ES2834382T3 - Dispositivo de lisis de especies biológicas y procedimiento puesto en práctica por este dispositivo - Google Patents

Abstract

Dispositivo de lisis mecánica (1) de especies biológicas (C) presentes en un fluido, que comprende una primera pared (21, 71) y una segunda pared (11) montadas móviles una respecto a la otra entre una posición inicial, en la que las paredes primera y segunda se hallan distanciadas una de la otra, y una posición de lisis, en la que la primera pared queda apoyada contra la segunda pared, estando asimismo las paredes primera y segunda montadas móviles a cizalladura una respecto a la otra en la posición de lisis, caracterizado por que una al menos de las paredes primera y segunda tiene una superficie de apoyo rugosa contra la otra pared y presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio comprendido entre 0,2 μm y 10 μm, y preferiblemente entre 0,2 μm y 3 μm.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo de lisis de especies biológicas y procedimiento puesto en práctica por este dispositivo

La invención se refiere a un dispositivo de lisis de especies biológicas (microorganismos, bacterias, células, esporas, etc.) y a un procedimiento puesto en práctica por este dispositivo.

Se necesita la lisis de células biológicas para recoger y estudiar el material intracelular. Por ejemplo, se necesita la lisis celular para recoger el ADN de la célula en vistas a una replicación y a un análisis, tal como una comparación de ADN.

Los métodos utilizados convencionalmente para la lisis de especies biológicas son los siguientes:

• la lisis química: esta técnica comprende la puesta en contacto de las células con una solución de lisis, que generalmente contiene un detergente que hace que las células se rompan. Esta técnica es eficaz, pero puede ser peligrosa para ciertos materiales celulares. Adicionalmente, es lenta y precisa de numerosas manipulaciones, entre ellas una etapa de purificación de la solución de lisis y, eventualmente, de concentración del lisado, lo cual la vuelve lenta, con un riesgo de perder una gran cantidad de material biológico en la purificación y en la concentración, y precisa de la intervención de una persona especializada; esta técnica no es eficaz para la lisis de las esporas.

• La lisis por choque térmico: esta técnica comprende, por ejemplo, la incubación del extracto a una temperatura inferior a 0 °C, inmediatamente seguida de la incubación del extracto a una temperatura de al menos 95 °C, preferentemente aproximadamente 100 °C. Esta técnica precisa de un material complejo, especialmente si se desea lisar esporas.

• La lisis por campo eléctrico: esta técnica comprende la utilización de una diferencia de potencial que conduce a la rotura de la membrana celular. Esta técnica precisa de un material complejo y, a semejanza de los anteriores métodos, está poco adaptada para la lisis de esporas.

• La lisis mecánica: esta técnica se basa en la agitación del extracto en presencia de bolas con el fin de que los choques de las bolas contra las células rompan estas últimas. Esta técnica precisa de un material complejo. Adicionalmente, es preciso utilizar bolas cumplidamente desprovistas de microorganismos, y recogerlas después de la lisis. Son ejemplos de dispositivos que llevan a la práctica este procedimiento los trituradores de muestras biológicas de la gama Precellys© de la firma Bertin technologies. Se trata de dispositivos caros y aparatosos, difícilmente integrables en un instrumento compacto.

• La lisis por presión: esta técnica comprende la aplicación de una presión hidrostática sobre las células, que conduce a la rotura de su membrana. Esta técnica precisa de un material complejo.

Entre los procedimientos de lisis por trituración mecánica, cabe citar los siguientes documentos:

• el documento FR 2781500, que describe un procedimiento de lisis mecánica de microorganismos mediante movilización de los medios de trituración por un campo magnético; y

• el documento US 2003/0066915, que describe un procedimiento de lisis mecánica de microorganismos mediante movilización de los medios de trituración por ultrasonidos.

Los documentos WO-A1-99/02958 y US-A-5114858 dan a conocer sendos dispositivos de lisis mecánica de especies biológicas que comprenden una primera y una segunda paredes móviles una respecto a la otra, entre una posición inicial, en la que se hallan distanciadas una de la otra, y una posición de lisis, donde la primera pared en configuración de pistón queda apoyada contra la segunda pared, estando las paredes primera y segunda montadas móviles a cizalladura una respecto a la otra en la posición de lisis. Los pistones presentados en estos dos documentos van provistos de salientes macroscópicos que determinan un dentado triturador, por lo que no confieren una microrrugosidad a las correspondientes superficies de apoyo de estos pistones.

Todas estas técnicas son complejas y precisan de un considerable equipo. Adicionalmente, precisan de un considerable tiempo de preparación, y de un tiempo de lisis de varias decenas de segundos a varios minutos. Además, son difícilmente integrables en instrumentos portátiles y compactos.

El objetivo de la presente invención es, pues, proponer un aparato y un procedimiento de lisis de especies biológicas simple, poco costoso y fácilmente integrable en un equipo de laboratorio o en un dispositivo portátil, y que presente una elevada eficiencia de lisis, en particular sobre esporas, permitiendo una lisis satisfactoria (al menos el 50 % de las especies biológicas lisadas) en menos de 10 segundos, e incluso en 1 segundo.

Para ello, la invención propone realizar un aparato y un procedimiento de lisis mecánica que ponen en práctica una superficie rugosa contra la cual los objetos que han de lisarse se trituran mediante un movimiento de fricción (cizalladura) y no mediante choques o una mera presión.

Para este fin, la invención tiene por objeto un dispositivo de lisis mecánica de especies biológicas presentes en un fluido, que comprende una primera pared y una segunda pared montadas móviles una respecto a la otra entre una posición inicial, en la que las paredes primera y segunda se hallan distanciadas una de la otra, y una posición de lisis, en la que la primera pared queda apoyada contra la segunda pared, estando asimismo las paredes primera y segunda montadas móviles a cizalladura una respecto a la otra en la posición de lisis, caracterizado por que una al menos de las paredes primera y segunda tiene una superficie de apoyo rugosa contra la otra pared y presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio comprendido entre 0,2 gm y 10 gm, y preferiblemente entre 0,2 gm y 3 gm.

De acuerdo con otras formas de realización del dispositivo según la invención:

(i) (una de las primera pared y segunda pared puede ser una pared microporosa, es decir, porosa a los líquidos y no porosa a las especies biológicas que deban lisarse;

(ii) la pared microporosa puede presentar un diámetro medio de poros inferior a 1 gm, e incluso inferior a 0,2 gm;

(iii) la pared microporosa puede ser rugosa;

(iv) la pared microporosa rugosa puede estar constituida a partir de una capa de material microporoso que tiene una superficie plana sobre la cual está posicionada una capa rugosa destinada a quedar apoyada contra la otra pared en posición de lisis;

(v) de acuerdo con una variante de (iv), la pared microporosa rugosa puede estar constituida a partir de una capa de material microporoso que tiene una superficie rugosa;

(vi) de acuerdo con otra variante de (iv), la pared microporosa rugosa puede estar constituida a partir de una capa de material macroporoso que tiene una superficie rugosa sobre la cual está posicionada una capa microporosa destinada a quedar apoyada contra la otra pared en posición de lisis, siendo la capa microporosa lo suficientemente flexible y fina para amoldarse a la rugosidad de la superficie de la capa de material macroporoso en posición de lisis;

(vii) la pared microporosa puede ser no rugosa y presentar un parámetro de rugosidad superficial Ra medio inferior a 0,1 gm, mientras que la pared no microporosa puede ser rugosa y presentar un parámetro de rugosidad superficial Ra medio comprendido entre 0,2 gm y 10 gm, preferiblemente entre 0,2 gm y 3 gm; (viii) de acuerdo con una variante de (vii), la primera pared y la segunda pared pueden ser rugosas;

(ix) el dispositivo según la invención puede comprender además una cámara y un pistón montado móvil dentro de la cámara entre la posición inicial y la posición de lisis, estando la primera pared montada sobre el pistón móvil y estableciéndose la segunda pared encarada con la primera pared;

(x) la segunda pared del dispositivo puede ser entonces microporosa, y la cámara puede incluir, además, una salida fluídica establecida en oposición a la primera pared respecto a la segunda pared microporosa;

(xi) la cámara, entonces, puede incluir, además, una entrada fluídica y otra salida fluídica; y

(xii) la cámara, entonces, puede incluir, además, una membrana estanca establecida entre la primera pared, la entrada fluídica y la salida fluídica, siendo la membrana lo suficientemente fina y flexible para amoldarse a la rugosidad de una al menos de las paredes primera y segunda en posición de lisis.

Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento de lisis mecánica de especies biológicas que comprende las siguientes etapas:

A) provisión de un dispositivo tal como el antedicho de manera tal que las paredes primera y segunda se hallen en posición inicial;

B) colocar entre estas paredes las especies biológicas que hayan de lisarse;

C) llevar estas paredes a la posición de lisis;

D) generar una cizalladura entre estas paredes en posición de lisis para provocar la lisis mecánica de estas especies y obtener un lisado;

E) distanciar estas paredes hasta que se hallen en posición inicial; y

F) recoger el lisado de las especies biológicas.

El procedimiento según la invención es eficaz, puesto que permite un rendimiento al menos equivalente al método de referencia de lisis de las esporas mediante los trituradores Precellys© (Bertin).

El procedimiento es rápido en relación con el método de referencia (triturador Precellys© (Bertin)): en menos de 10 segundos frente a 30 segundos con el triturador de referencia.

El procedimiento según la invención es económico y directo, pues no requiere adición de sustancias químicas, ni ulterior purificación, ni adición de cuerpos extraños en la muestra (tales como bolas). Adicionalmente, el ADN recogido al término de la lisis por el procedimiento según la invención es directamente analizable (es decir, sin etapa de purificación) con el concurso de las técnicas de biología molecular convencionales, tales como la “PCR” (“Polymerase Chain Reaction” en inglés) o la electroforesis. Finalmente, la liberación se efectúa sin degradación de los ácidos nucleicos de las especies.

De acuerdo con otras formas de realización del procedimiento según la invención:

- la etapa A) puede consistir en proporcionar un dispositivo según la característica (ix) antes señalada, la etapa C), en hacer correr el pistón dentro de la cámara hasta que las paredes primera y segunda se hallen en posición de lisis y, la etapa D), en hacer girar el pistón sobre sí mismo de manera tal que estas paredes permanezcan en contacto una con otra;

- la etapa A) puede consistir en proporcionar un dispositivo según (x) antes señalado, la etapa B), en colocar entre las paredes un líquido que incluya las especies que hayan de lisarse, la etapa C), en hacer correr el pistón dentro de la cámara hasta que el líquido se haya filtrado a través de la pared microporosa, que sobre la pared microporosa solo queden estas especies y que estas paredes se hallen en posición de lisis y, la etapa D), en hacer girar el pistón sobre sí mismo de modo que estas paredes permanezcan en contacto una con otra;

- la etapa A) puede consistir en proporcionar un dispositivo según (xi) antes señalado, la etapa B), en dar entrada a un líquido que incluya las especies que hayan de lisarse por la entrada fluídica, entre estas paredes, la etapa C), en hacer correr el pistón dentro de la cámara hasta que estas paredes se hallen en posición de lisis, la etapa D), en hacer girar el pistón sobre sí mismo de modo que estas paredes permanezcan en contacto una con otra y, la etapa F), en hacer circular un líquido de elución entre la entrada y la salida fluídica para recoger el lisado por esta salida; y

- la etapa A) puede consistir en proporcionar un dispositivo según (xii) antes señalado, la etapa B), en dar entrada a un líquido que incluya las especies que hayan de lisarse por la entrada fluídica, entre la membrana estanca y la segunda pared, la etapa C), en hacer correr el pistón dentro de la cámara hasta que estas paredes se hallen en posición de lisis por mediación de la membrana, la etapa D), en hacer girar el pistón sobre sí mismo de manera tal que estas paredes permanezcan en contacto una con otra por mediación de la membrana y, la etapa F), en hacer circular un líquido de elución entre la entrada fluídica y la salida fluídica para recoger el lisado por la salida fluídica.

Se enunciarán otras características de la invención en la descripción detallada que sigue, llevada a cabo con referencia a las figuras que se acompañan, las cuales representan, respectivamente:

- las figuras 1 y 2, dos vista esquemáticas en sección de una primera forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- la figura 3, una vista esquemática en sección de una segunda forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- la figura 4, una vista esquemática en sección de una tercera forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- la figura 5, una vista esquemática en sección de una cuarta forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- la figura 6, una vista esquemática en sección de una quinta forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- las figuras 7 y 8, dos vista esquemáticas en sección de una sexta forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- la figura 9, una vista esquemática en sección de una séptima forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención;

- la figura 10, una vista esquemática en sección de una octava forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención; y

- las figuras 11 y 12, dos vista esquemáticas en sección de una novena forma de realización de un dispositivo de lisis celular según la invención.

En la descripción, los términos siguientes se definen como sigue:

• superficie rugosa: se trata de una superficie que presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio, correspondiente a la media aritmética de medidas de parámetro Ra, superior a 0,2 gm, preferentemente comprendido entre 0,2 gm y 10 gm y aún más preferentemente entre 0,2 gm y 3 gm (el parámetro o coeficiente de rugosidad medio superficial Ra se establece a partir de una medida con perfilómetro, como se detalla en lo sucesivo);

• microporoso: se trata de una pared o de una capa de material que comprende poros abiertos lo suficientemente anchos para dejar pasar los líquidos, tales como el agua, pero lo suficientemente estrechos para impedir que pasen las especies biológicas que deban lisarse, así como el material biológico procedente de la lisis y que deba analizarse. Típicamente, una pared microporosa en el sentido de la invención incluye poros abiertos que tienen un diámetro inferior a 1 gm, y preferentemente inferior a 0,2 gm. A título de ejemplo, cabe citar los filtros sinterizados, los filtros de sílice porosa, los filtros de cerámica y los filtros de polímero poroso o de metal poroso;

• macroporoso: se trata de una pared, de una capa o de un material que comprende poros abiertos o canales lo suficientemente anchos para dejar pasar los líquidos, tales como el agua, pero, asimismo, lo suficientemente anchos para dejar pasar las especies biológicas que deban lisarse o el material biológico procedente de la lisis y que deba analizarse. Típicamente, una pared macroporosa en el sentido de la invención incluye poros abiertos o canales que tienen un diámetro superior a 0,2 gm, y preferentemente superior a 1 gm. A título de ejemplo, cabe citar una capa de vidrio, de metal o de polímero provista de canales pasantes por la capa;

• especie biológica: en especial, células, microorganismos, en particular bacterias, esporas, virus, hongos, microalgas.

Con objeto de realizar una lisis de especies biológicas, tales como microorganismos, células, esporas, etc., la invención propone un dispositivo de lisis mecánica que comprende una primera pared y una segunda pared montadas móviles una respecto a la otra, entre una posición inicial, en la que las paredes primera y segunda se hallan distanciadas una de la otra, y una posición de lisis, en la que la primera pared queda apoyada contra la segunda pared.

Asimismo, las paredes primera y segunda están montadas móviles a cizalladura una respecto a la otra, en la posición de lisis, es decir, apoyada una contra la otra. La cizalladura puede obtenerse mediante un giro o mediante una traslación de la primera pared respecto a la segunda pared. Por lo tanto, la invención prevé dos grados de libertad entre las paredes: un grado de libertad para aproximar las paredes contactando una con la otra, y un grado de libertad para permitir una cizalladura cuando las paredes quedan apoyadas una contra otra.

De acuerdo con la invención, una al menos de las paredes primera y segunda tiene una superficie rugosa de apoyo contra la otra pared. Dicho de otro modo, la superficie rugosa presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio comprendido entre 0,2 gm y 10 gm, preferentemente entre 0,2 gm y 3 gm.

A título de ejemplo de presión de apoyo, se realizaron pruebas utilizando una lámina de vidrio deslustrado y una lámina de vidrio convencional sujetadas entre los dedos pulgar e índice de una mano. La sola fuerza de los dedos aplicada a presión y a cizalladura basta para obtener una lisis de las especies colocadas entre las dos láminas. En las figuras 1 y 2, se ilustra una primera forma de realización de un dispositivo según la invención.

En la figura 1, el dispositivo según la invención se halla en posición inicial, en la que las paredes primera y segunda se hallan distanciadas una de la otra.

El dispositivo de lisis mecánica 1 comprende una cámara 10 y un pistón 20 montado con posibilidad de movimiento de traslación dentro de la cámara 10 entre la posición inicial (figura 1) y la posición de lisis (figura 2). Se prevé una junta (no ilustrada) entre el pistón y la cámara para asegurar la estanqueidad. La primera pared 21 está montada sobre el pistón móvil 20 y la segunda pared 11 se establece encarada con la primera pared 21.

En esta forma de realización, la segunda pared 11 es microporosa, con el fin de permitir que el líquido L que incluye las células C que han de lisarse se difunda a través de la segunda pared 11 cuando es bajado el pistón 20 hasta la posición de lisis, en la que las dos paredes 11 y 21 se hallan en contacto una con otra (figura 2). La segunda pared 11 es, por ejemplo, un filtro poroso de polímero. Ventajosamente, la cámara 10 incluye, además, una salida fluídica 12 establecida en oposición a la primera pared 21 respecto a la segunda pared microporosa 11, permitiendo la evacuación del líquido, así como de las especies lisadas. En una alternativa no ilustrada, un depósito puede sustituir a la salida fluídica, para recibir el líquido.

La pared microporosa 11 presenta un diámetro medio de poros comprendido entre 0,2 gm y 0,5 gm. El diámetro de los poros está adaptado para asegurar que el líquido se difunda a través de la pared 11, pero que las células íntegras (es decir, antes de la lisis) permanezcan en la superficie de la pared en cuya superficie se lisan. El material biológico de estudio (ADN, proteínas, etc.) liberado mediante la lisis puede pasar a través del filtro o permanecer en la superficie de este último, para su recogida.

En la forma de realización ilustrada en las figuras 1 y 2, la pared 21 de la que es portador el pistón 20 es la que presenta una superficie de apoyo rugosa 22 contra la otra pared. En otras palabras, la pared microporosa 11 presenta una superficie 13 no rugosa, mientras que la pared no microporosa 21 presenta una superficie rugosa 22, por ejemplo una superficie abrasiva.

Alternativamente, como se ilustra en la figura 3, es la pared microporosa 11 aquella contra la que se dispone una superficie rugosa 14. Por ejemplo, la pared microporosa rugosa 11 está constituida a partir de una capa de material microporoso 11 que tiene una superficie plana 13 sobre la cual está posicionada una capa rugosa 14 destinada a quedar apoyada contra la pared 21 del pistón 20 en posición de lisis. En esta forma de realización, la capa rugosa 14 debe poder dejar pasar el líquido en el que se encuentran las células que han de lisarse.

A título de ejemplo, se puede utilizar una capa rugosa 14 de 500 gm a 2 mm de espesor y una capa microporosa 11 de 500 gm a 5 mm de espesor. La capa rugosa 14 está constituida a partir de un material poroso abrasivo, por ejemplo una rejilla metálica.

La figura 4 ilustra una forma de realización alternativa de pared microporosa 11 rugosa.

En esta forma de realización, la pared microporosa rugosa 11 está constituida a partir de una capa de material microporoso que tiene una superficie rugosa 15, por ejemplo microestructurada. En otras palabras, la rugosidad de la superficie 15 se obtiene mediante microestructuración de un material microporoso. Asimismo, esta capa de material microporoso 11 puede estar constituida a partir de un filtro abrasivo, tal como un filtro sinterizado, una sílice porosa, una cerámica, un polímero poroso. Se trata, por ejemplo, de un filtro de acero inoxidable, materializado en forma de una rejilla.

Cualquiera que sea la forma de realización representada en las figuras 1 a 4, la pared microporosa 11 permite retener las especies biológicas que han de lisarse, al propio tiempo que deja discurrir el líquido biológico. A continuación de la operación de lisis, las especies biológicas lisadas discurren a través de la pared microporosa 11. La figura 5 ilustra una cuarta forma de realización alternativa de pared microporosa 11 rugosa.

En esta forma de realización, la pared microporosa rugosa 11 está constituida a partir de una capa macroporosa 16, que tiene una superficie rugosa 17, y de una capa microporosa 18, posicionada sobre la capa macroporosa 16 y destinada a quedar apoyada contra la primera pared 21 de la que es portador el pistón 20, en posición de lisis. La capa microporosa 18 debe ser lo suficientemente flexible y fina para amoldarse a la rugosidad de la superficie 17 de la capa macroporosa 16 en posición de lisis, con el fin de que la rugosidad de la capa macroporosa 16 trasparezca a través de la capa microporosa 18 y de que puedan lisarse las células. Merced a la capa microporosa 18, se retienen y pueden lisarse las especies biológicas que han de lisarse.

La figura 6 ilustra una quinta forma de realización en la que la primera pared 21 y la segunda pared 11 son, ambas, rugosas, es decir, las dos tienen una superficie 22-14 rugosa. Pueden estar constituidas por una combinación de las formas de realización de las figuras 1 y 3, una combinación de las formas de realización de las figuras 1 y 4 o una combinación de las formas de realización de las figuras 1 y 5.

Las figuras 7 y 8 ilustran una sexta forma de realización que permite una puesta en práctica facilitada de lisis y de recogida del material biológico que ha de analizarse.

En esta forma de realización, la cámara 10 incluye, además, una entrada fluídica 30 y una salida fluídica 40 establecida, vista en sección, entre las paredes primera y segunda 21 -11 cuando éstas se hallan en posición inicial. En posición inicial, se introduce, en la cámara 10, líquido L que incluye las células C que han de lisarse, entre la primera pared 21 y la segunda pared 11, abriendo la válvula V1 de la entrada fluídica 30 y cerrando las válvulas V2 y V3, respectivamente, de las salidas fluídicas 12 y 40. Esta etapa permite colocar las células biológicas C que han de lisarse entre las paredes primera y segunda 21-11.

Una vez llena de líquido la cámara 10, se cierra la válvula V1 y se abre la válvula V2. Entonces, se lleva el pistón 20 a la posición de lisis según la flecha F1 (figura 8). El líquido puede discurrir a través de la pared microporosa 11 y evacuarse según la flecha F3 por la salida fluídica 12 establecida en oposición a la primera pared 21 respecto a la segunda pared microporosa 11.

De este modo, solo permanecen sobre la pared microporosa 11 las células biológicas C que han de lisarse.

Una vez que el pistón 20 portador de la primera pared 21 queda apoyado contra la segunda pared microporosa 11 en posición de lisis, se hace girar el pistón 20 según la flecha F2 para generar una cizalladura entre las paredes primera y segunda 21 y 11 y provocar la lisis mecánica de las células biológicas y obtener un lisado. Durante esta etapa, representada en la figura 8, las válvulas V1, V2 y V3 permanecen cerradas. Seguidamente, se distancian las paredes primera y segunda 21 y 11 una de la otra, hasta que se hallen en posición inicial, ascendiendo el pistón 20 por la cámara 10 en sentido inverso a la flecha F1.

Es posible entonces recoger el lisado de células biológicas.

En la forma de realización de las figuras 7 y 8, esta recogida se consigue abriendo las válvulas V1 y V3, y haciendo circular un líquido de elución entre la entrada 30 y la salida fluídica 40 para recolectar el material biológico lisado. Seguidamente, se recoge por la salida fluídica 40 el líquido de limpieza que comprende el lisado.

La salida fluídica 40 puede estar directamente unida fluídicamente a un aparato de análisis.

Todas estas operaciones pueden llevarse a cabo en un circuito cerrado y estanco que evite toda contaminación del lisado. En efecto, no es necesario retirar bolas del lisado, como en los actuales procedimientos. Adicionalmente, no se corre riesgo de que el material biológico recogido sufra daños por productos químicos, rotura por ultrasonidos o desestructuración por el calor.

La cizalladura de las células biológicas entre dos paredes, de las cuales al menos una es rugosa, permite una lisis en unos pocos segundos, con un dispositivo simple, compacto y poco costoso.

La figura 9 ilustra una séptima forma de realización que evita limpiar el pistón después de cada lisis.

En esta forma de realización, la cámara incluye, además, una membrana estanca 50 establecida entre la primera pared 21, la entrada 30 y la salida fluídica 40. La membrana 50 debe ser lo suficientemente fina y flexible para amoldarse, en posición de lisis, a la rugosidad de la pared rugosa, que puede estar portada por el pistón y/o por la cámara.

A título de ejemplo, se puede utilizar una película de polímero o de plástico de espesor comprendido entre 50 gm y unos cientos de gm, por ejemplo 100 gm, pudiendo ser la pared rugosa y microporosa un filtro de acero inoxidable. Después de la lisis, el pistón se puede recuperar sin tener que limpiarlo, y la cámara, bien puede limpiarse para una próxima lisis, o bien eliminarse.

Esta solución es concebible merced a la posibilidad de integrar el dispositivo según la invención en un sistema de tipo “lab-on-a-chip” en inglés, o “laboratorio en un chip”. La cámara queda entonces constituida, dentro del chip, por el espacio situado entre la entrada fluídica, la salida fluídica y la segunda pared rugosa.

En este caso, la utilización de una membrana y de un pistón postizos permite efectuar la lisis en un chip de un único uso, recoger el lisado y luego eliminar el chip. La membrana puede ser lavada o eliminada, y el pistón se recupera, sin tener que lavarlo, para una ulterior utilización en otro consumible.

Por supuesto, se comprende que la palabra “pistón” cubre, en este caso, toda pieza que permita aplicar una cizalladura mecánica de las células contra la pared de la cámara, sin que esta pieza necesariamente tenga la forma convencional de un pistón. Así, es la membrana la que asegura la estanqueidad, y no el pistón, el cual, entonces, puede tener cualquier forma.

Podría tratarse, por ejemplo, de una espátula metálica aplicada a cizalladura por el usuario, o de un destornillador automático. El término “destornillador automático” designa un pistón 60 que presenta una parte superior y una parte inferior, tal que, cuando la parte superior describe una traslación, la parte inferior del pistón describe un movimiento de giro cuando una resistencia se opone a su traslación. La puesta en práctica de tal dispositivo se ilustra en la figura 10, en la que el pistón 60 presenta unas dimensiones (en el caso presente, la anchura 11, vista en sección) inferiores a las mismas dimensiones (en el presente caso, la anchura 12 vista en sección) de la cámara, de modo que la cizalladura no necesariamente se consigue mediante giro del pistón 60, sino que también puede conseguirse mediante traslación, como se ilustra mediante la flecha F4.

Las figuras 11 y 12 ilustran otra forma de realización en la que el pistón 70 es el que presenta una pared microporosa 71. De este modo, cuando éste se baja a la posición de lisis contra la segunda pared 11 (lisa o rugosa) de la cámara 10, el líquido L se difunde a través de la pared microporosa 71 del pistón 70 según el sentido de las flechas F5, y puede ser evacuado, por ejemplo volcando la cámara 10 o aspirando el líquido L. Esta forma de realización, asimismo, puede combinarse con una cámara que presente una entrada y una salida fluídica (no ilustrado).

El dispositivo y el procedimiento según la invención permiten obtener una lisis muy rápida de especies biológicas, sin precisar de la adición de medios complementarios de lisis en la cámara de lisis (bola, reactivo químico, aportación de calor, ultrasonidos, etc.).

La puesta en práctica es simple y se puede realizar manual o automáticamente.

Además de ser más rápido, el procedimiento según la invención es más eficaz que el procedimiento de referencia (triturador Precellys© (Bertin)).

La eficacia de la lisis se determina indirectamente mediante la cantidad de ADN liberada tras la lisis. Esta cantidad de ADN se evalúa por “q-PCR”.

Las especies, en contacto con una superficie rugosa, se someten a fuerzas de cizalladura y de presión con el concurso, bien de una superficie no rugosa, tal como la superficie de una espátula metálica o de un cono de pipeta de plástico, o bien con el concurso de una segunda superficie rugosa (caso de una lámina de vidrio deslustrado sobre vidrio deslustrado).

Las especies se trituran durante un tiempo de 2 segundos con el fin de liberar al medio al menos uno de los componentes celulares (ADN, ARN, proteína...).

Por ejemplo, el procedimiento se ensayó en las siguientes configuraciones:

• vidrio deslustrado (Ra = 0,425 |jm) / células biológicas / vidrio deslustrado (Ra = 0,425 |jm);

• punta de pipeta plástica (Ra no medible / células biológicas / vidrio deslustrado (Ra = 0,425 jm);

• espátula plana metálica (Ra < 0,2 jm ) / película de polímero / células biológicas / vidrio deslustrado (Ra = 0,425 jm ) sobre el cual se aplicó un filtro de polímero poroso, por ejemplo un filtro “Cyclopore Polycarbonate” de porosidad 0,4 jm , comercializado por Whatman (referencia) y envuelto en película; • PMMA deslustrado por chorro de arena (Ra = 0,92 jm / células biológicas / PMMA deslustrado (Ra = 0,92 jm);

• punta de pipeta plástica (Ra no medible) / células biológicas / PMMA deslustrado (Ra = 0,92 jm);

• espátula plana metálica (Ra < 0,2 jm ) / película plástica / células biológicas / PMMA deslustrado (Ra = 0,92 jm).

La utilización de la película plástica está destinada a evitar la contaminación de las especies con la utilización de una espátula de acero.

Es de señalar que:

• se ensayaron dos tipos de vidrio deslustrado (Ra = 0,425 jm - Ra = 1,98 jm),

• el procedimiento se validó sobre especies señaladas como difíciles de lisar, tales como las esporas Bg (Bacillus globigii), Bs (Bacillus subtilis),

• las lisis se realizaron en seco o en un volumen de 0,5 jL a 5 jL de solución acuosa,

• las lisis se realizaron sobre un número de esporas comprendido entre 100 y 105 esporas por lisis.

Cada parámetro de rugosidad Ra se determinó de la siguiente manera:

- medida de un perfil bruto con el concurso de un perfilómetro “Talysurf”,

- establecimiento de un perfil primario aplicando un filtrado de forma (llamado “form removal”) al perfil bruto, - establecimiento de un perfil de rugosidad aplicando un filtro “roughness filter” al perfil primario,

- determinación del parámetro Ra a partir de dicho perfil de rugosidad.

Una primera serie de ensayos se encaminó a comparar la eficacia del procedimiento según la invención (dos modalidades de configuración: vidrio sobre vidrio y vidrio sobre plástico) con el método de referencia por Precellys (Bertin). La cantidad de ADN liberado después de la lisis de las esporas se evalúa por “q-PCR”, con el concurso de una máquina “Stratagene” (Agilent) calibrada con arreglo a las instrucciones del constructor.

Los resultados de la primera modalidad de configuración fueron los siguientes:

1. Con la “PCR” sobre esporas lisadas mediante Precellys (Bertin), se obtuvo un Ct (“Cycle Threshold” en inglés) igual a 31.

2. El procedimiento según la invención se aplicó a la misma solución de esporas en la modalidad de configuración vidrio sobre vidrio, es decir, que se lisaron las esporas entre dos láminas de vidrio deslustrado de Ra = 0,425 jm . Con la “PCR” sobre las esporas lisadas mediante el procedimiento según la invención, se obtuvo un Ct igual a 30, lo cual indica que la concentración de esporas lisadas es dos veces superior a la del ensayo precedente.

3. Se realizó una “PCR” directa sobre un control no lisado, y se obtuvo un Ct igual a 35,5 (la mayoría de las esporas no están lisadas en la solución inicial).

Los resultados de la segunda modalidad de configuración fueron los siguientes:

1. Con la “PCR” sobre esporas lisadas mediante Precellys (Bertin), se obtuvo un Ct igual a 30.

2. El procedimiento según la invención se aplicó a la misma solución de esporas en la modalidad de configuración vidrio sobre cono de pipeta de plástico, es decir, se lisaron las esporas entre una lámina de vidrio de Ra = 0,425 gm y un cono de pipeta de plástico. La “PCR” sobre las esporas lisadas mediante el procedimiento según la invención condujo a un Ct igual a 29, lo cual indica que la concentración de esporas lisadas es dos veces superior al ensayo precedente.

3. Con una “PCR” directa realizada sobre un control no lisado, se obtuvo un Ct igual a 36 (la mayoría de las esporas no están lisadas en la solución inicial).

Estos resultados muestran:

1. que el procedimiento según la invención conduce a una lisis de las esporas (Ct = 30 ó 29 frente a 35,5 ó 36 para el control). Hay al menos 5 Ct de diferencia entre la solución lisada mediante el procedimiento según la invención y la solución no lisada, lo cual corresponde a un índice de 25.

2. que el procedimiento es más eficaz que el procedimiento de lisis de referencia: ACt = 1 (30-31 y 29-30), es decir, que el procedimiento según la invención permite recoger dos veces más material.

Una segunda serie de ensayos se encaminó a controlar la no adsorción y la no degradación del ADN por las superficies involucradas en el procedimiento según la invención.

Se comparó:

1. una “PCR” directa realizada sobre una solución de ADN puro esporas, con obtención de un Ct igual a 31, con

2. una “PCR” realizada sobre una solución de ADN puro esporas sometida a una lisis realizada de conformidad con el procedimiento según la invención en la modalidad de configuración vidrio sobre cono de pipeta de plástico, con obtención de un Ct igual a 31.

Estos resultados muestran que la “PCR” sobre la solución de ADN puro esporas arroja los mismos resultados que cuando la solución ha pasado por el procedimiento según la invención. Por consiguiente:

1. El procedimiento no destruye el ADN.

2. No hay adsorción del ADN por parte de las superficies.

3. La recogida de las muestras es eficaz (sin pérdidas, porque mismo Ct).

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo de lisis mecánica (1) de especies biológicas (C) presentes en un fluido, que comprende una primera pared (21,71) y una segunda pared (11) montadas móviles una respecto a la otra entre una posición inicial, en la que las paredes primera y segunda se hallan distanciadas una de la otra, y una posición de lisis, en la que la primera pared queda apoyada contra la segunda pared, estando asimismo las paredes primera y segunda montadas móviles a cizalladura una respecto a la otra en la posición de lisis, caracterizado por que una al menos de las paredes primera y segunda tiene una superficie de apoyo rugosa contra la otra pared y presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio comprendido entre 0,2 gm y 10 gm, y preferiblemente entre 0,2 gm y 3 gm.

2. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 1, en el que una de las primera pared (21, 71) y segunda pared (11) es una pared microporosa (11, 71), es decir, porosa a los líquidos y no porosa a las especies biológicas (C) que deban lisarse.

3. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 2, en el que la pared microporosa (11, 71) presenta un diámetro medio de poros inferior a 1 gm, e incluso inferior a 0,2 gm.

4. Dispositivo de lisis mecánica (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que la pared microporosa (11) es rugosa.

5. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 4, en el que la pared microporosa rugosa (11) está constituida a partir de una capa de material microporoso (11) que tiene una superficie plana sobre la cual está posicionada una capa rugosa (14) destinada a quedar apoyada contra la otra pared (21) en posición de lisis.

6. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 4, en el que la pared microporosa rugosa (11) está constituida a partir de una capa de material microporoso (11) que tiene una superficie rugosa (15).

7. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 4, en el que la pared microporosa rugosa (11) está constituida a partir de una capa de material macroporoso (16) que tiene una superficie rugosa (17) sobre la cual está posicionada una capa microporosa (18) destinada a quedar apoyada contra la otra pared (21) en posición de lisis, siendo la capa microporosa (18) lo suficientemente flexible y fina para amoldarse a la rugosidad de la superficie de la capa de material macroporoso (16) en posición de lisis.

8. Dispositivo de lisis mecánica (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que la pared microporosa (11) es no rugosa y presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio inferior a 0,1 gm, mientras que la pared no microporosa (21) es rugosa y presenta un parámetro de rugosidad superficial Ra medio comprendido entre 0,2 gm y 10 gm, preferiblemente entre 0,2 gm y 3 gm.

9. Dispositivo de lisis mecánica (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la primera pared (21) y la segunda pared (11) son rugosas.

10. Dispositivo de lisis mecánica (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por comprender, además, una cámara (10) y un pistón (20) montado móvil dentro de la cámara entre la posición inicial y la posición de lisis, estando la primera pared (21) montada sobre el pistón móvil y estableciéndose la segunda pared (11) encarada con la primera pared.

11. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 10 cuando ésta depende de una de las reivindicaciones 2 a 9, en el que la segunda pared (11) es microporosa, y en el que la cámara (10) incluye, además, una salida fluídica (12) establecida en oposición a la primera pared (21) respecto a la segunda pared microporosa (11).

12. Dispositivo de lisis mecánica (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que la cámara (10) incluye, además, una entrada fluídica (30) y otra salida fluídica (40).

13. Dispositivo de lisis mecánica (1) según la reivindicación 12 cuando ésta depende de la reivindicación 11, en el que la cámara (10) incluye, además, una membrana estanca (50) establecida entre la primera pared (21), la entrada fluídica (30) y la salida fluídica (40), siendo la membrana lo suficientemente fina y flexible para amoldarse a la rugosidad de una al menos de las paredes primera y segunda (21 y 11) en posición de lisis.

14. Procedimiento de lisis mecánica de especies biológicas (C), caracterizado por comprender las siguientes etapas:

A) provisión de un dispositivo (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, de manera tal que las paredes primera y segunda (21 y 11) se hallen en posición inicial;

B) colocar entre las paredes primera y segunda las especies biológicas que hayan de lisarse;

C) llevar las paredes primera y segunda a la posición de lisis;

D) generar una cizalladura entre las paredes primera y segunda en posición de lisis, para provocar la lisis mecánica de las especies biológicas y obtener un lisado;

E) distanciar las paredes primera y segunda hasta que se hallen en posición inicial; y

F) recoger el lisado de las especies biológicas.

15. Procedimiento de lisis mecánica de especies biológicas (C) según la reivindicación anterior, en el que:

- la etapa A) consiste en proporcionar un dispositivo (1) según la reivindicación 10,

- la etapa C) consiste en hacer correr el pistón (20) dentro de la cámara (10) hasta que las paredes primera y segunda (21 y 11) se hallen en posición de lisis; y

- la etapa D) consiste en hacer girar el pistón sobre sí mismo de manera tal que las paredes primera y segunda permanezcan en contacto una con otra.

16. Procedimiento de lisis mecánica de especies biológicas (C) según la reivindicación anterior, en el que:

- la etapa A) consiste en proporcionar un dispositivo (1) según la reivindicación 11;

- la etapa B) consiste en colocar un líquido que incluye las especies biológicas que han de lisarse entre las paredes primera y segunda (21 y 11);

- la etapa C) consiste en hacer correr el pistón dentro de la cámara hasta que el líquido se haya filtrado a través de la pared microporosa (11), que sobre la pared microporosa (11) solo queden las especies biológicas que han de lisarse y que las paredes primera y segunda se hallen en posición de lisis; y - la etapa D) consiste en hacer girar el pistón (20) sobre sí mismo de manera tal que las paredes primera y segunda permanezcan en contacto una con otra.

17. Procedimiento de lisis mecánica de especies biológicas (C) según la reivindicación anterior, en el que:

- la etapa A) consiste en proporcionar un dispositivo (1) según la reivindicación 12;

- la etapa B) consiste en dar entrada a un líquido que incluye las especies biológicas que han de lisarse por la entrada fluídica (30), entre las paredes primera y segunda (21 y 11);

- la etapa C) consiste en hacer correr el pistón (20) dentro de la cámara (10) hasta que las paredes primera y segunda se hallen en posición de lisis;

- la etapa D) consiste en hacer girar el pistón sobre sí mismo de manera tal que las paredes primera y segunda permanezcan en contacto una con otra; y

- la etapa F) consiste en hacer circular un líquido de elución entre la entrada fluídica (30) y la salida fluídica (40) para recoger el lisado por la salida fluídica.

18. Procedimiento de lisis mecánica de especies biológicas (C) según la reivindicación anterior, en el que:

- la etapa A) consiste en proporcionar un dispositivo (1) según la reivindicación 13,

- la etapa B) consiste en dar entrada a un líquido que incluye las especies biológicas que han de lisarse por la entrada fluídica (30), entre la membrana estanca (50) y la segunda pared (11);

- la etapa C) consiste en hacer correr el pistón (20) dentro de la cámara (10) hasta que las paredes primera y segunda (21 y 11) se hallen en posición de lisis por mediación de la membrana estanca;

- la etapa D) consiste en hacer girar el pistón sobre sí mismo de manera tal que las paredes primera y segunda permanezcan en contacto una con otra por mediación de la membrana estanca; y

- la etapa F) consiste en hacer circular un líquido de elución entre la entrada fluídica (30) y la salida fluídica (40) para recoger el lisado por la salida fluídica.