WO2016076686A1 - Composition pharmacologique de l'origan (huile essentielle) à effet antibactérien sur aggregatibacter actinomycetemcomitans clone jp2 - Google Patents

Composition pharmacologique de l'origan (huile essentielle) à effet antibactérien sur aggregatibacter actinomycetemcomitans clone jp2 Download PDF

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essential oil
sabinene
oregano
clone
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Leila LAKHDAR
Keltoum ENNIBI OUM
Abdellah FARAH
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Université Mohammed V De Rabat
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    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
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Definitions

  • Our invention relates to herbal medicine, in particular the antibacterial effect of Oregano essential oil (Origanum compactum) ofixie origin on a virulent oral bacterial strain; Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2. This original strain has never been the subject of antimicrobial tests based on essential oils.
  • Oregano essential oil Origanum compactum
  • This new application encompasses both the methodology and the results obtained.
  • the technique used is a simple, clear, evidence-based method with improved accuracy and reproducibility of results.
  • Aggregatibacter actinomycetemcomitans [Aa] clone JP2 is an optional facultative anaerobic gram-negative oral bacterium, known to be virulent, implicated as the main etiological agent in aggressive periodontitis, a real public health problem in Morocco. These are destructive periodontal diseases resulting in severe bone loss and leading to loss of teeth in youngsammlung adolescents (Haubek et al., 2001, Haubek et al., 2008, Ennibi et al., 2012). In recent decades, due to the increasing incidence of these periodontitis, increased resistance of oral bacteria to antibiotics and side effects related to antibacterial agents frequently used in dentistry, the search for a new alternative therapeutic agent safe for the health is necessary. Thus, essential oils, used in traditional medicine, can be considered as a good therapeutic alternative. This is especially true as Morocco is one of the leading producers of essential oils.
  • the MIC is generally determined visually which also lacks precision.
  • the microdilution dilution technique remains the most sensitive, the most accurate and the most reproducible for calculating the MIC (Budzynska et al., 2009).
  • TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride
  • INT Piodonitrotetrazolium Violet
  • Oregano essential oil This is Origanum compacting from the Lamiaceae family. It was extracted from plants that were grown in Morocco. The authenticated specimens were deposited in the photochemistry laboratory herbarium of the National Institute of Medicinal and Aromatic Plants - University of Sidi Mohamed Ben Abdellah, Fez, Morocco, according to code FA / RP / I MA / 107.
  • a solution of 10% Tween 80 (diluted in distilled water) is autoclaved beforehand. Then, 900 ⁇ of this solution is added to 100 ⁇ of essential oil and then the whole is homogenized: it is the mother solution of the emulsified essential oil.
  • GC gas chromatographic
  • GC gas chromatographic
  • HP-5 capillary column 5% phenyl methyl silicone
  • the characteristic of this column was: 30 m in length, 0.25 mm in diameter and 0.25 mm in film thickness.
  • the temperature is programmed from 50 ° C (5min initial wait) to 200 ° C at 4 ° C / min.
  • Gas chromatographic conditions were as follows: N2 as the carrier gas (1.8 ml / min); shared mode (flow rate: 72.1 ml / min, ratio: 1/50) was used, the injector and detector temperatures were 275 ° C and 250 ° C respectively.
  • the diluted samples (1/20 in hexane) of 1 ml were injected manually.
  • the machine was run by a type of "HP ChemStation" computer system.
  • GC / MS Gas Chromatography / Mass Spectrometry: The chemical composition of the essential oils were analyzed using a gas chromatograph (GC Ultra TRACE) mounted on a mass spectrometer (Polaris Q-lon Trap MS). Operation in electronic impact mode of employment insurance (70 eV). VB-5 (methylpolysiloxane 5% phenyl) and a column (30m x 0.25mm x 0.25 ⁇ m thickness) were used (National Center for Scientific and Technical Research - (CNRST), Rabat, Morocco).
  • the chromatographic conditions are as follows: injector and detector temperatures at 220 and 300 ° C respectively; carrier gas, helium at a flow rate of 1.4 ml / min, ramp program temperature of 40 to 300 ° C with a gradient of 4 ° C / min (maintenance of the initial and final temperature for 4 min).
  • the relative amount of the individual components of the total oil was expressed as percentage of peak area relative to the total peak area.
  • a literature search was conducted using the combination of NIST MS Research and literature. The components of the oils have also been identified by their relative retention indices for n-alkanes (C8-C24)
  • the protocol firstly uses the technique of direct diffusion contact in agar medium (well), which allows to predict the in vitro efficacy of the essential oil. Then, for the calculation of the MIC (Minimum Inhibitory Concentration) of the oil tested effective, the 96-well microdilution method is used. The CMB (Minimal Bactericidal Concentration) is also measured according to the protocol below.
  • This test is carried out by deposition of the essential oil in wells dug in the agar according to a modification of the Dorman and Deans 2000 technique. It ensures a total diffusion of the essential oil from a well by giving a zone clear inhibition and easily measurable diameter on agar seeded by the bacterial suspension.
  • 1 ml of the prepared inoculum is seeded on the surface of the agar medium by flooding. After 15 min, wells are dug using Pasteur pipettes (the thick end of 6 mm). It should be noted that the inoculum thus prepared should not be used beyond 30 minutes at the risk of an increase in the density of the inoculum because of bacterial growth. Then, 50 ⁇ l of the essential oil is poured into each well. The pure essential oil is tested and diluted in 1/10 Tween 80 (10%).
  • the doxycycline 30ug disc is used as a positive control, Tween 80 pure and diluted to 10% are used as a negative control.
  • a flood-seeded petri dish was taken as a control for bacterial growth. All tests are done in triplicate.
  • Incubation The seeded petri dishes are incubated in an oven at 37 ° C. in jars under 5% CO 2 for 48 hours.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • Aa YAggregatibacter actinomycetemeomitans
  • successive serial dilutions by geometric progression of reason 2 of the stock solution obtained for each essential oil tested are prepared in a sterile culture medium (BHI), so as to successively obtain the dilutions: 1/2, 1/4 , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512.
  • these dilutions correspond, therefore, to: 5%, 2.5%, 1.25%, 0.6%, 0.3% %, 0.15%, 0.07%, 0.03%, 0.01%.
  • 100 ⁇ l aliquots of each prepared dilution of oil tested were added to each microplate well to 100 ⁇ l of prepared inoculum.
  • Tween 80 to 10% is used as a negative control. Growth control (inoculum alone) for each strain is also included in the test. The tests are carried out in triplicate on the same microplate and the experiment is repeated twice. The diagram of the experimental distribution at the level of the microplates is illustrated below (FIG. 1).
  • a bacterial suspension in BHI (Brain Heart Infusion) broth equivalent to the McFarland 0.5 standard is prepared and added to the antibiotic solutions at different concentrations (0.01 mg / ml, 0.1 mg / ml, 1 mg / ml, 10 mg / ml).
  • a negative control sterile water + inoculum
  • a solution containing sterile broth is used as a contamination control.
  • concentration of 10 mg / ml, the solution of which remained clear (not turbid) is considered the MIC of Amoxicillin on Aa and which will be used as a positive control in our test.
  • microplates covered with their lids, were incubated in plastic bags at 5% CO 2 at 37 ° C. for 48 hours.
  • TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride
  • CMB Minimal Bactericidal Concentration
  • Origanum compactum, Doxycycline and Tween 80 the one-factor analysis (ANOVA) with Bonferroni correction was performed. The value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • Statistical analysis was conducted using SPSS for Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
  • the diameters of the zones of inhibition observed for the crude Origanum compactum essential oil showed values higher than 20 mm (Table 2), expressing a high sensitivity of the strain Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2 to the oil studied.
  • MIC (0.03 ⁇ 0.01%) and CMB (0.07 ⁇ 0%) indicate effective antibacterial activity.
  • Origanum compactum essential oil The CMB / MIC ratio obtained is less than 4, which gives information on the nature of the antibacterial effect of the essential oil tested which thus proves to be bactericidal.
  • Fig 1 Experimental distribution of the microplate for the oil tested for the determination of the MIC: Cl -> - C4: different concentrations of the oil tested + inoculum, Ce: growth control (inoculum alone), C-: control negative (tween 80 at 10% + inoculum), C +: positive control (Amoxicillin + inoculum)
  • MIC Minimal Inhibitory Concentration
  • CMB Minimal Bactericidal Concentration

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Abstract

L'application de l'effet antibactérien de l'huile essentielle d'Origan (Origanum compactum) d'origine Marocaine sur une souche bactérienne orale virulente; Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2. Cette souche originelle n'a jamais fait l'objet de tests antimicrobiens à base d'huiles essentielles. Cette nouvelle application englobe aussi bien la méthodologie que les résultats obtenus. La technique utilisée est une méthode simple, claire, basée sur la preuve et offrant une meilleure précision et une meilleure reproductibilité des résultats.

Description

Titre : Composition pharmacologique de l'Origan (huile essentielle) à effet antibactérien sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2
Description :
Notre invention concerne la phytothérapie, en particulier l'effet antibactérien de l'huile essentielle d'Origan [Origanum compactum) d'origine Marocaine sur une souche bactérienne orale virulente; Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2. Cette souche originelle n'a jamais fait l'objet de tests antimicrobiens à base d'huiles essentielles.
Cette nouvelle application englobe aussi bien la méthodologie que les résultats obtenus. La technique utilisée est une méthode simple, claire, basée sur la preuve et offrant une meilleure précision et une meilleure reproductibilité des résultats.
Aggregatibacter actinomycetemcomitans [Aa) clone JP2 est une bactérie orale à Gram négatif anaérobie facultative, connue virulente, incriminée comme agent étiologique principal dans les parodontites agressives, réel problème de santé publique au Maroc. Il s'agit de maladies parodontales destructrices entraînant des pertes osseuses sévères et aboutissant à la perte des dents chez de jeunes adolescents Marocains (Haubek et al. 2001, Haubek et al. 2008, Ennibi et al. 2012). Ces dernières décennies, en raison de l'incidence croissance de ces parodontites, de la résistance accrue des bactéries orales aux antibiotiques et des effets secondaires liés aux agents antibactériens fréquemment utilisés en dentisterie, la recherche d'un nouvel agent thérapeutique alternatif sans danger pour la santé s'impose. Ainsi, les huiles essentielles, utilisés en Médecine traditionnelle, peuvent être considérées comme une bonne alternative thérapeutique. Ceci d'autant plus que le Maroc figure parmi les principaux pays producteurs d'huiles essentielles.
A la date d'aujourd'hui, il n'existe pas de procédures standardisées concernant la détermination du pouvoir antimicrobien des huiles essentielles telles qu'il en existe pour les antibiotiques selon les recommandations de CLSI par National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA, USA (NCCLS). Toutefois, l'évaluation de l'activité antibactérienne de ces agents a fait l'objet de plusieurs publications dont celles sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans (clone non-JP2), et ce suivant différentes méthodes non standardisées pour la détermination de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) des huiles sur cette bactérie. En effet, on retrouve une grande divergence entre les études concernant le protocole employé ainsi que le matériel utilisé. Certains auteurs utilisent la méthode de diffusion en milieu solide (Shih et al. 2013, Kçdzia et al. 2013, Gursoy et al. 2009), d'autres rapportent la méthode de diffusion en milieu liquide, en macrodilution pour certains (Cha et al. 2005, 2007, ulik et al. 2000) et en microdilution pour d'autres (Cunha et al. 2013, Francesca et al. 2013, Park et al. 2012, Taweechaisupapong et al. 2010, Takarada et al 2004, Shapiro et al 1994). La méthode de diffusion en milieu solide est moins précise et présente certaines limites dû au cloisonnement des composants de l'huile dans la gélose en fonction de leur affinité avec l'eau (Budzynska et al. 2009). Concernant la méthode diffusion en milieu liquide en macrodilution, la CMI est généralement déterminée visuellement ce qui également manque de précision. Quant à la technique de dilution en milieu liquide en microdilution, elle reste la plus sensible, la plus précise et la plus reproductible pour le calcul de la CMI (Budzynska et al. 2009). Cependant, afin de mener à bien cette technique et obtenir des résultats probants, l'utilisation d'un indicateur de croissance est recommandée selon plusieurs auteurs (tel : Triphényl Tétrazolium Chloride (TTC), piodonitrotetrazolium violet (INT)...). Or, les études divergent concernant le choix de la dose appropriée de cet indicateur, sachant que ce dernier peut être toxique et peut avoir un effet inhibiteur sur la croissance bactérienne à haute concentration. Ainsi, dans notre méthodologie adoptée, nous avons utilisé une concentration appropriée de TTC (qui ne montre aucun effet inhibiteur sur la croissance bactérienne), en se référant à l'étude de Rahman et al. 2004 sur les bactéries anaérobies à Gram négatif.
Il est important de signaler que les protocoles rapportés sur l'étude de l'effet des huiles essentielles sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans sont souvent ambiguës, non clairs et/ou utilisant des matériaux ou appareils coûteux souvent compliqués tels que les systèmes automatisés (plaques microscan avec le système WalkAway-96 (Saiman et al. 2003), système de microbiologie automatisé Vitek (bioMérieuxVitek, lnc.)(Barry et al. 2003)...) ou se m l'automatisés (spectrophotomètres, traitement d'image assistée par ordinateur (Canton et al. 2000, Korgenski et al. 1998)...).
Par ailleurs, il est judicieux de noter qu'il n'existe pas de standards internationaux concernant les tests de susceptibilité antimicrobienne pour les bactéries orales. Par conséquent, notre présent travail se propose de présenter une méthodologie précise basée sur la preuve, aboutissant à des résultats reproductibles et fiables.
Matériel et méthodes :
• Matériel :
L'huile essentielle d'Origan: D s'agit de Origanum compactant de la famille des Lamiaceae. Elle a été extraite de plantes qui ont été cultivées au Maroc. Les spécimens authentifiés ont été déposés dans l'herbier de laboratoire de photochimie de l'Institut national de plantes médicinales et aromatiques - Université de Sidi Mohamed Ben Abdellah, Fès, Maroc, selon le code FA/RP/I MA/107.
Une solution mère de travail de cette huile est d'abord préparée selon la technique de Benjilali et al. 1986 comme suit:
Une solution de Tween 80 à 10% (diluée dans l'eau distillée) est préalablement autoclavée. Ensuite, 900 μΙ de cette solution est ajoutée à 100 μΙ d'huile essentielle et puis l'ensemble est homogénéisé : c'est la solution mère de l'huile essentielle émulsifiée. Souche bactérienne : Aggregatibacter actinomycetemcomitans, clone JP2, sérotype b. Il s'agit d'un isolât clinique issu de prélèvements de plaque sous-gingivale de patients atteints de parodontite agressive, au Service de Parodontologie du Centre de Consultation et de traitement dentaire de Rabat.
• Méthode expérimentale :
- Extraction de l'huile essentielle
Une portion (100 g) des parties aériennes des plantes a été hydrodistillée, pendant au moins trois heures, en utilisant un appareil de type Clevenger. Pour éliminer toute trace d'eau, l'huile extraite a été traitée avec du sulfate de sodium anhydre (Na2S04), filtrée et ensuite stockée à l'obscurité à 4 ° C. Le rendement en huiles essentielles est calculé selon la formule : YieU ^^^x 100
Ce dernier est exprimé en ml/100 g de matière sèche.
- Analyse chromatographique et caractérisation de l'huile essentielle
CG : analyse par la chromatographie en phase gazeuse (CG) est effectuée sur un chromatographe Hewlett -Packard ( HP 6890 ) gazeuse ( FID) , équipé d'une colonne capillaire HP- 5 (5% de phényl méthyl silicone ) . La caractéristique de cette colonne était de: 30 m de longueur, 0,25 mm de diamètre et de 0,25 mm d'épaisseur de film. La température est programmée de 50 ° C (5min d'attente initiale) à 200 ° C à 4 ° C / min . Des conditions de chromatographie en phase gazeuse ont été les suivantes : N2 comme gaz porteur (1,8 ml / min) ; mode partagé (débit: 72,1 ml / min , le rapport : 1/50 ) a été utilisée , les températures de l'injecteur et le détecteur sont de 275 " C et 250 " C respectivement . Les échantillons dilués (1/20 dans l'hexane) de 1 ml ont été injectés manuellement. La machine a été dirigée par un type de système informatique « HP ChemStation ».
GC / MS : chromatographie en phase gazeuse /spectrométrie de masse : La composition chimique des huiles essentielles ont été analysées en utilisant un chromatographe en phase gazeuse (GC Ultra TRACE ) monté sur un spectromètre de masse (Polaris Q-lon Trap MS). Fonctionnement en mode impact électronique d'assurance-emploi (70 eV). VB- 5 ( méthylpolysiloxane 5% phényle ) et une colonne ( 30m x 0,25 mm x épaisseur de 0,25 pm ) ont été utilisés (Centre national de la recherche scientifique et technique - ( CNRST ) , Rabat , Maroc ) . Les conditions chromatographiques sont les suivantes: températures de l'injecteur et du détecteur à 220 et 300 ° C respectivement; gaz porteur, de l'hélium à un débit de 1,4 ml / min, température de programme rampe de 40 à 300 ° C avec un gradient de 4 ° C / min (maintien de la température initiale et finale pendant 4min). La quantité relative des composants individuels de l'huile totale a été exprimée en pourcentage d'aire du pic par rapport à la zone de pic totale. Une recherche bibliographique a été réalisée en utilisant la combinaison de NIST MS Recherche et de la littérature. Les composants des huiles ont également été identifiés par leurs indices de rétention relatifs à n-alcanes (C8 - C24)
- Etude de l'activité antibactérienne in vitro de Origanum cotnpact m
Le protocole fait appel dans un 1er temps à la technique de contact direct par diffusion en milieu gélosé (en puits), qui permet de prévoir l'efficacité in vitro de l'huile essentielle. Ensuite, pour le calcul de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de L'huile testée efficace, la méthode de microdilution sur microplaque de 96 puits est utilisée. La CMB (Concentration Minimale Bactéricide) est également mesurée suivant le protocole ci-après.
1. Méthode de diffusion en puits
Ce test est réalisé par dépôt de l'huile essentielle dans des puits creusés dans la gélose suivant une modification de la technique de Dorman et Deans 2000. Elle assure une diffusion totale de l'huile essentielle à partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition claire et de diamètre facilement mesurable sur gélose ensemencée par la suspension bactérienne.
> Préparation de l'inoculum
A partir de souches conservées à -20°C (sous formes de billes), une mise en culture est réalisée sur gélose au sang cuit en condition d'anaérobiose sous 5% de C02 à 37°C pendant 24h. Une suspension bactérienne d'une densité de 0.5 Me Farland est ensuite préparée à partir de cette culture pure et jeune (âgée de 24 heures) dans une solution de 0,85% Nacl, en utilisant un étalon. La suspension ajustée devra ainsi contenir approximativement 108 CFU/ml (colony forming units /ml).
> Ensemencement des boîtes de pétri :
lml de l'inoculum préparé est ensemencé en surface du milieu gélosé par inondation. Après 15 min, des puits sont creusés à l'aide de pipettes Pasteur (l'extrémité épaisse de 6 mm). Il est à signaler que l'inoculum ainsi préparé ne doit pas être utilisé au delà de 30 minutes au risque d'une augmentation de la densité de l'inoculum à cause de la croissance bactérienne. Ensuite, 50 ul de l'huile essentielle est versée dans chaque puits. On teste l'huile essentielle pure et diluée dans du Tween 80 à 1/10 (10%).
La doxycycline en disque de 30ug est utilisée comme contrôle positif, Tween 80 pur et dilué à 10% sont utilisés comme contrôle négatif. Une boîte de pétri ensemencée par inondation a été prise comme témoin de croissance bactérienne. Tous les tests sont effectués en triplicata.
Incubation : Les boîtes de pétri ensemencées sont incubées à l'étuve à 37°C, dans des jarres, sous 5% de C02, pendant 48h.
2. Méthode de microdilution
La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'huile testée sur YAggregatibacter actinomycetemeomitans (Aa) est réalisée sur microplaque à 96 puits de culture cellulaire selon une modification de la méthode décrite par Shapiro et al. 1994 et Carson et al. 1995. A partir de colonies de Aa datant de 48h, on inocule 2 tubes contenant 10 ml de BHI (Brain Heart Infusion) stérile. Après 24h d'incubation à 37°C dans une jarre sous 5% de C02, on ajuste la densité à 0.5 Me Farland. Parallèlement, des dilutions en série successives par progression géométrique de raison 2 de la solution mère obtenue pour chaque huile essentielle testée sont préparées dans un milieu de culture stérile (BHI), de façon à obtenir successivement les dilutions : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512. En prenant en compte la solution mère de base préparée de l'huile essentielle (10%), ces dilutions correspondent, par conséquent, à : 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6%, 0,3%, 0,15%, 0,07%, 0,03%, 0,01%. Ensuite, des aliquotes de 100 μΙ de chaque dilution préparée d'huile testée ont été ajoutées, dans chaque puits de microplaque, à 100 μΙ d'inoculum préparé. Le Tween 80 à 10% est utilisé comme contrôle négatif. Un contrôle de croissance (inoculum seul) pour chaque souche est inclus également dans l'essai. Les tests sont effectués en triplicata sur la même microplaque et l'expérimentation est répétée 2 fois. Le schéma de la distribution expérimentale au niveau des microplaques est illustré ci-après (Fig 1).
Concernant le contrôle positif : nous avons utilisé l'Amoxicilline que nous avons préparé et dont nous avons déterminé la CMI sur Aa en utilisant la méthode de microdilution dans un bouillon de culture adapté. En l'absence de méthode standardisée d'antibiogramme de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) pour ce type de souche, nous avons adopté la procédure suivante en s'inspirant de celle des « entérobactéries » dans les recommandations de CLSI (2006):
Une suspension bactérienne en bouillon BHI (Brain Heart Infusion) équivalente au standard McFarland 0,5 est préparée et ajoutée aux solutions antibiotiques à différentes concentrations (0,01mg/ml, 0,lmg/ml, lmg/ml, 10mg/ml). Un contrôle négatif (eau stérile + inoculum) est utilisé comme témoin de croissance bactérienne et une solution contenant du bouillon stérile est utilisée comme contrôle de contamination. Ainsi, la concentration de 10 mg/ml, dont la solution est restée claire (non trouble) est considérée comme la CMI de l'Amoxicilline sur Aa et qui sera utilisée comme contrôle positif dans notre essai.
Les microplaques, recouvertes de leurs couvercles, ont été mises à l'étuve pour incubation dans des sachets en plastique sous 5% de C02 à 37°C pendant 48h.
Après la période d'incubation, 40 ul d'une solution à 2 mg / mL de Triphényl Tétrazolium Chloride (TTC) (indicateur de croissance bactérienne) (Shafiei et al. 2012) est ajouté dans chaque puits et la plaque est incubée à 37 ° C pendant 1 heure à 2 heures environ. La solution d'indicateur TTC change du clair au pourpre en présence d'activité bactérienne, tandis qu'elle reste claire lorsque la croissance microbienne est inhibée. CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) est définie comme la plus faible concentration de l'huile essentielle qui ne montre aucune croissance bactérienne visible après la période d'incubation (pas de changement de couleur (claire) de TTC). Pour déterminer la Concentration Minimale Bactéricide (CMB), une aliquote de 10 ul est prélevée à partir de cultures au niveau des puits ne présentant pas de turbidité visible, et ensemencée sur des milieux de gélose de sang cuit et incubée pendant 48h à 37 ° C sous 5% de C02 (Hammer et al. 2003). La détermination des valeurs de CMB a été réalisée en triplicata. Le rapport CMB / CMI a également été calculé pour mettre en évidence la nature de l'effet antibactérien de l'huiles essentielle testée. Lorsque le rapport est inférieur à 4, l'huile essentielle est considérée comme une huile essentielle bactéricide et lorsque le ratio est supérieur à 4, elle est considérée comme une huile essentielle bactériostatique (Levison et al. 2004). • Analyse statistique
Les diamètres des zones d'inhibition, la C I et CMB, variables continues avec distribution normale, ont été présentés en moyenne ± écart type. Pour les différences statistiques entre Origanum compactum, Doxycycline et Tween 80, l'analyse à un facteur (ANOVA) avec correction Bonferroni a été effectuée. La valeur du P< 0.05 a été considérée comme statistiquement significative. L'analyse statistique a été menée en utilisant SPSS pour Windows (SPSS, inc., Chicago, IL, USA).
RESULTATS
1. Composition chimique :
L'analyse chimique de l'huile essentielle étudiée a mis en évidence les constituants majeurs suivants : γ-terpinene (25.11%), Carvacrol (22.29%), Thymol (19.21 %), p-cymene (18.68 %) (Tableau 1).
2. Activité antibactérienne :
> Essai de diffusion en puits :
Après la période d'incubation (48h), des zones d'inhibition de croissance bactérienne sur gélose sont obtenues et mesurées par un pied à coulisse (Tableau 2). Cependant, aucun halo d'inhibition n'est obtenu pour les contrôles négatifs (Tween 80 pur et dilué à 10%). Concernant, le témoin de croissance utilisé, une croissance bactérienne sous forme d'un film recouvrant la gélose est obtenue. Le diamètre moyen des zones d'inhibition induits par la Doxycycline (22,67 ± 1,15 mm) est significativement plus petit que celui produit par l'huile essentielle testée à l'état pur [51,67 ± 5,77 mm). Les diamètres des zones d'inhibition observés pour l'huile essentielle de Origanum compactum à l'état brut, ont montré des valeurs supérieures à 20 mm (Tableau 2), traduisant une forte sensibilité de la souche Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2 à l'huile étudiée.
£550/ de microdilution :
Les valeurs enregistrées de CMI, CMB et rapport CMB/CMI sont représentés dans le Tableau 3. La CMI (0,03 ±0,01 %) et la CMB (0,07±0 %) obtenues témoignent d'une activité antibactérienne effective de l'huile essentielle de Origanum compactum. Le rapport CMB/CMI obtenu est inférieur à 4, ce qui renseigne sur la nature de l'effet antibactérien de l'huile essentielle testée qui s'avère ainsi bactéricide.
Liste des tableaux :
Fig 1: Distribution expérimentale de la microplaque pour l'huile testée pour la détermination de la CMI : Cl ->-C4 : différentes concentrations de l'huile testée + inoculum, Ce : contrôle de croissance (inoculum seul), C- : contrôle négatif (tween 80 à 10% + inoculum), C+ : contrôle positif (Amoxicilline + inoculum)
Tableau 1 : Composition chimique de Origanum compactum huile essentielle
Tableau 2 : Diamètres d'inhibition (mm) obtenues par la méthode de diffusion en puits
Tableau 3: Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et Concentration Minimale Bactéricide (CMB)
(%) (v/v) de l'huile essentielle testée sur la souche A. actinomycetemcomitans clone JP2

Claims

Revendications :
1- Composition pharmacologique de l'huile essentielle d'Origan pour le traitement des infections à Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2 Caractérisée en ce qu'elle contient:
γ-terpinene (25.11%), Carvacrol (22.29%), Thymol (19.21 %), p-cymene (18.68 %), a-thujene 0.22, a-pinene 0.54, Camphene 0.17, Sabinene 0.23, Sabinene 0.83, β- pinene 0.16, 2-octanol 0.86, Myrcene 2.21 , δ-2-carene 0.09, a-Phellandrene 0.26, δ-3- carene 0.08, a-terpinene 2.79, O-cymene 0.48, Camphor 0.05, β-Ε-ocimene 0.09, Cis- hydrate sabinene 0.15, m-cymenene 0.14, Terpinolene 0.07, linalool 1.24, borneol 0.20, terpinen-4-ol 0.34, p -cymen-8-ol 0.09, a-terpineol 0.99, E-caryophyllene 1.03, γ-cadinene 0.05, Caryophyllene oxide 0.06.
2- Composition pharmacologique de l'extrait d'Origan selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'effet antibactérien se produit avec l'utilisation de l'extrait de l'huile essentielle de l'Origan entre 0,02 à 0,1 %;
3- Composition pharmacologique de l'huile essentielle d'Origan selon la revendication 1 et 2 caractérisée en ce que l'effet est bactéricide sur espèce Aggregatibacter actinomycetemcomitans clone JP2 ;
4- Composition pharmacologique de l'extrait d'Origan selon la revendication 1,2 et 3 caractérisée en ce que l'effet antibactérien s'observe avec l'application locale de la composition sur les muqueuses ou sous les formes galéniques liquide et solide.
ι constituants '¾ .
931 α-thujene 0.22
939 α-pinene 0.54
948 Camphene 0.17
973 Sabinene 0.23
976 Sabinene 0.83
980 β-pinene 0.16
984 2-octanol 0.86
991 Myrcene 2.21
999 δ-2-carene 0.09
1005 a-Phellandrene 0.26
1011 δ-3-carene 0.08
1018 a-terpinene 2.79
1023 o-cymene 0.48
1026 p-cymene 18.68
1143 Camphor 0.05
1050 β-Ε-ocimene 0.09
1062 γ-ter pi nene 25.11
1067 Cis-hydrate sabinene 0.15
1080 m-cymenene 0.14
1087 Terpinolene 0.07
1098 linalool 1.24
1165 bomeol 0.20
1177 terpinen-4-ol 0.34
1184 p -cymen-8-ol 0.09
1189 a-terpineol 0.99
1290 Thymol 19.21
1298 Carvacrol 22.29
1418 E-caryophyllene 1.03
1513 γ-cadinene 0.05
1582 Caryophyllene oxide 0.06
Total 98.71 N : nombre de l'effectif, M± ET : Moyenne ± Ecart Type (pour une expérimentation en triplicata), †: diamètre de la zone d'inhibition incluant le diamètre du puits (6mm).* : P <0,001: Doxycycline Vs Origanum compactum pur.
†† : P <0,001 : Tween 80 (pur) Vs Origanum compactum (pur et dilué) et Doxycycline.
° : P <0,001 : Tween 80 (10%) Vs Origanum compactum (pur et dilué) et Doxycycline.
Figure imgf000010_0001
FIG 1 I *: ¾ 6 7 8 10 11 12
Figure imgf000010_0002
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060140884A1 (en) * 2004-12-28 2006-06-29 Colgate-Palmolive Company Oregano oral care compositions and methods of use thereof
US20120183588A1 (en) * 2011-01-13 2012-07-19 Austin Research Labs Corp. High load dispersions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060140884A1 (en) * 2004-12-28 2006-06-29 Colgate-Palmolive Company Oregano oral care compositions and methods of use thereof
US20120183588A1 (en) * 2011-01-13 2012-07-19 Austin Research Labs Corp. High load dispersions

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"OregaDENT -1 fl oz -North American Herb & Spice", 15 July 2014 (2014-07-15), XP055179740, Retrieved from the Internet <URL:https://web.archive.org/web/20140715042340/http://www.northamericanherbandspice.com/product/oregadent-1-fl-oz/> [retrieved on 20150327] *
"Oregano Oil & Periodontal Disease | LIVESTRONG", 16 August 2013 (2013-08-16), XP055179744, Retrieved from the Internet <URL:http://www.livestrong.com/article/521840-oregano-oil-periodontal-disease/> [retrieved on 20150327] *
"Oreganol P73 oil", 9 November 2013 (2013-11-09), XP055179739, Retrieved from the Internet <URL:https://web.archive.org/web/20131109050942/http://www.northamericanherbandspice.com/product/oreganol-p73-oil-1-fl-oz/> [retrieved on 20150327] *
ADEPAM, IAV HASSAN II, B.P. 6202, RABAT-INSTITUTS (MAROC): "Fiche technique de l'huile essentielle d'Origanum compactum Benth(Origan) du Maroc", 23 September 2007 (2007-09-23), XP002738117, Retrieved from the Internet <URL:http://corpolaseve.uqac.ca/manuel/chapitres/Annex1.pdf> [retrieved on 20150326] *
DORTE HAUBEK ET AL: "Pathogenicity of the highly leukotoxic JP2 clone of Aggregatibacter actinomycetemcomitans and its geographic dissemination and role in aggressive periodontitis", JOURNAL OF ORAL MICROBIOLOGY, vol. 108, no. 0, 14 August 2014 (2014-08-14), pages 136, XP055177870, DOI: 10.3402/jom.v6.23980 *
L LAKHDAR1 ET AL: "Antibacterial activity of essential oils against periodontal pathogens : a qualitative systematic review", 1 December 2012 (2012-12-01), XP055178063, Retrieved from the Internet <URL:http://www.researchgate.net/publication/236065647_Antibacterial_activity_of_essential_oils_against_periodontal_pathogens_a_qualitative_systematic_review> [retrieved on 20150320] *
LEILA LAKHDAR ET AL: "THESE N° : 28/14 CSVS THESE DE DOCTORAT EVALUATION DE L'ACTIVITE ANTIBACTERIENNE D'HUILES ESSENTIELLES MAROCAINES SUR AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS : ETUDE IN VITRO Equipe de Recherche en Ecosystème buccal Présentée et soutenue par", 24 February 2015 (2015-02-24), XP055177857, Retrieved from the Internet <URL:http://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCIQFjAA&url=http%3A%2F%2Fao.um5s.ac.ma%2Fjspui%2Fbitstream%2F123456789%2F14825%2F1%2FTHESE.pdf&ei=wCAMVfrsEsy8PbmjgdAB&usg=AFQjCNEQ7c8GNdc2GD57d0gdP1A47Mc2vA&sig2=pLPBGhd3wGOvR7ArVqddAg&bvm=bv.88528373,d.ZWU> [retrieved on 20150319] *
S BOUHDID ET AL: "Antibacterial and antioxidant activities of Origanum compactum essential oil", AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, 16 May 2008 (2008-05-16), pages 1563 - 1570, XP055007547, Retrieved from the Internet <URL:http://www.academicjournals.org/AJB/PDF/pdf2008/16May/Bouhdid et al.pdf> [retrieved on 20110920] *

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