WO2016006955A1 - 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머 및 이의 제조방법 - Google Patents

인지장애 질환 검출용 단백질 다이머 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2016006955A1
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protein dimer
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김혜연
이세진
김현진
최지원
김동진
배애님
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Korea Institute of Science and Technology KIST
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention can be used to detect cognitive impairment disorders that can be used for development of antibodies that can be used for diagnosing cognitive impairment disorders as well as differences in toxicity according to parallel or non-parallel conformation. It relates to a protein dimer and a method for producing the same.
  • Cognitive impairment disorders result from neuronal dysfunction and impairment, which can be caused by toxic, agglomerated proteins, and many neurological disorders are characterized by such conditions. These include diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, prion disease, polyglutamine dilatation, spinal cerebellar ataxia, spinal cord and soft muscle atrophy, spongy encephalopathy, tauopathy, Huntington's disease, or dystonia It includes.
  • AD Alzheimer's disease
  • dementia is a degenerative brain disease characterized by clinically progressive cognitive decline and behavioral disorders.
  • the main neuropathological findings of the disease are the aggregation and deposition of two insoluble proteins in the hippocampus and the cortex, and the accumulation of senile plaque (SP) composed of beta amyloid protein (A ⁇ ) outside neurons, Neurofibrillary tangles (NFTs), which consist of hyperphosphorylated tau proteins, were found in neurons.
  • SP senile plaque
  • a ⁇ beta amyloid protein
  • NFTs Neurofibrillary tangles
  • AD acetylcholinesterase inhibitors
  • AChE is also involved in the pathogenesis of AD through its noncholinergic effects, promoting the accumulation of beta amyloid proteins or transforming beta amyloid proteins into insoluble fibrils.
  • AChEI cannot be a fundamental treatment for AD because it cannot slow or stop the progression of the disease. While not complete, advances in the pathogenesis of AD are developing new mechanisms based on mechanisms.
  • beta amyloid protein As a common cause of hereditary and sporadic AD have been actively conducted. Although it has been reported that the beta amyloid protein plays a role in protecting neurons, the exact function is not yet known.
  • the beta amyloid protein is made in small quantities in various places in the human body even in a normal person, but is rapidly decomposed and accumulated in the human body after being made. However, if you look at the brain tissue of AD patients, the beta-amyloid protein is accumulated and aggregated. This is due to the excessive production of abnormally high levels of beta amyloid protein in places such as the hippocampus and the cerebral cortex, which play important roles in memory and learning.
  • the integrated beta amyloid protein causes inflammatory reactions in surrounding cells, damaging nerve cells and even damaging neural networks that maintain normal brain function.
  • the integrated beta amyloid protein has been shown to produce a lot of free radicals that activate signaling systems that kill nerve cells.
  • beta amyloid protein is a polypeptide consisting of 39-43 amino acid residues derived from amyloid protein precursor (APP) cleaved by ⁇ -, ⁇ -degrading enzymes (Wilson CA, Doms RW, Lee VM-Y. Intracellular APP processing and A production in Alzheimer's disease.J. Neuropath.Exp. Neurol. 1999; 58: 787-794).
  • the monomers undergo direct fibril sequential order to exhibit strong neurotoxicity (Forloni GE, Angeretti LN, Della Torre P, Salmona M. Amidation of -amyloid peptide strongly reduced the amyloidogenic activity without alteration of neurotoxicity J. Neurochem. 1997; 69: 2048-2054).
  • beta amyloid protein in nature is rapidly accumulated from the moment as a dimer and cannot be studied. Synthesis of proteins having a structure similar to that in which beta amyloid protein is accumulated (dimer, trimer, tetramer, etc.) is required.
  • An object of the present invention is to provide a protein dimer for detecting a cognitive disorder disease that can be used to diagnose the cognitive disorder disease.
  • Another object of the present invention to provide an antigen comprising the protein dimer for detecting the cognitive disorders.
  • Another object of the present invention to provide an antibody that specifically binds to the antigen.
  • Another object of the present invention is to provide a ligand molecule for the development of a substance other than an antibody that can recognize the protein dimer.
  • Another object of the present invention is to provide a nuclear medical brain imaging diagnostic target material that can recognize the protein dimer.
  • another object of the present invention is to provide a method for photographing with a nuclear medical imaging device (SPECT) using the target material for diagnosing brain images.
  • SPECT nuclear medical imaging device
  • Another object of the present invention to provide a method for producing the protein dimer.
  • a protein dimer for detecting a cognitive disorder of the present invention for achieving the above object may be represented by the following [Formula 1]:
  • P and P ⁇ are proteins or fragments thereof, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of P and P ⁇ in L, or (parallel) Or have an amino acid sequence identical to each other in the L direction at the outermost side of P and the outermost direction of the P ′ at L (anti-parallel),
  • S and S ′ are the same as or different from each other, and are each independently a single bond or a spacer, and L is a linker.
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of the P and the P ⁇ in L (parallel)
  • the protein dimer of 1] can be represented by the following [Formula 1-1];
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the C terminal from the N terminal when viewed in the L direction from the outermost, the C P ⁇ N is at the C terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction from the L The direction of the N terminus.
  • each of the protein dimer of [Formula 1] may be represented by the following [Formula 1-1a];
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the N terminal to the C terminal when viewed in the L direction from the outermost
  • the N S C is the C terminal at the N terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • C S ⁇ N represents the direction of the N- terminal from the C terminal when the S ⁇ is viewed from the L to the P ⁇ direction
  • C P ⁇ N represents the P ⁇ in the L It is the direction from the C terminus to the N terminus when viewed in the outermost direction.
  • S and S ⁇ are the same or different, wherein P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of the P and the P ⁇ in L (parallel)
  • the protein dimer of 1] may be represented by the following [Formula 1-2];
  • the C P N indicates that the P is in the direction of the N terminal from the C terminal when viewed in the L direction at the outermost, and the N P ⁇ C is at the N terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction at the L In the direction of the C terminus.
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence as each other in the outermost direction of P and P ⁇ in L, and the S And wherein S ′ is independently a single bond or a spacer having an amino acid sequence, the protein dimer of [Formula 1] may be represented by the following [Formula 1-2a];
  • the C P N indicates that the P is in the direction of the N terminal from the C terminal when viewed in the L direction from the outermost
  • the C S N is N terminal at the C terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • N S ⁇ C indicates that S ⁇ is a direction from the N terminal to the C terminal when viewed from the L to the P ⁇ direction
  • N P ⁇ C indicates that P ⁇ is the L When viewed in the outermost direction, it is the direction of the N-to-C terminal.
  • S and S ⁇ are the same or different and have the same or different amino acid sequences in the L direction at the outermost part of P and the outermost direction of the P ⁇ at L (anti-parallel ),
  • the protein dimer of [Formula 1] may be represented by the following [Formula 1-3];
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the C terminal from the N terminal when viewed in the L direction at the outermost, and the N P ⁇ C is at the N terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction at the L In the direction of the C terminus.
  • S and S ⁇ are the same or different and have the same or different amino acid sequences in the L direction at the outermost part of P and in the outermost direction of P ⁇ at L (anti-parallel ), wherein S and S ⁇ are each independently a single bond or a protein dimer of [Formula 1] which is a spacer having an amino acid sequence may be represented by the following [Formula 1-3a];
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the N terminal to the C terminal when viewed in the L direction from the outermost, and the N S C is the C terminal at the N terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • N S ⁇ C indicates that S ⁇ is a direction from the N terminal to the C terminal when viewed from the L to the P ⁇ direction
  • N P ⁇ C indicates that P ⁇ is the L When viewed in the outermost direction, it is the direction of the N-to-C terminal.
  • the P and the P ⁇ are a protein or a fragment thereof capable of forming aggregates, preferably a protein selected from the group consisting of 1 to 42 beta amyloid, tau protein, synuclein, and prion protein, or fragments thereof, More preferably, it may be selected from beta amyloid 40, beta amyloid 42 and any one fragment thereof.
  • aggregates are formed by binding proteins or peptides, and mean aggregates of dimers or more.
  • the fragment may include an amino acid sequence capable of forming aggregates in the amino acid sequence of beta amyloid 40 or beta amyloid 42.
  • the spacer may be polyethylene glycol or a peptide, preferably a peptide having a length of 5 to 30 amino acids, and more preferably a peptide including the amino acid sequence of GGGSGGGS.
  • the L may include two amine groups (diamine groups) or two carboxyl groups (dicarboxyl groups), and L may further include a functional group capable of binding to a substrate.
  • the substrate can be Wang's resin, Merrifield resin, or derivatives thereof.
  • L is alkyne ( ) And azide (R ⁇ -N 3 ) Husgen Cycloaddition reaction combination
  • R and R ⁇ are or May be the same or different.
  • the azide is H 2 NCH (N 3 ) COOH or H 2 NCH (CH 2 CH 2 CH 2 N 3 ) COOH
  • the alkyne is H 2 NCH (C ⁇ CH) COOH or H 2 NCH (CH 2 CH 2 CH 2 C ⁇ CH) COOH.
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence as each other in the outermost direction of P and P ⁇ in L, wherein [ The protein dimer of Formula 1 is represented by the following [Formula 1-1],
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the C terminal from the N terminal when viewed in the L direction from the outermost, the C P ⁇ N is at the C terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction from the L It represents the direction of an N terminal, and said L contains a diamine group.
  • L may further include a carboxyl group, preferably L is lysine (lysine, K).
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence as each other in the outermost direction of P and P ⁇ in L, and the S And wherein S ′ is independently a single bond or a spacer having an amino acid sequence, the protein dimer of [Formula 1] may be represented by the following [Formula 1-1a];
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the N terminal to the C terminal when viewed in the L direction from the outermost
  • the N S C is the C terminal at the N terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • C S ⁇ N represents the direction of the N- terminal from the C terminal when the S ⁇ is viewed from the L to the P ⁇ direction
  • C P ⁇ N represents the P ⁇ in the L When viewed in the outermost direction, it represents a direction from the C terminal to the N terminal, wherein L contains a diamine group.
  • L may further include a carboxyl group, and preferably L is lysine.
  • S and S ⁇ are the same or different, wherein P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of the P and the P ⁇ in L (parallel)
  • the protein dimer of 1] may be represented by the following [Formula 1-2];
  • the C P N indicates that the P is in the direction of the N terminal from the C terminal when viewed in the L direction at the outermost, and the N P ⁇ C is at the N terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction at the L It represents a direction of the C-terminal, and L includes a dicarboxyl group.
  • L may further include an amine group, preferably L is glutamic acid (E).
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence as each other in the outermost direction of P and P ⁇ in L, and the S And wherein S ′ is independently a single bond or a spacer having an amino acid sequence, the protein dimer of [Formula 1] may be represented by the following [Formula 1-2a];
  • the C P N indicates that the P is in the direction of the N terminal from the C terminal when viewed in the L direction from the outermost
  • the C S N is N terminal at the C terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • N S ⁇ C indicates that S ⁇ is a direction from the N terminal to the C terminal when viewed from the L to the P ⁇ direction
  • N P ⁇ C indicates that P ⁇ is the L When viewed in the outermost direction, it represents a direction from the N terminal to the C terminal, wherein L contains a dicarboxyl group.
  • L may further include an amine group, preferably L is glutamic acid (E).
  • L may further include a functional group capable of binding to a substrate, and the functional group may be selected from an amine group, a carboxyl group, an ester group, or a hydroxyl group.
  • the protein dimer may consist of the sequence of [SEQ ID NO: 1]:
  • protein dimer may consist of the sequence of the following [SEQ ID NO: 2]:
  • the antigen for detecting a cognitive disorder disease of the present invention for achieving the above another object may include the protein dimer.
  • the antibody of the present invention for achieving the above another object may be to specifically bind to the antigen.
  • the bioaggregate may be an aggregate of at least dimers of beta amyloid.
  • the material for recognizing the protein dimer of the present invention for achieving the above another object may include an antibody that interacts with the protein dimer.
  • the protein dimer of the present invention can be used as a ligand molecule to develop the recognizable substance.
  • the target material for diagnosing nuclear medical brain imaging of the present invention for achieving the above another object may include a material for recognizing the protein dimer.
  • the nuclear medical brain image measuring method of the present invention for achieving the above another object is a nuclear medical imaging apparatus for the increase in lesions specifically for cognitive impairment after inputting the target material for nuclear medical brain imaging diagnosis (SPECT) may include the step of photographing.
  • SPECT nuclear medical brain imaging diagnosis
  • the method for producing a protein dimer of the present invention for achieving the above another object is, in one embodiment, is represented by the following [Formula 1-1],
  • S and S ⁇ are a single bond, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence as each other in the outermost direction of P and P ⁇ in L,
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the C terminal from the N terminal when viewed in the L direction from the outermost, the C P ⁇ N is at the C terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction from the L
  • a method for producing a protein dimer showing the direction of the N terminal
  • S and S ⁇ are non-peptide spacers or spacers having the same or different amino acid sequences, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of P and P ⁇ in L ,
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the N terminal to the C terminal when viewed in the L direction from the outermost
  • the N S C is the C terminal at the N terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • C S ⁇ N represents the direction of the N- terminal from the C terminal when the S ⁇ is viewed from the L to the P ⁇ direction
  • C P ⁇ N represents the P ⁇ in the L
  • P and P ′ may be selected from beta amyloid 40, beta amyloid 42, and any one of these fragments, and the functional group may be a carboxyl group.
  • S and S ⁇ are a single bond, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence as each other in the outermost direction of P and P ⁇ in L,
  • the C P N indicates that the P is in the direction of the N terminal from the C terminal when viewed in the L direction at the outermost, and the N P ⁇ C is at the N terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction at the L
  • a method for producing a protein dimer showing the direction of the C terminal
  • S and S ⁇ are non-peptide spacers or spacers having the same or different amino acid sequences, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of P and P ⁇ in L ,
  • the C P N indicates that the P is in the direction of the N terminal from the C terminal when viewed in the L direction from the outermost
  • the C S N is N terminal at the C terminal when the S is viewed in the L direction from the P
  • N S ⁇ C indicates that S ⁇ is a direction from the N terminal to the C terminal when viewed from the L to the P ⁇ direction
  • N P ⁇ C indicates that P ⁇ is the L
  • a ⁇ binding at least two of said P and said P ⁇ to a substrate;
  • B ⁇ combining the two adjacent P and the P ⁇ with the S and the S ⁇ among the two or more P and the P ⁇ ;
  • C ⁇ combining the S and one L including the S ⁇ and the dicarboxyl group;
  • D ⁇ cutting the substrate with the P and the P ⁇ to obtain a protein dimer.
  • the P and the P ⁇ may be selected from beta amyloid 40, beta amyloid 42 and any one of them, and may be formed by sequentially combining a number of amino acids selected from 1 to 42 amino acids.
  • S and S ⁇ are a single bond and have the same amino acid sequence in the L direction at the outermost part of P and the outermost direction of the P ⁇ at L (anti-parallel),
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the C terminal from the N terminal when viewed in the L direction at the outermost, and the N P ⁇ C is at the N terminal when the P ⁇ is viewed in the outermost direction at the L
  • a method for producing a protein dimer showing the direction of the C terminal
  • step (a) binding said P ⁇ to a substrate; (b) combining the P ⁇ and L including a diamine group; (c) attaching a protecting group to one amine group of the diamine groups contained in L; (d) bonding the P to another amine group contained in L; (e) removing the protecting group attached in step (c); And (f) cleaving the substrate and the P ⁇ to obtain a protein dimer.
  • S and S ⁇ are non-peptide spacers or spacers having the same or different amino acid sequences, and have the same amino acid sequence in the outermost direction of P in the L direction and in the outermost direction of P ⁇ in L (anti- parallel),
  • the N P C indicates that the P is in the direction of the N terminal to the C terminal when viewed in the L direction from the outermost, and the N S C is the C terminal at the N terminal when the S is viewed in the L direction from the P And N S ⁇ C indicates that S ⁇ is a direction from the N terminal to the C terminal when viewed from the L to the P ⁇ direction, and N P ⁇ C indicates that P ⁇ is the L As a method for producing a protein dimer showing the direction from the N terminal to the C terminal when viewed in the outermost direction,
  • the P and the P ⁇ may be selected from beta amyloid 40, beta amyloid 42 and any one of them, and may be formed by sequentially combining a number of amino acids selected from 1 to 42 amino acids.
  • the amine group to which the protecting group is attached is an amine group chemically bonded to a side chain, and the protecting group is 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 4-methyltrityl (Mtt) or t-butoxycarbon It may be Nec (Boc).
  • the dimer structure can be obtained only by protecting the amine group of a side chain as mentioned above.
  • step (I) combining the compound of which P ′ and the terminal is an azide group; (II) combining the P and the compound whose terminal is an alkyne group; And (III) L may be formed by reaction of the azide group of step (I) with the alkyne group of step (II) to obtain a protein dimer.
  • the P and the P ⁇ may be formed by sequentially combining the number of amino acids selected from 1 to 42 amino acids, preferably may be formed by sequentially combining the number of amino acids selected from 1 to 42 amino acids.
  • the compound in which the terminal is an azide group and the compound in which the terminal is an alkyne group are represented by R ⁇ -N 3 and R- ⁇ , wherein R and R ⁇ or May be the same or different.
  • an integer of m 1 to 3
  • * denote a binding site that is an azide group or an alkyne group.
  • oligomeric oligomers dimers, trimers, tetramers, and the like
  • differences in toxicity according to parallel or non-parallel conformations using the protein dimers for detecting cognitive disorders synthesized according to the present invention, it is confirmed that they have toxicity It was.
  • the protein dimer of the present invention has a structure similar to that of natural protein aggregates in the brain, an antibody that recognizes the natural protein aggregates can be prepared when the protein dimer is reacted with the natural protein aggregates in the brain.
  • Developing materials that can recognize The recognizable materials include fluorescent materials, light absorbing materials, light emitting materials, materials that can be used in nuclear medicine, and the like.
  • by preparing a target material for diagnosing nuclear medical brain imaging capable of recognizing protein dimers natural protein aggregates in the brain may be diagnosed by brain imaging.
  • Figure 1a is a diagram showing a protein dimer of parallel conformation prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1b is a diagram showing a protein dimer of parallel conformation prepared according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is a graph measured by ESI-MASS protein dimer prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2b is a graph measured by ESI-MASS protein dimer prepared according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a simulation diagram measuring the simulation of the protein dimer prepared according to one embodiment of the present invention, the protein dimer prepared according to another embodiment and beta amyloid protein monomer two strands.
  • Figure 4 is a graph measuring the fluorescence intensity of the protein dimer prepared according to one embodiment of the present invention, the protein dimer and beta amyloid protein monomer prepared according to another embodiment.
  • 5 is an indicator showing aggregate formation levels for protein dimers prepared according to one embodiment of the present invention, protein dimers prepared according to another embodiment, and beta amyloid protein monomers.
  • Figure 6 is a graph measuring cell viability for the group treated with the beta amyloid protein monomer, the group treated with the protein dimer of one embodiment and the group treated with the protein dimer of another embodiment.
  • Figure 7a is a graph showing the percentage of behavioral changes for the untreated group, the group treated with beta amyloid protein monomer, the group treated with the protein dimer of one embodiment and the group treated with the protein dimer of another embodiment.
  • 7B is a graph showing passive avoidance for the untreated group, the group treated with beta amyloid protein monomer, the group treated with protein dimer of one embodiment and the group treated with protein dimer of another embodiment.
  • the present invention is synthesized in a structure similar to the dimers and oligomers in which the native protein is integrated in the brain, as well as the difference in toxicity according to parallel or non-parallel conformation, as well as the toxicity according to the oligomer structure of the dimer.
  • the present invention relates to a protein dimer for detecting a cognitive disorder disease and a method for preparing the same, which can be used for the development of an antibody or a substance capable of recognizing an oligomer structure of a dimer or more.
  • the cognitive disorders include Creutzfeldt-Jakob disease, Spongiform encephalopathies, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, Serpin deficiency, cirrhosis ), Prion disease, polyglutamine dilatation, spinal cerebellar ataxia, spinal cord and atrophic muscle atrophy, spongy encephalopathy, tau, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis, Fronto-temporal dementias, elderly systemic amyloidosis, family Familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloid angiopathy, age-related macular degeneration, Alzheimer's disease, radiotherapy induced dementia, axonal injury axon injury, acute cortical spreading depression, alpha-synucle Alpha-synucleinopathies, brain ischemia, permanent focal cerebralischemia, peripheral nerve regeneration, post-status epilepticusmodel, and sporadic amyotroph
  • protein dimers are synthesized in parallel or non-parallel structures to observe pathologically preferred protein dimer forms.
  • Protein dimer for detecting a cognitive disorder of the present invention comprises P, S, L, S ⁇ , P ⁇ , wherein the amino acid sequence of P and the amino acid sequence of P ⁇ is parallel (parallel) or anti-parallel It has a three-dimensional structure arranged so as to be represented by the following [Formula 1].
  • P and P ⁇ are a protein (full length) or a fragment thereof (truncated),
  • the P and the P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of the P and the P ⁇ in the L (parallel) or the outermost of the P ⁇ in the L direction and the L in the outermost of the P Have an amino acid sequence identical to each other in the outer direction (anti-parallel), wherein S and S ⁇ are the same or different from each other and are each independently a single bond or a spacer, and L is a linker.
  • the protein dimer for detecting a cognitive disorder of the present invention as shown in Figure 1, the P and P ⁇ is connected to both ends of the L has a folding (folding) structure.
  • S and P at both ends of L; S and P are each connected in sequence and are connected to the ends of the L and S; S ⁇ and P ⁇ have a folding structure.
  • the protein dimer of [Formula 1] is represented by the following [Formula 1-1] to [Formula 1-3] according to the three-dimensional structure arranged in parallel (parallel) or anti-parallel.
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of P and P ⁇ in L (parallel),
  • the protein dimer of Chemical Formula 1 is represented by the following [Formula 1-1].
  • C and N refer to a carboxyl group (C) and an amine group (N) formed at the ends of P and P ⁇ , for example, S- c P N is a carboxyl group of P is bonded to S and the amine group at the end Means provided.
  • S and S ⁇ are the same or different, and P and P ⁇ have the same amino acid sequence in the outermost direction of P and P ⁇ in L (parallel),
  • the protein dimer of Chemical Formula 1 is represented by the following [Formula 1-2].
  • S and S ⁇ are the same or different, and have the same or different amino acid sequence in the L direction at the outermost side of P and the outermost direction of the P ⁇ at L (anti-parallel),
  • the protein dimer of Chemical Formula 1 is represented by the following [Formula 1-3].
  • P and P ⁇ have the same or different amino acid sequences in the L direction at the outermost side of P and in the outermost direction of P ⁇ at L, wherein the same amino acids
  • the sequence means that P and P ⁇ have the same amino acid sequence and are present in different directions, so that the outermost shells are different from C and N, respectively.
  • the different amino acid sequences have the outermost shell with P and P ⁇ having different amino acid sequences. This means that they are different with C and N, respectively.
  • the P and P ⁇ used in the present invention is a protein or fragment thereof capable of forming aggregates, preferably a protein selected from the group consisting of beta amyloid, tau protein, synuclein, and prion protein of 1 to 42, or a fragment thereof. , More preferably beta amyloid 40, beta amyloid 42 and fragments of any one of them.
  • the fragment includes an amino acid sequence capable of forming aggregates in the amino acid sequence of beta amyloid 40 or beta amyloid 42, and specifically, only a part of the amino acid sequence of beta amyloid 40 or beta amyloid 42 is synthesized or the beta amyloid 40 or beta amyloid A short amino acid sequence obtained by cleaving and removing part of the amino acid sequence of 42.
  • the spacer is not particularly limited as long as it is a material that is flexible and can maintain a constant distance between the P and P ⁇ , preferably polyethylene glycol or a peptide
  • the spacer is not particularly limited as long as it is a material that is flexible and can maintain a constant distance between the P and P ⁇ , preferably polyethylene glycol or a peptide
  • Each may be independently the same or differently selected, more preferably a peptide having a length of 5 to 30 amino acids, more preferably a peptide having an amino acid sequence including GGGSGGGS.
  • the L is not particularly limited as long as it can connect P and P ⁇ , but may include a diamine group, a dicarboxyl group or a heteroaromatic.
  • L may include a diamine group and a functional group capable of bonding with the substrate, preferably may be lysine (lysine);
  • [Formula 1-2] and [Formula 1-2a] L may include a dicarboxyl group and a functional group capable of bonding with the substrate, preferably may be glutamic acid;
  • [Formula 1] to [Formula 3] L is alkyne ( ) And an azide (R′-N 3 ) Husgen Cycloaddition reaction combination, a diamine group or a carboxyl group, and a functional group capable of binding to a substrate.
  • the substrate is not particularly limited as long as it can fix L, but preferably includes Wang's resin, Merrifield resin, or derivatives thereof, and more preferably, alcohol-terminated It may be a royal resin with a Carboxypolystyrene base.
  • the functional group is not particularly limited as long as it is a functional group that can be bonded to a substrate, preferably an amine group, a carboxyl group, an ester group or a hydroxyl group, and more preferably a functional group when L contains a diamine group. Is a carboxyl group and when L contains a dicarboxyl group, the functional group is an amine group.
  • the protein dimers expressed as described above have three types of three-dimensional structures arranged in parallel or anti-parallel when the amino acid sequences of P and P ⁇ are the same ([Formula 2] to [ Formula 4]); When the amino acid sequences of P and P ⁇ are different, they may have four types ([Formula 5] to [Formula 8]) having three-dimensional structures arranged anti-parallel.
  • S and S ⁇ is a spacer or a single bond having the same amino acid sequence.
  • the protein dimer for detecting a cognitive disorder according to the present invention has a three-dimensional structure in which P and P ⁇ are parallel or anti-parallel, but the parallel three-dimensional structure has little toxicity.
  • nonparallel conformations are more toxic than parallel conformations, leading to hippocampus-dependent learning and memory deficits.
  • less than about 10% of people with high concentrations of natural protein in the brain do not develop cognitive impairment, which appears to aggregate in the form of a parallel conformation with little toxicity.
  • the protein dimer for detecting a cognitive disorder according to the present invention may be composed of a sequence disclosed in [SEQ ID NO: 1] (parallel conformation) or a sequence disclosed in [SEQ ID NO: 2 (nonparallel conformation).
  • the present invention may provide an antigen for detecting a cognitive disorder, including the protein dimer for detecting the cognitive disorder, and an antibody specifically binding to the antigen.
  • Antibodies prepared using protein dimers for detecting cognitive impairment diseases do not react with monomers, but specifically react with oligomers with dimers or more in which protein monomers are aggregated to recognize oligomers with or above dimers.
  • Recognition is not particularly limited as long as it recognizes the oligomer.
  • recognizing when an antibody reacts with the oligomer to generate a signal, when an antibody prepared by using a protein dimer having a parallel conformation meets an oligomer of a dimer or more having a parallel conformation, a signal is generated and criticized.
  • an antibody prepared using a protein dimer having a row conformation encounters an oligomer of a dimer or higher having a non-parallel conformation, a signal is generated.
  • Methods of generating antibodies specific for an antigen are well known in the art. There are two methods for generating the antibody, one method is a monoclonal antibody (monoclonal antibody) or through an immunization method (administration) to administer to the animal the protein antigen for detecting the cognitive disorder disease Polyclonal antibodies can be prepared, and another method is to find an antigen-specific antibody by using a library of antibodies to find a target antibody.
  • the present invention may provide a material capable of recognizing the protein dimer, including an antibody capable of interacting with a protein dimer for detecting a cognitive disorder disease.
  • the material capable of recognizing the protein dimer is not particularly limited, and may also include materials capable of giving signals such as fluorescence, light absorption, and luminescence.
  • the substance capable of recognizing the protein dimer is protein-protein interaction, protein (antigen) -antibody interaction, protein-small molecule interaction (protein-small molecule interaction) interaction).
  • protein-protein interaction protein (antigen) -antibody interaction
  • protein-small molecule interaction protein-small molecule interaction
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • SPR surface plasmon resonance
  • the protein dimer of the present invention may be used as a ligand molecule to find a substance that can interact with the protein dimer of the present invention through the above method.
  • the role of the protein dimer of the present invention is not limited to a method of finding a substance that can interact with the protein dimer and a substance that can interact with the protein dimer.
  • the amount of natural protein oligomer was measured by using a questionnaire or MRI or by extracting the cerebrospinal fluid, but the methods of diagnosing the questionnaire, the MRI and the cerebrospinal fluid were all inaccurate.
  • the method of extracting the cerebrospinal fluid is diagnosed by the amount of oligomers present in the cerebrospinal fluid is less accurate than the actual accuracy is low.
  • the antibody formed by the antigen having a three-dimensional structure arranged in parallel or non-parallel of the present invention it is possible to accurately measure the cognitive impairment disease because it can measure not only the aromatic but also the content of the protein oligomer.
  • the present invention may be provided to develop a target material for diagnosing nuclear medical brain imaging using a material capable of recognizing a protein dimer for detecting a cognitive disorder.
  • the substance capable of recognizing the protein dimer for detecting a cognitive disorder disease includes an antibody capable of interacting with the protein dimer, the protein dimer having a structure similar to that of the protein dimer in the brain can be recognized, so that the protein dimer in the brain can also be diagnosed.
  • the substance capable of recognizing the protein dimer for detecting a cognitive disorder disease exhibits a observable mark when reacted with a natural protein dimer in the brain, the observable mark can be observed with a nuclear medical imaging apparatus (SPECT).
  • SPECT nuclear medical imaging apparatus
  • the present invention can provide a method for producing a protein dimer for detecting a cognitive disorder disease.
  • the protein dimer for detecting a cognitive disorder of the present invention may be prepared by various methods depending on the constituent conditions.
  • Method for producing a protein dimer according to the [Scheme 1], First, (A) combining the functional group and the substrate (M) of L containing a diamine group and a functional group; (B) combining the P and the P ⁇ with each amine group included in L; And (C) cutting the L and the substrate (M) to obtain a protein dimer.
  • the step of binding the protein P or P ⁇ may be carried out by peptide binding of the amino acids constituting the protein P or P ⁇ in sequence.
  • synthesizing proteins by extending the amino acid sequence it is well known that synthesis is possible only from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • S or S ⁇ is a spacer having an amino acid sequence
  • the synthesis is the same as the synthesis of the above P or P ⁇ .
  • S or S ⁇ is a non-peptide spacer such as polyethylene glycol (PEG), it can be directly combined in one step.
  • PEG polyethylene glycol
  • Reaction Scheme 1 and the following Reaction Scheme C and N respectively means a carboxyl group (C) and an amine group (N) formed at the terminal, for example, L N N - C P N is a carboxyl group of P L amine It means that is bonded to the group and provided with an amine group at the P terminal.
  • Method for producing a protein dimer according to the [Scheme 2], first, (A ⁇ ) combining the functional group and the substrate (M) of L containing a diamine group and a functional group; (B ⁇ ) combining S and S ⁇ with each amine group included in L; (C ⁇ ) combining P and P ⁇ to each of S and S ⁇ ; And (D ⁇ ) cutting the L and the substrate (M) to obtain a protein dimer.
  • the functional group of L may be preferably a carboxyl group.
  • Method for producing a protein dimer according to the [Scheme 3], first, (A ⁇ ) to combine two or more P and P ⁇ to the substrate (M); (B ⁇ ) combining one of the two or more P and P ⁇ adjacent L and the L containing the dicarboxyl group; (C ⁇ ) cutting the P and P ⁇ and the substrate (M) to obtain a protein dimer.
  • Method for producing a protein dimer according to the above [Scheme 4], First, the step of binding two or more P and P ⁇ to the (A ⁇ ) substrate; (B ⁇ ) combining two adjacent P and P ⁇ with S and S ⁇ among two or more P and P ⁇ ; (C ⁇ ) combining the S and S ⁇ with one L including the dicarboxyl group; (D ⁇ ) cutting the substrate bound to P and P ⁇ to obtain a protein dimer.
  • the P and the P ⁇ and the peptide spacers S and S ⁇ are formed by sequentially combining amino acids one by one.
  • Method for producing a protein dimer according to the [Scheme 5] First, (a) binding P ⁇ to the substrate (M); (b) combining the P ⁇ and L including a diamine group; (c) attaching a protecting group (Pro) to one amine group of the diamine groups contained in L; (d) binding P to another amine group contained in L; (e) removing the protecting group attached in step (c); And (f) cleaving the substrate (M) and P ′ to obtain a protein dimer.
  • Method for producing a protein dimer according to the [Scheme 6], first, (a ⁇ ) binding P ⁇ to the substrate (M); (b ⁇ ) combining the P ⁇ and S ⁇ ; (c ⁇ ) combining L with the S ⁇ and a diamine group; (d ⁇ ) attaching a protecting group (Pro) to one amine group of the diamine groups contained in L; (e ⁇ ) binding S to another amine group contained in L; (f ⁇ ) binding P to S; (g ⁇ ) removing the protecting group attached in the step (d ⁇ ); And (h ⁇ ) cleaving the substrate (M) and P ⁇ to obtain a protein dimer.
  • the amine group to which the protecting group is attached is an amine group chemically bonded to a side chain, and is farther from the main chain than the amine group to which the protecting group is not attached.
  • the said protecting group is not specifically limited, Preferably, 9-fluorenyl methoxycarbonyl (Fmoc), 4-methyltrityl (Mtt), or t-butoxycarbonyl (Boc) is mentioned.
  • L includes a diamine group and a carboxyl group, each of the domains (P, P ⁇ , S and S ⁇ ) connected to the terminal of L are the above [Scheme 1] to It is a folding structure as shown in [Scheme 4].
  • DIEA diisopropylethylamine, 2 mL, in DMF
  • HBTU solution O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium he
  • Peptide-based resins with substrate bound to each reaction were washed for 20 seconds in the order of DMF, DCM, and DMF, and the Fmoc-protecting group was washed in 20% piperidine solution (1: 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v) was removed by shaking for 5 minutes and 15 minutes (twice, each with 5 minutes of DMF).
  • the protein dimer with the completed substrate bound to the Fmoc-protecting group was removed, washed with DCM, stored under reduced pressure, followed by TFA / anisole / TIS (95: 2.5: 2.5, v / v / v). After shaking for 4 hours, the resin and the protein dimer were separated, and the TFA was completely removed using a vacuum concentrator. Then, the protein dimer was treated with 45 ml of diethyl ether, followed by centrifugation at 3000 rpm twice for 10 minutes, and then the precipitated white protein dimer was dissolved in 25% acetonitrile aqueous solution and lyophilized to give a white solid powder. The protein dimer of the parallel stereostructure of was obtained.
  • Example 1 The preparation process of Example 1 is shown in Scheme 9 below, and the parallel dimer protein dimer prepared in Example 1 is illustrated in FIG. 1A.
  • beta amyloid (A ⁇ ) 1-40 P and P ′, 1.1 mmol
  • H 2 N-GGGSGGGS-COOH amino acid sequences (S and S ′) 1.1 mmol
  • Fmoc-protected amino acids 1.0 M DIEA (diisopropylethylamine, 2 mL, in DMF) and 0.4 M HBTU solution (O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2: 3 DMF / DMSO, v / v) was dissolved in 8 ml of the reaction and reacted with the valine with the protecting group removed for 50 minutes.
  • Peptide-based resins with substrate bound to each reaction were washed for 20 seconds in the order of DMF, DCM, and DMF, and the Fmoc-protecting group was washed in 20% piperidine solution (1: 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v) was removed by shaking for 5 minutes and 15 minutes (twice, each with 5 minutes of DMF).
  • the protein dimer with the completed substrate bound to the Fmoc-protecting group was removed, washed with DCM, stored under reduced pressure, followed by TFA / anisole / TIS (95: 2.5: 2.5, v / v / v). After shaking for 4 hours, the resin and the protein dimer were separated, and the TFA was completely removed using a vacuum concentrator. Then, the protein dimer was treated with 45 ml of diethyl ether, followed by centrifugation at 3000 rpm twice for 10 minutes, and then the precipitated white protein dimer was dissolved in 25% acetonitrile aqueous solution and lyophilized to give a white solid powder. A non-parallel conformation protein dimer of was obtained.
  • Example 2 The preparation process of Example 2 is shown in Scheme 10 below, and the protein dimer of the anti-parallel conformation prepared in Example 2 is illustrated in FIG. 1B.
  • spacer (S and S ⁇ ) (1.1 mmol) and beta amyloid (A ⁇ ) 1-40 (P and P ⁇ , 1.1 mmol) having an H 2 N-GGGSGGGS-COOH amino acid sequence using Fmoc-protected amino acids were used.
  • Peptide-based resins with substrate bound to each reaction were washed for 20 seconds in the order of DMF, DCM, and DMF, and the Fmoc-protecting group was washed in 20% piperidine solution (1: 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v) was removed by shaking for 5 minutes and 15 minutes (twice, each with 5 minutes of DMF).
  • piperidine solution 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • beta amyloid (A ⁇ ) 1-40 P and P ′, 1.1 mmol
  • H 2 N-GGGSGGGS-COOH amino acid sequences (S and S ′) (1.1 mmol) using Fmoc-protected amino acids.
  • Lysine (Fmoc-Lys (mtt) -OH) (1.1 mmol) protected with a protecting group as L was 1.0 M DIEA (diisopropylethylamine, 2 mL, in DMF) and 0.4 M HBTU solution (O- ( benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2: 3 DMF / DMSO, v / v) dissolved in 8 ml of reaction and then reacted with valine removed with protecting group for 50 minutes I was.
  • DIEA diisopropylethylamine
  • HBTU solution O- ( benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2: 3 DMF / DMSO, v / v
  • Peptide-based resins with substrate bound to each reaction were washed for 20 seconds in the order of DMF, DCM, and DMF, and the Fmoc-protecting group was washed in 20% piperidine solution (1: 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v) was removed by shaking for 5 minutes and 15 minutes (twice, each with 5 minutes of DMF).
  • a side chain protecting group of lysine was removed by shaking 5 times with 3% TFA (in DCM) for 5 minutes.
  • Half of the resin containing the free amine group from which Mtt was removed was divided into azaidoacetic acid and propiolic acid, respectively, to react with each other.
  • Each fragment can be prepared in parallel conformation protein dimer through azide / alkyne cycloaddition (Fragment 1 + Fragment 1, Fragment 2 + Fragment 2).
  • Green Frag.1 + Frag.1 (N-terminal free dimer)
  • Orange Frag.2 + Frag.2 (C-terminal free dimer)
  • spacer (S and S ⁇ ) (1.1 mmol) and beta amyloid (A ⁇ ) 1-40 (P and P ⁇ , 1.1 mmol) having an H 2 N-GGGSGGGS-COOH amino acid sequence using Fmoc-protected amino acids were used.
  • Peptide-based resins with substrate bound to each reaction were washed for 20 seconds in the order of DMF, DCM, and DMF, and the Fmoc-protecting group was washed in 20% piperidine solution (1: 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v) was removed by shaking for 5 minutes and 15 minutes (twice, each with 5 minutes of DMF).
  • piperidine solution 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • beta amyloid (A ⁇ ) 1-40 P and P ′, 1.1 mmol
  • H 2 N-GGGSGGGS-COOH amino acid sequences (S and S ′) (1.1 mmol) using Fmoc-protected amino acids.
  • Lysine (Fmoc-Lys (mtt) -OH) (1.1 mmol) protected with a protecting group as L was 1.0 M DIEA (diisopropylethylamine, 2 mL, in DMF) and 0.4 M HBTU solution (O- ( benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2: 3 DMF / DMSO, v / v) dissolved in 8 ml of reaction and then reacted with valine removed with protecting group for 50 minutes I was.
  • DIEA diisopropylethylamine
  • HBTU solution O- ( benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2: 3 DMF / DMSO, v / v
  • Peptide-based resins with substrate bound to each reaction were washed for 20 seconds in the order of DMF, DCM, and DMF, and the Fmoc-protecting group was washed in 20% piperidine solution (1: 1: 3 piperidine / DMSO / DMF, v / v / v) was removed by shaking for 5 minutes and 15 minutes (twice, each with 5 minutes of DMF).
  • a side chain protecting group of lysine was removed by shaking 5 times with 3% TFA (in DCM) for 5 minutes.
  • Half of the resin containing the free amine group from which Mtt was removed was divided into azaidoacetic acid and propiolic acid, respectively, to react with each other.
  • fragments 1 and 2 form one dimer (unbalanced structure)
  • Each fragment is capable of producing non-parallel protein dimers via azide / alkyne cycloaddition (Fragment 1 + Fragment 2). Green + Orange: Frag.1 + Frag.2 (anti-parallel dimer)
  • beta amyloid protein monomer used by the comparative example in the test example is A ⁇ 1-40.
  • Figure 2a is a graph measuring the protein dimer prepared in Example 1 by ESI-MASS
  • Figure 2b is a graph measured by the ESI-MASS protein dimer prepared in Example 2.
  • Example 1 shows a parallel three-dimensional structure (MW: 9802.8198 Da)
  • Example 2 was confirmed to show a non-parallel three-dimensional structure (MW: 9802.8198 Da).
  • Example 3 is a diagram measuring a simulation of the protein dimer prepared in two beta amyloid protein monomers, Example 1 and Example 2.
  • the protein monomer 2-strand is not a structure connected by a spacer and a linker
  • the protein dimers of Examples 1 and 2 have a structure in which two spacers are respectively connected to two protein monomers and two spacers are linked by a linker. It was confirmed that.
  • the protein dimer of Example 1 was confirmed that the two spacers are each connected to the carboxyl groups of the two protein monomers have a parallel stereostructure
  • the protein dimer of Example 2 is the first spacer of the two spacers of the carboxyl groups of the protein monomer It was confirmed that the second spacer was linked to the amine group of another protein monomer to have an antiparallel conformation.
  • ThT fluorescence was used to measure fibrils formation levels.
  • the ThT is a molecule known to convert fluorescence properties upon binding to the ⁇ -sheet complex.
  • beta amyloid protein monomer 2.5 mM of beta amyloid protein monomer dissolved in DMSO, 1.25 mM of each of the protein dimers of Examples 1 and 2 were diluted 100-fold with distilled water, and then sealed and incubated at 37 ° C. for 2 hours and 7 days to induce aggregation.
  • beta amyloid remaining in the experiment after dissolving in DMSO can be stored at -80 °C. After incubation, each sample was seeded in a half-area 96-well black plate, mixed with 5 ⁇ M ThT solution (5 ⁇ M ThT in pH 8.5 glycine buffer) in a dark place for 10 minutes. It was.
  • ThT fluorescence intensity was measured with a FlexStation3 multi-label reader (Molecular Device, CA, USA) at 450 nm / 485 nm.
  • Figure 4 is a graph measuring the fluorescence intensity of the beta amyloid protein monomer, the protein dimer of Example 1 and the protein dimer of Example 2.
  • Example 3 shows a similar level of fluorescence intensity as Example 1
  • Example 4 (Fragment 1 + Fragment 2) was confirmed to show a similar level of fluorescence intensity as Example 2
  • Example 4 also confirmed that fibrils were well formed.
  • FIG. 5 is an indicator showing aggregate formation levels for the beta amyloid protein monomer, the protein monomer of Example 1 and the protein monomer of Example 2.
  • beta amyloid protein dimers in the brain are known to be toxic, toxicity was measured using proteins synthesized in a structure similar to beta amyloid protein dimers in the brain.
  • the HT-22 cell line which is a mouse hippocampal neuron cell line, was applied to a plate with a constant channel, and then treated with each sample and treated with an untreated group, beta amyloid protein monomer, with the protein dimer of Example 1 It was divided into the treated group and the group treated with the protein dimer of Example 2. After 24 hours, cell viability was measured by MTT, and the higher the value, the higher the cell viability. In this case, since the beta amyloid protein monomer is a monomer, the beta amyloid protein monomer was treated at twice the concentration of Examples 1 and 2, which are dimers.
  • the MTT reagent is a reagent capable of indirectly measuring cell viability by measuring the mitochondrial activity of the cell.
  • Example 6 is an untreated group (control group), a group treated with beta amyloid protein monomer (Comparative Example), a group treated with a protein dimer of Example 1 (Example 1) and a group treated with a protein dimer of Example 2 ( It is a graph measuring the cell viability of Example 2).
  • the cells treated with the protein dimer of Example 2 were found to have the lowest viability. Therefore, the dimer of the parallel three-dimensional structure (Example 1) is less toxic, and the dimer of the non-parallel three-dimensional structure (Example 2) means more toxic.
  • mice were used as experimental animals, and 40 individuals of the same age of 5 weeks were used.
  • mice used in the study were purchased from Orient Bio Co., Ltd. and managed under the experimental animal ethics regulations and used for experiments.
  • the concentration of the injected beta amyloid protein monomer is 200 ⁇ M, which is twice the dimer concentration (100 ⁇ M).
  • mice mice injected with DMSO / PBS (10 mice)
  • Example 1 Mouse Group Infused with Protein Dimer Prepared in Example 1 (10)
  • Example 2 Mouse group injected with the protein dimer prepared in Example 2 (10 mice)
  • mice Four days after the sample was injected into the ventricle, Y-maze behavioral experiments were conducted to measure the spatial perception of each mouse group. This measures the alteration of behavior in mice. Behavioral alteration means that in behavioral therapy, the subject stops the distorted response pattern and realizes a new and more adapted behavior.
  • the Y-Maze Behavioral Test allows mice to roam freely for eight minutes in three directions of maze at 120 ° intervals to determine the order of entry into each maze.
  • the measured experimental value may be calculated as a percentage of behavioral variation, and the calculation method is shown in Equation 1 below.
  • the number of successful variations is defined when the values of the three overlapping mazes are all different.
  • 7A is a graph showing the percentage of behavioral changes for the four test groups.
  • mice of the group injected with the protein dimer of Example 2 was impaired behavioral ability as compared to the control group and the group injected with the protein dimer of Example 1.
  • mice Thirty minutes after the sample was injected into the ventricle, the mice were placed in the brightly lit compartments, and after 20 seconds of search time the guillotine doors were opened to enter the dark compartments. Mice that did not enter the dark side within 40 seconds after the guillotine door was opened were excluded from the experiment. After the guillotine door was opened, the time until the mouse entered the dark side was measured. Once the mouse enters the dark side, the guillotine door closes and an electric shock of 0.5 mA flows through the bottom of the grid for 3 seconds and the mouse remembers this electric shock.
  • the experiment was conducted 24 hours after the study test. After the 20 second search time, the time required for the guillotine door to open and the four shots to the dark side (latency time) was measured up to 180 seconds. The longer the time taken, the better the learning and memory of passive avoidance.
  • 7B is a graph showing passive avoidance for the four test groups.
  • mice of the group injected with the protein dimer of Example 2 have a shorter latency time than those of the control group and the group injected with the protein dimer of Example 1, indicating that learning and memory of passive avoidance are not good. Confirmed.
  • the protein dimer of the present invention has a structure similar to that of natural protein aggregates in the brain, when the protein dimer is reacted with the natural protein aggregates in the brain, an antibody that recognizes the natural protein aggregates can be prepared, and the protein dimer is recognized.

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Abstract

본 발명은 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머 및 이의 제조방법에 관한 것으로 P, S, L, S`, P`를 포함하고, 상기 P의 아미노산 서열과 P`의 아미노산 서열이 평행 또는 비평행하게 배치되는 입체구조를 갖는 하기 [화학식 1]로 표시됨으로써, 평행 또는 비평행의 입체구조에 따른 독성의 차이 및 다이머 이상의 올리고머 구조에 따른 독성을 알 수 있으며 인지장애 질환을 진단하는데 이용할 수 있는 항체의 개발에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 위의 다이머를 인식할 수 있는 물질의 개발에 이용 가능하며, 이에는 형광물질, 흡광물질, 발광물질, 핵의학 등에 이용할 수 있는 물질 등도 포함된다. 또한, 이를 이용하여 핵의학적 뇌영상으로 인지장애 질환을 진단할 수 있는 타겟물질을 제조할 수 있다. [화학식 1] P-S-L-S`-P`

Description

인지장애 질환 검출용 단백질 다이머 및 이의 제조방법
본 발명은 평행 또는 비평행의 입체구조에 따른 독성의 차이뿐만 아니라 다이머 이상의 올리고머 구조에 따른 독성을 알 수 있으며 인지장애 질환을 진단하는데 이용할 수 있는 항체 등의 개발에 이용이 가능한 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인지장애 질환은 신경세포 기능장애 및 손상으로 발생하며, 신경세포 기능장애 및 손상은 독성의 응집되기 쉬운 단백질에 의해 유발될 수 있고, 다수의 신경계 질환은 그러한 용태를 특징으로 한다. 이들은 근위축성 측삭경화증, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 프리온 병, 폴리글루타민 확장증, 척수소뇌성 실조증, 척수 및 연수 근육위축, 해면 뇌병증, 타우증(tauopathy), 헌팅톤 병, 또는 근육긴장 이상과 같은 질환을 포함한다.
치매 중 특히 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 서서히 진행하는 인지기능 저하와 행동장애를 임상적 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환이다. 상기 질환의 주요한 신경 병리 소견은 해마와 피질에 불용성의 두 가지 단백질이 응집하여 침착되는 것인데, 신경세포 밖에서 베타아밀로이드 단백질(amyloid beta protein, Aβ)로 구성된 노인반(senile plaque, SP)이 축적되거나, 신경세포 안에서 과인산화된 타우단백질(hyperphosphorylated tau protein)로 이루어진 신경섬유 농축제(neurofibrillary tangle, NFT)가 축적됨이 확인되었다.
그러나, 지난 수년에 걸친 많은 연구에도 AD의 원인과 발병기전은 완전히 밝혀지지 않고 있으며, 최근까지 AD의 약물치료는 콜린성 가설(cholinergic hypothesis)에 근거한 치료제가 근간이 되고 있다. 이러한 치료적 접근법은 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 등과 같은 가역성 콜린효소억제제(reversible acetylcholinesterase inhibitor, AChEI)에 의해 AChE를 억제하여 기억과 학습에 중요한 신경전달물질인 신경세포의 아세틸콜린(acetylcholine, Ach)의 농도를 일시적으로 상승시켜 치료 효과를 나타낸다.
일련의 연구에 의하면 AChE가 비콜린성 효과를 통해 AD 발병기전에도 관여하고 있음을 시사해 주는데, 베타아밀로이드 단백질 축적을 촉진시키거나 베타아밀로이드 단백질을 불용성의 원섬유(fibril)로 변형시킨다. 그러나 AChEI는 질병의 진행 속도를 완화시키거나 정지시킬 수 없기 때문에 AD의 근본적 치료제가 될 수는 없다. 완전하지는 않지만 AD의 발병기전에 대한 이해가 진전되면서 발병기전에 근거한(mechanism-based) 새로운 치료제들이 개발되고 있다.
특히, 유전성과 산발성 AD의 공통 원인으로 베타아밀로이드 단백질이라는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 상기 베타아밀로이드 단백질이 신경세포를 보호하는 역할을 한다는 보고가 있긴 하지만 아직 정확한 기능은 밝혀지지 않았다.
상기 베타아밀로이드 단백질은 정상인의 경우에도 인체 곳곳에서 소량으로 만들어지기는 하지만 만들어진 후 빠르게 분해돼 인체 내에 쌓이지는 않는다. 그러나 AD 환자의 뇌 조직을 살펴보면 베타아밀로이드 단백질이 집적되어 뭉쳐 있는 형태가 보이는데 이를 '노인반'이라고 한다. 이는 베타아밀로이드 단백질이 비정상적으로 많이 생성되어 기억과 학습에 중요한 역할을 하는 해마나 대뇌피질 같은 곳에 과다하게 집적된 것이다.
상기 집적된 베타아밀로이드 단백질은 주변의 세포들에 염증반응을 일으켜 신경세포가 손상되고 점점 뇌의 정상적인 기능을 유지하는 신경회로망마저 훼손시킨다. 게다가 집적된 베타아밀로이드 단백질은 신경세포를 죽이는 신호 체계를 가동시키는 활성산소를 많이 만들어내는 것으로 밝혀졌다.
또한, 베타아밀로이드 단백질은 β-, γ-분해효소에 의해 절단되어진 아밀로이드 단백질 전구체(APP)에서 유래된 39-43개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다(Wilson CA, Doms RW, Lee VM-Y. Intracellular APP processing and A production in Alzheimer's disease. J. Neuropath. Exp. Neurol. 1999; 58: 787-794). 상기 단량체는 순차적으로 직접하여 피브릴(fibril) 형태를 거치게 되면서 강한 신경 독성을 나타내게 된다(Forloni GE, Angeretti LN, Della Torre P, Salmona M. Amidation of -amyloid peptide strongly reduced the amyloidogenic activity without alteration of neurotoxicity. J. Neurochem. 1997; 69: 2048-2054).
따라서 집적된 베타아밀로이드 단백질에 의한 세포독성 작용기전 및 AD의 발병 연관성 등을 규명하기 위한 연구가 시급한 실정인데, 자연계의 베타아밀로이드 단백질은 다이머로 존재하는 순간부터 빠르게 집적이 이루어져 연구를 진행할 수 없으므로 뇌 내에서 베타아밀로이드 단백질이 집적되는 형태(다이머, 트라이머, 테트라머 등)와 유사한 구조의 단백질의 합성이 요구된다.
본 발명의 목적은 인지장애 질환을 진단하는데 이용할 수 있는 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 포함하는 항원을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 항체 이외의 물질의 개발을 위한 리간드 분자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟물질을 개발하기 위하여 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 뇌영상 진단용 타겟물질을 이용하여 핵의학영상촬영장치(SPECT)로 촬영하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 다이머를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머는 하기 [화학식 1]로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
P-S-L-S`-P`
상기 [화학식 1]에서 상기 P 및 상기 P`는 단백질 또는 그 절편이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지거나(parallel) 또는 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
상기 S 및 상기 S`는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 스페이서이며, 상기 L은 링커이다.
일 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지진(parallel) 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-1]
NPC-S-L-S`-CP`N
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향이다.
다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel), 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1a]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-1a]
NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 CS`N는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가진(parallel) 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-2]
CPN-S-L-S`-NP`C
상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel), 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2a]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-2a]
CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CSN는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가진(anti-parallel), 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-3]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-3]
NPC-S-L-S`-NP`C
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하며, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel), 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-3a]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-3a]
NPC-NSC-L-NS`C-NP`C
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향이다.
상기 P 및 상기 P`는 응집체 형성이 가능한 단백질 또는 그 절편이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 1 내지 42의 베타 아밀로이드, 타우 단백질, 시누클레인, 프리온 단백질로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 그 절편이고, 더욱 바람직하게는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서 응집체란 단백질 또는 펩타이드가 결합하여 형성되는 것으로, 다이머 또는 그 이상의 응집체를 의미한다.
상기 절편은 베타 아밀로이드 40 또는 베타 아밀로이드 42의 아미노산 서열 중에 응집체 형성이 가능한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 스페이서는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드이고, 더욱 바람직하게는 GGGSGGGS의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
상기 L은 2개의 아민기(디아민기) 또는 2개의 카르복실기(디카르복실기)를 포함할 수 있으며, L은 기질과 결합이 가능한 관능기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기질은 왕 레진(Wang's resin), 메리필드 레진(Merrifield resin), 또는 이들의 유도체일 수 있다.
상기 L은 알킨(
Figure PCTKR2015007160-appb-I000001
)과 아자이드(R`-N3)의 Husgen Cycloaddition 반응 결합물이고,
상기 R 및 R`는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000002
또는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000003
중에서 같거나 상이할 수 있다. 상기 n=0 내지 5의 정수, m=1 내지 3의 정수, * 표시는 아자이드기 또는 알킨기인 결합부위이다.
상기 아자이드는 H2NCH(N3)COOH 또는 H2NCH(CH2CH2CH2N3)COOH이고, 상기 알킨은 H2NCH(C≡CH)COOH 또는 H2NCH(CH2CH2CH2C≡CH)COOH일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가진(parallel), 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1]로 표현되고,
[화학식 1-1]
NPC-S-L-S`-CP`N
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 L은 디아민기를 포함한다. 이때 상기 L은 카르복실기를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 L은 라이신(lysine, K)이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel), 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1a]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-1a]
NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 CS`N는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 L은 디아민기를 포함한다. 이때 상기 L은 카르복실기를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 L은 라이신이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가진(parallel) 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-2]
CPN-S-L-S`-NP`C
상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 L은 디카르복실기를 포함한다. 이때 상기 L은 아민기를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 L은 글루탐산(E)이다.
또 다른 구현예로, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel), 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2a]로 표현될 수 있다;
[화학식 1-2a]
CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CSN는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 L은 디카르복실기를 포함한다. 이때 상기 L은 아민기를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 L은 글루탐산(E)이다.
상기 L은 기질과 결합이 가능한 관능기를 추가로 포함하고, 상기 관능기는 아민기, 카르복실기, 에스테르기 또는 하이드록실기 중에서 선택될 수 있다.
상기 단백질 다이머는 하기 [서열번호 1]의 서열로 이루어질 수 있다:
[서열번호 1]
NH2-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-GGGSGGGS-εK-SGGGSGGG-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-NH2.
또한, 상기 단백질 다이머는 하기 [서열번호 2]의 서열로 이루어질 수 있다:
[서열번호 2]
COOH-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-SGGGSGGG-K-ε-SGGGSGGG-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-NH2.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인지 장애 질환 검출용 항원은 상기 단백질 다이머를 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항체는 상기 항원과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 바이오 응집체는 베타 아밀로이드의 다이머 이상의 응집체일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 단백질 다이머를 인식하는 물질은 상기 단백질 다이머와 상호 작용하는 항체를 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 단백질 다이머를 리간드 분자로서 사용하여 상기 인식 가능한 물질을 개발하기 위하여 이용될 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟 물질은 상기 단백질 다이머를 인식하는 물질을 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 핵의학적 뇌영상 측정방법은 상기 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟 물질을 투입한 후 인지장애 질환에 특이적으로 증가된 병변을 핵의학영상촬영장치(SPECT)로 촬영하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 단백질 다이머를 제조하는 방법은 일 구현예로, 하기 [화학식 1-1]로 표시되며,
[화학식 1-1]
NPC-S-L-S`-CP`N
상기 S와 S`는 단일 결합이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지고(parallel),
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
(A) 디아민기 및 관능기를 포함하는 L의 상기 관능기와 기질을 결합하는 단계; (B) 상기 L에 포함된 각각의 아민기에 상기 P 및 상기 P`를 결합하는 단계; 및 (C) 상기 L과 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 하기 [화학식 1-1a]로 표시되며,
[화학식 1-1a]
NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
상기 S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 CS`N는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
(A`) 디아민기 및 관능기를 포함하는 L의 상기 관능기와 기질을 결합하는 단계; (B`) 상기 L에 포함된 각각의 아민기에 상기 S 및 상기 S`를 결합하는 단계; (C`) 상기 S 및 상기 S` 각각에 상기 P 및 상기 P`를 결합하는 단계; 및 (D`) 상기 L과 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 P 및 상기 P`는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택될 수 있으며, 상기 관능기는 카르복실기일 수 있다.
다른 구현예로, 하기 [화학식 1-2]로 표시되며,
[화학식 1-2]
CPN-S-L-S`-NP`C
상기 S와 S`는 단일 결합이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
(A``) 기질에 상기 P 및 상기 P`를 2개 이상으로 결합시키는 단계; (B``) 상기 2개 이상의 상기 P 및 상기 P`중에서 인접한 상기 P 및 상기 P`와 상기 디카르복실기를 포함하는 하나의 L을 결합하는 단계; 및 (C``) 상기 P 및 상기 P`와 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 하기 [화학식 1-2a]로 표시되며,
[화학식 1-2a]
CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
상기 S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CSN는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
(A```) 기질에 상기 P 및 상기 P`를 2개 이상으로 결합시키는 단계; (B```) 상기 2개 이상의 상기 P 및 상기 P` 중에서 인접한 2개의 상기 P 및 상기 P`와 상기 S 및 상기 S`를 결합하는 단계; (C```) 상기 S 및 상기 S`과 상기 디카르복실기를 포함하는 하나의 L을 결합하는 단계; 및 (D```) 상기 P 및 상기 P`와 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 P 및 상기 P`는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택될 수 있으며, 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것일 수 있다.
또 다른 구현예로, 하기 [화학식 1-3]으로 표시되며,
[화학식 1-3]
NPC-S-L-S`-NP`C
상기 S와 S`는 단일 결합이고, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
(a) 기질에 상기 P`를 결합하는 단계; (b) 상기 P`와 디아민기를 포함하는 L을 결합하는 단계; (c) 상기 L에 함유된 디아민기 중 하나의 아민기에 보호기를 부착하는 단계; (d) 상기 L에 함유된 다른 아민기에 상기 P를 결합하는 단계; (e) 상기 (c)단계에서 부착된 보호기를 제거하는 단계; 및 (f) 상기 기질과 상기 P`를 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 하기 [화학식 1-3a]로 표시되며,
[화학식 1-3a]
NPC-NSC-L-NS`C-NP`C
상기 S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
(a`) 기질에 상기 P`를 결합하는 단계; (b`) 상기 P`와 상기 S`를 결합하는 단계; (c`) 상기 S`와 디아민기를 포함하는 상기 L을 결합하는 단계; (d`) 상기 L에 함유된 디아민기 중 하나의 아민기에 보호기를 부착하는 단계; (e`) 상기 L에 함유된 다른 아민기에 상기 S를 결합하는 단계; (f`) 상기 S에 상기 P를 결합하는 단계; (g`) 상기 (d`)단계에서 부착된 보호기를 제거하는 단계; 및 (h`) 상기 기질과 상기 P`를 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 P 및 상기 P`는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택될 수 있으며, 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것일 수 있다.
상기 보호기가 부착되는 아민기는 사이드 체인(side chain)으로 화학결합된 아민기이며, 상기 보호기는 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 4-메틸트리틸 (Mtt) 또는 t-부톡시카보닐(Boc)일 수 있다. 상기와 같이 사이드 체인의 아민기를 보호해야만 꺽인 다이머 구조를 얻을 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 [화학식 1-1], [화학식 1-2] 및 [화학식 1-3] 중에서 선택되며, S와 S`는 단일 결합이고, L은 트리아졸을 포함하는 단백질 다이머를 제조하는 방법에 있어서,
(Ⅰ) 상기 P`와 말단이 아자이드기인 화합물을 결합하는 단계; (Ⅱ) 상기 P와 말단이 알킨기인 화합물을 결합하는 단계; 및 (Ⅲ) 상기 (Ⅰ)단계의 아자이드기와 (Ⅱ)단계의 알킨기의 반응으로 L이 형성되어 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제3항, 제5항 및 제7항에서 표시된 [화학식 1-1a], [화학식 1-2a] 및 [화학식 1-3a] 중에서 선택되며, S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, L은 트리아졸을 포함하는 단백질 다이머를 제조하는 방법에 있어서,
(Ⅰ`) 상기 S`와 말단이 아자이드기인 화합물을 결합하는 단계; (Ⅱ`) 상기 S`와 P`를 결합하는 단계; (Ⅲ`) 상기 S와 말단이 알킨기인 화합물을 결합하는 단계; (Ⅳ`) 상기 S와 상기 P를 결합하는 단계; 및 (Ⅴ`) 상기 (Ⅰ`)단계의 아자이드기와 (Ⅲ`)단계의 알킨기의 반응으로 L이 형성되어 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 P 및 상기 P`는 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것일 수 있다.
상기 말단이 아자이드기인 화합물 및 말단이 알킨기인 화합물은 R`-N3 및 R-≡로 표시되며, 상기 R 및 R`는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000004
또는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000005
중에서 같거나 상이할 수 있다. 이때 n=0 내지 5의 정수, m=1 내지 3의 정수, * 표시는 아자이드기 또는 알킨기인 결합부위이다.
본 발명에 따라 합성된 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 이용하여 평행 또는 비평행의 입체구조에 따른 독성의 차이뿐만 아니라 다이머 이상의 올리고머(다이머, 트라이머, 테트라머 등)는 독성을 가진다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 단백질 다이머는 뇌 내의 천연 단백질 응집체와 유사한 구조를 가지므로 단백질 다이머를 이용하여 상기 뇌 내의 천연 단백질 응집체와 반응하면 상기 천연 단백질 응집체를 인식하는 항체를 제조할 수 있으며, 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질을 개발할 수 있다. 상기 인식 가능한 물질로는 형광물질, 흡광물질, 발광물질, 핵의학 등에 이용할 수 있는 물질 등도 포함된다. 뿐만 아니라, 단백질 다이머를 인식할 수 있는 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟물질을 제조하여 뇌 내의 천연 단백질 응집체를 뇌영상으로 진단할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 평행 입체구조의 단백질 다이머를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따라 제조된 평행 입체구조의 단백질 다이머를 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머를 ESI-MASS로 측정한 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머를 ESI-MASS로 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머, 다른 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머 및 베타 아밀로이드 단백질 모노머 2가닥에 대한 시뮬레이션을 측정한 시뮬레이션도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머, 다른 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머 및 베타 아밀로이드 단백질 모노머에 대한 형광강도를 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머, 다른 실시예에 따라 제조된 단백질 다이머 및 베타 아밀로이드 단백질 모노머에 대한 응집체 형성 수준을 나타낸 지표이다.
도 6은 무처리군, 베타 아밀로이드 단백질 모노머로 처리한 군, 일 실시예의 단백질 다이머로 처리한 군 및 다른 실시예의 단백질 다이머로 처리한 군에 대한 세포생존능을 측정한 그래프이다.
도 7a는 무처리군, 베타 아밀로이드 단백질 모노머로 처리한 군, 일 실시예의 단백질 다이머로 처리한 군 및 다른 실시예의 단백질 다이머로 처리한 군에 대한 행동변용 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 무처리군, 베타 아밀로이드 단백질 모노머로 처리한 군, 일 실시예의 단백질 다이머로 처리한 군 및 다른 실시예의 단백질 다이머로 처리한 군에 대한 수동 회피를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 뇌 내에서 천연 단백질이 집적된 다이머 및 올리고머와 유사한 구조로 합성을 하여 평행 또는 비평행의 입체구조에 따른 독성의 차이뿐만 아니라 다이머 이상의 올리고머 구조에 따른 독성을 알 수 있으며 인지장애 질환을 진단하는데 이용할 수 있는 항체 혹은 다이머 이상의 올리고머 구조를 인식할 수 있는 물질 등의 개발에 이용이 가능한 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
상기 인지장애 질환은 크로이츠펠트-야콥병, 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathies), 파킨슨 병, 헌팅톤 병(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 프리온 병, 폴리글루타민 확장증, 척수소뇌성 실조증, 척수 및 연수 근육위축, 해면 뇌병, 타우증, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloid angiopathy), 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brain ischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerve regeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel) 및 산발성 루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis )으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
천연 단백질 다이머 이상의 올리고머는 인지장애 질환에 중요한 역할을 하는 것으로 보이지만, 상기 천연 단백질 다이머 이상의 올리고머를 분리할 수 없어 그 구조를 명확하게 알 수 있는 방법이 없었다.
따라서 본 발명에서는 단백질 다이머를 평행 또는 비평행 구조로 합성하여 병리학적으로 선호하는 단백질 다이머 형태를 관찰한다.
본 발명의 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머는 P, S, L, S`, P`를 포함하고, 상기 P의 아미노산 서열과 P`의 아미노산 서열이 평행(parallel) 또는 비평행(anti-parallel)하게 배치되는 입체구조를 갖으며 하기 [화학식 1]로 표시된다.
[화학식 1]
P-S-L-S`-P`
상기 [화학식 1]에서 상기 P 및 상기 P`는 단백질(full length) 또는 그 절편(truncated)이고,
상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지거나(parallel) 또는 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel), 상기 S 및 상기 S`는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 스페이서이며, 상기 L은 링커이다.
상기 [화학식 1]에는 P 및 P`만 기재되어 있어 다이머 형태를 나타내지만, 본 발명과 같은 방법으로 L, S, P를 연속적으로 연결하여 다이머 이상의 올리고머를 형성할 수도 있다.
또한, 본 발명의 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머는 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 P 및 P`가 상기 L의 양 말단에 연결되어 접힘(folding)구조를 가진다. 예를 들어, L의 양 말단에 S 및 P; S` 및 P`가 순차적으로 각각 연결되고 상기 L의 말단에 연결된 S 및 P와; S` 및 P`가 접힘(folding)구조를 갖는 것이다.
상기 [화학식 1]의 단백질 다이머는 평행(parallel) 또는 비평행(anti-parallel)하게 배치되는 입체구조에 따라 하기 [화학식 1-1] 내지 [화학식 1-3]으로 표현된다.
1-1. 평행(parallel), N 말단
상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1]로 표현된다.
[화학식 1-1]
NPC-S-L-S`-CP`N
상기 C 및 N은 각각 P 및 P`의 말단에 형성된 카르복실기(C) 및 아민기(N)를 의미하는 것으로서, 예를 들어 S-cPN은 P의 카르복실기가 S와 결합되고 말단에는 아민기가 구비된 것을 의미한다.
1-2. 평행(parallel), N 말단
구체적으로, 상기 [화학식 1-1]에서 상기 S 및 상기 S`가 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 경우에는 하기 [화학식 1-1a]로 표현된다.
[화학식 1-1a]
NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
2-1. 평행(parallel), C 말단
상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2]로 표현된다.
[화학식 1-2]
CPN-S-L-S`-NP`C
2-2. 평행(parallel), C 말단
구체적으로, 상기 [화학식 1-2]에서 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 경우에는 하기 [화학식 1-2a]로 표현된다.
[화학식 1-2a]
CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
3-1. 비평행(anti-parallel), 각 N, C 말단
상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-3]로 표현된다.
[화학식 1-3]
NPC-S-L-S`-NP`C
3-2. 비평행(anti-parallel), 각 N, C 말단
구체적으로, 상기 [화학식 1-3]에서 상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 경우에는 하기 [화학식 1-3a]로 표현된다.
[화학식 1-3a]
NPC-NSC-L-NS`C-NP`C
비평행(anti-parallel) 입체구조에서 상기 P와 P`는 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는데, 상기 서로 동일한 아미노산 서열은 P와 P`가 서로 동일한 아미노산 서열을 갖되 서로 다른 방향으로 존재하여 최외각이 각각 C 및 N으로 상이한 것을 의미하며 상기 상이한 아미노산 서열은 P와 P`가 서로 상이한 아미노산 서열을 가지면서 최외각이 각각 C 및 N으로 상이한 것을 의미한다.
본 발명에 이용된 상기 P 및 P`는 응집체 형성이 가능한 단백질 또는 그 절편이며, 바람직하게는 1 내지 42의 베타 아밀로이드, 타우 단백질, 시누클레인, 프리온 단백질로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 그 절편이고, 더욱 바람직하게는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택된다. 상기 절편은 베타 아밀로이드 40 또는 베타 아밀로이드 42의 아미노산 서열 중에 응집체 형성이 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것으로서, 구체적으로 베타 아밀로이드 40 또는 베타 아밀로이드 42의 아미노산 서열 중 일부 서열만 합성하거나 상기 베타 아밀로이드 40 또는 베타 아밀로이드 42의 아미노산 서열 중 일부를 잘라서 없앤 짧은 형태의 아미노산 서열을 의미한다.
또한, 상기 S 및 S`가 스페이서인 경우, 상기 스페이서로는 유연성이 있어 상기 P 및 P`간에 일정한 거리를 유지하도록 할 수 있는 물질이기만 하면 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩타이드가 각각 독립적으로 같거나 상이하게 선택할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 GGGSGGGS를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
또한, 상기 L은 P와 P`를 연결할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 디아민기, 디카르복실기 또는 헤테로방향족을 포함할 수 있다. 구체적으로 [화학식 1-1] 및 [화학식 1-1a]인 경우에 L은 디아민기 및 기질과 결합이 가능한 관능기를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 라이신(lysine)일 수 있으며; [화학식 1-2] 및 [화학식 1-2a]인 경우에 L은 디카르복실기 및 기질과 결합이 가능한 관능기를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 글루탐산일 수 있고; [화학식 1] 내지 [화학식 3]의 모든 화학식의 경우에 L은 알킨(
Figure PCTKR2015007160-appb-I000006
)과 아자이드(R`-N3)의 Husgen Cycloaddition 반응 결합물, 디아민기 또는 카르복실기, 및 기질과 결합이 가능한 관능기를 포함할 수 있다. 상기 R 및 R`는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000007
또는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000008
중에서 같거나 상이하며(n=0 내지 5의 정수, m=1 내지 3의 정수, * 표시는 아자이드기 또는 알킨기인 결합부위), 바람직하게 상기 아자이드는 H2NCH(N3)COOH또는 H2NCH(CH2CH2CH2N3)COOH이고 상기 알킨은 H2NCH(C≡CH)COOH 또는 H2NCH(CH2CH2CH2C≡CH)COOH로서, Husgen Cycloaddition 반응 결합물 L은 트리아졸을 포함한다.
상기 기질로는 L을 고정시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 왕 레진(Wang's resin), 메리필드 레진(Merrifield resin), 또는 이들의 유도체를 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알코올 말단의 폴리스타이렌(Carboxypolystyrene) 베이스를 가진 왕 레진일 수 있다.
또한, 상기 관능기로는 기질과 결합될 수 있는 관능기라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 아민기, 카르복실기, 에스테르기 또는 하이드록실기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 L에 디아민기가 포함되는 경우에 관능기는 카르복실기이고 L에 디카르복실기가 포함되는 경우에 관능기는 아민기이다.
상기와 같이 표현되는 단백질 다이머들은 구체적으로, P 및 P`의 아미노산 서열이 동일할 경우에는 평행(parallel) 또는 비평행(anti-parallel)하게 배치되는 입체구조를 3 종류([화학식 2] 내지 [화학식 4])로 가질 수 있으며; P 및 P`의 아미노산 서열이 상이할 경우에는 비평행(anti-parallel)하게 배치되는 입체구조를 4 종류([화학식 5] 내지 [화학식 8])로 가질 수 있다. 이때, S 및 S`는 동일한 아미노산 서열을 갖는 스페이서 또는 단일 결합일 경우이다.
P 및 P`의 아미노산 서열이 동일
[화학식 2]; 평행(parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000009
[화학식 3]; 평행(parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000010
[화학식 4]; 비평행(anti-parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000011
P 및 P`의 아미노산 서열이 상이
[화학식 5]; 평행(parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000012
[화학식 6]; 평행(parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000013
[화학식 7]; 비평행(anti-parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000014
[화학식 8]; 비평행(anti-parallel)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000015
본 발명에 따른 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머는 앞에서 설명한 바와 같이 P와 P`가 평행(parallel) 또는 비평행(anti-parallel)하게 배치되는 입체구조를 갖는데, 평행 입체구조는 독성이 거의 없는 것에 반하여 비평행 입체구조는 평행 입체구조에 비하여 독성이 있어 해마 의존적 학습(hippocampus-dependent learning) 및 기억 결손(memory deficits)이 유도된다. 일반적으로 뇌 내의 천연 단백질이 많이 응집된 사람들 중 약 10% 미만은 인지장애 질환이 발생되지 않는데, 이는 응집되더라도 독성이 거의 없는 평행 입체구조의 형태로 응집되어 인지장애 질환이 발생하지 않은 것으로 보인다.
바람직하게, 본 발명에 따른 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머는 하기 [서열번호 1]에 개시된 서열(평행 입체구조) 또는 [서열번호 2]에 개시된 서열(비평행 입체구조)로 이루어진 것일 수 있다.
[서열번호 1]
NH2-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-GGGSGGGS-εK-SGGGSGGG-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-NH2
[서열번호 2]
COOH-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-SGGGSGGG-K-ε-SGGGSGGG-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-NH2
또한, 본 발명은 상기 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 포함하는 인지장애 질환 검출용 항원 및 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 제공할 수 있다.
인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 이용하여 제조된 항체는 모노머와는 반응하지 않고 특이적으로 단백질 모노머가 응집된 다이머 이상의 올리고머와 반응하여 상기 다이머 이상의 올리고머를 인지한다. 상기 인지한다는 것은 올리고머를 인지할 수 있는 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 인지하는 방법 중에서 일 예로, 항체와 상기 올리고머가 반응하여 신호를 발생하는 경우에는 평행 입체구조를 가진 단백질 다이머를 이용하여 제조된 항체가 평행 입체구조를 가진 다이머 이상의 올리고머와 만나면 신호를 발생하고, 비평행 입체구조를 가진 단백질 다이머를 이용하여 제조된 항체가 비평행 입체구조를 가진 다이머 이상의 올리고머와 만나면 신호를 발생한다.
항원에 특이적인 항체를 생성시키는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 상기 항체를 생성하는 방법으로 두 가지 방법을 들 수 있는데, 한 가지 방법은 상기 인지장애 질환 검출용 단백질 항원을 동물에게 투여하는 이뮤니제이션 (immunization) 방법을 통해 모노클로널 항체(monoclonal antibody) 또는 폴리클로널 항체(polyclonal antibody)를 제작할 수 있으며, 다른 한 가지 방법은 항체라이브러리를 이용하여 표적 항체를 찾는 방법을 통해 항원 특이적인 항체를 찾는 방법이다.
또한, 본 발명은 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머와 상호작용이 가능한 항체를 포함하여 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질을 제공할 수 있다.
상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질은 특별히 한정되지 않지만, 형광, 흡광, 발광 등의 신호를 줄 수 있는 물질들도 포함될 수 있다.
또한, 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질은 단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction), 단백질(항원)-항체 상호작용 (protein-antibody interaction), 단백질-저분자물질 상호작용 (protein-small molecule interaction) 등으로 찾을 수 있다. 구체적으로, 마이크로칩(microchip)을 이용하는 방법, 풀-다운 어세이(Pull-down assay), 파지디스플레이(Phage display), 효모 이중 보합계(Yeast two-hybrid system), 친화성 전기영동(Affinity electrophoresis), 형광분석(Fluorescence assay), 비표시자 분석(label-free assay), ITC(isothermal titration calorimetry), SPR(Surface plasmon resonance) 등과 같이 특정 물질과 물질 사이의 동역학(kinetics) 등을 포함한 상호작용을 확인하는 실험법 등에 이용될 수 있다.
일 예로, 상기와 같은 방법을 통하여 본 발명의 단백질 다이머와 상호작용할 수 있는 물질을 찾기 위하여 본 발명의 단백질 다이머를 리간드 분자로 이용할 수 있다.
하지만, 단백질 다이머와 상호작용할 수 있는 물질을 찾는 방법 및 단백질 다이머와 상호작용할 수 있는 물질을 찾을 경우 본 발명의 단백질 다이머의 역할은 이에 한정되는 것은 아니다.
종래 인지장애 질환을 진단하기 위해서는 문진 또는 MRI를 이용하거나 뇌 척수액을 뽑아서 천연 단백질 올리고머의 양을 측정하였으나, 문진, MRI 및 뇌 척수액을 뽑아서 진단하는 방법은 모두 정확성이 떨어졌다. 특히, 뇌 척수액을 뽑아서 진단하는 방법은 뇌 척수액에 존재하는 올리고머의 양이 실제에 비하여 적게 측정되어 정확도가 낮다.
그러므로 본 발명의 평행 또는 비평행하게 배치되는 입체구조를 갖는 항원에 의해 형성된 항체를 이용하면 단백질 올리고머의 방향성뿐만 아니라 함량도 측정이 가능하므로 인지장애 질환을 정확히 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질을 이용한 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟 물질을 개발하기 위하여 제공할 수 있다.
상기 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질은 단백질 다이머와 상호작용이 가능한 항체를 포함하므로 뇌 내의 단백질 다이머와 유사한 구조인 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있으므로 뇌 내의 단백질 다이머도 진단이 가능하다. 특히, 상기 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질은 뇌 내의 천연 단백질 다이머와 반응시 관찰 가능한 표시를 나타내므로 핵의학영상촬영장치(SPECT)로 상기 관찰 가능한 표시를 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명은 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 인지장애 질환 검출용 단백질 다이머는 구성조건에 따라 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
1. [화학식 1-1]; 평행(parallel) 입체구조, S와 S`는 단일 결합, N 말단인 경우
[반응식 1]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000016
(A) (B) (C)
상기 [반응식 1]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (A) 디아민기 및 관능기를 포함하는 L의 상기 관능기와 기질(M)을 결합하는 단계; (B) 상기 L에 포함된 각각의 아민기에 상기 P 및 상기 P`를 결합하는 단계; 및 (C) 상기 L과 기질(M)을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서 단백질 P 또는 P`를 결합하는 단계는 단백질 P 또는 P`를 구성하는 아미노산을 그 서열 순서대로 차례로 펩티드 결합시킴으로써 수행될 수 있다. 다만, 아미노산 서열을 연장하며 단백질을 합성함에 있어 C말단에서 N말단 방향으로만 합성이 가능하다는 점은 널리 알려져 있는 바이다.
또한, S 또는 S`가 아미노산 서열을 갖는 스페이서인 경우에, 그 합성은 위 P 또는 P`의 합성과 마찬가지이다. 다만, S 또는 S`가 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 비펩티드 스페이서인 경우에는 바로 1단계로 결합시킬 수 있다.
이때, 상기 반응식 1 및 하기 반응식 모두 C 및 N은 각각 말단에 형성된 카르복실기(C) 및 아민기(N)를 의미하는 것으로서, 예를 들어 LN N-CPN은 P의 카르복실기가 L의 아민기와 결합되고 P 말단에는 아민기가 구비된 것을 의미한다.
2. [화학식 1-1a]; 평행(parallel) 입체구조, S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서, N 말단인 경우
[반응식 2]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000017
(A`) (B`) (C`) (D`)
상기 [반응식 2]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (A`) 디아민기 및 관능기를 포함하는 L의 상기 관능기와 기질(M)을 결합하는 단계; (B`) 상기 L에 포함된 각각의 아민기에 S 및 S`를 결합하는 단계; (C`) 상기 S 및 S` 각각에 P 및 P`를 결합하는 단계; 및 (D`) 상기 L과 기질(M)을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 [반응식 1] 및 [반응식 2]에서 L의 관능기는 바람직하게는 카르복실기일 수 있다.
3. [화학식 1-2]; 평행(parallel) 입체구조, S와 S`는 단일 결합, C 말단인 경우
[반응식 3]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000018
(A``) (B``) (C``)
상기 [반응식 3]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (A``) 기질(M)에 P 및 P`를 2개 이상으로 결합시키는 단계; (B``) 상기 2개 이상의 P 및 P` 중에서 인접한 상기 P 및 P`와 상기 디카르복실기를 포함하는 하나의 L을 결합하는 단계; (C``) 상기 P 및 P`와 기질(M)을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
4. [화학식 1-2a]; 평행(parallel) 입체구조, S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서, C 말단인 경우
[반응식 4]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000019
(A```) (B```) (C```) (D```)
상기 [반응식 4]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (A```) 기질에 P 및 P`를 2개 이상으로 결합시키는 단계; (B```) 상기 2개 이상의 P 및 P` 중에서 인접한 2개의 P 및 P`와, S 및 S`를 결합하는 단계; (C```) 상기 S 및 S`와 상기 디카르복실기를 포함하는 하나의 L을 결합하는 단계; (D```) 상기 P 및 P`와 결합된 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 반응식들에서 상기 P와 상기 P` 및 상기 펩티드 스페이서 S와 S`는 아미노산을 하나씩 순차적으로 결합시켜 형성된 것이다.
5. [화학식 1-3]; 비평행(anti-parallel) 입체구조, P와 P`는 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열, S와 S`는 단일 결합, 각각 C, N 말단인 경우
[반응식 5]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000020
(a) (b) (c) (d)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000021
(e) (f)
상기 [반응식 5]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (a) 기질(M)에 P`를 결합하는 단계; (b) 상기 P`와 디아민기를 포함하는 L을 결합하는 단계; (c) 상기 L에 함유된 디아민기 중 하나의 아민기에 보호기(Pro)를 부착하는 단계; (d) 상기 L에 함유된 다른 아민기에 P를 결합하는 단계; (e) 상기 (c)단계에서 부착된 보호기를 제거하는 단계; 및 (f) 상기 기질(M)과 P`를 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
6. [화학식 1-3a]; 비평행(anti-parallel) 입체구조, P와 P`는 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열, S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서, 각각 C, N 말단인 경우
[반응식 6]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000022
(a`) (b`) (c`) (d`)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000023
(e`) (f`)
Figure PCTKR2015007160-appb-I000024
(g`) (h`)
상기 [반응식 6]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (a`) 기질(M)에 P`를 결합하는 단계; (b`) 상기 P`와 S`를 결합하는 단계; (c`) 상기 S`와 디아민기를 포함하는 L을 결합하는 단계; (d`) 상기 L에 함유된 디아민기 중 하나의 아민기에 보호기(Pro)를 부착하는 단계; (e`) 상기 L에 함유된 다른 아민기에 S를 결합하는 단계; (f`) 상기 S에 P를 결합하는 단계; (g`) 상기 (d`)단계에서 부착된 보호기를 제거하는 단계; 및 (h`) 상기 기질(M)과 P`를 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
또한 상기 [반응식 5] 및 [반응식 6]에서, 보호기가 부착되는 아민기는 사이드 체인(side chain)으로 화학결합된 아민기로서, 보호기가 부착되지 않은 아민기에 비하여 주쇄와 거리를 두고 있다. 상기 보호기는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 4-메틸트리틸(Mtt) 또는 t-부톡시카보닐(Boc)을 들 수 있다.
또한 상기 [반응식 5] 및 [반응식 6]에서, L은 디아민기 및 카르복실기를 포함하고 있으며, 상기 L의 말단에 연결된 각 도메인(P, P`, S 및 S`)들은 상기 [반응식 1] 내지 [반응식 4]와 같이 접힘(folding)구조이다.
7. [화학식 1-1], [화학식 1-2] 및 [화학식 1-3]의 평행 또는 비평행 입체구조 모두 가능, P와 P`는 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열, S와 S`는 단일 결합, L이 트리아졸 포함인 경우
[반응식 7]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000025
(Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅲ)
상기 [반응식 7]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (Ⅰ) 상기 P`와 말단이 아자이드기인 화합물(R`-N3)을 결합하는 단계; (Ⅱ) 상기 P와 말단이 알킨기인 화합물(R-≡)을 결합하는 단계; (Ⅲ) 상기 (Ⅰ)단계의 아자이드기와 (Ⅱ)단계의 알킨기의 클릭화학(click chemistry)반응으로 L이 형성되어 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
8. [화학식 1-1a], [화학식 1-2a] 및 [화학식 1-3a]의 평행 또는 비평행 입체구조 모두 가능, P와 P`는 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열, S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서, L이 트리아졸 포함인 경우
[반응식 8]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000026
상기 [반응식 7]에 따른 단백질 다이머의 제조방법은 먼저, (Ⅰ`) 상기 S`와 말단이 아자이드기인 화합물을 결합하는 단계; (Ⅱ`) 상기 S`와 P`를 결합하는 단계; (Ⅲ`) 상기 S와 말단이 알킨기인 화합물을 결합하는 단계; (Ⅳ`) 상기 S와 P를 결합하는 단계; (Ⅴ`) 상기 (Ⅰ`)단계의 아자이드기와 (Ⅲ`)단계의 알킨기의 클릭화학(click chemistry)반응으로 L이 형성되어 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 [반응식 7] 및 [반응식 8]에서, 상기 말단이 아자이드기인 화합물 및 말단이 알킨기인 화합물은 R`-N3 및 R-≡로 표시되며, 상기 R 및 R`는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000027
또는
Figure PCTKR2015007160-appb-I000028
중에서 같거나 상이하다. 이때, n=0 내지 5의 정수, m=1 내지 3의 정수, * 표시는 아자이드기 또는 알킨기인 결합부위이다.
상기 [반응식 7] 및 [반응식 8]에는 평행 입체구조에 대해서만 설명되었으나 비평행 입체구조도 상기 [반응식 7] 및 [반응식 8]과 동일한 방법으로 진행하되, P 및 P`의 서열이 서로 반대 방향이 되도록 말단이 아자이드기인 화합물 또는 말단이 알킨기인 화합물에 결합시키면 된다.
실시예 1. 평행 입체구조의 단백질 다이머 제조
L로서 보호기로 보호된 라이신(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)(2.2 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM(Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비)혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 15분 동안 진탕기에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(0.25 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 라이신을 결합하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 스페이서(S 및 S`)(2.2 mmol) 및 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 2.2 mmol)을 아미노산 서열의 순서에 따라 1.0 M DIEA(diisopropylethylamine, 2 ㎖, in DMF) 및 0.4 M HBTU 용액(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2:3 DMF/DMSO, v/v) 8 ㎖에 용해시켜 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 라이신과 반응시켰다. 각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다.
상기 과정을 모두 거친 후 Fmoc-보호기가 제거되어 완성된 기질이 결합된 단백질 다이머는 DCM으로 세척하고, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 45 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 3000 rpm으로 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 평행 입체구조의 단백질 다이머를 얻었다.
상기 실시예 1에 제조과정은 하기 [반응식 9]에 나타내었으며, 상기 실시예 1에서 제조된 평행(parallel) 입체구조의 단백질 다이머는 도 1a에 도시되었다.
[반응식 9]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000029
실시예 2. 비평행 입체구조의 단백질 다이머 제조
Fmoc-으로 아민기가 보호된 발린 Fmoc-Val-OH(2.2 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM(Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비)혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 15분 동안 진탕기에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(0.25 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 발린을 결합하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 1.1 mmol) 와 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 스페이서(S 및 S`)(1.1 mmol)를 아미노산 서열의 순서에 따라 1.0 M DIEA(diisopropylethylamine, 2 ㎖, in DMF) 및 0.4 M HBTU 용액(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2:3 DMF/DMSO, v/v) 8 ㎖에 용해시켜 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 발린과 반응시켰다. 각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. L로서 보호기로 보호된 라이신(Boc-Lys(Fmoc)-OH)(1.1 mmol)을 사용하였고, 이후에 스페이서(1.1 mmol)인 H2N-GGGSGGGS-COOH와 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 1.1 mmol)를 Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 상기 반응법과 동일하게 반응시키서 기질-Aβ(P`)-스페이서(S`)-라이신(L)-스페이서(S)-Aβ(P) 구조의 기질이 결합된 단백질 다이머를 제조하였다.
상기 과정을 모두 거친 후 Fmoc-보호기가 제거되어 완성된 기질이 결합된 단백질 다이머는 DCM으로 세척하고, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 45 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 3000 rpm으로 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 비평행 입체구조의 단백질 다이머를 얻었다.
상기 실시예 2에 제조과정은 하기 [반응식 10]에 나타내었으며, 상기 실시예 2에 제조된 비평행(anti-parallel) 입체구조의 단백질 다이머는 도 1b에 도시되었다.
[반응식 10]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000030
실시예 3. 평행 입체구조의 단백질 다이머 제조(click chemistry)
-Fragment 1
L로서 보호기로 보호된 라이신(Fmoc-Lys(mtt)-OH)(2.2 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM(Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비)혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 15분 동안 진탕기에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(0.25 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 라이신을 결합하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 스페이서(S 및 S`)(1.1 mmol) 및 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 1.1 mmol)을 아미노산 서열의 순서에 따라 1.0 M DIEA(diisopropylethylamine, 2 ㎖, in DMF) 및 0.4 M HBTU 용액(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2:3 DMF/DMSO, v/v) 8 ㎖에 용해시켜 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 라이신과 반응시켰다. 각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. 마지막 아미노산 Fmoc-보호기의 제거 전 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고 라이신의 사이드 체인(side chain) 보호기인 mtt를 3% TFA(in DCM)으로 5분간 5회 진탕하여 제거하였다. Mtt가 제거된 Free한 아민기를 가진 레진을 반을 나누어 각각 아자이도아세틱 엑시드(azidoacetic acid)와 프로피오릭 엑시드(propiolic acid)로 커플링 반응을 시켜 각각 아자이드기 및 알킨기가 구비된 단백질 모노머를 얻었다. 이후 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고 DCM으로 세척 후, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 45 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 3000 rpm으로 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 평행 입체구조의 단백질 모노머를 얻었다.
[Fragment 1]
H2N-Aβ40-Spacer-Lys(mtt)-COOH
-Fragment 2
Fmoc-으로 아민기가 보호된 발린(Fmoc-Val-OH)(2.2 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM(Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비)혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 15분 동안 진탕기에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(0.25 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 발린을 결합하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 1.1 mmol) 와 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 스페이서(S 및 S`)(1.1 mmol), L로서 보호기로 보호된 라이신(Fmoc-Lys(mtt)-OH)(1.1 mmol)을 아미노산 서열의 순서에 따라 1.0 M DIEA(diisopropylethylamine, 2 ㎖, in DMF) 및 0.4 M HBTU 용액(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2:3 DMF/DMSO, v/v) 8 ㎖에 용해시켜 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 발린과 반응시켰다. 각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. 이후 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고 라이신의 사이드 체인(side chain) 보호기인 mtt를 3% TFA(in DCM)으로 5분간 5회 진탕하여 제거하였다. Mtt가 제거된 Free한 아민기를 가진 레진을 반을 나누어 각각 아자이도아세틱 엑시드(azidoacetic acid)와 프로피오릭 엑시드(propiolic acid)로 커플링 반응을 시켜 각각 아자이드기 및 알킨기가 구비된 단백질 모노머를 얻었다.
DCM으로 세척 후, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 45 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 3000 rpm으로 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 평행 입체구조의 단백질 모노머를 얻었다.
[Fragment 2]
H2N-Lys(mtt)-Spacer-Aβ40-COOH
fragments 1 과 2가 각각 하나의 다이머를 형성하는 경우 (평행구조)
각 fragment들은 azide/alkyne cycloaddition을 통해(Fragment 1 + Fragment 1, Fragment 2 + Fragment 2) 평행 입체구조의 단백질 다이머 제조가 가능하다. 녹색 : Frag.1 + Frag.1(N-terminal free dimer), 주황색 : Frag.2 + Frag.2(C-terminal free dimer)
[반응식 11]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000031
실시예 4. 비평행 입체구조의 단백질 다이머 제조(click chemistry)
-Fragment 1
L로서 보호기로 보호된 라이신(Fmoc-Lys(mtt)-OH)(2.2 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM(Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비)혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 15분 동안 진탕기에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(0.25 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 라이신을 결합하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 스페이서(S 및 S`)(1.1 mmol) 및 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 1.1 mmol)을 아미노산 서열의 순서에 따라 1.0 M DIEA(diisopropylethylamine, 2 ㎖, in DMF) 및 0.4 M HBTU 용액(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2:3 DMF/DMSO, v/v) 8 ㎖에 용해시켜 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 라이신과 반응시켰다. 각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. 마지막 아미노산 Fmoc-보호기의 제거 전 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고 라이신의 사이드 체인(side chain) 보호기인 mtt를 3% TFA(in DCM)으로 5분간 5회 진탕하여 제거하였다. Mtt가 제거된 Free한 아민기를 가진 레진을 반을 나누어 각각 아자이도아세틱 엑시드(azidoacetic acid)와 프로피오릭 엑시드(propiolic acid)로 커플링 반응을 시켜 각각 아자이드기 및 알킨기가 구비된 단백질 모노머를 얻었다. 이후 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고 DCM으로 세척 후, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 45 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 3000 rpm으로 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 평행 입체구조의 단백질 모노머를 얻었다.
[Fragment 1]
H2N-Aβ40-Spacer-Lys(mtt)-COOH
-Fragment 2
Fmoc-으로 아민기가 보호된 발린(Fmoc-Val-OH)(2.2 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM(Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비)혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 15분 동안 진탕기에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(0.25 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 발린을 결합하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 베타 아밀로이드(Aβ) 1-40(P 및 P`, 1.1 mmol) 와 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 스페이서(S 및 S`)(1.1 mmol), L로서 보호기로 보호된 라이신(Fmoc-Lys(mtt)-OH)(1.1 mmol)을 아미노산 서열의 순서에 따라 1.0 M DIEA(diisopropylethylamine, 2 ㎖, in DMF) 및 0.4 M HBTU 용액(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2:3 DMF/DMSO, v/v) 8 ㎖에 용해시켜 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 발린과 반응시켰다. 각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 용액(1:1:3 피페리딘/DMSO/DMF, v/v/v)으로 5분 및 15분(2회, 각 5분씩 DMF로 세척) 동안 진탕하여 제거하였다. 이후 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고 라이신의 사이드 체인(side chain) 보호기인 mtt를 3% TFA(in DCM)으로 5분간 5회 진탕하여 제거하였다. Mtt가 제거된 Free한 아민기를 가진 레진을 반을 나누어 각각 아자이도아세틱 엑시드(azidoacetic acid)와 프로피오릭 엑시드(propiolic acid)로 커플링 반응을 시켜 각각 아자이드기 및 알킨기가 구비된 단백질 모노머를 얻었다.
DCM으로 세척 후, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 45 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 3000 rpm으로 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 평행 입체구조의 단백질 모노머를 얻었다.
[Fragment 2]
H2N-Lys(mtt)-Spacer-Aβ40-COOH
fragments 1 과 2가 하나의 다이머를 형성하는 경우(비평형 구조)
각 fragment들은 azide/alkyne cycloaddition을 통해(Fragment 1 + Fragment 2) 비평행 입체구조의 단백질 다이머 제조가 가능하다. 녹색+주황색 : Frag.1 + Frag.2(anti-parallel dimer)
[반응식 12]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000032
<시험예>
실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 단백질 다이머 분말을 DMSO에 녹인 후 상기 용액에 기울기 용액 A(증류수+0.1% TFA)와 용액 B(아세토나이트릴+0.09% TFA)를 40분 동안 5 내지 95%의 농도구배로 고속액체크로마토그래피(HPLC, high-performance liquid chromatography)를 이용하여(파장: 230 nm, 유속: 0.96 ml/min) 순수한 단백질 다이머를 얻었다.
또한, 시험예에서 비교예로 사용한 베타 아밀로이드 단백질 모노머는 Aβ 1-40이다.
시험예 1. ESI-MASS 질량분석
도 2a는 실시예 1에서 제조된 단백질 다이머를 ESI-MASS로 측정한 그래프이고, 도 2b는 실시예 2에서 제조된 단백질 다이머를 ESI-MASS로 측정한 그래프이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 1 및 2의 단백질 다이머는 8개의 봉우리가 1634 Da(M/6 + 1H)에서 754 Da(M/13 + 1H)까지 보인다. 실시예 1은 평행 입체구조를 보이며(MW: 9802.8198 Da), 실시예 2는 비평행 입체구조(MW: 9802.8198 Da)를 보이는 것으로 확인하였다.
시험예 2. 시뮬레이션 측정
도 3은 베타 아밀로이드 단백질 모노머 2가닥, 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 단백질 다이머에 대한 시뮬레이션을 측정한 도면이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 단백질 모노머 2가닥은 스페이서 및 링커로 연결된 구조가 아니며, 실시예 1 및 실시예 2의 단백질 다이머는 두 단백질 모노머에 두 스페이서가 각각 연결되고 두 스페이서는 링커로 연결된 구조라는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1의 단백질 다이머는 두 스페이서가 각각 두 단백질 모노머의 카르복실기와 연결되어 평행 입체구조를 가진다는 것을 확인하였으며, 실시예 2의 단백질 다이머는 두 스페이서 중 제1 스페이서가 단백질 모노머의 카르복실기와 연결되고 제2 스페이서가 다른 단백질 모노머의 아민기와 연결되어 비평행 입체구조를 가진다는 것을 확인하였다.
시험예 3. 형광강도 측정
본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 단백질 다이머가 집적되어 피브릴을 형성하는지 여부를 확인하기 위하여 수행하였으며, 피브릴 형성 수준을 측정하는 위하여 thioflavin T(ThT) 형광분석을 이용하였다. 상기 ThT는 β-시트 복합체에 결합할 때 형광 특성이 전환된다고 알려진 분자이다.
형광강도를 측정하는 위하여 하기와 같은 전처리 시험을 수행하였다.
DMSO에 용해된 베타 아밀로이드 단백질 모노머 2.5 mM, 실시예 1 및 실시예 2의 단백질 다이머 각 1.25 mM을 증류수로 100배 희석한 다음 밀봉하여 37 ℃에서 2시간 및 7일 동안 배양하여 응집을 유도하였다. 단, DMSO에 용해시킨 후 실험에 사용하고 남은 베타 아밀로이드는 -80 ℃에 보관가능하다. 배양 후 시료를 각각 96웰 플레이트(half-area 96-well black plate)에 파종하고, 5 μM ThT 용액(pH 8.5 글리신 완충용액 내 5 μM ThT)을 첨가하여 10분 동안 어두운 곳에서 약하게 진탕하여 혼합하였다.
ThT 형광세기는 450nm /485 nm에서 플렉스스테이션 3 멀티-레이블 리더기(FlexStation3 multi-label reader(Molecular Device, CA, USA))로 측정하였다.
도 4는 베타 아밀로이드 단백질 모노머, 실시예 1의 단백질 다이머 및 실시예 2의 단백질 다이머에 대한 형광강도를 측정한 그래프이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 시간의 지날수록 실시예 2의 단백질 다이머가 베타 아밀로이드 단백질 모노머 및 실시예 1의 단백질 다이머에 비하여 형광강도가 급격히 증가하는 것을 확인하였다. 이는 실시예 2의 단백질 다이머가 베타 아밀로이드 단백질 모노머 및 실시예 1의 단백질 다이머에 비하여 피브릴을 잘 형성한다는 것을 의미한다.
또한, 실시예 3(Fragment 1 + Fragment 1)은 실시예 1과 유사한 수준의 형광강도를 보이고, 실시예 4(Fragment 1 + Fragment 2)는 실시예 2와 유사한 수준의 형광강도를 보이는 것을 확인하였으므로 실시예 4도 피브릴을 잘 형성하는 것을 확인하였다.
시험예 4. 응집체 형성 수준 측정
응집제 형성 수준을 측정하기 위하여, 상기 시험예 3에서 배양한 시료에 변경되지 않은 단백질(PICUP, photo-induced cross-linking of unmodified proteins) 프로토콜의 광유도된 가교로 SDS-PAGE를 수행하고 은으로 염색하였다.
도 5는 베타 아밀로이드 단백질 모노머, 실시예 1의 단백질 모노머 및 실시예 2의 단백질 모노머에 대한 응집체 형성 수준을 나타낸 지표이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 단백질 다이머는 4량체, 6량체 및 피브릴 형태로 상당한 양을 형성할 수 있다는 것을 확인하였다. 이는 상기 시험예 3의 분석 결과와 일치하는 것이다.
시험예 5. 세포독성 측정
뇌 내의 베타 아밀로이드 단백질 다이머는 독성이 있는 것으로 알려져 있으므로, 상기 뇌 내의 베타 아밀로이드 단백질 다이머와 유사한 구조로 합성된 단백질을 이용하여 독성을 측정하였다.
독성을 측정하기 위하여 하기와 같은 전처리 시험을 수행하였다.
마우스 해마신경세포(mouse hippocampal neuron cell line)인 HT-22세포주를 일정한 수로 플레이트에 도포 후, 이를 각 샘플로 처리하여 무처리군, 베타 아밀로이드 단백질 모노머로 처리한 군, 실시예 1의 단백질 다이머로 처리한 군 및 실시예 2의 단백질 다이머로 처리한 군으로 나누었다. 24시간 후 세포의 생존률을 MTT로 측정하였으며, 수치가 높을수록 세포 생존률이 높음을 나타낸다. 이때, 상기 베타 아밀로이드 단백질 모노머는 모노머이므로 다이머인 실시예 1 및 실시예 2에 비하여 2배의 농도로 처리하였다.
상기 MTT 시약은 세포의 미토콘드리아의 활성을 측정하므로써 간접적으로 세포의 생존률을 측정할 수 있는 시약이다.
도 6은 무처리군(대조군), 베타 아밀로이드 단백질 모노머로 처리한 군(비교예), 실시예 1의 단백질 다이머로 처리한 군(실시예 1) 및 실시예 2의 단백질 다이머로 처리한 군(실시예 2)에 대한 세포생존능을 측정한 그래프이다.
도 6에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 단백질 다이머로 처리한 세포가 생존율이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 그러므로 평행 입체구조의 다이머(실시예 1)는 독성이 적으며, 비평행 입체구조의 다이머(실시예 2)는 독성이 많은 것을 의미한다.
시험예 6. 뇌 신경세포의 손상 여부 측정
마우스 준비
실험동물로는 ICR(Crl:CD1)마우스를 이용하였으며 5주령의 동일 주령 개체 40마리를 이용하였다.
연구에 사용된 마우스는 (주)오리엔트 바이오에서 구입하여 실험동물 윤리 규정 하에 관리하고 실험에 이용하였다.
급성 알츠하이머 병을 유도하기 위하여 생쥐의 뇌실 부분(ICV, intracerebrovenricular)에 시료를 5 μL씩 주입하여 하기 4개의 군으로 나누었다. 이때 주입한 베타 아밀로이드 단백질 모노머의 농도는 다이머 농도(100 μM)의 두 배인 200 μM이다.
대조군: DMSO/PBS를 주입한 마우스 군(10마리)
비교예: 베타 아밀로이드 단백질 모노머를 주입한 마우스 군(10마리)
실시예 1: 실시예 1에서 제조된 단백질 다이머를 주입한 마우스 군(10마리)
실시예 2: 실시예 2에서 제조된 단백질 다이머를 주입한 마우스 군(10마리)
6-1. Y자형 미로실험
시료를 뇌실에 주입하고 4일 후, 각 생쥐군의 공간 지각능력을 측정하기 위해서 와이-메이즈(Y-maze) 행동 실험을 실시하였다. 이는 생쥐의 행동변용(alternation of behavior)을 측정하는 것으로, 행동변용이란 행동요법에 있어서 피실험자가 이제까지의 일그러진 반응패턴을 멈추고 새롭게 보다 적응한 행동양식을 깨달아 그것을 실천하게 되는 것을 말한다. 와이-메이즈 행동 실험법은 120° 간격의 3가지 방향의 미로에 생쥐를 8분 동안 자유롭게 돌아다니게 하여 각각의 미로에 들어가는 순서를 측정한다. 측정된 실험값은 행동변용 백분율(%)로 계산될 수 있는데, 계산법은 하기 [수학식 1]과 같다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2015007160-appb-I000033
상기의 성공적 변용횟수는 3개씩 겹쳐진 미로의 값들이 모두 다를 때 정의된다.
도 7a는 상기 4개의 시험군에 대한 행동변용 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 단백질 다이머를 주입한 군의 마우스가 대조군 및 실시예 1의 단백질 다이머를 주입한 군에 비하여 행동 능력이 손상된 것으로 확인되었다.
6-2. 수동 회피 실험
시료를 뇌실에 주입하고 30분 후, 마우스를 조명이 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 20초의 탐색시간 후 길로틴문(guillotine door)이 열려 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이때 길로틴문이 열린 후 40초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 마우스는 실험에서 제외시켰다. 길로틴문이 열린 후 마우스가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 일단 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.5 mA의 전기 충격이 3초 동안 격자 바닥을 통해 흐르게 되고 마우스는 이러한 전기충격을 기억하게 된다.
학습 시험이 끝나고 24시간 후에 본 실험을 시행하였다. 마우스가 20초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time : 머무름 시간)을 180초까지 측정하였다. 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.
도 7b는 상기 4개의 시험군에 대한 수동 회피를 나타낸 그래프이다.
도 7b에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 단백질 다이머를 주입한 군의 마우스는 대조군 및 실시예 1의 단백질 다이머를 주입한 군에 비하여 latency time이 짧으므로 수동회피의 학습과 기억이 좋지 않음을 확인하였다.
이러한 시험을 통해, 비평행 입체구조의 실시예 2의 단백질 다이머가 해마 의존적 학습 및 기억 결손을 유도하는 것을 확인하였다.
본 발명의 단백질 다이머는 뇌 내의 천연 단백질 응집체와 유사한 구조를 가지므로 단백질 다이머를 이용하여 상기 뇌 내의 천연 단백질 응집체와 반응하면 상기 천연 단백질 응집체를 인식하는 항체를 제조할 수 있으며, 상기 단백질 다이머를 인식할 수 있는 물질을 개발할 수 있다. 뿐만 아니라, 단백질 다이머를 인식할 수 있는 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟물질을 제조하여 뇌 내의 천연 단백질 응집체를 뇌영상으로 진단할 수 있다.

Claims (61)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 단백질 다이머:
    [화학식 1]
    P-S-L-S`-P`
    상기 화학식 1에서 상기 P 및 상기 P`는 단백질 또는 그 절편이고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지거나(parallel) 또는 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
    상기 S 및 상기 S`는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 스페이서이며,
    상기 L은 링커이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1]로 표현되고,
    [화학식 1-1]
    NPC-S-L-S`-CP`N
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고,
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1a]로 표현되며,
    [화학식 1-1a]
    NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 CS`N는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  4. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2]로 표현되고,
    [화학식 1-2]
    CPN-S-L-S`-NP`C
    상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  5. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서이며,
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2a]로 표현되고,
    [화학식 1-2a]
    CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
    상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 CSN는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  6. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-3]로 표현되고,
    [화학식 1-3]
    NPC-S-L-S`-NP`C
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  7. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하며,
    상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
    상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서이며,
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-3a]로 표현되고,
    [화학식 1-3a]
    NPC-NSC-L-NS`C-NP`C
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  8. 제1항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 응집체 형성이 가능한 단백질 또는 그 절편인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  9. 제1항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 1 내지 42의 베타 아밀로이드, 타우 단백질, 시누클레인, 프리온 단백질로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 그 절편인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  10. 제1항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 각각 독립적으로 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  11. 제1항에 있어서, 상기 절편은 베타 아밀로이드 40 또는 베타 아밀로이드 42의 아미노산 서열 중에 응집체 형성이 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  12. 제1항에 있어서, 상기 스페이서는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  13. 제1항에 있어서, 상기 스페이서는 5 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  14. 제1항에 있어서, 상기 스페이서는 GGGSGGGS의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  15. 제1항에 있어서, 상기 L은 2개의 아민기 또는 2개의 카르복실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  16. 제1항에 있어서, 상기 L은 기질과 결합이 가능한 관능기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  17. 제16항에 있어서, 상기 기질은 왕 레진(Wang's resin), 메리필드 레진(Merrifield resin), 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  18. 제1항에 있어서, 상기 L은 알킨(
    Figure PCTKR2015007160-appb-I000034
    )과 아자이드(R`-N3)의 Husgen Cycloaddition 반응 결합물이고,
    상기 R 및 R`는
    Figure PCTKR2015007160-appb-I000035
    또는
    Figure PCTKR2015007160-appb-I000036
    중에서 같거나 상이한(n=0 내지 5의 정수, m=1 내지 3의 정수, * 표시는 아자이드기 또는 알킨기인 결합부위) 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  19. 제18항에 있어서, 상기 아자이드는 H2NCH(N3)COOH또는 H2NCH(CH2CH2CH2N3)COOH이고, 상기 알킨은 H2NCH(C≡CH)COOH 또는 H2NCH(CH2CH2CH2C≡CH)COOH인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  20. 제18항에 있어서, 상기 L은 트리아졸을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  21. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1]로 표현되고,
    [화학식 1-1]
    NPC-S-L-S`-CP`N
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 L은 2개의 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  22. 제19항에 있어서, 상기 L은 카르복실기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  23. 제19항에 있어서, 상기 L은 라이신인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  24. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서이며,
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-1a]로 표현되고,
    [화학식 1-1a]
    NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 CS`N는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 L은 2개의 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  25. 제24항에 있어서, 상기 L은 카르복실기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  26. 제24항에 있어서, 상기 L은 라이신인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  27. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2]로 표현되고,
    [화학식 1-2]
    CPN-S-L-S`-NP`C
    상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 L은 2개의 카르복실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  28. 제27항에 있어서, 상기 L은 아민기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  29. 제27항에 있어서, 상기 L은 글루탐산인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  30. 제1항에 있어서, 상기 S와 S`는 동일하거나 상이하고,
    상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 S 및 상기 S`는 각각 독립적으로 단일 결합이거나 또는 아미노산 서열을 갖는 스페이서이며,
    상기 화학식 1의 단백질 다이머는 하기 [화학식 1-2a]로 표현되고,
    [화학식 1-2a]
    CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
    상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 CSN는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고,
    상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며,
    상기 L은 2개의 카르복실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  31. 제30항에 있어서, 상기 L은 아민기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  32. 제30항에 있어서, 상기 L은 글루탐산인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  33. 제1항에 있어서, 상기 L은 기질과 결합이 가능한 관능기를 추가로 포함하고,
    상기 관능기는 아민기, 카르복실기, 에스테르기 또는 하이드록실기 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 단백질 다이머.
  34. 제1항에 있어서, 상기 단백질 다이머는 하기 [서열번호 1]의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단백질 다이머:
    [서열번호 1]
    NH2-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-GGGSGGGS-εK-SGGGSGGG-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-NH2.
  35. 제1항에 있어서, 상기 단백질 다이머는 하기 [서열번호 2]의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단백질 다이머:
    [서열번호 2]
    COOH-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-SGGGSGGG-K-ε-SGGGSGGG-VVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD-NH2.
  36. 제1항의 단백질 다이머를 포함하는 인지 장애 질환 검출용 항원.
  37. 제36항의 항원과 특이적으로 결합하는 항체.
  38. 제1항의 단백질 다이머와 상호작용을 하는 항체를 포함하여 상기 단백질 다이머를 인식하는 물질.
  39. 제38항의 물질을 포함하는 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟 물질.
  40. 제39항의 핵의학적 뇌영상 진단용 타겟 물질을 투입한 후 인지장애 질환에 특이적으로 증가된 병변을 핵의학영상촬영장치(SPECT)로 촬영하는 단계를 포함하는 핵의학적 뇌영상 측정방법.
  41. 제38항의 단백질 다이머를 인식하는 물질을 개발하기 위한 리간드 분자.
  42. 제41항에 있어서, 상기 리간드 분자는 제1항의 단백질 다이머인 것을 특징으로 하는 리간드 분자.
  43. 하기 [화학식 1-1]로 표시되며,
    [화학식 1-1]
    NPC-S-L-S`-CP`N
    상기 S와 S`는 단일 결합이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지고(parallel),
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
    (A) 2개의 아민기 및 관능기를 포함하는 L의 상기 관능기와 기질을 결합하는 단계;
    (B) 상기 L에 포함된 각각의 아민기에 상기 P 및 상기 P`를 결합하는 단계; 및
    (C) 상기 L과 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  44. 하기 [화학식 1-1a]로 표시되며,
    [화학식 1-1a]
    NPC-NSC-L-CS`N-CP`N
    상기 S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 CS`N는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CP`N는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
    (A`) 2개의 아민기 및 관능기를 포함하는 L의 상기 관능기와 기질을 결합하는 단계;
    (B`) 상기 L에 포함된 각각의 아민기에 상기 S 및 상기 S`를 결합하는 단계;
    (C`) 상기 S 및 상기 S`각각에 상기 P 및 상기 P`를 결합하는 단계; 및
    (D`) 상기 L과 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 관능기는 카르복실기인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  47. 하기 [화학식 1-2]로 표시되며,
    [화학식 1-2]
    CPN-S-L-S`-NP`C
    상기 S와 S`는 단일 결합이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
    (A``) 기질에 상기 P 및 상기 P`를 2개 이상으로 결합시키는 단계;
    (B``) 상기 2개 이상의 상기 P 및 상기 P`중에서 인접한 상기 P 및 상기 P`와 2개의 카르복실기를 포함하는 하나의 L을 결합하는 단계; 및
    (C``) 상기 P 및 상기 P`와 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  48. 하기 [화학식 1-2a]로 표시되며,
    [화학식 1-2a]
    CPN-CSN-L-NS`C-NP`C
    상기 S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, 상기 P 및 상기 P`는 상기 L에서 상기 P 및 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일한 아미노산 서열을 가지며(parallel),
    상기 CPN는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 CSN는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 C 말단에서 N 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
    (A```) 기질에 상기 P 및 상기 P`를 2개 이상으로 결합시키는 단계;
    (B```) 상기 2개 이상의 상기 P 및 상기 P` 중에서 인접한 2개의 상기 P 및 상기 P`와 상기 S 및 상기 S`를 결합하는 단계;
    (C```) 상기 S 및 상기 S`과 상기 2개의 카르복실기를 포함하는 하나의 L을 결합하는 단계; 및
    (D```) 상기 P 및 상기 P`와 기질을 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  51. 하기 [화학식 1-3]으로 표시되며,
    [화학식 1-3]
    NPC-S-L-S`-NP`C
    상기 S와 S`는 단일 결합이고, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
    (a) 기질에 상기 P`를 결합하는 단계;
    (b) 상기 P`와 상기 2개의 아민기를 포함하는 L을 결합하는 단계;
    (c) 상기 L에 함유된 2개의 아민기 중 하나의 아민기에 보호기를 부착하는 단계;
    (d) 상기 L에 함유된 다른 아민기에 상기 P를 결합하는 단계;
    (e) 상기 (c)단계에서 부착된 보호기를 제거하는 단계; 및
    (f) 상기 기질과 상기 P`를 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  52. 하기 [화학식 1-3a]로 표시되며,
    [화학식 1-3a]
    NPC-NSC-L-NS`C-NP`C
    상기 S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, 상기 P의 최외각에서 상기 L 방향과 상기 L에서 상기 P`의 최외각 방향으로 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가지며(anti-parallel),
    상기 NPC는 상기 P가 최외각에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NSC는 상기 S가 상기 P에서 상기 L 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내며, 상기 NS`C는 상기 S`가 상기 L에서 상기 P` 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내고, 상기 NP`C는 상기 P`가 상기 L에서 최외각 방향으로 보았을 때 N 말단에서 C 말단의 방향인 것을 나타내는 단백질 다이머를 제조하는 방법으로서,
    (a`) 기질에 상기 P`를 결합하는 단계;
    (b`) 상기 P`와 상기 S`를 결합하는 단계;
    (c`) 상기 S`와 2개의 아민기를 포함하는 상기 L을 결합하는 단계;
    (d`) 상기 L에 함유된 2개의 아민기 중 하나의 아민기에 보호기를 부착하는 단계;
    (e`) 상기 L에 함유된 다른 아민기에 상기 S를 결합하는 단계;
    (f`) 상기 S에 상기 P를 결합하는 단계;
    (g`) 상기 (d`)단계에서 부착된 보호기를 제거하는 단계; 및
    (h`) 상기 기질과 상기 P`를 절단하여 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 베타 아밀로이드 40, 베타 아밀로이드 42 및 이들 중 어느 하나의 절편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  55. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 보호기가 부착되는 아민기는 사이드 체인(side chain)으로 화학결합된 아민기인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  56. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 보호기는 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 4-메틸트리틸 (Mtt) 또는 t-부톡시카보닐(Boc)인 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  57. 제2항, 제4항 및 제6항에서 표시된 [화학식 1-1], [화학식 1-2] 및 [화학식 1-3] 중에서 선택되며, S와 S`는 단일 결합이고, L은 트리아졸을 포함하는 단백질 다이머를 제조하는 방법에 있어서,
    (Ⅰ) 상기 P`와 말단이 아자이드기인 화합물을 결합하는 단계;
    (Ⅱ) 상기 P와 말단이 알킨기인 화합물을 결합하는 단계; 및
    (Ⅲ) 상기 (Ⅰ)단계의 아자이드기와 (Ⅱ)단계의 알킨기의 반응으로 L이 형성되어 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  58. 제3항, 제5항 및 제7항에서 표시된 [화학식 1-1a], [화학식 1-2a] 및 [화학식 1-3a] 중에서 선택되며, S와 S`는 비펩티드 스페이서 또는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고, L은 트리아졸을 포함하는 단백질 다이머를 제조하는 방법에 있어서,
    (Ⅰ`) 상기 S`와 말단이 아자이드기인 화합물을 결합하는 단계;
    (Ⅱ`) 상기 S`와 P`를 결합하는 단계;
    (Ⅲ`) 상기 S와 말단이 알킨기인 화합물을 결합하는 단계;
    (Ⅳ`) 상기 S와 상기 P를 결합하는 단계; 및
    (Ⅴ`) 상기 (Ⅰ`)단계의 아자이드기와 (Ⅲ`)단계의 알킨기의 반응으로 L이 형성되어 단백질 다이머를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 P 및 상기 P`는 1 내지 42개 아미노산 중에서 선택된 개수의 아미노산을 순차적으로 결합시켜 형성된 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
  61. 제57항 또는 제58항에 있어서 상기 말단이 아자이드기인 화합물 및 상기 말단이 알킨기인 화합물은 R`-N3 및 R-≡로 표시되며, 상기 R 및 R`는
    Figure PCTKR2015007160-appb-I000037
    또는
    Figure PCTKR2015007160-appb-I000038
    중에서 같거나 상이한(n=0 내지 5의 정수, m=1 내지 3의 정수, * 표시는 아자이드기 또는 알킨기인 결합부위) 것을 특징으로 하는 단백질 다이머의 제조방법.
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WO2007064917A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Abbott Laboratories Methods of preparation of recombinant forms of human beta-amyloid protein and uses of these proteins

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