WO2015166645A1 - キシロース資化能及びエタノール生産能を有する酵母 - Google Patents

キシロース資化能及びエタノール生産能を有する酵母 Download PDF

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スカンヤ ニチヨン
チャンソム ケオ－ウドネ
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a yeast having xylose assimilation ability and ethanol production ability, and a method for producing ethanol, more specifically, yeast Kluyveromyces marxianus No. 21 strains (Accession No .: NITE BP-01739), or mutants thereof having xylose utilization ability and ethanol production ability when cultured at 30 ° C. under aerobic conditions in a medium containing xylose as a sugar source And a method for producing ethanol using the yeast or a mutant thereof.
  • Bioethanol is produced by fermenting sugars produced from biomass, and is a renewable natural energy, and it does not increase the amount of carbon dioxide in the atmosphere due to its combustion. The future as an alternative fuel is expected.
  • Lignocellulosic biomass is composed of cellulose, hemicellulose, lignin and the like.
  • Xylose is a kind of pentose sugar and occupies about 25% of lignocellulose. If such xylose can be used as a raw material for bioethanol production, the use of lignocellulose-based biomass is expected to expand. However, since Saccharomyces cerevisiae, which is a general ethanol-producing yeast, does not have xylose utilization ability, xylose cannot be used as a raw material for ethanol production when Saccharomyces cerevisiae is used.
  • microorganisms imparted with xylose assimilation ability by genetic recombination for example, fungal hosts transformed with a nucleic acid construct containing a nucleotide sequence encoding xylose isomerase and given the ability to use xylose as a carbon source
  • Mutant yeast belonging to the genus Kluyveromyces modified so as to improve ethanol yield from xylose by attenuating cells see Patent Document 3
  • ADH1 gene and ADH4 gene see Patent Document 4
  • a microorganism whose expression rate of glycine synthesis protein gene and / or methionine synthesis protein gene is lost and xylose metabolism enzyme gene is introduced to increase the utilization rate of xylose (Patent Document 5) Have been proposed).
  • genetically modified microorganisms are microorganisms that do not exist in nature
  • the gene assembly is taken from the fermentation tank that produced ethanol.
  • Many restrictions on so-called physical containment arise, such as the need to provide highly airtight equipment so that the replacement microorganisms do not leak.
  • an accompanying device in case of leakage is required, and at the end of fermentation, it becomes a factor of high cost such as having to be completely sterilized and discarded.
  • Non-Patent Document 1 the phenomenon of “glucose repression” in which a pathway related to metabolism of other sugars is inhibited in the presence of glucose is well known (see Non-Patent Document 1), and various types including glucose. It was a problem in ethanol production from biomass composed of various sugars.
  • Kluyveromyces marcianus DMKU3-1042 strain which is a heat-resistant ethanol-producing yeast, using various pentoses and hexoses as sugar sources (non- Patent Document 2). Since Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042 has heat resistance, fermentation at high temperature is possible. Therefore, if Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042 strain is used, the cost required for the equipment for cooling the culture solution that has become high temperature due to the heat of fermentation generated in the fermentation process can be reduced. As a source, there was a problem that ethanol productivity was very low.
  • an object of the present invention is to provide a heat-resistant yeast that can assimilate xylose and produce ethanol, or a mutant thereof, and a method for assimilating xylose to produce ethanol.
  • the present inventors first obtained a heat-resistant yeast that can grow at 47 ° C. in Laos. Further examination of the properties of such heat-resistant yeast revealed that xylose can be assimilated when cultured at 40 ° C. in the presence of glucose, and when cultured under aerobic conditions using xylose as the sole sugar source. In addition, it was found that ethanol can be produced by assimilating xylose, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to [1] yeast Kluyveromyces marcianus no. 21 strains (Accession No .: NITE BP-01739), or mutants thereof having xylose utilization ability and ethanol production ability when cultured at 30 ° C. under aerobic conditions in a medium containing xylose as a sugar source [2]
  • the present invention relates to a method for producing ethanol, comprising culturing the yeast according to the above [1] or a mutant thereof under aerobic conditions in a medium containing xylose as a sugar source.
  • a heat-resistant yeast capable of assimilating xylose and producing ethanol.
  • the yeast of the present invention or its mutant strain can assimilate xylose even at 40 ° C., if ethanol is produced using the yeast of the present invention or its mutant strain, it can be used as a facility for cooling the culture solution. Costs required can be reduced.
  • the yeast of the present invention or a mutant strain thereof has glucose resistance, it is possible to efficiently produce ethanol even if a saccharified solution derived from lignocellulose biomass is used as a sugar source.
  • Kluyveromyces Marcianus No. It is a figure which shows the result of having performed various stress tolerance tests about 21 strains. Kluyveromyces Marcianus No. It is a figure which shows the result of having performed the glucose tolerance test about 21 strains. Kluyveromyces Marcianus No. It is a figure which shows the result of having performed the ethanol production test from xylose about 21 strains. Kluyveromyces Marcianus No. It is a figure which shows the result of having culture
  • the 21 strains (hereinafter also simply referred to as “No. 21 strain”) are naturally-derived strains isolated by the present inventors in Laos, and are under the accession number NITE BP-01739, Kazusa Kama, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Deposited on October 24, 2013 at NITE Incorporated Administrative Agency Product Evaluation Technology Foundation, Patent Microbiology Deposit Center located in Room 122-5-8. No.
  • the 21 strain is a heat-resistant yeast that can assimilate xylose to produce ethanol.
  • mutant strain of the present invention No. 1 having xylose utilization ability and ethanol production ability when cultured at 30 ° C. under aerobic conditions in a medium containing xylose as a sugar source.
  • the mutant is not particularly limited as long as it is a 21 mutant (hereinafter also simply referred to as “the present mutant”).
  • a known mutagenesis method such as a method of irradiating 21 strains with ultraviolet rays or radiation, or a method of contacting with a mutagen substance is performed, and the medium containing xylose as a sugar source is subjected to aerobic conditions at 30 ° C. Can be obtained by selecting a strain capable of producing ethanol by assimilating xylose.
  • examples of the medium containing xylose as a sugar source include a medium containing at least xylose as a sugar component serving as a substrate for ethanol synthesis.
  • the amount of xylose contained in the medium is 0.5 to 20 %, Preferably 1.0 to 15%.
  • a medium containing xylose as a sugar source As a medium containing xylose as a sugar source, YPD medium (2% bactopeptone, 1% yeast extract, 2% glucose), YPAD medium (2% bactopeptone, 1% yeast extract, 2% glucose, 40 ⁇ l / ml) Adenine sulfate), SD medium (2% glucose, 0.67% L amino acid-free yeast nitrogen base), YM medium (0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% % Glucose), YP medium (1% yeast extract, 2% peptone), etc., a medium in which xylose is added to a medium generally used for yeast, and a pure sugar such as glucose, sucrose, or fructose together with xylose Or mixtures thereof, and xylose may be added as the sole sugar source.
  • YPD medium 2% bactopeptone, 1% yeast extract, 2% glucose
  • YPAD medium 2%
  • xylose as the sole sugar source means that xylose is included as a sugar component serving as a substrate for ethanol synthesis and no saccharide other than xylose is added.
  • a medium containing xylose as the sole sugar source examples include YPxy medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% xylose) in which xylose is added to the medium.
  • an inorganic salt such as ammonium sulfate, magnesium sulfate, or potassium phosphate or a sugar alcohol may be added as an auxiliary component to a medium containing xylose as a sugar source.
  • a medium containing xylose as a sugar source a medium added with a saccharified liquid derived from lignocellulose-based biomass may be used, and the method for preparing the saccharified liquid is not particularly limited, but an enzyme that degrades polysaccharides. It is prepared by degrading to monosaccharides that can be assimilated using sucrose, or by hydrolyzing polysaccharides with microorganisms that have the ability to degrade polysaccharides and degrading them to assimilate monosaccharides The method of doing can be mentioned.
  • culturing under aerobic conditions refers to culturing in the presence of molecular oxygen, and in the case of shaking culture, culturing at a rotational speed of 60 to 400 rpm (revolution per minute) can be mentioned. it can.
  • xylose can be metabolized.
  • Such xylose assimilation ability can be evaluated by cultivating yeast in a medium containing xylose and using the consumption of xylose contained in the medium from the start of culture as an index. When the yeast is cultured at 30 ° C. for 48 hours under the conditions and xylose is consumed by 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, the yeast has the ability to assimilate xylose. .
  • the consumption of xylose can be measured by a known method using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • ethanol production ability can be evaluated by cultivating yeast and using the amount of ethanol produced in the medium from the start of culture as an index.
  • the yeast can be produced at 30 ° C. under aerobic conditions using a YPXyl medium. Is cultured for 48 hours and ethanol is produced when ethanol is produced at 0.05% w / v or more, preferably 0.1% w / v or more, more preferably 0.2% w / v or more. It can be said that it has the ability.
  • the production amount of ethanol can be measured by a known method using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • the 21 strains and the mutant of the present invention (hereinafter collectively referred to as “the yeast”) can be cultured in YPD medium, YPAD medium, SD medium, YM medium and the like generally used for yeast culture.
  • the present yeast has resistance to various stresses.
  • the yeast is resistant to heat stress and can grow well even at a high temperature of 47 ° C.
  • the yeast has resistance to oxidative stress and can grow well in a medium containing 6 mM H 2 O 2 .
  • the present yeast has resistance to osmotic stress and can grow well in a medium containing 35% glucose.
  • the yeast is resistant to ethanol stress and can grow well in a medium containing 10% ethanol.
  • the yeast has glucose resistance.
  • Glucose resistance means resistance to the aforementioned glucose suppression. That is, glucose resistance is an indicator of the ability to assimilate various sugars and convert them to ethanol. Since the present yeast has glucose resistance, it is possible to efficiently produce ethanol using a liquid containing various sugars such as a saccharified liquid derived from lignocellulosic biomass.
  • the yeast can efficiently produce ethanol by assimilating xylose.
  • the heat-resistant yeast strain Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042 strain that the present inventors isolated in Thailand and exhibits excellent ethanol productivity at 40 ° C. or higher accesion number: NITE BP-291, Patent No. 5051727
  • strain 3-1042 When the xylose is assimilated using the publication (hereinafter also simply referred to as “strain 3-1042”), since xylitol is obtained as a metabolite more than ethanol, the ethanol production efficiency is low.
  • strain 3-1042 when xylose is assimilated using the present yeast, more ethanol is obtained as a metabolite than xylitol, so that ethanol production efficiency is high.
  • by culturing with increased air permeability most of the metabolites can be converted to ethanol, and in addition, the ethanol production time can be shortened.
  • the ethanol production method of the present invention is not particularly limited as long as the yeast is cultured under an aerobic condition in a medium containing xylose as a sugar source. By the ethanol production method of the present invention, From this, ethanol can be produced efficiently.
  • the present yeast is capable of ethanol fermentation at a high temperature of 30 ° C. or higher, saccharification treatment of lignocellulosic biomass with an enzyme and ethanol fermentation may be performed simultaneously in a medium.
  • the culture temperature is not particularly limited, but preferably 30 to 40 ° C, more preferably 30 to 37 ° C.
  • examples of the culture method include shaking culture, stirring culture, shaking stirring culture, continuous culture, or a combination thereof, and preferable examples include shaking culture and stirring culture.
  • the rotation speed can be 60 to 400 rpm, preferably 80 to 200 rpm.
  • aeration corresponding to 0.1 to 0.3 vvm may be performed in order to increase the cell density of yeast in a large-scale culture system.
  • the culture time can be 1 to 10 days, preferably 2 to 7 days, more preferably 2 to 3 days.
  • Examples of the pH of the medium include pH 4 to 8, preferably pH 5 to 7.
  • any conventionally known method can be applied.
  • a liquid phase containing ethanol by a solid-liquid separation operation yeast
  • a method of recovering by separating and purifying ethanol contained in the liquid phase by a distillation method after separating the solid phase containing the solid component can be mentioned.
  • oxidative stress 5 mM or 6 mM H 2 O 2
  • osmotic stress 30% or 35% glucose
  • ethanol stress 8% or 10% ethanol
  • Fig. 1 shows the results of various stress tolerance tests.
  • the figure is a matrix, columns are temperature conditions (30 ° C, 45 ° C, 47 ° C), rows are various stresses (1. heat stress, 2. oxidative stress, 3. osmotic stress, 4. ethanol stress). Respectively.
  • control strain 3-1042 upper: DMKU3-1042
  • No. Twenty-one stocks (bottom) are spotted side by side in a single photo.
  • strain 3-1042 For oxidative stress, no. Twenty-one strains showed better growth than strain 3-1042 under all temperature conditions. Strain 3-1042 hardly grew in the presence of 5 mM H 2 O 2 . On the other hand, no. It was revealed that 21 strains grew well at 30 ° C. and 45 ° C. and had a certain resistance to 5 mM H 2 O 2 even at 47 ° C.
  • FIG. 1 The results are shown in FIG.
  • the figure is a matrix, the columns indicate the culture temperature (30 ° C, 37 ° C, 40 ° C) and the conditions regarding the presence or absence of 2-DOG ([+ 0.01% 2-DOG] has 2-DOG).
  • the sugar sources (glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose) in the medium are shown.
  • control strain 3-1042 top
  • No. 21 stocks bottom
  • Glucose was a positive control, and both glucose and 2-DOG were taken up by cells, so there was no difference in growth between the two.
  • FIG. Fig has become a matrix
  • the column is absorbed OD 660 from the left (Growth OD660), xylose concentration (Xylose% w / v) in the culture medium, xylitol concentration in the broth (Xylitol% w / v), incubated
  • the ethanol concentration in the liquid is shown respectively.
  • the row indicates the shaking condition (50, 100, 150 rpm).
  • No. 21 strains are represented by light gray solid lines (- ⁇ -)
  • 3-1042 strains are represented by dark gray solid lines (- ⁇ -).
  • the results are shown in FIG.
  • the ethanol concentration (% w / v) in the culture solution is a light gray solid line (- ⁇ -)
  • the xylose concentration (g / L) in the culture solution is a dark gray solid line (- ⁇ -)
  • OD 660 Absorption is represented by a dark gray solid line (- ⁇ -).
  • the upper axis represents OD 660 absorption and xylose concentration (g / L) in the culture solution
  • the lower axis represents ethanol concentration (% w / v) in the culture solution.
  • yeast of the present invention If the yeast of the present invention is used, xylose can be assimilated to produce ethanol efficiently, which is useful in the ethanol production field.

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Abstract

　キシロースを資化してエタノールを生産可能な耐熱性の酵母又はその変異株や、キシロースを資化してエタノールを生産する方法を提供することを課題とする。　酵母クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３９）、又は、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下、３０℃で培養した場合にキシロース資化能及びエタノール生産能を有するその変異株を用いる。また、前記酵母又はその変異株を、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下で培養することを特徴とするエタノールの生産方法を行う。

Description

キシロース資化能及びエタノール生産能を有する酵母
　本発明は、キシロース資化能及びエタノール生産能を有する酵母や、エタノールの生産方法に関し、より詳しくは、酵母クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３９）、又は、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下、３０℃で培養した場合にキシロース資化能及びエタノール生産能を有するその変異株や、前記酵母又はその変異株を用いたエタノールの生産方法に関する。
　地球温暖化が世界中で問題となっているなかで、微生物によって様々な原料から発酵生産されるバイオエタノールが注目されている。バイオエタノールはバイオマスから生成した糖を発酵して生産されるエタノールであり、再生可能な自然エネルギーであること、及びその燃焼によって大気中の二酸化炭素量を増やさないことから、化石燃料、特にガソリンに代替する燃料としての将来性が期待されている。
　現在、工業的なバイオエタノールの生産において、原料としては、サトウキビ、糖蜜等の糖質や、トウモロコシ、ジャガイモ、キャッサバ等のデンプンが用いられているため、食料や飼料の生産と競合するという問題が生じている。そこで、草本系や木質廃材等のリグノセルロース系バイオマスが次世代のバイオエタノール原料として着目されている。リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等から構成される。これまでにリグノセルロース系バイオマスを原料としたエタノール生産についての研究が進められ、リグノセルロースを物理的、化学的処理により糖化してエタノールを生産する方法として、例えば、雑草を使用し、前記雑草を緩衝液に浸漬して当該緩衝液に電圧を印加することにより雑草の通電処理物を得る通電処理工程と、前記通電処理物を酵素により糖化物とする糖化工程と、前記糖化物を原料として酵母を添加してエタノール発酵を行う発酵工程とからなる処理方法（特許文献１参照）や、酵素糖化処理によって糖を製造し、さらにエタノール発酵によって糖からエタノールを製造する方法において、酵素糖化処理の前に、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物のエタノール水溶液を用いて、リグノセルロース系バイオマスを蒸解処理することにより糖を製造することを特徴とする前処理方法（特許文献２参照）が提案されている。しかしながら、リグノセルロースの物理的、化学的処理はコストや環境負荷の問題が解決しておらず、未だ実用化には至っていない。
　キシロースは五炭糖の一種であり、リグノセルロースの約２５％を占める。かかるキシロースをバイオエタノール生産の原料とすることができれば、リグノセルロース系バイオマス活用が拡大すると期待される。しかしながら、一般的なエタノール生産酵母であるサッカロマイセス・セレビシエはキシロース資化能を有さないため、サッカロマイセス・セレビシエを用いた場合、キシロースをエタノール生産の原料とすることができない。
　近年、遺伝子組換え等によりキシロース資化能を付与した微生物、例えば、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換し、キシロースを炭素源として利用する能力を付与された真菌宿主細胞（特許文献３参照）や、ＡＤＨ１遺伝子及びＡＤＨ４遺伝子を減弱化することで、キシロースからのエタノール収率を向上するように改変されたクルイベロマイセス属に属する変異体酵母（特許文献４参照）や、グリシン合成系タンパク質の遺伝子及び／又はメチオニン合成系タンパク質の遺伝子の発現機能を喪失させて、かつキシロース代謝酵素遺伝子を導入することで、キシロースの資化速度が上昇した微生物（特許文献５参照）が提案されている。
　しかしながら、遺伝子組換え微生物は自然界に存在しない微生物であるため、生態系への影響の関係上、遺伝子組換え微生物を用いてエタノール生産を行なう場合には、エタノール生産を行った発酵タンクから遺伝子組換え微生物が漏出しないように、気密性の高い設備を用意する必要がある等、いわゆる物理的封じ込めに関する多くの制約を生じる。さらに、漏出した場合に備えた付随装置も必要となると共に、発酵終了時には、完全に殺菌して廃棄しなければならない等のコスト高の要因となる。また、酵母では、グルコースの存在下で他の糖の代謝に係る経路が阻害される“グルコース抑制（Glucose Repression）”の現象がよく知られており（非特許文献１参照）、グルコースを含む多様な糖で構成されるバイオマスからのエタノール生産における課題となっていた。
　また、本発明者らは、耐熱性エタノール生産酵母であるクルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３－１０４２株を用い、糖源として様々な五炭糖や六炭糖を用いてエタノール生産を検討した（非特許文献２参照）。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３－１０４２株は耐熱性を有するため、高温での発酵が可能となる。したがって、クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３－１０４２株を用いれば、発酵工程で生じた発酵熱により高温となった培養液を冷却するための設備に要するコストを低減できるが、五炭糖のみを糖源とするとエタノール生産性は非常に低いという問題があった。
特開２００５－０５８０５５号公報 特開２０１３－０４２７２７号公報 特開２０１２－２３１７９４号公報 特開２０１２－２１０１６９号公報 特開２０１２－１８３０１３号公報
Marian C (1999) Current Opinion in Microbiology 2:202-207 Rodrussamee N et al. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. 90:1573-1586
　上述したように、微生物を利用して、キシロースを資化してエタノールを生産する方法が提案されているが、未だ低コストで効率よくキシロースを資化してエタノールを生産可能な株は得られていないのが現状であった。そこで、本発明の課題は、キシロースを資化してエタノールを生産可能な耐熱性の酵母又はその変異株や、キシロースを資化してエタノールを生産する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、まずはラオス国内において４７℃でも生育可能な耐熱性酵母を得た。かかる耐熱性酵母の性質をさらに調べたところ、グルコース存在下、４０℃で培養した場合にキシロースを資化可能であること、及び、キシロースを唯一の糖源として好気的条件下で培養した場合に、キシロースを資化してエタノールを生産可能であることを見いだし、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、［１］酵母クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３９）、又は、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下、３０℃で培養した場合にキシロース資化能及びエタノール生産能を有するその変異株や、［２］上記［１］記載の酵母又はその変異株を、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下で培養することを特徴とするエタノールの生産方法に関する。
　本発明によれば、キシロースを資化してエタノールを生産することが可能な耐熱性の酵母を提供することができる。また、本発明の酵母又はその変異株は４０℃でもキシロースを資化可能であることから、本発明の酵母又はその変異株を用いてエタノールを生産すれば、培養液を冷却するための設備に要するコストを低減することが可能となる。さらに、本発明の酵母又はその変異株はグルコース抵抗性を有することから、糖源としてリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を用いても効率よくエタノール生産を行うことが可能となる。
クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株について、各種ストレス耐性試験を行った結果を示す図である。 クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株について、グルコース抵抗性試験を行った結果を示す図である。 クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株について、キシロースからのエタノール生産試験を行った結果を示す図である。 クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株について、３０℃又は３７℃で培養してキシロースからのエタノール生産試験を行った結果を示す図である。
　本発明の酵母クルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)Ｎｏ．２１株（以下、単に「Ｎｏ．２１株」ともいう）は、本発明者らがラオス国内で分離した天然由来の株であり、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３９として、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室に所在するＮＩＴＥ独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに２０１３年１０月２４日に寄託されている。Ｎｏ．２１株は、キシロースを資化してエタノールを生産することが可能な耐熱性の酵母である。
　本発明の変異株としては、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下、３０℃で培養した場合にキシロース資化能及びエタノール生産能を有するＮｏ．２１株の変異株（以下、単に「本件変異株」ともいう）であれば特に制限されず、かかる本件変異株は、Ｎｏ．２１株に対して紫外線や放射線を照射する方法や、変異原となる物質と接触させる方法等の公知の変異処理方法を行い、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下、３０℃で培養した場合にキシロースを資化してエタノールを生産可能である株を選択することにより得ることができる。
　本発明において、キシロースを糖源として含有する培地としては、エタノール合成の基質となる糖成分として少なくともキシロースを含有する培地を挙げることができ、培地に含有するキシロース量としては、０．５～２０％、好ましくは１．０～１５％を挙げることができる。かかるキシロースを糖源として含有する培地としては、ＹＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース）、ＹＰＡＤ培地（２％バクトペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース、４０μｌ／ｍｌ硫酸アデニン）、ＳＤ培地（２％グルコース、０．６７％Ｌアミノ酸不含イーストニトロジェンベース）、ＹＭ培地（０．３％酵母エキス、０．３％麦芽抽エキス、０．５％ペプトン、１％グルコース）、ＹＰ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン）等の酵母に一般的に用いられる培地にキシロースを加えた培地を挙げることができ、キシロースと共にグルコース、スクロース、又はフルクトースといった純粋な糖やそれらの混合物を加えてもよく、また、キシロースを唯一の糖源として加えてもよい。キシロースを唯一の糖源として加えるとは、エタノール合成の基質となる糖成分としてキシロースを含み、キシロース以外の糖類を加えないことを意味し、キシロースを唯一の糖源として含有する培地としては、ＹＰ培地にキシロースを加えたＹＰＸｙｌ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％キシロース）を挙げることができる。なお、キシロースを糖源として含有する培地に、補助成分として硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム等の無機塩や、糖アルコールを加えてもよい。
　さらに、キシロースを糖源として含有する培地としては、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を加えた培地を用いてもよく、糖化液を作製する方法としては特に制限されないが、多糖類を分解する酵素を用いて資化可能な単糖類にまで分解することにより作製する方法や、多糖類を分解する能力を有する微生物により多糖類を加水分解し、資化可能な単糖類にまで分解することにより作製する方法を挙げることができる。
　本発明において、好気的条件下で培養するとは、分子状酸素の存在下で培養することをいい、振とう培養の場合、回転数６０～４００ｒｐｍ（revolution per minute）での培養を挙げることができる。
　本件変異株において、キシロース資化能を有するとは、キシロースを代謝することが可能であることを意味する。かかるキシロース資化能は、キシロースを含有する培地で酵母を培養し、培養開始からの培地に含まれるキシロースの消費量を指標にして評価することができ、具体的にはＹＰＸｙｌ培地により好気的条件下、３０℃で酵母を４８時間培養し、キシロースが５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上消費される場合に、前記酵母はキシロース資化能を有するということができる。なお、キシロースの消費量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた公知の手法により測定することができる。
　本件変異株において、エタノール生産能を有するとは、エタノールを生産することが可能であることを意味する。かかるエタノール生産能は、酵母を培養し、培養開始からの培地に含まれるエタノールの生産量を指標にして評価することができ、具体的にはＹＰＸｙｌ培地により好気的条件下、３０℃で酵母を４８時間培養し、エタノールが０．０５％　ｗ／ｖ以上、好ましくは０．１％　ｗ／ｖ以上、より好ましくは０．２％　ｗ／ｖ以上生産される場合に、前記酵母はエタノール生産能を有するということができる。なお、エタノールの生産量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた公知の手法により測定することができる。
　Ｎｏ．２１株や本件変異株（以下、総称して「本件酵母」ともいう）は、一般的に酵母の培養に用いられるＹＰＤ培地、ＹＰＡＤ培地、ＳＤ培地、ＹＭ培地等により培養することができる。
　本件酵母は、さまざまなストレスに対する耐性を有する。まず、本件酵母は、熱ストレスに対する耐性を有し、４７℃という高温においても良好に生育することが可能である。また、本件酵母は、酸化ストレスに対する耐性を有し、６ｍＭのＨ2Ｏ2を含有する培地において良好に生育することが可能である。さらに、本件酵母は、浸透圧ストレスに対する耐性を有し、３５％グルコースを含有する培地において良好に生育することが可能である。加えて、本件酵母は、エタノールストレスに対する耐性を有し、１０％エタノールを含有する培地において良好に生育することが可能である。
　また、本件酵母はグルコース抵抗性を有する。グルコース抵抗性とは、前述のグルコース抑制に対する抵抗性を意味する。すなわちグルコース抵抗性は、多様な糖を資化しこれをエタノールに変換する能力の指標である。本件酵母はグルコース抵抗性を有することから、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液等の様々な糖類を含有する液体を用いて効率よくエタノール生産を行うことが可能となる。
　さらに、本件酵母はキシロースを資化して効率よくエタノールを生産することが可能である。本発明者らがタイ国内にて分離し、４０℃以上で優れたエタノール生産性を示す耐熱性酵母株クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３－１０４２株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－２９１、特許第５０５１７２７号公報：以下単に「３－１０４２株」ともいう）を用いてキシロースを資化した場合には、代謝産物としてエタノールよりもキシリトールが多く得られるため、エタノール生産効率が低い。しかしながら、本件酵母を用いてキシロースを資化した場合には、代謝産物としてキシリトールよりもエタノールが多く得られるため、エタノール生産効率が高い。特に通気性を高めて培養することにより、代謝産物のほとんどをエタノールとすることができ、加えて、エタノール生産時間の短縮も可能となる。
　本発明のエタノールの生産方法としては、本件酵母を、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下で培養する方法であれば特に制限されず、かかる本発明のエタノール生産方法により、キシロースからエタノールを効率的に生産することが可能となる。
　なお、本件酵母は３０℃以上の高温でのエタノール発酵が可能であることから、培地中でリグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化処理とエタノール発酵を同時に行ってもよい。
　本発明のエタノールの生産方法において、培養する温度としては特に制限されないが、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃を挙げることができる。また、培養方法としては、振とう培養、撹拌培養、振とう撹拌培養、連続培養、又はこれらの組み合わせを挙げることができ、振とう培養又は撹拌培養を好適に挙げることができる。振とう培養の場合の回転数は６０～４００ｒｐｍ、好ましくは８０～２００ｒｐｍを挙げることができる。さらに、大量培養系における酵母の細胞密度を上げるためには０．１～０．３ｖｖｍ（Vessel volume per minute）に相当するエアレーションを行ってもよい。通気性を高めることによって、キシロースを資化して得られた代謝産物としてキシリトールよりもエタノールの生産割合を高めることが可能となる。また、培養時間としては、１～１０日、好ましくは２～７日、より好ましくは２～３日を挙げることができる。培地のｐＨとしては、ｐＨ４～８、好ましくはｐＨ５～７を挙げることができる。
　本発明におけるエタノールの生産方法において、培地から生産されたエタノールを回収する方法としては、従来公知のいかなる方法も適用することができ、例えば、固液分離操作によってエタノールを含む液相と、酵母や固形成分を含有する固相とを分離し、その後、液相に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで回収する方法を挙げることができる。
（酵母の単離）
　ラオス国内４つの地域において、果実、野菜、草木の葉や土からサンプルを採取し、ＹＰＤ培地に植え込み、３７℃で３日間培養後、ＹＰＤ寒天平板上に広げて３７℃で１～２日間培養しコロニーとして分離した。かかる分離したコロニーから、耐熱性を有し、キシロース資化能が高い株をスクリーニングし、そのうちの１株をＮｏ．２１と命名した。
（酵母の同定）
　前述のスクリーニングで得られたＮｏ．２１株について、その形態的、生理的、生化学的性質を一般的な方法（Kurtzman and Fell (1998)）等により調べた。その結果、Ｎｏ．２１株は、コロニーはクリーム色、湿光、隆起状で、滑らかな縁を有し、粘着性があり、多極性に出芽しており、子嚢胞子は球形で、２～４胞子／子嚢であった。また、かかる株は４５℃で生育し、グルコースからエタノールを生産した。さらに、Ｎｏ．２１株からゲノムＤＮＡを抽出し、サンガー法によりその２６Ｓ　ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を決定し、ＢＬＡＳＴ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｓｅａｒｃｈを用いて酵母の既知種と比較した。その結果、クルイベロマイセス・マルシアヌスの既知株（ＢＭ４株、ＮＢＲＣ１７７７株等）と１００％配列が一致した。したがって、Ｎｏ．２１株はクルイベロマイセス・マルシアヌスと同定した。
（各種ストレス耐性）
　Ｎｏ．２１株の工業的な有用性を確認するため、酵母を用いた培養で起こりうる種々のストレスへの耐性を検討した。ＹＰＤ液体培地（ｐＨ７．０）にＮｏ．２１株又は対照株として３－１０４２株を一白金耳植菌し、３０℃、１８時間、好気的条件下で培養して原菌液を調製した。次にＹＰＤ寒天培地を用意し、Ｎｏ．２１株、３－１０４２株の原菌液をＹＰ液体培地によって１倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈してそれぞれ左から順に５箇所スポットし、３０℃、４５℃、４７℃の３温度条件下で１８時間培養して生育を調べた。また、上記の熱ストレス（物理的ストレス）の他、酸化ストレス（５ｍＭ又は６ｍＭ　Ｈ2Ｏ2）、浸透圧ストレス（３０％又は３５％　グルコース）、エタノールストレス（８％又は１０％　エタノール）の３種類の化学的なストレスを検討するため、各ストレス源を含有したＹＰＤ寒天培地上に上述と同様に希釈した原菌液をそれぞれスポットして培養し、生育を比較した。
　図１に、各種ストレス耐性試験の結果を示す。図はマトリックスになっており、列は温度条件（３０℃、４５℃、４７℃）を、行は各種ストレス（１．熱ストレス、２．酸化ストレス、３．浸透圧ストレス、４．エタノールストレス）をそれぞれ示している。１枚のＹＰＤ寒天培地プレートに対照株の３－１０４２株（上段：ＤＭＫＵ３－１０４２と記載）とＮｏ．２１株（下段）を並べてスポットし、１枚の写真に収めている。
　熱ストレスに対しては、Ｎｏ．２１株は３０℃、４５℃、４７℃いずれの温度条件下でも良好に生育し、特に４７℃では耐熱性エタノール生産株である３－１０４２株よりも生育が良好であった。このことから、Ｎｏ．２１株は耐熱性の菌株として高温条件下で利用可能なことが明らかとなった。
　酸化ストレスに対しては、Ｎｏ．２１株はすべての温度条件下で３－１０４２株よりも良好な生育を示した。５ｍＭ　Ｈ2Ｏ2存在下で３－１０４２株はほとんど生育しなかった。一方、Ｎｏ．２１株は３０℃、４５℃では良好に生育し、４７℃においても５ｍＭのＨ2Ｏ2に対しては一定の抵抗性を持つことが明らかとなった。
　浸透圧ストレスに対しては、Ｎｏ．２１株は３－１０４２株とほぼ同程度の抵抗性を示した。３－１０４２株にはわずかに劣るものの、４５℃まではその生育が良好であることが示され、浸透圧ストレス下でも利用可能なことが明らかとなった。
　エタノールストレスに対しては、Ｎｏ．２１株は３０℃において３－１０４２株よりも良好な生育を示した。４５℃、４７℃ではどちらの株も全く生育しなかった。３０℃、８％エタノールでは、化学的なストレスの無い熱ストレスのみの場合と同程度の生育を示し、本菌株がエタノール耐性を有していることが示された。
（グルコース抵抗性試験）
　上述のＮｏ．２１株及び３－１０４２株の原菌液をＹＰ液体培地によって１倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈して、各種糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース）を唯一の糖源とするＹＰＤ寒天培地（各種糖をそれぞれ２％含有）にそれぞれ左から順に５箇所スポットし、２－デオキシグルコース（２－ＤＯＧ）を０．０１％となるように添加して３０℃、３７℃、４０℃の３温度条件下で４８時間培養してグルコース抵抗性を調べた。２－ＤＯＧはグルコーストランスポーターによって取り込まれ、かつ解糖系において代謝されない物質であり、２－ＤＯＧを添加することでグルコース抑制を誘導することができる。
　結果を図２に示す。図はマトリックスになっており、列は培養温度（３０℃、３７℃、４０℃）と２－ＤＯＧの有無に関する条件（［＋０．０１％　２－ＤＯＧ］が２－ＤＯＧ有）を、行は培地中の糖源（グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース）をそれぞれ示している。１枚のＹＰＤ寒天培地プレートに対照の３－１０４２株（上段）とＮｏ．２１株（下段）をそれぞれスポットし、撮影した写真を並べている。
　グルコースは陽性対照であり、グルコースも２－ＤＯＧも共に細胞が取り込むため、両者の間で生育に差は見られなかった。
　ガラクトースについては、３０℃、３７℃、４０℃の各温度で２－ＤＯＧ存在下における生育が陽性対照のグルコースよりも悪くなっており、Ｎｏ．２１株及び３－１０４２株の両方でグルコース抑制がみられた。また、Ｎｏ．２１株と３－１０４２株との間で明確な差はみられなかった。
　マンノースについては、Ｎｏ．２１株及び３－１０４２株の両方でグルコース抑制がみられなかった。これはマンノースの代謝がグルコースの存在によって影響を受けないという酵母の性質によるものと考えられた。また、Ｎｏ．２１株と３－１０４２株との間で明確な差はみられなかった。
　キシロースについては、Ｎｏ．２１株及び３－１０４２株の両方でグルコース抑制がみられたが、Ｎｏ．２１株の方がその抑制効果は小さく、Ｎｏ．２１株はグルコース抵抗性を有する株であることが明らかになった。２－ＤＯＧへの抵抗性は特に高温（３７℃、４０℃）で顕著であり、Ｎｏ．２１株は４０℃付近という高温条件において、たとえグルコースが存在する培養液でもキシロースを資化する能力を有していることが明らかとなった。
　アラビノースについては、Ｎｏ．２１株及び３－１０４２株の両方でグルコース抑制がみられたが、Ｎｏ．２１株は特に高温（３７℃、４０℃）において３－１０４２株より高いグルコース抵抗性を有していることが明らかとなった。アラビノースについても、Ｎｏ．２１株はグルコース存在下で資化できることが示された。
（キシロースからのエタノール生産－１）
　Ｎｏ．２１株が有するキシロースからのエタノール生産性を検討するため、キシロースを唯一の糖源として含有する液体ＹＰＸｙｌ培地を用いたエタノール生産試験を行った。Ｎｏ．２１株及び３－１０４２株を３０ｍＬのＹＰＸｙｌ培地（ｐＨ７、キシロースを２％含有）に一白金耳植菌し、３０℃で培養した。キシロース資化の酸素要求性を確認するため、５０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍの３条件で振とう培養し、生育とエタノール生産性を調べた。培養はそれぞれ９６時間行い、２４時間ごとに培養液を少量採取し、ＯＤ660の吸収（生育の指標）、培養液中のキシロース濃度（キシロースの資化の指標）、培養液中のキシリトール濃度（エタノール発酵に使われなかったキシロースの指標）、培養液中のエタノール濃度（エタノール生産能の指標）をそれぞれ測定した。キシロース濃度、エタノール濃度は、培養液を遠心分離（１４,０００ｒｐｍ、１分）し、上清をメンブレンフィルター（日本ポール社製）でろ過して検液とし、高速液体クロマトグラフィー（日立ハイテクノロジーズ社製）で測定することで求めた。培地中のエタノール濃度の測定における高速液体クロマトグラフィーの分析条件として、カラムはＧｅｌｐａｃｋ（登録商標）ＧＬ－Ｃ６１０－Ｓ（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用した。
　結果を図３に示す。図はマトリックスになっており、列は左からＯＤ660の吸収（Ｇｒｏｗｔｈ　ＯＤ６６０）、培養液中のキシロース濃度（Ｘｙｌｏｓｅ　％ｗ／ｖ）、培養液中のキシリトール濃度（Ｘｙｌｉｔｏｌ　％ｗ／ｖ）、培養液中のエタノール濃度（Ｅｔｈａｎｏｌ　％ｗ／ｖ）をそれぞれ表している。行は振とう条件（５０、１００、１５０ｒｐｍ）を示す。図中、Ｎｏ．２１株を薄い灰色実線（－▲－）、３－１０４２株を濃い灰色実線（－◆－）でそれぞれ表している。
　５０ｒｐｍで振とう培養した場合は、両株ともほとんど生育せず、培養液中のキシロース濃度もほとんど変化が無く、エタノールも生産されなかった。これは、キシロースの資化に酸素（通気）が必要であることを示している。
　１００ｒｐｍで振とう培養した場合は、両株とも良好に増殖した。培養液中のキシロース濃度も時間経過と共に減少し、それぞれの菌株がキシロースを資化したことを示している。一方、培養液中のキシリトール濃度は３－１０４２株の方が高く、反対にエタノール濃度はＮｏ．２１株の方が高かった。この結果は、Ｎｏ．２１株がキシロースを資化してエタノール発酵を行ったのに対し、３－１０４２株はエタノール発酵以外の他の代謝にキシロースを使い、その結果、キシリトールが代謝産物として増加したと考えられた。また、Ｎｏ．２１株は、７２時間で０．３％（ｗ／ｖ）のエタノールを生産した。
　１５０ｒｐｍで振とう培養した場合でも、１００ｒｐｍ同様に両株ともキシロースを資化し、良好に増殖した。Ｎｏ．２１株では、培養液中のキシリトールの濃度はほぼ０％であり、エタノール濃度は４８時間でほぼ極大（０．２％　ｗ／ｖ）に達した。十分な通気により、Ｎｏ．２１株ではキシロースの資化が早く進み、エタノールが効率よく生産されたことが示された。なお、３－１０４２株においては、エタノールはほとんど生産されず（＜０．１％）、その代わりにキシリトールが培養液中に蓄積した。
　これらの結果より、Ｎｏ．２１株は培養液中のキシロースを唯一の糖源として資化し、ここからエタノールを生産する能力を有している株であることが示された。キシロースは植物系バイオマスに豊富に含まれる五炭糖である。これまでは酵母の資化性に問題があり、かかる問題が植物系バイオマスからのエタノール生産を阻害する要因になっていたが、本発明の酵母であるＮｏ．２１株はこの技術課題を解決する優れた酵母株であることが示された。
（キシロースからのエタノール生産－２）
　Ｎｏ．２１株が３７℃でもキシロースからのエタノール生産性を有することを以下の方法で確認した。Ｎｏ．２１株、３－１０４２株及びキシロースを資化してエタノールを生産する能力が高いピキア・スチピチス（P.stipitis）株を３０ｍＬのＹＰＸｙｌ培地（ｐＨ７、キシロースを２％含有）に一白金耳植菌し、３０℃又は３７℃、１６０ｒｐｍで培養して生育とエタノール生産性を調べた。培養はそれぞれ１２０時間行い、１２時間ごとに培養液を少量採取し、ＯＤ660の吸収（生育の指標）及び培養液中のキシロース濃度（キシロースの資化の指標）、培養液中のエタノール濃度（エタノール生産能の指標）をそれぞれ測定した。キシロース濃度、エタノール濃度は、上述と同様の方法で測定することで求めた。
　結果を図４に示す。各図中、培養液中のエタノール濃度（％ｗ／ｖ）を薄い灰色実線（－▲－）、培養液中のキシロース濃度（ｇ／Ｌ）を濃い灰色実線（－◆－）、ＯＤ660の吸収を濃い灰色実線（－■－）でそれぞれ表している。また、各図中、上段の軸はＯＤ660の吸収や、培養液中のキシロース濃度（ｇ／Ｌ）、下段の軸は培養液中のエタノール濃度（％ｗ／ｖ）を表す。
　Ｎｏ．２１株を培養した場合には、３０℃だけでなく３７℃でもキシロースを糖源としてエタノールを効率よく生産するが、３－１０４２株やピキア・スチピチス株を培養した場合には、３０℃ではキシロースを糖源としてエタノールを効率よく生産するものの、３７℃ではキシロースを糖源としたエタノールの生産効率が低いことが明らかとなった。
　本発明の酵母を用いれば、キシロースを資化してエタノールを効率的に生産することが可能であり、エタノール生産分野において有用である。

Claims (2)

  1. 酵母クルイベロマイセス・マルシアヌスＮｏ．２１株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３９）、又は、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下、３０℃で培養した場合にキシロース資化能及びエタノール生産能を有するその変異株。
  2. 請求項１記載の酵母又はその変異株を、キシロースを糖源として含有する培地により好気的条件下で培養することを特徴とするエタノールの生産方法。
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RODRUSSAMEE, NADCHANOK ET AL.: "Growth and ethanol fermentation ability on hexose and pentose sugars and glucose effect under various conditions in thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 90, 2011, pages 1573 - 1586, XP055122883, ISSN: 0175-7598 *

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