WO2016005639A1 - Método de diagnóstico de cáncer de páncreas - Google Patents

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WO2016005639A1
WO2016005639A1 PCT/ES2015/070529 ES2015070529W WO2016005639A1 WO 2016005639 A1 WO2016005639 A1 WO 2016005639A1 ES 2015070529 W ES2015070529 W ES 2015070529W WO 2016005639 A1 WO2016005639 A1 WO 2016005639A1
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WO
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albumin
pancreatic cancer
subject
value
pancreatic
Prior art date
Application number
PCT/ES2015/070529
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rosa PERACAULA MIRÓ
Marc SÁEZ ZAFRA
María José FERRI IGLESIAS
Joan FIGUERAS FELIP
Rosa Nuria ALEIXANDRE CERAROLS
Rafael DE LLORENS DURAN
Original Assignee
Universitat De Girona
Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Girona Dr. Josep Trueta
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention is related to medicine, and particularly to the diagnosis of cancer. Specifically it refers to a method of
  • pancreatic cancer diagnosis of pancreatic cancer.
  • pancreatic cancer pancreatic ductal adenocarcinoma
  • Imaging techniques are used for the diagnosis and classification of the degree or development of the disease.
  • Carbohydrate Antigen 19-9 CA 19-9
  • CA 19-9 Carbohydrate Antigen 19-9
  • One of the main clinical problems of pancreatic cancer lies precisely in distinguishing this malignant disease from other benign pancreatic diseases, such as chronic pancreatitis (CP).
  • the PDAC is the fourth leading cause of cancer-related mortality in the US.
  • the data also show that this type of cancer is the least improved in terms of survival compared to other types of cancer.
  • the poor prognosis of PDAC is mainly due to the advanced stage of the disease at the time of diagnosis and the aggressive nature of the tumor, which does not usually respond to available therapies.
  • the most effective treatment to date is extractive surgery (resection), but few are the candidates (20%) who can benefit from it, because generally when cancer is detected it is too late even to address it this way.
  • tumor markers are not specific enough to distinguish between benign and malignant forms, in particular and as stated before, it is especially difficult to distinguish cancer from chronic pancreatitis. This is because several types of CP are very similar clinically and morphologically to PDAC in particular. This means that many false positives are detected by image or by tumor markers in patient samples.
  • CA19-9 carbohydrate Antigen 19-9
  • CEA Carcinoembryonic Antigen
  • the levels of other serum proteins are also used alone or in combination with CA19-9 and CEA.
  • CA19-9 is proposed as the most widely used marker, but as discussed below it presents serious limitations, which make it unhelpful for early diagnosis, and only useful for follow-up.
  • the measurement of CA19-9 in isolation allows to obtain sensitivities of 70-90% and specificities of 68-91%.
  • CA19-9 is elevated in non-malignant diseases reduces its specificity. Therefore, combinations of markers that achieve greater sensitivity and specificity are pursued.
  • Proposed marker combinations include the combination of the measurement of serum levels of CEA, CA19-9 and insulin growth factor type 1 (IGF-1). Precisely with this combination, sensitivity and specificity values of 88% and 100%, respectively, are obtained as discriminatory of the two diseases.
  • IGF-1 insulin growth factor type 1
  • the inventors have found combinations of markers, which allow to diagnose pancreatic cancer with great sensitivity from the isolated sample of a subject.
  • the markers correspond to molecules analyzed in the clinical routine. These combinations also provide high specificity allowing differential diagnosis of pancreatic cancer (particularly PDAC) of other benign diseases of the pancreas, such as chronic pancreatitis.
  • the inventors also propose a method of differential diagnosis of pancreatic cancer and chronic pancreatitis (or other benign diseases of the pancreas) of easy clinical implementation. This derives from the fact that a diagnostic method is proposed in which the values of the different markers are entered into a function to obtain a test value. This test value is compared with a discriminatory value or reference control that allows patients to be classified as subjects with pancreatic cancer or benign pancreatic diseases, more specifically patients with PDAC or CP.
  • the invention relates to a method for the diagnosis of pancreatic cancer, characterized in that it comprises determining in a fluid sample isolated from a subject at least the following markers: - Carbohydrate antigen 19-9 (CA19.9);
  • concentrations of carbohydrate antigen 19-9, and albumin of the isolated sample of the subject are combined in a function to obtain a test value that is compared with a value of discrimination between pancreatic cancer and benign pancreatic diseases.
  • the method when at least these two compounds (CA19-9 and albumin) are measured in the subject's sample, the method is characterized in that the reference control value of carbohydrate antigen 19-9 is 2.9 U / ml; and the reference control value of albumin is 3.9 g / dl. These values are in particular applicable to a fluid sample of the isolated serum type of the subject.
  • the invention relates to a method for the diagnosis of pancreatic cancer, characterized in that it comprises determining at least the levels of CA19-9 and albumin; and optionally calculate a test value by entering the levels detected in the isolated sample of a subject, in a mathematical function. Also, with only the levels of these two molecules or Markers can already differentiate patients or subjects suffering from pancreatic cancer from those suffering from chronic pancreatitis.
  • pancreatic cancer for the diagnosis of pancreatic cancer, it is characterized in that it comprises determining in a fluid sample isolated from a subject the
  • concentrations of CA 19-9 and / or CEA antigen are lower than the reference control values; and / or if the concentrations of IGF-1 and / or albumin are higher than respective reference control values, said concentrations of carbohydrate antigen 19-9, carcinoembryonic antigen, insulin growth factor type 1 and sample albumin isolated from the subject are combined in a function to obtain a test value that is compared with a value of
  • the human IGF-1 corresponds to the access number in the UniProtKB / Swiss-Prot P05019 database, version 1 of the sequence of August 13, 1987 (public data available in version 185 of database entry) .
  • the serum polypeptide sequence comprises 70 amino acids.
  • Human CEA (carcinoembryonic antigen) is a glycoprotein that is produced during fetal development and is usually not detectable in the blood of healthy adults. CEA belongs to the superfamily of
  • immunoglobulins In the present invention, any of its isoforms or group of isoforms expressed in humans are detected interchangeably. Most commercial tests for its detection are directed to the sequence with access number in the UniProtKB / Swiss-Prot database P06731, version 3 of the sequence from 1 January 1, 201 1 (public data available in version 157 database entry).
  • the second serum polypeptide has 651 amino acids and is also known as a cell adhesion molecule related to the carcinoembryonic antigen 5
  • CA 19-9 corresponds to the carbohydrate determinant defined as sialylated lacto-N-fucopentose (II), which was detected as a single band by the mouse monoclonal antibody CA 19-9, produced from a hybridoma derived from cells of the spleen of a mouse immunized with the human colorectal cancer cell line SW1 1 16 (Leibovitz et al., "Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines", Cancer Res-1976, vol. No. 36, pp .: 4562-4569) .
  • Receiver Operating Characteristic with values close to 1. This means that the probability of randomly choosing a positive value (cancer patient) is greater than the probability of obtaining a negative value (patient with pancreatitis or another benign disease of the pancreas). In other words, the probability that the diagnosis made to a patient with pancreatic cancer is correct is greater than that which would be made to a healthy person or benign disease chosen at random.
  • Sensitivity is the concept that indicates that the method is capable of detecting patients with pancreatic cancer despite minimal changes in the levels of markers with respect to healthy control or another disease. Specificity is the concept that indicates that we unequivocally classify well between a cohort of patients, those who have pancreatic cancer of those who do not.
  • CA19-9 levels have been used independently for the monitoring of pancreatic cancer, this invention proposes their use in combination with the addition of albumin levels, or with the addition of CEA levels, IGF-1 and albumin.
  • IGF-1 levels have been described in
  • the method when it is contemplated in the method to determine the concentrations of the four molecules, the method is characterized in that the reference control value of CA 19-9 is 64.61 Units per milliliter (U / ml);
  • the reference control value of CEA is 1 1 .8 nanograms per milliliter (ng / ml)
  • the reference control value of IGF-1 is 80.7 nanograms per milliliter (ng / ml)
  • the reference control value of albumin is 4.1 grams per deciliter (g / dl).
  • the reference control values of CA 19-9 and albumin vary depending on whether only the concentrations of these two molecules are to be determined or considered or whether the concentrations are also to be taken into consideration.
  • CEA and IGF-1 in the isolated patient sample This means that these values can adjust in order not to compromise the sensitivity and specificity of the method, in any of its embodiments, but adapting for example to the type of sample, or population, if necessary and as understood by the person skilled in the art.
  • the method according to the invention can be implemented in clinical practice not only because it is used in it.
  • concentrations of markers or what is the same concentrations of molecules or compounds usually analyzed in the clinical routine for the diagnosis of cancers or other pathologies, but also because the inventors propose an analysis of the concentrations of these two or four molecules combining the values obtained for each of them, so that a test value is obtained.
  • This test value is compared with a reference value that discriminates between pancreatic cancer patients and subjects with
  • the subject if it is diagnosed with pancreatic cancer, it also comprises combining the concentrations of CA 19-9 and albumin; or CA 19-9, CEA, IGF-1 and albumin of the sample isolated from the subject in a function, to obtain the test value that compares with the value of discrimination between pancreatic cancer and benign pancreatic diseases.
  • This particular embodiment makes it possible to verify that, in effect, the subject suffers from cancer although it was already reflected in the concentrations of the markers that were above (CEA, CA19-9) and below (IGF-1, albumin) of the respective reference control values.
  • this test value is obtained from the following formula (I), if the levels of the four molecules are used:
  • Vxob (PDAC) 0 + ⁇ ⁇ 19-9 + p 2 CEA + p 3 IGFl + PtA! Bu min)
  • PDAC Prob
  • ⁇ 16,000764
  • ⁇ 1 0.099556
  • ⁇ 2 0.342634
  • ⁇ 3 is 0.004923
  • ⁇ 4 is -5,200419;
  • Pr ob (Pancreatic— cancer /) ⁇ - ⁇ - ⁇ repet ⁇ ⁇ ⁇ » Q - rx
  • Prob also refers to a probability value, expressed as a percentage, of classifying a subject from suffering from pancreatic cancer or benign pancreatic diseases;
  • ⁇ 13,013
  • ⁇ 1 is 0.035
  • ⁇ 2 is -3,539
  • CA19-9 is the concentration in units per milliliter (U / ml) of carbohydrate antigen 19-9 of the sample isolated from the subject
  • Albumin is the
  • albumin concentration in g / dl of the sample isolated from the subject is albumin concentration in g / dl of the sample isolated from the subject.
  • This discrimination value is a percentage of probability, which is obtained, in a particular embodiment, from the point of maximum sensitivity and specificity, calculated by the generalized linear model (GLM) with binomial response from the values (concentrations) of the four or both markers of a reference cohort comprising subjects with pancreatic cancer and benign pancreatic diseases.
  • the discrimination value between pancreatic cancer and benign pancreatic diseases is 48.2% when the four markers (concentrations of the four molecules) are used in the formula; and 33.5% when only the levels of CA19-9 and albumin according to formula (II) are used.
  • the GLM model allows classifying subjects with pancreatic cancer with a certain sensitivity (97.9% with the four markers and 96.4% with the two) and a specific specificity (95% with the four markers and 90.9% with the two) .
  • the optimum discrimination value is one in which the sensitivity and specificity values are maximum. This value, which corresponds to a probability expressed in percentage (%), is the one used for the classification of the subjects. Based on the values of the four markers in a sample of a test subject (not previously classified) and applying the same model, if the probability is greater than or equal to that of the discriminatory value, the subjects are classified as pancreatic cancer. If the value is less than discriminatory, the subjects are classified as benign pancreas disease, such as CP.
  • a diagnostic method which, still determining the levels of CA19-9, albumin, IGF-1 and CEA, gives the option to the person responsible for issuing a diagnosis of choosing between using only the levels of CA19-9 and albumin. , or the levels of all four together, without noticeable loss of sensitivity and specificity.
  • the probability of suffering from pancreatic cancer will be above 48.2% and the patient will have cancer with a sensitivity of 97.9% and a specificity of 95%.
  • pancreatic cancer is ductal pancreatic adenocarcinoma (PDAC).
  • PDAC pancreatic adenocarcinoma
  • benign pancreas disease is chronic pancreatitis.
  • the method according to this first aspect is for the differential diagnosis of pancreatic cancer with respect to benign diseases of this organ, in a particular embodiment it is for the differential diagnosis of pancreatic cancer and chronic pancreatitis.
  • the method is characterized in that it is for the differential diagnosis of pancreatic cancer and chronic pancreatitis. More particularly for the differential diagnosis of ductal pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis.
  • the isolated fluid sample of the subject is selected from the group consisting of whole blood, serum and plasma.
  • the isolated sample is serum.
  • one of the advantages of the method of the invention is that the levels of these markers can be easily determined from a patient serum sample and by the use of conventional clinical reagents such as commercial antibodies and colorimetric reagents, and
  • Chemiluminescent This avoids having to obtain biopsies of tissues that are invasive and, in addition, representative areas of the tissue in question are not always chosen.
  • CA 19-9, CEA, IGF-1 and albumin concentrations are carried out using a specific binding group for each of the markers.
  • the specific binding group for the determination of the concentration of CA 19-9, CEA, and IGF-1 is an antibody and the
  • said immunoassay is selected from radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluoroimmunoassay (FPIA), immunochemiluminescent.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • FPIA fluoroimmunoassay
  • the specific binding group for the determination of albumin is an anionic coloring compound and the determination is carried out by a colorimetric assay.
  • the specific dye forms a complex with the molecule to be detected (in this case albumin), and the complex has a characteristic absorbance spectrum that is used for quantification.
  • the anionic dye compound is bromocresol green, which forms a bluish green complex with albumin. The intensity of the color is directly proportional to the concentration of albumin. Obviously, other coloring compounds in which this property is maintained that the coloration appearing in the complex is proportional to the amount of albumin may be used in the method according to the invention.
  • immunoassays and / or colorimetric assays have the advantage that they can be carried out in small and easy-to-use biosensors that do not need to be located in a laboratory, nor do they require personnel specialized in analytical chemistry.
  • the process of the invention could be carried out quickly at the point of assistance, for example, it can be carried out by health workers in the same unit
  • Non-limiting examples of rapid detection biosensors suitable for carrying out the method of the invention are a strip
  • Another aspect according to the invention relates, in a second aspect, to a method for deciding or recommending a medical regimen for pancreatic cancer, said medical regimen selected from among treatment.
  • pharmacological and surgical intervention which comprises carrying out the diagnostic method according to any of the embodiments described above; and where, if the subject is diagnosed with pancreatic cancer the recommended medical regimen for pancreatic cancer is recommended or decided, and if the subject is not diagnosed with pancreatic cancer but is diagnosed with a benign pancreatic disease, it is recommended or Decide the medical regimen for this other disease.
  • the invention then relates, according to another aspect of the invention, to the combined use of carbohydrate antigen 19-9 and albumin concentrations; or of carbohydrate antigen 19-9, of carcinoembryonic antigen, of insulin growth factor type 1 and of albumin as a marker of pancreatic cancer. More particularly as a combination of ductal pancreatic adenocarcinoma (PDAC) markers.
  • PDAC pancreatic adenocarcinoma
  • these binary or quaternary combinations of markers are for use in the differential diagnosis of pancreatic cancer and chronic pancreatitis.
  • kits comprising means for determining levels (concentrations) of proteins and carbohydrates in an isolated sample of a subject, said kits characterized in that the means comprising are specific binding groups of 19-9 carbohydrate and albumin antigen; and optionally also of carcinoembryonic antigen and insulin growth factor type 1.
  • the kits are characterized in that they comprise means for calculating a test value that is obtained from the combination of carbohydrate antigen 19-9 and albumin levels and / or the combination of carbohydrate antigen levels 19 -9, of carcinoembryonic antigen, of insulin-like growth factor type 1 and of albumin of the isolated sample in a mathematical function. This test value is compared with a value of
  • kits comprise in a particular embodiment a programmable electronic chip or device, which calculates the value of the concentrations of each of the markers and optionally introduces them in the function of formula (I) or in the function of formula (II) to calculate a probability value
  • the means used for the detection of the concentrations of both (CA19-9 and albumin) or four markers (CA19-9, CEA, IGF-1 and albumin) are part of a kit in a particular embodiment, but can also be part of separate kits.
  • a subject of the invention is also the use of said means for carrying out the method of diagnosis of pancreatic cancer and, more particularly, the method of differential diagnosis of pancreatic cancer and chronic pancreatitis or other benign diseases of the pancreas.
  • the method according to the invention comprises in a particular embodiment the step of collecting and / or supplying and / or saving the data of the previous stages in a data carrier. Therefore, the invention also comprises any data carrier with the diagnostic data directly obtained from the pancreatic cancer diagnostic method of the invention.
  • a “data carrier” should be understood as any means comprising significant information for the diagnosis of pancreatic cancer. In particular, significant information on differential diagnosis of PDAC and CP.
  • data carriers include printed paper with the serum levels of a patient of carbohydrate 19-9 antigen, carcinoembryonic antigen, type 1 insulin growth factor and albumin, said levels determined according to the method of the invention and correlated with the diagnosis of the disease.
  • the data carrier can also be any entity or device capable of containing this diagnostic information.
  • electronic memories such as a ROM, CD ROM or a semiconductor ROM, or a magnetic recording medium, such as a flexible disk or a hard disk.
  • the data carrier may be transmissible such as an electrical or optical signal, which can be transmitted by optical or electrical cable, by radio frequency or other means.
  • the carrier can be this cable itself.
  • Other types of data carriers are
  • diagnosis is well known in the state of the art and refers to the procedure by which a disease, nosological entity, syndrome, or any health-disease condition is identified.
  • sample refers to a patient's body fluid (subject) obtained for the purpose of carrying out the in vitro diagnosis of pancreatic cancer, or for the differential diagnosis of pancreatic cancer and chronic pancreatitis.
  • subject is a mammal and preferably a human.
  • markers or “biomarker” should be understood any molecule (in this case specific protein or carbohydrate) that is detected in an isolated sample of a patient and can be associated with a given signal.
  • the markers are carbohydrate antigens (CA 19-9) or proteins, which from reference values can be associated with pancreatic cancer.
  • Reference control value means a value with which the quantity (concentration) of each of the CA 19-9, CEA, albumin and IGF-1 molecules, determined according to the invention for the diagnosis of cancer of cancer, is compared pancreas. It is a value of each of the markers that allows to distinguish with a degree of probability a subject with pancreatic cancer from the rest of individuals who do not suffer from this cancer, including among these individuals, healthy individuals and individuals suffering from benign diseases of the pancreas , such as chronic pancreatitis.
  • the reference value is a value, also called a cut-off point or threshold value, which allows us to rule out with a high sensitivity that the diagnosed patient suffers from pancreatic cancer and in particular ductal pancreatic adenocarcinoma.
  • This threshold value represents a concentration of each of the markers above or below which, depending on each case, the subject's sample is associated with the disease or not. Therefore, when indicated herein invention that the concentration of one of the markers is "outside the reference control value" refers to exceeding the values associated with a greater probability of non-disease (no pancreatic cancer), or that it is not reached at the minimum levels associated with a greater likelihood of no disease (no pancreatic cancer).
  • the reference value will depend on several factors, among which the type of sample in which the marker is determined, the time period in which said determination is carried out and, to a lesser extent, the determination technique used are highlighted. This is because the levels of the markers may vary in the different fluids of the patient, depending on the time elapsed since the onset of the disease, and depending on the determination technique used, or even depending on the algorithm used where they include the values detected in a test sample to obtain a derived value that gives information to the technician (for example a probability or cut-off value to classify the patients). All this is well known by the person skilled in the art who knows how to adapt the values to each computation of circumstances (type of sample, measurement time, technology, etc.).
  • the reference value can also vary due to the regulation of clinical practice, so that levels that were not considered as pathological at a given time, become so by decision of the health authorities and with the aim of improving the screening of Certain diseases.
  • One possible way to establish the reference value for the method of the invention under given conditions is from the cut-off points of the ROC curve for the marker or combination of markers under those conditions.
  • An ROC curve (acronym for English Receiver Operating Characteristic, or
  • Receiver Operating Characteristic is a graphic representation of the sensitivity to (1 - specificity) for a binary classifier system as the discrimination threshold is varied.
  • the discrimination threshold is equivalent to the reference value of the method of the invention.
  • concentration refers to the amount of each of the markers CA19-9, CEA, IGF-1 and albumin in a sample obtained from a subject. Generally this amount is given per unit volume and therefore it is talked about concentrations.
  • binding group is meant a molecule or segment of molecule capable of specifically binding to a target molecule or protein (in this case the target molecule or protein may be CA19-9, CEA, IGF-1 and albumin).
  • Biosensor means an instrument for measuring biological or chemical parameters.
  • the parameter to be measured is any of the CA19-9, CEA, IGF-1 and albumin molecules.
  • antibody refers to a complete antibody, including without limitation a chimeric, recombinant, transgenic, humanized, grafted and single chain antibody, and the like, as well as any fusion protein, its conjugates, its fragments, or its derivatives containing one or more domains that selectively bind to the target protein or peptide.
  • a complete antibody including without limitation a chimeric, recombinant, transgenic, humanized, grafted and single chain antibody, and the like, as well as any fusion protein, its conjugates, its fragments, or its derivatives containing one or more domains that selectively bind to the target protein or peptide.
  • immunoassay an immunochemical technique where immune complexes are used, that is, those resulting from the conjugation of antibodies and antigens, as quantification references of a given analyte, which may be the antibody or the antigen, used for measurement a molecule as a marker that is part of the reaction with the immune complex.
  • the immunoassay is a set of laboratory analytical immunochemical techniques that have in common the use of immune complexes, that is, those resulting from the conjugation of antibodies and antigens, as quantification references of a given analyte (substance under analysis), which can be the antibody (Ac) or an antigen (Ag), using for measurement a molecule as a marker that is part of the reaction with the immune complex in the chemical test or assay.
  • the techniques are based on the great specificity and affinity of the antibodies for their specific antigens and the monoclonal antibodies (obtained in the laboratory) or polyclonal sera (obtained from animals) are used, the monoclonal ones being more specific. Its high sensitivity and specificity allows the quantification of compounds present in organic liquids in reduced concentration, of the order of nanograms / ml or picograms / ml.
  • “Colorimetric assays” refer to analytical techniques, in which a coloring compound (which gives color to a certain wavelength of light) is complexed with the molecule to be detected.
  • the "dye-molecule to be detected” complex has a characteristic absorbance spectrum that is used for quantification. The intensity of the color is intended to be directly proportional to the concentration of the molecule to be detected.
  • medical regimen should be understood as the set of actions or activities that include pharmacological therapies (such as chemotherapy) and also therapeutic surgical interventions (such as tumor resection), and even other clinical decisions that the specialist oncologist can take, such as hospitalization, or the advice of certain social and dietary habits (avoid drinking alcoholic beverages).
  • pharmacological therapies such as chemotherapy
  • therapeutic surgical interventions such as tumor resection
  • other clinical decisions that the specialist oncologist can take such as hospitalization, or the advice of certain social and dietary habits (avoid drinking alcoholic beverages).
  • pancreatic cancer a malignant neoplasm originating from pancreatic cancer.
  • benign diseases include acute or chronic pancreatitis, which is an inflammation of the pancreas, and benign neoplasms such as serum pancreatic cystadenoma and solid pseudopapillary neoplasm.
  • FIG. 1 shows in each box A to E the levels of CA19-9 (U / ml) (FIG. 1 A), the levels of CEA (ng / ml) (FIG. 1 B), the levels of IGF-1 (ng / ml) (FIG. 1 C), albumin levels (g / dl) (FIG. 1 D); and CRP levels (mg / dl) (FIG. 1 E), for each patient sample, said patients classified as healthy (HC), patients with chronic pancreatitis (CP) and with ductal pancreatic adenocarcinoma (PDAC). The marks * show that the difference between groups was significant.
  • HC healthy
  • CP chronic pancreatitis
  • PDAC ductal pancreatic adenocarcinoma
  • FIG. 2 shows an ROC curve for the discrimination of subjects with PDAC from subjects with CP using only the serum levels of CA19-9 (solid line) and using the levels of the four markers CA19-9, CEA, IGF-1 and albumin in combination according to the invention (dashed line).
  • FIG. 3 shows an ROC curve for the discrimination of subjects with PDAC from subjects with CP, using the levels of the two CA19-9 markers and albumin in combination, according to the invention.
  • An independent sample cohort was used for validation. This cohort comprised 20 patients with PDAC (mean age (standard deviation) 67.2 (10.4), 45.0% men) and 13 patients with CP (mean age (standard deviation) 50.9 (9.55), 76.9% men). Serum samples from cancer patients were taken by venipuncture before surgery. Serum samples from patients with CP and controls (HC) were obtained when these patients went to routine testing controls in the hospital laboratory. The serum was collected by standard procedures and stored at -80 ° C until the time of analysis.
  • PC pancreaticoduodenoctomy.
  • the diagnosis of PC was based on radiological imaging tests, magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography scanner (CT) or ultrasound methods (transcutaneous or endoscopic), as well as clinical evolution. Patients diagnosed with other malignant diseases the last five years were excluded, as were patients with CP with acute disease outbreak.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • CT computed tomography scanner
  • ultrasound methods transcutaneous or endoscopic
  • CA19-9 carbohydrate antigen and carcinoembryonic antigen was determined by immunoassay "ECLIA"
  • Quantitative electrochemiluminescent prepared for use with the Roche Diagnostics E-170 platform.
  • the monoclonal antibody 1 16-NS 19-9 (Life technologies®) is used for the CA19-9 assay.
  • the CEA test is standardized against standard reference 73/601 of the first international reference preparation (1st IRP) of the World Health Organization (WHO).
  • the design characteristics of the CA19-9 and CEA trials were, respectively: intra-test coefficient of variation (CV) 3.4% and 1 .7%, intershile CV 3.9% and 4.9%, sensitivity 0.6 U / ml and 0.2 ng / ml, and linearity 1000 U / ml and 1000 ng / ml.
  • the albumin test was performed with a colorimetric test in a Cobas 71 1 (Roche Diagnostics) standardized against the BCR470 / CRM470 reference preparation (RPPHS-Reference Preparation for Proteins in Human Serum) of the Institute for the Reference of Materials and Measures, with an intra-assay and inter-assay CV of 0.8% and 1 .1%,
  • BCR470 / CRM470 (RPPHS); with an intra-assay and inter-assay CV of 1% and 1 .7%, respectively, a sensitivity of 0.1 g / dl and linearity of 25 g / dl.
  • IGF-1 was determined using the Immulite 2000 analyzer with the solid phase enzymatic chemiluminescent immunometric tide test, which is calibrated with the WHO NIBSC 1 st IRR 87/518.
  • the intra-test and inter-test CV is 3% and 6%, respectively.
  • the sensitivity and linearity are 20 ng / ml and 1600 ng / ml.
  • Nephelometry was also used to measure prealbumin with an Immage 800 (Beckman), with a sensitivity of 1.17 mg / dl, an intra-assay CV of 4% and a linearity of up to 1800 mg / dl.
  • the generalized linear model (GLM) with binomial response was estimated with the R-free statistical program (DeLong ER, et al., "Compahng the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach", Biomethcs-1988; 44: 837-845).
  • the TNM system is a widely used system for tumor staging and has been accepted by the "Union for International Cancer Control (UICC)", and by the "American Joint Committee on Cancer, AJCC”.
  • the age, sex and body mass index (BMI) of the patients are shown in Table 1. While the PDAC and HC groups did not show significant differences in age, sex and BMI, the CP group tends to be formed by men with a lower BMI than the other two groups. This could be explained by the fact that several causes of this disease, such as alcohol abuse, along with inadequate intake or poor absorption of Nutrients caused by the loss of exocrine pancreatic tissue can contribute to a low BMI.
  • Test 1 Univariate analysis of biomarkers: tumor markers (CA 19-9 and CEA), acute phase proteins (albumin and PCR) and IFG-1 in PDAC, CP and HC groups.
  • CP disease or type of sample
  • CA 19-9 and CEA were only measured in patients with CP and in the PDAC groups since the level of these tumor markers in HC are clearly below the established cut-off values.
  • the mean serum concentration of CA 19-9 in PDAC was 945 U / mi, significantly higher than in CP (15.1 U / mi) (p ⁇ 0.001). Using a cut-off point or reference control value of 36.99 U / mi, a specificity of 95% and a sensitivity of 80.9% were obtained.
  • the ROC curve to differentiate PDAC from the CP gave an AUC of 0.862.
  • the serum CEA levels showed no significant differences between the CP and PDAC groups.
  • the ROC curve to differentiate PDAC from the CP gave an AUC of 0.661.
  • the mean serum albumin concentration in PDAC was 3.4 g / di significantly lower than in CP (4.3 g / di) and in HC (4.5 g / di) (p ⁇ 0.001 and p ⁇ 0.001,
  • prealbumin levels were measured as respective indicators of the two disorders. Also its possible correlation with IGF-1 levels. For the measurement of GH the same Immulite 2000 analyzer was used as for IGF-1. Prealbumin levels were determined by nephelometry with an Immage 800 (Beckman). Although the levels of
  • Prealbumin were lower in the PDAC group than in the CP and HC groups, the mean serum prealbumin concentration showed no significant differences between PDAC (mean 16.5 mg / di, SD 5.6) and CP (mean 19.9 mg / di, SD 4.4), but there were significant differences between CP and HC (mean of 25.5 mg / di, SD 3.84) and between PDAC and HC.
  • GH levels there were no significant differences in GH levels between PDAC (mean 1.69 ng / mi, 2.16) and CP (mean 1.58 ng / mL, SD 1, 71) or HC (mean 1. 57, SD 1.81) groups. No correlation was found between GH and IGF-1 levels.
  • Table 2 shows the sensitivity, specificity, negative predictive value, positive predictive value and AUC of each marker to differentiate PDAC from patients with CP.
  • the ability of biomarkers to discriminate PDAC from patients with CP was evaluated based on the AUC value. As shown, there was no marker that behaved better than CA 19-9, but as mentioned earlier, CA 19-9 is not
  • IGF-1 57.4 100 100 50 0.839
  • Table 3 Diagnostic parameters of different combinations of markers to differentiate PDAC from CP.
  • Biomarkers was from CA 19-9 and IGF-1, which gave an AUC of 0.946. This value is much higher than that of CA 19-9 only.
  • the addition of a new biomarker such as CEA levels slightly improved the yield to 0.947.
  • By adding albumin the AUC increased to 0.979. Therefore, the best performance to distinguish patients with PDAC from patients with CP was found with the combination of concentrations of CA 19-9, CEA, IGF-1 and albumin, which resulted in a sensitivity of 97 , 9%, one
  • FIG. 2 ROC curves for the discrimination of CP PDAC are detailed using only the serum levels of CA19-9 (solid line) and using the levels of the four markers (CA19-9, CEA, IGF-1 and albumin) in combination of according to the invention (dashed line).
  • the reference control values or cut-off point for each marker in the combination were for CA 19-9, 64.61 U / ml; for CEA, 1 1 .8 ng / ml; for IGF-1, 80.7 ng / ml and for albumin 4.1 g / dL.
  • the best combination corresponds to the proposal in this invention. This that is, which comprises determining in a fluid sample isolated from a subject the levels of Carbohydrate Antigen 19-9, Carcinoembryonic Antigen, Type 1 insulin growth Factor and Albumin.
  • the high specificity and sensitivity achieved with this combination is a great advantage in the differentiation of patients with PDAC from patients with CP.
  • this combination of biomarkers has the advantage that it can be easily measured in clinical laboratories using autoanalyzers that are already available in the clinical routine, so its clinical implementation is easy and allows a better diagnosis of PDAC. With this, the therapy to be applied in each case can be chosen more quickly without delays due to misdiagnosis and without embezzlement by the health authorities when applying unnecessary treatments in case of patients with CP instead of PDAC.
  • biomarkers biological markers, in this case protein and carbohydrates
  • PDAC pancreatic cancer
  • a generalized linear model (GLM) with binomial response was estimated by programming it free of R statistics, using data from the patient cohort, and whose predictive variables were the concentrations of CA 19-9, CEA, IGF-1 and of albumin. The estimate allowed us to build a formula that made it possible to classify patients with cancer and without cancer, with a sensitivity of 97.9% and a specificity of 95%.
  • the cut-off points or reference control values for each marker are: CA 19-9 64.61 U / ml; CEA 1 1 .8 ng / ml, IGF-1 80.7 ng / ml; and 4.1 g / dl of albumin.
  • the probability of diagnosing new patients of CP or PDAC For a probability equal to or greater than 48.2% (point with maximum sensitivity and specificity) the patient will be classified as PDAC with a sensitivity of 97.9%, but if the probability is less than 48.2% the patient is classified as CP with a specificity of 95%.
  • the probability of being classified as CP or PDAC for a particular patient is calculated with their CA 19-9, CEA, IGF-1 and albumin values, using the following function or formula (I), where ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 and ⁇ 4 are parameters estimated by the GLM model:
  • Vxob (PDAC) 6 ( 0 + l CA19-9 + 2 CEA + 3 IGFl + / i Albu min)
  • the panel of CA 19-9, CEA, IGF-1 and albumin was validated in an independent cohort consisting of 20 patients with PDAC and 13 patients with CP (data for these patients are shown in Table 4).
  • Each validation sample was diagnosed as cancer or CP using the function (I) described above. With this model, 19 of the 20 patients with PDAC and 12 of the 13 patients with CP were classified
  • TNM Tumor-Node-Metastasis
  • UICC International Union against Cancer
  • Table 4 Clinical and pathological characteristics of the validation cohort.
  • the new combination of albumin, CEA, CA19-9 and IGF-1 proposed allows to obtain optimal values of sensitivity, specificity, area under curve (AUC), positive predictive value (PPV) and negative ( NPV), not obtainable with other combinations proposed for this same type of cancer.
  • the invention further supposes the additional advantage of providing a method that uses only markers (molecules) already commonly used in the clinic, in order to give a significant value that allows the physician to diagnose other diseases. This correct discrimination is maintained even when the values of the different markers separately give opposite diagnoses. For example, if CEA levels indicate the presence of PDAC and, on the other hand, IGF-1 levels indicate otherwise, the combination described allows for the correct diagnosis and therefore, more accurate.
  • celiac trunk or superior mesenteric artery celiac trunk or superior mesenteric artery.
  • T4 Tumor that affects the celiac trunk or superior mesenteric artery T4 Tumor that affects the celiac trunk or superior mesenteric artery.
  • pancreatic adenocarcinoma Classification of pancreatic adenocarcinoma based on regional lymph node involvement
  • PDAC pancreatic cancer
  • CP chronic pancreatitis
  • the four serum markers of the patients were also analyzed (CA19.9, CEA, IGF-1 and albumin). To do this, the same procedures for sample extraction by venipuncture and serum analysis of the markers were followed, as indicated for the rest of the trials. That is, using the same reagents and automatic systems and statistical calculations. Repeating the scheme of Test 2, to evaluate the performance of the combination of the serum levels of the different biomarkers, the statistical package R was used (program it free of statistics R).
  • FIG. 3 shows the ROC curve for PDAC discrimination of CP using the levels of the two markers (CA19-9 and albumin) in
  • the reference control values or cut-off point for each marker in the combination were for CA 19-9, 2.9 U / ml; and for albumin 3.9 g / dL.
  • a generalized linear model was also estimated ( GLM) with binomial response by programming it free of R statistics, using the data from the patient cohort, and which had as predictive variables the
  • the cut-off points or reference control values for each marker are: CA 19-9, 2.9 U / ml; and 3.9 g / dl of albumin.

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Abstract

La invención se refiere a un método para el diagnósticodiferencialin vitro de cáncer de páncreas sensible y específico y que comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto los niveles de Antígeno carbohidrato 19-9, Antígeno carcinoembrionario, Factor de crecimiento insulínico tipo 1 y Albúmina. La invención se refiere en particular a un método altamente sensible y especifico que permite distinguir muestras de pacientes con cáncer de páncreas, de muestras de pacientes con pancreatitis crónica. También se refiere a kits para llevar a cabo dichos métodos dediagnóstico.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de diagnóstico de cáncer de páncreas
La presente invención está relacionada con la medicina, y particularmente con el diagnóstico del cáncer. Específicamente se refiere a un método de
diagnóstico de cáncer de páncreas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Todavía no hay un marcador biológico fiable para la detección y el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas y en concreto del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Se emplean técnicas de imagen para el diagnóstico y la clasificación del grado o desarrollo de la enfermedad. Aunque también se emplea el Antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9), este se recomienda más para el seguimiento de PDAC que para su diagnóstico. Uno de los principales problemas clínicos del cáncer de páncreas radica, precisamente, en distinguir esta enfermedad maligna de otras enfermedades pancreáticas benignas, tales como la pancreatitis crónica (CP).
El PDAC es la cuarta causa de mortalidad relacionada con cáncer en los EEUU. Los datos muestran además que este tipo de cáncer es el que menos ha mejorado en términos de supervivencia respecto de otros tipos de cáncer. El mal pronóstico de PDAC se debe principalmente a la etapa avanzada de la enfermedad en el momento del diagnóstico y a la naturaleza agresiva del tumor, que no suele responder a las terapias disponibles. El tratamiento más efectivo a fecha de hoy es la cirugía extractiva (resección), pero pocos son los candidatos (20 %) que puede beneficiarse de ello, porque generalmente cuando se detecta el cáncer ya es demasiado tarde incluso para abordarlo de esta manera.
Aunque la técnicas endoscópicas y de imagen son cada vez más precisas, no suelen ser útiles para el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas. Además, los marcadores tumorales no son lo suficientemente específicos para distinguir entre formas benignas y malignas, en particular y como se decía antes, resulta especialmente difícil distinguir el cáncer de la pancreatitis crónica. Ello se debe a que varios tipos de CP son muy parecidas clínica y morfológicamente a PDAC en particular. Ello hace que se detecten bastantes falsos positivos por imagen o mediante marcadores tumorales en muestras de los pacientes.
Dos de los marcadores más estudiados en el diagnóstico de cáncer de páncreas y en particular de PDAC han sido el Antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9) antes mencionado y el Antígeno carcinoembrionario (CEA). También se emplean los niveles de otras proteínas séricas solas o en combinación con CA19-9 y CEA. Actualmente el CA19-9 se propone como el marcador más ampliamente utilizado, pero como se comenta a continuación presenta serias limitaciones, que lo hacen poco útil para el diagnóstico precoz, y sólo útil para el seguimiento. La medición de CA19-9 de manera aislada permite obtener sensibilidades del 70-90% y especificidades de 68-91 %. Sin embargo, el hecho de que CA19-9 se encuentre elevado en enfermedades no malignas reduce su especificidad. Por ello, se persiguen combinaciones de marcadores que alcancen una mayor sensibilidad y especificidad.
Ejemplos de estas combinaciones se desprenden, por ejemplo, del documento de tesis doctoral titulado "Moléculas séricas relacionadas con la fisiopatología del adenocarcinoma pancreático como posibles marcadores tumorales" defendido por María José Ferri Iglesias (Fecha de defensa: 27-09-2012) y dirigida por Rosa Peracaula Miro y Rosa Núria Aleixandre Cerarols. En este documento se describen algunas combinaciones de marcadores séricos para diagnosticar de manera diferencial PDAC de CP. Algunas de las
combinaciones de marcadores propuestos incluyen la combinación de la medición de los niveles séricos de CEA, CA19-9 y de factor de crecimiento insulínico de tipo 1 (IGF-1 ). Precisamente con esta combinación se obtienen valores de sensibilidad y especificidad del 88% y 100%, respectivamente, como discriminatorios de las dos enfermedades.
Otra combinación de marcadores se desprende también del documento de Chung et al, "Clinical significance of serum levéis of immune-associated molecules, uric acid and soluble MHC class I chain-related molecules A and B, as diagnostic tumor markers for pancreatic ductal adenocarcinoma", Cáncer Science - 201 1 , Vol. NO. 102(9), pp.: 1673-9. En este documento se describe el uso de la combinación de los marcadores séricos ácido úrico, CA19-9, y las moléculas A y B relacionadas con la cadena I del complejo principal de histocompatibilidad (denominadas MICA y MICB, respectivamente), para diagnosticar diferencialmente PDAC frente a enfermedades no malignas de páncreas, entre las que se incluye CP. Se obtienen valores de sensibilidad y especificidad para la discriminación de ambas enfermedades del 94,2% y 93,3%, respectivamente. Aunque los valores de sensibilidad y especificidad son muy buenos, esta combinación conlleva el inconveniente que los marcadores MICA y MICB no son empleados de manera rutinaria en laboratorios clínicos.
De todo ello se desprende la necesidad de nuevos marcadores, combinaciones o parámetros que permitan diagnosticar el cáncer de páncreas, en particular el PDAC y distinguirlo de otras enfermedades de páncreas con gran especificidad y sensibilidad.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado combinaciones de marcadores, que permiten diagnosticar con gran sensibilidad el cáncer de páncreas a partir de la muestra aislada de un sujeto. Los marcadores se corresponden con moléculas analizadas en la rutina clínica. Estas combinaciones proporcionan además una especificidad elevada permitiendo diagnosticar de manera diferencial el cáncer de páncreas (en particular PDAC) de otras enfermedades benignas de páncreas, tal como la pancreatitis crónica. Suponiendo la combinación de marcadores ya de por sí una ventaja, los inventores proponen también un método de diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y de pancreatitis crónica (u otras enfermedades benignas de páncreas) de fácil implementación en clínica. Ello se deriva del hecho que se propone un método de diagnóstico en el que los valores de los distintos marcadores se introducen en una función para obtenerse un valor test. Este valor test se compara con un valor discriminatorio o control de referencia que permite clasificar los pacientes como sujetos con cáncer de páncreas o con enfermedades benignas de páncreas, más concretamente pacientes con PDAC o con CP.
Así, de acuerdo con un primer aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer de páncreas, caracterizado porque comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto al menos los siguientes marcadores: - Antígeno carbohidrato 19-9 (CA19.9);
- Albúmina; donde,
- si la concentración de Antígeno carbohidrato 19-9 es superior a un valor control de referencia y la concentración de Albúmina es inferior a un valores control de referencia, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y
- si las concentración de Antígeno carbohidrato 19-9 es inferior al valor control de referencia; y/o la concentración de Albúmina es superior al valor control de referencia, dichas concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan en una función para obtener un valor test que se compara con un valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.
Con el análisis conjunto simultáneo o secuencial de estos dos marcadores se obtienen, como podrá verse en los ejemplos, valores óptimos de sensibilidad y especificidad. Además, el análisis estadístico confirma valores predictivos positivos y negativos elevados y también valores del área bajo la curva (AUC) en una curva ROC (acrónimo de Receiver Operating Characteristic, o
Característica Operativa del Receptor) con valores próximos a 1 .
En una realización particular, cuando se miden al menos estos dos compuestos (CA19-9 y albúmina) en la muestra del sujeto, el método está caracterizado porque el valor control de referencia de antígeno carbohidrato 19-9 es 2.9 U/ml; y el valor control de referencia de albúmina es 3.9 g/dl. Estos valores son en particular aplicables a una muestra fluida del tipo suero aislado del sujeto.
Así, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer de páncreas, caracterizado porque comprende determinar al menos los niveles de CA19-9 y albúmina; y opcionalmente calcular un valor test introduciendo los niveles detectados en la muestra aislada de un sujeto, en una función matemática. Además, con solo los niveles de estas dos moléculas o marcadores ya se pueden diferenciar los pacientes o sujetos que padecen cáncer de páncreas de aquellos que padecen una pancreatitis crónica.
En otra realización particular del método y dado que también se obtienen valores de sensibilidad y de especificidad elevados, el método
para el diagnóstico de cáncer de páncreas, está caracterizado porque comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto la
concentración de los siguientes marcadores:
- Antígeno carbohidrato 19-9;
- Antígeno carcinoembrionario;
- Factor de crecimiento insulínico tipo 1 ;
- Albúmina;
donde,
- si las concentraciones de antígeno CA 19-9 y CEA son superiores a respectivos valores control de referencia y las concentraciones de IGF-1 y de albúmina son inferiores a respectivos valores control de referencia, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y
- si las concentraciones de antígeno CA 19-9 y/o CEA son inferiores a los valores control de referencia; y/o si las concentraciones de IGF-1 y/o de albúmina son superiores a respectivos valores control de referencia, dichas concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan en una función para obtener un valor test que se compara con un valor de
discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.
Existen diversas isoformas de albúmina humana, tomándose como consenso la isoforma 1 con número de acceso en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot P02768, versión 2 de la secuencia de 1 de abril de 1990 (datos públicos consultables en la versión 219 de entrada en base de datos). La forma sérica de la proteína tiene 585 aminoácidos.
El IGF-1 humano se corresponde con el número de acceso en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot P05019, versión 1 de la secuencia de 13 de agosto de 1987 (datos públicos consultables en la versión 185 de entrada en base de datos). La secuencia polipeptídica en suero comprende 70 aminoácidos. El CEA (antígeno carcinoembrionario) humano es una glicoproteína que se produce durante el desarrollo fetal y usualmente no es detectable en la sangre de las personas sanas adultas. CEA pertenece a la superfamilia de
inmunoglobulinas. En la presente invención se detectan de manera indistinta cualquiera de sus isoformas o grupo de isoformas expresadas en humanos. La mayoría de tests comerciales para su detección van dirigidos a la secuencia con número de acceso en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot P06731 , versión 3 de la secuencia de 1 1 de enero de 201 1 (datos públicos consultables en la versión 157 de entrada en base de datos). La secunda polipeptídica en suero tiene 651 aminoácidos y es conocida también como molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5
(CEACAM5).
Finalmente, el CA 19-9 se corresponde con el determinante carbohidrato definido como lacto-N-fucopentosa (II) sialilado, que fue detectado como banda única por el anticuerpo monoclonal de ratón CA 19-9, producido de un hibridoma derivado de células del bazo de un ratón inmunizado con la línea celular humana de cáncer colorectal SW1 1 16 (Leibovitz et al., "Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines", Cáncer Res- 1976, vol. No. 36, pp.: 4562-4569).
Con el análisis conjunto simultáneo o secuencial de estos cuatro marcadores se obtienen, como podrá verse en los ejemplos, valores óptimos de sensibilidad y especificidad. Además, el análisis estadístico confirma valores predictivos positivos y negativos elevados y también valores del área bajo la curva (AUC) en una curva ROC (acrónimo de Receiver Operating Characteristic, o
Característica Operativa del Receptor) con valores próximos a 1 . Ello quiere decir que la probabilidad de escoger al azar un valor positivo (enfermo de cáncer) es mayor que la probabilidad de obtener un valor negativo (enfermo con pancreatitis u otra enfermedad benigna de páncreas). Dicho de otra forma, la probabilidad de que el diagnóstico realizado a un paciente con cáncer de páncreas sea correcto es mayor que el que se realizaría a una persona sana o con enfermedad benigna escogida al azar. La sensibilidad es el concepto que indica que el método es capaz de detectar los pacientes con cáncer de páncreas a pesar de mínimos cambios en los niveles de los marcadores respecto de un control sano o con otra enfermedad. La especificidad es el concepto que nos indica que de manera inequívoca clasificamos bien entre una cohorte de pacientes, aquellos que tienen cáncer de páncreas de aquellos que no.
Si bien los niveles de CA19-9 se vienen utilizando de manera independiente para el seguimiento de cáncer de páncreas, en esta invención se propone su uso combinado con la adición de los niveles de albúmina, o bien con la adición de los niveles de CEA, IGF-1 y de albúmina.
La albúmina, en combinación con los niveles séricos de proteína C reactiva (CRP), se ha asociado también a la prognosis de pacientes previamente diagnosticados con cáncer de páncreas. La respuesta de las proteínas inflamatorias de fase aguda supone un marcador independiente de prognosis en este tipo de cáncer una vez diagnosticado por otras vías (Falconer et al., "Acute-Phase Protein Response and Survival Duration of Patients with
Pancreatic Cáncer", Cáncer - 1995, Vol. No. 75(8), pp.:2077-2082).
Como se ha indicado antes, los niveles de IGF-1 se han descrito en
combinación con CEA y CA19-9 como posibles marcadores diagnósticos del cáncer de páncreas. Sin embargo, su sensibilidad es menor a la deseada, con lo que podrían darse bastantes falsos negativos respecto de pacientes con enfermedades benignas de páncreas y, en particular, con CP.
En una realización particular, cuando se contempla en el método determinar las concentraciones de las cuatro moléculas, el método se caracteriza porque el valor control de referencia de CA 19-9 es 64.61 Unidades por mililitro (U/ml); el valor control de referencia de CEA es 1 1 .8 nanogramos por mililitro (ng/ml), el valor control de referencia de IGF-1 es 80.7 nanogramos por mililitro (ng/ml); y el valor control de referencia de albúmina es 4.1 gramos por decilitro (g/dl). Estos valores son en particular aplicables a una muestra fluida del tipo suero aislado del sujeto.
En el método de la presente invención, los valores control de referencia de CA 19-9 y de albúmina varían en función de si se van a determinar o considerar solo las concentraciones de estas dos moléculas o bien si van a tenerse también en consideración las concentraciones de CEA y de IGF-1 en la muestra aislada del paciente. Ello quiere decir que estos valores pueden ajustarse con la finalidad de no comprometer la sensibildad y especificidad del método, en cualquiera de sus realizaciones, pero adaptándose por ejemplo al tipo de muestra, o de población, si fuera necesario y según comprenderá el experto en la materia.
Como se ha indicado antes, el método de acuerdo con la invención puede implementarse a la práctica clínica no solo porque en él se emplean
concentraciones de marcadores (o lo que es lo mismo concentraciones de moléculas o compuestos) habitualmente analizados en la rutina clínica para el diagnóstico de cánceres u otras patologías, sino también porque los inventores proponen un análisis de las concentraciones de estas dos o cuatro moléculas combinando los valores obtenidos para cada una de ellas, de tal modo que se obtiene un valor test. Dicho valor test se compara con un valor de referencia que discrimina entre enfermos de cáncer de páncreas y sujetos con
enfermedades benignas de páncreas.
Para ello, en una realización particular del método según la invención, si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas, además comprende combinar las concentraciones de CA 19-9 y de albúmina; o de CA 19-9, de CEA, de IGF- 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto en una función, para obtener el valor test que se compara con el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas. Esta realización particular permite verificar que, efectivamente, el sujeto padece cáncer a pesar de que ya se reflejaba en las concentraciones de los marcadores que estaban por encima (CEA, CA19-9) y por debajo (IGF-1 , albúmina) de los respectivos valores control de referencia.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con cualquier aspecto o realizaciones comentadas anteriormente o a continuación, este valor test se obtiene de la siguiente fórmula (I), si se emplean los niveles de las cuatro moléculas:
Figure imgf000009_0001
Vxob(PDAC) = 0 + β Α19-9+ p2CEA + p3IGFl+ PtA!bu min)
(i) donde:
Prob(PDAC) se refiere a un valor de probabilidad, expresado en porcentaje, de clasificar un sujeto como cáncer de páncreas o enfermedades benignas de páncreas;
βθ es 16,000764;
β1 es 0,099556;
β2 es 0,342634;
β3 es 0,004923;
β4 es -5,200419;
CA19-9 es la concentración en U/ml de antígeno carbohidrato 19-9 de la muestra aislada del sujeto; CEA es la concentración en ng/ml de antígeno carcinoembrionario de la muestra aislada del sujeto; IGF1 es la concentración en ng/ml de factor de crecimiento insulínico tipo 1 de la muestra aislada del sujeto; y Album in es la concentración de albúmina en g/dl de la muestra aislada del sujeto.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con cualquier aspecto o realizaciones comentadas anteriormente o a continuación, si lo que se emplea para obtener el valor test son solo los niveles de CA19-9 y de albúmina, la fórmula utilizada es la siguiente fórmula (II): e (A) +PlCA19-9+p2Albu min)
Pr ob ( Pancreatic— cáncer / ) = τ-Ω— α„Λ Λ η » Q — rx
V -i (β0+ iCA\9-9+ iAlbu m)
(II)
donde:
Prob(Pancreatic_cancer) se refiere también a un valor de probabilidad, expresado en porcentaje, de clasificar un sujeto de padecer cáncer de páncreas o enfermedades benignas de páncreas;
βθ es 13,013;
β1 es 0,035;
β2 es -3,539; CA19-9 es la concentración en unidades por mililitro (U/ml) de antígeno carbohidrato 19-9 de la muestra aislada del sujeto; y Albumin es la
concentración de albúmina en g/dl de la muestra aislada del sujeto.
Así, si el método se lleva a cabo mediante la introducción de las
concentraciones de los cuatro marcadores en la función de fórmula (I), o de dos marcadores en la fórmula (II), si el valor test es igual o superior al valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y si el valor test es inferior al valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas, el sujeto es diagnosticado de enfermedad benigna de páncreas.
Este valor de discriminación es un porcentaje de probabilidad, que se obtiene, en una realización particular, a partir del punto de máxima sensibilidad y especificidad, calculadas por el modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial a partir de los valores (concentraciones) de los cuatro o los dos marcadores de una cohorte de referencia que comprende sujetos con cáncer de páncreas y con enfermedades benignas de páncreas. En una realización más particular todavía, el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas es del 48.2 % cuando se emplean en la fórmula los cuatro marcadores (concentraciones de las cuatro moléculas); y del 33.5 % cuando se emplean solo los niveles de CA19-9 y de albúmina de acuerdo con la fórmula (II).
El modelo GLM permite clasificar sujetos con cáncer de páncreas con una determinada sensibilidad (del 97.9 % con los cuatro marcadores y del 96.4 % con los dos) y una determinada especificidad (del 95 % con los cuatro marcadores y del 90.9 % con los dos). El valor de discriminación óptimo es aquel en que los valores de sensibilidad y especificidad son máximos. Este valor, que se corresponde con una probabilidad expresada en porcentaje (%), es el que se emplea para la clasificación de los sujetos. A partir de los valores de los cuatro marcadores en una muestra de un sujeto test (no previamente clasificado) y aplicando el mismo modelo, si la probabilidad es mayor o igual que la del valor discriminatorio, los sujetos se clasifican como cáncer de páncreas. Si el valor es inferior al discriminatorio, los sujetos se clasifican como enfermedad benigna de páncreas, tal como CP. Lo mismo aplica si solo se dispone de al menos los niveles de CA19-9 y de albúmina, o bien si solo quieren emplearse estos niveles para hacer el diagnóstico. Con la presente invención se aporta un método de diagnóstico que aún determinándose los niveles de CA19-9, albúmina, IGF-1 y CEA, da la opción al responsable de emitir un diagnóstico de escoger entre utilizar solo los niveles de CA19-9 y albúmina, o los niveles de todos cuatro juntos, sin pérdida de sensibilidad y especificidad notorias.
Así, según el método de la invención, si en un sujeto (paciente) todas las concentraciones de los marcadores están fuera de los valores control de referencia (por encima para CEA y CA 19-9 y por debajo para IGF-1 y albúmina) la probabilidad de padecer un cáncer de páncreas estará por encima del 48.2 % y el paciente tendrá cáncer con una sensibilidad del 97.9 % y una especificidad del 95 %. Del mismo modo y también según el método de la invención, pero cuando solo se determinan o utilizan los niveles de albúmina y CA19-9, si en un sujeto (paciente) todas las concentraciones de estas moléculas están fuera de los valores control de referencia (por encima para CA 19-9 y por debajo para albúmina) la probabilidad de padecer un cáncer de páncreas estará por encima del 33.5 % y el paciente tendrá cáncer con una sensibilidad del 96.4 % y una especificidad del 90.9 %.
Por otro lado, si alguno de los cuatro, o de los dos tratándose solo de CA19-9 y albúmiba, o ninguno de los marcadores está fuera de los valores control de referencia, resulta apropiado introducir las concentraciones de CA 19-9, de CEA, de IGF-1 y de albúmina detectadas en la muestra aislada del sujeto en una de las funciones de fórmula (I) o (II), para obtener un valor test que se compara con un valor de discriminación entre cáncer de páncreas y
enfermedades benignas de páncreas. Estas funciones permiten calcular la probabilidad de padecer cáncer de páncreas, de tal modo que, si la
probabilidad calculada es menor del 48.2 % (en el caso de la fórmula (I)) el sujeto probablemente no padece de cáncer de páncreas. Mientras que, si la probabilidad calculada con la fórmula (I) es igual o superior a 48.2 %, el sujeto muy probablemente padece de cáncer de páncreas, tomándose en
consideración los datos de sensibilidad y especificidad inherentes en este cálculo mediante la fórmula (I). Paralelamente, si se emplea la fórmula (II), si la probabilidad calculada es menor del 33.5 % el sujeto probablemente no padece de cáncer de páncreas. Mientras que, si la probabilidad calculada con la fórmula (II) es igual o superior a 33.5 %, el sujeto muy probablemente padece de cáncer de páncreas, tomándose en consideración los datos de sensibilidad y especificidad inherentes en este cálculo mediante la fórmula (II).
En una realización particular del método según la invención, el cáncer de páncreas es adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC).
En otra realización particular del método, la enfermedad benigna de páncreas es pancreatitis crónica.
Aunque el método según este primer aspecto es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas respecto de enfermedades benignas de este órgano, en una realización particular es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica. Así, el uso combinado de las concentraciones de estos cuatro marcadores (moléculas) permite diagnosticar con gran sensibilidad y especificidad el cáncer de páncreas, respecto de un sujeto con pancreatitis crónica, enfermedad que en numerosas ocasiones se confunde con el cáncer. Por ello, en una realización particular el método se caracteriza porque es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica. Más en particular para el diagnóstico diferencial de adenocarcinoma pancreático ductal y pancreatitis crónica.
Para la puesta en práctica del método según la invención, la muestra fluida aislada del sujeto se selecciona del grupo constituido por sangre completa, suero y plasma. De un modo preferido la muestra aislada es suero.
Precisamente, una de las ventajas del método de la invención es que los niveles de estos marcadores pueden determinarse fácilmente a partir de una muestra de suero del paciente y mediante el empleo de reactivos habituales en clínica tal como anticuerpos comerciales y reactivos colorimétricos, y
quimioluminiscentes. Con ello, se evita tener que obtener biopsias de tejidos que son invasivas y además no siempre se escogen zonas representativas del tejido en cuestión. En una realización particular, la determinación (o detección) de las
concentraciones de CA 19-9, de CEA, de IGF-1 y de albúmina se lleva a cabo usando un grupo de unión específico para cada uno de los marcadores. En una realización particular, el grupo de unión específico para la determinación de la concentración de CA 19-9, de CEA, y de IGF-1 es un anticuerpo y la
determinación se lleva a cabo mediante inmunoensayo. En una realización particular y en función del elemento o técnica que se emplea para visualizar la interacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), dicho inmunoensayo se selecciona de radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoensayo (ELISA), fluoroinmunoanálisis (FPIA), ¡nmunoquimioluminescente.
En otra reacción particular del método según el primer aspecto de la invención, el grupo de unión específico para la determinación de albúmina es un compuesto colorante aniónico y la determinación se lleva a cabo mediante un ensayo colorimétrico. En estas reacciones colorimétricas, el colorante específico forma un complejo con la molécula a detectar (en este caso la albúmina), y el complejo posee un espectro de absorbancia característico que se utiliza para su cuantificación. En una realización particular, el compuesto colorante aniónico es verde de bromocresol, que forma un complejo verde azulado con albúmina. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de albúmina. Evidentemente, otros compuestos colorantes en los que se mantenga esta propiedad que la coloración aparecida en el complejo sea proporcional a la cantidad de albúmina, pueden emplearse en el método según la invención.
Algunos de estos inmunoensayos y/o ensayos colorimétricos tienen la ventaja de que pueden llevarse a cabo en biosensores de pequeño tamaño y fácil uso que no necesitan estar ubicados en un laboratorio, ni requieren de personal especializado en química analítica. Así, el procedimiento de la invención podría ser llevado a cabo de forma rápida en el punto de asistencia, por ejemplo, se puede llevar a cabo por los asistentes sanitarios en la misma unidad
ambulatoria. Ejemplos no limitativos de biosensores de detección rápida adecuados para llevar a cabo el método de la invención son una tira
inmunocromatográfica (también conocido por "dipstick") o una tarjeta lab-on-a- chip con circuito de microfluídica e immunodetección o detección de la interacción con una segunda molécula. Otro aspecto de acuerdo con la invención se refiere, en un segundo aspecto, a un método para decidir o recomendar un régimen médico para cáncer de páncreas, dicho régimen médico seleccionado de entre tratamiento
farmacológico e intervención quirúrgica, que comprende llevar a cabo el método de diagnóstico según cualquiera de las realizaciones descritas más arriba; y donde, si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas se recomienda o decide el régimen médico indicado para el cáncer de páncreas, y si el sujeto no es diagnosticado de cáncer de páncreas pero es diagnosticado de una enfermedad benigna de páncreas, se recomienda o decide el régimen médico para esta otra enfermedad.
La invención se refiere entonces, según otro aspecto de la invención, al uso combinado de las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina; o de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina como marcador de cáncer de páncreas. Más particularmente como combinación de marcadores de adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC).
En una realización particular, estas combinaciones binaria o cuaternaria de marcadores son para uso en el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica.
En la práctica, el método según la invención se lleva a cabo en kits que comprenden medios para determinar niveles (concentraciones) de proteínas y carbohidratos en una muestra aislada de un sujeto, dichos kits caracterizados porque los medios que comprenden son grupos de unión específicos de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina; y opcionalmente también de antígeno carcinoembrionario y factor de crecimiento insulínico tipo 1 . Además, en una realización particular, los kits están caracterizados porque comprenden medios para calcular un valor test que se obtiene de la combinación de los niveles de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina y/o de la combinación de los niveles de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra asilada en una función matemática. Este valor test se compara con un valor de
discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedad benigna de páncreas. Los kits comprenden en una realización particular un chip o dispositivo electrónico programable, que calcula el valor de las concentraciones de cada uno de los marcadores y opcionalmente los introduce en la función de fórmula (I) o en la función de fórmula (II) para calcular un valor de probabilidad
"Prob(PDAC)" o "Prob(Pancreatic_Cancer)", que se corresponde con el valor denominado aquí valor test.
Los medios empleados para la detección de las concentraciones de los dos (CA19-9 y albúmina) o cuatro marcadores (CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina) forman parte de un kit en una realización particular, pero también pueden formar parte de kits separados. La invención tiene también por objeto el uso de dichos medios para llevar a cabo el método de diagnóstico de cáncer de páncreas y, más en particular, el método de diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica u otras enfermedades benignas de páncreas.
El método según la invención comprende en una realización particular la etapa de recopilar y/o suministrar y/o salvar los datos de las etapas anteriores en un portador de datos. Por tanto, la invención también comprende cualquier portador de datos con los datos del diagnóstico directamente obtenidos a partir del método de diagnóstico de cáncer de páncreas de la invención.
En el sentido de la presente invención, un "portador de datos" debe entenderse como cualquier medio que comprenda información significativa para el diagnóstico de cáncer de páncreas. En particular información significativa de diagnóstico diferencial de PDAC y CP. Ejemplos de portadores de datos incluyen papel impreso con los niveles en suero de un paciente de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina, dichos niveles determinados de acuerdo con el método de la invención y correlacionados con el diagnóstico de la enfermedad. El portador de datos puede también ser cualquier entidad o dispositivo capaz de contener esta información diagnóstica. Por ejemplo, memorias electrónicas, tal como una ROM, tipo CD ROM o un semiconductor ROM, o un medio de grabado magnético, tal como un disco flexible o un disco duro. Además, el portador de datos puede ser transmisible tal como una señal eléctrica u óptica, la cual puede ser transmitida por cable óptico o eléctrico, por radio frecuencia u otros medios. Cuando los datos diagnósticos son incorporados en una señal que puede transmitirse directamente por cable u otros medios, el portador puede ser este cable mismo. Otros tipos de portadores de datos son
dispositivos USB y archivos de ordenador.
El término "diagnóstico" es bien conocido en el estado de la técnica y se refiere al procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad.
El término "muestra" se refiere a un fluido corporal del paciente (sujeto) obtenido con el propósito de llevar a cabo el diagnóstico in vitro del cáncer de páncreas, o para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica. El sujeto es un mamífero y preferentemente un humano.
Por "marcador" o "biomarcador" debe entenderse cualquier molécula (en este caso concreto proteína o carbohidrato) que se detecta en una muestra aislada de un paciente y puede ser asociada a una señal dada. En el caso de esta invención, los marcadores son antígenos carbohidratos (CA 19-9) o proteínas, que a partir de unos valores de referencia pueden asociarse a cáncer de páncreas.
Se entiende por "valor control de referencia" un valor con el cual se compara la cantidad (concentración) de cada una de las moléculas CA 19-9, CEA, albúmina e IGF-1 , determinada según la invención para el diagnóstico del cáncer de páncreas. Se trata de un valor de cada uno de los marcadores que permite distinguir con un grado de probabilidad un sujeto con cáncer de páncreas del resto de individuos que no sufren este cáncer, incluyendo entre estos individuos, individuos sanos e individuos que padecen enfermedades benignas de páncreas, tal como la pancreatitis crónica. El valor de referencia es un valor, también denominado punto de corte o valor umbral, que permite descartar con una elevada sensibilidad que el paciente diagnosticado sufre cáncer de páncreas y en particular adenocarcinoma pancreático ductal. Este valor umbral representa una concentración de cada uno de los marcadores por encima o por debajo del cual, en función de cada caso, se asocia la muestra del sujeto con la enfermedad o no. Por ello, cuando se indica en la presente invención que la concentración de uno de los marcadores está "fuera del valor control de referencia" se hace referencia a que se superan por encima los valores asociados con mayor probabilidad a no enfermedad (no cáncer de páncreas), o bien a que no se llega a los niveles mínimos asociados con mayor probabilidad a no enfermedad (no cáncer de páncreas).
El valor de referencia dependerá de varios factores, entre los que destacan el tipo de muestra en la que se determine el marcador, el plazo de tiempo en el cual se lleve a cabo dicha determinación y, en menor medida, la técnica de determinación empleada. Esto es debido a que los niveles de los marcadores pueden variar en los diferentes fluidos del paciente, en función del tiempo trascurrido desde el inicio de la enfermedad, y en función de la técnica de determinación empleada, o incluso en función del algoritmo empleado donde se incluyen los valores detectados en una muestra test para obtener un valor derivado que da información al técnico (por ejemplo un valor de probabilidad o de corte para clasificar a los pacientes). Todo ello es bien conocido por el experto en la materia que sabe adecuar los valores a cada cómputo de circunstancias (tipo de muestra, tiempo de medición, tecnología, etc.). El valor de referencia además puede variar debido a la regulación de la práctica clínica, de tal modo que niveles que no se consideraban como patológicos en un determinado momento, pasen a serlo por decisión de las autondades sanitarias y con el objetivo de mejorar el cribado de ciertas enfermedades. Una posible forma de establecer el valor de referencia para el método de la invención en unas condiciones dadas es a partir de los puntos de corte de la curva ROC para el marcador o combinación de marcadores en esas condiciones. Una curva ROC (acrónimo del inglés Receiver Operating Characteristic, o
Característica Operativa del Receptor) es una representación gráfica de la sensibilidad frente a (1 - especificidad) para un sistema clasificador binario según se varía el umbral de discriminación. El umbral de discriminación equivale al valor de referencia del método de la invención.
El término "concentración", "nivel" o "niveles" (empleados como sinónimos) se refieren a la cantidad de cada uno de los marcadores CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina en una muestra obtenida de un sujeto. Generalmente esta cantidad se da por unidad de volumen y por ello se habla de concentraciones. Por "grupo de unión" se entiende una molécula o segmento de molécula capaz de unirse específicamente a una molécula o proteína diana (en el presente caso la molécula o proteína diana puede ser CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina).
Se entiende por "biosensor" un instrumento para la medición de parámetros biológicos o químicos. En la presente invención el parámetro a medir es cualquiera de las moléculas CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina.
Según la invención, "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo completo, incluyendo sin limitación un anticuerpo quimérico, recombinante, transgénico, humanizado, injertado y de una única cadena, y similares, así como cualquier proteína de fusión, sus conjugados, sus fragmentos, o sus derivados que contengan uno o más dominios que se unen selectivamente a la proteína diana o péptido. Cuando se utilizan anticuerpos completos para la presente
invención, se prefieren anticuerpos monoclonales.
Por "inmunoensayo" se entiende una técnica inmunoquímica donde se emplean complejos inmunes, es decir, los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito determinado, que puede ser el anticuerpo o el antígeno, usando para la medición una molécula como marcador que forma parte de la reacción con el complejo inmune.
El inmunoensayo es un conjunto de técnicas inmunoquímicas analíticas de laboratorio que tienen en común el usar complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis) determinado, que puede ser el anticuerpo (Ac) o un antígeno (Ag), usando para la medición una molécula como marcador que hace parte de la reacción con el complejo inmune en la prueba o ensayo químico.
Las técnicas se basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antígenos específicos y se usan los anticuerpos monoclonales (obtenidos en el laboratorio) o de sueros policlonales (obtenidos de animales), siendo más específicos los monoclonales. Su gran sensibilidad y especificidad permite la cuantificación de compuestos presentes en líquidos orgánicos en concentración reducida, del orden de nanogramos/ml o de picogramos/ml. Los "ensayos colorimétricos" se refieren a técnicas analíticas, en las cuales un compuesto colorante (que da color a una determinada longitud de onda de luz) se compleja con la molécula a detectar. El complejo "compuesto colorante- molécula a detectar" posee un espectro de absorbancia característico que se utiliza para su cuantificación. Se intenta que la intensidad del color sea directamente proporcional a la concentración de la molécula a detectar.
Por "régimen médico" debe entenderse como el conjunto de acciones o actividades que incluyen terapias farmacológicas (tal como la quimioterapia) y también intervenciones quirúrgicas terapéuticas (tal como la resección del tumor), e incluso otras decisiones clínicas que el oncólogo especialista pueda tomar, tal como la hospitalización, o el consejo de ciertos hábitos sociales y dietéticos (evitar el consumo de bebidas alcohólicas).
Por "enfermedades benignas de páncreas" debe entenderse aquellas enfermedades causadas o que afectan este órgano, pero que no se
corresponden con el cáncer de páncreas. Ejemplo de enfermedades benignas incluyen la pancreatitis aguda o crónica, que es una inflamación del páncreas, y neoplasias benignas como el cistoadenoma sérico de páncreas y el neoplasma pseudopapilar sólido.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso
"consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra en cada recuadro A a E los niveles de CA19-9 (U/ml) (FIG. 1 A), los niveles de CEA (ng/ml) (FIG. 1 B), los niveles de IGF-1 (ng/ml) (FIG. 1 C), los niveles de albúmina (g/dl) (FIG. 1 D); y los niveles de CRP (mg/dl) (FIG. 1 E), para cada muestra de paciente, dichos pacientes clasificados entre sanos (HC), pacientes con pancreatitis crónica (CP ) y con adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC). Las marcas * muestran que la diferencia entre grupos era significativa.
La FIG. 2 muestra una curva ROC para la discriminación de sujetos con PDAC de sujetos con CP utilizando solo los niveles séricos de CA19-9 (línea sólida) y utilizando los niveles de los cuatro marcadores CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina en combinación de acuerdo con la invención (línea discontinua).
La FIG. 3 muestra una curva ROC para la discriminación de sujetos con PDAC de sujetos con CP, utilizando los niveles de los dos marcadores CA19-9 y albúmina en combinación, de acuerdo con la invención.
EJEMPLOS
Para el análisis de la combinación de marcadores, los siguientes materiales y métodos fueron empleados.
Pacientes y muestras de suero:
El presente estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Universitario Dr. Josep Trueta y se obtuvo un consentimiento informado firmado de todos los participantes. Se obtuvieron de 2007 a 2012 muestras de suero de 47 pacientes de PDAC (media de edad (desviación estándar) 64.1 (10.3), 59.6 % hombres), de 20 pacientes con CP (media de edad (desviación estándar) 56.3 (1 1 .5), 80.0 % hombres): y de 15 controles sanos (HC) (media de edad
(desviación estándar) 60.9 (9.2), 26.7 % hombres). La Tabla 1 siguiente muestra las características de los pacientes.
PDAC CP HC
N 47 20 15
Mediana de edad, 64.1 56.3 60.9
años (min-max) (30-81) (42-79) (44-75)
Hombres 28 16 4
Mujeres 19 4 1 1
Mediana del IMC 25.9 23.4 25.3
(min-max) (18.1-32.8) (16.7-29.7) (19.8-32)
Estadio
enfermedad
IA 0
IB 1
NA 4
IIB 22
III 8
IV 12
Una cohorte independiente de muestras se empleó para validación. Esta cohorte comprendía 20 pacientes con PDAC (media de edad (desviación estándar) 67.2 (10.4), 45.0 % hombres) y 13 pacientes con CP (media de edad (desviación estándar) 50.9 (9.55), 76.9 % hombres). Las muestras de suero de los pacientes de cáncer se tomaron por venopunción antes de la intervención quirúrgica. Las muestras de suero de pacientes con CP y de los controles (HC) se obtuvieron cuando estos pacientes iban a los controles rutinarios de análisis en el laboratorio del hospital. El suero se recolectó mediante procedimientos estándares y fue almacenado a -80 °C hasta el momento de su análisis.
El diagnóstico de los pacientes con PDAC se derivó de un examen
histopatológico de especímenes procedentes de pancreaticoduodenoctomía. La diagnosis de CP se basó en tests de imágenes radiológicas, resonancia magnética (MRI), escáner de tomografía computarizada (CT) o métodos de ultrasonidos (transcutáneos o endoscópicos), así como la evolución clínica. Los pacientes diagnosticados de otras enfermedades malignas los últimos cinco años se excluyeron, igual que los pacientes con CP con brote agudo de la enfermedad.
Todos los parámetros fueron medidos en sistemas automáticos y con reactivos estandarizados empleados en la rutina clínica en laboratorios clínicos. El análisis del antígeno carbohidrato CA19-9 y de antígeno carcinoembrionario (CEA) se determinó mediante inmunoensayo "ECLIA"
electroquimioluminescente cuantitativo, preparado para ser usado con la plataforma E-170 de Roche Diagnostics. Para el ensayo de CA19-9 se emplea el anticuerpo monoclonal 1 16-NS 19-9 (Life technologies®). El ensayo de CEA se estandariza frente la referencia estándar 73/601 de la primera preparación de referencia internacional (1 st IRP) de la Organización Mundial de la Salud (WHO). Las características del diseño de los ensayos CA19-9 y CEA fueron, respectivamente: coeficiente de variación intraensayo (CV) 3.4 % y 1 .7 %, CV interensayo 3.9 % y 4.9 %, sensibilidad 0.6 U/ml y 0.2 ng/ml, y linealidad 1000 U/ml y 1000 ng/ml. El ensayo de la albúmina se realizó con un ensayo colorimétrico en un Cobas 71 1 (Roche Diagnostics) estandarizado frente la preparación de referencia BCR470/CRM470 (RPPHS-Reference Preparation for Proteins in Human Serum) del Instituto para la Referencia de Materiales y Medidas, con un CV intraensayo e interensayo de 0.8 % y 1 .1 %,
respectivamente; y una linealidad de 6 g/dl. La determinación cuantitativa de CRP se midió mediante el ensayo inmunoturbidimétrico en el Cobas 71 1. Este método se estandarizó frente la preparación de referencia del IRMM
BCR470/CRM470 (RPPHS); con un CV intraensayo y interensayo de 1 % y 1 .7 %, respectivamente, una sensibilidad de 0.1 g/dl y linealidad de 25 g/dl. IGF-1 se determinó utilizando el analizador Immulite 2000 con el ensayo de mareaje inmunométrico quimioluminescente enzimático de fase sólida, que se calibra con el WHO NIBSC 1 st IRR 87/518. El CV intraensayo e interensayo es del 3 % y 6 %, respectivamente. La sensibilidad y linealidad son 20 ng/ml y 1600 ng/ml. También se utilizó la nefelometría para la medición de la prealbúmina con un Immage 800 (Beckman), con una sensibilidad de 1 .17 mg/dl, un CV intraensayo del 4 % y una linealidad de hasta 1800 mg/dl.
El análisis estadístico se realizó con el paquete SPSS estadístico v. 15.0. Las características de los pacientes se compararon entre PDAC, CP y HC mediante el test U Mann-Whitney. Para el análisis univariante, PDAC se consideró estadio de enfermedad. El test del rango de correlación de Spearman fue aplicado para determinar la correlación entre dos variables. Se empleó el software estadístico R versión 1 .1 .49 para el análisis de ROC (receiver operating characteristics). Las curvas ROC se emplearon para describir el diseño de biomarcadores o el diseño de la combinación de biomarcadores como test diagnóstico. El área bajo la curva (AUC) se empleó para evaluar la utilidad de un determinado biomarcador como test diagnóstico y los niveles de corte o umbrales (para encontrar un valor de referencia). El modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial se estimó con el programaho libre de estadística R (DeLong ER, et al., "Compahng the áreas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach", Biomethcs-1988; 44:837-845). Las bibliotecas Epi y pROC, también en la plataforma R, se emplearon para la construcción y comparación,
respectivamente, del AUC de las distintas curvas ROC (Hills M, et al., "Follow- up with the Epi package". Spring 2009 [disponible en: http://cran.r- proiect.orq/web/packages/Epi/vignettes/FoHow-up.pdf, en Noviembre 30, 2013). La significación estadística se estableció a p<0.05.
Resultados:
En cuanto a las características clínicas de la población en estudio, las muestras de suero de 82 sujetos; 47 PDAC, 20 CP y 15 HC, fueron analizadas. La distribución histológica tipo TNM de los 47 pacientes con PDAC incluyó diferentes estadios (estadio IB n = 1 ; estadio NA n = 4; estadio IIB n = 22, estadio III n = 8; estadio IV n = 12) de acuerdo con la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC); y de éstos, 29 pacientes tuvieron tumores
resectables. El sistema TNM es un sistema ampliamente utilizado para el estadiaje de los tumores y ha sido aceptado por la "Union for International Cáncer Control (UICC)", y por el "American Joint Committee on Cáncer, AJCC". La edad, el sexo y el índice de masa corporal (IMC) de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Mientras que los grupos de PDAC y HC no mostraron diferencias significativas en la edad, el sexo y el IMC, el grupo CP tiende a estar formado por hombres con un menor IMC que los otros dos grupos. Esto podría explicarse por el hecho de que varias causas de esta enfermedad, como el abuso de alcohol, junto con la ingesta inadecuada o mala absorción de nutrientes causados por la pérdida de tejido pancreático exocrino, pueden contribuir a un IMC bajo.
Ensayo 1 : Análisis univariante de biomarcadores: marcadores tumorales (CA 19-9 y CEA), proteínas de fase aguda (albúmina y PCR) y IFG-1 en PDAC, CP y grupos de HC.
Los niveles séricos de cada molécula, CA 19-9, CEA, la albúmina, la CRP y el IGF-1 , se compararon entre PDAC, CP y grupos sanos (HC, de healthy control) y se muestran en los gráficos de dispersión. Los resultados pueden visualizarse en la FIG. 1 , donde para cada marcador se indican los niveles en las
ordenadas respecto de cada enfermedad o tipo de muestra (CP, PDAC y/o HC).
CA 19-9 y CEA sólo se midieron en pacientes con CP y en los grupos PDAC ya que el nivel de estos marcadores tumorales en HC están claramente por debajo de los valores de corte establecidos. Para evaluar su especificidad y
sensibilidad, se realizaron curvas ROC para todos ellos (datos no mostrados).
La concentración media de suero de CA 19-9 en PDAC era de 945 U / mi, significativamente mayor que en CP (15.1 U / mi) (p <0,001 ). Utilizando un punto de corte o valor control de referencia de 36.99 U / mi, se obtuvo una especificidad del 95% y una sensibilidad del 80.9%. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.862. Los niveles séricos de CEA no mostraron diferencias significativas entre los grupos CP y PDAC.
La concentración sérica media de la CRP en PDAC fue de 1 .8 mg / di, significativamente mayor que en CP (0.4 mg / di) y en HC (0.169 mg / di) (p = 0.038, p = 0.019). Utilizando un valor control de referencia (punto de corte) de 0.23 mg / di, la especificidad fue del 55 % y la sensibilidad de 76.6%. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.661. La concentración media de suero de albúmina en PDAC era 3.4 g / di significativamente menor que en CP (4.3 g / di) y en HC (4.5 g / di) (p <0.001 y p <0.001 ,
respectivamente). Utilizando un valor control de referencia (punto de corte) de 3.8 g / di, la especificidad fue del 95 % y la sensibilidad del 78,7%. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.870 Los niveles de IGF-1 en suero no mostraron diferencias entre HC y CP pero hubo diferencias significativas entre el grupo HC y el PDAC (p = 0.002) y el CP y los grupos PDAC (p < 0.001 ) .Utilizando un valor control de referencia (punto de corte) de 80.7 ng / mi, la especificidad fue del 100 % y la sensibilidad del 57.4 %. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.839.
Para determinar si los niveles significativamente bajos de IGF-1 que se encuentran en PDAC podrían estar asociados ya sea a un estado de
malnutrición o a la resistencia a la hormona del crecimiento, se midieron los niveles de prealbumina y los niveles de Hormona de crecimiento (GH) como respectivos indicadores de los dos trastornos. También su posible correlación con los niveles de IGF-1 . Para la medición de GH se usó el mismo analizador Immulite 2000 que para IGF-1 . Los niveles de prealbumina se determinaron por nefelometría con un Immage 800 (Beckman). Aunque los niveles de
prealbumina fueron inferiores en el grupo de PDAC que en el CP y los grupos de HC, la concentración sérica media de prealbumina no mostró diferencias significativas entre PDAC (media 16.5 mg / di, SD 5.6) y CP (media 19.9 mg / di, SD 4,4 ), pero hubo diferencias significativas entre CP y HC (media de 25.5 mg / di, SD 3.84) y entre PDAC y HC. Los niveles de prealbumina y de IGF - 1 mostraron una correlación positiva (r = 0.454 , p = 0.005 ) en el grupo de PDAC pero no en el grupo CP.
En cuanto a los niveles de GH, no hubo diferencias significativas en los niveles de GH entre PDAC (media 1.69 ng / mi, 2.16) y CP (media 1 .58 ng / mL, SD 1 ,71 ) o HC (media 1 .57, SD 1.81 ) grupos. No se encontró correlación entre los niveles de GH y de IGF-1 .
En la Tabla 2 se muestran la sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y el AUC de cada marcador para diferenciar PDAC de los pacientes con CP. La capacidad de los biomarcadores para discriminar PDAC de los pacientes con CP fue evaluado a partir del valor AUC. Como se muestra, no hubo ningún marcador que se comportara mejor que el CA 19-9, pero como se mencionó anteriormente, CA 19-9 no es lo
suficientemente sensible y específico para ser utilizado para el diagnóstico PDAC. Tabla 2: Parámetros diagnósticos de distintos marcadores únicos para diferenciar PDAC de CP.
Sensibilidad Especificidad
PPVa (%) NPVb (%) AUCC
(%) (%)
CA 19-9 80.9 95 97.4 67.9 0.862
CEA 83 40 76.5 50 0.561
Albúmina 78.7 95 97.4 65.5 0.869
PCR 76.6 55 80 50 0.654
IGF-1 57.4 100 100 50 0.839
aPPV, valor predictivo positivo, bNPV, valor predictivo negativo, CAUC área bajo la curva ROC.
Ensayo 2. Análisis multivariante de los niveles de biomarcadores.
Con el fin de evaluar el rendimiento de la combinación de los niveles séricos de los diferentes biomarcadores, se utilizó el paquete estadístico R (programarlo libre de estadística R). La sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y el AUC de cada combinación de biomarcadores para diferenciar PDAC de los grupos de la CP fueron evaluados. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3: Parámetros diagnósticos de distintas combinaciones de marcadores para diferenciar PDAC de CP.
Sensibilidad Especificidad PPVa NPVb
AUCC
(%) (%) (%) (%)
CA 19-9 80.9 95 97.4 67.9 0.862
CA 19-9+CEA 83 95 97.5 70.4 0.887
CA 19-9+IGF-1 83 100 100 71.4 0.946
CA 19-9+Albumin 95.7 95 97.8 90.5 0.954
CA19-9 +CRP 83 95 97.5 70.4 0.907 Sensibilidad Especificidad PPVa NPVb
AUCC
(%) (%) (%) (%)
CA 19-9+ IGF-1 +CEA 80.9 100 100 69 0.947
CA 19-9+ IGF-1 +Albumin 93.6 95 97.8 86.4 0.959
CA 19-9+IGF-
97.9 95 97.9 95 0.979 1+CEA+Albumin
CA 19-9+CEA+IGF-
87.2 100 100 76.9 0.954 1 +CRP
CA 19-9+CEA+IGF-1
91.5 100 100 83.3 0.979 +Albumin+CRP aPPV, valor predictivo positivo, bNPV, valor predictivo negativo, CAUC área bajo la curva ROC.
Tomando CA 19-9 como referencia, la mejor combinación de dos
biomarcadores era de CA 19-9 y el IGF - 1 , lo que dio un AUC de 0,946. Este valor es mucho más alto que el de CA 19-9 sólo. La adición de un nuevo biomarcador tal como los niveles de CEA mejoró ligeramente el rendimiento a 0.947. Al añadir albúmina, el AUC aumentó a 0.979. Por lo tanto, el mejor rendimiento para distinguir pacientes con PDAC de los pacientes con CP se encontró con la combinación de las concentraciones de CA 19-9 , CEA , el IGF - 1 y la albúmina, lo que dio lugar a una sensibilidad del 97,9 %, una
especificidad del 95% y una AUC de 0,979, tal como se muestra en la FIG. 2.
En esta FIG. 2 se detallan las curvas ROC para la discriminación de PDAC de CP utilizando sólo los niveles séricos de CA19-9 (línea sólida) y utilizando los niveles de los cuatro marcadores (CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina) en combinación de acuerdo con la invención (línea discontinua). Los valores control de referencia o punto de corte para cada marcador en la combinación fueron para CA 19-9, 64.61 U/ml; para CEA, 1 1 .8 ng/ml; para IGF-1 , 80.7 ng/ml y para albúmina 4.1 g/dL.
Tal como puede apreciarse, la mejor combinación (con mayor sensibilidad, especificidad y AUC) se corresponde con la propuesta en esta invención. Esto es, la que comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto los niveles de Antígeno carbohidrato 19-9, de Antígeno carcinoembrionario, de Factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de Albúmina.
Según se desprende además de la Tabla 3, la alta especificidad y sensibilidad lograda con esta combinación supone una gran ventaja en la diferenciación de pacientes con PDAC de los pacientes con CP. Además, esta combinación de biomarcadores conlleva la ventaja de que se puede medir fácilmente en laboratorios clínicos usando autoanalizadores que ya están disponibles en la rutina clínica, por lo que su implementación en clínica es fácil y permite un mejor diagnóstico de PDAC. Con ello, puede escogerse más rápidamente la terapia a aplicar en cada caso sin demoras de tiempo por diagnóstico erróneo y sin malversación de recursos por parte de las autoridades sanitarias al aplicarse tratamientos no necesarios en caso de tratarse de pacientes con CP en vez de PDAC.
Para poner en práctica esta combinación de biomarcadores (marcadores biológicos, en este caso proteicos y carbohidratos) en la práctica clínica, y en particular con el objetivo de predecir la probabilidad de un sujeto (paciente) de padecer cáncer de páncreas, en concreto PDAC, se estimó un modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial mediante el programarlo libre de estadística R, utilizando los datos de la cohorte de pacientes, y que tenía como variables predictoras las concentraciones de CA 19-9, CEA, de IGF-1 y de la albúmina. La estimación permitió construir una fórmula que posibilitó clasificar los pacientes con cáncer y sin cáncer, con una sensibilidad del 97,9 % y con una especificidad del 95%.
En esta fórmula (la fórmula (I) que está descrita aquí) las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan para obtener un valor test que se compara con un valor de
discriminación entre cáncer de páncreas y pancreatitis crónica.
Para esta realización particular, los puntos de corte o valores control de referencia para cada marcador son: CA 19-9 64.61 U/ml; CEA 1 1 .8 ng/ml, de IGF-1 80.7 ng/ml; y 4.1 g/dl de albúmina. Con este modelo se calculó la probabilidad de diagnosticar nuevos pacientes de CP o PDAC. Para una probabilidad igual a o mayor que 48,2 % (punto con la máxima sensibilidad y especificidad) el paciente será clasificado como PDAC con una sensibilidad del 97,9 %, pero si la probabilidad es inferior a 48,2 % el paciente se clasifica como CP con una especificidad de 95 %. La probabilidad de ser clasificado como CP o PDAC para un paciente particular se calcula con sus valores de CA 19-9, de CEA, de IGF - 1 y de albúmina, usando la siguiente función o fórmula (I), donde βθ, β1 , β2, β3 y β 4 son parámetros estimados por el modelo GLM:
(β0 + β Α19-9+ p2CEA + p3IGFl+ p^Albu min)
Vxob(PDAC) = 6 ( 0 + lCA19-9+ 2CEA + 3IGFl+ /iAlbu min)
l + e
(i).
El panel de CA 19-9, CEA, IGF-1 y albúmina se validó en una cohorte independiente compuesta de 20 pacientes con PDAC y 13 pacientes con CP (los datos de estos pacientes figuran en la Tabla 4). La distribución TNM de los 20 pacientes con PDAC era: Estadio NA n=7; Estadio IIB n=9; Estadio III n=1 y Estadio IV n=3. Cada muestra de validación se diagnosticó como cáncer o CP empleándose la función (I) descrita arriba. Con este modelo, 19 de los 20 pacientes con PDAC y 12 de los 13 pacientes con CP se clasificaron
correctamente. Esto supone una sensibilidad de 95 % y una especificidad del 92 %.
Los estadios de la enfermedad se corresponden con la clasificación Tumor- Node-Metastasis (TNM) del adenocarcinoma pancreático. (Extraído de TNM classification of malignant tumours. UICC (International Union Against Cáncer)); y se detallan en la Tabla 5, más adelante.
Tabla 4: Características clínicas y patológicas de la cohorte de validación.
PDAC CP
N 20 13
Media edad, años 67.2 50.9
(min-max) (39-86) (39-72) PDAC CP
Hombres 9 10
Mujeres 1 1 3
Estadio
IA 0
IB 0
NA 7
IIB 9
III 1
IV 3
De todos estos ensayos se desprende que la nueva combinación de albúmina, CEA, CA19-9 y IGF-1 propuesta permite la obtención de valores óptimos de sensibilidad, especificidad, área bajo curva (AUC), valor predictivo positivo (PPV) y negativo (NPV), no obtenibles con otras combinaciones propuestas para este mismo tipo de cáncer. La invención supone además la ventaja adicional de facilitar un método que utiliza únicamente marcadores (moléculas) ya usados habitualmente en clínica, con la finalidad de dar un valor significativo que permite al médico diagnosticar otras enfermedades. Esta discriminación correcta se mantiene incluso cuando los valores de los distintos marcadores por separados dan diagnósticos contrarios. Por ejemplo, si los niveles de CEA indican la presencia de PDAC y, por otro lado, los niveles de IGF-1 indican lo contrario, la combinación descrita permite el diagnóstico correcto y por ende, más preciso.
Tabla 5.: Clasificación TNM
ESTADÍO T N M
ESTADÍO 0 T in situ NO M0
ESTADÍO IA T1 NO M0
ESTADÍO IB T2 NO M0
ESTADÍO NA T3 NO M0
ESTADÍO IIB T1 -3 N1 M0
ESTADÍO III T4 Cualquier N M0
ESTADÍO IV Cualquier T Cualquier N M1 T, N, M se definen según:
CLASIFICACION CARACTERISTICAS
TX Tumor primario no puede ser valorado
T0 No evidencia de tumor primario
T/s Carcinoma in situ
T1 Tumor < 2 cm limitado al páncreas
T2 Tumor > 2 cm limitado al páncreas
Tumor que se extiende más allá del páncreas pero sin afectación del
T3
tronco celíaco o la arteria superior mesentérica.
T4 Tumor que afecta a tronco celíaco o arteria superior mesentérica.
Clasificación del adenocarcinoma pancreático en función del tamaño del tumor primario
CLASIFICACION CARACTERISTICAS
Nx No pueden valorarse los ganglios linfáticos regionales
NO No hay metástasis en ganglios linfáticos regionales
N1 Presencia de metástasis en ganglios linfáticos regionales
Clasificación del adenocarcinoma pancreático en función de la afectación de ganglios linfáticos regionales
CLASIFICACION CARACTERISTICAS
Mx No puede valorarse si existen metástasis a distancia
M0 No hay metástasis a distancia
M1 Presencia de metástasis a distancia
Clasificación del adenocarcinoma pancreático en función de la presencia o ausencia de metástasis Ensayo 3. Análisis multivariante de los niveles de biomarcadores CA19-9 y albúmina.
Alentados por los valores prometedores de la combinación de los niveles de CA19-9 y albúmina de la Tabla 3, los inventores realizaron un nuevo ensayo en una cohorte independiente de sujetos.
En este caso se disponía de 127 pacientes, de los cuales 83 estaban diagnosticados de cáncer de páncreas (PDAC) y 44 era pacientes con pancreatitis crónica (CP).
Se analizaron igualmente los cuatro marcadores en suero de los pacientes (CA19.9, CEA, IGF-1 y albúmina). Para ello, se siguieron los mismos procedimientos de extracción de muestra por venopunción y de análisis en suero de los marcadores, tal cual indicados para el resto de ensayos. Esto es, utilizando los mismos reactivos y sistemas automáticos y cálculos estadísticos. Repitiendo el esquema del Ensayo 2, para evaluar el rendimiento de la combinación de los niveles séricos de los diferentes biomarcadores, se utilizó el paquete estadístico R (programarlo libre de estadística R).
Con la combinación de los biomarcadores CA19-9 y albúmina para diferenciar PDAC de los grupos de la CP se obtuvieron una sensibilidad del 96.4 % y una especificidad de 90.9 %, con un AUC de 0.963. El valor predictivo positivo (PPV) fue del 95.2 %; y el valor predictivo negativo del 93 %.
En la FIG. 3 se muestra la curva ROC para la discriminación de PDAC de CP utilizando los niveles de los dos marcadores (CA19-9 y albúmina) en
combinación de acuerdo con la invención. Los valores control de referencia o punto de corte para cada marcador en la combinación fueron para CA 19-9, 2.9 U/ml; y para albúmina 3.9 g/dL.
Además, para poner en práctica esta combinación binaria de biomarcadores en la práctica clínica, y en particular con el objetivo de predecir la probabilidad de un sujeto (paciente) de padecer cáncer de páncreas, en concreto PDAC, se estimó también un modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial mediante el programarlo libre de estadística R, utilizando los datos de la cohorte de pacientes, y que tenía como variables predictoras las
concentraciones de CA 19-9, y de la albúmina. La estimación permitió construir una fórmula (II) que posibilitó clasificar los pacientes con cáncer y sin cáncer, con una sensibilidad del 96.4 % y con una especificidad del 90.9 %.
Para esta realización particular, los puntos de corte o valores control de referencia para cada marcador son: CA 19-9, 2.9 U/ml; y 3.9 g/dl de albúmina. Con este modelo se calculó la probabilidad de diagnosticar nuevos pacientes de CP o PDAC. Para una probabilidad igual a o mayor que 33.5 % (punto con la máxima sensibilidad y especificidad) el paciente será clasificado como PDAC con una sensibilidad del 96.4 %, pero si la probabilidad es inferior a 33.5 % el paciente se clasifica como CP con una especificidad de 90.9 %.
La fórmula (II) es la siguiente :
e (A) +PlCA19-9+p2Albu min)
Pr ob ( V Pancreatic— cáncer τ-Ω
/ ) = — α„Λ Λ η » Q — rx
-i (β0+ iCA\9-9+ iAlbu m)
(II), donde βθ, β1 , β2, son parámetros estimados por el modelo GLM.
Este ensayo permite afirmar que con solo el análisis sérico de dos marcadores de práctica habitual en clínica (CA 19-9 y albúmina) es suficiente para obtener datos muy relevantes de sensibilidad y especificidad, lo que reduce la complejidad de la metodología.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método para el diagnóstico de cáncer de páncreas caracterizado porque comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto la
concentración de al menos los siguientes marcadores:
- Antígeno carbohidrato 19-9;
- Albúmina; donde,
- si la concentración de Antígeno carbohidrato 19-9 es superior a un valor control de referencia y la concentración de Albúmina es inferior a un valor control de referencia, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y
- si la concentración de Antígeno carbohidrato 19-9 es inferior al valor control de referencia; y/o la concentración de Albúmina es superior al valor control de referencia, dichas concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan en una función para obtener un valor test que se compara con un valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.
2. - Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el valor control de referencia de antígeno carbohidrato 19-9 es 2.9 U/ml; y el valor control de referencia de albúmina es 3.9 g/dl.
3. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, caracterizado porque si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas además
comprende combinar las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto en una función, para obtener el valor test que se compara con el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.
4. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el valor test se obtiene de la siguiente fórmula (II): (β0 + /¾C419-9+ /32 ¾Μ min)
Pr obxPancreatic cáncer (β0 + /¾C419-9+ β lAlbu min)
(I I)
donde:
Prob(Pancreatic_cancer) se refiere a un valor de probabilidad, expresado en porcentaje, de clasificar un sujeto de padecer cáncer de páncreas o
enfermedades benignas de páncreas;
βθ es 13,013;
β1 es 0,035;
β2 es -3,539;
CA19-9 es la concentración en unidades por mililitro (U/ml) de antígeno carbohidrato 19-9 de la muestra aislada del sujeto; y Albumin es la
concentración de albúmina en g/dl de la muestra aislada del sujeto.
5.- Método para el diagnóstico de cáncer de páncreas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto la concentración de los siguientes marcadores:
- Antígeno carbohidrato 19-9;
- Antígeno carcinoembrionario;
- Factor de crecimiento insulínico tipo 1 ;
- Albúmina; donde,
- si las concentraciones de Antígeno carbohidrato 19-9 y Antígeno
carcinoembrionario son superiores a respectivos valores control de referencia y las concentraciones de Factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de Albúmina son inferiores a respectivos valores control de referencia, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y
- si las concentraciones de Antígeno carbohidrato 19-9 y/o Antígeno
carcinoembrionario son inferiores a los valores control de referencia; y/o si las concentraciones de Factor de crecimiento insulínico tipo 1 y/o de Albúmina son superiores a respectivos valores control de referencia, dichas concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan en una función para obtener un valor test que se compara con un valor de
discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.
6. - Método según la reivindicación 5, caracterizado porque el valor control de referencia de antígeno carbohidrato 19-9 es 64.61 U/ml; el valor control de referencia de antígeno carcinoembrionario es 1 1 .8 ng/ml, el valor control de referencia de factor de crecimiento insulínico tipo 1 es 80.7 ng/ml; y el valor control de referencia de albúmina es 4.1 g/dl.
7. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, caracterizado porque si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas además
comprende combinar las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto en una función, para obtener el valor test que se compara con el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.
8. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizado porque el valor test se obtiene de la siguiente fórmula (I):
(β0 + β Α19-9+ p2CEA + p3IGFl+ p^Albu min)
Vxob(PDAC) = 6 ( 0 + lCA19-9+ 2CEA + 3IGFl+ /iAlbu min)
l + e
(i)
donde:
Prob(PDAC) se refiere a un valor de probabilidad, expresado en porcentaje, de clasificar un sujeto de padecer cáncer de páncreas o enfermedades benignas de páncreas; βθ es 16,000764;
β1 es 0,099556;
β2 es 0,342634;
β3 es 0,004923;
β4 es -5,200419;
CA19-9 es la concentración en unidades por mililitro (U/ml) de antígeno carbohidrato 19-9 de la muestra aislada del sujeto; CEA es la concentración en ng/ml de antígeno carcinoembrionario de la muestra aislada del sujeto; IGF1 es la concentración en ng/ml de factor de crecimiento insulínico tipo 1 de la muestra aislada del sujeto; y Albumin es la concentración de albúmina en g/dl de la muestra aislada del sujeto.
9. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, caracterizado porque si el valor test es igual o superior al valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y si el valor test es inferior al valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas, el sujeto es diagnosticado de enfermedad benigna de páncreas.
10. - Método según la reivindicación 9, caracterizado porque el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas es un porcentaje de probabilidad y es del 48.2 % si se calcula mediante la fórmula (I); y es de 33.5 % si se calcula mediante la fórmula (II).
1 1 . - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, caracterizado porque el cáncer de páncreas es adenocarcinoma pancreático ductal.
12. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , caracterizado porque la enfermedad benigna de páncreas es pancreatitis crónica.
13. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, caracterizado porque es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica.
14. - Método según la reivindicación 13, caracterizado porque es para el diagnóstico diferencial de adenocarcinoma pancreático ductal y pancreatitis crónica.
15. -Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, caracterizado porque la muestra aislada del sujeto se selecciona del grupo constituido por sangre completa, suero y plasma.
16. - Método según la reivindicación 15, caracterizado porque la muestra aislada es suero.
17. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -16, caracterizado porque la determinación de la concentración de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina, cuando se determinan estos dos marcadores; o la determinación de la concentración de antígeno carbohidrato 19-9, de albúmina, de antígeno carcinoembrionario, y de factor de crecimiento insulínico tipo 1 , cuando se determinan estos cuatro marcadores, se lleva a cabo usando un grupo de unión específico para cada uno de los marcadores.
18. - Método según la reivindicación 17, caracterizado porque el grupo de unión específico para la determinación de la concentración de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 es un anticuerpo y la determinación se lleva a cabo mediante inmunoensayo.
19. - Método según la reivindicación 17, caracterizado porque el grupo de unión específico para la determinación de albúmina es un compuesto colorante aniónico y la determinación se lleva a cabo mediante un ensayo colorimétrico.
20. - Método para decidir o recomendar un régimen médico para cáncer de páncreas, dicho régimen médico seleccionado de entre tratamiento
farmacológico e intervención quirúrgica, que comprende llevar a cabo el método de diagnóstico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -19; y donde, si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas se recomienda o decide el régimen médico indicado para el cáncer de páncreas, y si el sujeto no es diagnosticado de cáncer de páncreas pero es diagnosticado de una enfermedad benigna de páncreas se recomienda o decide el régimen médico para esta otra enfermedad.
21 . - Uso combinado de las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina como marcador de cáncer de páncreas.
22. - Uso combinado de las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina como marcador de cáncer de páncreas.
23. - Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 -22, caracterizado porque el cáncer de páncreas es adenocarcinoma pancreático ductal.
24. - Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 -23, caracterizado porque el marcador es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica.
25. - Kit que comprende medios para determinar niveles de proteínas y carbohidratos en una muestra aislada de un sujeto, caracterizado porque los medios son grupos de unión específicos de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina.
26. - Kit según la reivindicación 25 que comprende además medios para determinar niveles de proteínas en una muestra aislada de un sujeto, donde los medios son grupos de unión específicos de antígeno carcinoembrionario, y de factor de crecimiento insulínico tipo 1 .
27. - Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 25-26, caracterizado porque además comprende medios para calcular el valor test según se ha definido en las reivindicaciones 4 y/o 8.
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