WO2015167296A1 - 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도 - Google Patents

프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2015167296A1
WO2015167296A1 PCT/KR2015/004428 KR2015004428W WO2015167296A1 WO 2015167296 A1 WO2015167296 A1 WO 2015167296A1 KR 2015004428 W KR2015004428 W KR 2015004428W WO 2015167296 A1 WO2015167296 A1 WO 2015167296A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
protein phosphatase
lateral sclerosis
inhibitor
amyotrophic lateral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2015/004428
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
선웅
최소연
박해철
김현
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea University Research and Business Foundation
Original Assignee
Korea University Research and Business Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea University Research and Business Foundation filed Critical Korea University Research and Business Foundation
Publication of WO2015167296A1 publication Critical patent/WO2015167296A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to novel uses of protein phosphatase 1 and protein phosphatase inhibitor 2 in the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis.
  • Mitochondria are intracellular organelles that produce the energy necessary for cell survival through cellular respiration, while being present in the form of a mesh in the cytoplasm, with continuous fusion and division. Mitochondria are the backbone of intracellular energy metabolism, so mitochondrial dysfunction causes various diseases.
  • the pathological phenomena of amyotrophic lateral sclerosis one of the representative features of motor neurons is the function and morphological modification of mitochondria responsible for intracellular energy production. Abnormal fragmentation of mitochondria begins before the pathological phenomenon of amyotrophic lateral sclerosis, which not only affects mitochondrial function but also affects intracellular metabolic activity.
  • the present invention is to provide a new therapeutic agent that can block the onset of Amyotrophic lateral sclerosis and a method for discovering the same.
  • Mitochondria are organelles for intracellular energy production, which are abnormal in proximal lateral sclerosis. Morphological changes in mitochondria are one of the most important processes for maintaining the homeostasis of mitochondrial qualitative and quantitative changes.
  • the present invention focused on the search for new targets and candidates that can control the shape of the mitochondria for the discovery of therapeutic agents for amyotrophic lateral sclerosis.
  • Protein phosphatase 1 is involved in morphological regulation of mitochondria and thus can be a target for drug development.
  • Protein phosphatase inhibitor 2 which is a type of inhibitor against protein phosphatase 1, is a type of mitochondria. Inhibition of intracellular protein degeneration by functional alteration and neurological disease was shown to normalize the flow of metabolic mechanisms of the cells, thereby showing a therapeutic effect against amyotrophic lateral sclerosis.
  • the protein of protein phosphatase 1 or a gene encoding the same may be utilized for the discovery of a therapeutic agent for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, and the inhibitor of protein phosphatase 1 including protein phosphatase inhibitor 2 It can be used for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, and the discovery of a therapeutic agent.
  • the present invention provides a use of protein phosphatase 1 protein for the screening of a medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, a composition for screening a medicament for the prevention or treatment of atrophic lateral sclerosis comprising the protein, and protein phosphate
  • a method for screening a medicament for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis comprising contacting a datase 1 protein with a candidate in vitro and determining whether the candidate increases or decreases the function or activity of the protein.
  • the present invention also relates to the use of the protein phosphatase 1 gene for the screening of a medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, the medicament for the prevention or treatment of atrophic lateral sclerosis comprising the gene or cells expressing the same.
  • a composition for screening, and muscular dystrophy comprising contacting the protein phosphatase 1 gene or a cell expressing the same with a candidate in vitro and determining whether the candidate increases or decreases the expression of the gene
  • a method for screening a medicament for preventing or treating sclerosis is provided.
  • Confirmation of the reaction between the protein or the gene and the candidate is used to confirm the reaction between the protein-protein, protein-compound, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-protein, DNA-compound, RNA-protein, RNA-compound.
  • Conventional methods can be used. For example, a hybridization test for confirming the binding between the gene and the candidate substance in vitro, reaction of mammalian cells with the test substance, and then Northern analysis, quantitative PCR, quantitative real-time PCR, etc.
  • a method of measuring the expression rate of a gene or a method of connecting a reporter gene to the gene and introducing it into a cell, reacting with a test substance and measuring the expression rate of a reporter protein, a method of measuring activity after reacting the protein and a candidate substance, Yeast two-hybrid, search for phage-displayed peptide clones that bind to the target protein, high throughput screening (HTS) using natural and chemical libraries Screening using drug hit HTS, cell-based screening, or DNA array And the like can be used.
  • HTS high throughput screening
  • the composition for screening may include distilled water or a buffer to stably maintain the structure of the nucleic acid or protein.
  • the composition for screening may include a cell expressing the protein or gene, or a cell containing a plasmid expressing the gene under a promoter capable of controlling transcription rate for in vivo experiments. .
  • test substance is assumed to have the potential as a medicament with regulatory function for neurons according to a conventional selection method or randomly selected individual nucleic acids, proteins, peptides, other extracts or natural products , Compounds and the like.
  • the present invention relates to the use of an inhibitor of protein phosphatase 1 for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, of atrophic lateral sclerosis comprising an inhibitor of protein phosphatase 1 as an active ingredient.
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition a method for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis comprising administering to a subject an effective amount of an inhibitor of protein phosphatase 1.
  • the inhibitor of protein phosphatase 1 may be a protein, peptide, antibody, small molecule, antisense-oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA or a vector comprising the same.
  • the present invention provides a protein phosphatase inhibitor 2 protein for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, a polynucleotide encoding the same or a pharmaceutical use of the expression vector comprising the polynucleotide, protein Phosphatase inhibitor 2 protein, a polynucleotide encoding the same or a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis comprising an expression vector comprising the polynucleotide as an active ingredient, protein phosphatase inhibitor 2 protein, encoding the same
  • a method for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis comprising administering to a subject an effective amount of a polynucleotide or an expression vector comprising said polynucleotide.
  • the protein phosphatase inhibitor 2 protein is restored to normal levels and mitochondrial fragmentation occurred in cells with a mutant gene causing atrophic lateral sclerosis, it is known that inhibiting apoptosis Can be.
  • the treatment of protein phosphatase inhibitor 2 protein has been shown to inhibit neuronal cell death in atrophic lateral sclerosis model.
  • the protein phosphatase inhibitor 2 protein, a polynucleotide encoding the same or an expression vector comprising the polynucleotide can be used as an active ingredient for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis.
  • Protein phosphatase inhibitor 2 proteins of the invention include native or recombinant protein phosphatase inhibitor 2, and protein phosphatase inhibitor 2 proteins having physiological activities substantially equivalent thereto. Proteins having substantially equivalent physiological activity include native / recombinant protein phosphatase inhibitor 2 and its functional equivalents and functional derivatives.
  • the “functional equivalent” refers to an amino acid sequence variant in which some or all of the amino acids of the native protein are substituted, or a portion of the amino acids are deleted or added, and have a physiological activity substantially equivalent to that of the native protein phosphatase inhibitor 2. .
  • “functional derivative” is meant a protein that has been modified to increase or decrease the physicochemical properties of the protein phosphatase inhibitor 2 protein and which has a physiological activity substantially equivalent to that of the native protein phosphatase inhibitor 2.
  • Protein phosphatase inhibitor 2 protein of the present invention is a protein derived from mammals, preferably humans, mice, rats and the like, for example, GenBank accession no. It refers to a protein having a sequence known as NM_006241 and the like. Protein phosphatase inhibitor 2 proteins of the invention can be prepared from these known sequences by genetic engineering methods known to those skilled in the art.
  • Natural protein phosphatase inhibitor 2 protein is produced by genetic recombination method in the case of using mammalian cells rather than E. coli or insect cells. It is believed to be similar to that of.
  • the recombinant protein phosphatase inhibitor 2 protein can be separated using a conventional column chromatography method.
  • the degree of purification of the protein can be confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • composition of the present invention can also use a polynucleotide encoding a protein phosphatase inhibitor 2 protein or an expression vector comprising the polynucleotide as an active ingredient.
  • an "expression vector” refers to a gene construct that is capable of expressing a target protein or target RNA in a suitable host cell, and includes a gene regulatory element operably linked to express the gene insert.
  • the expression vector can be, for example, a viral vector. More preferably, they may be adenovirus vectors with high efficiency of gene transfer, the ability to transfer genes into undifferentiated cells, and the ease of preparing high titers of viral storage. Adenovirus vectors delete a series of genes essential for replication and induce high expression of the therapeutic protein in vivo with a cytomegalovirus (CMV) or loose sarcoma virus (RSV) promoter with high levels of promoter activity. can do.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV loose sarcoma virus
  • promoter refers to a nucleic acid sequence that regulates the expression of another nucleic acid sequence operably linked in a suitable host cell
  • operably linked refers to nucleic acid expression to perform a general function. It refers to a functional linkage between a regulatory sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest.
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the coding sequence.
  • Operative linkage with expression vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation employs enzymes and the like generally known in the art.
  • the promoter may be constitutive or inducible, preferably may be specifically activated in specific tissues, and more preferably may be a promoter specifically activated for neurons (eg, HB9).
  • Protein phosphatase inhibitor 2 protein, a polynucleotide encoding the same, or an expression vector comprising the polynucleotide according to the present invention can be used in combination with known therapeutic agents for amyotrophic lateral sclerosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • 'pharmaceutically acceptable carrier refers to known pharmaceutical excipients that are useful when formulating pharmaceutically active compounds for administration and which are virtually nontoxic and insensitive under the conditions of use. The exact proportion of such excipients is determined by standard pharmaceutical practices, as well as solubility and chemical properties of the active ingredient, as well as the route of administration chosen.
  • the 'subject' means a warm-blooded animal such as a mammal suffering from a specific disease, disorder or disease, and for example, human, orangutan, chimpanzee, mouse, rat, dog, cow, chicken, pig. , Chlorine, sheep, and the like, but are not limited to these examples.
  • Treatment also includes, but is not limited to, alleviating the symptom, removing the cause of the symptom temporarily or permanently, or preventing or slowing the appearance of the symptom and the progression of the disease, disorder or condition described above.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required to achieve treatment of a disease.
  • the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health, sex and diet, sex and diet, time of administration, route of administration and composition of the patient It can be adjusted according to various factors including the rate of secretion, the duration of treatment, and the drug used concurrently.
  • the present invention also provides the use of a protein phosphatase inhibitor 2 protein for the screening of a medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, the composition for screening a medicament for the prevention or treatment of atrophic lateral sclerosis comprising the protein, and protein A medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis comprising contacting a phosphatase inhibitor 2 protein with a candidate in vitro and determining whether the candidate increases or decreases the function or activity of the protein. It provides a screening method.
  • the present invention also provides the use of a protein phosphatase inhibitor 2 gene for the screening of a medicament for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis, a medicament for the prevention or treatment of atrophic lateral sclerosis comprising said gene or cells expressing the same.
  • a method for screening a medicament for preventing or treating atrophic lateral sclerosis is provided.
  • Protein phosphatase inhibitor 2 protein according to the present invention, a polynucleotide encoding the same or an expression vector comprising the polynucleotide can not only restore the mitochondrial fragmentation appearing in neurons to normal levels of mitochondria, but also neurons Can suppress cell death. Therefore, they can be usefully used for the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis.
  • Figure 1 shows that the activity of protein phosphatease 1 is increased before the onset of pathological symptoms in the spinal cord of SOD1 G93A mice, a model of amyotrophic lateral sclerosis.
  • Figure 2 shows the increase in the activity of protein phosphatease 1 in motor neurons by immunohistochemistry before the onset of pathological symptoms in the spinal cord of SOD1 G93A mice, a model of atrophic lateral sclerosis.
  • Figure 3 shows that the expression of protein phosphatease 1 high in motor neurons specifically.
  • Figure 11 shows that protein phosphatease 1 inhibitor 2 reduces the degeneration of neurites induced by mutant SOD1 G93A.
  • Figure 12 shows the effect of the protein phosphatease 1 inhibitor 2 to suppress the mitochondrial deterioration due to amyotrophic lateral sclerosis.
  • FIG. 13 shows the effect of protein phosphatease 1 inhibitor 2 in the zebrafish model (SOD1 G93A, TDP-43 Q331K), a model of atrophic atrophy.
  • SOD1 G93A a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis, was used to observe the activity of protein phosphatease 1 before the onset of pathological symptoms.
  • SOD1 G93A mouse model about 90 days of birth, a decrease in hindlimb reflex, one of the pathological symptoms of amyotrophic lateral sclerosis, begins to occur. The tissue was cooled.
  • the activity of protein phosphatease 1 is known to be inhibited by phosphorylation of amino acid 320 (Dohadwala et al., PNAS , 91: 6408-6412, 1994).
  • Western blotting was performed by separating the lumbar level of the spinal cord.
  • the spinal cord contains interneurons, astrocytes, and oligodendrocytes, as well as motor neurons, which are mainly damaged by amyotrophic lateral sclerosis, and protein phosphates in motor neurons.
  • the activity of 1 is not directly known. Therefore, we analyzed the phosphorylation of protein phosphatease 1 in motor neurons using immunohistochemistry, and indirectly examined their activation in motor neurons.
  • mice 60 days old wild-type and SOD1 G93A mice were intraperitoneally injected with urethane 5cc / 100g, anesthesia was performed, and a 100% 0.9% saline solution was perfused with a ringer needle in the left atrium. Blood was removed. After phosphate saturated saline containing 4% paraformaldehyde was flowed through the heart to the whole body, the spinal cord was extracted, and post-fixed in phosphate buffered saline containing 4% paraformaldehyde for 48 hours. Fixed tissues were placed in phosphate buffered saline containing 30% sugar and treated for 48 hours.
  • the spinal cord tissues were then placed in a template with OCT composites and frozen on dry ice and stored at -80 ° C until used in the experiment.
  • the frozen tissue was sectioned to a thickness of 40 um by a freezing section machine, and treated with PBS-T (phosphate buffered saline containing 1% triton X-100) containing 3% bovine serum albumin for 30 minutes for nonspecific binding. Was suppressed.
  • PBS-T phosphate buffered saline containing 1% triton X-100
  • bovine serum albumin containing 3% bovine serum albumin for 30 minutes for nonspecific binding.
  • the tissue was treated with a blocking liquid containing phosphorylated protein phosphatease 1-labeled antibody (p-PP1) and ChAT antibody labeling motor neurons for 24 hours to carry out a primary antibody reaction.
  • the tissues were washed three times with phosphate buffered saline and then subjected to a second antigen-antibody reaction for 30 minutes using FITC-anti Rabbit and Cy3-anti goat IgG.
  • the tissue was washed again three times with phosphate buffered saline, encapsulated flat on slide glass, dried at room temperature for 10 minutes, coated with crystal mount solution, and then covered with a cover slide to prepare a sample. .
  • the prepared sample was observed by using a fluorescent confocal microscope (Cal Zeiss LSM 700 microscope).
  • Mitochondria have morphological changes such as fragmentation when the function of cell respiration through the electron transfer system decreases, and mitochondrial membrane potential is depolarized even when the activity of proteins that directly cause morphological changes is observed. Close associations have been reported (Choi et al., FASEB , 27: 51-62, 2013; Dickey and Strack, J Neurosci , 31: 15716-15726).
  • a key protein that causes morphological changes in mitochondria is DRP1 (Praefcke and McMahon, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol ., 5: 133-147, 2004).
  • GFP-labeled mutant SOD1 genes (G93A, G85R, G37R) related to amyotrophic lateral sclerosis were overexpressed using Lipofectamine 2000, and then treated with cantharidin for 1 hour after 24 hours.
  • mitochondrial function has been significantly reduced since the onset of pathologic symptoms of amyotrophic lateral sclerosis. Therefore, mitochondrial function was verified to determine whether protein phosphatease 1 inhibitor 2 affects the electron transport system activity of mitochondria.
  • the spinal cord of the SOD1 G93A mice was rapidly frozen and sectioned. After the sectioning, NADH was added to the tissue to test the dehydrogenase activity of the electron transport system complex I of mitochondria. As shown in FIG. 12A, the function of mitochondria was significantly reduced from the time before the pathological phenomenon of amyotrophic lateral sclerosis.
  • protein phosphatease 1 inhibitor 2 was treated after culturing neurons of SOD1 G93A. As shown in FIG. 12B, the complex activity of mitochondria was improved by protein phosphatease 1 inhibitor 2. In addition, the mitochondrial membrane potential level, which is another indicator of mitochondrial function, also demonstrated the improvement of protein phosphatease 1 inhibitor 2. As such, protein phosphatease 1 inhibitor 2 showed a great effect in improving the function of mitochondria important in neurons.
  • the zebrafish amyotrophic lateral sclerosis model was used to examine the effect of protein phosphatease 1 inhibitor 2 at the individual level.
  • Human SOD1 G93A mutant clones were purchased from Addgene to synthesize sense RNA with T7 RNA polymerase.
  • the embryos cultured for 24 hours were then treated with embryo phosphatease 1 inhibitor 2 at a concentration of 20-30 nM in embryo culture and further incubated for 2 days.
  • Image analysis was performed on day 3 of an embryo with 0.03% Tricaine (Sigma-Aldrich), and then sampled on 0.8% low-melting agarose using an LSM5 laser scanning confocal microscope (Ziss).
  • the zebrafish model overexpressing another gene related to atrophic atrophic atrophic sclerosis also inhibited axonal degeneration of motor neurons in the group treated with the protein phosphatease 1 inhibitor 2 and the group treated with the ocardic acid. And it was found.
  • protein phosphatease 1 inhibitor 2 restores the abnormal function of mitochondria, a pathological phenomenon of amyotrophic lateral sclerosis, thereby inhibiting axonal degeneration, thereby improving the function of motor neurons and further inhibiting cell death. Seems.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료와 관련한 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, 프로테인 포스파타아제 1의 저해제의 하나인 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 신경세포에서 나타나는 미토콘드리아의 단편화를 정상수준의 미토콘드리아 길이로 회복시킬 수 있을 뿐만 아니라, 신경세포의 세포사멸을 억제할 수 있다. 따라서, 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2를 비롯한 프로테인 포스파타아제 1의 저해제는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료, 및 치료제 스크리닝을 위해 유용하게 활용될 수 있다.

Description

프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도
본 발명은 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료와 관련한 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도에 관한 것이다.
미토콘드리아는 지속적인 융합과 분열을 반복하며 세포질에 그물망 형태로 존재하면서, 세포 호흡을 통하여 세포의 생존에 필요한 에너지를 생산하는 세포내 소기관이다. 미토콘드리아는 세포내 에너지 대사의 중추이므로 미토콘드리아의 기능 이상은 다양한 질병을 유발한다. 근위축성측삭경화증의 병리적 현상 중, 운동신경세포내의 대표적인 특징 중 하나는 세포 내 에너지 생산을 담당하는 미토콘드리아의 기능 및 형태학적 변형이다. 근위축성측삭경화증의 병리적 현상이 일어나기 이전 시기부터 미토콘드리아의 비정상적인 단편화는 일어나기 시작하고, 이로 인해 미토콘드리아의 기능 저하뿐만 아니라, 더 나아가 세포 내 대사활동에 영향을 미치게 된다. 미토콘드리아의 비정상적인 형태적 변화는 미토콘드리아의 재생과 분열, 세포내의 이동과 분포에 밀접한 관련이 있으며, 이러한 형태적 변화와 관련된 단백질들의 비정상적인 활성은 신경세포의 손상을 초래할 수 있다(Su et al, Mol Neurobiol, 41(2-3):87-96, 2010).
하지만, 현대의학의 발달에도 불구하고 아직까지 이러한 근위축성측삭경화증의 병리기전조차 명확히 밝혀지지 않았고, 단지 증상의 진행을 늦추거나 완화시키는 수준에 머물러 있다. 현재 근위축성측삭경화증에 대해 FDA 승인을 받은 릴루졸(riluzole)이 유일하다. 하지만, 릴루졸은 근위축성측삭경화증에 대해 치료 효과를 나타내기 보다는 수명을 연장시키는 수단에 불과하다. 따라서 근위축성측삭경화증에 대한 발병 기전의 이해에 바탕한 조기 진단 및 치료법의 개발이 절실하다.
이에 본 발명에서는 근위축성측삭경화증의 발병을 초기 단계에서 차단할 수 있는 새로운 치료제 및 이를 발굴하기 위한 방법을 제공하고자 한다.
미토콘드리아는 세포 내 에너지 생성을 위한 소기관으로, 근위측성측삭경화증에서 비정상적인 형태를 나타낸다. 미토콘드리아의 형태적 변화는 미토콘드리아의 질적, 양적 변화의 항상성을 유지하기 위한 매우 중요한 과정 중 하나이다.
이에 본 발명에서는 근위축성측삭경화증에 대한 치료제 발굴을 위해 미토콘드리아의 형태를 조절할 수 있는 신규 타겟과 후보물질을 탐색하는데 초점을 맞추었다.
그 결과, 프로테인 포스파타아제 1이 미토콘드리아의 형태 조절에 관여하므로 이와 관련한 약물 개발에 타겟이 될 수 있으며, 프로테인 포스파타아제 1에 대한 저해제의 일종인 프로테인 포스파타아제 저해제 2가 미토콘드리아의 형태적, 기능적 변형과 신경계질환에 의한 세포 내 단백질의 변성을 억제하여 세포의 대사적 메카니즘의 흐름을 정상화함으로써 근위축성측삭경화증에 대한 치료 효과를 나타낸다는 점을 확인하였다.
따라서, 프로테인 포스파타아제 1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료를 위한 치료제 발굴에 활용될 수 있으며, 프로테인 포스파타아제 저해제 2를 비롯한 의 프로테인 포스파타아제 1의 저해제는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료, 및 이에 대한 치료제 발굴에 활용할 수 있다.
이에 본 발명은 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝을 위한 프로테인 포스파타아제 1 단백질의 용도, 상기 단백질을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝용 조성물, 및 프로테인 포스파타아제 1 단백질을 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의기능 또는 활성을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
마찬가지로, 본 발명은 또한 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝을 위한 프로테인 포스파타아제 1 유전자의 용도, 상기 유전자 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝용 조성물, 및 프로테인 포스파타아제 1 유전자 또는 이를 발현하는 세포를 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단백질 또는 유전자와 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물, RNA-단백질, RNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 후보 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법, 상기 단백질과 후보 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 표적 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.
상기 스크리닝용 조성물은 상기 단백질 또는 유전자 외에도, 핵산 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한 상기 스크리닝용 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질 또는 유전자를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 유전자를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 신경세포에 대한 조절 기능을 가진 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 프로테인 포스파타아제 1의 저해제의 용도, 프로테인 포스파타아제 1의 저해제를 유효성분으로 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약 조성물, 프로테인 포스파타아제 1의 저해제를 유효량으로 대상체에 투여하는 것을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
프로테인 포스파타아제 1의 저해제는 단백질, 펩타이드, 항체, 소분자물질, 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터의 의약적 용도, 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약 조성물, 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효량으로 대상체에 투여하는 것을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질의 처리 시 근위축성측삭경화증을 유발하는 돌연변이 유전자를 갖는 세포에서 발생한 미토콘드리아의 단편화를 정상 수준으로 회복시키고, 세포사멸을 억제함을 알 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질의 처리시 근위축성측삭경화증 모델에서의 신경세포 사멸을 억제하는 것으로 확인되었다.
따라서, 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료를 위한 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명의 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질은 천연형 또는 재조합 프로테인 포스파타아제 저해제 2, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질을 포함한다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 프로테인 포스파타아제 저해제 2와 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.
상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 프로테인 포스파타아제 저해제 2와 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.
"기능적 유도체"는 상기 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 프로테인 포스파타아제 저해제 2와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질은 포유동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 랫트 등으로부터 기원하는 단백질이며, 예컨대, 사람 유래의 GenBank accession no. NM_006241 등으로 공지된 서열을 가진 단백질을 말한다. 본 발명의 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질은 이들 공지의 서열로부터 당업자에게 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.
천연형의 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질은 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균(E.coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다.
상기 재조합 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE))등으로 확인할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명에서, "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 발현 벡터는 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는 유전자 전달의 높은 효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성을 가지는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 복제에 필수적인 일련의 유전자들을 삭제시키고, 프로모터 활성의 수준이 높은 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터를 넣어 치료 목적 단백질의 생체 내에서의 높은 발현을 유도할 수 있다.
본 발명에서 "프로모터"는 적당한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
상기 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 바람직하게는 특정한 조직에서 특이적으로 활성화될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 신경세포에 대해 특이적으로 활성화되는 프로모터(예컨대, HB9)일 수 있다.
본 발명에 따른 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 공지의 근위축성측삭경화증에 대한 치료제와 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, '약제학적으로 허용가능한 담체'는 투여용 약제학적 활성 화합물을 제형화할 경우에 유용하고 사용 조건하에 사실상 비독성 및 비민감성인 공지된 약제학적 부형제를 의미한다. 이러한 부형제의 정확한 비율은 유효성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다.
한편, 본 발명에 있어서, '대상체'는 특정 질병, 장애 또는 질환에 걸린 포유동물과 같은 온혈 동물을 의미하며, 예를 들어, 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한 '치료'는 증상을 경감시키거나, 증상의 원인을 일시적 또는 영구적으로 제거하거나 증상의 출현 및 상기한 질병, 장애 또는 질환의 진행을 예방 또는 둔화시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명은 또한 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝을 위한 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질의 용도, 상기 단백질을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝용 조성물, 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질을 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
마찬가지로, 본 발명은 또한 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝을 위한 프로테인 포스파타아제 저해제 2 유전자의 용도, 상기 유전자 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 근위축성측삭경화증 의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝용 조성물, 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2 유전자 또는 이를 발현하는 세포를 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 신경세포에서 나타나는 미토콘드리아의 단편화를 정상수준의 미토콘드리아 길이로 회복할 수 있을 뿐만 아니라, 신경세포의 세포사멸을 억제할 수 있다. 따라서, 이들은 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 근위축성 측삭 경화증 모델인 SOD1 G93A 생쥐의 척수에서 병리적 현상이 나타나기 이전 시기에, 프로테인 포스파테아제 1의 활성이 증가함을 나타낸 것이다.
도 2는 근위축성 측삭 경화증 모델인 SOD1 G93A 생쥐의 척수에서 병리적 현상이 나타나기 이전 시기에, 면역조직화학법으로 운동신경세포에서 프로테인 포스파테아제 1의 활성이 증가함을 나타낸 것이다.
도 3은 운동신경세포에 특이적으로 프로테인 포스파테아제 1의 발현이 높음을 나타낸 것이다.
도 4는 DRP1의 인산화가 병리적 현상 이전 시기에 감소되었음을 나타낸 것이다.
도 5는 감소된 DRP1의 인산화가 운동신경세포 내에 특이적으로 나타난 것을 보여준다.
도 6은 DRP1의 탈인산화는 PP1과 PP2A에 의해서 일어남을 나타낸 것이다
도 7은 SOD1 G93A에 의해 유도된 DRP1의 탈인산화는 PP1과 PP2A 억제제를 처리함으로써 억제될 수 있음을 나타낸 것이다.
도 8은 DRP1의 탈산화는 PP1에 의해서 일어남을 나타낸 것이다.
도 9는 돌연변이 SOD1 G93A에 의해 유도되는 미토콘드리아 단편화에 대한 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 억제효과를 나타낸 것이다.
도 10은 돌연변이 SOD1 G93A에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 억제효과를 나타낸 것이다.
도 11은 돌연변이 SOD1 G93A에 의해 유도되는 신경돌기의 변성을 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2가 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 12는 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2가 근위축성측삭경화증으로 인한 미토콘드리아의 기능 저하를 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도 13는 근위축성축삭경화증 모델인 제브라피쉬 모델 (SOD1 G93A, TDP-43 Q331K)에서 프로테인 포스파테아제 1 저해제2의 효과를 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
<실시예 1> 근위축성측삭경화증 동물 모델에서 발병 시기 프로테인 포스파테아제 1의 활성 증가
근위축성측삭경화증의 생쥐 모델인 SOD1 G93A를 이용하여, 병리적 증상이 나타나기 이전 시기에 프로테인 포스파테아제 1의 활성을 관찰하였다. SOD1 G93A 생쥐 모델은 태어난 지 90일정도가 되면 근위축성측삭경화증의 병리적 현상 중 하나인 하지반사(hindlimb reflex)의 저하 등이 나타나기 시작하는데, 그 이전 시기인 60일 생쥐의 척수를 적출하여 급속히 조직을 냉각시켰다. 프로테인 포스파테아제 1의 활성은 320번 아미노산의 인산화에 의하여 억제된다고 알려져 있다(Dohadwala et al., PNAS, 91:6408-6412, 1994). 이에, 프로테인 포스파테아제 1의 활성을 알아보기 위하여, 척수의 허리부(lumbar level)를 분리하여 웨스턴블랏팅을 실시하였다.
프로테인 프로파테아제 1의 비활성 상태를 나타내는 프로테인 포스파테아제 1의 인산화 정도를 웨스턴블랏팅을 통해 관찰하였다. 그 결과, 도 1A에서 볼 수 있는 바와 같이, 근위축성측삭경화증의 병리적 증상이 나타나기 이전 시기인 생후 60일부터 프로테인 포스파테아제 1의 단백질 발현 수준이 다소 낮아져 있었으나, 그 인산화 정도가 매우 낮아져 있는 것을 알 수 있었으며, 이에 따라서 조직 내 프로테인 포스파테아제 1의 활성화 수준이 SOD1 G93A 그룹에서 다소 높아져 있음을 알 수 있었다.
프로테인 포스파테아제 1의 활성 정도를 직접적으로 측정하기 위하여, 근위축성측삭경화증의 전 시기의 생쥐의 허리부 부위의 척수를 적출하여, -80도의 아이소펜탄에서 급속히 냉각시켰다. 얼린 척수 조직은 프로테인 포스파테아제 1의 활성을 측정하기 위한 완충용액에 넣은 뒤, 조직분쇄기와 초음파분쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄된 조직에 프로테인 포스파테아제 1의 기질을 넣어준 뒤 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 1B에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로테인포스파테아제 1의 활성은 근위축성측삭경화증 전 시기에 대조군에 비하여 월등히 높아져 있음을 알 수 있었다.
척수에는 근위축성 측삭 경화증에 의해서 주로 손상 받는 운동신경세포뿐만 아니라, 개재뉴런(interneuron), 아교세포(astrocytes), 희소돌기교세포(oligodendrocytes) 등이 포함되어있어, 운동신경세포에서의 프로테인 포스파테아제 1의 활성을 직접적으로 알 수 없다. 그러므로 면역조직화학법을 이용하여 운동신경세포의 프로테인 포스파테아제 1의 인산화 정도를 분석, 운동신경세포에서 그 활성화 정도를 간접적으로 조사하였다.
면역조직화학법을 이용하기 위해서, 60일된 야생형 및 SOD1 G93A 생쥐에 우레탄 5cc/100g을 복강 주사하여 마취를 실시하였고, 흉부 부위를 절개하여 좌심방에 링거 바늘을 꽂아 0.9% 생리식염수 100 ml 정도를 관류하여 혈액을 제거하였다. 이 후 4% 파라포름알데하이드가 포함된 인산완층식염수를 심장을 통해 몸 전체로 흘려 보낸 뒤, 척수를 적출하여, 48시간 동안 4% 파라포름알데하이드가 포함된 인산완충식염수에서 후고정을 실시하였다. 고정된 조직은 30% 설탕이 포함된 인산완충식염수에 넣은 뒤, 48시간 동안 처치하였다. 이 후 척수 조직은 OCT 합성물과 함께 주형물에 넣은 뒤 드라이 아이스 위에서 얼렸으며, 실험에 사용되기 전까지 -80도에서 보관하였다. 얼려진 조직은 냉동절편기계에 의해 40 um의 두께로 절편 하였으며, 3% 소혈청 알부민이 포함된 PBS-T (1% triton X-100이 포함된 인산완충식염수)에 30분간 처치하여 비특이성 결합을 억제하였다. 다음으로 조직을 인산화된 프로테인 포스파테아제 1을 표지하는 항체(p-PP1)와 운동신경세포를 표지하는 ChAT 항체를 포함한 블로킹 액체에 24시간 동안 처리하여 일차항체반응을 수행하였다. 일차항체반응이 끝난 조직은 인산완충식염수로 세 차례 씻어낸 후, FITC-anti Rabbit과 Cy3-anti goat IgG를 이용하여 2차 항원-항체반응을 30분 동안 실시하였다. 이차항체반응이 끝난 뒤, 조직은 다시 인산완충식염수로 3차례 씻어내고, 슬라이드 글라스 위에 편평하게 봉입하고, 10분간 상온에서 건조 한 뒤, crystal mount 용액을 도포한 뒤 커버슬라이드로 덮어 표본을 준비하였다. 준비된 표본은 형광 표지 신호를 레이저공초점현미경(Cal Zeiss LSM 700 microscope)을 이용하여 관찰하였다.
실험 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 생후 60일된 SOD G93A 생쥐의 운동신경세포에서 인산화된 프로테인 포스파테아제 1의 발현 정도가 정상생쥐의 발현보다 낮음을 알 수 있었다. 이러한 프로테인 포스파테아제 1의 인산화 변화는 병리적 증상이 일어나기 시작한 생후 90일째에도 계속 유지되었다. 또한 도 3에서도 보여지듯이, 총 프로테인 포스파테아제 1을 표지 할 수 있는 항체를 이용하여 발현부위를 알아본 결과, 흥미롭게도 운동신경세포에서 매우 강하게 발현되고 있음을 알 수 있었다. 이는 근위축성측삭경화증에서 운동신경세포가 프로테인 포스파테아제 1의 활성 변화에 다른 세포에 비하여 보다 민감할 가능성을 시사한다. 이처럼 정상 생쥐보다 근위축성측삭경화증 생쥐의 운동신경세포에서 프로테인 포스파테아제 1의 활성이 증가되어 있으므로, 그 하위에 있는 다양한 단백질의 번역 후 변화에 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있으며, 이는 운동신경세포의 퇴행 및 사멸에 원인을 제공할 가능성을 제기한다.
<실시예 2> 근위축성측삭경화증 생쥐의 척수에서 인산화된 Dynamin related protein 1 (DRP 1)의 감소
미토콘드리아는 전자전달계를 통한 세포호흡의 기능이 감소할 때 단편화 등 형태적 변화가 일어나고, 직접적으로 형태적 변화를 일으키는 단백질의 활성을 억제하였을 때도 미토콘드리아의 막전위가 탈분극이 관찰되는 등 그 기능과 형태간의 긴밀한 관련이 보고된 바 있다(Choi et al., FASEB, 27:51-62, 2013; Dickey and Strack, J Neurosci, 31:15716-15726). 미토콘드리아의 형태적 변화를 일으키는 핵심적인 단백질은 DRP1이다(Praefcke and McMahon, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 5:133-147, 2004). 최근 보고에 따르면, 근위축성 측삭 경화증 동물모델의 초기에 미토콘드리아의 단편화가 진행됨이 관찰된 바 있으며(Boillee et al, Neuron, 52:39-59, 2006), 세포배양 모델에서 DRP1의 활성을 억제하면, 미토콘드리아의 정상적인 길이 유지와 세포사멸을 억제한다는 보고가 있었다(Song et al., Neurobiol Dis. 51:72-81, 2013). 따라서 근위축성측삭경화증 생쥐의 척수에서 미토콘드리아의 형태 변화에 관련된 단백질인 DRP1의 인산화 변화를 웨스턴블랏팅으로 확인하였다. <실시예 1>와, 동일한 방법으로 조직을 적출하였으며, SOD1 G93A 생쥐의 척수는 병리적 증상 진행에 따라 생후 60일, 90일, 200일에 시료를 채취하였다. SOD1 G93A 생쥐에서 DRP1의 인산화 감소는 프로테인 포스파타아제 1의 활성이 증가되는 생후 60일부터 관찰되었으며, 이는 프로테인 포스파타아제 1의 비정상적 활성 증가가 미토콘드리아의 비정상적인 형태 변화와 기능적 저하를 유발할 가능성을 시사한다. 또한, Drp1 단백질의 인산화 변화가 프로테인 포스파타아제 1의 활성이 특이적으로 증대되는 운동신경세포 내에서 진행되는지 관찰하기 위하여, <실시예 1>과 동일한 방법으로 정상 생쥐와 SOD1 G93A 형질 전환 생쥐의 척수를 적출하여 면역조직화학법으로 분석하였다.
실험 결과, 도 4와 도 5에서 보여지는 바와 같이 DRP1의 인산화는 SOD1 G93A 생쥐의 운동신경세포에서 선택적으로 감소되어 있음을 관찰하였다. 이는 근위축성측삭경화증의 비정상적인 프로테인 포트파타아제의 활성 증대가 Drp1 단백질을 조절하여, 미토콘드리아의 비정상적인 단편화와 미토콘드리아 전자절달계의 활성 감소를 일으킬 가능성을 시사한다.
<실시예 3> 프로테인 포스파테아제 1의 DRP1 탈인산화 효과
미토콘드리아의 형태적 변화를 일으키는 DRP1의 탈인산화에 프로테인 포스파테아제 1이 작용하는지 조사하기 위해서, 선택적 포스파테아제 억제제를 대뇌피질 신경세포에 처리하였다. 대뇌피질의 신경세포를 배양하기 위해서 17일된 정상 생쥐의 배아를 꺼내어, 배아의 뇌를 적출한 뒤, HBSS (Hank's balanced salt solution) 용액 속에서 대뇌피질만을 분리하였다. 분리된 대뇌피질은 0.05% trypsin-EDTA을 처치하여 단일 세포로 분리하였으며, 분리된 대뇌피질 신경세포는 B27 (Gibco), 1% penicillin/streptomycin과 글루타민이 포함된 Neurobasal media (Gibco)에서 배양하였다. 배양 10일째 대뇌피질 신경세포는 프로테인 포스파테아제 1과 프로테인 포스파테아제 2B를 억제하는 오카드산(Okadaic acid) 또는 칸타라이딘 (Cantharidine)을 각각 1시간 동안 처리한 후 DRP1의 인산화 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, DRP1의 인산화는 각각의 약물의 농도에 따라 증가함을 나타내었고, 프로테인 포스파타아제1의 억제가 가능한 비교적 고농도에서 특히 인산화 증가 효과가 두드러졌다. 이는 DRP1의 탈인산화가 주로 프로테인 포스파테아제 1에 의하여 매개됨을 시사한다.
또한, 배양된 신경세포에서 근위축성측삭경화증에 관련된 유전자 클론을 과발현시킨 후 DRP1 단백질의 인산화를 관찰하였다. 배양 10일째 신경세포에 GFP가 표지된 근위축성측삭경화증에 관련된 돌연변이 SOD1 유전자들(G93A, G85R, G37R)을 Lipofectamine 2000을 이용하여 과발현 시킨 후, 24시간뒤 칸 타라이딘을 1시간동안 처리하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 칸타라이딘을 처리하지 않은 그룹에서 돌연변이 SOD1 클론들이 과발현된 신경세포에서는 DRP1의 인산화가 감소됨이 관찰된 반면, 칸타라이딘을 처리한 그룹에서는 DRP1의 인산화 감소가 강력히 억제됨이 관찰되었다.
또한, 프로테인 포스파테아제 1만 억제할 수 있는 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2 단백질을 처리한 후 DRP1 단백질의 인산화 패턴을 웨스턴블롯을 통해 관찰한 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, DRP1의 인산화가 처치 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 따라서 DRP1의 탈인산화는 프로테인 포스파테아제 1에 의하여 매개되는 과정임을 확인하였다. .
<실시예 4> 근위축성측삭경화증에 의해 유도되는 병리적 현상의 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2에 의한 감소
프로테인 포스파테아제 1의 비정상적 활성 억제가 근위축성측삭경화증에 대한 치료 효과가 있는지 검증하기 위하여 대뇌피질 신경세포를 배양한 후, 배양 9일 후에 미토콘드리아를 표지 할 수 있는 클론과 SOD1 G93A 돌연변이 유전자와 GFP가 부착된 융합유전자를 각각 신경세포에 유전자 도입한 뒤 24시간 후에 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정한 뒤 면역세포화학법을 실시하였다. 고정된 신경세포는 3% 소 혈청이 포함된 PBS-T(0.2% Triton X-100이 포함된 인산완충식염수)로 블롯킹을 실시한 후, GFP를 표지할 수 있는 일차항체를 이용하여 돌연변이 SOD1 단백질이 과발현된 세포를 표지하였다. 준비된 표본은 공초점 현미경 (Cal Zeiss LSM 510)를 이용하여 GFP가 표지된 세포의 미토콘드리아의 이미지를 얻었다.
도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, SOD1 G93A 유전자를 과발현시킨 신경세포의 미토콘드리아는 비정상적인 과단편화가 일어난 반면, 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2를 처리한 그룹에서는 미토콘드리아의 길이가 감소가 억제되어, 정상 수준으로 회복되는 것을 볼 수 있다.
또한 면역세포화학법을 이용하여 아폽토시스에 의한 세포사멸의 표지자인 활성화된 카스파아제 3 단백질의 발현과 핵 응축이 나타난 세포의 수를 세어 세포사멸에 미치는 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 활성을 조사한 결과, 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2를 처리한 그룹에서는 SOD1 G93A 유전자 과발현에 의해 일어나는 세포사멸이 유의하게 억제되는 것을 관찰하였다.
근위축성측삭경화증과 밀접하게 관련된 병리적 현상 중 하나는 신경세포의 축삭변성이 일어나 신경망 기능에 장애가 발생하는 것이다. 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2에 대한 신경세포의 축삭변성 억제 효과를 조사하기 위하여, 일차배양한 신경세포에 SOD1 G93A 돌연변이를 과발현시킨 후 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2을 처리하고 24시간 뒤에 신경돌기의 형태를 관찰하였다. 또한 프로테인 포스파테아제 1의 발현율을 특이적으로 감소시킬 수 있는 shRNA를 이용하여 SOD1 G93A를 과발현 시킨 신경세포에서 그 변화를 관찰하였다. 신경세포는 도 7에서 시행한 면역세포화학법을 이용하여 돌연변이유전자와 함께 도입한 GFP 신호를 기반으로 신경돌기 형태를 계측하여 분석하였다. 획득한 신경돌기 이미지는 ImageJ 프로그램을 이용한 영상 분석을 통하여 길이를 계산하였다. 분석 결과, 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2와 프로테인 포스파테아제 1의 shRNA 처치는 SOD1 G93A 돌연변이 유전자 과발현에 의하여 일어난 축삭성장 장애를 유의하게 개선하였다.
종합하면, 배양세포 모델에서 프로테인 포스파타아제 1의 억제는 신경세포의 미토콘드리아 단편화, 축삭성장 장애, 세포사멸 등 핵심적인 병리적 변성 현상을 모두 강력하게 개선하는 효과를 보였다.
<실시예 5> 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 미토콘드리아 기능 개선 효과
신경세포의 신경돌기 성장은 미토콘드리아의 기능과 밀접한 관계가 있다. 또한 근위축성측삭경화증의 병리적 현상이 나타나기 이전 시기부터 미토콘드리아의 기능은 현저히 감소되어 있다. 따라서 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2가 미토콘드리아의 전자전달계 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 미토콘드리아 기능을 검증하였다. 근위축성측삭경화증의 미토콘드리아 기능을 알아보기 위하여, SOD1 G93A 생쥐의 허리 부위의 척수를 급속히 냉동 시킨 후 절편하였다. 절편 후 조직에 NADH를 첨가하여 미토콘드리아의 전자전달계 복합체 I의 탈수소효소 활성을 테스트하였다. 도 12A에서 보여지는 바와 같이 미토콘드리아의 기능은 근위축성측삭경화증의 병리적 현상이 나타나기 이전시기부터 현저히 감소되어짐을 알 수 있었다.
이러한 근위축성측삭경화증에 의한 미토콘드리아의 기능 저하에 대한 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 효과를 알아보기 위하여, SOD1 G93A의 신경세포를 배양한뒤 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2를 처리하였다. 도 12B에서 보여지는 바와 같이 미토콘드리아의 복합체 활성은 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2에의해 개선됨을 알 수 있었다. 또한 미토콘드리아의 기능을 나타내는 또 다른 지표인 미토콘드리아 막전위 수치에서도 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 개선효과는 입증되었다. 이처럼 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2는 신경세포에서 중요한 미토콘드리아의 기능을 개선하는데 큰 효과를 나타내었다.
<실시예 6> 제브라 피쉬 근위축정측삭경화증 모델에서 프로테인 포스파테아제 1 억제제 2의 질환 개선 효과
프로테인 포스파테아제 1 저해제 2의 효과를 개체 수준에서 알아보기 위하여 제브라 피쉬 근위축성측삭 경화증 모델을 이용하였다. Human SOD1 G93A 돌연변이 클론을 Addgene에서 구매하여 T7 RNA 중합효소로 sense RNA를 합성하였다. 운동신경세포와 축삭의 가시화가 가능한 형질전환(olig2:egfp) 제프라 피쉬의 1 세포 단계의 배아를 생산하여, 각 배아에 1.76 ng의 합성한 RNA를 미세주사하였다. 이후 24시간 동안 배양된 배아에 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2를 20 - 30 nM의 농도로 배아 배양액에 처리하고, 2일간 추가 배양하였다. 이미지 분석은 3일 째 배아를 0.03% Tricaine (Sigma-Aldrich)로 마취시킨 후 0.8% low-melting agarose에 표본화하여 레이저공초점주사현미경(LSM5 laser scanning confocal microscope, Zeiss)를 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, SOD1 G93A를 과발현시킨 배아의 운동신경세포의 축삭의 경우 짧고 변성이 일어나고 신경근육접합 부위 또한 변성이 나타남을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 등쪽으로 뻗은 운동신경세포의 축삭 또한 변성이 일어남을 볼 수 있다. 그러나 이러한 근위축성측삭경화증 모델에 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2를 처리한 그룹과 프로테인 포스파테아제 1의 화학적 억제제인 오카드산 (Okdaic acid)를 처리한 그룹에서 운동신경세포의 축삭 손상이 줄어들었음을 알 수 있다. 또한, 근위축성축삭경화증에 관련된 또 다른 유전자인 돌연변이 TDP-43를 과발현시킨 제브라피쉬 모델에서도 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2를 처리한 그룹과 오카드산를 처리한 그룹에서 운동신경 세포의 축삭변성이 억제됨을 알 수 있었다. 이처럼, 프로테인 포스파테아제 1 저해제 2는 근위축성측삭경화증의 병리적 현상인 미토콘드리아의 비정상적인 기능을 회복시키고, 이로 인해 축삭변성이 억제되어 운동신경세포의 기능적 향상과, 더 나아가 세포사멸을 억제하는 효과를 보인다.

Claims (6)

  1. 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  2. 프로테인 포스파타아제 저해제 2 단백질을 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고,
    상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는
    근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
  3. 프로테인 포스파타아제 저해제 2 유전자 또는 이를 발현하는 세포를 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고,
    상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는
    근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
  4. 프로테인 포스파타아제 1의 저해제를 유효성분으로 포함하며, 상기 저해제는 프로테인 포스파타아제 1에 대한 항체, 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터인 근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  5. 프로테인 포스파타아제 1 단백질을 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고,
    상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는
    근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
  6. 프로테인 포스파타아제 1 유전자 또는 이를 발현하는 세포를 시험관 내에서 후보물질과 접촉시키고,
    상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 증가시키는지 또는 감소시키는지를 판단하는 것을 포함하는
    근위축성측삭경화증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
PCT/KR2015/004428 2014-04-30 2015-04-30 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도 Ceased WO2015167296A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0052788 2014-04-30
KR1020140052788A KR101473153B1 (ko) 2014-04-30 2014-04-30 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015167296A1 true WO2015167296A1 (ko) 2015-11-05

Family

ID=52678979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2015/004428 Ceased WO2015167296A1 (ko) 2014-04-30 2015-04-30 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101473153B1 (ko)
WO (1) WO2015167296A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008089961A1 (en) * 2007-01-22 2008-07-31 University Of Zurich Use of phosphatase inhibitors for the treatment of neurodegenerative diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008089961A1 (en) * 2007-01-22 2008-07-31 University Of Zurich Use of phosphatase inhibitors for the treatment of neurodegenerative diseases

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORFINI, G.A. ET AL.: "Axonal Transport Defects in Neurodegenerative Diseases", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 29, no. 41, 2009, pages 12776 - 12786, XP055234993 *
STRAND, A. D. ET AL.: "Gene expression in Huntington's disease skeletal muscle: a potential biomarker", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 14, no. 13, 2005, pages 1863 - 1876, XP055234992 *
ZAMBRANO, C. A. ET AL.: "Oxidative stress promotes tau dephosphorylation in neuronal cells: the roles of cdk5 and PP1", FREE RADICAL BIOLOGY & MEDICINE, vol. 36, 2004, pages 1393 - 1402, XP055234990 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101473153B1 (ko) 2014-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nizzardo et al. Synaptotagmin 13 is neuroprotective across motor neuron diseases
Trazzi et al. HDAC4: a key factor underlying brain developmental alterations in CDKL5 disorder
Webster et al. O-GlcNAc modifications regulate cell survival and epiboly during zebrafish development
Li et al. Renal telocytes contribute to the repair of ischemically injured renal tubules
Jӓntti et al. Trophic activities of endoplasmic reticulum proteins CDNF and MANF
Vieira de Sá et al. ATAXIN-2 intermediate-length polyglutamine expansions elicit ALS-associated metabolic and immune phenotypes
Vicente-Acosta et al. The smoothened agonist SAG reduces mitochondrial dysfunction and neurotoxicity of frataxin-deficient astrocytes
WO2019180664A1 (en) Method for preventing or modulating fibrosis and fibrotic response associated with the integrated stress response
JP2001505766A (ja) アポトーシスと生長を調節するアデノウイルスベクターを有する、有糸分裂後のニューロン
Patel et al. Inhibition of mitochondrial fission and iNOS in the dorsal vagal complex protects from overeating and weight gain
Cai et al. USP25 contributes to defective neurogenesis and cognitive impairments
Chen et al. Neonatal but not juvenile gene therapy reduces seizures and prolongs lifespan in SCN1B–Dravet syndrome mice
WO2020168850A1 (zh) Ube3a泛素化PP2A激活因子PTPA在治疗天使综合症和孤独症中的应用
WO2015167296A1 (ko) 프로테인 포스파타아제 1 및 프로테인 포스파타아제 저해제 2의 신규 용도
Cadile Molecular determinants of diaphragm muscle impairment in a mouse model of Spinal Muscular Atrophy and a possible nutraceutical intervention
US8088892B2 (en) Inhibitors of proteins from the Rho-GEF family
Zhang et al. Long noncoding RNA upregulates adapter ShcA protein expression to promote cognitive impairment after cardiac arrest and resuscitation
KR20220159053A (ko) Ncapg2의 1010번째 트레오닌의 인산화 특이적 반응 여부를 확인하기 위한 항체 및 이의 이용
US20250059505A1 (en) Improved methods for inducing the maturation of mammalian cells
US20260043817A1 (en) Agent for detecting structurally abnormal protein and agent for reducing structurally abnormal protein
EP4253566A1 (en) Marker of calcium-overload-mediated neuronal death and application thereof
WO2009116764A2 (ko) Ptk7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제
CN118453601A (zh) 石蒜碱在制备治疗tdp-43相关疾病的药物中的应用
JP2006525031A (ja) Ａｃｈｅｒｏｎ発現の制御方法
Dutta et al. The 5-HT1A receptor antagonist WAY-100635 maleate promotes retinal ganglion cell differentiation and protects the retino-visual circuits

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15786625

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15786625

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1