WO2016034751A1 - Productos biocidas, aislados a partir del producto de fermentación de hongos endófitos del género guignardia sp. y su uso para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas. - Google Patents

Productos biocidas, aislados a partir del producto de fermentación de hongos endófitos del género guignardia sp. y su uso para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas. Download PDF

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Azucena GONZÁLEZ COLOMA
Carmen Elisa DÍAZ HERNÁNDEZ
Mª Fe ANDRÉS YEVES
Braulio M. FRAGA GONZÁLEZ
Patricia BOLAÑOS GONZÁLEZ
Raimundo CABRERA PÉREZ
Cristina GIMÉNEZ MARIÑO
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Universidad de La Laguna
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de La Laguna
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
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    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
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    • A01N43/28—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with two or more hetero atoms five-membered rings with two hetero atoms in positions 1,3
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    • C07D317/32—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Definitions

  • Biocidal products isolated from the fermentation product of endophytic fungi of the genus
  • the invention is within the field of agriculture, and more specifically, in the field of biocides comprising substances produced or extracted from 0 microorganisms.
  • the invention also relates to a method of obtaining said compound using endophytic fungi of the genus Guignardia sp. and to a fermentation product that comprises it together with other known compounds of general formula (II) that share structure and biocidal activity with the compound of formula (I).
  • the compounds included in the scope of the present invention are related for the first time to biocidal activity, and especially to nematicidal activity, so that the invention also has to do with the use of said compounds as biocides, both in isolation and through a composition or biocide that understands them.
  • the invention also relates to a method of controlling phytopathogens and pest organisms that affect plants and that uses the biocidal composition, the fermentation product, or the compounds included in the invention. 5 STATE OF THE TECHNIQUE
  • Endophyte fungi represent an alternative source of interesting natural products from a biological point of view. These fungi are microorganisms that colonize the interstitial spaces of the plants without becoming pathogenic for them 0 and that establish an endophyte-plant interaction that improves the ecological adaptation of the plant to the ecosystem in which it lives, increasing its tolerance to stress, to changes in temperature and salinity, and its resistance to diseases, herbivores, insects, nematodes, bacteria and fungi (Aly et al. 2010. Fungal Divers 41, 1-16).
  • the genus Guignardia (Ascomycetes) and its anamorphic genus Phyllosticta is a group of microscopic fungi that comprise important phytopathogens that affect a wide range of plant species. Some species of this genus cause black spots on the leaves and diseases of crops and ornamental plants of great economic importance, such as citrus fruits, bananas, apples, grapes, blueberries and orchids (Wikee et al. 201 1. Fungal Divers 51, 43-61 ). Species of the genus Phyllosticta are also a source of new bioactive metabolites such as fillostine and fillostoxin, which have been considered potential agents for pest control due to their phytotoxic activity (Evidente et al. 2008.
  • document W02002 / 017937 A1 refers to aqueous or organic extracts obtained from the fermentation of fungi of Guignardia sp. isolated from the leaves of the Spondias mombin tree; to fractions with biological activity obtained from the extract; and to the guignaric acid identified in said extract and which are effective against bacteria, yeasts and fungi.
  • G. manguiferae has been isolated as an endophyte from species such as // ex cornuta. In its fermentation in liquid medium, the meroterpenic compounds guignardones AC have been obtained (Yuan et ai. 2010. Eur. J. Org. Chem. 6348-6353). In the culture of G. manguiferae isolated from Garcinia hombreroniana, the AD Guignareronas (Sommart et al. 2012. Phytochemistry Letters 5,139-143). In addition to! extract from! Endophyte G.
  • manguiferae isolated from Smiiax glabra have identified the compounds: 15-hydroxytricycloalternarene, guignardianes D and C, guignardones A and B, 3- (4-methylphenoxy) -propanoic acid, nonano-2, 4-diol, ergosterol, thiol and p- hydroxybenzaldehyde (Liang et al. 2012. Ch ⁇ nese Traditional and Herbal Drugs 43, 856-860).
  • the present invention relates in a first aspect to a compound with biocidal activity isolated from a fermentation product of endophytic fungi of the genus Guignardia, of formula (I):
  • the invention relates to a process for obtaining the compound of formula (I) comprising the following steps: a) cultivating mycelium of a fungus of the genus Guignardia sp. in a culture medium until a fermented product is achieved and b) isolate the compound of formula (I) from the fermented product of the previous step.
  • the fungus of the genus Guignardia sp is a fungus of the species G. manguiferae, and more preferably, the YCC4 strain isolated from Persea leaves indicates deposited in the CECT with accession number 20914 as of July 2, 2014.
  • the invention relates to the fermented product obtained after step (a) of the process obtained and comprising the compound of formula (I) and biocidal activity.
  • the fermented product comprises a compound of general formula (II):
  • the invention relates to the use for the control of phytopathogens and pest organisms that affect plants, and preferably for the control of nematodes, of the compound of formula (I) or of the compound of general formula (II), either in isolation or in combination, or of the fermented product.
  • the invention in a fifth aspect, relates to a biocidal composition
  • a biocidal composition comprising the compound of formula (I) or the compound of general formula (II), either in isolation or in combination, or to the fermented product.
  • the invention relates to the use of the biocidal composition for the control of phytopathogens and pest organisms that affect plants, and preferably for the control of nematodes.
  • the invention relates to a method of controlling phytopathogens and pest organisms that affect plants, and preferably nematodes, which comprises administering an effective dose of the compound of formula (I) or of the compound of general formula (II ), either in isolation or in combination, or of the fermented product, or of the biocidal composition.
  • the technical problem that solves the present invention is the search for new natural active principles, which have their origin in extracts obtained from fermentation with endophytic fungi, and which due to their biocidal activity can be used in the control of phytopathogens and pest organisms that affect to plants, and especially nematodes, in an effective and environmentally friendly way. It has been found that a compound of formula (I) obtained from a fermentation product of a strain of Guignardia manguiferae fungus isolated from Persea indica leaves (see examples 1 to 4), exhibits biocidal activity (see examples 5 and 6 ), and that this one is especially considerable against nematodes (see example 7).
  • the main technical advantages of the compounds that are included within the scope of the invention, of their method of obtaining, as well as of their use for the control of phytopathogens and pest organisms that affect plants are listed below:
  • the inventors of the present invention have identified, for the first time, a bioactive compound with biocidal activity obtained from a fermentation with endophytic fungi of the genus Guignardia sp, thanks to its characterization based on physical and spectroscopic data, and by comparison of same with those published in the bibliography.
  • a bioactive compound with biocidal activity obtained from a fermentation with endophytic fungi of the genus Guignardia sp, thanks to its characterization based on physical and spectroscopic data, and by comparison of same with those published in the bibliography.
  • other compounds known as guignaric acid Rodrigues-Heerklotza et al. 2001. Helv. Chim. Acta 84, 3766-3772
  • the methyl ester of penguignardic acid Andernach et al. . 2013.
  • the invention relates to a compound with biocidal activity that is isolated from a fermentation product with endophytic fungi of the genus Guignardia sp. and of formula (I), hereinafter compound of the invention,
  • all the compounds included in the scope of the invention can include isomers, depending on the presence of multiple bonds, including optical isomers or enantiomers, depending on the presence of chiral centers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof fall within the scope of the present invention, that is, the term isomer also refers to any mixture of isomers, such as diastereomers, racemic, etc., even their optically isomers. assets or mixtures in different proportions thereof.
  • the individual enantiomers or diastereoisomers, as well as mixtures thereof, can be separated by conventional techniques.
  • the invention relates to a method of obtaining the compound of the invention, hereinafter method of obtaining the invention, which comprises the following steps: a) cultivating mycelium of a fungus of the genus Guignardia sp. capable of producing the compound of formula (I) in a culture medium until a fermented product is achieved and b) isolating the compound of formula (I) from the fermented product of the previous stage.
  • fungi of the genus Guignardia sp. have the ability to produce the compound of the invention. It is the endophyte-host plant interaction that gives the fungus certain characteristics that enable the production of certain compounds.
  • fungus of the genus Guignardia sp. capable of producing the compound of the invention is understood as any strain of a fungus of the genus Guignardia sp. that due to its interaction with the host plant has developed the characteristics necessary to produce the compounds of the invention.
  • the fungus strain of the genus Guignardia sp. belongs to the species G. manguiferea.
  • the strain of the fungus of the Guignardia manguiferae species is the YCC4 strain of G. manguiferae isolated from Persea indica leaves deposited on July 2, 2014 in the Spanish Type Culture Collection with CECT 20914, following the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of the Patent Procedure.
  • the YCC4 strain of G. manguiferae isolated from Persea leaves indicates deposited in the Spanish Type Culture Collection with CECT 20914 on July 2, 2014, is grown using a modified Czapek-Dox liquid medium.
  • fermented product is meant a product that is the result of the action of the endophytic fungus on the culture medium and comprising the compound of the invention.
  • the fermented product can be a dry extract obtained by extraction with organic solvent prior filtration, or a lyophilisate.
  • organic solvents that are used in the scope of the invention are dichloromethane, ethyl ether and, preferably, ethyl acetate.
  • fermented product which is obtained after step (a) of the process of the invention that has biocidal activity and which comprises the compound of the invention, hereinafter fermented product of the invention, is also included.
  • the fermented product of the invention comprises a compound of general formula (II),
  • R1 is selected from methylethyl and R2 methylphenyl and is selected from CH 3, ethylphenyl and H, or an isomer, salt or solvate thereof.
  • R1 is methyl ethyl and R2 is CH3 and is Guignardianone C.
  • R1 is methylphenyl and R2 is ethylphenyl and is Guignardianone D.
  • R1 is methylphenyl and R2 is CH3 and is the methyl ester of penguignaric acid.
  • R 1 is methyl ethyl and R 2 is H and is the guignaric acid.
  • the compounds of general formula (II) included in the scope of this invention share biocidal structure and activity with the compound of the invention and also have the same origin.
  • the isolation of the compounds included in the scope of the invention starting from the fermented product is carried out by fractionation techniques.
  • Fractionation techniques known to any person skilled in the art, and which make it possible to obtain the compounds included in the scope of the invention, are for example and without limitation, liquid vacuum chromatography (VLC-1), column chromatography (CC), column chromatography (CC) using different solid phases (Silica Gel, Sephadex LH-20) and high performance liquid chromatography (HPLC), eluting with different polarity gradients by different combinations of organic solvents.
  • VLC-1 liquid vacuum chromatography
  • CC column chromatography
  • CC column chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the fermented product of the invention is the crude product that is obtained after step (a) of the process of the invention, but also any successive fraction or subfraction obtained from said product and that is obtained by the fractionation techniques that are collected in the description.
  • Biocidal activity means the ability to control at least one phytopathogen or pest organism that affects plants through different mechanisms of action. Said control includes the prevention of the action or the direct destruction of said organisms harmful to public health and also for agriculture during production, but also extends to the storage, transport, distribution and processing of agricultural products and their derivatives. Examples of phytopathogens and Pest organisms that affect plants and that are included in the present invention are although not limited to, nematodes, fungi and pest insects.
  • the invention relates to the use for the control of phytopathogens and pest organisms that affect plants, and preferably for the control of nematodes, of the compound of the invention, or of the compound of general formula (II), either in isolation or in combination, or of the fermented product of the invention.
  • the activity against insect pests can be determined by different types of bioassays that include anti-food activity (inhibition of food and / or settlement in the case of aphids), repellent or toxic, among others (see example 5).
  • insects against which the compound of the invention, the fermented product of the invention and the compound of general formula (II) are effective are mainly herbivorous pest insects with different trophic adaptations, whether chewing or sucking, and which may have a high incidence on horticultural crops causing serious economic losses, developing resistance to synthetic insecticides and presenting virus transmission capacity.
  • Examples, by way of illustration and not limitation, of orders and species of herbivorous pest insects with different trophic adaptations, chewers or suckers are Lepidoptera, Homoptera and Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, respectively.
  • the compound of the invention and the fermented product of the invention comprise a bioinsecticidal activity against Spodoptera littoralis and Myzus persicae insects, greater than 80%.
  • guignardianone C and guignaric acid comprise a bioinsecticidal activity against at least one insect selected from Spodoptera littoralis and Myzus persicae, greater than 80%.
  • the activity against fungi is determined by assays of inhibition of mycelium growth in plaque.
  • Examples of fungi against which the fermented product of the invention is effective are Fusarium and Botrytis.
  • the activity against nematodes is related to toxicity, that is, the ability to interrupt a specific phase of the nematode's life cycle, preventing its development.
  • nematicidal activity is determined, for example, by determining the percentage of infective juveniles (J2) killed after 24, 48 and 72 hours after the application of the extract (see example 7), as well as through the determination of the effects of the treatment on the hatching of the eggs after 5 days of treatment of the egg masses and by the determination of the effects of sublethal concentrations on the capacity of infection of the juveniles in the roots of tomato seedlings .
  • the nematodes against which the compound of the invention, the fermented product of the invention and the compound of general formula (II) are effective, are preferably root nodule-forming nematodes (Meloidogyne sp).
  • An example of a nodule-forming nematode is the Meloidogine javanica, a polyphagous species, capable of parasitizing more than 3,000 species of crop plants, including extensive, horticultural and fruit crops, seriously affecting production (Agrios. 2005. Plant Pathology, Fifth edition, Elsevier / Academic, Amsterdam), and causing annual economic losses of billions of euros (Singh et al. 2013. OEPP / EPPO Bulletin 43 (2), 334-374).
  • the compound of the invention or the fermented product of the invention comprises a nematicidal activity preferably of up to 85%, more preferably of up to 95% and even more preferably of up to 100% when used in a concentration.
  • a nematicidal activity preferably of up to 85%, more preferably of up to 95% and even more preferably of up to 100% when used in a concentration.
  • 0.5 mg / ml and 1 mg / ml respectively at 24, 48 and 72 hours of treatment.
  • the fermented product of the invention comprises a nematicidal activity manifested by inhibition, preferably 98% of egg hatching after 72 hours of treatment when used at the concentration of 1 mg / ml and suppression. preferably 60% of the infective capacity when used at a concentration of 0.5 mg / ml.
  • guignardianone D and the methyl ester of penguignaric acid comprise a nematicidal activity preferably of up to 90%, more preferably up to 95% and still more preferably 100% when used in a concentration of 0.5 mg / ml.
  • the invention in another aspect, relates to a biocidal composition
  • a biocidal composition comprising the compound of formula (I), or the compound of general formula (II), either in isolation or in combination, or to the fermented product, hereinafter biocidal composition of the invention.
  • the biocidal composition of the invention can additionally comprise various vehicles and agents that facilitate its conservation, handling and application.
  • phytosanitary products solid vehicles, liquid vehicles, gaseous vehicles, etc. are usually used, and, if necessary, surfactants and auxiliary agents for the formulation of phytosanitary compositions such as, for example, an additive for formulating forms such as emulsifiable concentrates, wettable powders, flowable liquids (eg, water suspension, water emulsion, etc.), powders, aerosols, ULV and the like.
  • surfactants and auxiliary agents for the formulation of phytosanitary compositions such as, for example, an additive for formulating forms such as emulsifiable concentrates, wettable powders, flowable liquids (eg, water suspension, water emulsion, etc.), powders, aerosols, ULV and the like.
  • solid carriers examples include fine powders or clay granules (eg kaolin clay, diatomaceous earth, synthetic hydrated silicon oxide, bentonite, Fubasami clay, acid clay, etc.), talc, ceramics and other inorganic minerals (eg, sericite, quartz, sulfur, active carbon, calcium carbonate, hydrated silica, etc.), commercial fertilizers (eg, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea, ammonium chloride, etc. ) and the like.
  • clay granules eg kaolin clay, diatomaceous earth, synthetic hydrated silicon oxide, bentonite, Fubasami clay, acid clay, etc.
  • talc ceramics and other inorganic minerals
  • ceramics and other inorganic minerals eg, sericite, quartz, sulfur, active carbon, calcium carbonate, hydrated silica, etc.
  • commercial fertilizers eg, ammonium sulfate, ammonium
  • liquid vehicles examples include water, alcohols (eg, methanol, ethanol, etc.), ketones (eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.), aromatic hydrocarbons (eg, benzene , toluene, xylene, ethylbenzene, methylnaphthalene, etc.), aliphatic hydrocarbons (eg hexane, cyclohexane, kerosene, gas oil, etc.), esters (eg, ethyl acetate, butyl acetate, etc.), nitriles (eg, acetonitrile , isobutyronitrile, etc.), ethers (eg, diisopropyl ether, dioxane etc.), acid amides (eg, N, N-dimethylformamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacetamide, etc.), halogenated hydrocarbons
  • alcohols eg,
  • Examples of a gaseous vehicle that are included in the scope of the invention are spray agents, including flon gas, butane gas, LPG (liquid petroleum gas), dimethyl ether, carbon dioxide gas and the like.
  • Examples of surfactant that are included in the scope of the invention are alkyl sulfates, alkyl sulfonate salts, alkyl aryl sulfonates, alkyl aryl esters, polyoxyethylene compounds thereof, polyethylene glycol esters, polyhydroxy alcohol esters, sugar alcohol derivatives and the like.
  • auxiliary agent for the formulation as fixing agent and dispersing agent examples include casein, gelatin, polysaccharides (eg, starch powder, gum arabic, cellulose derivative, alginic acid, etc.) , derivatives of lignin, bentonite, sugars, synthetic water-soluble polymers (eg, vinyl polyol, vinyl polypyrrolidone, acrylic polyacids, etc.) and the like.
  • stabilizers examples include PAP (isopropyl acid phosphate), BHT (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol), BHA (mixture of 2-tert-butyl- 4-methoxyphenol and 3-tert-butyl-4-methoxyphenol), vegetable oils, mineral oils, surfactants, fatty acids or esters thereof and the like.
  • the compound of the invention, the compound of general formula (II), the fermented product of the invention and the biocidal composition of the invention can be used in conjunction with at least one additional active ingredient.
  • additional active ingredient are nematicides, insecticides, acaricides, fungicides, herbicides, plant growth regulators, synergists, fertilizers, soil conditioners and animal baits.
  • the invention relates to the use of the biocidal composition of the invention for the control of phytopathogens and pest organisms that affect plants, and preferably for the control of nematodes.
  • the invention in another aspect, relates to a method of control of phytopathogens and pest organisms that affect plants, and preferably for the control of nematodes, which comprises administering an effective dose of the compound of the invention, or of the compound of general formula (II), either in isolation or in combination, or of the fermented product of the invention or of the biocidal composition of the invention.
  • the application can be directly sprayed on the pest organism, or on the substrate in which the phytopathogens are found.
  • the “effective dose” may optionally increase or decrease depending on whether the compound of the invention, the compound of general formula (II), the fermented product of the invention, or the biocidal composition of the invention, of the type of formulation, of the formulation is used. time, place and method of application, the type of phytopathogen or pest organism that affects the plant and the degree of damage.
  • the endophyte G fungus, manguiferae was isolated from leaves of the Persea indica tree, collected in the Anaga Rural Park (Las Mercedes, Tenerife). Said fungus was deposited with the CECT on July 2, 2014 and with accession number 20914 following the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of the Patent Procedure.
  • the fresh plant material was superficially sterilized with sodium hypochlorite (65%), ethanol (75%) and sterile distilled water. Small samples of explants (leaves) were placed in Petri dishes with PDA medium and incubated at 27 ° C. The pure culture was obtained individually isolating a colony grown in this environment and was periodically replicated for maintenance.
  • the fungus was identified at the molecular level based on the amplification (PC) and sequencing of the ribosomal ITS region of the rDNA extracted from a mycelium sample (Arenal et al. 2000. Mycological Research 104, 2000, 301-303), The fungus It was identified as G. manguiferae by comparison of the sequence ITS1-5.8S-ITS2 of the rDNA with those deposited in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) (GenBank accession number gi255068992).
  • PC amplification
  • GenBank accession number gi255068992 GenBank accession number gi255068992
  • YCC4 was grown in PDA medium in Petri dishes for 15 days at a temperature of 27 ° C. 10 ml of sterile distilled water was added and the surface of the mycelium was gently scraped with a spatula. This mycelium suspension was poured into an eriermeyer (250ml) with 100 ml Czapek-Dox-Yeast liquid medium [Cz-L: NaN0 3 (2 g / l), KH 2 P0 4 (5 g / l), MgS0 4 ( 0.5 g / l), FeSO 4 (0.01 g / l), ZnS0 4 (0.003 g / l), yeast extract (1 g / l) and glucose (60 g / l)] and grown at a temperature of 25 ° C in continuous agitation (120 rpm) for 4 days.
  • the dried crude extract (10.5 g) obtained according to Example 2 was fractionated by a vacuum liquid chromatography (VLC) using as eluent increasing polarity mixtures of n-hexane / ethyl acetate and ethyl acetate / methanol resulting in 9 fractions .
  • Fraction 1 n-hexane / 25% ethyl acetate
  • Fraction 1 was chromatographed on a medium pressure flash column using an elution system n-hexane / ethyl acetate in order of increasing polarity.
  • Guignardianone A (Buckel et al. 2013.
  • Fraction 2 of the extract was chromatographed on a silica gel medium pressure column with mixtures of increasing polarity of n-hex / AcOEt and AcOEt / MeOH and guignardianone A (430 mg), guignardone A (80) were isolated again. mg), which were previously obtained in fraction 1 of the extract.
  • guignardone B was isolated (Yuan et al. 2010. Eur. J. Org. Chem.
  • the high and low resolution mass spectra were recorded on a Micromass Autospec® spectrometer, with direct introduction of the samples by means of a solids probe.
  • the technique used was the electronic impact (IE) with an ionization potential of 70 eV and a source temperature of 230 ° C.
  • the signals are described in units of mass / load ratio (m / z) and in brackets the relative intensity (int. Laugh) of each signal with respect to the base peak (100%) is indicated. For each compound, only the most structurally significant and / or the highest relative intensity peaks are indicated.
  • insects The breeding and maintenance of insects was carried out in a temperature controlled chamber at 24 + 1 ° C, 60-70% relative humidity and a photoperiod of 16: 8 hours (light: dark).
  • the larvae of S. littoralis were maintained on a semi-synthetic diet (Poitut and Bues. 1970. Ann. Zool. Ecol. Anim. 2, 79-91) and aphids on their host plants, pepper (Capsicum annum L.) for M persicae Food activity trials were performed with newly emerged larvae of the sixth stage of S. littoralis and aphid adult aphids.
  • leaf discs 1.0 cm 2 ) of pepper (Capsicum annum L.), were treated with 10 ⁇ 10 of the sample.
  • Each test consisted of 5 Petri dishes with two larvae per plate (S. littoralis) or twenty boxes (2x2 cm) with ten aphids of M. persicae incubated in a growth chamber under the same conditions described for insect breeding. After consuming 75% of the surface of the control discs (S. littoralis) or after 24 h (aphids) the consumption index (% FI) or settlement (% SI), respectively, was calculated.
  • Compounds with a Fl / SI> 70% were tested in a dose-response experiment to calculate their relative potency (EC 50 , is the effective dose for a 50% reduction in feed).
  • Table 2 Anti-food activity of compounds with biocidal activity and dry crude extract against pest insects, applied at a concentration of 50 ⁇ / ⁇ 2 mg / l culture ⁇ / ⁇ ' 1 S.littoralis M. persicae
  • the agar dilution method was used to determine the antifungal activity (Murabayashi et al. 1991. J. Pesticide Sci. 16, 419-427).
  • Samples of the dry crude extract obtained according to Example 2 were incorporated into the culture medium (5 ml) at 5 different concentrations (1, 0.5, 0.1, 0.05 and 0.01 mg / ml).
  • controls were prepared with ethanol at a concentration of 2%.
  • the sowing of the target organisms was done by bite (Fusarium) or with 5 mm diameter discs (B. cinerea). Colonies grown in Petri dishes and incubated for 48 h were digitized and measured using the ImageJ 1.43 program.
  • the effective dose of growth inhibition (EC 50 ) was determined by linear regression analysis (% inhibition of the dose log). Table 3. Fungal activity of dry crude extract
  • the dried crude extract obtained according to Example 2 showed a moderate antifungal activity against F. solani and F. oxysporum and B. cinérea.
  • the activity of the dry crude extract obtained according to example 2 and of the compounds with biocidal activity was quantified to a final concentration per well of 1.0 / 0.5 mg / ml, respectively, each treatment was repeated four times and the nematicidal activity was determined from the percentage of infectious juveniles killed after 72 hours, in the cases in which a rate of Mortality> 99% dose-response experiments were performed to determine LC 50 and LCg 0 (Table 4).
  • the activity of the dry crude extract obtained according to example 2 on the hatching of the eggs was quantified at a final concentration per well of 1.0 mg / ml. He treatment was repeated four times and hatching suppression activity was determined from the percentage of hatched juveniles of egg masses in two stages: immediately after 5 days of treatment and after 28 days of immersion in water (Table 5 ).
  • the activity of the dry crude extract obtained according to example 2 on the juvenile infection capacity was quantified at a final concentration per well of 0.5 mg / ml and the inhibitory activity of the infective capacity was determined from the percentage of juveniles treated for 72 h that have penetrated the roots of tomato seedlings (Table 5).
  • the activity of the dry crude extract obtained according to example 2 on the inoculum (Pi) of M. javanica was determined in an experimental test in vivo in pots with tomato plants in plant growth chambers (temperature: 25 ° C and photoperiod D: N 16: 8).
  • the dried crude extract was quantified at a final concentration of 0.42 mg / ml which constituted the treatment applied to the clay-sandy substrate of 10 pots of 1 kg capacity previously inoculated with an initial population (Pi) of 2000 J2 eggs of M javanica and to which tomato seedlings var. Marmande one month old.
  • As a control another 10 pots were considered, with the same characteristics as those described, but treated with distilled water.
  • the effectiveness of the treatment was analyzed after two months by quantifying and comparing a series of population parameters of the nematode: number of masses of eggs and number of eggs (final population, Pf) recovered from the radical systems of the plants, as well as from the significant variation in the reproduction rate (Pf / Pi) of the population of M. javanica in the pots with the treatment with respect to those of the control.
  • Example 8 Phytotoxic activity The phytotoxic activity of the dry crude extract obtained according to example 2 was evaluated against seeds of Lactuca sativa Maria (Fito, Spain), Lolium perenne and Lycopersicon esculentum. The experiments were carried out in 12-well plates (Falcon), applying 20 ⁇ (10 ⁇ g / ⁇ l) on 2.5 cm diameter paper discs placed at the bottom of each well. 500 ⁇ of distilled water, 10/5 seeds, and the plates were incubated in a growth chamber at 25 ° C, 70% relative humidity and a photoperiod 16:08 L: O. Seed germination was counted. for six days and elongation of the roots at the end of the experiment. Data were analyzed by analysis of variance (ANOVA).
  • ANOVA analysis of variance
  • Juglone (5 g / l) was used as a positive control of germination inhibition. No significant effects were observed in the germination of L. perenne, L. sativa and L. esculetum, although it has a slight inhibition of the germination of the monocotledonea L. perenne and reduces its growth without affecting the dicotyledons L. sativa and L. esculentum (Table 7).

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Abstract

Las enfermedades y plagas constituyen un importante problema en el campo de la agricultura. La presente invención propone un nuevo compuesto de fórmula (I) con actividad biocida, aislado a partir del producto de fermentación de hongos endófitos del género Guignardia sp. La invención también se refiere al método de obtención del compuesto de fórmula (I), a un producto de fermentación que lo comprende junto a otros compuestos conocidos que comparten estructura y actividad biocida con el compuesto de fórmula (I) y al uso de dichos compuestos como biocidas, y especialmente como nematicidas, bien directamente o a través de una composición, constituyendo de este modo un efectivo método de control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas.

Description

Productos biocidas, aislados a partir del producto de fermentación de hongos endófitos del género
Guignardia sp. y su uso para el control de fitopatogenos y organismos plaga que afectan a plantas.
DESCRIPCIÓN
5
SECTOR DE LA INVENCION
La invención se sitúa dentro del campo de la agricultura, y más concretamente, en el sector de los biocidas que comprenden sustancias producidas o extraídas de 0 microorganismos. Se propone un nuevo compuesto de fórmula (I) con actividad biocida aislado a partir de un producto de fermentación de hongos endófitos del género Guignardia sp. La invención también se refiere a un método de obtención de dicho compuesto que utiliza hongos endófitos del género Guignardia sp. y a un producto de fermentación que lo comprende junto a otros compuestos conocidos de 5 fórmula general (II) que comparten estructura y actividad biocida con el compuesto de fórmula (I). Los compuestos que se incluyen en el ámbito de la presente invención se relacionan por primera vez con actividad biocida, y especialmente con actividad nematicida, por lo que la invención también tiene que ver con el uso de dichos compuestos como biocidas, tanto de forma aislada como a través de una composición 0 biocida que los comprenda. En último lugar, la invención también se refiere a un método de control de fitopatogenos y organismos plaga que afectan a plantas y que utiliza a la composición biocida, al producto de fermentación, o a los compuestos incluidos en la invención. 5 ESTADO DE LA TECNICA
Los hongos endófitos representan una fuente alternativa de productos naturales interesantes desde el punto de vista biológico. Estos hongos son microorganismos que colonizan los espacios intersticiales de las plantas sin llegar a ser patógenos para ellas 0 y que establecen una interacción endófito-planta que mejora la adaptación ecológica de la planta al ecosistema en el que habita, aumentando su tolerancia al estrés, a cambios de temperatura y salinidad, y su resistencia frente a enfermedades, herbívoros, insectos, nematodos, bacterias y hongos (Aly et al. 2010. Fungal Divers 41 , 1-16).
5 El género Guignardia (Ascomycetes) y su género anamorfo Phyllosticta es un grupo de hongos microscópicos que comprenden importantes fitopatógenos que afectan a un amplio rango de especies vegetales. Algunas especies de este género provocan manchas negras en las hojas y enfermedades de cultivos y plantas ornamentales con gran importancia económica, como cítricos, plátanos, manzanas, uvas, arándanos y orquídeas (Wikee et al. 201 1 . Fungal Divers 51 , 43-61 ). Especies del género Phyllosticta son también fuente de nuevos metabolitos bioactivos como fillostina y fillostoxina, que se han considerado agentes potenciales para el control de plagas por su actividad fitotóxica (Evidente et al. 2008. J. Agrie. Food Chem. 56, 884-888). En el cultivo del hongo G. bidwelli se han identificado nuevos compuestos fitotóxicos como el ácido penguignárdico y otros siete metabolitos secundarios: ácido alaguignárdico y las guignardianonas A-E (Molitor et al. 2012. J. Nat. Prod. 75, 1265-1269; Buckel et al. 2013. Phytochemistry 89, 96-103), estructuralmente relacionados con el ácido guignárdico (Rodrigues-Heerklotz et al. 2001 . Helv. Chim. Acta. 84, 3766-3772).
Se ha descrito una reducida capacidad biocida contra hongos, insectos y parásitos de algunos extractos de Guignardia manguiferae aislados de distintos huéspedes (Giménez, C. 2006. Productos bioactivos de plantas canarias y sus hongos endófitos: detección de actividad y utilización en el control de plagas y enfermedades agrícolas Universidad de la Laguna. Tesis de doctorado.); y también un moderado nivel de actividad fungicida contra la enfermedad Sclerotinia del garbanzo de un extracto de etilacetato obtenido a partir del hongo endófito Guignardia cammillae aislado de J. curcus (Susheel et al. 2013. Píos One 8 (2), e56202). Por su parte y dentro de la literatura patente, el documento W02002/017937 A1 se refiere, a extractos acuosos u orgánicos obtenidos a partir de la fermentación de hongos de Guignardia sp. aislados de las hojas del árbol Spondias mombin; a fracciones con actividad biológica obtenidas a partir del extracto; y al ácido guignárdico identificado en dicho extracto y que son efectivos contra bacterias, levaduras y hongos.
La G. manguiferae se ha aislado como endófito de especies como //ex cornuta. En su fermentación en medio líquido se han obtenido los compuestos meroterpénicos guignardonas A-C (Yuan et ai. 2010. Eur. J. Org. Chem. 6348-6353). En el cultivo de G. manguiferae aislado de Garcinia hombroniana se han identificado las guignareronas A-D (Sommart et al. 2012. Phytochemistry Letters 5,139-143). Además, de! extracto de! endófito G. manguiferae aislado de Smiiax glabra se han identificado los compuestos: 15-hidroxitricicloalternareno, guignardiaenos D y C, guignardonas A y B, ácido 3-(4-metilfenoxi)-propanoico, nonano-2, 4-diol, ergosterol, tirasol y p- hidroxibenzaldehido (Liang et al. 2012. Chínese Traditional and Herbal Drugs 43, 856- 860).
Tradicionalmente el método habitual para el control de fitopatogenos y organismos plaga que afectan a plantas ha sido la aplicación de productos químicos de síntesis, que además de su alto precio económico implica un grave coste ambiental. Sin embargo, el nuevo entorno regulatorio, véase por ejemplo tanto a nivel nacional como europeo el Reglamento (CE) N° 1 107/2009, ha limitado drásticamente el número de materias activas y la disponibilidad de los productos fitosanitarios destinados al control de las enfermedades causadas por estos patógenos. Por todo ello actualmente existe una necesidad clara de búsqueda y desarrollo de nuevas compuestos activos alternativos eficaces y menos tóxicos entre los que los productos naturales procedentes del metabolismo secundario de microorganismos pueden presentar un gran potencial. EXPLICACION DE LA INVENCION
Breve descripción
La presente invención se relaciona en un primer aspecto con un compuesto con actividad biocida aislado a partir de un producto de fermentación de hongos endófitos del género Guignardia, de fórmula (I):
Figure imgf000004_0001
(I) o un isómero, una sal o un solvato del mismo. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (I) que comprende las siguientes etapas: a) cultivar micelio de un hongo del género Guignardia sp. en un medio de cultivo hasta conseguir un producto fermentado y b) aislar al compuesto de fórmula (I) a partir del producto fermentado de la etapa anterior.
Preferentemente el hongo del género Guignardia sp. es un hongo de la especie G. manguiferae, y más preferentemente, la cepa YCC4 aislada de hojas de Persea indica depositado en la CECT con número de acceso 20914 en fecha 2 julio de 2014.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con el producto fermentado que se obtiene tras la etapa (a) del procedimiento obtención y que comprende al compuesto de fórmula (I) y actividad biocida.
Adicionalmente, el producto fermentado comprende un compuesto de fórmula general (II):
Figure imgf000005_0001
(II)
donde R1 se selecciona entre metiletil y metilfenil y R2 se selecciona de entre CH3, etilfenil y H, o un isómero, una sal o un solvato del mismo. En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas, y preferentemente para el control de nematodos, del compuesto de fórmula (I) o del compuesto de fórmula general (II), ya sea de forma aislada o en combinación, o del producto fermentado.
En un quinto aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida que comprende al compuesto de fórmula (I) o al compuesto de fórmula general (II), ya sea de forma aislada o en combinación, o al producto fermentado.
En un sexto aspecto, la invención se relaciona con el uso de la composición biocida para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas, y preferentemente para el control de nematodos. En un último aspecto, la invención se relaciona con un método de control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas, y preferentemente de nematodos, que comprende administrar una dosis eficaz del compuesto de fórmula (I) o del compuesto de fórmula general (II), ya sea de forma aislada o en combinación, o del producto fermentado, o de la composición biocida.
Descripción detallada de la invención
El problema técnico que resuelve la presente invención es la búsqueda de nuevos principios activos naturales, que tienen su origen en extractos obtenidos de la fermentación con hongos endófitos, y que por su actividad biocida puedan ser utilizados en el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas, y especialmente de nematodos, de una forma efectiva y respetuosa con el medio ambiente. Se ha descubierto que un compuesto de fórmula (I) obtenido a partir de un producto de fermentación de una cepa de hongo Guignardia manguiferae aislada de las hojas de Persea indica (ver ejemplos 1 a 4), presenta actividad biocida (ver ejemplos 5 y 6), y que ésta, es especialmente considerable contra nematodos (ver ejemplo 7). Las principales ventajas técnicas de los compuestos que se incluyen dentro del ámbito de la invención, de su procedimiento de obtención, así como de su uso para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas se enumeran a continuación:
-se obtienen de fuentes naturales, por procedimientos sencillos y económicos,
-se pueden obtener a gran escala por fermentación del microorganismo en biorreactores y las condiciones de fermentación se pueden manipular para aumentar la producción de componentes activos,
-son efectivos simultáneamente contra varios patógenos,
-son singularmente efectivos contra nematodos, alcanzando en este caso una efectividad superior al 99%, muy por encima, por ejemplo, del producto Abamectina (AVICTA®) que presenta un valor de en torno al 35 % en condiciones experimentales similares.
Los inventores de la presente invención han identificado, por primera vez, un compuesto bioactivo con actividad biocida obtenido a partir de una fermentación con hongos endófitos del género Guignardia sp, gracias a su caracterización en base a datos físicos y espectroscópicos, y por comparación de los mismos con los publicados en la bibliografía. Adicionalmente al compuesto de fórmula (I) se han identificado otros compuestos conocidos como son el ácido guignárdico (Rodrigues-Heerklotza et al. 2001 . Helv. Chim. Acta 84, 3766-3772), el metil ester del ácido penguignardico (Andernach et al. 2013. European Journal of Organic Chemistry 26, 5946-5951 ), las guignardonas A y B (Yuan et al. 2010. Eur. J. Org. Chem, 8348-6353), las guignarenonas B y C (Sommart et al. 2012. Phytochemistry Lett. 5, 139-143), las guignardianonas A, C (1 ) y D (2) y E (Buckel et al. 2013. Phytochemistry 89, 96-103) y el ácido 3,4 dihidroxibenzoico.
En un aspecto, la invención se relaciona con un compuesto con actividad biocida que se aisla a partir de un producto de fermentación con hongos endófitos del género Guignardia sp. y de fórmula (I), en adelante compuesto de la invención,
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o un isómero, una sal o un solvato del mismo.
En el ámbito de la invención se utilizan indistintamente los términos compuesto de fórmula (I) o ácido metguignárdico.
De forma general, todos los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales y solvatos aceptables de todos los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención o de cualquier otro compuesto que, cuando se aplica a un fitopatogeno o a un organismo plaga que afecta a plantas, es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento. Los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. Los métodos de solvatacion se conocen generalmente dentro de la técnica. En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del compuesto de la invención, en adelante procedimiento de obtención de la invención, que comprende las siguientes etapas: a) cultivar micelio de un hongo del género Guignardia sp. con capacidad para producir al compuesto de fórmula (I) en un medio de cultivo hasta conseguir un producto fermentado y b) aislar al compuesto de fórmula (I) a partir del producto fermentado de la etapa anterior.
No todos los hongos del género Guignardia sp. presentan la capacidad de producir el compuesto de la invención. Es la interacción endófito-planta hospedadora la que confiere al hongo unas características determinadas que posibilitan la producción de determinados compuestos. Por este motivo, en la presente invención por hongo del género Guignardia sp. con capacidad para producir el compuesto de la invención se entiende cualquier cepa de un hongo del género Guignardia sp. que debido a su interacción con la planta hospedadora ha desarrollado las características necesarias para producir los compuestos de la invención. Preferentemente la cepa del hongo del género Guignardia sp. pertenece a la especie G. manguiferea. Más preferentemente, la cepa del hongo de la especie Guignardia manguiferae es la cepa YCC4 de G. manguiferae aislada de hojas de Persea indica depositada en fecha 2 julio de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo con CECT 20914, siguiendo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes.
Ejemplos de medios de cultivo que permiten la fermentación de los hongos del género Guignardia sp. son PDB (potato dextrose broth); los medios citados en las referencias Molitor et al (2012. J. Nat. Prod. 75, 1265-1269) y Buckel et al (2013. Phytochemistry 89, 96-103); los que se citan en el documento W02002017937 A1 o cualquier otro medio de cultivo comercial para hongos fitopatógenos. En una realización particular, la cepa YCC4 de G. manguiferae aislada de hojas de Persea indica depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con CECT 20914 en fecha 2 julio de 2014 se cultiva utilizando un medio líquido Czapek-Dox modificado. Por "producto fermentado" se entiende un producto que es el resultado de la acción del hongo endófito sobre el medio de cultivo y que comprende al compuesto de la invención. El producto fermentado puede ser un extracto seco obtenido por extracción con solvente orgánico previa filtración, o un liofilizado. Ejemplos de solventes orgánicos que se utilizan en el ámbito de la invención son diclorometano, éter etílico y, preferentemente, acetato de etilo.
En el ámbito de la presente invención, también se incluye el producto fermentado que se obtiene tras la etapa (a) del procedimiento de la invención que cuenta con actividad biocida y que comprende al compuesto de la invención, en adelante producto fermentado de la invención.
Adicionalmente, el producto fermentado de la invención comprende a un compuesto de fórmula general (II),
Figure imgf000010_0001
(II)
donde R1 se selecciona de entre metiletil y metilfenil y R2 se selecciona de entre CH3, etilfenil y H, o un isómero, una sal o un solvato del mismo.
En una realización particular, en el compuesto de fórmula general (II) R1 es metiletil y R2 es CH3 y es la Guignardianona C. En otra realización particular, en el compuesto de fórmula general (II) R1 es metilfenil y R2 es etilfenil y es la Guignardianona D.
En otra realización particular, en el compuesto de fórmula general (II) R1 es metilfenil y R2 es CH3 y es el metil éster del ácido penguignárdico.
En otra realización particular, en el compuesto de fórmula general (II) R1 es metiletil y R2 es H y es el acido guignárdico. Los compuestos de fórmula general (II) que se incluyen en el ámbito de esta invención comparten estructura y actividad biocida con el compuesto de la invención y además tienen el mismo origen.
El aislamiento de los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención partiendo del producto fermentado se realiza por técnicas de fraccionamiento.
Técnicas de fraccionamiento conocidas por cualquier experto en el estado de la técnica, y que permiten obtener a los compuestos incluidos en el ámbito de la invención, son por ejemplo y sin limitarse, cromatografía líquida de vacío (VLC-1 ), cromatografía en columna (CC), cromatografía en columna (CC) empleando diferentes fases sólidas (Gel de Sílice, Sephadex LH-20) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), eluyéndose con distintos gradientes de polaridad mediante diferentes combinaciones de disolventes orgánicos. El producto fermentado de la invención es el producto crudo que se obtiene tras la etapa (a) del procedimiento de la invención, pero también cualquier fracción o subfracción sucesiva obtenida a partir de dicho producto y que se obtiene por las técnicas de fraccionamiento que se recogen en la descripción. Por "actividad biocida" se entiende la capacidad de controlar al menos un fitopatógeno u organismo plaga que afecte a plantas a través de diferentes mecanismos de acción. Dicho control comprende la prevención de la acción o la destrucción directa de dichos organismos perjudiciales para la salud pública y también para la agricultura durante la producción, pero también se extiende al almacenamiento, transporte, distribución y elaboración de productos agrícolas y sus derivados. Ejemplos de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas y que se incluyen en la presente invención son aunque sin limitarse, nematodos, hongos e insectos plaga.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso para el control de fitopatogenos y organismos plaga que afectan a plantas, y preferentemente para el control de nematodos, del compuesto de la invención, o del compuesto de fórmula general (II), ya sea de forma aislada o en combinación, o del producto fermentado de la invención.
La actividad contra insectos plaga se puede determinar mediante diferentes tipos de bioensayos que incluyen actividad antialimentaria (inhibición de la alimentación y/o asentamiento en el caso de áfidos), repelente o tóxica, entre otras (ver ejemplo 5).
Los insectos contra los que es efectivo el compuesto de la invención, el producto fermentado de la invención y el compuesto de fórmula general (II) son principalmente insectos-plaga herbívoros con diferentes adaptaciones tróficas, ya sean masticadores o chupadores, y que pueden presentar una alta incidencia sobre cultivos hortícolas provocando graves pérdidas económicas, desarrollar resistencias a insecticidas de síntesis y presentar capacidad de transmisión de virus. Ejemplos, a título ilustrativo y no limitativo, de órdenes y especies de insectos-plaga herbívoros con diferentes adaptaciones tróficas, masticadores o chupadores son Lepidoptera, Homoptera y Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, respectivamente.
En una realización particular, el compuesto de la invención y el producto fermentado de la invención comprenden una actividad bioinsecticida contra los insectos Spodoptera littoralis y Myzus persicae, superior al 80%.
En otra realización particular, la guignardianona C y el acido guignárdico comprenden una actividad bioinsecticida contra al menos un insecto seleccionado de entre Spodoptera littoralis y Myzus persicae, superior al 80%.
La actividad contra hongos se determina mediante ensayos de inhibición del crecimiento del micelio en placa. Ejemplos de hongos contra los que es efectivo el producto fermentado de la invención son Fusarium y Botrytis. La actividad contra nematodos se relaciona con la toxicidad, es decir, capacidad para interrumpir una fase concreta del ciclo de vida del nematodo impidiendo su desarrollo. En el ámbito de la invención, la actividad nematicida se determina por ejemplo a través de la determinación del porcentaje de juveniles infectivos (J2) muertos tras 24, 48 y 72 horas posteriores a la aplicación del extracto (ver ejemplo 7), así como a través de la determinación de los efectos del tratamiento sobre la eclosión de los huevos tras 5 días de tratamiento de las masas de huevos y por la determinación de los efectos de concentraciones subletales sobre la capacidad de infección de los juveniles en las raíces de plántulas de tomate.
Los nematodos contra los que son efectivos el compuesto de la invención, el producto fermentado de la invención y el compuesto de fórmula general (II), preferentemente son nematodos formadores de nodulos de las raíces (Meloidogyne sp). Un ejemplo de nematodo formador de nodulos es la especie Meloidogine javanica, polífaga, con capacidad de parasitar más de 3.000 especies de plantas de cultivo, que incluyen cultivos extensivos, hortícolas y frutales, afectando gravemente la producción (Agrios. 2005. Plant Pathology, Fifth edition, Elsevier/Academic, Amsterdam), y causando pérdidas económicas anuales de miles de millones de euros (Singh et al. 2013. OEPP/EPPO Bulletin 43 (2), 334-374).
En otra realización particular, el compuesto de la invención o el producto fermentado de la invención comprenden una actividad nematicida preferentemente de hasta el 85%, más preferentemente de hasta el 95% y todavía más preferentemente de hasta el 100% cuando se utilizan en una concentración de 0.5 mg/ml y 1 mg/ml respectivamente a 24, 48 y 72 horas de tratamiento.
En otra realización particular, el producto fermentado de la invención comprende una actividad nematicida manifestada por la inhibición, preferentemente de un 98% de la eclosión de huevos después de 72 horas de tratamiento cuando se utiliza a la concentración de 1 mg/ml y la supresión preferentemente de un 60% de la capacidad infectiva cuando se utiliza a una concentración del 0,5 mg/ml.
En otra realización particular, la guignardianona D y el metil éster del ácido penguignárdico comprenden una actividad nematicida preferentemente de hasta el 90%, más preferentemente de hasta el 95% y todavía más preferentemente de el 100% cuando se utiliza en una concentración de 0,5 mg/ml.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida que comprende al compuesto de fórmula (I), o al compuesto de fórmula general (II), ya sea de forma aislada o en combinación, o al producto fermentado, en adelante composición biocida de la invención.
La composición biocida de la invención adicionalmente puede comprender diversos vehículos y agentes que faciliten su conservación, manejo y aplicación.
Como el experto en el estado de la técnica conocerá en la aplicación de fitosanitarios, habitualmente se utilizan vehículos sólidos, vehículos líquidos, vehículos gaseosos, etc., y, si es necesario, agentes tensioactivos y agentes auxiliares para la formulación de composiciones fitosanitarias como, por ejemplo, un aditivo para formular formas tales como concentrados emulsionables, polvos humectables, líquidos fluibles, (v.g., suspensión en agua, emulsión en agua, etc.), polvos, aerosoles, ULV y similares.
Ejemplos de vehículo sólido que se incluyen en el ámbito del uso de la invención son polvos finos o gránulos de arcillas (v.g. arcilla de caolín, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, bentonita, arcilla Fubasami, arcilla ácida, etc.), talcos, cerámicas y otros minerales inorgánicos (v.g., sericita, cuarzo, azufre, carbono activo, carbonato cálcico, sílice hidratada, etc.), fertilizantes comerciales (v.g., sulfato amónico, fosfato amónico, nitrato amónico, urea, cloruro amónico, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo líquido que se incluyen en el ámbito del uso de la invención son agua, alcoholes (v.g., metanol, etanol, etc.), cetonas (v.g., acetona, metil etil cetona, etc.), hidrocarburos aromáticos (v.g, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, metilnaftaleno, etc.), hidrocarburos alifáticos (v.g. hexano, ciclohexano, kerosina, gas oil, etc), ésteres (v.g., acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), nitrilos (v.g, acetonitrilo, isobutironitrilo, etc.), éteres (v.g, éter diisopropílico, dioxano etc.), amidas de ácido (v.g, N,N-dimetilformamida, Ν,Ν-dimetilacetamida, etc.), hidrocarburos halogenados (v.g., dicloroetano, tricloroetano, tetracloruro de carbono, etc. ), sulfóxido de dimetilo, aceites vegetales (v. g., aceite de soja, aceite de semilla de algodón, etc.) y similares. Ejemplos de vehículo gaseoso que se incluyen en el ámbito del uso de la invención son agente de pulverizado, incluyendo gas flon, gas butano, LPG (gas de petróleo liquificado), éter dimetílico, gas de dióxido de carbono y similares. Ejemplos de agente tensioactivo que se incluyen en el ámbito del uso de la invención son sulfatos de alquilo, sales de sulfonato de alquilo, alquil aril sulfonatos, ásteres alquil arílicos, compuestos de polioxietileno de los mismos, ásteres polietilen glicólicos, ásteres de alcohol polihidroxílico, derivados de alcohol de azúcar y similares. Ejemplos de agente auxiliar para la formulación como agente de fijación y agente de dispersión que se incluyen en el uso de la invención son caseína, gelatina, polisacáridos (v.g., polvo de almidón, goma arábiga, derivado de celulosa, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, azúcares, polímeros hidrosolubles sintéticos (v.g., polialcohol vinílico, polipirrolidona de vinilo, poliácidos acrílicos, etc.) y similares.
Ejemplos de estabilizantes que se incluyen en el ámbito del uso de la invención son PAP (fosfato de ácido isopropílico), BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol), BHA (mezcla de 2-terc-butil-4-metoxifenol y 3-terc-butil-4-metoxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, agentes tensioactivos, ácidos grasos o ásteres de los mismos y similares.
El compuesto de la invención, el compuesto de fórmula general (II), el producto fermentado de la invención y la composición biocida de la invención se pueden utilizar conjuntamente con al menos otro ingrediente activo adicional. Ejemplos de ingrediente activo adicional son nematicidas, insecticidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, sinérgicos, fertilizantes, acondicionadores del suelo y cebos para animales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la composición biocida de la invención para el control de fitopatogenos y organismos plaga que afectan a plantas, y preferentemente para el control de nematodos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de control de fitopatogenos y organismos plaga que afectan a plantas, y preferentemente para el control de nematodos, que comprende administrar una dosis eficaz del compuesto de la invención, o del compuesto de fórmula general (II), ya sea de forma aislada o en combinación, o del producto fermentado de la invención o de la composición biocida de la invención. La aplicación puede ser directamente por rociado sobre el organismo plaga, o sobre el sustrato en el que se encuentren los fitopatógenos.
La "dosis eficaz" puede aumentar o disminuir opcionalmente según si se utiliza el compuesto de la invención, el compuesto de fórmula general (II), el producto fermentado de la invención, o la composición biocida de la invención, del tipo de formulación, del tiempo, del lugar y del método de aplicación, del tipo de fitopatógeno u organismo plaga que afecta a la planta y del grado de daño.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas. Para el experto en la materia, otros aspectos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION
A) OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPUESTOS CON ACTIVIDAD BIOCIDA
Ejemplo 1. Aislamiento e identificación del hongo YCC4
El hongo endófito G, manguiferae fue aislado de hojas del árbol Persea indica, recolectadas en el Parque Rural de Anaga (Las Mercedes, Tenerife). Dicho hongo fue depositado en la CECT en fecha 2 de julio de 2014 y con el número de acceso 20914 siguiendo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes. El material vegetal fresco se esterilizó superficialmente con hipoclorito de sodio (65%), etanol (75%) y agua destilada estéril. Pequeñas muestras de explantos (hojas) se colocaron en placas Petri con medio PDA y se incubaron a 27°C. El cultivo puro se obtuvo aislando individualmente una colonia crecida en este medio y se replicó periódicamente para su mantenimiento. El hongo se identificó a nivel molecular en base a la amplificación (PC ) y secuenciación de la región ITS ribosomal del ADNr extraído de una muestra del micelio (Arenal et al. 2000. Mycological Research 104, 2000, 301-303), El hongo se identificó como G. manguiferae por comparación de la secuencia ITS1-5.8S-ITS2 del ADNr con las depositadas en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (número de acceso GenBank gi255068992). Ejemplo 2, Fermentación con el hongo YCC4
YCC4 se cultivó en medio PDA en placas Petri durante 15 días a una temperatura de 27° C. Se le añadió 10 mi de agua destilada estéril y la superficie del micelio se raspó suavemente con una espátula. Esta suspensión del micelio se vertió en un eriermeyer (250ml) con 100 mi medio liquido Czapek-Dox-Levadura [Cz-L: NaN03 (2 g/l), KH2P04 (5 g/l), MgS04 (0.5 g/l), FeSO4 (0.01 g/l), ZnS04 (0.003 g/l), extracto de levadura (1 g/l) y glucosa (60 g/l)] y se cultivó a una temperatura de 25°C en continua agitación (120 r.p.m.) durante 4 días. Transcurrido este tiempo, 5 mi del cultivo se inocularon en cada uno de los 100 erlermeyers (250ml) con 100 mi de medio fresco. Después de 20 días de fermentación en las mismas condiciones, el medio de cultivo se separó del micelio por filtración en un büchner y se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo obteniendo el extracto crudo de la invención. Posteriormente, el disolvente se secó sobre S04Na2 y se llevó a sequedad a vacío a presión reducida, obteniendo 10.5 g de extracto crudo seco. El micelio se congeló con nitrógeno líquido y se liofilizó para su conservación.
Ejemplo 3. Aislamiento de los compuestos con actividad biocida
El extracto crudo seco (10.5 g) obtenido según el ejemplo 2 se fraccionó mediante una cromatografía líquida de vacío (VLC) utilizando como eluyente mezclas crecientes en polaridad de n-hexano/acetato de etilo y acetato de etilo/metanol dando lugar a 9 fracciones. La fracción 1 (n-hexano/acetato de etilo 25%) fue cromatografiada en una columna flash de media presión empleando como sistema de elución n-hexano/acetato de etilo en orden de polaridad creciente. De las fracciones menos polares (n-hex/acet, 10%) se aislaron la guignardianona A (Buckel et al. 2013. Phytochemistry 89, 96-103) (23.0 mg) y la guignardianona C (96.1 mg), empleando una cromatografía líquida de alta presión (HPLC) (n-hex/ AcOEt 3%). La fracción posterior obtenida con n- hex/AcOEt 15% fue cromatografiada en columna de media de presión de gel de sílice y, posteriormente, mediante HPLC (n-hex/ AcOEt 3%), y se obtuvo la guignardianona D (89 mg) y el metil éster del ácido penguignárdico (36.5 mg). De la fracción eluida en n-hex/acet 20%, después de una cromatografía en HPLC (n-hex/ AcOEt 15%) se obtuvo la guignardona A (Yuan et al. 2010. Eur. J. Org. Chem. 6348-6353) (78.3 mg). En la fracción más polar (n-hex/ AcOEt 50%) de la cromatografía de esta fracción 1 se aisló el ácido metguignárdico (204 mg).
La fracción 2 del extracto fue cromatografiada en una columna de media presión con gel de sílice con mezclas de polaridad creciente de n-hex/ AcOEt y AcOEt / MeOH y se aislaron de nuevo la guignardianona A (430 mg), la guignardona A (80 mg), que se habían obtenido anteriormente en la fracción 1 del extracto. En las fracciones eluidas con AcOEt 100% se aisló la guignardona B (Yuan et al. 2010. Eur. J. Org. Chem. 6348-6353) (13.6 mg) y de las más polares obtenidas con MeOH 100%, se obtuvieron los ácidos metguignárdico (30 mg) y guignárdico (1 17.8 mg), empleando una cromatografía en HPLC con n-Hex/ AcOEt /MeOH 30/64/6. En la fracción 3 obtenida con n-hex/ AcOEt 50% después de sucesivas cromatografías en columna a media presión y/o HPLC se aislaron en orden de polaridad la guignardianona C (49 mg), el metil éster del ácido penguignárdico (2.4 mg), la guignardianona E (Buckel et al. 2013. Phytochemistry 89, 96-103) (1.5 mg), la guignarenona C (Sommart et al. 2012. Phytochemistry Lett. 5, 139-143) (8.8 mg) y la guignardona B (13.6 mg).
Del fraccionamiento cromatográfico de las fracciones más polares del extracto, 4, 5 y 6, se aislaron nuevamente la guignarenona C (5.8 mg), la guignardona B (5.6 mg), la guignarenona B (Sommart et al. 2012. Phytochemistry Lett. 5, 139-143) (2.2 mg) y el ácido 3,4 dihidroxibenzoico (34.3 mg).
Ejemplo 4. Caracterización de los compuestos con actividad biocida
Técnicas experimentales Los espectros de RMN de 1H y 13C de los compuestos con actividad biocida se realizaron en espectrómetros Bruker Advance y AMX-500, a 400 y 500 MHz para el 1H y a 100 y 125 MHz para el 13C, respectivamente. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en partes por millón y las constantes de acoplamiento (J) en Hertzios (Hz). Como patrón interno de referencia se empleó el tetrametilsilano (TMS) y como disolvente se usó el deuterocloroformo (CDCI3). Los experimentos de 2D con correlación homo y heteronuclear, COSY, HSQC, HMBC y NOESY, fueron realizados con programas de la firma Bruker. Los espectros de masas de alta y de baja resolución se registraron en un espectrómetro Micromass Autospec®, con introducción directa de las muestras mediante una sonda de sólidos. La técnica empleada fue el impacto electrónico (IE) con un potencial de ionización de 70 eV y una temperatura de la fuente de 230 °C. Las señales se describen en unidades de relación masa/carga (m/z) y entre paréntesis se indica la intensidad relativa (int. reí.) de cada señal respecto al pico base (100%). Para cada compuesto se indican solamente los picos estructuralmente más significativos y/o de mayor intensidad relativa. Las cromatografías se realizaron sobre gel de sílice (0.015-0.040 mm 0, Merck) mediante una cromatografía líquida de vacío (VLC) o en columnas cromatográficas acopladas a una bomba de media presión (Fluid Metering Inc). La elución se realizó en gradientes de polaridad creciente, empleando como disolventes mezclas de n-hexano/acetato de etilo (AcOEt) o diclorometano (CH2CI2)/metanol (MeOH). Posteriores purificaciones de los compuestos se llevaron a cabo en un equipo de cromatografía líquida de alta presión (Beckman 125P®) acoplado a un detector fotodiodo, controlado por la aplicación informática Beckman 32-Karat. Las separaciones se llevaron a cabo en columnas de fase normal con un tamaño de partícula de 5 μ, sílica Inertsil de 20.0 x 250 mm (preparativa) o sílica Ultrasphere de 10.0 x 250 mm (semipreparativa), dependiendo del peso de la muestra a cromatografiar. El desarrollo de las cromatografías en columna se siguió por cromatografía en capa fina, visualizando las placas a la luz UV (254 y 360 nm) y calentando a 100-130 °C las placas pulverizadas con oleum (disolución de H2S04 (4%) y ácido acético (80%) en agua destilada).
Guignardianona C
[a]D:- 10.2 0 (c 0.25, CHCI3). 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): 5 7.68 (2 H, d, J= 7.1 Hz, H- 8 y H-12), 7.41 (2 H, m, H-9 y H-1 1 ), 7.35 (1 H, m, H-10), 6.50 (1 H, s, H-6), 3.85 (3 H, s, -OCH3), 2.69 (1 H, sept, J= 6.9 Hz, H-1 '), 1.07 (6 H, d, J= 6.9 Hz, Η-2'y H-3'); EM a m/z: 276 [M+] (5), 1 18 (100), 90 (39), 71 (13); EMAR [M+] a m/z: 276.0999 calculado para C15H1605, 276.0998. Guignardianona D
[a]D:+40.3 0 (c 0.25, CHCI3). 1 H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.63 (2 H, d, J= 7.2 Hz, H-8 y H-12), 7.41 (2 H, m, H-9 y H-1 1 ), 7.35 (1 H, m H-10); 7.24 (5 H, s ancho, Η-3', Η-4', Η-5', Η-6' y Η-7'), 7.21 (1 Η, m, Η-6"), 7.19 (2 Η, m, Η-5" y Η-7"), 7.15 (2 Η, m, Η-4" y Η-8"), 6.30 (1 Η, s, Η-6), 4.45 (2 Η, m, Η-1 "), 3.52 y 3.46 (1 Η cada uno, d, J= 14.6 Hz, Η-1 '), 2.96 (2 H, t, J= 6.6 Hz, H-2"); EIMS a m/z: 414 [M+] (4), 265 (1 1 ), 1 18 (100), 105 (27), 91 (84); EMAR [M+] a m/z: 414.1465 calculado para C26H22O5, 414.1467.
Metil éster del ácido penguignárdico
[a]D:+ 47.6 0 (c 0.14, CHCI3). 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.63 (2 H, d, J= 7.2 Hz, H- 8 y H-12), 7.40 (2 H, m, H-9 y H-1 1 ), 7.36 (1 H, m, H-10), 7.28 (2 H, m, H-3' y H-7'), 7.24 (3 H, m, H-4', H-5' y H-6'), 6.30 (1 H, s, H-6), 3.85 (3 H, s, -OCH3), 3.58 (1 H, d, J= 14.8 Hz, Η-1 'b), 3.52 (1 H, d, J= 14.8 Hz, H-1 'a); EIMS a m/z: 324 [M+] (2), 264 (2), 1 18 (100), 91 (29), 90 (17), 65 (3); EMAR [M+] a m/z: 324.0987 calculado para Ci9H1605, 324.0998.
Ácido metguignárdico [a]D: -54.7 0 (c 0.3, CHCI3). 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.67 (2 H, dd, J= 7.1 y 1 .5 Hz, H-8 y H-12), 7.40 (2 H, m, H-9 y H-1 1 ), 7.35 (1 H, m, H-10), 6.52 (1 H, s, H-6), 2.43 (1 H, dcd, J= 10.2, 6.9 y 3.3 Hz, H-1 '), 1 .66 y 1.29 (1 H cada uno, m, H-2'), 1 .07 (3 H, d, J= 6.9 Hz, H-3'), 0.99 (3 H, t, J=7.4 Hz, H-4'); EIMS a m/z: 276 [M+] (6), 1 18 (100), 90 (54), 85 (7), 63 (5), 57 (25); EMAR [M+] a m/z: 276.1001 , calculado para
Figure imgf000020_0001
Acido guignárdico [a]D: -26.70 (c 0.25, CHCI3).1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.66 (2 H, d, J= 7.1 Hz, H- 8yH-12), 7.40 (2 H, m, H-9yH-11), 7.35(1 H, m, H-10), 6.53 (1 H, s, H-6), 2.68 (1 H, sept. J= 6.9 Hz, H-1'), 1.09 y 1.08 (3 H cada uno, d, J = 6.9, H-2' y H-3'); EIMS a m/z: 262 [M+] (5), 118 (100), 90 (38), 71 (9); EMAR [M+] a m/z: 262.0853 calculado para
Figure imgf000021_0001
Tabla 1. RMN de C de los compuestos con actividad biocida
Figure imgf000021_0002
B) ACTIVIDAD BIOCIDA Ejemplo 5. Actividad antialimentaria contra insectos-plaga
La cría y mantenimiento de los insectos se llevó a cabo en una cámara de temperatura controlada a 24+1 °C, 60-70% de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 horas (luz:oscuridad). Las larvas de S. littoralis se mantuvieron con una dieta semisintética (Poitut y Bues . 1970. Ann. Zool. Ecol. Anim. 2, 79-91 ) y los áfidos sobre sus plantas huésped, pimiento (Capsicum annum L.) para M. persicae. Los ensayos de actividad alimentaria se realizaron con larvas recién emergidas de sexto estadio de S. littoralis y pulgones adultos ápteros. La superficie superior de discos de hoja (1 ,0 cm2) de pimiento (Capsicum annum L.), fueron tratados con 10 μΙ de la muestra. Cada ensayo consistió en 5 placas Petri con dos larvas por placa (S. littoralis) o veinte cajas (2x2 cm) con diez áfidos de M. persicae incubados en una cámara de crecimiento en las mismas condiciones descritas para la cría de los insectos. Una vez consumido el 75% de la superficie de los discos control (S. littoralis) o después de 24 h (áfidos) se calculó el índice de consumo (%FI) o de asentamiento (% de SI), respectivamente. % Fl = [1 - (T / C) x 100], donde T y C son el consumo de discos de hojas tratadas y control; % de SI = [1 - (% T / C %)], donde % C y % T son el porcentaje de áfidos asentados en los discos de hojas control y tratadas (Burgueño et al. 2008. J. Chem. Ecol. 34, 766-771 ). Los compuestos con un Fl / SI > 70 % se ensayaron en un experimento de dosis - respuesta para calcular su potencia relativa (EC50, es la dosis efectiva para una reducción de un 50 % de la alimentación). Tabla 2. Actividad antialimentaria de los compuestos con actividad biocida y del extracto crudo seco contra insectos-plaga, aplicados en una concentración de 50 μς/αη2 mg/l cultivo μς/οηι'1 S.littoralis M. persicae
%Fla± SE %Sl ± SE
(n=6) (n=20)
Extracto i g/i 100 81 .79 ± 5.06 78.1 5 ± 6.45
50 70.14 ± 8.69
20 50.52 ± 1 5.05 41 .17±6.99
4 41 .35 ± 5.46 33.41 ±7.17
Figure imgf000023_0001
a %FI Porcentaje de inhibición de la alimentación
b % SI Porcentaje de inhibición de asentamiento
EC50, dosis efectiva para producir un 50% de inhibición de la alimentación/asentamiento
Ejemplo 6. Actividad antsfúngsca
Los hongos fitopatogenos Fusarium moniliforme (Sheldon) [CECT2152], F. oxysporum fs.lycopersici (Escalda) [CECT2715] y F. solani (Mart) [CECT2199] proceden de la Colección Española de CultivosTipo (CET). La cepa de Botrytis cinérea Pers. Fr. (B05.10) es una donación del Departamento de Bioquímica de la Universidad de La Laguna (ULL). Para su mantenimiento las cepas se cultivaron en medio sólido comercial PDA a 25°C (Fusarium) o temperatura ambiente (Botrytis), y posterior conservación a -30°C en viales con glicerol al 18%.
Para determinar la actividad antifúngica se empleó el método de dilución en agar (Murabayashi et al. 1991 . J. Pesticide Sci. 16, 419-427). Muestras del extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 se incorporaron en el medio de cultivo (5 mi) a 5 concentraciones diferentes (1 , 0,5, 0,1 , 0,05 y 0,01 mg/ml). De forma paralela, se prepararon controles con etanol a una concentración del 2 %. La siembra de los organismos diana se realizó por picadura (Fusarium) o con discos de 5 mm de diámetro (B. cinérea). Las colonias cultivadas en placas de Petri e incubadas durante 48 h fueron digitalizadas y se midieron empleando el programa ImageJ 1.43. El porcentaje de inhibición (% I) se calculó como: % I = (C-T/C) x 100, donde C es el diámetro de las colonias del control y T de las colonias de las muestras ensayadas. La dosis efectiva de inhibición de crecimiento (EC50) se determinó por análisis de regresión lineal (% de inhibición del log de la dosis). Tabla 3. Actividad fungicida del extracto crudo seco
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El extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 mostró tener una moderad actividad antifúngica frente a F.solani y F. oxysporum y B. cinérea.
Ejemplo 7. Actividad nematicida
7 A. ín vítro La población de nematodos (Meloidogyne javanica) se mantuvo en cámaras de crecimiento sobre plantas de tomate (Lycopersicon esculentum (var. Marmande) a 25 °C y una humedad relativa del 70%. Los ensayos se realizaron según la metodología descrita para M. javanica (Andrés et al. 2012. Phytochem. Rev. 1 1 , 371 -390) utilizando la fase biológica de juveniles infectivos (J2). La actividad del extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 y de los compuestos con actividad biocida se cuantificó a una concentración final por pocilio de 1.0/ 0.5 mg/ml, respectivamente. Cada tratamiento se repitió cuatro veces y la actividad nematicida se determinó a partir del porcentaje de juveniles infectivos muertos después de 72h. En los casos en los que se determinó una tasa de mortalidad > 99% se realizaron experimentos de dosis- respuesta para determinar LC50 y LCg0 (Tabla 4).
Tabla 4. Actividad nematicida de los compuestos con actividad biocida y del extracto crudo seco
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La actividad del extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 sobre la eclosión de los huevos se cuantificó a una concentración final por pocilio de 1 .0mg/ml. El tratamiento se repitió cuatro veces y la actividad de supresión de la eclosión se determinó a partir del porcentaje de juveniles eclosionados de las masas de huevos en dos tiempos: inmediatamente después de 5 días de tratamiento y a los 28 días posteriores en inmersión en agua (Tabla 5). La actividad del extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 sobre la capacidad de infección de los juveniles se cuantificó a una concentración final por pocilio de 0,5 mg/ml y la actividad de inhibición de la capacidad infectiva se determinó a partir del porcentaje de juveniles tratados durante 72 h que han penetrado en las raíces de plántulas de tomate (Tabla 5).
Tabla 5. Actividad extracto crudo seco sobre la eclosión de huevos de M. javanica después de 5 días de tratamiento y sobre la capacidad infectiva de juveniles (J2) de M. javanica en raíces de plántulas de tomate
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7 B. In vivo
La actividad del extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 sobre el inoculo (Pi) de M. javanica se determinó en un ensayo experimental in vivo en macetas con plantas de tomate en cámaras de crecimiento vegetal (temperatura: 25°C y fotoperiodo D : N 16:8). El extracto crudo seco se cuantificó a una concentración final de 0,42 mg/ml que constituyó el tratamiento aplicado al sustrato arcillo-arenoso de 10 macetas de 1 Kg de capacidad previamente inoculadas con una población inicial (Pi) de 2000 huevos J2 de M. javanica y a las que se transplantaron plántulas de tomate var. Marmande de un mes de edad. Como control se consideraron otras 10 macetas, de iguales características a las descritas, pero tratadas con agua destilada. La efectividad del tratamiento se analizó al cabo de dos meses mediante la cuantificación y comparación de una serie de parámetros poblacionales del nematodo: n° de masas de huevos y n° de huevos (Población final, Pf) recuperados de los sistemas radicales de las plantas, así como a partir de la variación significativa de la tasa de reproducción (Pf/Pi) de la población de M. javanica en las macetas con el tratamiento respecto a las del control.
Tabla 6. Actividad del extracto crudo seco en macetas con plantas de tomate, sobre una población inicial (Pi) de 2000 huevos/ J2 de M. javanica. Valores en la misma columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo al Test LSD de Fisher (P<0,05)
Figure imgf000027_0001
Se observa que la aplicación del tratamiento produce una reducción significativa de las masas de huevos así como del número de huevos obtenidos al final del ciclo vital del nematodo y que tiene como consecuencia una reducción significativa de la tasa de reproducción de la población de M. javanica.
Ejemplo 8. Actividad fitotóxica La actividad fitotóxica del extracto crudo seco obtenido según el ejemplo 2 fue evaluado frente a semillas de Lactuca sativa Teresa (Fito, España), Lolium perenne y Lycopersicon esculentum. Los experimentos se realizaron en placas de 12 pocilios (Falcon), aplicando 20 μΙ (10μg/μl) sobre discos de papel de 2,5 cm de diámetro colocados en el fondo de cada pocilio. Se le añadió 500 μΙ de agua destilada, 10/5 semillas, y las placas se incubaron en una cámara de crecimiento a 25 °C, 70% humedad relativa y un fotoperiodo 16:08 L: O. La germinación de las semillas se contabilizó durante seis días y la elongación de las raíces al final del experimento. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA). Como control positivo de la inhibición de la germinación se empleó la juglona (5 g/ l). No se observaron efectos significativos en la germinación de L. perenne, L. sativa y L. esculetum, aunque presenta una ligera inhibición de la germinación de la monocotledonea L. perenne y reduce su crecimiento sin afectar a las dicotiledóneas L. sativa y L. esculentum (Tabla 7).
Tabla 7. Actividad fitotóxica del extracto crudo seco
Lolium perenne Latuca sativa Lycopersicon esculentum
Germinación Hoja Raíz Germinación Raíz Germinación Raíz
85.7±21 .4 65.8±7.8 74.4±7.1 100.0±0.0 155.6±22.9 96.7±1 1.8 107.7± 13.1

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Compuesto de fórmula (I):
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o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
2. - Procedimiento de obtención del compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) cultivar micelio de un hongo del género Guignardia sp. en un medio de cultivo hasta conseguir un producto fermentado y b) aislar al compuesto de fórmula (I) a partir del producto fermentado de la etapa anterior.
3. - Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que el hongo que se utiliza en la etapa (a) es un hongo de la especie G. manguiferae.
4. - Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que el hongo de la especie G. manguiferae es la cepa YCC4, aislada de hojas de Persea indica y depositada en la CECT con número de acceso 20914 en fecha 2 de julio de 2014.
5.- Producto fermentado que se obtiene tras la etapa (a) del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que comprende al compuesto según la reivindicación 1.
6.- Producto fermentado según la reivindicación 5, caracterizado por que adicionalmente comprende a un compuesto de fórmula general (II):
Figure imgf000030_0001
(II) donde R1 se selecciona de entre metiletil y metilfenil y R2 se selecciona de entre CH3, etilfenil y H,
o un isómero, una sal o un solvato del mismo.
7.- Producto fermentado según una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado por que comprende actividad biocida.
8.- Producto fermentado según la reivindicación 7, caracterizado por que la actividad biocida es actividad nematicida.
9.- Uso del compuesto según la reivindicación 1 , o de un compuesto de fórmula general (II) según se describe en la reivindicación 6, ya sea de forma aislada o en combinación, o del producto fermentado según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas.
10.- Uso según la reivindicación 9 para el control de nematodos.
1 1.- Composición biocida que comprende al compuesto según la reivindicación 1 , o a un compuesto de fórmula general (II) según se define en la reivindicación 6, ya sea de forma aislada o en combinación, o al producto fermentado según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
12. - Uso de la composición biocida según la reivindicación 1 1 para el control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas.
13. - Uso según la reivindicación 12 para el control de nematodos.
14. - Método de control de fitopatógenos y organismos plaga que afectan a plantas, que comprende administrar una dosis eficaz del compuesto según la reivindicación 1 , o de un compuesto de fórmula general (II) tal y como se describe en la reivindicación 6, ya sea de forma aislada o en combinación, o del producto fermentado según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, o de la composición biocida según la reivindicación 10.
15. - Método de control según la reivindicación 14 para el control de nematodos.
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