WO2016009352A1 - Método de sensado molecular basado en modulación de luminiscencia por calentamiento específico de nanopartículas - Google Patents

Método de sensado molecular basado en modulación de luminiscencia por calentamiento específico de nanopartículas Download PDF

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WO2016009352A1
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luminescence
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PCT/IB2015/055322
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Fernando Daniel STEFANI
Jesica Vanesa PELLEGROTTI
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Consejo Nacional De Investigaciones Científicas Y Técnicas (Conicet)
Inis Biotech Llc
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    • G01N21/1717—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated with a modulation of one or more physical properties of the sample during the optical investigation, e.g. electro-reflectance
    • G01N2021/1731—Temperature modulation

Definitions

  • the present invention relates to a molecular sensing method based on luminescence modulation by specific heating of nanoparticles and preferably the present invention relates to a method for detecting and quantifying molecular interactions based on luminescence modulation by specific heating of nanoparticles.
  • a molecular sensor is a device that allows to detect the presence or quantify the concentration of a relevant molecule at a biological, medical, pharmacological or analytical level (analyte or white molecule). In general they consist of a specific molecular recognition system and a sensing system that translates the presence of analyte into a measurable signal.
  • a biological, medical, pharmacological or analytical level analyte or white molecule
  • Figure la and Ib show working diagrams of two fluorescent sandwich molecular sensors.
  • Figure 2 illustrates the components of the sensing method based on specific nanoparticle heating.
  • Figure 3 illustrates a scheme of the system used for the experimental demonstration of the sensing system.
  • Figure 4 is an electron microscopy image of the gold nano-rods used in the method object of the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the calculation of the temperature generated in the vicinity of a gold nano-rod when it is illuminated with a power density of 10kW / cm2.
  • Figure 6 shows in a graph the absorption spectrum of the gold nano-rods, together with the absorption and emission spectra of the fluorophore used.
  • Figure 7 is a schematic image of the device used with the method object of the present invention.
  • Figure 8 is a graph showing the fluorescence reduction of fluorophores attached to gold nano-rods as a function of the intensity of the heating beam.
  • Figure 9 is a graph detailing several cycles of photothermal fluorescence reduction.
  • Figure 10 is a graph showing the percentage reduction in fluorescence as a function of the analyte concentration (streptavidin).
  • Figure 11 is a graph showing the percentage reduction in fluorescence as a function of the analyte concentration (streptavidin), using a different composition than the one used in the graph of Figure 11.
  • the method object of the present invention takes advantage of specific heating mechanisms of nanoparticles to discern specific contributions of background contributions and thus obtain a greater sensitivity in a homogeneous system.
  • a successful type of molecular sensors consists in the formation of a "molecular sandwich", in which two different entities bind independently and at different sites to the analyte.
  • two different entities bind independently and at different sites to the analyte.
  • monoclonal antibodies are used that bind to the white protein in different specific positions (epitopes).
  • the sensing signal originates from some interaction between the two entities linked to the analyte.
  • FIGS. la and lb schematically show two examples of sandwich molecular sensors based on two different physical principles: Fig la) by means of transfer of Forster energy between a donor and an acceptor fluorophore, and Fig Ib) by reduction of fluorescence by transfer of energy to a metal nanoparticle
  • Fig la by means of transfer of Forster energy between a donor and an acceptor fluorophore
  • Fig Ib by reduction of fluorescence by transfer of energy to a metal nanoparticle
  • a molecular sensor like the one in Figure Ib was developed by FDS in collaboration with Roche Diagnostics GmbH (Penzberg, Germany) for the detection of cardiac troponin T.
  • the two recognition entities of the white molecule are fluorescently labeled, some with a donor fluorophore (D) and the other with an acceptor (A) capable of interacting by FRET (Foster resonance energy transfer) .
  • FRET Flured resonance energy transfer
  • the formation of the molecular sandwich puts donors and acceptors in sufficient proximity, allowing the occurrence of FRET.
  • the amount of analyte is determined by quantifying the fluorescence emission of the acceptor, reduction of donor fluorescence, combinations of both measurements, or other consequences of FRET.
  • the formation of the molecular sandwich puts a fluorophore in the vicinity of a metal nanoparticle, capable of absorbing excitation energy and suppressing fluorescence emission. In this case the amount of analyte is determined by quantifying the fluorescence reduction that occurs when the molecular sandwich is assembled.
  • the new method consists of a physically independent mechanism and can be used exclusively or in combination with other nanoparticle based methods.
  • the new molecular sensing method is based on the combination of two well-established concepts, on the one hand the variation of the luminescence with the temperature and on the other the specific heating of nanoparticles.
  • the processes that give rise to luminescence generally depend on temperature.
  • fluorescence emission of light from a singlet state of a molecule excited by light absorption
  • the temperature can influence several processes.
  • the quantum fluorescence yield of most organic fluorophores decreases with temperature, typically at a rate of 1-2 ° C. This effect has been known for decades and has its origin in a number of non-radiative temperature-activated de-excitation processes (eg collisions with solvent molecules or intramolecular vibrations).
  • all Organic fluorophores have the possibility of undergoing chemical reactions from the excited state that transform them into non-fluorescent molecules or that run their absorption and / or emission spectrum outside the working spectral range.
  • photo-bleaching photobleaching, bleaching
  • photo-degradation photo-degradation
  • This process is generally also temperature activated. Consequently, it is a typical behavior that the fluorescence emission of organic fluorophores decreases with increasing temperature.
  • phosphorescence emission of light from a triplet state of a molecule excited by light absorption
  • semiconductor photoluminescence similar processes occur.
  • temperature changes affect any type of luminescence to a greater or lesser extent. Any variation of luminescence produced by temperature can be exploited in the new sensing method.
  • Nanoparticles of various materials can be specifically heated by selective absorption of electromagnetic radiation. For this it is necessary that the nanoparticles absorb, in some region of the electromagnetic spectrum, considerably more than the rest of the components of the sample per unit volume.
  • metal nanoparticles e.g. gold or silver
  • metal nanoparticles can be heated by illumination in the visible range at the frequency of their plasmon resonances (plasmonic heating; plasmonic heating, photothermal heating).
  • plasmonic heating plasmonic heating; photothermal heating
  • nanoparticles of magnetic materials which when they have sizes below a certain threshold exhibit superparamagnetic behavior (eg magnetite nanoparticles with 10 nm in diameter) and can be heated by applying high frequency magnetic fields in the range of radiofrequency
  • the temperature fields can be controlled by the frequency, intensity and spatial and temporal distribution of the radiation used. It is possible to achieve heating only in nanometric regions around the nanoparticles, leaving the temperature in the rest of the system unchanged. In regions Very high nanometric temperatures can be easily reached, even above the boiling point of the suspension medium.
  • the molecular sensing method takes advantage of local, specific and nanometric heating around nanoparticles to detect and quantify molecular recognition events.
  • Figure 2 schematizes the necessary components.
  • Surface-functionalized nanoparticles with a specific molecular recognition entity for the analyte (RML) are needed.
  • Another or the same molecular recognition entity (RM2) is bound to one or more luminescent species.
  • sandwich structures are formed that leave the luminescent species in the direct and nanometric neighborhood of the nanoparticles.
  • a specific heating mechanism of the nanoparticles used is needed. When the system is irradiated with the heating radiation, it is specifically absorbed by the nanoparticles, and a high temperature field is generated locally around the nanoparticles.
  • Luminescent species bound to the nanoparticles through the analyte will be affected by temperature, while those that remain free in solution will not. From the measurement of the effect of temperature on the luminescence it is possible to quantify how many sandwich structures have been formed, and consequently the amount of analyte present.
  • the fluorescence of AlexaFluor546 is excited at 532 nm and the heating of the nano-rods is carried out by near-infrared illumination at 785 nm; at this wavelength the absorption capacity per unit volume of gold nano-rods is orders of magnitude greater than that of any other component of the sample, which allows to generate temperature fields specifically in the nanometric neighborhood of the nanoparticles (figure 5). This means that this high temperature field influences highly preferentially molecules that bind specifically to nanoparticles, and not the rest of the molecules in the solution or working medium; fundamental concept of the method.
  • FIG 4 an image of the gold nano-rods used with a diameter of 25 nm and a length of 100 nm is observed, on average obtained by Transmission Electron Microscopy (TEM).
  • Figure 6 shows the absorption spectrum of gold nano-rods, absorption and emission spectra of AlexaFluor546. The vertical bands indicate the wavelengths used for fluorescence excitation and for the specific photothermal heating of the nanoparticles.
  • Figure 5 shows a graph that shows the calculation of the temperature generated in the vicinity of a gold nano-rod when it is illuminated with a power density of 10kW / cm2.
  • the experimental device is shown in Figure 7. This consists of a fluorescence excitation and detection system, with the addition of an independent light source for heating the nanoparticles, in this case a 785 nm continuous wave laser.
  • Figure 7 shows the components that are part of the experimental device where DM: dichroic mirror, M: mirror, PMT: photomultiplier tube, MMF: multimode optical fiber, L: lens.
  • the measurement consists of exciting and detecting the fluorescence until you have a reliable measurement of its intensity. At that moment the heating radiation is turned on. This produces a local high temperature field around the nanoparticles which in turn produces, in this case, a decrease in fluorescence intensity.
  • a high temperature produces a reduction in the quantum yield of fluorescence and an increased probability of reactions of (photo-) degradation of fluorophores.
  • the reduction in fluorescence emission increases directly with the power of the heating beam (figure 8) and in suspension it is completely reversible (Figure 9). Where in Figure 8 the fluorescence reduction of fluorophores bound to gold nano-rods is observed as a function of the intensity of the heating beam, while in the graph of Figure 9 several cycles of photothermal fluorescence reduction are appreciated .
  • the sensitivity and dynamic range of the sensor can be adapted by modifying the concentrations of the components, as seen in the examples in Figures 10 and 11.
  • the fluorescence excitation, detection and heating wavelengths used in this demonstration are not essential.
  • the method can also be applied in any other spectral range.
  • gold nano-rods are not essential. There are numerous metallic and non-metallic nanoparticles that provide sufficient absorption to generate a local temperature field by lighting with wavelengths between 300 and 2000 nm. There are also suitable light sources for its application. The same applies to the luminescent species. In this demonstration an organic fluorophore was used but a nanoparticle of semiconductor material, a phosphorescent molecule or any other luminescent species that is affected by temperature could alternatively be used.
  • a chopper (Ch) or some other excitation modulation system and lock-in detection are not fundamental, but optional.
  • the same goes for heating;
  • the heating beam could also be modulated to filter and amplify the fluorescence modulated signal and quantify the photothermal reduction.
  • the same goes for the multi-mode fiber and the photo-multiplier tube; they are not fundamental to the method and any other photodetection system (photodiodes, cameras, etc.) could be used.
  • the analyte concentration was determined in this case through the relative (percentage) reduction. Alternatively, it can be done by absolute measurements of variation with the temperature of any luminescence property. Finally, it is worth noting that the method can be "multiplexed", that is to say, using in a mixture simultaneously several nanoparticles that can be specifically heated separately (ie with different sources of heating radiation), and / or several luminescent species that can be excited and / or detected separately. This allows different analytes to be sensed simultaneously or at different concentration ranges.
  • the object of the present invention presents a method for detecting and quantifying the presence of an analyte (white molecule) based on the modification or modulation of luminescence by specific heating of nanoparticles.
  • Fluorescence or luminescence modulation locally in the nanoparticulate nanoparticle neighborhood, through specific nanoparticle heating, has not been described for use in molecular sensing, biosensing or quantitative analysis of any kind.
  • This new mechanism allows to obtain sub-nanomolar sensitivity in the detection of analytes in a homogeneous (1 phase) or inhomogeneous system (several phases or including separation steps prior to measurement).
  • the sensing and quantification mechanism can be applied to the detection of any molecule of interest (e.g. protein) for which there is at least one recognition entity (e.g. antibody).
  • molecule of interest e.g. protein
  • recognition entity e.g. antibody
  • This mechanism to detect the presence and / or quantify the concentration of proteins, antigens, metabolites or any relevant molecule in solution is applicable to diagnostic clinical analysis, as well as to other non-medical quantitative analyzes.

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Abstract

Un método de sensado molecular basado en modulación de luminiscencia por calentamiento específico de nanopartículas, en donde el método comprende emplear mecanismos de calentamiento específico de nanopartículas para discernir contribuciones específicas de contribuciones de fondo. Este nuevo mecanismo permite obtener sensibilidad sub-nanomolar en la detección de analitos en un sistema homogéneo (1 fase) o inhomogéneo (varias fases o incluyendo pasos de separación previos a la medición). El mecanismo de sensado y cuantificación puede aplicarse a la detección de cualquier molécula de interés (p.e. proteína) para el cual se cuente con al menos una entidad de reconocimiento (p.e. anticuerpo). Este mecanismo para detectar la presencia y/o cuantificar la concentración de proteínas o metabolitos en solución es aplicable a cualquier análisis de clínico de diagnóstico, como así también a otros análisis cuantitativos no médicos.

Description

MÉTODO DE SENSADO MOLECULAR BASADO EN MODULACIÓN DE
LUMINISCENCIA POR CALENTAMIENTO ESPECÍFICO DE NANOP ARTICULAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de sensado molecular basado en modulación de luminiscencia por calentamiento específico de nanopartículas y preferentemente la presente invención se relaciona con método para detectar y cuantificar interacciones moleculares basadas en la modulación de luminiscencia mediante el calentamiento específico de nanopartículas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Como es sabido un sensor molecular es un dispositivo que permite detectar la presencia o cuantificar la concentración de una molécula relevante a nivel biológico, médico, farmacológico o analítico (analito o molécula blanco). En general constan de un sistema de reconocimiento molecular específico y de un sistema de sensado que traduce la presencia de analito en una señal medible. Mundialmente la comercialización de sensores moleculares, en particular de biosensores para medicina es un negocio de varios miles de millones de dólares estadounidenses y ha impulsado fuertemente la investigación y desarrollo de numerosos sistemas de reconocimiento y sensado.
Dentro de los sistemas de sensado molecular se destacan los basados en fluorescencia, que aprovechan la alta sensibilidad y no-invasividad de la detección óptica. En general un sensor exitoso debe proveer una respuesta rápida, con una sensibilidad adecuada y gran reproducibilidad. Los sensores moleculares son clasificados en homogéneos y heterogéneos. Los sensores homogéneos funcionan en solución, no requieren tratamientos de separación, y son los más simples y rápidos. Una limitación común a la mayoría de los sensores homogéneos está impuesta por las contribuciones de fondo a la señal de sensado. Para reducir la contribución de estas señales se realizan sensores heterogéneos que involucran pasos de separación y purificación como así también reacciones superficiales sobre substratos. Gracias a la separación física del analito previa a la medición, estos sensores brindan en general las sensibilidades más altas.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Es por lo tanto un objeto de la presente invención proveer un método de sensado molecular basado en modulación de luminiscencia por calentamiento específico de nanopartículas, en donde el método comprende emplear mecanismos de calentamiento específico de nanopartículas para discernir contribuciones específicas de contribuciones de fondo y obtener una sensibilidad mayor.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Para mayor claridad y comprensión del objeto de la presente invención, se lo ha ilustrado en varias figuras, en las que se ha representado el mismo en una de las formas preferidas de realización, todo a título de ejemplo, en donde:
La figura la y Ib muestran esquemas de funcionamiento de dos sensores moleculares sandwich basados en fluorescencia.
La figura 2 ilustra los componentes del método de sensado basado en calentamiento específico de nanopartículas.
La figura 3 ilustra un esquema del sistema usado para la demostración experimental del sistema de sensado.
La figura 4 es una imagen de microscopía electrónica de las nano-varillas de oro empleadas en el método objeto de la presente invención.
La figura 5 es un gráfico que muestra el cálculo de la temperatura generada en la cercanía de una nano-varilla de oro cuando es iluminada con una densidad de potencia de 10kW/cm2. La figura 6 muestra en un gráfico el espectro de absorción de las nano- varillas de oro, junto a los espectros de absorción y emisión del fluoróforo empleado.
La figura 7 es una imagen esquemática del dispositivo empleado con el método objeto de la presente invención.
La figura 8 es un gráfico que muestra la reducción de fluorescencia de fluoróforos unidos a nano-varillas de oro en función de la intensidad del haz de calentamiento.
La figura 9 es un gráfico que detalla varios ciclos de reducción fototérmica de fluorescencia.
La figura 10 es un gráfico que muestra la reducción porcentual de fluorescencia en función de la concentración de analito (streptavidina).
La figura 11 es un gráfico que muestra la reducción porcentual de fluorescencia en función de la concentración de analito (streptavidina), empleando una composición distinta a la empleada en el gráfico de la figura 11.
DESCRIPCION DETALLADA DEL EJEMPLO DE REALIZACION
Haciendo referencia a las figuras, el método objeto de la presente invención aprovecha mecanismos de calentamiento específico de nanopartículas para discernir contribuciones específicas de contribuciones de fondo y de esta manera obtener una sensibilidad mayor en un sistema homogéneo.
Un tipo exitoso de sensores moleculares consiste en la formación de un "sandwich molecular", en el cual dos entidades diferentes se unen independientemente y en sitios diferentes al analito. Por ejemplo para la detección de proteínas se emplean anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína blanco en posiciones específicas (epitopes) diferentes. La señal de sensado se origina a partir de alguna interacción entre las dos entidades unidas al analito. Las figuras la ylb muestran esquemáticamente dos ejemplos de sensores moleculares sandwich basados en dos principios físicos diferentes: Fig la) mediante transferencia de energía Fórster entre un fluoróforo donor y uno aceptor, y Fig Ib) mediante reducción de fluorescencia por transferencia de energía a una nanopartícula metálica. Un sensor molecular como el de la figura Ib fue desarrollado por FDS en colaboración con Roche Diagnostics GmbH (Penzberg, Alemania) para la detección de troponina cardíaca T.
En el método de la figura la, las dos entidades de reconocimiento de la molécula blanco se encuentran marcadas fluorescentemente, unas con un fluoroforo donor (D) y las otras con uno aceptor (A) capaces de interactuar mediante FRET (Fórster resonance energy transfer). En presencia de la molécula blanco, la formación del sandwich molecular pone en cercanía suficiente a los donores y aceptores, permitiendo la ocurrencia de FRET. La cantidad de analito se determina cuantificando la emisión de fluorescencia del aceptor, reducción de fluorescencia del donor, combinaciones de ambas medidas, o de otras consecuencias de FRET. En el método de la figura Ib, la formación del sandwich molecular pone a un fluoroforo en la cercanía de una nanopartícula metálica, capaz de absorber la energía de excitación y suprimir la emisión de fluorescencia. En este caso la cantidad de analito se determina cuantificando la reducción de fluorescencia que se produce al armarse el sándwich molecular.
El nuevo método consiste en un mecanismo físicamente independiente y puede emplearse exclusivamente o en combinación con otros métodos basados en nanopartículas.
El nuevo método de sensado molecular se basa en la combinación de dos conceptos bien establecidos, por un lado la variación de la luminiscencia con la temperatura y por el otro el calentamiento específico de nanopartículas.
Los procesos que dan origen a luminiscencia dependen en general de la temperatura. En el caso de fluorescencia (emisión de luz desde un estado singulete de una molécula excitada mediante la absorción de luz) la temperatura puede influenciar varios procesos. Por ejemplo, el rendimiento cuántico de fluorescencia de la mayoría de los fluoróforos orgánicos decrece con la temperatura, típicamente con una tasa del 1- 2 /°C. Este efecto es conocido desde hace décadas y se tiene su origen en un número de procesos de de-excitación no radiativos activados por temperatura (p.e. colisiones con moléculas de solvente o vibraciones intramoleculares). Además, todos los fluoroforos orgánicos tienen la posibilidad de sufrir reacciones químicas desde el estado excitado que las transforman en moléculas no fluorescentes o que corren su espectro de absorción y/o emisión fuera del rango espectral de trabajo. Esto último se conoce como foto-blanqueo (photobleaching, bleaching) o foto-degradación. Este proceso es en general también activado por temperatura. En consecuencia, es un comportamiento típico que la emisión de fluorescencia de fluoroforos orgánicos decrece con el aumento de la temperatura. En el caso de fosforescencia (emisión de luz desde un estado triplete de una molécula excitada mediante absorción de luz) o fotoluminiscencia de semiconductores ocurren procesos similares.
En el caso más general, cambios de temperatura afectan cualquier tipo de luminiscencia en mayor o menor medida. Cualquier variación de luminiscencia producida por temperatura puede explotarse en el nuevo método de sensado.
Nanopartículas de diversos materiales pueden calentarse de manera específica mediante absorción selectiva de radiación electromagnética. Para esto se necesita que las nanopartículas absorban, en alguna región del espectro electromagnético, considerablemente más que el resto de los componentes de la muestra por unidad de volumen.
Por ejemplo, nanopartículas metálicas (p.e. de oro o plata) pueden calentarse mediante iluminación en el rango visible a la frecuencia de sus resonancias de plasmones (calentamiento plasmónico; plasmonic heating, photothermal heating). Otro ejemplo son las nanopartículas de materiales magnéticos, las cuales cuando tienen tamaños por debajo de un cierto umbral presentan comportamiento superparamagnético (p.e. nanopartículas de magnetita con 10 nm de diámetro) y pueden calentarse mediante la aplicación de campos magnéticos de alta frecuencia en el rango de radiofrecuencia.
Los campos de temperaturas pueden controlarse mediante la frecuencia, intensidad y distribución espacial y temporal de la radiación empleada. Es posible conseguir calentamiento únicamente en regiones nanométricas alrededor de las nanopartículas, dejando la temperatura en el resto del sistema inalterada. En regiones nanométricas se pueden alcanzar fácilmente temperaturas muy altas, incluso superiores al punto de ebullición del medio de suspensión.
El método de sensado molecular aprovecha el calentamiento local, específico y nanométrico alrededor de nanopartículas para detectar y cuantificar eventos de reconocimiento molecular. La figura 2 esquematiza los componentes necesarios. Se necesitan nanopartículas funcionalizadas superficialmente con una entidad de reconocimiento molecular específica para el analito (RMl). Otra o la misma entidad de reconocimiento molecular (RM2) se encuentra unida a una o varias especies luminiscentes. En presencia del analito se forman estructuras "sandwich" que dejan a las especies luminiscentes en la vecindad directa y nanométrica de las nanopartículas. Se necesita un mecanismo de calentamiento específico de las nanopartículas utilizadas. Cuando se irradia el sistema con la radiación de calentamiento, esta es absorbida específicamente por las nanopartículas, y se genera un campo de temperatura elevada localmente alrededor de las nanopartículas. Las especies luminiscentes unidas a las nanopartículas mediante el analito se verán afectadas por la temperatura, mientras que las que sigan libres en solución no. De la medición del efecto de la temperatura sobre la luminiscencia es posible cuantificar cuántas estructuras "sandwich" se han formado, y en consecuencia la cantidad de analito presente.
Si se monitorea en el tiempo el efecto de la temperatura sobre la luminiscencia es posible también obtener información sobre la cinética de la reacción de bioreconocimiento, lo cual a su vez provee información sobre las constantes de afinidad de la reacción.
Las pruebas experimentales de sensado molecular fueron realizadas usando nano-varillas de oro y fluoróforos AlexaFluor546. La demostración experimental se hizo en un ensayo para la detección de la proteína streptavidina. Para este fin las nano- varillas de oro y los fluoróforos fueron funcionalizados con biotina. La streptavidina tiene 4 sitios de reconocimiento específico para biotina, lo cual permite el ensamblado de sándwiches moleculares nanopartícula-analito-fluoróforo (Figura 3). Se usaron nano-varillas de oro aproximadamente cilindricas, de 25 nm de diámetro y 100 nm de longitud (Nanopartz inc). En la figura 4 se muestra una imagen TEM de las nano-varillas usadas y el espectro de absorción en el rango visible e infrarrojo cercano. El fluoróforo usado fue AlexaFluor546 (Life Technologies - Thermo Fisher Scientific Inc.), cuyos espectros de absorción y emisión se muestran en la figura 6.
En este caso particular la fluorescencia de AlexaFluor546 se excita a 532 nm y el calentamiento de las nano-varillas se realiza mediante iluminación en el infrarrojo cercano a 785 nm; a esta longitud de onda la capacidad de absorción por unidad de volumen de las nano-varillas de oro es ordenes de magnitud mayor a la de cualquier otro componente de la muestra, lo cual permite generar campos de temperatura específicamente en la vecindad nanométrica de las nanopartículas (figura 5). Esto significa que este campo de temperaturas elevadas influye de manera altamente preferencial a moléculas que se unen específicamente a las nanopartículas, y no al resto de las moléculas en la solución o el medio de trabajo; concepto fundamental del método.
Haciendo referencia a la figura 4 se observa una imagen de las nano-varillas de oro usadas con diámetro de 25 nm y longitud de 100 nm, en promedio obtenida mediante Transmission Electron Microscopy (TEM). La figura 6 muestra el espectro de absorción de las nano-varillas de oro, espectros de absorción y emisión de AlexaFluor546. Las bandas verticales indican las longitudes de onda usadas para la excitación de fluorescencia y para el calentamiento específico fototérmico de las nanopartículas. En la figura 5 se observa un gráfico que muestra el cálculo de la temperatura generada en la cercanía de una nano-varilla de oro cuando es iluminada con una densidad de potencia de 10kW/cm2.
El dispositivo experimental se muestra en la figura 7. Este consiste de un sistema de excitación y detección de fluorescencia, con la adición de una fuente de luz independiente para el calentamiento de las nanopartículas, en este caso un láser de onda continua de 785 nm. En dicha figura 7 se aprecian los componentes que forman parte del dispositivo experimental en donde DM: espejo dicroico, M: espejo, PMT: tubo fotomultiplicador, MMF: fibra óptica multimodo, L: lente.
La medición consiste en excitar y detectar la fluorescencia hasta tener una medición confiable de su intensidad. En ese instante se enciende la radiación de calentamiento. Esto produce un campo de altas temperaturas local alrededor de las nanopartículas el cual a su vez produce, en este caso, una disminución de la intensidad de fluorescencia. Una temperatura alta produce una reducción del rendimiento cuántico de fluorescencia y un aumento de probabilidad de reacciones de (foto-) degradación de los fluoróforos. La reducción de emisión de fluorescencia aumenta directamente con la potencia del haz de calentamiento (figura 8) y en suspensión es completamente reversible (Figura 9). En donde en la figura 8 se observa la reducción de fluorescencia de fluoróforos unidos a nano-varillas de oro en función de la intensidad del haz de calentamiento, en tanto que en el gráfico de la figura 9 se aprecian varios ciclos de reducción fototérmica de fluorescencia.
Finalmente se emplea este efecto de reducción fototérmica de emisión, local y específico, para cuantificar la presencia del analito, en este caso streptavidina. A mayor presencia de streptavidina, mayor cantidad de fluoróforo se une a las nanopartículas en el sándwich molecular nanopartícula-analito-fluoróforo. En consecuencia, la fracción de fluorescencia reducida es mayor (Figura 10). Haciendo referencia a la figura 10 y 11 se observa la reducción porcentual de fluorescencia en función de la concentración de analito (streptavidina) para dos composiciones del ensayo. Para la figura 10, la composición empleada es [NR-biotin] = 1 nM, [Alexa546- biotin] = 80 nM, [STV]= 5 - 80 nM, en tanto que para la figura 11 la composición empleada es [NR-biotin] = 1 nM, [Alexa546-biotin] = 5 nM, [STV]= 0 - 1.4nM.
La sensibilidad y el rango dinámico del sensor pueden adaptarse modificando las concentraciones de los componentes, como se ve en los ejemplos de las figuras 10 y 11. Las longitudes de onda de excitación de fluorescencia, de detección y de calentamiento usadas en esta demostración no son esenciales. El método puede aplicarse igualmente en cualquier otro rango espectral.
El uso de nano-varillas de oro no es esencial. Existen numerosas nanopartículas metálicas y no metálicas que proveen la absorción suficiente para generar un campo de temperaturas local mediante iluminación con longitudes de onda entre 300 y 2000 nm. Así mismo existen también las fuentes de luz adecuadas para su aplicación. Lo mismo vale para la especie luminiscente. En esta demostración se usó un fluoróforo orgánico pero se podría usar alternativamente una nanopartícula de material semiconductor (quantum dot), una molécula fosforescente o cualquier otra especie luminiscente que se vea afectada por temperatura.
En la demostración se usó un fluoróforo cuya emisión de fluorescencia decrece con la temperatura. De modo análogo, se podrían usar especies luminiscentes cuya emisión de fluorescencia aumentara con la temperatura, o alguna otra propiedad de la excitación o emisión (p.e. tiempo de vida media o espectros de absorción o emisión) variara suficientemente con la temperatura.
El uso de un chopper (Ch) o algún otro sistema de modulación de la excitación y la detección lock-in no son fundamentales, sino opcionales. Lo mismo ocurre para el calentamiento; también podría modularse el haz de calentamiento para filtrar y amplificar la señal modulada de fluorescencia y cuantificar la reducción fototérmica. Lo mismo ocurre con la fibra multi-modo y el tubo foto-multiplicador; no son fundamentales para el método y podría usarse cualquier otro sistema de fotodetección (fotodiodos, cámaras, etc.).
La concentración de analito se determinó en este caso a través de la reducción relativa (porcentual). Alternativamente puede hacerse mediante mediciones absolutas de variación con la temperatura de cualquier propiedad de la luminiscencia. Finalmente vale destacar que el método puede "multiplexarse", es decir usar en una mezcla simultáneamente varias nanopartículas que puedan ser calentadas específicamente por separado (e.d. con distintas fuentes de radiación de calentamiento), y/o varias especies luminiscentes que puedan ser excitadas y/o detectadas por separado. Esto permite sensar simultáneamente distintos analitos o en distintos rangos de concentración.
Si bien existen numerosos sensores basados en nanopartículas y/o algún tipo de luminiscencia (fluorescencia, fosforescencia, quimiluminiscencia, electroluminiscencia, etc.), el objeto de la presente invención presenta un método para detectar y cuantificar la presencia de un analito (molécula blanco) basado en la modificación o modulación de la luminiscencia mediante el calentamiento específico de nanopartículas.
La modulación de fluorescencia o luminiscencia de manera local en la vecindad nanométrica de nanopartículas, mediante el calentamiento específico de nanopartículas, no ha sido descripto para su uso en sensado molecular, biosensado o análisis cuantitativo de ningún tipo. Este nuevo mecanismo permite obtener sensibilidad sub-nanomolar en la detección de analitos en un sistema homogéneo (1 fase) o inhomogéneo (varias fases o incluyendo pasos de separación previos a la medición).
El mecanismo de sensado y cuantificación puede aplicarse a la detección de cualquier molécula de interés (p.e. proteína) para el cual se cuente con al menos una entidad de reconocimiento (p.e. anticuerpo). Este mecanismo para detectar la presencia y/o cuantificar la concentración de proteínas, antígenos, metabolitos o cualquier molécula relevante en solución es aplicable a análisis de clínico de diagnóstico, como así también a otros análisis cuantitativos no médicos.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:
1. Un método de sensado molecular basado en modulación de luminiscencia por calentamiento específico de nanopartículas, estando el método caracterizado porque comprende emplear mecanismos de calentamiento específico de nanopartículas para discernir contribuciones específicas de contribuciones de fondo
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de sensado molecular el cual consiste en la formación de un "sandwich molecular", en el cual dos entidades idénticas o diferentes se unen independientemente y en sitios diferentes al analito.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el método de sensado molecular se basa en la combinación de la variación de la luminiscencia con la temperatura y el calentamiento específico de nanopartículas.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque emplea un dispositivo el cual consiste en un sistema de excitación y detección de fluorescencia, con la adición de una fuente de radiación independiente para el calentamiento de las nanopartículas.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque dicha fuente de radiación independiente es una fuente de luz con longitud de onda en el rango de 300 a 2000 nm.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque permite obtener sensibilidad sub-nanomolar en la detección de analitos en un sistema homogéneo (1 fase), en donde la sensibilidad y el rango de concentraciones de trabajo puede adaptarse a las necesidades modificando las concentraciones de nanopartículas y especies luminiscentes.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque permite obtener sensibilidad sub-nanomolar en la detección de analitos en un sistema inhomogéneo (varias fases o incluyendo pasos de separación previos a la medición).
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque puede usar en una mezcla simultáneamente varias nanopartículas las cuales pueden ser calentadas específicamente por separado, y/o varias especies luminiscentes que puedan ser excitadas y/o detectadas por separado, con el objetivo de sensar distintos analitos o en distintos rangos de concentración simultáneamente.
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