WO2016039606A1 - Biodétecteur pour la surveillance de l'infiltration d'oxygène, méthode pour la fabrication du biodétecteur - Google Patents

Biodétecteur pour la surveillance de l'infiltration d'oxygène, méthode pour la fabrication du biodétecteur Download PDF

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WO2016039606A1
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oxygen
biodetector
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oxygen gas
polyphenoloxidase
Prior art date
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PCT/MA2015/000014
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Inventor
Abdellatif BENABDELLAH
Abdelaziz BOUCHAIB
Amin LAGLAOUI
Mohammed BAKKALI
Amal MAURADY
Abdelhay ARAKRAK
Carlo CARBONI
Benoit GROSDIDIER
Original Assignee
Université Abdelmalek Essaâdi
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Definitions

  • Biosensor for the monitoring of oxygen infiltration method for the manufacture of the biodetector.
  • the present invention relates to the field of detection of oxygen infiltration in confined spaces containing substances that can be altered by the presence of oxygen.
  • State of the art :
  • Gardiol, et al [4,5] patented an oxygen enzymatic sensor in which they used laccase and ascorbate-oxidase.
  • This sensor is in the form of an aqueous solution containing ascorbic acid, laccase and ascorbate oxidase. The solution was encapsulated in a low density polyethylene bag to allow good diffusion of oxygen. In contact with oxygen the solution becomes blue.
  • This sensor also has a storage problem since it is a liquid and sulfur sensor with a very long response time of the order of 24 hours.
  • Polyphenoloxidase (PPO) is a widely replicated enzyme in plant rein. It is the enzyme responsible for the browning and ripening of fruits and vegetables. It catalyzes the oxidation of polyphenols by oxygen [6, 7]. The products of this oxidation polymerize to give brown or red colored substances. The scheme of this reaction is given in Figure -1-.
  • the OPP action can occur both in the liquid phase and when immobilized in the solid phase. Immobilization of solid-phase PPO or gel has been extensively studied [8, 9, 10] and studies show that PPO retains its activity when immobilized in the solid phase. We took advantage of this property to design the present oxygen sensor.
  • Patent application WO2007051860 describes a matrix consisting of at least a partially organic polymer and at least one component selected from components that are reactive with oxygen after appropriate activation. These components are preferably compounds that consume oxygen and / or can indicate the presence of oxygen.
  • the first reaction utilizes glucose oxidase as a catalyst
  • the second reaction requires the presence of o-dianisidine to be added to the medium in the presence of peroxidase as a catalyst;
  • Patent application WO2007051860 discloses a technique whereby the element transformed into the colored material is the cofactor of peroxidase (o-Dianisidine) and requires mixing in a single system at least five substances (D-Glucose, Glucose Oxidase, o- Dianisidine, peroxidase and the support material).
  • Glucose Oxidase, O-Dianisidine and Peroxidase are toxic substances and may pose a risk to human health when incorporated into food packaging.
  • the present invention relates to a colorimetric oxygen sensor whose operating principle is an enzymatic oxidation reaction. It is a solid hydrogel on which we immobilized the PPO and its substrate in the absence of oxygen. The contact of the sensor with oxygen causes the oxidation of the substrate, according to an irreversible reaction, producing colored substances as shown in Figure -2-.
  • the enzyme and its substrate are immobilized on a hydrogel derived from natural products and without any risk to human health.
  • the hydrogel used can be prepared from any kind of natural gum or gel: tragacanth gum, gum arabic, indubiosis, agarose, agar-agar.
  • the enzyme used is extracted from local fruits and plants, partially or totally purified.
  • the list of enzyme sources we tested contains: palm heart, apple, banana, bunch mushroom, quince and potato.
  • the products used as substrate of the enzyme can be selected from the following list:
  • this sensor is to be made of substances extracted from natural products that pose no risk to human health, on the one hand, and that the system is in the form of a solid hydrogel that remains stable and effective even after several days of storage, on the other hand. It is therefore very convenient and easy to use to detect a possible infiltration of oxygen.
  • the first reaction uses glucose oxidase as a catalyst; o
  • the second reaction requires the presence of o-Dianisidine which must be added to the medium in the presence of peroxidase as a catalyst; In this technique it is the second reaction which is responsible for enzymatic browning and not the first.
  • WO2007051860 discloses a technique by which the element transformed into a colored material is the cofactor of peroxidase (o-Dianisidine), while in the present patent application it is the substrate (polyphenol) of polyphenoloxidase which is transformed into a colored product.
  • Glucose Oxidase, ⁇ -Dianisidine and peroxidase are toxic substances and may pose a risk to human health when incorporated into food packaging, while substances used in the biosensor, which is the subject of this application for patent, pose no risk to human health due to the use of natural substances.
  • the indicator at least one volume of the enzyme solution of minimum concentration 1 mg / ml and at least one volume of substrate of minimum concentration 2.10 -2 mol / l are mixed with at least 2 volumes of the liquid hydrogel .
  • the mixture is evacuated into an oxygen impervious vial and solidifies at room temperature.
  • a quantity of the sensor is brought into contact with the oxygen of the air in a tank of the spectrophotometer.
  • the activity of the PPO in the hydrogel and hence the initial rate of the oxidation reaction were determined by following the evolution of the absorbance as a function of time.
  • the maximum absorbance of the products of the oxidation reaction is between 420 and 480 nm.
  • FIG. 3 shows the evolution of the absorbance at 470 nm of the sensor containing the PPO of the parisian mushroom and the gallic acid. This is the course of the evolution of the absorbance of a product obtained by an enzymatic reaction.
  • a significant variation of the absorbance is obtained after 10 min, which makes it possible to say that the sensor has a rather short response time. This is confirmed by monitoring the evolution of the color of the sensor over time.
  • the sensor containing the PPO of palm heart and gallic acid in the absence of oxygen for a month.
  • the sensor keeps its appearance and does not undergo any change as long as it is safe from oxygen. Once it comes into contact with the oxygen of the area, it undergoes a change of color observable after twenty minutes, figure-8-.
  • Figure 1 enzymatic oxidation reaction of polyphenols catalyzed by the PPO
  • Figure 2 Schematic diagram of the enzymatic oxygen sensor
  • Figure 3 Evolution of the absorbance of the sensor containing the PPO of the parisian mushroom and gallic acid
  • Figure 4 Evolution of the color of the sensor containing the PPO of the parisian mushroom and chlorogenic acid
  • Figure 5 Evolution of the color of the sensor containing the PPO of the palm heart and gallic acid
  • Figure 6 Evolution of the sensor color containing the PPO of the palm heart and chlorogenic acid
  • Figure 7 Evolution of the color of the sensor containing the PPO of the palm heart and gallic acid following contact with the oxygen after 1 month of storage.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de détection de l'infiltration d'oxygène dans les espaces confinés contenant des substances pouvant être altérées par la présence de l'oxygène. Il s'agit d'un senseur colorimétrique d'oxygène dont le principe de fonctionnement est une réaction d'oxydation enzymatique en phase solide. C'est un hydrogel solide sur lequel la polyphénoloxydase (PPO) et son substrat ont été immobilisés en l'absence d'oxygène. Le contact du senseur avec l'oxygène engendre l'oxydation du substrat, selon une réaction irréversible, en produisant des substances colorées comme illustré sur la figure -2-.

Description

BIODÉTECTEUR POUR LA SURVEILLANCE DE L'INFILTRATION D'OXYGÈNE, MÉTHODE POUR LA FABRICATION DU BIODÉTECTEUR
DESCRIPTION
Intitulé de l'invention :
Biodétecteur pour la surveillance de l'infiltration d'oxygène, méthode pour la fabrication du biodétecteur.
Domaine de l'invention:
La présente invention concerne le domaine de détection de l'infiltration d'oxygène dans les espaces confinés contenant des substances pouvant être altérées par la présence de l'oxygène. Etat de l'art :
Le problème de l'infiltration d'oxygène dans les emballages est une préoccupation majeure de plusieurs secteurs industriels, agroalimentaires, pharmaceutiques, médicaux, d'électroniques, etc. Par exemple, un produit alimentaire ou médical emballé sous vide pourrit suite à une infiltration accidentelle ou intentionnelle d'oxygène. Souvent cette détérioration des produits alimentaires passe inaperçue, ce qui peut représenter un réel danger pour le consommateur.
Afin de remédier à ce problème, plusieurs types de senseurs d'oxygène ont été conçus, les plus courants sont basés sur l'extinction de la luminescence de certaines substances convenables [1]. Ce sont des colorants dont les molécules sont excitées par la lumière ultraviolette. Ces molécules se désexcitent en contact de l'oxygène provoquant ainsi un changement de couleur du senseur [2]. D'autres systèmes sont à base de colorants dont les formes réductrice et oxydante ont des couleurs différentes. En contact de l'oxygène il y a transformation de la forme réductrice en forme oxydante indiquant ainsi la présence d'oxygène par changement de couleur [3].
Malgré leur efficacité à détecter l'oxygène, ces indicateurs soufrent de certains problèmes, ils sont réversibles, coûteux et présentent un problème de stockage. Mais leur inconvenant majeur est qu'ils sont constitués de substances chimiques qui peuvent avoir des effets néfastes pour la santé humaine. En effet, il y a actuellement une tendance générale à supprimer tout ce qui est chimique des emballages alimentaires et une demande accrue pour les produits naturels.
Gardiol, et al [4,5] ont breveté un senseur enzymatique d'oxygène dans lequel ils ont utilisé la laccase et l'ascorbat-oxydase. Ce senseur se présente sous forme d'une solution aqueuse contenant l'acide ascorbique, la laccase et l'ascorbate oxydase. La solution a été encapsulée dans un sachet en polyéthylène basse densité pour permettre une bonne diffusion de l'oxygène. Au contact de l'oxygène la solution devient bleue. Ce senseur présente lui aussi un problème de stockage puisqu'il s'agit d'un senseur liquide et soufre d'un temps de réponse très long de l'ordre de 24 heurs. La polyphénoloxydase (PPO) est une enzyme largement répondue dans la rêne végétale. C'est l'enzyme responsable du brunissement et de mûrissement des fruits et légumes. Elle catalyse l'oxydation des polyphénols par l'oxygène [6, 7]. Les produits de cette oxydation se polymérisent pour donner des substances colorées brunes ou rouges. Le schéma de cette réaction est donnée par la figure -1-.
L'action de la PPO peut se produire aussi bien en phase liquide que lorsqu'elle est immobilisée en phase solide. L'immobilisation de la PPO en phase solide ou gel a été largement étudiée [8, 9, 10] et les études montrent que la PPO garde son activité lorsqu'elle est immobilisée en phase solide. Nous avons profité de cette propriété pour concevoir le présent senseur d'oxygène.
La demande de brevet WO2007051860 décrit une matrice constituée d'un polymère au moins en partie organique et au moins un composant choisi parmi les composants qui sont réactifs vis-à-vis de l'oxygène après activation appropriée. Ces composants sont de préférence des composés consommant de l'oxygène et/ou pouvant indiquer la présence d'oxygène.
Ladite demande de brevet décrit donc une technique qui est basée essentiellement sur la détection de l'oxygène et cette détection s'effectue nécessairement en deux réactions chimiques (étapes) :
Glucose
Oxydasse
D-Giucose + H;03 + 02 Acide D-Gluconic + ¾02
Peroxydase
+ o-Dianisidine o-Dianisidine
réduit oxydé
(incolore) (brun)
■ La première réaction utilise le glucose oxydase comme catalyseur ;
■ La deuxième réaction nécessite la présence d'o-Dianisidine qui doit être ajouté au milieu en présence de la peroxydase comme catalyseur ;
Dans cette technique c'est la deuxième réaction qui est responsable du brunissement enzymatique et non pas la première.
Pour que la présence d'oxygène se manifeste par un effet de brunissement, la technique mentionnée dans la demande de brevet WO2007051860 nécessite exclusivement deux enzymes : la glucose oxydase, dans une première réaction, et la peroxydase, dans une seconde réaction. La demande de brevet WO2007051860 présente une technique par laquelle l'élément transformé en matière colorée est le cofacteur de la peroxydase ( o-Dianisidine ) et nécessite de mélanger dans un seul système au moins cinq substances ( D-Glucose , Glucose Oxydase, o-Dianisidine, Peroxydase et le matériau support).
La Glucose Oxydase, ο-Dianisidine et la Peroxydase sont des substances toxiques et peuvent présenter un risque pour la santé humaine lorsqu'elles sont incorporées dans l'emballage alimentaire.
Description de l'invention :
La présente invention concerne un senseur colorimétrique d'oxygène dont le principe de fonctionnement est une réaction d'oxydation enzymatique. C'est un hydrogel solide sur lequel nous avons immobilisé la PPO et son substrat en l'absence d'oxygène. Le contact du senseur avec l'oxygène engendre l'oxydation du substrat, selon une réaction irréversible, en produisant des substances colorées comme illustré sur la figure -2-.
L'enzyme et son substrat sont immobilisés sur un hydrogel issu de produits naturels et sans aucun risque pour la santé humaine. L'hydrogel utilisé peut être préparé à partir de toute sorte de gomme ou gel naturels : gomme de tragacanthe, gomme arabique, indubiose, agarose, agar-agar.. . L'enzyme utilisée est extraite de fruits et plantes locales, partiellement ou totalement purifiée. La liste des plantes sources d'enzyme que nous avons testées contient : le cœur de palmier, la pomme, la banane, le champignon de paris, le coing et la pomme de terre. Les produits utilisés comme substrat de l'enzyme peuvent être sélectionnés parmi la liste suivante :
■ Les phénols simples ;
■ Les acides aminés ;
■ les acides organiques ;
■ Les flavonoïdes et les tannins.
La particularité de ce senseur est d'être constitué de substances extraites de produits naturels qui ne présentent aucun risque pour la santé humaine, d'une part, et que le système se présente sous forme d'un hydrogel solide qui demeure stable et efficace même après plusieurs jours de stockage, d'autre part. Il est donc très pratique et facile à utiliser pour détecter une possible infiltration d'oxygène.
Les avantages que présente cette invention par rapport au brevet cité sont les suivants :
• contrairement à la demande de brevet citée WO2007051860, qui décrit donc une technique qui est basée essentiellement sur la détection de l'oxygène et cette détection s'effectue nécessairement en deux réactions chimiques :
o La première réaction utilise la glucose oxydase comme catalyseur ; o La deuxième réaction nécessite la présence d'o-Dianisidine qui doit être ajouté au milieu en présence de la peroxydase comme catalyseur ; Dans cette technique c'est la deuxième réaction qui est responsable du brunissement enzymatique et non pas la première.
La technique objet de la présente demande de brevet ne nécessite qu'une seule réaction chimique pour aboutir à une coloration résultant de la présence d'oxygène.
• Pour que la présence d'oxygène se manifeste par un effet de brunissement, la technique mentionnée dans la demande de brevet citée WO2007051860 nécessite exclusivement deux enzymes ; la glucose oxydase, dans une première réaction, et la peroxydase, dans une seconde réaction, alors que la technique proposée dans la présente demande n'a besoin que d'une seule enzyme : la polyphénoloxydase en tant que catalyseur ;
• La demande de brevet citée WO2007051860 présente une technique par laquelle l'élément transformé en matière colorée est le cofacteur de la peroxydase ( o- Dianisidine ), alors que dans la présente demande de brevet, il s'agit du substrat ( polyphénol ) de la polyphénoloxydase qui est transformé en produit coloré.
• La technique présentée dans la demande de brevet citée WO2007051860 nécessite de mélanger dans un seul système au moins cinq substances ( D-Glucose , Glucose Oxydase, o-Dianisidine, Peroxydase et le matériau support) alors celle présentée dans la présente demande de brevet nécessite uniquement une enzyme, son substrat et un matériau support.
• La Glucose Oxydase, Γο-Dianisidine et la Peroxydase sont des substances toxiques et peuvent présenter un risque pour la santé humaine lorsqu'elles sont incorporées dans l'emballage alimentaire, tandis que les substances utilisées dans le biodétecteur, objet de la présente demande de brevet, ne présentent aucun risque pour la santé humaine en raison du recours à des substances naturelles.
Description de la méthode de préparation du biosenseur d'infiltration d'oxygène :
A titre d'exemple, nous avons préparé un senseur d'oxygène contenant :
• la PPO, que nous avons extraite du champignon de paris ou du cœur du palmier ;
• un gel d'indubiose ; et
• l'un des substrats suivants : l'acide gallique ou l'acide chlorogénique.
Le protocole de la préparation est le suivant :
préparer la solution d'enzyme de concentration minimale lmg/ml ;
préparer la solution du substrat de concentration minimale égale à 2.10"2 mol/1 dans une solution tampon de pH compris entre 6 et 7.5 ;
préparer la solution d'indubiose de concentration comprise entre 2,5 et 10% ;
chauffer la solution d'indubiose jusqu'au moins 50°C pour obtenir le gel d'indubiose. Pour préparer l'indicateur, au moins un volume de la solution d'enzyme de concentration minimale lmg/ml et au moins un volume de substrat de concentration minimale 2.10'2 mol/1 sont mélangés à au moins 2 volumes de l'hydrogel liquide. Le mélange est mis sous vide dans un flacon imperméable à l'oxygène et se solidifie à la température ambiante.
Suivie de l'évolution du senseur par spectrophotométrie :
Une quantité du senseur est mise en contact de l'oxygène de l'air dans une cuve du spectrophotomètre. L'activité de la PPO dans l'hydrogel et par suite la vitesse initiale de la réaction d'oxydation ont été déterminées en suivant l'évolution de l'absorbance en fonction du temps. L'absorbance maximale des produits de la réaction d'oxydation se situe entre 420 et 480 nm. A titre d'exemple, la figure-3- représente l'évolution de l'absorbance à 470 nm du senseur contenant la PPO du champignon de paris et l'acide gallique. Il s'agit bien de l'allure de l'évolution de l'absorbance d'un produit obtenu par une réaction enzymatique. Une variation importante de l'absorbance est obtenue au bout de 10 min, ce qui permet de dire que le senseur a un temps de réponse assez court. Ceci est confirmé par le suivi de l'évolution de la couleur du senseur au cours du temps.
Évolution de la couleur des senseurs :
L'observation de la couleur des senseurs d'oxygène que nous avons élaborés montre qu'ils sont translucides en absence d'oxygène. En les exposant à l'oxygène de l'air, ils changent de couleur et leur coloration est de plus en plus intense au cours du temps, figures 4, 5 et 6. Effet de la durée du stockage sur la réponse du senseur :
A titre d'exemple, nous avons stocké le senseur contenant la PPO du cœur de palmier et l'acide gallique en l'absence d'oxygène pendant un mois. Le senseur garde son aspect et ne subit aucun changement tant qu'il est à l'abri de l'oxygène. Une fois il entre en contact avec l'oxygène de l'aire, il subit un changement de couleur observable au bout de vingt minutes, figure-8-.
Brève description des dessins :
Figure 1 : Réaction d'oxydation enzymatique des polyphénols catalysée par la PPO ;
Figure 2 : Schéma de principe du senseur enzymatique d'oxygène ;
Figure 3 : Evolution de l'absorbance du senseur contenant la PPO du champignon de paris et l'acide gallique ;
Figure 4 : Evolution de la couleur du senseur contenant la PPO du champignon de paris et l'acide chlorogénique ;
Figure 5 : Evolution de la couleur du senseur contenant la PPO du cœur de palmier et l'acide gallique ;
Figure 6 : Evolution de la couleur senseur contenant la PPO du cœur de palmier et l'acide chlorogénique ;
Figure 7 : Evolution de la couleur du senseur contenant la PPO du cœur de palmier et l'acide gallique suite au contact de l'oxygène après 1 mois de stockage.
Références :
1. Klimant, O.S. Wolfbeis, Oxygen-sensitive luminescence materials based on silicone- soluble ruthénium diimine complexes, Anal. Chem. 67 ( 1995) 3160-3166
2.. Baker N.R, Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo, Annu.
Rev. Plant Biol. 59 (2008) 89-113.
3. Stefan W, Otto S. Wolfbeis. Irréversible sensing of oxygen ingress . Sensors and Actuators B 153 (2011) 199-204
4. Gardiol, A, E. Hernandez, R, J. Reinhammar, B. Harte, B, R. Development of a gas-phase oxygen biosensor using a blue copper-containing oxidase Enzyme and Microbial Technology , Volume 18 (5) Elsevier - Apr 1, 1996.
5. Gardiol, A, E. Hernandez, R, J. Reinhammar, B. Harte, B, R. Device for reducing oxygen with a reduced oxidase with color formation. Patent Number 5,654,164. Date of Patent: Aug. 5, 1997
6. Martinez V,M, Whitaker J,R. The biochemistry and control of enzymatic browning. Trends Food Sci. Tech. 6: 195-200 (1995)
7. Sanchez-Ferrer A. Rodriguez-Lopez JN. Garcia Canovas F. Garcia- Carmona F. Tyrosinase: A comprehensive review of its mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1247: 1-11 (1995)
8. Vilanova E. Manjon A. Iborra JL. Tyrosine hydroxylase activity of immobilized tyrosinase on Enzacryl-AA and CPG-AA supports: stabilization and properties. Biotchnol Bioeng 1984;26: 1306-12.
9. Algieri, L. Donato, P. Bonacci, L. Giorno. Tyrosinase immobilised on polyamide tubular membrane for the L-DOPA production: Total recycle and continuous reactor study C Biochemical Engineering Journal 66 (2012) 14- 19;
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Claims

REVENDICATIONS
1. Biodétecteur pour détecter la présence de gaz d'oxygène dans un espace fermé contenant un produit périssable en contact d'oxygène et muni d'une zone transparente qui fournit une indication visuelle de l'infiltration de l'oxygène gazeux à l'intérieur de l'espace fermé par changement de coloration du biodétecteur, comprenant :
• de la polyphénoloxydase comme catalyseur enzymatique de la réaction d'oxydation ;
• le substrat de la polyphénoloxydase configuré comme support matériel ; et
• un hydrogel solide configuré pour immobiliser la polyphénoloxydase et son substrat.
Le biodétecteur étant caractérisé en ce que le changement de coloration a lieu par réaction enzymatique irréversible en phase solide ;
2. Biodétecteur pour détecter la présence de gaz d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé en ce que la polyphénoloxydase est extraite de plantes et de fruits ;
3. Biodétecteur pour détecter la présence de gaz d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat de la polyphénoloxydase est sélectionné à partir du groupe constitué de l'acide gallique, de l'acide chlorogénique, de pyrocatéchol, des flavonoïdes et des tannins ;
4. Biodétecteur pour détecter la présence de gaz d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrogel peut être préparé à partir de toute sorte de gomme ou gel naturels telles que la gomme de tragacanthe, la gomme arabique, l'indubiose, l'agarose, l'agar-agar ;
5. Biodétecteur pour détecter la présence de gaz d'oxygène selon les revendications de 1 à 4, caractérisé en ce qu'au moins un volume de la solution d'enzyme de concentration minimale 1 mg/ml et au moins un volume de substrat de concentration minimale 2.10"2 mol/1 sont mélangés à au moins deux volumes de l'hydrogel liquide chaud ;
6. Méthode pour préparer le biodétecteur selon les revendications 1 à 5, la méthode comprenant :
• préparer la solution d'enzyme de concentration minimale de 1 mg/ml ;
• préparer la solution du substrat de concentration minimale de 2.10"2 mol/1 dans une solution tampon de pH compris entre 6 et 7.5 ; • préparer la solution d'indubiose de concentration comprise entre 2,5% et 10% ;
• chauffer la solution d'indubiose jusqu'à au moins 50°C pour obtenir le gel d'indubiose ;
7. Méthode pour préparer le biodétecteur selon les revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le mélange substrat-enzyme-hydrogel est mis sous vide en l'absence de l'oxygène pour se solidifier à la température ambiante.
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