WO2015166124A1 - Extracto de material vegetal del género crocus l. con alta actividad bioinsecticida - Google Patents

Extracto de material vegetal del género crocus l. con alta actividad bioinsecticida Download PDF

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alcoholic extract
crocus
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alcoholic
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PCT/ES2015/070320
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Azucena GONZÁLEZ COLOMA
Matías REINA ARTILES
Rodney Roland LACRET PIMIENTA
Alleta NIEUEWENHUIJS-BERBEE
Omar SANTANA MERIDAS
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Fundacion Parque Cientifico Y Tecnologico De Albacete (pcyta)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Holland Biodiversity Bv (hbd)
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Fundacion Parque Cientifico Y Tecnologico De Albacete (pcyta)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Holland Biodiversity Bv (hbd)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom

Definitions

  • the invention falls within the field of agriculture, and more specifically, in the field of biopesticides that comprise plant extracts, since it specifically refers to an alcoholic extract of plant material of the genus Crocus L., to its method of obtaining , to a phytosanitary composition comprising said extract, its use as a bioinsecticide and an insect-pest control method that uses the extract, the phytosanitary composition that comprises it and bioactive compounds present in the extract that are identified for the first time with bioinsecticidal activity.
  • Crocus L. (Iridaceae) comprises more than 88 different species of herbaceous perennials and geophytes, distributed throughout central and southeastern Europe, from Central Europe to Turkey, North Africa and from southwest Asia to Western China Many of them are highly regarded as ornamental plants for their colorful flowers and have great value as horticultural varieties (floriculture), while others stand out for their industrial applications.
  • the literature refers to the presence of anthocyanin and flavonoid pigments in petals of more than 70 Crocus species. Some lipids and fatty acids have been described in C. vallicola. In C. vernus the presence of alkanes and aroma-related compounds (ar-tumerona) in corms and flowers respectively has been reported. In methanolic extracts of the complete plant of C. Baytopiorum has been found different phenolic compounds (p-cumaric and rosmarinic acids, quercetin, kaempferol and apigenin glycosides). Different flavone glycosides have been described in leaves of C. tommasinianus and C. corsicus.
  • Crocus sativus L. (saffron) is the most representative species of the genus and the only iridácea that has been used extensively in the food industry, specifically to obtain the spice "saffron", which is considered one of the most expensive food products of the world with a market value close to € 3000 per kilogram.
  • each day is valued more for its pharmacological and nutraceutical properties.
  • it has very little added value if we take into account that less than 0.001% of the plant's biomass is used to obtain the main product.
  • the chemical composition of the stigmas of C. sativus includes more than 150 volatile compounds belonging to different chemical classes among which are terpenes, terpene alcohols and their respective esters.
  • volatile compounds belonging to different chemical classes among which are terpenes, terpene alcohols and their respective esters.
  • carotenoids zeaxanthin, lycopene and ⁇ -carotene
  • kaempferol axanthin, lycopene and ⁇ -carotene
  • the major and most studied components of stigmas are crocines (c / s- and trans-), picrocrocin and safranal, compounds responsible for yellow color, taste (bitter principle) and spice aroma, respectively.
  • fatty acids Among the natural compounds present in the petals of C. sativus, fatty acids, stigmasterol, monoterpenes, anthocyanins (delfinidine, petunidine and malvidin derivatives), flavonoids (quercetin, myricetin, apigenin, naringenin, phenolic acids and some derivatives of kaempferol) as well as more than 21 glycosylated and esterified derivatives of flavonones and flavonols.
  • flavonoids quercetin, myricetin, apigenin, naringenin, phenolic acids and some derivatives of kaempferol
  • the species C. sativus is attributed antidepressant, antitussive, antioxidant, anti-inflammatory, relaxing, anticonvulsant, aphrodisiac, anticancer, free radical chelating, and detoxifying activity, among others, which are related to the main components of stigma (crocinas, picrocinas and safranal) and corm (triterpenic saponins and bioactive glycoconjugates).
  • bioactive defense compounds that act against pests and pathogenic organisms. These types of compounds are characterized by being effective at very low doses, having little persistence in the environment (biodegradable), reducing the occurrence of cross-resistance and not presenting associated cytotoxic effects.
  • biopesticides is in a clear phase of expansion, mainly in North America and Europe, mainly due to the increase in organic and horticultural production (main plaintiffs of biopesticides), but also due to the need for the use of waste and to the consumer demand for healthier products.
  • Examples of natural insecticides that exist in the market are azadirachtin (Azadirachta indica, Neem), eugenol (Laurus sp.), Karanjin (Derris indica), PONNEEM (mixture of the oil of A. indica and Pongamia glabra), nicotine ⁇ Nicotiana tabacum ), phenethyl propionate (Mentha piperita), pyrethrins (Tanacetum cinerariaefolium), rotenone (Derris sp.), ryania and some essential oils and plant-derived acids.
  • a first aspect of the invention constitutes an alcoholic extract of plant material of the genus Crocus L. with bioinsecticidal activity, which comprises 3-0-3-D-glucopyranosyl- (3R) -hydroxybutanolide and which is especially effective against herbivorous pest insects.
  • the alcoholic extract is from the corm of Crocus sativus and additionally comprises at least one other bioactive compound with bioinsecticidal activity, which is selected from (R) -3-hydroxybutanolide and ethyl 3- (R) -3-3 - D-glucopyranosyloxybutanoate.
  • the alcoholic extract is an ethanolic extract.
  • a second aspect of the invention constitutes the method of obtaining the alcoholic extract comprising extracting with an alcohol, starting from plant material of the genus Crocus L.
  • the alcohol in the extraction is ethanol.
  • the process comprises a filtrate to obtain the soluble fraction.
  • a phytosanitary composition comprising the alcoholic extract constitutes a third aspect of the invention.
  • the use of the alcoholic extract and / or the phytosanitary composition for the control of herbivorous pest insects constitutes a fourth aspect of the invention.
  • a sixth aspect of the invention constitutes a phytosanitary treatment method for the control of herbivorous pest insects comprising administering a phytosanitary effective dose of the alcoholic extract and / or of the phytosanitary composition and / or of at least one of the bioactive compounds with bioinsecticidal activity.
  • the technical problem solved by the present invention is the search for new natural biopesticide products that can be used in the phytosanitary treatment of herbivorous insect pests, which are at the same time easily obtainable, effective and environmentally friendly. . It has been discovered that a product that is obtained from an ethanolic extraction of plant material from plants of numerous species and / or varieties belonging to the genus Crocus L., (see examples 1 to 4), surprisingly have a high bioinsecticidal activity against insects -Plague suckers and / or chewers herbivores (see examples 5 to 8).
  • obtaining extracts with bioinsecticidal activity constitutes an alternative for the recovery of plant material (corms, leaves, petals) with very little or no commercial value, which are mainly managed as a residue after the cultivation of saffron and / or spice processing.
  • plant material corms, leaves, petals
  • the invention relates to an alcoholic extract of plant material of the genus Crocus L.
  • alcoholic extract of the invention which comprises 3-0-3-D-glucopyranosyl- (3R) -hydroxybutane.
  • alcoholic extract of the invention is meant indistinctly the crude extract directly obtained from the extraction with an alcohol, of plant material of the genus Crocus L, which is preferably its soluble part, but also any successive fraction or subfraction obtained from said extract that comprises kinsenoside.
  • the alcoholic extract of the invention can be presented in a liquid state but also in a solid state, for example using lyophilization techniques.
  • the alcoholic extract of the invention is an ethanolic extract.
  • bioinsecticidal activity in the context of this invention, the ability to control pest insects is understood through different mechanisms of action. This capacity can be determined by different types of bioassays that include anti-food activity (inhibition of feeding and / or settlement in the case of aphids), repellent or toxic, among others.
  • Plant material means any of the different plant organs of the species of the genus Crocus L, including those found in the aerial part and in the underground part.
  • aerial parts are the stem, the leaves or the flowers, and preferably the leaves and / or the tepals.
  • underground parts are the corm and the roots, and preferably the corm.
  • Crocus L a genus of herbaceous, perennial and geophite plants belonging to the Iridáceas family and which are characterized by presenting an underground reserve organ called corm.
  • Examples, by way of illustration and not limitation, of species, subspecies and / or varieties of Crocus L. which are used within the scope of the invention are C. sativus, C. ancyrensis, C. cancellatus, C. carpetanus, C. chrysanthus, C. nevadensis, C. serotinus, C. serotinus ssp. salzmanii, C. vernus var. "flower record”, C. vernus var. "geel yellow", C.
  • the alcoholic extract of the invention is obtained from leaves, tepals or corms of the genus Crocus L, or a combination of the above parts.
  • insects against which the alcoholic extract of the invention is effective are mainly herbivorous pest insects with different trophic adaptations, be they chewing or sucking, and which can have a high incidence on horticultural crops causing serious economic losses, develop resistance to insecticides of synthesis and present virus transmission capacity.
  • Examples, by way of illustration and not limitation, of orders and species of herbivorous pest insects with different trophic, chewing or sucking adaptations are Lepidoptera, Homoptera, Coleoptera and Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata respectively.
  • the alcoholic extract of the invention comprises a bioinsecticidal activity against at least one of the Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata insects preferably between 50% and 75%, more preferably between 75% and 90% and still more preferably greater than 90% when used with a dose of 100 pg / cm 2
  • an alcoholic extract of the invention that is the soluble part of the ethanolic crude extract of the corm that is chosen from C. chrysanthus , C. ancyrensis, C. cancellatus, C. serotinus, C. serotinus ssp. salzmanii, C.
  • nevadensis comprises a bioinsecticidal activity against at least one of the Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi insects , Leptinotarsa decemlineata preferably greater than 80%, when used with a dose of 100 pg / cm 2
  • an alcoholic extract of the invention that is the soluble part of the ethanolic crude leaf extract that is chosen from C. chrysanthus, C. ancyrensis, C. serotinus, C. serotinus ssp. salzmanii, C. versicolor, C. vernus "flower record” C. carpetanus, C. speciosus, C. speciosus, "Aitchinsonü” C. angustifolius, C. dalmaticus, C. pulchellus, C. corsicus, C. kotschyanus, C. cartwrightianus, C. ligusticus and C.
  • sativus comprises a bioinsecticidal activity against at least one of the Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata preferably greater than 80%, when used with a dose of 100 pg / cm 2 .
  • fractionation techniques of the crude alcoholic extract widely known by any person skilled in the art are used.
  • liquid vacuum chromatography VLC
  • column chromatography CC
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • eluting with different polarity gradients by different combinations of organic solvents but also extraction with water at room temperature after dissolution in CH2CI2 .
  • any other technique that allows the obtaining and fractionation of the alcoholic extract of the invention for example, by the use of extractions by means of supercritical fluids and other advanced and / or conventional extraction / separation techniques.
  • the extract of the invention is any successive fraction and / or subfraction obtained from the crude alcoholic extract that It comprises kinsenoside and bioinsecticidal activity.
  • the person skilled in the art will know, it is possible to obtain different fractions from the crude extract, each of which comprises a different composition of bioactive compounds, and which in turn can be repeatedly subfractioned until the subfraction is constituted by a simple mixture and / or a single bioactive compound.
  • bioinsecticidal activity of the alcoholic extract of the invention is not explained exclusively by the activity of the kinsenoside.
  • the chemical fractionations carried out by the inventors, the determination of bioactive compounds and the bioinsecticide activity tests (see examples 5 to 8), allow to identify the activity of other compounds that could act synergistically.
  • fraction 10 obtained from corm of C. sativus in which the kinsenoside is present has an antialimentary activity of less than 40% against M. persicae, while the crude extract has an antialimentary activity of more than 80% for this insect .
  • an alcoholic extract of the invention which is the soluble part of the crude ethanol extract of corm of Crocus sativus, in addition to the kinsenoside, comprises at least one other bioactive compound with bioinsecticidal activity, which is selected from among the kinsenoside aglycon also known as (R) -3-hydroxybutanolide and ethyl 3- (R) -3- 3- D-glucopyranosyloxybutanoate.
  • an alcoholic extract of the invention which is the soluble part of the Crocus sativus ethanol crude corm extract, in addition to the above bioactive compounds, comprises at least one other bioactive compound that is selected from ⁇ -amirenone, lupenone , friedelin, ⁇ -amirin, stigmastenone and lupeol.
  • an alcoholic extract of the invention which is the soluble part of the crude ethanol extract of corm from Crocus sativus, It comprises a bioinsecticidal activity against at least one of the Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata, preferably greater than 70%, when used with a dose of 100 pg / cm 2 .
  • the invention relates to a method of obtaining the alcoholic extract of the invention, hereinafter the method of the invention, which comprises extracting with an alcohol based on plant material of the genus Crocus L.
  • Alcohol extraction means an extraction that uses an alcohol as an extractant, either pure or combined.
  • alcohols that are used in the scope of the present invention are ethanol and methanol.
  • the alcoholic extraction is carried out with ethanol.
  • the process of the invention comprises another filtering step to obtain the soluble fraction.
  • the invention relates to a phytosanitary composition comprising the alcoholic extract of the invention, hereinafter phytosanitary composition of the invention.
  • the phytosanitary composition of the invention can additionally comprise various vehicles and agents that facilitate its conservation, handling and application.
  • solid vehicles, liquid vehicles, gaseous vehicles, etc. are usually used, and, if necessary, surfactants and auxiliary agents for the formulation of phytosanitary compositions such as, for example, an additive to formulate forms such as emulsifiable concentrates, wettable powders, flowable liquids, (eg, water suspension, water emulsion, etc.), powders, aerosols, ULV and the like.
  • surfactants and auxiliary agents for the formulation of phytosanitary compositions such as, for example, an additive to formulate forms such as emulsifiable concentrates, wettable powders, flowable liquids, (eg, water suspension, water emulsion, etc.), powders, aerosols, ULV and the like.
  • solid carriers examples include fine powders or clay granules (eg kaolin clay, diatomaceous earth, synthetic hydrated silicon oxide, bentonite, Fubasami clay, acid clay, etc.), talcs , ceramics and other inorganic minerals (eg, sericite, quartz, sulfur, active carbon, calcium carbonate, hydrated silica, etc.), commercial fertilizers (eg, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea, ammonium chloride, etc.) and the like
  • liquid carriers examples include water, alcohols (eg, methanol, ethanol, etc.), ketones (eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.), aromatic hydrocarbons (eg, benzene, toluene, xylene, ethylbenzene, methylnaphthalene, etc.), aliphatic hydrocarbons (eg hexane, cyclohexane, kerosene, gas oil, etc.), esters (eg, ethyl acetate, butyl acetate, etc.), nitriles (eg, acetonitrile, isobutyronitrile, etc.), ethers (eg, diisopropyl ether, dioxane etc.), acid amides (eg, ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacetamide, etc.), halogenated hydrocarbons (eg, ⁇ , ⁇
  • Examples of a gaseous vehicle that are included in the scope of the present invention are spray agent, including flon gas, butane gas, LPG (liquid petroleum gas), dimethyl ether, carbon dioxide gas and the like.
  • spray agent including flon gas, butane gas, LPG (liquid petroleum gas), dimethyl ether, carbon dioxide gas and the like.
  • surfactant examples include alkyl sulfates, alkyl sulfonate salts, alkyl aryl sulfonates, alkyl aryl esters, polyoxyethylene compounds thereof, polyethylene glycol esters, polyhydric alcohol esters, derivatives of sugar alcohol and the like.
  • auxiliary agent for the formulation as fixing agent and dispersing agent examples include casein, gelatin, polysaccharides (eg, starch powder, gum arabic, cellulose derivative, alginic acid, etc. ), derivatives of lignin, bentonite, sugars, synthetic water-soluble polymers (eg, vinyl polyol, vinyl polypyrrolidone, acrylic polyacids, etc.) and the like.
  • stabilizers examples include PAP (isopropyl acid phosphate), BHT (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol), BHA (mixture of 2-tert-butyl-4 -methoxyphenol and 3-tert-butyl-4-methoxyphenol), vegetable oils, mineral oils, surfactants, fatty acids or esters thereof and the like.
  • the phytosanitary composition of the invention may comprise another active ingredient.
  • additional active ingredient examples include other insecticides, nematicides, acaricides, fungicides, herbicides, plant growth regulators, synergists, fertilizers, soil conditioners and animal baits.
  • the invention relates to the use of the alcoholic extract of the invention and / or the phytosanitary composition of the invention for the control of herbivorous pest insects.
  • the present invention relates for the first time to kinsenoside and other bioactive compounds identified from the alcoholic extract of the invention with the control of herbivorous pest insects.
  • the use of the invention includes kinsenoside, kinsenoside aglycone and ethyl 3- (R) -3-3-D-glucopyranosyloxybutanoate, either individually or in combination for insect control. herbivorous plague.
  • the invention relates to a phytosanitary treatment method for the control of herbivorous pest insects comprising administering a phytosanitary effective dose of the alcoholic extract of the invention and / or of the phytosanitary composition of the invention and / or of minus one of the bioactive compounds with bioinsecticidal activity comprised in the alcoholic extract of the invention and which are chosen from among kinsenoside, the kinsenoside aglycone and ethyl 3- (R) -3-3-D-glucopyranosyloxybutanoate.
  • the dose of the alcoholic extract of the invention and / or of the phytosanitary composition of the invention and / or of the bioactive compounds with bioinsecticidal activity included in the alcoholic extract of the invention may optionally increase or decrease depending on the product, the type of formulation, time, place and method of application, type of insect, degree of damage and the like.
  • FIGURES Figure 1 Chemical structure of the major compounds isolated from the corm of Crocus sativus.
  • A 3-0- 3-D-glucopyranosyl- (3R) -hydroxybutanolide (kinsenoside),
  • B (R) -3-hydroxybutanolide (kinsenoside aglycone)
  • C Ethyl 3- (R) -3- 3-D-glucopyranosyloxybutanoate.
  • C. ligusticus Leaves HBD to HBD Holland Biodiversity (Nursery), b Collected in the Sierra de Madrid (Madrid, Spain), c Collected in Motilla del Palancar (Cuenca, Spain), d Collected in Huete (Cuenca, Spain).
  • the dried and ground samples were repeatedly extracted for 24 hours with ethanol in a Soxhiet apparatus and filtered in vacuo.
  • the raw ethanol extracts obtained, after removing the solvent, were stored at 4 ° C until the analysis of the biological and chemical profiles of the corms, leaves and tepals.
  • Table 2 shows the extraction yields before filtering, obtained for each part of the plant and species of the genus Crocus L. used in this invention.
  • the soluble part of the ethanolic crude extract obtained using corms of C. sativus according to example 2 constituted 6.70%, while the precipitate constituted 0.72%.
  • the fractionation of the soluble part in ethanol was performed by a vacuum liquid chromatography (VLC) using silica gel as stationary phase It was eluted with a gradient of increasing polarity of Hexane: AcOEt (0-100% AcOEt) and AcOEt: MeOH, (2-50% MeOH) obtaining 10 fractions (Frs. 1-10). The fractions with the highest biocidal activity; 3, 6 and 10 were again divided.
  • GC-MS Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry
  • Fraction 10 which constitutes the most polar and abundant fraction of the C. sativus corm (32.2g, 48% of the initial crude extract) was eluted in a mixture of AcOEt: MeOH (50:50). A part of this fraction (7.1 g) was fractionated by column chromatography (CC) using Sephadex LH-20 as a stationary phase and as a liquid phase a mixture of dichloromethane: methanol (1: 1), obtaining 6 fractions (10A-10E) and a major compound (0.21 Og) that corresponds to the kinsenoside (3-0-3-D-glucopyranosyl- (3R) -hydroxybutanolide): solid; [a
  • 5 +13.0 (c 0.84, CH 3 OH); IR vmax (KBr) cm "1 ;
  • fraction 10B (0.99g) was fractionated by CC using Sephadex LH-20 and a mixture of dichloromethane: methanol (1: 1) to obtain 6 new fractions (10B1 -10B6).
  • Fraction 10B3 (0.24g) was purified by CC using a gradient of increasing polarity of dichloromethane: methanol: water and ethyl 3- (R) -3- 3-D-glucopyranosylxybutanoate (0.017g) was obtained: [a
  • Fraction 6 (10.13g, 15.10% of the initial crude extract) was eluted at 100% AcOEt, from its fractionation by VLC in a gradient of increasing polarity of n-Hexane / Acetone 9 fractions were obtained (Frs. 6A-6H) .
  • the majority fraction (6F, 9.78g) was dissolved in CH 2 CI 2 and extracted with water at room temperature. After evaporating the solvent from the organic part, the dichloromethane fraction (6FA, 0.29g) was obtained. The remaining aqueous extract was dried to obtain the aqueous fraction (6FB, 9.49g).
  • insects were used (see table 5) selected according to the economic importance of their incidence on horticultural crops, the development of synthetic insecticide resistance (L. decemlineata) and their virus transmission capacity (Homoptera ).
  • the antialimentary activity test was based on the preference of larvae of the sixth stage (L6) of S. littoralis and adults of L. decemlineata by leaf disks (treated and control) of host plant (Capsicum annuum and Solanum tuberosum, respectively) placed on the same plate (choice). Foliar areas not consumed were measured with the Image J. 1 .43, 2010 application (http://rsb.info.nih.gov/ii/). Based on these data, the percentage of food inhibition (% FI) (Burgue ⁇ o-Tapia et al. 2008. J. Chem. Ecol. 34, 766-771) was calculated.
  • Bioinsecticidal activity of the ethanol extract in tests of choice The crude ethanolic extracts of species of the genus Crocus L. obtained according to example 2, recorded different levels of bioinsecticidal activity in sucking and chewing phytophagous insects, measured through antialimentary activity, depending on the insect, the species and the part of the plant used (see table 6).
  • EH tepals
  • EC corms
  • Table 7 shows the effective doses for ethanol raw extracts of C. sativus in sucking and chewing insects. Table 7. Effective doses of inhibition of feeding (Fl) and settlement (SI) of ethanolic crude extracts of C. sativus from the results of Example 5
  • fractions obtained from the crude extract of corm of C. sativus obtained according to example 4 showed different bioinsecticidal activity with sucking or chewing neoptera (see table 8).
  • Fractions 3 and 10 had a significant effect on the inhibition of the feeding of L. decemlineata (% FI> 85%) with a maximum activity in fractions 3 and 10.
  • Fractions 2, 3, 5 showed a significant reduction in settlement of M. persicae (% SI> 75%), while only fraction 10 was active against S. littoralis.
  • Table 8 Anti-food activity of 10 fractions obtained from VLC-1 of the ethanolic crude extract of corms from C. sativus against insect pests (100Mg / cm 2 )
  • a% Fl [1 - (T / C)] x 100, where T and C refers to the areas consumed in the disks treated and controlled respectively by chewing insects;
  • Example 7 Bioinsecticidal activity of different subfractions obtained from the crude ethanol extract of corm of C. sativus in tests of choice
  • Fractions 3A and 3B showed a very significant activity against L. decemiineata and the latter also significantly inhibited the settlement of M. persicae (see table 9).
  • 3C stigmastenone ⁇ 100 n.e.
  • lupeol at % SI 1 - (% T /% C) x 100, where T and C refers to% aphids seated on the treated and control surface respectively;
  • Example 8 Bioinsecticidal activity of the bioactive compounds identified from the crude ethanol extract of corm of C. sativus in tests of choice
  • Table 10 shows the antialimentary activity of the isolated compounds against the different biological targets.
  • the majority compound was kinsenoside and significantly inhibited the feeding of S. littoralis and L. decemlineata as evidenced by the low effective doses (EC50).
  • EC50 effective doses
  • the presence of this compound in large quantities in the saffron corm explains the strong activity of the original extract (see table 6) and the starting fraction (Fr. 10, VLC, see table 8) against the S. littoralis polyphagous lepidoptera. .
  • the compound (R) -3-hydroxybutanolide was active only against L. decemlineata, while the compound Ethyl 3- (R) -3-3-D-glucopyranosyloxybutanoate inhibited the settlement of M. persicae.

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Abstract

Las plagas de insectos fitófagos afectan una gran variedad de cultivos y tienen especial relevancia en sistemas agrícolas sostenibles donde los productos de síntesis están restringidos. La presente invención reivindica un extracto alcohólicode material vegetal del género Crocus L.con alta actividad bioinsecticida,que se caracteriza por comprender3-O-β-D-glucopiranosil-(3R)- hidroxibutanolida, por ser fácilmente obtenible y por estar exento de problemas de toxicidad. La invención también reivindica el procedimiento de obtención del extracto; una composición fitosanitaria que lo comprende; el uso como bioinsecticida del extracto, de la composición fitosanitaria y de compuestos presentes en el extracto que se identifican por primera vez con actividad bioinsecticida; así como un método de control de plagas de insectos.

Description

EXTRACTO DE MATERIAL VEGETAL DEL GÉNERO CROCUS L. CON ALTA ACTIVIDAD BIOINSECTICIDA
DESCRIPCION
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La invención se engloba dentro del campo de la agricultura, y más concretamente, en el sector de los biopesticidas que comprenden extractos de plantas, ya que específicamente se refiere a un extracto alcohólico de material vegetal del género Crocus L., a su procedimiento de obtención, a una composición fitosanitaria que comprende a dicho extracto, a su uso como bioinsecticida y a un método de control de insectos-plaga que utiliza al extracto, a la composición fitosanitaria que lo comprende y a compuestos bioactivos presentes en el extracto que se identifican por primera vez con actividad bioinsecticida.
ESTADO DE LA TECNICA El género Crocus L. (Iridaceae) comprende más de 88 especies diferentes de plantas herbáceas perennes y geófitas, distribuidas por el centro y sureste de Europa, desde Europa Central hasta Turquía, África del Norte y desde el suroeste de Asia hasta China Occidental. Muchas de ellas son muy apreciadas como plantas ornamentales por sus vistosas flores y tienen gran valor como variedades hortícolas (floricultura), mientras que otras destacan por sus aplicaciones industriales.
La bibliografía refiere la presencia de los pigmentos antocianos y flavonoides en pétalos de más de 70 especies de Crocus. Algunos lípidos y ácidos grasos se han descrito en C. vallicola. En C. vernus se ha informado la presencia de alcanos y compuestos relacionados con el aroma (ar-tumerona) en cormos y flores respectivamente. En extractos metanólicos de la planta completa de C. baytopiorum se han encontrado diferentes compuestos fenólicos (ácidos p- cumárico y rosmarínico, quercetina, kaempferol y glucósidos de la apigenina). En hojas de C. tommasinianus y C. corsicus se han descrito diferentes glicósidos de flavonas.
Crocus sativus L. (azafrán) es la especie más representativa del género y la única iridácea que se ha utilizado extensivamente en la industria alimentaria, concretamente para la obtención de la especia "azafrán", que se considera uno de los productos alimentarios más caros del mundo con un valor de mercado cercano a los 3000€ el kilogramo. Además de su uso más generalizado como especia, colorante alimentario y textil, cada día se valoriza más por sus propiedades farmacológicas y nutracéuticas. Sin embargo, como la mayoría de las plantas aromáticas, condimentarías y medicinales, tiene muy poco valor añadido si tenemos en cuenta que menos del 0.001 % de la biomasa de la planta se utiliza para obtener el producto principal.
Precisamente por ser la especie de Crocus con mayor valor comercial, ha sido la más profusamente caracterizada. La composición química de los estigmas de C. sativus, incluye más de 150 compuestos volátiles pertenecientes a diferentes clases químicas entre las que se encuentran terpenos, alcoholes de terpenos y sus respectivos ésteres. Entre los componentes no volátiles más representativos se encuentran los carotenoides (zeaxantina, licopeno y β- caroteno) y diferentes derivados del kaempferol. Sin embargo, los componentes mayoritarios y más estudiados de los estigmas son las crocinas (c/s- y trans-), picrocrocina y safranal, compuestos responsables del color amarillo, sabor (principio amargo) y aroma de la especia, respectivamente.
Entre los compuestos naturales presentes en las pétalos de C. sativus se han descrito ácidos grasos, estigmasterol, monoterpenos, antocianinas (delfinidina, petunidina y derivados de la malvidina), flavonoides (quercetina, miricetina, apigenina, naringenina, ácidos fenólicos y algunos derivados del kaempferol) así como más de 21 derivados glicosilados y esterificados de flavononas y flavonoles.
En las hojas de C. sativus se ha identificado la presencia de kaempferol y derivados glicosilados de la quercetina, luteolina, apigenina y miricetina. En los cormos de C. sativus se han encontrado diferentes compuestos como el campesterol, estigmaterol, 3-sitosterol, saponinas triterpénicas, glicoconjugados, sesquiterpenos tipo bisabolano, monoterpenos, alkanos y ácidos grasos. Otras partes de la planta como el estambre y el perianto de C. sativus han sido menos estudiadas detectándose la presencia de ácido láurico, ácido hexadecanoico, derivados hidroxilados de la furanona y estigmasterol.
Finalmente, un estudio sobre la composición de los brotes de C. sativus refiere el primer informe sobre aislamiento y elucidación del 3-(S)-3- 3-D- glucopiranosiloxibutanolida (Goodyerosido A) (Gao et al. 1999. Planta Med. 65, 425-427), un diasteroisómero en la parte del aglicón.
En cuanto a propiedades farmacológicas, nutracéuticas e industriales de especies del género Crocus L, se han descrito actividades antioxidantes y antimicrobianas en los pétalos de C. baytopiorum, C. biflorus y C. flavus. Por su parte, a la especie C. sativus se le atribuye actividad antidepresiva, antitusiva, antioxidante, anti-inflamatoria, relajante, anticonvulsiva, afrodisíaca, anticancerígena, quelante de radicales libres, y detoxificante, entre otras, que se relacionan con los componentes principales del estigma (crocinas, picrocinas y safranal) y del cormo (saponinas triterpénicas y glicoconjugados bioactivos).
Por otra parte, la agricultura se enfrenta constantemente a serios problemas relacionados con la incidencia de plagas y ataques de organismos patógenos con la consiguiente reducción de la productividad. El uso de plaguicidas sintéticos es el método más empleado para la protección de los cultivos. Sin embargo, el uso excesivo de estos compuestos ha derivado en la aparición de organismos-plaga más resistentes, contaminación del medio ambiente, toxicidad hacia organismos beneficiosos y polinizadores y riesgos para la salud humana, lo que en combinación con la preocupación por parte de los consumidores por el medio ambiente y la segundad alimentaria, han promovido la vuelta a los productos naturales renovables para la obtención de compuestos bioactivos con propiedades biocidas.
Las plantas y residuos agroindustriales, constituyen una fuente barata y renovable de compuestos bioactivos de defensa que actúan contra plagas y organismos patógenos. Este tipo de compuestos se caracterizan por ser efectivos a dosis muy bajas, tener poca persistencia en el medio (biodegradables), reducir la aparición de resistencias cruzadas y no presentar efectos citotóxicos asociados. De ahí que el mercado de los bioplaguicidas se encuentre en una clara fase de expansión, fundamentalmente en Norteamérica y Europa, debido fundamentalmente al incremento de la producción orgánica y hortícola (principales demandantes de bioplaguicidas), pero también a la necesidad del aprovechamiento de los residuos y a la demanda de los consumidores de productos más sanos. Ejemplos de insecticidas naturales que existen en el mercado son la azadiractina (Azadirachta indica, Neem), eugenol (Laurus sp.), karanjin (Derris indica), PONNEEM (mezcla del aceite de A. indica y Pongamia glabra), nicotina {Nicotiana tabacum), fenetil propionato (Mentha piperita), piretrinas (Tanacetum cinerariaefolium), rotenona (Derris sp.), ryania y algunos aceites esenciales y ácidos derivados de plantas.
Aunque algunos de ellos están siendo comercializados a gran escala (Neem y PONNEEM), son también muchos los que están sujetos a numerosas restricciones por sus efectos negativos en el medio ambiente, mamíferos e insectos beneficiosos (eugenol, nicotina, piretrina y rotenona) y los que no han tenido mucha aceptación en el mercado (karanjin), lo que pone de manifiesto la dificultad de contar con productos bioinsecticidas naturales que simultáneamente sean fácilmente obtenibles, efectivos y respetuosos con el medio ambiente.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCION
Constituye un primer aspecto de la invención un extracto alcohólico de material vegetal del género Crocus L. con actividad bioinsecticida, que comprende 3-0-3-D-glucopiranosil-(3R)-hidroxibutanolida y que es especialmente efectivo contra insectos-plaga herbívoros.
En una realización particular, el extracto alcohólico es del cormo de Crocus sativus y adicionalmente comprende al menos otro compuesto bioactivo con actividad bioinsecticida, que se selecciona de entre (R)-3-hidroxibutanolida y etil 3-(R)-3- 3 -D-glucopiranosiloxibutanoato.
En otra realización particular, el extracto alcohólico es un extracto etanólico.
Constituye un segundo aspecto de la invención el procedimiento de obtención del extracto alcohólico que comprende realizar una extracción con un alcohol, partiendo de material vegetal del género Crocus L.
En una realización particular, el alcohol de la extracción es etanol.
Adicionalmente, el procedimiento comprende un filtrado para obtener la fracción soluble.
Constituye un tercer aspecto de la invención una composición fitosanitaria que comprende al extracto alcohólico. Constituye un cuarto aspecto de la invención el uso del extracto alcohólico y/o de la composición fitosanitaria para el control de insectos-plaga herbívoros. Constituye un quinto aspecto de la invención el uso de al menos uno de los compuestos bioactivos con actividad bioinsecticida seleccionado de entre 3-0-3-D-glucopiranosil-(3R)-hidroxibutanolida, (R)-3-hidroxibutanolida y etil 3-(R)-3- β -D-glucopiranosiloxibutanoato, ya sea individualmente o en combinación, para el control de insectos-plaga herbívoros.
Finalmente, constituye un sexto aspecto de la invención un método de tratamiento fitosanitario para el control de insectos-plaga herbívoros que comprende administrar una dosis fitosanitariamente eficaz del extracto alcohólico y/o de la composición fitosanitaria y/o de al menos uno de los compuestos bioactivos con actividad bioinsecticida.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El problema técnico que resuelve la presente invención es la búsqueda de nuevos productos bioplaguicidas naturales que pueden ser utilizados en el tratamiento fitosanitario de plagas de insectos herbívoros, que son al mismo tiempo fácilmente obtenibles, efectivos y respetuosos con el medio ambiente. Se ha descubierto que un producto que se obtiene a partir de una extracción etanólica de material vegetal de plantas de numerosas especies y/o variedades pertenecientes al género Crocus L., (ver ejemplos 1 a 4), sorprendentemente presentan una alta actividad bioinsecticida contra insectos-plaga herbívoros chupadores y/o masticadores (ver ejemplos 5 a 8).
Las principales ventajas técnicas del extracto alcohólico de material vegetal del género Crocus L. así como de su uso para el control de plagas de insectos se enumeran a continuación:
-presenta alta capacidad bioinsecticida comparada con otros compuestos de reconocida actividad, referidos en muchas ocasiones como modelos antialimentarios de insectos. Por ejemplo, en el caso de L. decemlineata, se obtienen valores de actividad antialimentaria superiores a los de otros compuestos de referencia como el Polygodial [EC5o=8.34 (2.3-3.01 )] y el Thymol [EC5o=23.9 (7.3-85.8)]. En el caso de S. littoralis, el compuesto mayoritario del cormo de C. sativus (3-0- 3-D-glucopiranosil-(3R)- hidroxibutanolida) presenta un nivel de actividad cercano a la Azadiractina;
-no presenta toxicidad para humanos o animales, ya que por ejemplo las hojas se han utilizado en alimentación animal (Valizadeh, R. 2000. Agricultural Sciences and Technology. 14: 3-9; Mohammad-Abadi, A.A. et al. 2007. Acta Hort. (ISHS), 739: 151 -153) y se recomienda el posible empleo de los cormos como antioxidantes naturales en alimentación humana (Esmaeili, N. et al. 201 1. Pharmacogn. Mag. 7: 74-80);
- el género Crocus L. presenta una biodiversidad vegetal enorme y por lo tanto una disponibilidad considerable de material de partida que puede reducir el coste final del producto en el mercado; y
-en el caso del C. sativus la obtención de extractos con actividad bioinsecticida constituye una alternativa de valorización de material vegetal (cormos, hojas, pétalos) con muy escaso o nulo valor comercial, que principalmente se gestionan como un residuo tras el cultivo del azafrán y/o procesado de la especia. Por ejemplo, para producir 1 kg de la especia se recolectan más de 200.000 flores y se desechan 300-350 kg de residuos florales (tépalos, anteras, estambres) después de la monda, 1500 kg de hojas como residuo de cosecha y cientos de bulbos que no cumplen los requisitos establecidos (tamaño de floración, sanos, etc.) para ser replantados y/o comercializados. En un aspecto, la invención se relaciona con un extracto alcohólico de material vegetal del género Crocus L. con actividad bioinsecticida, en adelante extracto alcohólico de la invención, que comprende 3-0- 3-D-glucopiranosil-(3R)- hidroxibutanolida. El "3-0- 3-D-glucopiranosil-(3R)-hidroxibutanolida o kinsenósido", descrito en esta invención por primera vez en extractos de material vegetal del género Crocus L. (ver ejemplo 3), ha sido aislado previamente de otras fuentes naturales, fundamentalmente de Anoectochilus formosanus y A. roxburghii y se conoce, casi exclusivamente, por sus propiedades hepatoprotetoras y para el tratamiento de enfermedades vasculares. Los ejemplos que se incluyen en esta invención lo relacionan por primera vez con la actividad bioinsecticida.
Por "extracto alcohólico de la invención" se entiende indistintamente al extracto crudo directamente obtenido de la extracción con un alcohol, de material vegetal del género Crocus L, que preferentemente es su parte soluble, pero también cualquier fracción o subfraccion sucesiva obtenida a partir de dicho extracto que comprenda kinsenósido. El extracto alcohólico de la invención puede presentarse en estado líquido pero también en estado sólido, por ejemplo utilizando técnicas de liofilización.
Preferentemente el extracto alcohólico de la invención es un extracto etanólico.
Por "actividad bioinsecticida", en el contexto de esta invención, se entiende la capacidad de controlar insectos-plaga a través de diferentes mecanismos de acción. Esta capacidad se puede determinar mediante diferentes tipos de bioensayos que incluyen actividad antialimentaria (inhibición de la alimentación y/o asentamiento en el caso de áfidos), repelente o tóxica, entre otras.
Por "material vegetal" se entiende cualquiera de los diferentes órganos vegetales de las especies del género Crocus L, incluyendo los que se encuentran en la parte aérea y en la parte subterránea. Ejemplos de partes aéreas son el tallo, las hojas o las flores, y preferentemente las hojas y/o los tépalos. Ejemplos de partes subterráneas son el cormo y las raíces, y preferentemente el cormo.
Por "Crocus L." se entiende un género de plantas herbáceas, perennes y geófitas pertenecientes a la familia de las Iridáceas y que se caracterizan por presentar un órgano subterráneo de reserva llamado cormo. Ejemplos, a título ilustrativo y no limitativo, de especies, subespecies y/o variedades de Crocus L. que se utilizan en el ámbito de la invención son C. sativus, C. ancyrensis, C. cancellatus, C. carpetanus, C. chrysanthus, C. nevadensis, C. serotinus, C. serotinus ssp. salzmanii, C. vernus var. "flower record", C. vernus var. "geel yellow", C. vernus "jeam d'arc", C. versicolor, C. speciosus, C. speciosus "albus", C. speciosus "Aitchinsonii", C. angustifolius, C. dalmaticus, C. pulchellus, C. corsicus, C. kotschyanus, C. kotchyanus "albus", C. cartwrightianus, C. laevigatus "fontenayi" y C. ligusticus.
El extracto alcohólico de la invención se obtiene a partir de hojas, tépalos o cormos del género Crocus L, o una combinación de las partes anteriores.
Los insectos contra los que es efectivo el extracto alcohólico de la invención son principalmente insectos-plaga herbívoros con diferentes adaptaciones tróficas, ya sean masticadores o chupadores, y que pueden presentar una alta incidencia sobre cultivos hortícolas provocando graves pérdidas económicas, desarrollar resistencias a insecticidas de síntesis y presentar capacidad de transmisión de virus. Ejemplos, a título ilustrativo y no limitativo, de órdenes y especies de insectos-plaga herbívoros con diferentes adaptaciones tróficas, masticadores o chupadores son Lepidoptera, Homoptera, Coleóptera y Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata respectivamente.
El extracto alcohólico de la invención comprende una actividad bioinsecticida contra al menos uno de los insectos Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata preferentemente de entre el 50% y el 75%, más preferentemente de entre el 75% y el 90% y todavía más preferentemente superior al 90% cuando se utiliza con una dosis de 100 pg/cm2 En una realización particular, un extracto alcohólico de la invención que es la parte soluble del extracto crudo etanólico del cormo que se elige de entre C. chrysanthus, C. ancyrensis, C. cancellatus, C. serotinus, C. serotinus ssp. salzmanii, C. nevadensis, C. laevigatus "fontenayi", C. kotschyanus "albus", C. speciosus "albus" y C. pulchellus, comprende una actividad bioinsecticida contra al menos uno de los insectos Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata preferentemente superior al 80%, cuando se utiliza con una dosis de 100 pg/cm2
En otra realización particular, un extracto alcohólico de la invención que es la parte soluble del extracto crudo etanólico de hoja que se elige de entre C. chrysanthus, C. ancyrensis, C. serotinus, C. serotinus ssp. salzmanii, C. versicolor, C. vernus "flower record" C. carpetanus, C. speciosus, C. speciosus, "Aitchinsonü" C. angustifolius, C. dalmaticus, C. pulchellus, C. corsicus, C. kotschyanus, C. cartwrightianus, C. ligusticus y C. sativus, comprende una actividad bioinsecticida contra al menos uno de los insectos Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata preferentemente superior al 80%, cuando se utiliza con una dosis de 100 pg/cm2.
En el ámbito de la invención se utilizan técnicas de fraccionamiento del extracto alcohólico crudo ampliamente conocidas por cualquier experto en el estado de la técnica. Así por ejemplo, se utiliza cromatografía líquida de vacío (VLC), cromatografía en columna (CC) empleando diferentes fases sólidas (Gel de Sílice, Sephadex LH-20) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), eluyéndose con distintos gradientes de polaridad mediante diferentes combinaciones de disolventes orgánicos, pero también extracción con agua a temperatura ambiente tras disolución en CH2CI2 . Sin embargo, es posible utilizar cualquier otra técnica que permita la obtención y fraccionamiento del extracto alcohólico de la invención como por ejemplo, mediante el empleo de extracciones mediante fluidos supercríticos y otras técnicas de extracción/separación avanzadas y/o convencionales.
En otro aspecto, el extracto de la invención es cualquier fracción y/o subfracción sucesiva obtenida a partir del extracto alcohólico crudo que comprende kinsenósido y actividad bioinsecticida. Como el experto en la materia conocerá es posible obtener distintas fracciones a partir del extracto crudo, cada una de las cuales comprende una composición distinta de compuestos bioactivos, y que a su vez pueden volver a subfraccionarse en repetidas ocasiones hasta que la subfracción esté constituida por una mezcla simple y/o un único compuesto bioactivo.
La actividad bioinsecticida del extracto alcohólico de la invención no se explica exclusivamente por la actividad del kinsenósido. Los fraccionamientos químicos realizados por los inventores, la determinación de compuestos bioactivos y los ensayos de actividad bioinsecticida (ver ejemplos 5 a 8), permiten identificar la actividad de otros compuestos que podrían actuar de forma sinérgica. Así por ejemplo, la fracción 10 obtenida de cormo de C. sativus en la que está presente el kinsenósido presenta una actividad antialimentaria inferior al 40% contra M. persicae, mientras que el extracto crudo presenta una actividad antialimentaria superior al 80% para este insecto.
En otra realización particular, un extracto alcohólico de la invención que es la parte soluble del extracto crudo etanólico de cormo de Crocus sativus, adicionalmente al kinsenósido, comprende al menos otro compuesto bioactivo con actividad bioinsecticida, que se selecciona de entre el aglicón del kinsenósido también conocido como (R)-3-hidroxibutanolida y el etil 3-(R)-3- 3- D-glucopiranosiloxibutanoato. En otra realización más particular, un extracto alcohólico de la invención que es la parte soluble del extracto crudo etanólico de cormo de Crocus sativus, adicionalmente a los compuestos bioactivos anteriores, comprende al menos otro compuesto bioactivo que se selecciona de entre α-amirenona, lupenona, friedelín, β-amirina, estigmastenona y lupeol.
En otra realización particular, un extracto alcohólico de la invención que es la parte soluble del extracto crudo etanólico de cormo de Crocus sativus, comprende una actividad bioinsecticida contra al menos uno de los insectos Spodoptera littoralis, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Leptinotarsa decemlineata preferentemente superior al 70%, cuando se utiliza con una dosis de 100 pg/cm2.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del extracto alcohólico de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende realizar una extracción con un alcohol partiendo de material vegetal del género Crocus L.
Por "extracción alcohólica" se entiende una extracción que utiliza un alcohol como extractante, ya sea puro o combinado. Ejemplos de alcoholes que se utilizan en el ámbito de la presente invención son etanol y metanol.
En una realización particular del procedimiento de la invención, la extracción alcohólica se realiza con etanol.
Adicionalmente, el procedimiento de la invención comprende otra etapa de filtrado para obtener la fracción soluble. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición fitosanitaria que comprende al extracto alcohólico de la invención, en adelante composición fitosanitaria de la invención.
La composición fitosanitaria de la invención adicionalmente puede comprender diversos vehículos y agentes que faciliten su conservación, manejo y aplicación.
Como el experto en el estado de la técnica conocerá, habitualmente se utilizan vehículos sólidos, vehículos líquidos, vehículos gaseosos, etc., y, si es necesario, agentes tensioactivos y agentes auxiliares para la formulación de composiciones fitosanitarias como, por ejemplo, un aditivo para formular formas tales como concentrados emulsionables, polvos humectables, líquidos fluibles, (v.g., suspensión en agua, emulsión en agua, etc.), polvos, aerosoles, ULV y similares.
Ejemplos de vehículo sólido que se incluyen en el ámbito de la presente invención son polvos finos o gránulos de arcillas (v.g. arcilla de caolín, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, bentonita, arcilla Fubasami, arcilla ácida, etc.), talcos, cerámicas y otros minerales inorgánicos (v.g., sericita, cuarzo, azufre, carbono activo, carbonato cálcico, sílice hidratada, etc.), fertilizantes comerciales (v.g., sulfato amónico, fosfato amónico, nitrato amónico, urea, cloruro amónico, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo líquido que se incluyen en el ámbito de la presente invención son agua, alcoholes (v.g., metanol, etanol, etc.), cetonas (v.g., acetona, metil etil cetona, etc.), hidrocarburos aromáticos (v.g, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, metilnaftaleno, etc.), hidrocarburos alifáticos (v.g. hexano, ciclohexano, kerosina, gas oil, etc), ésteres (v.g., acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), nitrilos (v.g, acetonitrilo, isobutironitrilo, etc.), éteres (v.g, éter diisopropílico, dioxano etc.), amidas de ácido (v.g, Ν,Ν-dimetilformamida, Ν,Ν-dimetilacetamida, etc.), hidrocarburos halogenados (v.g., dicloroetano, tricloroetano, tetracloruro de carbono, etc.), sulfóxido de dimetilo, aceites vegetales (v. g., aceite de soja, aceite de semilla de algodón, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo gaseoso que se incluyen en el ámbito de la presente invención son agente de pulverizado, incluyendo gas flon, gas butano, LPG (gas de petróleo liquificado), éter dimetílico, gas de dióxido de carbono y similares.
Ejemplos de agente tensioactivo que se incluyen en el ámbito de la presente invención son sulfatos de alquilo, sales de sulfonato de alquilo, alquil aril sulfonatos, ésteres alquil arílicos, compuestos de polioxietileno de los mismos, ésteres polietilen glicólicos, ésteres de alcohol polihidroxílico, derivados de alcohol de azúcar y similares. Ejemplos de agente auxiliar para la formulación como agente de fijación y agente de dispersión que se incluyen en el ámbito de la presente invención son caseína, gelatina, polisacáridos (v.g., polvo de almidón, goma arábiga, derivado de celulosa, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, azúcares, polímeros hidrosolubles sintéticos (v.g., polialcohol vinílico, polipirrolidona de vinilo, poliácidos acrílicos, etc.) y similares.
Ejemplos de estabilizantes que se incluyen en el ámbito de la presente invención son PAP (fosfato de ácido isopropílico), BHT (2,6-di-terc-butil-4- metilfenol), BHA (mezcla de 2-terc-butil-4-metoxifenol y 3-terc-butil-4- metoxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, agentes tensioactivos, ácidos grasos o ésteres de los mismos y similares.
Adicionalmente, la composición fitosanitaria de la invención puede comprender otro ingrediente activo.
Ejemplos de ingrediente activo adicional son otros insecticidas, nematicidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, sinérgicos, fertilizantes, acondicionadores del suelo y cebos para animales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del extracto alcohólico de la invención y/o de la composición fitosanitaria de la invención para el control de insectos-plaga herbívoros. Tal y como se ha indicado antenormente, en la presente invención se relaciona por primera vez al kinsenósido y a otros compuestos bioactivos identificados a partir del extracto alcohólico de la invención con el control de insectos-plaga herbívoros. Por este motivo, en otro aspecto, el uso de la invención incluye el kinsenósido, el aglicón del kinsenósido y el etil 3-(R)-3- 3 -D- glucopiranosiloxibutanoato, ya sea individualmente o en combinación para el control de insectos-plaga herbívoros. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento fitosanitario para el control de insectos-plaga herbívoros que comprende administrar una dosis fitosanitariamente eficaz del extracto alcohólico de la invención y/o de la composición fitosanitaria de la invención y/o de al menos uno de los compuestos bioactivos con actividad bioinsecticida comprendidos en el extracto alcohólico de la invención y que se eligen de entre kinsenósido, el aglicón del kinsenósido y etil 3-(R)-3- 3 -D-glucopiranosiloxibutanoato.
La dosis del extracto alcohólico de la invención y/o de la composición fitosanitaria de la invención y/o de los compuestos bioactivos con actividad bioinsecticida comprendidos en el extracto alcohólico de la invención puede aumentar o disminuir opcionalmente según el producto, el tipo de formulación, el tiempo, el lugar y el método de aplicación, el tipo de insecto, el grado de daño y similar.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas. Para el experto en la materia, otros aspectos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Estructura química de los compuestos mayoritarios aislados del cormo de Crocus sativus. (A) 3-0- 3-D-glucopiranosil-(3R)-hidroxibutanolida (kinsenósido), (B) (R)-3-hidroxibutanolida (aglicón del kinsenósido) y (C) Etil 3-(R)-3- 3 -D-glucopiranosiloxibutanoato. EJEMPLOS
A. EXTRACTO ETANÓLICO Ejemplo 1. Material vegetal de especies del género Crocus L.
Los cormos, hojas y tépalos de distintas especies de Crocus L. (ver tabla 1 ) se secaron en una cámara con recirculación de aire a 30°C y se molieron en un molino para material vegetal. Tabla 1 . Especies del género Crocus L. empleadas en la invención
Parte de la planta
Especie Procedencia
estudiada
Residuos de cormo, Producción local
C. sativus (azafrán)
hojas y tépalos (España, Teruel)
C. ancyrensis Cormos, hojas HBDa
C. cancellatus Cormos HBD
C. carpetanus Hojas Silvestre15
C. chrysanthus Cormos, hojas HBD
C. nevadensis Cormos Silvestre0
C. serotinus Cormos, hojas Silvestred
C. serotinus ssp. salzmanii Cormos, hojas HBD
C. vernus var. "flower
Hojas, tépalos HBD
record"
C. vernus var. "geel
Tépalos HBD
yellow"
C. vernus var. "Jeanne
Tépalos HBD
d'arc"
C. versicolor Hojas HBD
C. speciosus Hojas HBD
C. speciosus "albus" Cormos HBD
C. speciosus "Aitchinsonii" Cormos, hojas HBD
C. angustifolius Hojas HBD C. dalmaticus Hojas HBD
C. pulchellus Cormos, Hojas HBD
C. corsicus Hojas HBD
C. kotschyanus Hojas HBD
C. kotschyanus "albus" Cormos HBD
C. cartwrightianus Hojas HBD
C. laevigatus "fontenayi" Cormos HBD
C. ligusticus Hojas HBD aHBD: Holland Biodiversity (Vivero), b Recolectada en la Sierra de Madrid (Madrid, España), c Recolectada en Motilla del Palancar (Cuenca, España), d Recolectada en Huete (Cuenca, España).
Ejemplo 2. Obtención de un extracto etanólico
Las muestras secas y molidas se extrajeron repetidas veces durante 24 horas con etanol en un aparato Soxhiet y se filtraron al vacio. Los extractos crudos etanolicos obtenidos, después de eliminar el disolvente, se conservaron a 4°C hasta el análisis de los perfiles biológicos y químicos de los cormos, hojas y tépalos.
En la tabla 2 se muestran los rendimientos de extracción antes del filtrado, obtenidos para cada parte de la planta y especie del género Crocus L. empleadas en esta invención.
Tabla 2. Rendimientos de extracción (antes del filtrado) expresados gramos de extracto crudo etanólico seco / 100 g de material vegetal seco
Parte de la planta Rendimiento de
Especie
extraída extracción (%)
Cormos 7.4
C. sativus Tépalos 45.0
Hojas 25.0
Cormos 4.2
C. ancyrensis
Hojas 23.7 C. cancellatus Cormos 6.42
C. carpetanus Hojas 21 .2
Cormos 4.2
C. chrysanthus
Hojas 29.1
C. nevadensis Cormos 8.63
Cormos 9.83
C. serotinus
Hojas 24.7
C. serotinus ssp. Cormos 4.13
salzmanii Hojas 24.2
C. vernus "flower Tépalos 66.5
record" Hojas 16.8
C. vernus "geel yellow" Tépalos 71 .0
C. vernus "jeanne d'arc" Tépalos 63.9
C. versicolor Hojas 20.0
C. speciosus Hojas 22.2
C. speciosus "albus" Cormos 7.9
C. speciosus Cormos 13.9
"Aitchinsonii" Hojas 18.9
C. angustifolius Hojas 1 1 .1
C. dalmaticus Hojas 46.4
Hojas 23.4
C. pulchellus
Cormos 6.0
C. corsicus Hojas 30.3
C. kotschyanus Hojas 10.0
C. kotschyanus "albus" Cormos 9.9
C. cartwrightianus Hojas 27.4
C. laevigatus "fontenayi" Cormos 4.3
C. ligusticus Hojas 26.9
Ejemplo 3. Espectros de RMN en extractos crudos etanolicos
El espectro de Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RNM de 1H), realizado en CD3OD), de los extractos etanolicos de cormos de diferentes especies del género Crocus L. obtenidos según el ejemplo 2 presentaron señales de protones característicos de una mezcla enriquecida de kinsenósidos sin poder especificar el fragmento glucósido (ver tabla 3).
Tabla 3. Datos espectroscopios de RMN de 1H en CD3OD de extractos de cormos de especies del género Crocus L.
Figure imgf000020_0001
Por su parte, el espectro de RNM de 1H de los extractos etanólicos de hojas de especies del género Crocus L. indicados en la tabla 4 también presentaron señales de protones característicos de una mezcla enriquecida de kinsenósidos sin poder especificar el fragmento glucósido. Además, en este caso probablemente vaya acompañada de componentes parafínicos (0.75-1 .50 ppm).
Tabla 4. Datos espectroscopios de RMN de 1H en CD3OD de extractos de hojas de Crocus sativus de diferente procedencia
Figure imgf000020_0002
Ejemplo 4. Fraccionamiento del extracto etanólico
La parte soluble del extracto crudo etanólico obtenido utilizando cormos de C. sativus según el ejemplo 2, constituyó un 6.70%, mientras que el precipitado constituyó un 0.72%. El fraccionamiento de la parte soluble en etanol se realizó mediante una cromatografía líquida de vacío (VLC) empleando gel de sílice como fase estacionaria. Se eluyó con un gradiente de polaridad creciente de Hexano:AcOEt (0-100% de AcOEt) y AcOEt:MeOH, (2-50% de MeOH) obteniéndose 10 fracciones (Frs. 1 -10). Las fracciones con mayor actividad biocida; la 3, la 6 y la 10 fueron nuevamente fraccionadas.
La fracción 3 (0.55g, 0.81 % del extracto crudo inicial) se eluyó en una mezcla de n-Hexano:AcOEt (75:25) y se purificó mediante cromatografía en columna (CC) obteniéndose 3 fracciones activas (3A, 3B y 3C) que se caracterizaron por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS) lográndose identificar los compuestos mayoritarios: a- amyrenona, lupenona y friedelin (Fr. 3A), un esteral no identificado (con fórmula C30H50O y peso molecular, MW=259) (Fr. 3B) así como 3-amyrina, estigmastenona y lupeol (Fr. 3C).
La fracción 10, que constituye la fracción más polar y abundante del cormo de C. sativus (32.2g, 48% del extracto crudo inicial) se eluyó en una mezcla de AcOEt:MeOH (50:50). Una parte de esta fracción (7.1 g) se fraccionó mediante cromatografía en columna (CC) empleando Sephadex LH-20 como fase estacionaria y como fase líquida una mezcla de diclorometano:metanol (1 : 1 ), obteniéndose 6 fracciones (10A-10E) y un compuesto mayoritario (0.21 Og) que se corresponde con el kinsenósido (3-0- 3-D-glucopiranosil-(3R)- hidroxibutanolida): sólido; [a|5 = +13.0 (c 0.84, CH3OH); IR vmax (KBr) cm"1;
3400 (OH), 2967 (CH), 1770 (C=O, γ -lactone). 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 4.77 (1 H, m, H-3), 4.49 (1 H, br d, J = 9.5 Hz, H-4a), 4.47 (1 H, dd, J = 10.0, 4.6 Hz, H-4b), 4.32 (1 H, d, J = 7.6 Hz, G-1 ), 3.62 (1 H, br dd, J = 11.0, J = 5,6, G- 6a), 3.82 (1 H, dd, J = 12.0, 1 ,2 Hz, G-6b), 3.26 (1 H, m, G-4), 3.26 (1 H, m, G- 5), 3.30 (1 H, dd, J = 5.0, 4.4 Hz, G-3), 3.14 (1 H, dd, J = 7.6, 9.1 Hz, G-2), 2.61 (1 H, dd, J = 18.0, 1 .3 Hz, H-2a) 2.82 (1 H, dd, J = 18.0, 6.4 Hz, H-2b); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ 178.7 (C, C-1 ), 103.8 (CH, G-1 ), 77.9 (CH, G-5), 77.8 (CH, C-3), 76.3 (CH, G-3), 76.2 (CH2, C-4), 74.8 (CH, G-2), 71.4 (CH, G-4), 62.7 (CH2, G-6'), 36.1 (CH2, C-2); ESI-MS: [M+Na]+ = 287.0753 caled, para CioHi608Na.
A continuación, la fracción 10B (0.99g) se fraccionó mediante CC empleando Sephadex LH-20 y una mezcla de diclorometano:metanol (1 :1 ) obteniéndose 6 nuevas fracciones (10B1 -10B6). La fracción 10B3 (0.24g) se purificó mediante CC empleando un gradiente de polaridad creciente de diclorometano:metanol:agua y se obtuvo el etil 3-(R)-3- 3 -D- glucopiranosiloxibutanoato (0.017g): [a|5 = -4.0 (c, 0.53, CH3OH).; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 4.32 (1 H, dd, J = 9.0, 1 .5 Hz, G-1 ),4.09 (1 H, dd, J= 8.0, 3.0 Hz, H-3a), 4.09 (2H, q, J= 7.0 Hz, OCH2CH3), 3.80 (1 H, dd, J = 11 .7, 1 .5 Hz, G-6'), 3.60 (1 H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6), 3.57 (2H, m, H-4 y H-4'), 3.29 (1 H, dd, J = 9.0, 1 .5 Hz, G-3), 3.23 (1 H, m, G-4), 3.23 (1 H, m, G-5), 3.12 (1 H, dd, J = 9.5, 7.8 Hz, G-2), 2.56 (2H, dd, J = 2.0, 5.5 Hz, H-2 y H-2'), 1 .20 (3H, t, J = 7.1 Hz, OCH2CH3); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ 173.3 (C, OCOCH2CH3), 104.3 (CH, G-1 ), 78.9 (CH, C-3), 77.9 (CH, G-4), 77.8 (CH, G-3), 75.0 (CH, G-2), 71.5 (CH, G-5), 65.4 (CH2, C-4), 62.6 (CH2, G-6), 61 .8 (OCOCH2CH3), 37.7 (CH2, C- 2); 14.5 (CH3, OCOCH2CH3); ESI-MS: [M+Na]+ = 333.1175 caled, para
Figure imgf000022_0001
La fracción 6 (10.13g, 15.10% del extracto crudo inicial) se eluyó al 100% de AcOEt, de su fraccionamiento mediante VLC en un gradiente de polaridad creciente de n-Hexano/Acetona se obtuvieron 9 fracciones (Frs. 6A-6H). La fracción mayoritaria (6F, 9.78g) se disolvió en CH2CI2 y se extrajo con agua a temperatura ambiente. Después de evaporar el disolvente de la parte orgánica se obtuvo la fracción de diclorometano (6FA, 0.29g). El extracto acuoso remanente se secó obteniéndose la fracción acuosa (6FB, 9.49g). A continuación, una parte la fracción 6FB (0.4g) se fraccionó mediante CC empleando Sephadex LH-20 como fase estacionaria y una mezcla de hexano:diclorometano:metanol (2: 1 : 1 ) como fase móvil; obteniéndose el (R)-3- hidroxibutanolida (aglicón del kinsenósido) (0.296g): sólido; = +77.1 (c, 0.24, CH3OH); IR vmax (KBr) cm-1 ; 3462 (OH), 1738 (C=O), 1608. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 5 4.72 (1 H, m, H-3a), 4.45 (1 H, dd, J = 10.0, 4.5 Hz, H-4b), 4.35 (1 H, br d, J = 10.0 Hz, H-4a, 2.79 (1 H, dd, J = 17.9, 6.1 Hz, H-2b), 2.56 (1 H, br d, J = 17.9 Hz, H-2a); 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) δ 176.5 (C, C-1 ), 76.1 (CH2, C-4), 67.5 (CH, C-3), 37.8 (CH2, C-2); ESI-MS: [M+Na]+ = 125.0219 caled, para C4H603Na.
B. ACTIVIDAD BIOINSECTICIDA
Para los bioensayos de actividad bioinsecticida se utilizaron insectos (ver tabla 5) seleccionados en función de la importancia económica de su incidencia sobre cultivos hortícolas, el desarrollo de resistencia a insecticidas de síntesis (L. decemlineata) y su capacidad de transmisión de virus (Homoptera).
Tabla 5. Insectos-plaga empleados como dianas biológicas
Figure imgf000023_0001
El ensayo de actividad antialimentaria se basó en la preferencia de larvas del sexto estadio (L6) de S. littoralis y adultos de L. decemlineata por discos de hojas (tratados y control) de planta huésped (Capsicum annuum y Solanum tuberosum, respectivamente) colocados en la misma placa (elección). Las áreas foliares no consumidas se midieron con la aplicación Image J. 1 .43, 2010 (http://rsb.info.nih.gov/ii/). A partir de estos datos se calculó el porcentaje de inhibición de la alimentación (%FI) (Burgueño-Tapia et al. 2008. J. Chem. Ecol. 34, 766-771 ). En el caso de los áfidos o chupadores se determinó el efecto del extracto crudo etanólico, fracciones y/o compuestos bioactivos puros sobre el asentamiento de adultos no alados de M. persicae y R. padi sobre discos de hojas (tratados y control) de planta huésped (C. annuum y Hordeum vulgare, respectivamente) colocados en la misma placa (elección). A partir de estos datos se calculó el porcentaje de inhibición del asentamiento (% SI) (Burgueño-Tapia et al. 2008. J. Chem. Ecol. 34, 766-771 ).
La significación de los porcentajes de inhibición de la alimentación (%FI) y del asentamiento (%SI) se analizaron mediante la prueba estadística no paramétrica de rangos con signos de Wilcoxon.
Los extractos etanólicos crudos y sus fracciones obtenidas según los ejemplos 2 y 4 se ensayaron a una dosis inicial de 100 μg/cm2 y los compuestos bioactivos puros a 50 μg/cm2. Algunos extractos crudos etanólicos, fracciones y/o compuestos bioactivos puros que mostraron un efecto antialimentario significativo (%FI/%SI>70), se sometieron a experimentos de dosis-respuesta para calcular sus dosis efectivas (EC50 = dosis para la cual se produce un 50% de inhibición de la alimentación) mediante un análisis de regresión lineal. Cría y mantenimiento de los insectos diana
Las larvas de S. littoralis se alimentaron con una dieta semisintética (Poitut y Bues, 1970. Ann. Zool. Ecol. Anim. 2, 79-91 ) mientras que L. decemlineata, M. persicae y R. padi se mantuvieron alimentándose sobre sus plantas huésped (Solanum tuberosum L., Capsicum annuum L. y Hordeum vulgare L., respectivamente) (Reina et al. 2001 . J. Nat. Prod. 64, 6-1 1 ). Todas las poblaciones de insectos se mantuvieron en cámaras climatizadas en las siguientes condiciones ambientales: 22 ± 1 °C, 60-70 % de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 horas (luz:oscuridad). Ejemplo 5. Actividad bioinsecticida del extracto etanólico en ensayos de elección Los extractos etanólicos crudos de especies del género Crocus L. obtenidos según el ejemplo 2, registraron diferentes niveles de actividad bioinsecticida en insectos fitófagos chupadores y masticadores, medidos a través de la actividad antialimentaria, en dependencia del insecto, la especie y de la parte de la planta empleada (ver tabla 6).
Tabla 6. Actividad antialimentaria de los extractos crudos etanólicos de hojas
(EH), tépalos (ET) y cormos (EC) de especies del género Crocus L. frente a L. decemlineata, S. littoralis, M. persicae y R. padi (100pg/cm2)
Figure imgf000025_0001
C. speciosus
EC 88.3 ± 7.6* 0.0 ± 0.0 67.08 ± 8.0 n.e "albus"
C. speciosus EC 62.0±10.9 76.1 ±13.7* 51.1 ±8.7 n.e. "Aitchinsonii" EH 83.1 ±15.8* 46.0±20.3 21.7±7.2 n.e.
C.
EH 82.3±17.4* 80.2±13.9* n.e. n.e. angustifolius
C. dalmaticus EH 86.9±12.2* 10.6±7.6 n.e. n.e.
EH n.e. 51.0±21.1 86.2±4.6*
C. pulchellus
EC 39.6 ± 24.2 20.5 ± 12.5 83.5 ± 6.9* n.e
C. corsicus EH 82.86±9.7* 41.1 ±23.4 n.e. n.e.
C.
EH 89.3±7.3* 54.9±22.5 n.e. n.e. kotschyanus
C.
kotschyanus EC 92.8 ± 2.4* 88.5 ± 5.7* 57.2 ± 8.9 n.e "albus"
C.
EH 89.8±15.2* n.e. n.e. n.e. cartwrightianus
C. laevigatus
EC 91.7 ± 2.7* 2.5 ± 2.0 66.6 ± 8.3 n.e "fontenayi"
C. ligusticus EH 94.6±5.2* n.e. n.e. n.e.
EH 95.1 ± 2.1 * 61.2 ± 10.4 87.1 ± 3.4* 51.7 ± 8.9
C. sativus ET 78.5 ± 9.4* 81.4 ± 8.4* 38.3 ± 9.1 30.7 ± 8.3
EC 79.2 ± 8.7* 84.4 ± 9.7* 84.9 ± 5.2* 75.2 ± 4.8* a % Fl = [1 - (T/C)] x 100, donde T y C se refiere a las áreas consumidas en los discos tratados y control respectivamente por insectos masticadores; b % Sl=1 - (%T/%C) x 100, donde T y C se refiere al % de insectos chupadores asentados en la superficie tratada y control respectivamente ; * p<0.05, prueba no paramétrica de rangos con signos de Wilcoxon; n.e.= No ensayado
La tabla 7 recoge las dosis efectivas para extractos crudos etanolicos de C. sativus en insectos chupadores y masticadores. Tabla 7. Dosis efectivas de inhibición de la alimentación (Fl) y del asentamiento (SI) de los extractos crudos etanólicos de C. sativus de los resultados del ejemplo 5
Figure imgf000027_0001
a Dosis efectiva de inhibición de la alimentación, 95% límite de confianza inferior y superior
Ejemplo 6. Actividad bioinsecticida de distintas fracciones obtenidas a partir del extracto crudo etanólico de cormo de C. sativus en ensayos de elección
Las fracciones obtenidas a partir del extracto crudo de cormo de C. sativus obtenidas según el ejemplo 4 presentaron diferente actividad bioinsecticida con neópteros chupadores o masticadores (ver tabla 8). Las fracciones 3 y 10 tuvieron un efecto significativo en la inhibición de la alimentación de L. decemlineata (%FI>85%) con un máximo de actividad en las fracciones 3 y 10. Las fracciones 2, 3, 5 mostraron una reducción significativa del asentamiento de M. persicae (%SI>75%), mientras que sólo la fracción 10 resultó activa frente a S. littoralis. Tabla 8. Actividad antialimentaria de 10 fracciones obtenidas de la VLC-1 del extracto crudo etanólico de cormos de C. sativus frente a insectos plaga (100Mg/cm2)
Fracciones %Fla %SID (rendimiento L. decemlineata S. littoralis M. persicae )
1 (0.13%) 44.5±1 1 .6 10.8±10.5 66.4±12.1 *
2 (0.90%) 59.7±13.0 51.2±12.5 78.1 ±5.1 *
3 (0.81 %) 100.0±0.0* n.e. 92.9±2.3*
4 (2.73%) 93.6±3.3* 30.9±10.2 67.9±8.5*
5 (3.52%) 86.8±8.4* 15.2±6.3 85.5±3.8*
6 (15.1 %) 91.9±2.6* 19.9±13.1 64.7±6.4*
7 (6.17%) 94.1 ±5.9* 26.3±18.9 54.3±7.4
8 (8.34%) 88.7±3.2* 45.5±21 .8 46.1 ±1 1 .7
9 (1 1 .89%) 88.7±4.7* 45.2±12.5 33.8±7.1
10 (48%) 97.2±1 .2* 94.1 ±3.4* 38.8±8.6
Elución de las fracciones (polaridad del disolvente): Fr.1 (100% hexano), Fr.2 (90: 10, hexano:AcOEt), Fr.3 (75:25, hexano:AcOEt), Frs.4-5 (50:50, hexano:AcOEt), Fr.6 (100% AcOEt), Fr.7 (98:2, AcOE MeOH), Frs.8-10 (50:50, AcOEt: MeOH)
a % Fl = [1 - (T/C)] x 100, donde T y C se refiere a las áreas consumidas en los discos tratados y control respectivamente por insectos masticadores; b % Sl=1 - (%T/%C) x 100, donde T y C se refiere al % de insectos chupadores asentados en la superficie tratada y control respectivamente ; * p<0.05, prueba no paramétrica de rangos con signos de Wilcoxon; n.e.= No ensayado
Ejemplo 7. Actividad bioinsecticida de distintas subfracciones obtenidas a partir del extracto crudo etanólico de cormo de C. sativus en ensayos de elección
La fracciones 3A y 3B mostraron una actividad muy significativa frente a L. decemiineata y esta última también inhibió significativamente el asentamiento de M. persicae (ver tabla 9).
Tabla 9. Actividad antialimentaria y composición (GC-MS) de las fracciones bioactivas obtenidas a partir del fraccionamiento de la fracción 3 frente a insectos plaga (100pg/cm2)
Fracciones Identificación EC50 ^g/cm2) %Sla tentativa L. S. M.
decemlineata littoralis persicae α-amirenona,
3A 1 .6 (0.2, 14.8) > 100 n.e.
lupenona, friedelin
Esterol (C30H50O,
3B 0.05 (0.0, 5.5) ~ 100 72.0±9.9*
MW 259)
3-amirina,
32.5 ( 15.9,
3C estigmastenona, ~ 100 n.e.
54.5)
lupeol a %SI=1 - (%T/%C) x 100, donde T y C se refiere al % áfidos asentados en la superficie tratada y control respectivamente; EC50 = Dosis efectiva a la que se produce el 50% de la inhibición de la alimentación (95% límites de confianza inferior y superior); * p<0.05, prueba no paramétrica de rangos con signos de Wilcoxon; n.e. = no ensayado
Ejemplo 8. Actividad bioinsecticida de los compuestos bioactivos identificados a partir del extracto crudo etanólico de cormo de C. sativus en ensayos de elección
En la tabla 10 se muestra la actividad antialimentaria de los compuestos aislados frente a las diferentes dianas biológicas. El compuesto mayoritario fue el kinsenósido e inhibió significativamente la alimentación de S. littoralis y L. decemlineata como lo demuestran las bajas dosis efectivas (EC50). La presencia de este compuesto en grandes cantidades en el cormo de azafrán, explica la fuerte actividad del extracto original (ver tabla 6) y de la fracción de partida (Fr. 10, VLC, ver tabla 8) frente al lepidóptero polífago S. littoralis. El compuesto (R)-3-hidroxibutanolida fue activo solo frente a L. decemlineata, mientras que el compuesto Etil 3-(R)-3- 3 -D-glucopiranosiloxibutanoato inhibió el asentamiento de M. persicae.
Tabla 10. Inhibición del asentamiento (%SI) y dosis efectivas (EC50, 95% límites inferior y superior) de los compuestos A, B y C frente a L. decemlineata, S. littoralis y M. persicae %SI
EC50 ^g/cm2)
(50Mg/cm2)a
Compuesto
L. M. persicae
S. littoralis
decemlineata
Kinsenosido (A) 3.58 (1 .2, 9.9) 0.32 (0.07, 1 .33) 49.9±5.9
Aglicón del
2.31 (0.5, 1 1 .0) ~ 100 51 .1 ±7.9 kinsenósido (B)
Etil 3-(R)-3-p -D- glucopiranosiloxibuta - 50 > 50 72.3±8.1 * noato (C) a %SI=1 - (%T/%C) x 100, donde T y C se refiere al % áfidos asentados en la superficie tratada y control respectivamente; EC50 = Dosis efectiva a la que se produce el 50% de la inhibición de la alimentación (95% límites de confianza inferior y superior); * p<0.05, prueba no paramétrica de rangos con signos de Wilcoxon

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Extracto alcohólico de material vegetal del género Crocus L. con actividad bioinsecticida que comprende 3-0- 3-D-glucopiranosil-(3R)-hidroxibutanolida.
2. - Extracto alcohólico según la reivindicación 1 , caracterizado por que el material vegetal del género Crocus L. se selecciona de entre cormos, hojas y tépalos.
3.- Extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que es la parte soluble del extracto.
4. - Extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el material vegetal es cormo de Crocus sativus y por que comprende al menos otro compuesto bioactivo con actividad bioinsecticida que se selecciona de entre (R)-3-hidroxibutanolida y etil 3-(R)-3- 3-D- glucopiranosiloxibutanoato.
5. - Extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que comprende al menos otro compuesto bioactivo que se selecciona de entre α-amirenona, lupenona, friedelín, 3-amirina, estigmastenona y lupeol.
6. - Extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que es un extracto etanólico.
7. - Procedimiento de obtención del extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende realizar una extracción alcohólica partiendo de material vegetal del género Crocus L.
8.- Procedimiento de obtención según la reivindicación 7, caracterizado por que la extracción alcohólica se lleva a cabo con etanol.
9. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, caracterizado por que adicionalmente comprende un filtrado para obtener la fracción soluble.
10. - Composición fitosanitaria que comprende al extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
1 1 .- Uso del extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de la composición fitosanitaria según la reivindicación 10 para el control de insectos-plaga herbívoros.
12. - Uso de al menos uno de los compuestos identificados en el extracto alcohólico según la reivindicación 4 y que se seleccionan de entre 3-0- 3-D- glucopiranosil-(3R)-hidroxibutanolida, (R)-3-hidroxibutanolida y etil 3-(R)-3- 3-D- glucopiranosiloxibutanoato, para el control de insectos-plaga herbívoros.
13. - Método de tratamiento fitosanitario para el control de insectos-plaga, caracterizado por que comprende administrar una dosis fitosanitariamente eficaz del extracto alcohólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y/o de la composición fitosanitaria según la reivindicación 10 y/o de al menos uno de los compuestos según la reivindicación 12.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GAO W -Y ET AL.: "Phenolic glucosides and a [gamma]-lactone glucoside from the sprouts of Crocus sativus", PLANTA MEDICA, vol. 65, June 1999 (1999-06-01), pages 425 - 427, XP055232309 *

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