigen-specific CD8-positive T cells can be provided.

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Abstract

　病原微生物由来のタンパク質を発現させたカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ菌）を有効成分とするＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチンは、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるため有用である。

Description

ワクチン及びプライムブーストワクチン
　本発明は、ワクチン及びプライムブーストワクチンに関する。本願は、２０１４年１１月１７日に、日本に出願された特願２０１４－２３２８３７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　結核をはじめとして、エボラ出血熱、クリミア・コンゴ熱、南米出血熱、マールブルグ病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マラリア等の様々な重症感染症が知られている。
　これらの重症感染症には、有効なワクチンが存在しないものも多い。また、結核ワクチンとして広く用いられている、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチンについても、乳幼児結核と結核性髄膜炎の予防効果は認められているものの、成人の肺結核予防に関しては否定的な見解が存在する（例えば、非特許文献１を参照）。
　したがって、感染症に対するより効果的なワクチンが求められている。
Andersen P., Tuberculosis vaccines - an update., Nat. Rev. Microbiol., 5(7), 484-7, 2007.
　例えば結核菌のような細胞内寄生菌に対する感染防御には、細胞性免疫が重要である。これに対し、発明者らは、ＢＣＧワクチンによる免疫によって活性化される抗原特異的Ｔ細胞は、主にＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）であり、細胞性免疫に重要なＣＤ８陽性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）はほとんど活性化されないことを見出した。
　そこで、本発明は、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるワクチンを提供することを目的とする。
　本発明は以下の通りである。
（１）病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を有効成分とするＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチン。
（２）前記ＢＣＧ菌が、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入したＢＣＧ菌である、（１）に記載のワクチン。
（３）前記発現ベクターが、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能な発現ベクターである、（２）に記載のワクチン。
（４）結核ワクチンである、（１）～（３）のいずれかに記載のワクチン。
（５）前記タンパク質が、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉ）のＡｇ８５Ｂタンパク質である、（１）～（４）のいずれかに記載のワクチン。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載のワクチンと、前記タンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンとの組み合わせからなり、（１）～（５）のいずれかに記載のワクチンで初回免疫を行い、前記ＤＮＡワクチンで追加免疫を行うように用いられることを特徴とする、プライムブーストワクチン。
　本発明によれば、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるワクチンを提供することができる。
全単核細胞群における、インターフェロン－γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。 ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群における、インターフェロン－γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。 ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群における、インターフェロン－γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。 ｐ３ＨＡ８５Ｂベクターの構造を示す図である。 ｐＤＮＡ８５Ｂベクターの構造を示す図である。 Ａｇ８５Ｂタンパク質の発現を検討したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 ＢＣＧ菌のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 ２９３Ｔ細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。 各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞を更に詳細に解析した結果を示すグラフである。 図７Ａの結果を円グラフにしたものである。 各サイトカインを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。 細胞内サイトカイン解析の結果をまとめたグラフである。 細胞内サイトカイン解析の結果をまとめたグラフである。 細胞内サイトカイン解析の結果をまとめたグラフである。
　１実施形態において、本発明は、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を有効成分とするＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチンを提供する。
　後述するように、本実施形態のワクチンによれば、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する（誘導する）ことができる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化とは、ワクチンを投与した（免疫した）生体に、上記の病原微生物由来のタンパク質に暴露すると特定のサイトカインを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞を形成させることを意味する。したがって、本実施形態のワクチンは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤であるともいえる。上記サイトカインとしては、例えば、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１α等が挙げられる。
（病原微生物）
　本実施形態のワクチンが対象とする病原微生物には特に制限はない。本実施形態のワクチンは、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるため、効果的なワクチンを得ることが困難とされる病原微生物にも適用することができる。
　したがって、病原微生物は、効果的なワクチンを得ることが困難とされる病原微生物であってもよく、例えば、結核の原因菌である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エボラ出血熱の原因ウイルスであるエボラ出血熱ウイルス、クリミア・コンゴ熱の原因ウイルスであるクリミア・コンゴウイルス、南米出血熱の原因ウイルスであるフニンウイルス、サビアウイルス、ガナリトウイルス、マチュポウイルス等のアレナウイルス科のウイルス、マールブルグ病の原因ウイルスであるマールブルグウイルス、マラリアの原因微生物であるマラリア原虫、及び、例えば弱毒株等の、上記の病原微生物の類縁微生物等が挙げられる。
　本実施形態のワクチンにおいて、ＢＣＧ菌に発現させる病原微生物由来のタンパク質としては、例えば、上記の病原微生物が感染した場合に発現量の高いタンパク質が挙げられる。より具体的には、結核菌のＡｇ８５Ｂタンパク質、結核菌と同じ抗酸菌であるマイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質、エボラ出血熱ウイルスのエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶウイルスのｇｐ１４０タンパク質、マラリア原虫のマラリア抗原タンパク質等が挙げられる。
　本実施形態のワクチンによれば、ＢＣＧ菌で発現させる病原微生物由来のタンパク質を変更することにより、多種多様な病原微生物に対するワクチンを容易に提供することができる。例えば、マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌は、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が可能な結核ワクチンとして使用することができる。
　本実施形態のワクチンでは、病原微生物由来のタンパク質を発現させる宿主としてＢＣＧ菌を使用する。ＢＣＧ菌はワクチンとして長年ヒトに接種されてきた実績があり、安全性も確立されているため、本実施形態のワクチンにより、安全なワクチンを簡便に提供することができる。
　また、本実施形態のワクチンでは、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を用いることにより、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができる。これに対し、単に病原微生物由来のタンパク質をワクチンとして投与しても、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を効果的に活性化することは困難である。
　発明者らは、本実施形態のワクチンの投与によりＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができる理由について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化には、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌が生体内でマクロファージ等の食細胞に貪食され、病原微生物由来タンパク質が細胞中で適切なプロセッシングを受けたうえで抗原提示されることが重要であるためではないかと推測している。
　更に、後述するように、本実施形態のワクチンにより、１個の細胞が複数種類のサイトカインを産生する能力、すなわち多機能性を有する、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。多機能性を有するＴ細胞は感染防御能に優れているため、本実施形態のワクチンにより、高い感染防御能を付与することができる。
（発現ベクター）
　ＢＣＧ菌を宿主とした病原微生物由来のタンパク質の発現は、ＢＣＧ菌に、病原微生物由来のタンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入することにより行うことが好ましい。これにより、ＢＣＧ菌を宿主として病原微生物由来のタンパク質の発現を容易に行うことができる。また、適切なプロモーターを選択したり、エンハンサーを組み合わせたりすることにより、病原微生物由来のタンパク質の発現量を増加させることができる。
　また、発現ベクターは、ＢＣＧ菌のゲノムに導入されるのではなく、ＢＣＧ菌内でプラスミドの形態で維持されるものであることが好ましい。これにより、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌の品質が安定するため、本実施形態のワクチンの品質管理が容易になる。
　ＢＣＧ菌でタンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、例えばマイコバクテリウムフォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）由来のｐＡＬ５０００等が挙げられる。
　上記の発現ベクターは、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能な発現ベクターであることが更に好ましい。生体内に投与されたＢＣＧ菌は、マクロファージ等の食細胞に貪食され破壊される。そこで、ＢＣＧ菌の破壊により放出された発現ベクターが、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能なものであると、マクロファージ等の細胞内においても病原微生物由来のタンパク質の発現が継続される。この結果、より多くの病原微生物由来のタンパク質が生体内に供給されることとなり、より効果的に免疫を確立することができる。
　本実施形態のワクチンは皮内投与することが好ましい。また、投与量は、投与対象により適宜調整すればよいが、例えばマウスの場合には、１頭あたり２×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）程度でよい。
（プライムブーストワクチン）
　１実施形態において、本発明は、上記ワクチンと、上記ワクチンの有効成分であるＢＣＧ菌に発現させたタンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンとの組み合わせからなり、上記ワクチンで初回免疫を行い、上記ＤＮＡワクチンで追加免疫を行うように用いられることを特徴とする、プライムブーストワクチンを提供する。
　プライムブーストワクチンとは、初回免疫に用いたワクチンとは別のワクチンで１回以上の追加免疫を行うワクチンの組み合わせ、又はこのようなワクチン投与方法を意味する。
　また、ＤＮＡワクチンとは、生体内に投与するとタンパク質に翻訳され、そのタンパク質が免疫の成立に寄与するワクチンである。
　本実施形態のプライムブーストワクチンは、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させた組換えＢＣＧ菌で初回免疫を行い、Ａｇ８５Ｂタンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンで追加免疫を行うものである。
　組換えＢＣＧ菌は皮内投与することが好ましい。また、投与量は、投与対象により適宜調整すればよいが、例えばマウスの場合には、１頭あたり２×１０６ＣＦＵ程度が挙げられる。
　また、ＤＮＡワクチンは筋肉注射することが好ましい。また、投与量は、投与対象により適宜調整すればよいが、例えばマウスの場合には、１頭あたり１００μｇ程度が挙げられる。
　ワクチン投与のスケジュールも適宜調整すればよいが、例えば、組換えＢＣＧ菌による初回免疫から３週間後にＤＮＡワクチンによる１回目の追加免疫を行い、更に３週間後にＤＮＡワクチンによる２回目の追加免疫を行い、更に２週間後にＤＮＡワクチンによる３回目の追加免疫を行うスケジュール等が挙げられる。
（その他の実施形態）
　１実施形態において、本発明は、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の活性化のための、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を提供する。
　１実施形態において、本発明は、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチンを製造するための、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌の使用を提供する。
　１実施形態において、本発明は、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の活性化方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を有効成分とするワクチンを投与して初回免疫を行う工程と、上記タンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンを投与して追加免疫を行う工程と、を備える、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の活性化方法を提供する。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
　モルモットをＢＣＧ菌で免疫し、精製ツベルクリン（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ、以下「ＰＰＤ」という場合がある。）特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＰＰＤ特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されるか否かを検討した。
（免疫）
　モルモット（日本エスエルシー株式会社）に、２×１０６ＣＦＵ／匹のＢＣＧ菌を皮内投与した。免疫から１２週間後に採血して検討を行った。
（ＥＬＩＳＰＯＴ法によるインターフェロン－γ産生細胞の検出）
　採血した血液を、血球分離溶液（商品名「リンホセパール」、タカラバイオ株式会社）を用いた密度勾配遠心により遠心し、末梢血単核細胞を回収した。続いて、細胞ベースの酵素免疫スポット測定法（ＥＬＩＳＰＯＴ）により、回収した末梢血単核細胞中のインターフェロン－γ産生細胞の割合を測定した。
　具体的には、まず、回収した末梢血単核細胞を4つの群に分けた。第１の群（全単核細胞群）はそのまま次の操作に用いた。第２の群（ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群）からは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を除去して次の操作に用いた。第３の群（ＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群）からは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去して次の操作に用いた。第4の群（ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群）からは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去して次の操作に用いた。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の除去又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の除去は、セルソーターを用いて行った。
　続いて、各群の細胞の培地にＰＰＤ　１μｇ／ｍＬを添加して刺激し、２０時間後に次の操作に用いた。陰性対照として、ＰＰＤの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加した群も準備した。また、陽性対照として、ＰＰＤの代わりにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）１μｇ／ｍＬを添加した群も準備した。
　続いて、抗インターフェロン－γ抗体を結合させたＰＶＤＦ膜底の９６ウェルマイクロタイタープレートに培地及び上記の各群の細胞を添加し、５時間インキュベートした。この結果、細胞がインターフェロン－γを分泌すると、分泌されたインターフェロン－γが細胞近傍に存在する抗インターフェロン－γ抗体と結合する。その後、細胞を洗い流し、メンブレン上に結合したインターフェロン－γを免疫染色により検出した。その結果、インターフェロン－γ産生細胞が存在していたメンブレン上の部分には、インターフェロン－γの存在を示すスポットが形成された。１つのスポットが１個のインターフェロン－γ産生細胞に対応する。そこで、スポットの数を測定することにより、インターフェロン－γ産生細胞の存在割合を測定することができる。
　図１Ａは、全単核細胞群のインターフェロン－γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。図１Ｂは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群のインターフェロン－γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。図１Ｃは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群のインターフェロン－γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。
　図１Ａに示すように、全単核細胞群では、ＰＰＤで刺激するとインターフェロン－γを産生する細胞が誘導されたことが示された。また、図１Ｂに示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を除去すると、ＰＰＤ刺激によりインターフェロン－γを産生する細胞が大幅に減少することが示された。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去しても、ＰＰＤ刺激によりインターフェロン－γを産生する細胞の数はほとんど変わらなかった。また、図１Ｃに示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去すると、ＰＰＤ刺激によりインターフェロン－γを産生する細胞が大幅に減少することが示された。
　以上の結果から、ＢＣＧ菌による免疫の結果誘導されるＰＰＤ特異的なインターフェロン－γ産生細胞は主にＣＤ４陽性Ｔ細胞であり、ＰＰＤ特異的なインターフェロン－γ産生ＣＤ８陽性Ｔ細胞はあまり誘導されていないことが明らかとなった。
［実験例２］
　マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質の発現ベクターを作製した。
（ｐ３ＨＡ８５Ｂベクター）
　ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現することが可能な発現ベクターであるｐ３ＨＡ８５Ｂを作製した。ｐ３ＨＡ８５Ｂは、マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）の上流に、ＢＣＧ菌で作動可能であるｐＡＬ５０００プロモーターを有しており、ｐＡＬ５０００プロモーターの上流に、哺乳動物細胞で作動可能であるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとＨＴＬＶ－１プロモーターを有している。さらに、Ａｇ８５Ｂタンパク質をコードする遺伝子の下流にｐｏｌｙＡシグナル遺伝子を組み込んだ。図２Ａにｐ３ＨＡ８５Ｂベクターの構造を示す。
（ｐＤＮＡ８５Ｂベクター）
　哺乳動物細胞でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現することが可能な発現ベクターである、ｐＤＮＡ８５Ｂを作製した。ｐＤＮＡ８５Ｂは、Ａｇ８５Ｂタンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）の上流に、哺乳動物細胞で作動可能であるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有している。図２ＢにｐＤＮＡ８５Ｂベクターの構造を示す。
［実験例３］
　発現ベクターｐ３ＨＡ８５ＢをＢＣＧ菌に導入し、マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を作製した。続いて、ウエスタンブロッティングによりＡｇ８５Ｂタンパク質の発現を確認した。
（ｐ３ＨＡ８５ＢのＢＣＧ菌への導入）
　エレクトロポレーション法により、発現ベクターｐ３ＨＡ８５ＢをＢＣＧ菌に導入した。続いて、カナマイシン耐性を指標として、ｐ３ＨＡ８５Ｂが導入されたＢＣＧ菌を選択し、クローニングして、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を作製した。
（ウエスタンブロッティング）
　Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌及び対照である通常のＢＣＧ菌をそれぞれＣｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて溶解した。
　続いて、ＲＣ　ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）を用いてタンパク量を定量し、同量のタンパクを４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　ｇｅｌ（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて電気泳動した。
　続いて、電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に転写し、抗Ａｇ８５Ｂ抗体で免疫染色した。二次抗体にはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。シグナルの検出にはＡｍｅｒｓｈａｍ　ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。
　図３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１は対照のＢＣＧ菌の結果であり、レーン２は、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌の結果である。なお、ここで使用した抗Ａｇ８５Ｂ抗体は、ＢＣＧ菌のＡｇ８５Ｂタンパク質及びマイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質の双方に結合するものである。
　その結果、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂの導入により、ＢＣＧ菌によるＡｇ８５Ｂタンパク質の発現が５０～１００倍増強したことが確認された。
［実験例４］
　発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂにより、哺乳動物細胞でＡｇ８５Ｂタンパク質の発現が可能か否かを検討した。
　ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３Ｔ細胞に、遺伝子導入試薬（商品名「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ　２０００」、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｐ３ＨＡ８５Ｂを導入して発現させた。
　続いて、実験例３と同様にしてウエスタンブロッティングによりＡｇ８５Ｂタンパク質の発現を確認した。陽性対照として、実験例３でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌のウエスタンブロッティングも行った。
　図４Ａは、陽性対照であるＢＣＧ菌のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１は陽性対照であるＢＣＧ菌の結果である。また、レーン２は、リコンビナントＡｇ８５Ｂタンパク質をウエスタンブロッティングに供した結果である。また、レーン３は、広く交差反応することが知られているリコンビナントＭＰＢ５９タンパク質をウエスタンブロッティングに供した結果である。
　図４Ｂは、２９３Ｔ細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン３は、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入した２９３Ｔ細胞の結果である。レーン４は、陰性対照として空のベクターｐ３Ｈ８．３のみを導入した２９３Ｔ細胞の結果である。レーン５は、陰性対照としてＰＢＳのみをウエスタンブロッティングに供した結果である。また、レーン１及びレーン２は、実験例２で作製したｐＤＮＡ８５Ｂを導入した２９３Ｔ細胞の結果である。
　その結果、ｐ３ＨＡ８５Ｂベクターの導入により、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方において、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させることが可能であることが確認された。また、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターによって、哺乳動物細胞でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させることが可能であることが確認された。
［実験例５］
　マウスをＢＣＧ菌で免疫し、抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されるか否かを検討した。
（免疫）
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オリエンタル酵母社）に、２×１０６ＣＦＵ／匹のＢＣＧ菌を皮内投与した。免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
（細胞内サイトカイン解析）
　上記の免疫マウスから脾臓細胞を分離し、ウシ胎児血清１０ｖ／ｖ％、２－メルカプトエタノール、ＤＮａｓｅ　１Ｕ／ｍＬ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で６時間抗原刺激した。抗原としては、１０μｇ／ｍＬのＰＰＤを使用した。
　続いて細胞を回収し、ＡＰＣ標識抗ＣＤ３抗体（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥ－ｃｙ７標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰｅｒＣＰ　ｃｙ５．５標識抗ＣＤ８抗体（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞表面を染色した。更に、ＢＤ　Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を処理し、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識抗ＴＮＦ－α抗体（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥ標識抗インターフェロン－γ抗体（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗インターロイキン－２抗体（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖ５００標識抗ＭＩＰ－１α抗体（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞内サイトカインを染色した。染色した細胞はＦＡＣＳｖｅｒｓｅソフトウエア（ＢＤ　ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）及びＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）を用いて解析した。図５は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
　図６は、各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。ＰＰＤの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で刺激した細胞を陰性対照として使用した。その結果、ＢＣＧ菌による免疫によって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が誘導されたことが示された。
　図７Ａは、各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞を更に詳細に解析した結果を示すグラフである。図中、Ｌはインターロイキン－２を表し、Ｇはインターフェロン－γを表し、ＭはＭＩＰ－１αを表し、ＴはＴＮＦ－αを表す。また、「＋」は陽性であることを表し、「－」は陰性であることを表す。その結果、１個のＣＤ４陽性Ｔ細胞が、１～４種類のサイトカインを産生していることが明らかとなった。すなわち、ＢＣＧ菌による免疫によって多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞が誘導されたことが示された。また、図７Ｂは、図７Ａの結果を円グラフにしたものである。
　図８は、各サイトカインを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。ＰＰＤの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で刺激した細胞を陰性対照として使用した。その結果、ＢＣＧ菌による免疫によって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はほとんど誘導されないことが示された。
　以上の結果から、ＢＣＧ菌による免疫によって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が誘導されるものの、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はほとんど誘導されないことが明らかとなった。また、誘導されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は多機能性であることが確認された。
［実験例６］
　マウスをＢＣＧ菌、又は発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫し、多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されるか否かを検討した。
（免疫）
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエンタル酵母社）に、２×１０６ＣＦＵ／匹のＢＣＧ菌、又は発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌を皮内投与した。免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
（細胞内サイトカイン解析）
　上記の免疫マウスから脾臓細胞を分離し、ウシ胎児血清１０ｖ／ｖ％、２－メルカプトエタノール、ＤＮａｓｅ　１Ｕ／ｍＬ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で２４時間抗原刺激した。抗原としては、１０μｇ／ｍＬのＰＰＤを使用した。陰性対照として、抗原刺激を行わない細胞を使用した。
　続いて細胞を回収し、実験例５と同様にしてフローサイトメトリーにより細胞内サイトカイン解析を行った。
　図９は、解析結果をまとめたグラフである。図中、「組換えＢＣＧ」は、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫した群を意味する。その結果、抗原刺激を行わない場合には、多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞及び多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在は認められなかった。また、抗原刺激を行った結果、ＢＣＧ菌で免疫した群からは多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在が認められなかったのに対し、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫した群からは多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在が認められた。
　また、抗原刺激を行った結果、ＢＣＧ菌で免疫した群、及び発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫した群のいずれにおいても多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在が認められた。
　以上の結果から、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌を用いた免疫により、多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができることが明らかとなった。
［実験例７］
　発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で初回免疫を行い、ｐＤＮＡ８５Ｂベクター（ＤＮＡワクチン）で追加免疫を行うプライムブーストワクチンによりマウスを免疫し、多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を検討した。対照としては、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスを用いた。
　具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエンタル酵母社）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オリエンタル酵母社）に、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌を、それぞれ１頭あたり２×１０６ＣＦＵずつ皮内投与して初回免疫を行った。続いて、３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して１回目の追加免疫を行い、更に３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して２回目の追加免疫を行い、更に２週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して３回目の追加免疫を行った。３回目の追加免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
　対象として、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスを用いた。具体的には、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して初回免疫を行った。続いて、３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して１回目の追加免疫を行い、更に３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して２回目の追加免疫を行い、更に２週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して３回目の追加免疫を行った。３回目の追加免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
（細胞内サイトカイン解析）
　上記の免疫マウスから脾臓細胞を分離し、ウシ胎児血清１０ｖ／ｖ％、２－メルカプトエタノール、ＤＮａｓｅ　１Ｕ／ｍＬ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で２４時間抗原刺激した。抗原としては、下記表１に示す、Ａｇ８５Ｂタンパク質のプールペプチド（プール１～プール６）をそれぞれ使用した。抗原刺激にあたり、プールペプチドは２．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、陰性対照として、抗原刺激を行わない細胞を使用した。続いて細胞を回収し、実験例５と同様にしてフローサイトメトリーにより細胞内サイトカイン解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１０Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの解析結果をまとめたグラフである。図１０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの解析結果をまとめたグラフである。図中、「組換えＢＣＧ－ＤＮＡ」は、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で初回免疫し、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターで追加免疫した群（プライムブースト免疫した群）を意味する。また、「ＤＮＡ」は、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫した群を意味する。
　その結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウスのいずれの脾臓細胞においても、抗原刺激を行わない場合には、多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞及び多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在はほとんど認められなかった。
　また、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓細胞において、抗原刺激を行った場合には、プライムブースト免疫したマウスのほうが、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスよりも多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在割合が高かった（プール２、５、６等）。
　また、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞において、抗原刺激を行った場合には、プライムブースト免疫したマウスのほうが、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスよりも多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在割合が高かった（プール２等）。
　本発明によれば、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるワクチンを提供することができる。

Claims (6)

  1. 　病原微生物由来のタンパク質を発現させたカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ菌）を有効成分とするＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチン。
  2. 　前記ＢＣＧ菌が、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入したＢＣＧ菌である、請求項１に記載のワクチン。
  3. 　前記発現ベクターが、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能な発現ベクターである、請求項２に記載のワクチン。
  4. 　結核ワクチンである、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
  5. 　前記タンパク質が、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉ）のＡｇ８５Ｂタンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のワクチンと、
    　前記タンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンとの組み合わせからなり、
    　請求項１～５のいずれか一項に記載のワクチンで初回免疫を行い、前記ＤＮＡワクチンで追加免疫を行うように用いられることを特徴とする、プライムブーストワクチン。
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