WO2015181743A1 - Dispositif de lyse d'especes biologiques et procede mis en œuvre par ce dispositif - Google Patents

Dispositif de lyse d'especes biologiques et procede mis en œuvre par ce dispositif Download PDF

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WO2015181743A1
WO2015181743A1 PCT/IB2015/053970 IB2015053970W WO2015181743A1 WO 2015181743 A1 WO2015181743 A1 WO 2015181743A1 IB 2015053970 W IB2015053970 W IB 2015053970W WO 2015181743 A1 WO2015181743 A1 WO 2015181743A1
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wall
lysis
walls
biological species
microporous
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PCT/IB2015/053970
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Anne-Gaelle BOURDAT
Antonio VIANA
Remco Den Dulk
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Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
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    • G01N2001/2866—Grinding or homogeneising

Definitions

  • the invention relates to a device for lysing biological species (microorganisms, bacteria, cells, spores, etc.) and to a method implemented by this device,
  • Bio cell lysis is required to recover and study the intracellular material.
  • cell lysis is required to recover DNA from the cell for replication and analysis, such as a comparison of DNA.
  • Chemical lysis This technique involves contacting the cells with a lysis solution, usually containing a detergent bursting the cells. This technique is effective but may be dangerous for some cellular materials. In addition, it is long and requires many manipulations, including a purification step of the lysis solution, and possibly concentration of the lysate which makes it long, with a risk of losing a large amount of biological material fors purification and concentration requires the intervention of a specialized person; this technique is not effective for lysis of spores,
  • Heat shock lysis this technique includes, for example, incubating the extract at a temperature below 0 °, followed immediately by incubation of the extract at a temperature of at least 95%, preferably about 00%. This technique requires complex equipment, especially if it is desired to lyse spores.
  • Electric field lysis this technique involves the use of a potential difference leading to rupture of the cell membrane. This technique requires a complex material and is, like the previous methods, poorly adapted to lysis of spores.
  • Mechanical lysis this technique is based on the agitation of the extract in the presence of beads so that the shocks of the balls against the cells burst them. This technique requires complex equipment. In addition, it is necessary to use beads perfectly free of microorganisms, and to recover them after lysis. Examples of devices implementing this method are the biological sample mills of the Precellys® range. Berlin Technologies is a costly and cumbersome device that is difficult to incorporate in a compact instrument.
  • Pressure lysis this technique involves applying a hydrostatic pressure to the cells, leading to the rupture of their membrane. This technique requires complex equipment.
  • FR 2 781 500 which describes a method of mechanical lysis of microorganisms by setting the grinding means in motion by a magnetic field
  • the documents WO-A1 -99 / 02958 and US-A-5,114,858 each disclose a device for mechanical lysis of biological species comprising first and second walls movable relative to one another, between an initial position. where they are spaced from each other and a lysis position where the first piston wall bears against the second wall, the first and second walls being movably mounted in shear with respect to each other in the lysis position.
  • the pistons presented in these two documents are provided with macroscopic projections which form a grinding toothing and therefore do not confer a microroughness to the corresponding bearing surfaces of these pistons. All these techniques are complex and require important equipment. In addition, they require a significant preparation time, and a lysis time of several tens of seconds to several minutes. In addition, they are difficult to integrate on portable and compact instruments.
  • the object of the present invention is therefore to provide a device and a method for lysis of biological species that is simple, inexpensive, and easily integrable in laboratory equipment or in a portable device, and having a high Syse efficiency * in particularly on spores allowing satisfactory lysis (at least 50% of lysed biological species) in less than 10 seconds, or even in 1 second.
  • the invention proposes to provide an apparatus and a method of mechanical lysis implementing a rough surface against which the objects to be iysed are ground by a friction movement (shear) and not by shocks or a simple pressure.
  • the subject of the invention is a device for mechanical lysis of biological species present in a fluid comprising a first wall and a second wall movably mounted relative to each other, between an initial position in which the first and second walls are spaced apart from each other, and a lysis position in which the first wall bears against the second wall, the first and second walls also being movable in shear with respect to the second wall; other in the lysis position, characterized in that at least one of the first and second walls has a rough bearing surface against the other wall and has a mean surface roughness parameter Ra of between 0.2 ⁇ m and 10 ⁇ m, and preferably between 0.2 ⁇ m and 3 ⁇ m.
  • one of the first wall and second wall may be a microporous wall, i.e., porous to liquids and non-porous to biological species to be lysed;
  • the microporous wall may have an average pore diameter of less than 1 ⁇ m, or even less than 0.2 ⁇ m;
  • the microporous wall may be rough
  • the rough microporous parasite may consist of a layer of microporous material having a flat surface on which is positioned a rough layer intended to abut against the other wall in the Iyse position;
  • the rough microporous wall may consist of a layer of microporous material having a rough surface
  • the rough microporous wall may consist of a layer of macroporous material having a rough surface on which is positioned a microporous layer intended to bear against the other wall in a position of Iyse, the microporous layer being sufficiently flexible and thin to conform to the roughness of the surface of the layer of macroporous material in the Iyse position;
  • the microporous wall may be non-rough and have a mean Ra surface roughness parameter of less than 0.1 ⁇ m, while the non-microporous wall may be rough and have a mean Ra surface roughness parameter of between 0, 2 ⁇ m and 10 ⁇ m, preferably between 0.2 ⁇ m and 3 ⁇ m;
  • the device according to the invention may further comprise a chamber and a piston movably mounted in the chamber between the initial position and the position of Iyse, the first wall being mounted on the movable piston and the second wall being arranged facing the first wall;
  • the second wall of the device may then be microporous, and the chamber may further comprise a fluidic outlet arranged opposite the first wall relative to the second microporous wall; (xi) the chamber may then further comprise a fluidic inlet and another fluidic outlet; and
  • the chamber may then further comprise a sealed membrane arranged between the first wall, fluidic inlet and the fluidic outlet, the membrane being sufficiently thin and flexible to match the roughness of at least one of the first and second walls in position lysis.
  • the invention also relates to a method of mechanical lysis of biological species comprising the following steps:
  • the method according to the invention is effective since it allows a yield at least equivalent to the reference method of lysis of spores by Preoelys ⁇ (Berti ' n) mills.
  • the process is fast compared to the reference method (Pre ⁇ llys ⁇ (Bertin) mill): in less than 10 seconds against 30 seconds for the reference mill.
  • the method according to the invention is economical and direct because it does not require the addition of a chemical substance, nor any subsequent purification, nor the addition of foreign bodies in the sample (such as beads).
  • the DNA recovered after lysis by the method according to the invention is directly analyzable (Le, without purification step) using conventional molecular biology techniques, such as "PCR” ( “Polymerase Chain Reaction ”) or electrophoresis. Finally, the release is carried out without degradation of the nucleic acids of the species.
  • step A) may consist in providing a device according to the above-mentioned feature (ix), step C) in sliding the piston in the chamber until the first and second walls are in the lysis position. and step D) rotating the piston on itself such that these walls remain in contact with each other;
  • step A) may consist in providing a device according to (x) above, step B) in placing a liquid comprising the species to be lysed between the walls, step G) in sliding the piston in the chamber until the liquid has been filtered through the microporous wall, that only these species remain on the micropotage wall and that these walls are in the lysis position, and step D) to rotate the piston on itself. even so that these walls remain in contact with each other;
  • step A) may consist in providing a device according to (xi) above, step B) for introducing a liquid comprising the species to be dispersed by the fluidic inlet, between these walls, step C) to slide the piston into the chamber until these walls are in the tyse position, step D) to rotate the piston on itself so that these walls remain in contact with each other and step F ⁇ circulating an elution liquid between the inlet and the fluid outlet to recover Se yat by this outlet; and
  • step A) may consist in providing a device according to (xli) above, step B) for introducing a liquid comprising the species to be lysed by the fluidic inlet, between the impervious membrane and the second wall, step C) to slide the piston in the chamber until these walls are in lysis position through the membrane in step D) to rotate the piston itself so these walls remain in contact with each other through ia membrane, and the step F) to circulate a flow liquid between fluidic inlet and fluidic outlet to recover the lysate by the fluidic outlet.
  • FIGS. 1 and 2 two schematic sectional views of a first embodiment of a cell lysis device according to the invention
  • FIG. 3 is a diagrammatic sectional view of a second embodiment of a cellular cell device according to the invention.
  • FIG. 4 is a diagrammatic sectional view of a third embodiment of a cellular cell device according to the invention.
  • Figure 5 is a schematic sectional view of a fourth embodiment of a cell lysis device according to the invention.
  • FIG. 6 is a diagrammatic sectional view of a fifth embodiment of a cellular cell device according to the invention.
  • Figure 9 is a schematic sectional view of a seventh embodiment of a cell phone device according to the invention.
  • Figure 10 is a schematic sectional view of an eighth embodiment of a cell phone device according to the invention.
  • FIGS. 11 and 12 two schematic sectional views of a ninth embodiment of a cellular cell device according to the invention.
  • Ra means arithmetic mean ia corresponding to Ra parameter measurements greater than 0.2 microns, preferably between 0.2 and 10 ⁇ pm and even more preferentially between 0.2 pm and 3 pm.
  • the parameter or coefficient of average surface roughness Ra is established from a profilometer measurement, as zero-rated by Hereafter);
  • Microporous it is a wall or layer of material comprising open pores large enough to pass liquids, such as water, but narrow enough to prevent passage of the biological species to be lysed as well as the biological material derived from the fyse and to be analyzed.
  • a microporous wall within the meaning of the invention comprises open pores having a diameter of less than 1 ⁇ m, and preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • sintered filters porous silica filters, ceramic filters, and porous polymer or porous metal filters;
  • Macroporous it is a wall, a layer or a material comprising open pores or channels large enough to allow liquids, such as water, to pass, but also wide enough to allow biological species to pass be lysed or biological material from the lysis and to be analyzed.
  • a macroporous wall within the meaning of the invention comprises open pores or channels having a diameter greater than 0.2 ⁇ m, and preferably greater than 1 ⁇ m.
  • a layer of glass, metal or polymer provided with channels passing through the layer;
  • Bio species especially cells, microorganisms, in particular bacteria, spores, viruses, fungi, microalgae.
  • the invention provides a mechanical lysis device comprising a first wall and a second wall mounted movable relative to one another. at the other, between an initial position in which the first and second walls are spaced from each other, and a lysis position in which the first wall bears against its second wall.
  • the first and second walls are also mounted movable in shear with respect to each other in the lysis position, that is to say one in abutment against the other.
  • the shear can be obtained by rotating or translating the first wall relative to the second wall.
  • the invention therefore provides two degrees of freedom between your walls; a degree of freedom to approach Tune walls in contact with each other, and a degree of freedom to enable a shear when the walls are pressed against Tune the other.
  • the rough surface has an average surface roughness parameter Ra of between 0.2 ⁇ m and 10 ⁇ m, preferably between 0.2 ⁇ m and 3 ⁇ m.
  • FIGS. 1 and 2 A first embodiment of a device according to the invention is illustrated in FIGS. 1 and 2.
  • the device according to the invention is in the initial position in which the first and second walls are spaced from one another.
  • the mechanical lysis device 1 comprises a chamber 10 and a piston 20 mounted to move in translation in the chamber 10 between the initial positio (FIG. 1) and the lysis position (FIG. 2).
  • a seal (not shown) is provided between the
  • the first wall 21 is mounted on the movable piston 20 and the second wall 11 is arranged facing the first wall 21.
  • the second wall 11 is microporous in order to allow the liquid. L having cells C to iyser diffuse through the second wall 11 when the piston 20 is lowered to the lysis position in which the two walls 11 and 21 are in contact with each other ( Figure 2).
  • the second wall 11 is for example a porous polymer filter.
  • the chamber 10 further comprises a fluid outlet 2 arranged opposite the first wall 21 relative to the second microporous wall 11, allowing the evacuation of the liquid as well as the iysed species.
  • a tank can replace the fluidic outlet, to receive the liquid,
  • the microporous wall 11 has an average pore diameter of between 0.2 m and 0.5 p.
  • the pore diameter is adapted to ensure that the liquid diffuses through the wall 11, but that the cells are intact (before the lysis) remain on the surface of the wall on the surface of which they are lysed.
  • the biological material to be studied (DNA, proteins, etc.) released by the lysis can pass through the filter or remain on the surface of the latter, to be recovered,
  • the wall 21 carried by the piston 20 which has a rough bearing surface 22 against the other wall.
  • the microporous wall 1 has a non-rough surface 13
  • the non-microporous wall 21 has a rough surface 22, for example an abrasive surface.
  • the microporous wall 11 which is arranged a rough surface 4.
  • the microporous rough wall 11 consists of a layer 11 of microporous material having a flat surface 13 on which is positioned a rough layer 14 intended to bear against the wall 21 of the piston 20 in the lysis position.
  • the rough layer 14 must be able to pass the liquid in which the cells to be lysed.
  • the rough layer 14 is made of a porous abrasive material, for example a metal grid.
  • Figure 4 illustrates an alternative embodiment of a rough microporous wall 11.
  • the rough microporous wall 11 is made of a layer of microporous material having a rough surface, for example microstructured.
  • the roughness of the surface is obtained by microsiruciuration of a microporous material.
  • This layer 11 of microporous material may also consist of an abrasive filter, such as a sintered silica, a porous silica, a ceramic, a porous polymer * It is for example a stainless steel filter, presenting itself in the form of a grid.
  • the microporous wall 11 makes it possible to retain the biological species to be lysed, while allowing the biological fluid to flow. Following the lysis operation, the lysed biological species flow through the microporous wall.
  • Figure 5 illustrates a fourth alternative embodiment of a rough microporous wall 11.
  • It consists of a macroporous layer 16 having a rough surface 17, and a microporous layer 18, positioned on the macroporous layer 18 and intended to bear against the first wall 21 carried by the piston 20, in the lysis position. .
  • the microporous layer 18 must be sufficiently flexible and thin to conform to the roughness of the surface 17 of the macroporous layer 16 in the lysis position, so that the roughness of the macroporous layer 16 is visible through the microporous layer 18 and that the cells can to be lysed. Thanks to the microporous layer 18, the biological species to be fysed are retained and can be lysed.
  • Figure 8 illustrates a fifth embodiment in which the first wall 21 and the second wall 11 are both rough, i.e. both have a rough surface 22-14.
  • Eiles can be constituted by a combination of the embodiments of Figures 1 and 3, a combination of the embodiments of Figures 1 and 4 or a combination of the embodiments of Figures 1 and 5.
  • Figures 7 and 8 illustrate a sixth embodiment for a facilitated implementation of iyse and recovery of the biological material to be analyzed.
  • the chamber 10 further comprises a fluidic inlet 30 and a fluidic outlet 40 arranged, seen in section, between the first and second walls 21-11 when in the initial position.
  • liquid L comprising cells C to be fysed is introduced into the chamber 10, between the first wall 21 and the second wall 11, by opening the valve VI of the fluidic inlet 30, and closing the valves V 2 and V3, respectively of the fluidic outlets 12 and 4P, This step makes it possible to place the biological cells C to be lysed between the first and second walls 21-1 1.
  • valve V1 is closed, and the valve V2 is open.
  • the piston 20 is then brought to the Iyse position according to the arrow FI ( Figure S).
  • the liquid can flow through the microporous wall 11 and be discharged along the arrow F3 through the fluid outlet 12 arranged opposite the first wall 21 with respect to the second microporous wall 11.
  • this recovery is achieved by opening the valves V1 and V3, and circulating an elution liquid between the inlet 30 and the fluid outlet 40 to collect the biological material Iyse. Then the cleaning liquid comprising the lysate is recovered by the fluidic outlet 40.
  • the fluid outlet 40 can be directly connected fluidly to an analysis apparatus.
  • the shearing of biological cells between two walls allows lysis in a few seconds, with a simple, compact and inexpensive device.
  • Figure 9 illustrates a seventh embodiment avoiding cleaning the piston after each lysis.
  • the chamber further comprises a sealed membrane 50 arranged between the first wall 21, the inlet 30 and the fluid outlet 40.
  • the membrane 50 must be sufficiently thin and flexible. to marry, in the Iyse position, the roughness of the rough wall, which may be carried by the piston and / or the chamber,
  • a polymer or plastic film with a thickness of between 50 ⁇ m and a few hundreds of ⁇ %, for example 100 ⁇ m, the rough, microporous wall possibly being a stainless steel filter.
  • the plunger can be recovered without having to be cleaned, and the chamber can be cleaned for a next lysis. be eliminated.
  • the use of a reported diaphragm and piston makes it possible to carry out a disposable chip, to recover the lysate, and then to eliminate the chip.
  • the membrane can be washed or removed, and the piston is recovered without having to be washed for later use on another consumable.
  • the word “piston” covers, in this case, any room for applying a mechanical shear of the cells against the wall of the chamber, this part not necessarily having the conventional shape of a piston. It is thus the membrane which assures the gasket, and not the piston which can then have any form.
  • an automatic screwdriver means a piston 60 having an upper portion and a lower portion, such that, when the upper portion describes a translation, the lower portion of the piston describes a rotational movement when a resistance opposes its translation.
  • FIG. 10 The implementation of such 10 is illustrated in FIG. 10, in which the piston 60 has dimensions (here, width 1, sectional view) smaller than the same dimensions (here, width 2, sectional view) of the chamber, so that the shear does not is not necessarily obtained by rotation of the piston 60, but can also be obtained by translation, as illustrated by the arrow F4,
  • Figures 11 and 12 illustrate another embodiment in which it is the piston 70 which has a microporous wall 71.
  • the liquid L diffuses through the microporous wall 71 of the piston 70 in the direction of the arrows F5, and can be evacuated for example by flipping the chamber 10 or aspirating the liquid L.
  • This embodiment can also be combined with a chamber having an inlet and a fluid outlet (not shown).
  • the device and the method according to the invention make it possible to obtain a very fast jyse of biological species, without requiring the addition of additional lysis means in the lysis chamber (iSSe, chemical reagent, heat input, ultrasound, etc. .).
  • the implementation is simple and can be done manually or automatically.
  • the method according to the invention is more effective than the reference method (Precellys ⁇ (Bertin) mill).
  • the efficiency of the lysis is determined indirectly by the amount of DNA released after lysis. This amount of DNA is evaluated by "q-PCR".
  • the species, in contact with a rough surface are subjected to shear and pressure forces using a non-rough surface, such as the surface of a metal spatula or a plastic pipette cone. , or using a second rough surface (case of a glass slide deposits on frosted glass).
  • the species are crushed for a period of 2 seconds in order to release at least one of the cellular constituents in the medium (DNA, RNA, protein, etc.).
  • plastic film is intended to prevent contamination of species when using a steel spatula. It is to highlight that :
  • the lyses were carried out dry or in a volume of 0.5 ⁇ l with 5 ⁇ l of aqueous solution,
  • a first series of tests aimed to compare the efficiency of the process according to the invention (two versions: glass on glass, and glass on plastic) with the reference method by Preceiiys (Berin).
  • the amount of DNA released after lysis of the spores is evaluated by "q-PCR", using a machine ⁇ x Stratagene "(Agiient) calibrated according to the manufacturer's instructions.
  • a second series of tests aimed at controlling the non-adsorptivity and non-degradation of DNA by the surfaces involved in the process according to the invention.

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Abstract

L'invention propose un dispositif et un procédé simple et rapide de lyse d'espèces biologiques présentes dans un fluide, mettant en œuvre une surface rugueuse contre laquelle les objets à lyser sont broyés par un mouvement de cisaillement. Un dispositif (1) selon l'invention de lyse mécanique d'espèces biologiques (C) comprend une première paroi (21) et une seconde paroi (11) montées mobiles l'une par rapport à l'autre,- entre une position initiale dans laquelle ces parois sont écartées l'une de l'autre, et une position de lyse dans laquelle la première paroi est en appui contre là seconde paroi, les première et seconde parois étant également montées mobiles en cisaillement l'une par rapport à l'autre dans la position de lyse, l'une au moins des première et seconde parois ayant une surface d'appui rugueuse contre l'autre paroi et présentant un paramètre de rugosité de surface Ra moyen, compris entre 0,2 μm et 10 μm, et préférentiellement entre 0,2 μm et 3 μm.

Description

DISPOSITIF DE LYSE D'ESPECES BIOLOGIQUES ET PROCEDE MIS EU
ŒUVRE PAR CE, DISPOSITIF.
.L'invention se rapporte à un dispositif de lyse d'espèces biologiques (micro-organismes, bactéries, cellules, spores, etc.} et à un procédé mis en œuvre par ce dispositif,
La lyse de cellules biologique est nécessaire pour récupérer et étudier le matériel intracellulaire, Par exemple, la lyse cellulaire est nécessaire pour récupérer f'ADN de la cellule en vue d'une réplication et d'une analyse, telle qu'une comparaison d'ADN.
Les méthodes classiquement utilisées pour la lyse d'espèces biologiques sont les suivantes :
s La lyse chimique : cette technique comprend la mise au contact des ceiiules avec une solution de lyse, contenant généralement un détergent faisant éclater les cellules, Cette technique est efficace mais peut être dangereuse pour certains matériels cellulaires. En outre, elle est longue et nécessite de nombreuses manipulations, dont une étape de purification de la solution de lyse, et éventuellement de concentration du lysat ce qui la rend longue, avec un risque de perdre une grande quantité de matériel biologique fors de la purification et de la concentration ei nécessite l'intervention d'une personne spécialisée ; cette technique n'est pas efficace pour la lyse des spores,
* La lyse par choc thermique : cette technique comprend par exemple l'incubation de l'extrait â une température inférieure à 0X, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95X, de préférence environ 00X. Cette technique nécessite un matériel complexe, notamment si on souhaite lyser des spores.
• La lyse par champ électrique : cette technique comprend l'utilisation d'une différence de potentiel conduisant à la rupture de la membrane cellulaire. Cette technique nécessite un matériel complexe et est, à l'instar des méthodes précédentes, peu adaptée à la lyse de spores. * La lyse mécanique : cette technique est basée sur l'agitation de l'extrait en présence de billes afin que les chocs des billes contre les cellules éclatent ces dernières. Cette technique nécessite un matériel complexe. En outre, il est nécessaire d'utiliser des billes parfaitement dépourvues de micro- organismes, et de les récupérer après la lyse.. Des exemples de dispositifs mettant en œuvre ce procédé sont les broyeurs d'échantillons biologiques dé la gamme Precellys© de la société Berlin technologies, fi s'agit de dispositifs chers et encombrants, difficilement inîëgfables dans un instrument compact.
® La lyse par pression : cette technique comprend l'application d'une pression hydrostatique sur les cellules, conduisant à la rupture de leur membrane. Cette technique nécessite un matériel complexe.
Parmi les procédés de lyse par broyage mécanique, on peut citer les documents suivants ;
» FR 2 781 500, qui décrit un procédé de lyse mécaniqu de micro- organismes par mise en mouvement des moyens de broyage par un champ magnétique ; et
« US 2003/0068915s qui décrit un procédé de lyse mécanique de micro- organismes pa mise en mouvement des moyens de broyage par des ultrasons .
Les documents WO-A1 -99/02958 et US-A-5 114 858 divulguent chacun un dispositif de lyse mécanique d'espèces biologiques comprenant une première et une seconde parois mobiles l'une par rapport à l'autre, entre une position initiale où elles sont écartées l'une de l'autre et une position de lyse où la première paroi formant piston est en appui contre la seconde paroi, les première et seconde parois étant montées mobiles en cisaillement l'une par rapport à l'autre dans la position de lyse. Les pistons présentés dans ces deux documents sont pourvus de saillies macroscopiques qui forment une denture de broyage et ne confèrent donc pas une microrugosité aux surfaces d'appui correspondantes de ces pistons. Toutes ces techniques sont complexes et nécessitent un matériel Important, En outre, elles nécessitent un temps de préparation important, et une durée de lyse de plusieurs dizaines de secondes à plusieurs minutes. De plus, elles sont difficilement inîégrabtes sur des instruments portables et compacts.
L'objectif de la présente invention est donc de proposer un appareil et un procédé de lyse d'espèces biologiques simple, peu onéreux, et facilement intégrable dans un équipement de laboratoire ou dans un dispositif portable, et présentant une efficacité de Syse élevée* en particulier sur des spores permettant une lyse satisfaisante (au moins 50 % des espèces biologiques lysèes) en moins de 10 secondes, voire même en 1 secondé.
Pou cela, l'invention propose de réaliser un appareil et un procédé de lyse mécanique mettant en œuvre une surface rugueuse contre laquelle tes objets à iyser sont broyés par un mouvement de friction (cisaillement) et non par des chocs ou une simple pression.
A cette fin, l'invention a pour objet un dispositif de lyse mécanique d'espèces biologiques présentes dans un fluid comprenant une première paroi et une seconde paroi montées mobiles l'une par rapport à l'autre, entre une position initiale dans laquelle les première et seconde parois sont écartées l'un de l'autre, et une position de lyse dans laquelle la première paroi est en appui contre la seconde paroi, les première et seconde parois étant également montées mobiles en cisaillement l'une par rapport à l'autre dan la position de lyse, caractérisé e ce que l'une au moins des première et seconde parois a une surface d'appui rugueuse contre l'autre paroi et présente un paramètre de rugosité de surface Ra moyen compris entre 0,2 pm eî 10 pm, et préférentieliement entre 0,2 pm et 3 pm.
Selon d'autres modes de réalisation du dispositif selon l'invention :
(t) l'une des première paroi et seconde paroi peut être une paroi microporeuse, c'est-à-dire poreuse aux liquides et non poreuse aux espèces biologiques devant être lysèes ; (il) la paroi microporeuse peut présenter un diamètre moyen de pores inférieur à 1 pm, voire inférieur à 0,2 prn ;
(m) la paroi microporeuse peut être rugueuse ;
(iv) la paras microporeuse rugueuse peut être constituée d'une couche de matériau microporeux ayant une surface plane sur laquelle est positionnée une couche rugueuse destinée à être en appui contre l'autre paroi en position de Iyse ;
(v) selon une variante de (iv), la paroi microporeuse rugueuse peut être constituée d'une couche de matériau microporeux ayant une surface rugueuse ;
(vi) selon une autre variante de (iv), la paroi microporeuse rugueuse peut être constituée d'un couche de matériau macroporeux ayant une surface rugueuse sur laquelle est positionnée une couche microporeuse destinée à être en appui contre l'autre paroi en position de Iyse, la couche microporeuse étant suffisamment souple et fine pour épouser la rugosité de la surface de la couche de matériau macroporeux en position de Iyse ;
(vil) la paroi microporeuse peut être non rugueuse et présenter un paramètre de rugosité de surface Ra moyen inférieur à 0,1 pm, alors que la paroi non microporeuse peut être rugueuse et présenter un paramètre de rugosité de surface Ra moyen compris entre 0,2 ym et 10 μπι, préférentieltement entre 0,2 pm et 3 pm ;
(viii) selon une variante de (vii). la première paroi et fa seconde paroi peuvent être rugueuses ;
(îx) le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre une chambre et un piston monté mobile dans la chambre entre la position initiale et la position de Iyse, la première paroi étant montée sur ie piston mobile et la seconde paroi étant agencée en regard de la première paroi ;
(x) la seconde paroi du dispositif peut être alors microporeuse, et la chambre peut comporter en outre une sortie fiuidique agencée à l'opposé de ia première paroi par rapport à la seconde paroi microporeuse ; (xi) la chambre peut alors comporter en outre une entrée fluidique et une autre sortie fluidique ; et
(xii) la chambre peut alors comporter en outre une membrane étanche agencée entre ta première paroi, rentrée fluidique et la sortie fluidique, la membrane étant suffisamment fine et souple pour épouser la rugosité de l'une au moins des première et seconde parois en position de lyse.
L'invention se rapport également à un procédé de lyse mécanique d'espèces biologiques comprenant tes étapes suivantes :
A) , fourniture d'un dispositif tel que celui précité de telle sorte que les première et seconde parois soient en position initiale ;
B) Placer les espèces biologiques à iyser entre ces parois ;
C) Amener ces parois en position de lyse ;
D) Générer un cisaillement entre ces parois en position de lyse pour provoquer la lyse mécanique de ces espèces et obtenir un lysat ;
E) Écarter ces parois jusqu'à ce qu'elles soient en position initiale ; et
F) Récupérer le lysat dés espèces biologiques.
Le procédé selon l'invention est efficace puisqu'il permet un rendement au moins équivatenî â la méthode de référence de lyse des spores par le broyeurs Preœllys© (Berti'n).
Le procédé est rapide en regard de la méthode de référence (broyeur Preœllys© (Bertin)} : en moins de 10 secondes contre 30 secondes pour le broyeur de référence.
Le procédé selon l'invention est économique et direct car il ne requiert pas d'ajout de substance chimique, ni de purification ultérieure, ni d'ajout de corps étrangers dans l'échantillon (tels que des billes). En outre, i'ÂDN récupéré à l'issue de la lyse par le procédé selon l'invention est directement analysable (Le, sans étape de purification) à l'aide des techniques de biologie moléculaire classiques, telles que la « PCR » {« Polymerase Chain Reaction » en anglais) ou i'électraphorèse. Enfin, ia libération s'effectue sans dégradation des acides nucléiques des espèces.
Selon d'autres modes de réalisation du procédé selon l'invention ;
- l'étape A) peut consister à fournir un dispositif selon la caractéristique <ix) ci-dessus, l'étape C) à faire coulisser le piston dans la chambre jusqu'à ce que les première et seconde parois soient en position de lyse et l'étape D) à faire tourner le piston sur lui-même de telle sorte que ces parois restent en contact l'une avec l'autre ;
- l'étape A) peut consister â fournir un dispositif selon (x) ci- dessus, l'étape B) à placer un liquide comportant les espèces à Iyser entre les parois, l'étape G) â faire coulisser le piston dans la chambre jusqu'à ce que le liquide ait été filtré à travers la paroi microporeuse, que seules ces espèces restent sur îa paroi micropoteuse et que ces parois soient en position de lyse, et l'étape D) à faire tourner le piston sur lui-même de sorte que ces parois restent en contact l'une avec l'autre ;
- l'étape A) peut consister à fournir un dispositif selon (xi) ci- dessus, l'étape B) à faire entrer un liquide comportant les espèces é Iyser par l'entrée fluidique, entre ces parois, l'étape C) à faire coulisser le piston dans ia chambre jusqu'à ce que ces parois soient en position de tyse, l'étape D) à faire tourner le piston sur lui-même de sorte que ces paroi restent en contact l'une avec l'autre et l'étape F} à faire circuler un liquide d'élution entre l'entrée et la sortie fluidique pour récupérer Se ysat par cette sortie ; et
- l'étape A) peut consister à fournir un dispositif selon (xli) ci- dessus, l'étape B) à faire entrer un liquide comportant les espèces à Iyser par l'entrée fluidique, entre la membrane étanche et fa seconde paroi, l'étape C) à faire coulisser le piston dans ia chambre jusqu'à ce que ces parois soient en position de lyse par l'intermédiaire de la membrane, l'étape D) à faire tourner le piston sur lui-même de telle sorte que ces parois restent en contact l'une avec l'autre par l'intermédiaire de ia membrane, et l'étape F) à faire circuler un liquide d'éiution entre entrée fluidique et fa sortie fluidique pour récupérer te lysat par la sortie fluidique.
D'autres caractéristiques de l'invention seront énoncées dans la description détaillée ci-après, faite en référence aux figures annexées qui représentent, respectivement :
les figures 1 et 2, deux vues schématiques en coupe d'un premier mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention ;
la figure 3, une vue schématique en coupe d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention ;
la figure 4, une vue schématique en coupe d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention ;
la figure 5, une vue schématique en coupe d'un quatrième mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention ;
ia figure 6, une vue schématique en coupe d'un cinquième mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention ;
les figures ? et 8. deux vues schématiques en coupe d'un sixième mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention ;
la figure 9, une vue schématique en coupe d'un septième mode de réalisation d'un dispositif de iyse cellulaire selon l'invention ;
la figure 10, une vue schématique en coupe d'un huitième mode de réalisation d'un dispositif de iyse cellulaire selon l'invention ; et les figures 11 et 12, deux vues schématiques en coupe d'un neuvième mode de réalisation d'un dispositif de Iyse cellulaire selon l'invention.
Dans la description, les termes suivants sont définis comme suif :
* Surface rugueuse : Il s'agit d'une surface présentant un paramètre de rugosité de surface Ra moyen, correspondant à ia moyenne arithmétique de mesures de paramètre Ra, supérieur à 0,2 pm, de préférence compris entre 0,2 μηι et 10 pm et encore plus préfèrentîellement entre 0,2 pm et 3 pm. (le paramètr ou coefficient de rugosité moyen de surface Ra est établi à partir d'une mesure au profilomètre, comme détaxé par Sa suite) ;
* Microporeux. : il s'agit d'une paroi ou d'une couche de matériau comprenant des pores ouverts suffisamment larges pour laisser passer les liquides, tels que l'eau, mais suffisamment étroits pour empêcher de passer les espèces biologiques devant être Iysée ainsi que le matériel biologique issu de la fyse et devant être analysé. Typiquement, une paroi microporeuse au sens de l'invention comporte des pores ouverts ayant un diamètre inférieur à 1 pm, et de préférence inférieur à 0,2 pm. A titre d'exemple, on peut citer les filtres frittes, les filtres en silice poreuse, les filtres en céramique, et tes filtres en polymère poreu ou en métal poreux ;
* Macroporeux; il s'agît d'une paroi, d'une couche ou d'un matériau comprenant des pores ouverts ou des canaux suffisamment larges pour laisser passer les liquides, tels que l'eau, mais également suffisamment large pour laisser passe les espèces biologiques devant être Iysées ou le matériel biologique issu de la lyse et devant être analysé. Typiquement, une paroi macroporeuse au sens de l'invention comporte des pores ouverts ou des canaux ayant un diamètre supérieur à 0,2 pm, et de préférence supérieur à 1 pm. A titre d'exemple, on peut citer une couche de verre, de métal ou de polymère munie de canaux traversant la couche ;
* Espèce biologique ; notamment des cellules, micro-organismes, en particulier bactéries, spores, virus, champignons, microalgues.
Afin de réaliser une lyse d'espèces biologiques, telles que des micro-organismes, des cellules, des spores, etc., l'invention propose un dispositif de lyse mécanique comprenant une première paroi et une seconde paroi montées mobiles l'une par rapport à l'autre, entre une position initiale dans laquelle les première et seconde parois sont écartées l'une de l'autre, et une position de lyse dans laquelle la première paroi est en appui contre Sa seconde paroi.
Les première et seconde parois sont également montées mobiles en cisaillement l'une par rapport à f autre, dans la position de lyse, c'est-à-dire l'une en appui contre l'autre. Le cisaillement peut être obtenu par une rotation ou par une translation de la première paroi par rapport à ia seconde paroi. L'invention prévoit donc deux degrés de liberté entre tes parois ; un degré de liberté pour approcher les parois Tune au contact de l'autre, et un degré de liberté pour permettre un cisaillement lorsque les parois sont en appui Tune contre l'autre.
Selon l'invention, l'une au moins des première et seconde parois a une surface rugueuse d'appui contre l'autre paroi. En d'autres termes, la surface rugueuse présente un paramètre de rugosité de surface Ra moyen, compris entre 0,2 pm et 10 pm, de préférenc entre 0,2 pm et 3. pm.
A tire -d'exemple de pression d'appui, des tests ont été réalisés en utilisant une iame de verre dépolie et une lame de verre classique maintenues entre Se pouce et l'index d'une main. La seule force des doigts appliquée en pression et en Cisaillement suffit à obtenir une lyse des espèces placées entre les deux lames.
Un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention est illustré aux figures 1 et 2.
À la figure 1 , le dispositif selon l'invention est en position initiale dans laquelle les première et seconde parois sont écartées l'une de l'autre.
Le dispositif de lyse mécanique 1 comprend une chambre 10 et un piston 20 monté mobile en translation dans la chambre 10 entre l positio Initiale (figure 1 } et la position de lyse (figure 2), Un joint (non illustré) est prévu entre le piston et ia chambre pour assurer rétanchéité. La premièr paroi 21 est montée sur le piston mobile 20 et la seconde paroi 11 est agencée en regard de ia première paroi 21. Dans ce mode de réalisation, la seconde paroi 11 est microporeuse afin de permettre au liquide. L comportant les cellules C à iyser de diffuser à travers la seconde paroi 11 lorsque le piston 20 est abaissé jusqu'à la position de lyse dans laquelle les deux parois 11 et 21 sont en contact Tune de l'autre (figure 2). La seconde paroi 11 est par exemple un filtre poreux en polymère. Avantageusement, la chambre 10 comporte, en outre, une sortie flusdique 2 agencée à l'opposé de la premièr paroi 21 par rapport à la seconde paroi microporeuse 11, permettant l'évacuation du liquide ainsi que des espèces iysées. Dans une alternativ non illustrée, un réservoir peut remplacer la sortie fluidique, pour recevoir le liquide,
La paroi microporeuse 11 présente un diamètre moyen de pores compris entre 0,2 m et 0,5 p , Le diamètre des pores est adapté pour assurer que le liquide diffuse à travers la paroi 11 , mais que tes cellules intègres (Le. avant la lyse) restent à la surface de la paroi à la surface de laquelle elles sont Iysées. Le matériel biologique à étudie (ADN, protéines, etc.) libéré par la lyse peut passer a travers .le filtre ou rester à la surface de ce dernier, pour être récupéré,
Dans le mode dé réalisation illustré aux figures 1 et 2, c'est la paroi 21 portée pa le piston 20 qui présente une surface d'appui rugueuse 22 contre l'autre paroi. Autrement dit, la paroi microporeuse 1 présente une surface 13 non rugueuse, alors que la paroi non microporeuse 21 présente une surface 22 rugueuse, par exemple une surface abrasive.
Alternativement, comme illustré à la figure 3, c'est la paroi microporeuse 11 contr laquelle est disposée une surface 4 rugueuse. Par exemple, la paroi microporeuse rugueuse 11 est constituée d'une couche 11 de matériau microporeux ayant une surface 13 plane sur laquelle est positionnée une couche rugueuse 14 destinée à être en appui contre la paroi 21 du piston 20 en position de lyse. Dans ce mode de réalisation, la couche rugueuse 14 doit pouvoir laisser passer le liquide dans lequel se trouvent les cellules à Iyser. A titre d'exemple, on peut utiliser une couche rugueuse 14 de 500 pm, à 2 mm d'épaisseur, et une couche microporeuse 1 1 d 50.0 pm à 5 mm d'épaisseur. La couche rugueuse 14 est constituée d'un matériau poreux abrasif, par exemple une grille métallique.
La figure 4 illustre un mode de réalisation alternatif de paroi microporeuse 11 rugueuse.
Dans ce mode de réalisation, la paroi microporeuse rugueuse 11 est constituée d'une couche de matériau microporeux ayant une surface 15 rugueuse, par exemple microstructurée. Autrement dit, la rugosité de la surfac 15 est obtenue par microsiruciuration d'un matériau microporeux. Cette couche 11 de matériau microporeux peut égalemen être constituée d'un filtre abrasif, tel qu'un fiitré fritté, une silice poreuse, une céramique, urt polymère poreux* Il s'agit par exempte d'un filtre en acier Inoxydable, se présentant sous la forme d'une grille.
Quel que soit le mode de réalisation représenté sur les figures
I à 4, la paroi microporeuse 11 permet de retenir les espèces biologiques à lyser, tout en laissant s'écouler le liquide biologique. Suite â l'opération de lyse, les espèces biologiques lysêes s'écoulent à travers la paroi microporeuse .
La figure 5 illustre un quatrième mode de réalisation alternatif de paroi microporeuse 11 rugueuse.
Dans ce mode de réalisation, la paroi microporeuse rugueus
I I est constituée d'une couche macroporeuse 16 ayant une surface 17 rugueuse, et d'une couche microporeuse 18, positionnée sur la couche macroporeuse 18 et destinée à être en appui contre la première paroi 21 portée par le piston 20, en position de lyse.
La couche microporeuse 18 doit être suffisamment souple et fine pour épouser la rugosité de la surface 17 de la couche macroporeuse 16 en position de lyse, afin que la rugosité de la couche macroporeuse 16 transparaisse à travers la couche microporeuse 18 et que les cellules puissent être lysées. Grâce à la couche microporeuse 18, les espèces biologiques à fyser sont retenues et peuvent être lysées.
La figure 8 illustre un cinquième mode de réalisation dans lequel la première paroi 21 et Sa seconde paroi 11 sont toutes les deux rugueuses, c'est-à-dire qu'elles oni toutes les deux une surface 22-14 rugueuse. Eiles peuvent être constituées par une combinaison des modes de réalisation des figures 1 et 3, une combinaison des modes d réalisation des figures 1 et 4 ou un combinaison des modes de réalisation des figures 1 et 5.
les figures 7 et 8 illustrent un sixième mode de réalisation permettant une mise en œuvre facilitée de iyse et de récupération du matériel biologique à analyser.
Dans ce mode de réalisation, la chambre 10 comporte, en outre, une entrée fluidique 30 et une sortie fluidique 40 agencée, vue e coupe, entre ies première et seconde parois 21-11 lorsqu'elles sont en position initiale.
En position initiale, du liquide L comportant ies cellules C à fyser est introduit dans la chambre 10, entre la première paroi 21 et la seconde paroi 11 , en ouvrant la vanne VI de l'entrée fluidique 30, et e fermant ies vannes V2 et V3, respectivement des sorties fluidiques 12 et 4P, Cette étape permet de placer les cellules biologiques C à lyser entre les première et seconde parois 21-1 1.
Une fois la chambre 10 remplie de liquide, la vanne V1 est fermée, et la vanne V2 est ouverte. Le piston 20 est alors amené en position de Iyse selon la flèche FI (figure S). Le liquide peut s'écouler à travers la paroi microporeuse 11 et être évacué selon la flèche F3 par la sortie fluidique 12 agencée à l'opposé de is première paroi 21 par rapport à la seconde paroi microporeuse 11.
Ainsi, seules ies cellules biologiques C à lyser restent sur la paroi microporeuse 11.
Une fois que le piston 20 portant la première paroi 21 est en appui contre la seconde paroi microporeuse 1 1 en position de Iyse, le piston 20 est mis en rotation selon Sa flèche F2 pour générer un cisaillement entre les première et seconde parois 21 et 11 et provoquer la iyse mécanique des cellules biologiques et obtenir un lysat Durant cette étape, représentée sur la figure S, les vannes V1 ( V2 et V3 restent fermées. Puis tes première et seconde parois 21 et 1 sont écartées l'une de l'autre, jusqu'à ce qu'elles soient en position initiale, en remontant le piston 20 dans la chambre 10 dans le sens inverse de la flèche F1.
Il est alors possible de récupérer le lysat de cellules biologiques.
Dans le mode de réalisation des figures ? et 8, cette récupération est obtenue en ouvrant les vannes V1 et V3, et en faisant circuler un liquide d'élution entre l'entrée 30 et fa sorti fiuidique 40 pour collecter te matériel biologique Iyse. Puis le liquide de nettoyage comprenant le lysat est récupéré par la sortie fiuidique 40.
La sortie fiuidique 40 peut directement être reliée de manière fiuidique à un appareil d'analyse.
Toutes ces opérations peuvent être faites dans un circuit fermé et étanche évitant toute contamination du lysat. En effet, il n'est pas nécessaire de retirer des billes du lysat, comme dans les procédés actuels. En outre, le matériel biologique récupéré ne risque pas d'être endommagé par des produits chimiques, cassé par des ultrasons, ou déstructuré par la chaleur,
Le cisaillement des cellules biologiques entre deux parois, dont une au moins est rugueuse, permet une Iyse en quelques secondes, avec un dispositif simple, compact et peu onéreux.
La figure 9 illustre un septième mode de réalisation évitant de nettoyer le piston après chaque Iyse.
Dans ce mode de réalisation, la chambre comporte, en outre, un membrane étanche 50 agencée entre la première paroi 21 , l'entrée 30 et la sortie fiuidique 40. La membrane 50 doit être suffisamment fine et souple pour épouser, en position de Iyse, la rugosité de la paroi rugueuse, qui peut êtr portée par le piston et/ou par la chambre,
A titre d'exemple, on peut utiliser un film polymère ou en piastique d'épaisseur comprise entre 50 pm et quelques centaines de μη% par exemple 100 prn, la paroi rugueuse et microporeuse pouvant être un filtre en acier inoxydable.
Après la Iyse, le piston peut être récupéré sans avoir à être nettoyé, et la chambre peut être soit nettoyée pou une prochaine Iyse. soit éliminée.
Cett solution est envisageable grâce â ia possibilité d'intégrer le dispositif selon l'invention dans un système de type « lab-on-a* chip » en anglais, ou « laboratoire sur puce ». La chambre est alors constituée dans la puce, par l'espace situé entre l'entrée fiuidique, (a sortie fiuidique et l seconde paroi rugueuse.
Dans ce cas, l'utilisation d'une membrane et d'un piston rapportés permet d'effectuer fa Iyse sur une puce â usage unique, de récupérer le lysaî, puis d'élimine la puce. La membrane peut être lavée ou éliminée, et le piston est récupéré sans avoir à être lavé pour une utilisation ultérieure, sur un autre consommable.
Bien entendu, on comprend que le mot « piston » couvre, dans ce cas, toute pièce permettant d'appliquer un cisaillement mécanique des cellules contre là paroi de la chambre, cette pièce n'ayant pas nécessairement la forme classique d'un piston. C'est ainsi la membrane qui assure i'étanehéité, et non le piston qui peut alors avoir n'importe quelle forme.
il pourrait s'agir, par exemple, d'une spatule métallique appliquée en cisaillement par {'utilisateur, ou d'un tournevis automatique. Le terme « tournevis automatique » désigne un piston 60 présentant une partie supérieure et une partie inférieure, tel que, lorsque ia partie supérieure décrit une translation, la partie inférieure du piston décrit un mouvement de rotation lorsqu'une résistance s'oppose à sa translation, La mise en œuvre d'un tel dispositif est illustrée à la figure 10 dans laquelle 1e piston 60 présente des dimensions (ici ia largeur 1, vue en coupe) inférieures aux mêmes dimensions (ici ia largeur 2, vue en coupe) de ia chambre, de sorte que te cisaillement n'est pas obtenu nécessairement par rotation du piston 60, mais peut également être obtenu par translation, comme illustré par la flèche F4,
Les figures 11 et 12 illustrent un autre mode de réalisation dans lequel c'est le piston 70 qui présente un paroi 71 microporeuse. Ainsi, lorsqu'il est descendu en position de lyse contre la seconde paroi 11 (lisse ou rugueuse) dé la chambre 10, le liquide L diffuse à travers la paroi microporeuse 71 du piston 70 selon le sens des flèches F5, et peut être évacué, par exemple en renversant Sa chambre 10 ou en aspirant le liquide L. Ce mode de réalisation peut également être combiné avec une chambre présentant une entrée et une sortie fluîdique (non illustré).
Le dispositif et le procédé selon l'invention permettent d'obtenir une Jyse très rapide d'espèces biologiques, sans nécessiter l'ajout de moyens complémentaires de lyse dans la chambre de lyse ( iSSe, réactif chimique, apport de chaleur, ultrasons, etc.).
La mise en œuvre est simple et peut être réalisée manuellement ou automatiquement.
En plus d'être plus rapide, le procédé selon l'invention est plus efficace que l procédé de référence (broyeur Precellys© (Bertin)}.
L'efficacité de la lyse est déterminé indirectement par la quantité d'ADN libérée après la lyse. Cette quantité d'ADN est évaluée par « q-PCR ».
Les espèces, en contact avec une surface rugueuse, sont soumises à des forces de cisaillement et de pression à l'aide soiî d'une surface non rugueuse, telle que la surface d'une spatule métallique ou d'un cône de pipette en plastique, soit à l'aide d'une seconde surface rugueuse (cas d'une lame de verre dépôts sur verre dépoli). Les espèces sont broyées pendant une durée de 2 secondes afin de libérer au moins un des constituants cellulaires dans 1e milieu (ADN, ARN, protéine,...}.
Par exemple, te procédé a été testé dans les configurations suivantes :
* verre dépoli (Ra ~ 0,425 pm) / cellules biologiques / verre dépoli (Ra - 0,425 pm) ;
* embout de pipette plastique (Ra non mesurable / cellules biologiques / Verre dépoli (Ra - 0,425 pm) ;
*> spatule plate métallique (Ra < 0,2 pm) / film polymère / cellules biologiques / verre dépoli (Ra - 0,425 pm) sur lequel on a appliqué un filtre polymère poreux, par exemple un filtre « Cyclopore Polycarbonate » de porosité 0,4 pm, commercialisé par Whatmar* (référence) et filmé ;
* PMMA dépoli par sablage (Ra = 0,92 pm cellules biologiques / PivtfvIA dépoli (Ra ~ 0,92 pm) ;
* embout de pipette plastique (Ra non mesurable) / cellules biologiques / PMMA dépoli (Ra ~ 0,92 pm) ;
* spatule piaîe métallique (Ra < 0,2 pm) / film plastique / cellules biologiques / PIvtfVIA dépoli (Ra « 0,92 pm).
L'utilisation du film plastique est destinée à éviter la contamination des espèces lors de l'utilisation d'une spatule en acier. il est à noter que :
* deux types de verre dépoli (Ra - 0,425 pm - Ra ~ 1 ,98 pm), ont été testés,
» le procédé a été validé sur des espèces réputées difficiles à lyser, telles les spores Bg {Sadilus giobigii), Bs {Baciilus subiilis),
* les lyses ont été réalisées à sec ou dans un volume de 0,5 pL à S pL de solution aqueuse,
» les lyses ont été réalisées sur un nombre de spores compris entre 100 et 105 spores par lyse. Chaque de paramètre de rugosité Ra a été déterminé de la façon suivante :
·- mesure d'un profil brut à l'aide d'un profifomètre « Talysurf »,
- établissement d'un profil primaire en appliquant un filtrage de forme (dit « fprm removai ») au profil brut,
- établissement d'un profil de rugosité en appliquant un filtre « roughness filter » au profil primaire,
~ détermination du paramètre Ra à partir dudit profil de rugosité.
Une première série d'essais a visé s comparer l'efficacité du procédé selon l'invention (deux déclinaisons : verre sur verre, et verre sur plastique) avec la méthode de référence par Preceiiys (Berîin). La quantité d'ADN libéré après la lyse des spores est évalué par « q-PCR », à l'aide d'une machine <x Stratagene » (Agiiènt) étalonnée conformément aux instructions du constructeur.
Les résultats de la première déclinaison ont été les suivants ;
1. Avec ia « PC » sur des spores lysées pa Precellys (Bertin), on a obtenu un Ct (« Cycle Threshold » en anglais) égal à 31,
2. Le procédé selo l'invention a été appliqué à la même solution de spores dans la déclinaison verre sur verre, c'est-à-dire qu'on a iysé les spores entre deux lames de verre dépoli de Ra - 0,425 pm. Avec la « PCR » sur les spores lysées par le procédé selon l'invention, on a obtenu un Ct égai à 30, ce qui indique que la concentration en spores lysées est deux fois supérieure à celle de l'essai précédent.
3. Un « PCR » directe a été réalisée sur un témoin non Iysé, et l'on a obtenu un Ct égal à 3$ ,5 (la plupart des spores ne sont pas lysées dans la solution initiale).
Les résultats de la seconde déclinaison ont été les suivants : 1. Avec ia « PCR » sur des spores lysées par Preceiiys (Bertin), on a obtenu un Ct égal à 3Q.
2. Le procédé selon l'invention a été appliqué à la même solution de spores dans la déclinaison verre sur cône de: pipette en plastique, c'est-à-dire qu'o a lysé les spores entre une lame de verre de Ra - 0,425 pm et un cône de pipette en plastique. La « PCR » sur les spores lysées par le procédé selon ['invention a conduit à un Ci égal à 20 ce qui indique que la concentration en spores lysées est deux fois supérieure à Fessai précédent,
3. Avec une « PCR » directe réalisée sur un témoin non lysé, on a obtenu un Ct égal à 38 (la plupart des spores ne sont pas lysées dans la solution initiale).
Ces résultats montrent :
1. que le procédé selon l'invention conduit a une lyse des spores (01-30 ou 29 contre 35,5 ou 36 pour le témoin). Il y a au moins 5 Ct d'écart entre la solution Iysée par le procédé selon l'invention et la solution non Iysée, ce qui correspond à un ratio de 2*.
2. que le procédé est plus efficace que 1e procédé de lyse de référence : âÇt~1 (30-31 et 29-3.0), c'esî-à-dire que l procédé selon l'invention permet de récupérer deu fols plus de matériel.
Une seconde série d'essais a visé à contrôler la non- adsprption et la non-dégradation de i'ADN par les surfaces mises en jeu dans le procédé selon l'invention.
On a comparé :
1 » Une « PC > directe réalisée sur une solution d'ADN pur + spores, avec obtention d'un Ci égal a 31 , à
2. Une « PCR » réalisée sur une solution d'ADN pur + spores soumise â une lyse réalisée conformément au procédé selon l'invention dans la déclinaison verre sur cône de pipette en plastique, avec obtention d'un Ct égal a 31, Ces résultats montrent que ta « PCR » sur la solution d'ADN pur + spores donne les mêmes résultats que lorsque la solution a subi le procédé selon l'invention. Par conséquent :
1. Le procédé ne détruit pas i'AD .
2. Il n'y a as d'adsorpiion de f'ADN par les surfaces.
3. La récupération des échantillons est efficace (pas de pertes car même Gt).

Claims

REVENDICATIONS
L Dispositif de iyse mécanique (1) d'espèces biologiques (C) présentes dans un fluide -comprenant une première paroi (21 , 71) et une seconde paroi {11} montées mobiles l'une par rapport à l'autre, entre une position initiale dans laquelle les première et seconde parois sont écartées l'une de l'autre, et une position de Iyse dans laquelle la première paroi est en appui contre la seconde paroi, les première et seconde parois étant également montées mobiles en cisaillement l'une par rapport à l'autre dans la position de Iyse, caractérisé en ce que l'une au moins des première et seconde parois a une surface d'appui rugueuse contre l'autre paroi et présente un paramètre de rugosité de surface Ra moyen compris entre 0,2 pm et 10 pm, et préférentieiiement entre 0,2 pm et 3 pm.
2. Dispositif de Iyse mécanique {1) selon la revendication 1 , dans lequel l'une des première paroi (21 , 71) et seconde paroi (11) est une paroi microporeuse (11, 71 ), c'est-à-dire poreuse aux liquides et non poreuse aux espèces biologiques (C) devant être lysées.
3. Dispositif de iyse mécanique (1) selon là revendication 2, dans lequel la paroi microporeuse (11 , 71 ) présente un diamètre moyen de pores inférieur à 1 pm, voire inférieur à 0,2 pm.
4. Dispositif de iyse mécanique (1) selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, dans lequel la paroi microporeuse (11 ) est rugueuse,
5* Dispositif de Iyse mécanique (1 ) selon la revendication 4, dans lequel la paroi microporeuse rugueuse (11) est constituée d'une couche de matériau microporeux (11) ayant une surface plane sur laquelle est positionnée une couche rugueuse (14) destinée a être en appui contre l'autre paroi (21 ) en position de Iyse.
6. Dispositif de Iyse mécanique (1 ) selon la revendication 4, dans lequel la paroi mieroporeuse rugueuse (11 ) est constituée d'une couche de matériau microporeux (1 1) ayant une surface rugueuse (1.5),
7, Dispositif de lyse mécanique (1 ) selon la revendication 4,. dans lequel la paroi mlcroporeuse rugueuse (11) est constituée d'une couche de matériau macroporeux (16) ayant une surface rugueuse (1 ?) sur laquelle est positionnée une couche mlcroporeuse (18) destinée à être en appui contre l'autre paroi (2.1 ) en position de lyse, la couche microporeuse (18) étant suffisamment souple et fine pour épouser la rugosité de la surface de la couche de matériau macroporeux (18) en position de lyse.
S, Dispositif de lyse mécanique (1) selon furie quelconque des revendications 2 ou 3, dans lequel Sa paroi microporeuse (11 ) est non rugueuse et présente un paramètre de rugosité de surface Ra moyen inférieur à 0,1 pm, alors que la paroi non microporeuse (21 ) est rugueuse eî présente un paramètre de rugosité de surface Ra moyen compris entre 0,2 ;um et 10 pm, préférentieilement entre 0,2 m et 3 pm.
9. Dispositif de lyse mécanique (1) selon Tune quelconque des revendications 4 à 7, dans lequel la première paroi (21) et la seconde paroi (1 1 ) sont rugueuses.
10. Dispositif de lyse mécanique (1) selo l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une chambre (10) et un piston (20) monté mobile dans la chambre entre la position initiale et la position de lyse, la premièr paroi (21 ) étant montée sur le piston mobile et la seconde paroi (11 ) étant agencé en regard de la première paroi.
11. Dispositif de lyse mécanique (1 ) selon la revendication 10 lorsqu'elle dépend d l'une des revendications 2 à 9, dans lequel la seconde paroi ( 1) est rnicroporeuses et dans lequel la chambre (10) comporte, en outre, une sortie fiusdîque (12) agencée à l'opposé de te première paroi (21) par rapport à la seconde paroi mieroporeuse {11 },
12. Dispositif de lyse mécanique (1) selon Tune quelconque des revendications 2 à 11 , dans lequel la chambre {10) comporte, en outre, une entrée fluidique (30) et une autre sortie fluidique (40).
13. Dispositif de lyse mécanique (1). selon la revendication 12 lorsqu'elle dépend de la revendication 11, dans lequel ia chambre (10) comporte, en outre, une membrane éianch (50) agencée entre ia première paroi (21), l'entrée fluidique (30) et la sortie fluidique (40), ia membrane étant suffisamment fine et souple pour épouser la rugosité de l'une au moins des première et seconde parois (21 et 11 ) en position de lyse,
14. Procédé de lyse mécanique d'espèces biologiques (CJ, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
A) Fourniture d'un dispositif (1 ) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, de telle sorte que les première et seconde parois (21 et 11) soient en position initiale ;
B) Placer les espèces biologiques à lyser entre les première eî seconde parois ;
C) Amener les premièr et seconde parois en position de lyse ;
D) Générer un cisaillement entre les première et seconde parois en position de lyse, pour provoquer la lyse mécanique des espèces biologiques et obtenir un iysat ;
E) Écarter les première et seconde parois jusqu'à ce qu'elles soient en position initiale ; et
F) Récupérer le Iysat des espèces biologiques,
15. Procédé de lyse mécanique d'espèces biologiques (C). selon la revendication précédente, dans lequel :
l'étape Â) consiste à fournir un dispositif (1 ) selon la revendication 10, - l'étape C) consiste à faire coulisser te piston (20) dans la chambre (10) jusqu'à ce que les première et seconde parois (21 et 11 ) soient en position de lyse ; et
- l'étape D) consiste à faire tourner ie piston sur lui-même de telle sorte que les première et seconde parois restent en contact l'une avec 'l'autre.
16. Procédé de lyse mécanique d'espèces biologiques (C) selon la revendication précédente dans lequel :
- l'étape A) consiste à fournir u dispositif (1 } selon la revendication 11 ;
- l'étape B) consiste à placer un liquide comportant les espèces biologiques à fyser entre les première et seconde parois (21 et 11) ;
- f étape C) consiste à faire coulisser le piston dans la chambre jusqu'à ce que le liquide ait été filtré à travers la paroi microporeuse (11 ), que seules les espèces biologiques à lyser restent sur la paroi microporeuse (11 ) et que les première et seconde parois soient en position de lyse ; et
- l'étape D) consiste à faire tourner le piston (20) sur lui-même de telle sorte que les première et seconde parois restent en contact l'une avec l'autre,
17. Procédé de lyse mécanique d'espèces biologiques (C) selon la revendication précédente, dans lequel :
- {'étape A) consiste à fournir un dispositif (1) selon Sa revendication 12 ;
- l'étape S) consiste à faire entrer un liquide comportant !es espèces biologiques à iyser par l'entrée fluidique (30), entre tes première et seconde parois (21 et 11 ) ;
~ l'étape C) consiste à faire coulisser te piston (20) dans ia chambre (10) jusqu'à ce que tes première et seconde parois soient en position de lyse ;
~ l'étape D) consiste à faire tourner (e piston sur lui-même de telle sorte que les première et seconde parois restent en contact l'une avec l'autre ; et - l'étape F) consiste à fair circuler un liquide d'élution entre l'entrée fiuidique (30) et fa sortie fiuidique (40) pour récupérer te lysat par la sortie fiuidique,
18. Procédé de Syse mécanique d'espèces biologiques (Ç) selon la revendication précédente, dans lequel :
- l'étape A) consiste à fournir un dispositif (1 } selon la revendication 13,
• l'étape B) consiste à faire entrer un liquide comportant les espèces biologiques à iyser par l'entrée fiuidique (30), entre la membrane étanche (50) et la seconde paroi (11 ) ;
- l'étape C) consiste à faire coulisser le piston (20) dans la chambre (10) jusqu'à ce que les première et seconde parois (21 et 1 1 ) soient en position de îyse par l'intermédiaire de la membrane étanche ;
- l'étape D) consiste à faire tourner le piston su lui-même de telle sorte que les première et seconde parois restent en contact l'une avec l'autre par l'intermédiaire de la membrane étanche ; et
- l'étape F) consiste à faire circuler un liquide d'élution entre l'entrée fiuidique (30) et ia sortie fiuidique (40) pour récupérer le lysat par la sortie fiuidique.
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