WO2015140366A1 - Method for the absolute quantification of peptides using tandem mass spectrometry, and the uses thereof - Google Patents

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WO2015140366A1
WO2015140366A1 PCT/ES2015/000047 ES2015000047W WO2015140366A1 WO 2015140366 A1 WO2015140366 A1 WO 2015140366A1 ES 2015000047 W ES2015000047 W ES 2015000047W WO 2015140366 A1 WO2015140366 A1 WO 2015140366A1
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isotopically enriched
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PCT/ES2015/000047
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Pablo RODRÍGUEZ GONZÁLEZ
Ana GONZÁLEZ ANTUÑA
José Ignacio GARCÍA ALONSO
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Universidad De Oviedo
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Abstract

The invention relates to a method for the absolute quantification of peptides by means of tandem mass spectrometry, and the uses thereof using peptides that are isotopically enriched in stable isotopes that exhibit spectral overlapping with the peptide of natural isotopic abundance; monitoring multiple reactions at low resolution in the first analyser of a tandem mass spectrometer; and multiple linear regression. The method is also suitable for indirectly determining proteins after the hydrolysis of the proteins using enzymes, the selection of one or a number of peptides that are characteristic of same, and the determining of these peptides in an absolute manner. The invention is suitable for application in fields requiring the quantification of proteins and/or peptides in a sample, such as in biological fluids or in cell cultures, for example in the fields of agriculture, chemistry, pharmacy, biomedicine or food safety.

Description

MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA DE PÉPTIDOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM. Y SUS USOS  METHOD FOR THE ABSOLUTE QUANTIFICATION OF PEPTIDES THROUGH MASS SPECTROMETRY IN TANDEM. AND ITS USES
La presente invención se refiere a un método para la cuantificación absoluta de péptidos mediante espectrometría de masas en tándem utilizando péptidos enriquecidos isotópicamente con isótopos estables que presenten solapamiento espectral con el péptido de abundancia natural, monitorización de reacciones múltiples a baja resolución en el primer analizador y regresión lineal múltiple. El método es también aplicable para la determinación indirecta de proteínas tras su hidrólisis la selección de uno o varios péptidos característicos de éstas y la determinación absoluta de estos péptidos. La presente invención también se refiere a los usos del método para la cuantificación absoluta de péptidos. The present invention relates to a method for absolute quantification of peptides by tandem mass spectrometry using isotopically enriched peptides with stable isotopes that exhibit spectral overlap with the natural abundance peptide, monitoring multiple reactions at low resolution in the first analyzer and multiple linear regression. The method is also applicable for the indirect determination of proteins after hydrolysis the selection of one or several peptides characteristic of these and the absolute determination of these peptides. The present invention also relates to the uses of the method for absolute quantification of peptides.
La invención resulta de aplicación en aquellos sectores en los que sea necesaria la cuantificación de proteínas y/o péptidos en una muestra, como puede ser en fluidos biológicos o en cultivos celulares, como por ejemplo en los sectores de la agricultura, la química, la farmacia, la biomedicina o la seguridad alimentaria. The invention is applicable in those sectors in which the quantification of proteins and / or peptides in a sample is necessary, such as in biological fluids or in cell cultures, such as in the agriculture, chemistry, and agriculture sectors. pharmacy, biomedicine or food safety.
ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE
La expresión de los genes tiene como resultado final la síntesis de péptidos y proteínas. Se considera que una cadena de aminoácidos es un péptido cuando contiene menos de 50 aminoácidos y que es una proteína cuando la cadena es más larga. En muestras biológicas se pueden encontrar tanto péptidos como proteínas. Estas biomoléculas son la llave para descifrar y entender la información contenida en el genoma de cualquier organismo vivo. El proteoma humano comprende más de 100.000 proteínas y péptidos con diferentes propiedades químicas que cubren concentraciones de hasta nueve órdenes de magnitud. Para llegar a entender molecularmente los procesos de las enfermedades es vital comparar sistemas celulares normales y en estado patológico para identificar y cuantificar los cambios que se efectúan en el proteoma. Esta tecnología se conoce con el nombre de proteómica cuantitativa y se basa en el análisis de proteínas y péptidos mediante distintas técnicas incluyendo su mareaje metabólico, químico o enzimático. Los métodos analíticos desarrollados hasta la fecha en este campo están lejos de lograr la cuantificación de todas las proteínas y péptidos contenidos en un organismo. Sin embargo, la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas es una de las herramientas actuales más eficientes y prometedoras. The expression of genes results in the synthesis of peptides and proteins. An amino acid chain is considered to be a peptide when it contains less than 50 amino acids and that it is a protein when the chain is longer. In biological samples both peptides and proteins can be found. These biomolecules are the key to deciphering and understanding the information contained in the genome of any living organism. The human proteome comprises more than 100,000 proteins and peptides with different chemical properties that cover concentrations of up to nine orders of magnitude. In order to understand molecularly the disease processes, it is vital to compare normal and pathological cellular systems to identify and quantify the changes that are made in the proteome. This technology is known as quantitative proteomics and is based on the analysis of proteins and peptides by different techniques including its metabolic, chemical or enzymatic marking. The analytical methods developed to date in this field are far from achieving the quantification of all proteins and peptides contained in an organism. However, liquid chromatography coupled to mass spectrometry is one of the most efficient and promising current tools.
El uso de isótopos estables enriquecidos juega un papel muy importante en el desarrollo de nuevas técnicas basadas en la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas para la cuantificación de proteínas y péptidos ya que permite el desarrollo de métodos de cuantificación mediante análisis por dilución isotópica (IDMS). El análisis por dilución isotópica está considerado como un método absoluto de análisis que proporciona resultados directamente trazables al Sistema Internacional de unidades. Además, el uso de isótopos estables enriquecidos ha dado lugar al desarrollo de nuevas metodologías para explorar la dinámica de proteomas enteros y así proporcionar comparaciones relativas de las abundancias de las proteínas entre muestras (cuantificación relativa). IDMS ha sido también empleado en el desarrollo de métodos capaces de proporcionar un alto nivel en la precisión y exactitud de la determinación de proteínas (cuantificación absoluta). The use of stable enriched isotopes plays a very important role in the development of new techniques based on liquid chromatography coupled to mass spectrometry for the quantification of proteins and peptides since it allows the development of quantification methods by isotopic dilution analysis (IDMS ). Isotopic dilution analysis is considered as an absolute method of analysis that provides directly traceable results to the International System of Units. In addition, the use of stable enriched isotopes has resulted in the development of new methodologies to explore the dynamics of whole proteomes and thus provide relative comparisons of protein abundances between samples (relative quantification). IDMS has also been used in the development of methods capable of providing a high level in the precision and accuracy of protein determination (absolute quantification).
La cuantificación relativa tiene como objetivo caracterizar cualitativa y cuantitativamente los cambios en la composición de un proteoma en función del genotipo, estado del ciclo celular, estado de la enfermedad y metabolismo de un fármaco (Moseley A, "Current trends in differential expression proteomics: isotopically coded tags" Trends in Biotechnology 19 (2001) S10) en lo que se ha venido llamando "expresión diferencial". Hay una gran cantidad de proteínas y péptidos que están involucrados en la respuesta a un estímulo, produciendo cambios en la señalización, transcripción, transducción y en las interacciones metabólicas de las modificaciones post-transduccionales. El reto reside en conocer los patrones de respuesta que se encuentran ocultos en ese cambio. El empleo de isótopos estables enriquecidos en combinación con la espectrometría de masas en tándem es una de las herramientas más eficaces para llevar a cabo el estudio de la expresión diferencial de las proteínas. Este tipo de cuantificación, conocida como cuantificación relativa, se basa en generar dos mezclas de proteoma: una isotópicamente enriquecida y otra con abundancia natural. La combinación de ambas mezclas durante la preparación de la muestra disminuye al mínimo las diferencias en la pérdida de proteínas o péptidos. Por tanto, la comparación de las intensidades de las señales correspondientes a cada mezcla de proteoma separadas por una diferencia de masa definida, proporcionará una medida en el nivel de la expresión relativa de los péptidos o proteínas en la muestra que se estudia (Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B "Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review" Anal.Bioanal. Chem. 389 (2007) 1017). Es muy importante resaltar que este modo de cuantificación en ningún caso permite determinar la cantidad absoluta de proteína o péptido presente en una muestra. Los primeros procedimientos que se desarrollaron dentro de la cuantificación relativa con isótopos estables enriquecidos fueron el mareaje metabólico (Y, Huang K, Cross F.R, Cowburn D, Chait B.T "Accurate quantitation of protein expression and site-specifle phosphorylation" Proc. Nattl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) 6591; "Method for the comparative quantitative analysis of proteins and other biological material by isotopic labelling and mass spectrometry" Pat. No. US 6,391,649 Bl) y el mareaje estable de células en cultivo con aminoácidos enriquecidos isotópicamente, SILAC (Stable isotope labelling by aminoacids in cell culture) (Ong S, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen D.B, Steen H, Pandey A, Mann M "Stable isotope labeling by omino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics" Mol. Cell. Proteomics 1(2002) 376). Posteriormente se desarrollaron métodos basados en el mareaje proteolítico, como la introducción de la marca isotópica de forma simultánea con la digestión de la proteína ("Enzyme Catalyzed Isotope LabeUn^ Pat. No. US 2005/0032149; Fenselau C, Yao X iil802-Labeling in Quantitative Proteomic Strategies: A Status Report" J. Proteome Res 8 (2009) 2140). Sin embargo, los métodos más utilizados actualmente son los basados en el mareaje químico. Dependiendo del reactivo utilizado, se pueden encontrar numerosos métodos en la bibliografía (Julka S, Regnier F "Quantification in Proteomics through Stable Isotope Coding: A Review" J. Proteome Res 3 (2004) 350; Iliuk A, Galán J, Tao W. A "Playing tag with quantitative proteomics" Anal. Bioanal. Chem. 393 (2009) 503). Por ejemplo, Goodlett y colaboradores (Goodlett D. R, Keller A, Watts J.D, Newitt R, Yi E.C, Purvine S, Eng J.K, von Haller P, Aebersold R, Kolker E "Dijferential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de novosequence derivation" Rapid Commun. Mass Spectrom. 15 (2001) 1214) propusieron en 2001 introducir pequeñas marcas después de la digestión tríptica. Estas marcas consistían en utilizar alcoholes deuterados para esterifícar los grupos carboxílicos de los péptidos (carboxilo terminal y cadena lateral del ácido glutámico y ácido aspártico). Otro mareaje químico es conocido como "dimethyl labelling" y consiste en utilizar formaldehído enriquecido con deuterio después de la digestión (Hsu J, Huang S, Chow N, Chen S "Stable-isotope dimethyl labeling or quantitative proteomics" Anal. Chem.75 (2003) 6843; "Reagent Kit of Global Analysis for Protein Expression and Method for Qualitative and Quantitative Proteomic Analysis using the same" Patent No.: US 7,338,806 B2). Gygi y colaboradores (Gygi S. P, Rist B, Gerber S.A, Turecek F, Gelb M.H, Aebersold R ''''Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags" Nat. Biotechnol. 17 (1999) 994; "Rapid Quantitative Analysis of Proteins or Protein Function in Complex Mixtures" Patent No.: US 6,670,194 Bl) desarrollaron otra estrategia de mareaje químico con isótopos estables y una etiqueta de afinidad para la cuantificación relativa de proteínas en mezclas complejas. En ella se procede a la derivatización química de los péptidos con un reactivo conocido como ICAT. Este compuesto posee un extremo que reacciona con los residuos de cisteína libres, un linker que puede contener ocho hidrógenos (ligero) u ocho deuterios (pesado), y otro extremo con biotina como ancla de afinidad. Los péptidos (que contienen cisteína) se aislan selectivamente por cromatografía de afinidad con avidina. Li y colaboradores (Li J, Steen H, Gygi S.P "Protein Profiling with Cleavable Isotope-coded Affinity Tag (cICAT) Reagents" Mol. Cell. Proteomics 2 (2003) 1198) desarrollaron una nueva versión de ICAT denominada "cleavage ICAT (cICAT)" mediante la sustitución del reactivo (linker) que contenía 8 átomos de deuterio por otro que contenía nueve átomos de 13 C. Otros métodos que se basaron en el procedimiento ICAT consistieron en marcar sitios específicos de péptidos con cisteína (Zhou H, Ranish J.A, Watts J.D, Aebersold R "Quantitative proteome analysis By solid-phase isotope tagging and mass spectrometry" Nat. Biotechnol. 19 (2002) 512). Otro tipo de estrategia de mareaje químico es el que hace uso de marcas isobáricas. Este método fue publicado por Thompson y colaboradores Thompson A, Scháfer J.U, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neuman T, Hamon C "Tándem mass tags: a novel quantifleation strateg for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS* Anal. Chem.75 (2003) 1895; "Mass Labels" Patent Application No.: US 2005/0048489 Al) y recibió el nombre de etiqueta de masa en tándem {tándem mass tags, TMT). Es similar a otras estrategias para marcar péptidos pero la diferencia es que los péptidos de abundancia isotópica natural y sus análogos enriquecidos isotópicamente contienen la misma masa global. En este caso, el grupo amino terminal y el grupo épsilon amino de la lisina es marcado utilizando N-hidroxysuccinimida. Solamente, después de la colisión en la celda, los péptidos naturales y enriquecidos se distinguen en el espectro de masas. Actualmente, la estrategia que más se utiliza se conoce con el nombre de iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantifleation) (Ross P.L, Huang Y.N, Márchese J.N, Williamson B, Parker K, Hartan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet- Jones M, He F, Jacobson A, Pappin D "Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine- reactive isobaric tagging reagents" Mol.Cell. Proteomics 3 (2004) 1154; "Isobarically Labelled Analytes and Fragment Ions derived therefrom" Patent Application No.: US 2010/0129842 Al). iTRAQ se basa en el empleo de un reactivo que reacciona con el grupo amino terminal y el grupo amino de la cadena lateral de la Usina. La molécula que se utiliza para el mareaje químico es la N- metilpiperazina. El reactivo iTRAQ consta de un equilibrador con masa 28 a 31 Da y un grupo repórter con masa 114 a 117 Da. Tras la fragmentación, el grupo repórter se pierde generando fragmentos entre 114 a 117 Da. La intensidad o la relación de la abundancia de los fragmentos se utilizan para la cuantificación de los péptidos. La principal ventaja es que se pueden marcar 4 muestras diferentes en el mismo experimento. The relative quantification aims to qualitatively and quantitatively characterize the changes in the composition of a proteome according to the genotype, state of the cell cycle, disease status and metabolism of a drug (Moseley A, "Current trends in differential expression proteomics: isotopically coded tags "Trends in Biotechnology 19 (2001) S10) in what has been called" differential expression ". There are a large number of proteins and peptides that are involved in the response to a stimulus, producing changes in signaling, transcription, transduction and in the metabolic interactions of post-transductional modifications. The challenge lies in knowing the response patterns that are hidden in that change. The use of stable isotopes enriched in combination with tandem mass spectrometry is one of the most effective tools to carry out the study of differential protein expression. This type of quantification, known as relative quantification, is based on generating two proteome mixtures: one isotopically enriched and another with natural abundance. The combination of both mixtures during sample preparation minimizes differences in the loss of proteins or peptides. Therefore, comparing the intensities of the signals corresponding to each proteome mixture separated by a defined mass difference, will provide a measure in the level of the relative expression of the peptides or proteins in the sample being studied (Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B "Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review" Anal Bioanal. Chem. 389 (2007) 1017). It is very important to emphasize that this mode of quantification in no case allows to determine the absolute amount of protein or peptide present in a sample. The first procedures that were developed within the relative quantification with stable enriched isotopes were metabolic (Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT "Accurate quantitation of protein expression and site-specifle phosphorylation" Proc. Nattl. Acad . Sci. USA, 96 (1999) 6591; "Method for the comparative quantitative analysis of proteins and other biological material by isotopic labelling and mass spectrometry" Pat. No. US 6,391,649 Bl) and the stable marking of cells in culture with enriched amino acids isotopically, SILAC (Stable isotope labelling by aminoacids in cell culture) (Ong S, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M "Stable isotope labeling by omino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics "Mol. Cell. Proteomics 1 (2002) 376). Subsequently, methods based on proteolytic tracing were developed, such as the introduction of the isotopic label simultaneously with the protein digestion ("Enzyme Catalyzed Isotope LabeUn ^ Pat. No. US 2005/0032149; Fenselau C, Yao X iil8 0 2 -Labeling in Quantitative Proteomic Strategies: A Status Report "J. Proteome Res 8 (2009) 2140). However, the most commonly used methods are those based on chemical marking. Depending on the reagent used, numerous methods can be found in the literature (Julka S, Regnier F "Quantification in Proteomics through Stable Isotope Coding: A Review" J. Proteome Res 3 (2004) 350; Iliuk A, Galán J, Tao W. A "Playing tag with quantitative proteomics" Anal. Bioanal. Chem. 393 (2009) 503). For example, Goodlett et al. (Goodlett D. R, Keller A, Watts JD, Newitt R, Yi EC, Purvine S, Eng JK, von Haller P, Aebersold R, Kolker E "Dijferential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de novosequence derivation" Rapid Commun. Mass Spectrom 15 (2001) 1214) proposed in 2001 to introduce small marks after tryptic digestion. These marks consisted of using deuterated alcohols to esterify the carboxylic groups of the peptides (terminal carboxyl and glutamic acid and aspartic acid side chain). Another chemical marking is known as "dimethyl labelling" and consists of using formaldehyde enriched with deuterium after digestion (Hsu J, Huang S, Chow N, Chen S "Stable-isotope dimethyl labeling or quantitative proteomics" Anal. Chem.75 ( 2003) 6843; "Reagent Kit of Global Analysis for Protein Expression and Method for Qualitative and Quantitative Proteomic Analysis using the same" Patent No .: US 7,338,806 B2). Gygi et al. (Gygi S. P, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R '''Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags "Nat. Biotechnol. 17 (1999) 994; "Rapid Quantitative Analysis of Proteins or Protein Function in Complex Mixtures" Patent No .: US 6,670,194 Bl) developed another chemical mapping strategy with stable isotopes and an affinity label for the relative quantification of proteins in complex mixtures. The chemical derivatization of peptides with a reagent known as ICAT This compound has one end that reacts with free cysteine residues, a linker that can contain eight hydrogens (light) or eight deuteria (heavy), and another end with biotin as affinity anchor Peptides (containing cysteine) are selectively isolated by affinity chromatography with avidin Li and collaborators (Li J, Steen H, Gygi SP "Protein Profiling with Cleavable Isotope-co ded Affinity Tag (cICAT) Reagents "Mol. Cell Proteomics 2 (2003) 1198) developed a new version of ICAT called "cleavage ICAT (cICAT)" by replacing the reagent (linker) containing 8 atoms of deuterium with another containing nine atoms of 13 C. Other methods that were based in the ICAT procedure they consisted of marking specific sites of cysteine peptides (Zhou H, Ranish JA, Watts JD, Aebersold R "Quantitative proteome analysis By solid-phase isotope tagging and mass spectrometry" Nat. Biotechnol. 19 (2002) 512). Another type of strategy Chemical marking is the one that makes use of isobaric labels. This method was published by Thompson and collaborators Thompson A, Scháfer JU, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neuman T, Hamon C "Tandem mass tags: a novel quantifleation strateg for comparative analysis of complex protein mixtures by MS / MS * Anal. Chem. 75 (2003) 1895; "Mass Labels" Patent Application No .: US 2005/0048489 Al) and was called a tandem mass tag (TMT). It is similar to other strategies to label peptides but the difference is that peptides of natural isotopic abundance and their isotopically enriched analogs contain the same global mass.In this case, the amino terminal group and the amino epsilon group of lysine is labeled using N-hydroxysuccinimide. after the collision in the cell, the natural and enriched peptides are distinguished in the mass spectrum.Today, the most commonly used strategy is known as iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantifleat ion) (Ross PL, Huang YN, Mark JN, Williamson B, Parker K, Hartan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet- Jones M, He F, Jacobson A, Pappin D "Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents" Mol.Cell. Proteomics 3 (2004) 1154; "Isobarically Labelled Analytes and Fragment Ions derived therefrom" Patent Application No .: US 2010/0129842 Al). iTRAQ is based on the use of a reagent that reacts with the amino terminal group and the amino group of the Usina side chain. The molecule used for chemical makeup is N-methylpiperazine. The iTRAQ reagent consists of a balancer with mass 28 to 31 Da and a reporter group with mass 114 to 117 Da. After fragmentation, the reporter group is lost generating fragments between 114 to 117 Da. The intensity or ratio of the abundance of the fragments are used for the quantification of the peptides. The main advantage is that 4 different samples can be labeled in the same experiment.
Cabe resaltar que ninguno de estos procedimientos permite determinar la cantidad absoluta de proteína presente en una muestra ya que la cuantificación relativa tiene como objetivo determinar la expresión diferencial de las proteínas entre dos estados, como por ejemplo ausencia o presencia de un fármaco. Sin embargo, la cuantifícación absoluta pretende conocer cuál es la concentración de las proteínas y los péptidos en una muestra concreta. Esto tiene una relevancia importante en campos como la biomedicina, la industria farmacéutica, la seguridad alimentaria o la salud pública. Solamente las concentraciones de proteínas o péptidos obtenidas mediante el empleo de cuantificaciones absolutas puede relacionarse con una referencia establecida a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones, en donde todas ellas tienen asociada una incertidumbre (trazabilidad). Ésta es la única forma de asegurar que la determinación de la concentración de proteína en una muestra es directamente trazable al Sistema Internacional de unidades. La cuantifícación de una proteína mediante IDMS requiere la adición de un compuesto enriquecido isotópicamente (trazador isotópico) a la muestra. La exactitud y precisión en la determinación de la concentración de la proteína dependerá del trazador que se seleccione y de la metodología analítica que se vaya a utilizar. Dependiendo de la forma en que se encuentre el análogo enriquecido se pueden encontrar proteínas, péptidos o aminoácidos enriquecidos isotópicamente en alguno de sus átomos. Por tanto, existen tres estrategias actuales de cuantifícación absoluta. It should be noted that none of these procedures allows to determine the absolute amount of protein present in a sample since the relative quantification aims to determine the differential expression of the proteins between two states, such as the absence or presence of a drug. However, the Absolute quantification aims to know the concentration of proteins and peptides in a specific sample. This has an important relevance in fields such as biomedicine, the pharmaceutical industry, food safety or public health. Only the concentrations of proteins or peptides obtained through the use of absolute quantifications can be related to an established reference through an unbroken chain of comparisons, where all of them have an uncertainty associated (traceability). This is the only way to ensure that the determination of protein concentration in a sample is directly traceable to the International System of Units. Quantification of a protein by IDMS requires the addition of an isotopically enriched compound (isotopic tracer) to the sample. The accuracy and precision in determining the protein concentration will depend on the tracer that is selected and the analytical methodology to be used. Depending on the way in which the enriched analog is found, isotopically enriched proteins, peptides or amino acids can be found in any of its atoms. Therefore, there are three current strategies for absolute quantification.
La primera de las estrategias se basa en la cuantifícación de proteínas y péptidos utilizando aminoácidos enriquecidos isotópicamente. Esta estrategia es directamente trazable al SI (Burkitt W. I, Pritchard C, Arsene C, Henrion A, Bunk D, O'Connor G "Toward Systéme International d'Unité-traceable protein quantification: From omino acids to proteins" Anal. Biochem. 376 (2008) 242), ya que los aminoácidos se pueden adquirir comercialmente en diferentes empresas con certificados de pureza que incluso pueden ser proporcionados por Institutos Nacionales de Metrología. La cuantifícación de una proteína a través de esta estrategia se hace con una hidrólisis química en condiciones ácidas, pero también han sido descritas hidrólisis básicas y enzimáticas. Estas reacciones requieren tiempos largos (24 h), que pueden acortarse mediante el empleo de microondas (Fountoulakis M, Lahm H. "Hydrolysis and omino acid composition analysis of proteins" J. Chrom. A. 826 (1998) 109). El paso limitante en este procedimiento es conseguir una hidrólisis completa de las proteínas, lo cual es determinante para la exactitud final de la medida. La principal desventaja de este método es que no se puede aplicar directamente a muestras reales debido a la presencia de otras proteínas o péptidos que también contienen los aminoácidos a determinar. Por tanto, este método está limitado al análisis de una proteína o péptido en patrones o en muestras que contengan única y exclusivamente la proteína a determinar. La determinación de proteínas como la albúmina (Kato M, Kato H, Eyama S, Takatsu A "Application of omino acid analysis using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with isotope dilution mass spectrometry for peptide and protein quantification" J. Chromatogr. B 877 (2009) 3059) de suero bovina, péptidos como la angiotensina o la hormona de crecimiento humana (Jeong J, Lim H, Kim S, Ku H, Oh K, Park S "Quantification of human growth hormone by omino acid composition analysis using isotope dilution liquid-chromatography tándem mass spectrometry" J. Chrom. A 1218 (2011) 6596) son algunos ejemplos recientes. The first of the strategies is based on the quantification of proteins and peptides using isotopically enriched amino acids. This strategy is directly traceable to SI (Burkitt W. I, Pritchard C, Arsene C, Henrion A, Bunk D, O'Connor G "Toward Systéme International d'Unité-traceable protein quantification: From omino acids to proteins" Anal. Biochem 376 (2008) 242), since amino acids can be purchased commercially from different companies with certificates of purity that can even be provided by the National Metrology Institutes. The quantification of a protein through this strategy is done with a chemical hydrolysis under acidic conditions, but basic and enzymatic hydrolysis have also been described. These reactions require long times (24 h), which can be shortened by the use of microwaves (Fountoulakis M, Lahm H. "Hydrolysis and omino acid composition analysis of proteins" J. Chrom. A. 826 (1998) 109). The limiting step in this procedure is to achieve a complete hydrolysis of the proteins, which is decisive for the final accuracy of the measurement. The main disadvantage of this method is that it cannot be applied directly to real samples due to the presence of other proteins or peptides that also They contain the amino acids to be determined. Therefore, this method is limited to the analysis of a protein or peptide in standards or in samples containing only and exclusively the protein to be determined. The determination of proteins such as albumin (Kato M, Kato H, Eyama S, Takatsu A "Application of omino acid analysis using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with isotope dilution mass spectrometry for peptide and protein quantification" J. Chromatogr. B 877 (2009 ) 3059) of bovine serum, peptides such as angiotensin or human growth hormone (Jeong J, Lim H, Kim S, Ku H, Oh K, Park S "Quantification of human growth hormone by omino acid composition analysis using isotope dilution liquid -chromatography tandem mass spectrometry "J. Chrom. A 1218 (2011) 6596) are some recent examples.
La segunda estrategia se basa en la utilización de péptidos enriquecidos isotópicamente. La cuantificación de proteínas a través péptidos enriquecidos se realiza a través de la determinación de uno o varios de los péptidos característicos de la proteína liberados tras una hidrólisis enzimática (comúnmente utilizando tripsina). Para llevar a cabo esta estrategia es imprescindible que el péptido a determinar sea único de la proteína que se va a estudiar. Además, se debe asegurar que la hidrólisis enzimática sea completa para que el péptido de interés de abundancia isotópica natural se libere cuantitativamente de la proteína. Esta estrategia, por tanto, está basada en la adición de un péptido enriquecido isotópicamente al inicio del análisis, es decir, antes de la digestión tríptica. El péptido enriquecido isotópicamente debe ser estable a lo largo de todo el proceso de digestión y no debe sufrir ningún tipo de degradación hasta que el péptido característico de abundancia isotópica natural sea liberado completamente y se mezcle homogéneamente con el péptido enriquecido isotópicamente. La primera aplicación donde se utilizaron péptidos enriquecidos isotópicamente fue publicada por Desiderio y Kai (Desiderio D.M, Kai M "Preparation of stable isotope-incorporated peptide infernal standards for field desorption mass spectrometry quantification of peptides in biologic tissue" Biol. Mass Spectrom. 10 (1983) 471) en 1983 para determinar una serie de aminoácidos presentes en el tejido del tálamo. A continuación, Barr y colaboradores (Barr J. R, Maggio V.L, Patterson D. G, Cooper G.R, Henderson L.O, Turner W.E, Smith S.J, Hannon W.H, Needham L.L, Sampson E. J "Isotope dilution-mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein Α-Γ Clin. Chem. 42 (1996) 1676) sintetizaron péptidos de abundancia natural y enriquecidos isotópicamente para llevar a cabo la cuantificación de la apoproteina Al. Posteriormente se desarrollaron y patentaron otras metodologías como AQUA y QCONCAT. El acrónimo AQUA (Absolute QUAantification) se refiere al uso de péptidos enriquecidos isotópicamente sintetizados químicamente para la cuantificación de las proteínas (Gygi S.P, Gerber S.A "Absolute Quantification of Proteins and modified forms thereof by multistage mass Spectrometry". Pat. no. US 7,501,286 B2; Gerber S.A, Rush J, Stemman O, Kirschner M.W, S.P. Gygi "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tándem MSP PNAS 100 (2003) 6940). Antes de optar por esta estrategia de trabajo la selección del tipo de péptido enriquecido isotópicamente es crucial y se deben realizar estudios previos para la selección del péptido más adecuado. El péptido seleccionado debe ser específico de la proteína y debe ser detectado mediante el espectrómetro de masas sin interferencias isobáricas incluso cuando se trabaje en modo tándem. Para la determinación directa de péptidos el método es análogo sin necesidad de realizar la hidrólisis de la proteína. Actualmente, existen empresas que ofrecen una amplia variedad de péptidos enriquecidos isotópicamente para aplicar métodos basados en la estrategia AQUA. Por otra parte, QconCAT es una estrategia más refinada capaz de realizar cuantificación múltiple de proteínas ("Artificial protein, method for absolute quantification of proteins and uses thereof Pat. no. WO 2006/128492 Al; Rivers J, Simpson D.M, Robertson D.H.L, Gaskell SJ, Beynon R.J "Absolute Multiplexed Quantitative Analysis of Protein Expression during Muscle Development Using QconCAV Mol. Cell. Proteomics 6 (2007) 1416). Este método se basa en crear genes artificiales (síntesis de novo) que al expresarse producen proteínas sintéticas formadas por péptidos trípticos. En otras palabras, los genes sintéticos se expresan generando péptidos estándar concatenados, los cuales a través de una digestión tríptica producen múltiples péptidos enriquecidos isotópicamente. De esta manera se pueden utilizar hasta 50 péptidos trípticos incluidos en QconCAT, permitiendo una cuantificación múltiple y absoluta de una o varias proteínas en un solo experimento. Las limitaciones de esta estrategia se deben principalmente a la trazabilidad del estándar de QconCAT. La calibración requiere la hidrólisis de aminoácidos descrita en la sección anterior. Además, al igual que en AQUA, se necesita una hidrólisis completa de la proteína y una buena estabilidad de los péptidos a lo largo de la digestión. Las metodologías AQUA y QconCAT utilizan mareaje isotópico múltiple para evitar el solapamiento espectral entre los péptidos enriquecidos isotópicamente y los de abundancia isotópica natural ya que el cálculo final se realiza mediante relación de intensidades entre el pico más abundante del péptido de abundancia isotópica natural y el más abundante del péptido enriquecido isotópicamente. Además, para una cuantificación correcta estas metodologías requieren la preparación de un calibrado metodológico que se suele realizar en ausencia de matriz, lo que puede provocar errores significativos en la cuantificación. La tercera estrategia para la cuantificación absoluta de proteínas se basa en la utilización de proteínas enriquecidas isotópicamente. Este procedimiento recibe el nombre de PSAQ {Protein Standard for Absolute Quantification) (Brun V, Dupuis A, Garin J "Method for absolute quantification of polypeptides" . Pat. no. US 2010/0173786 Al) y se aplicó por primera vez en la determinación de toxinas de estafilococos (Brun V, Dupuis A, Adrait A, Marcellin M, Thomas D, Court M, Vandenesch F, Garin J "Isotope-labeled Protein Standards Toward Absolute Quantitative Proteomics" Mol. Cell. Proteomics 6 (2007) 2139). La principal ventaja es la adición de la proteína marcada al comienzo del análisis. De esta forma se pueden corregir los errores a lo largo de todo el procedimiento, incluida una digestión no cuantitativa o la inestabilidad de los péptidos durante la misma. Otra ventaja es que al tener las mismas propiedades químicas hace que esta estrategia sea compatible con cualquier tipo de fraccionamiento de la muestra como es el SDS-PAGE o la inmunocaptura de proteínas. Otra ventaja de este método es que ofrece la posibilidad de que la cuantificación de la proteína se pueda realizar con cualquiera de los péptidos generados en la hidrólisis de la proteína. Por tanto, interferencias generadas durante la ionización de la muestra o la supresión de la ionización se pueden corregir con una adecuada selección del péptido que se va a medir (Brun V, Masselon C, Garin J, Dupuis A, "Isotope dilution strategies for absolute quantitative proteomics" J. Proteomics 72 (2009) 740). Sin embargo, esta estrategia tiene dos inconvenientes fundamentales. El primero de ellos es que la certificación de los estándares de proteínas debe realizarse mediante hidrólisis de aminoácidos para obtener una concentración trazable al SI. Como consecuencia, los estándares de la proteína deben estar purificados y no contener ningún péptido o aminoácido que no pertenezca a la cadena proteica. El segundo es el alto coste de esta estrategia debido a la enorme dificultad de la síntesis y purificación de las proteínas enriquecidas isotópicamente. The second strategy is based on the use of isotopically enriched peptides. The quantification of proteins through enriched peptides is carried out through the determination of one or more of the characteristic peptides of the protein released after enzymatic hydrolysis (commonly using trypsin). To carry out this strategy it is essential that the peptide to be determined is unique to the protein to be studied. In addition, it must be ensured that enzymatic hydrolysis is complete so that the peptide of interest of natural isotopic abundance is quantitatively released from the protein. This strategy, therefore, is based on the addition of an isotopically enriched peptide at the beginning of the analysis, that is, before the tryptic digestion. The isotopically enriched peptide must be stable throughout the entire digestion process and must not undergo any degradation until the characteristic peptide of natural isotopic abundance is completely released and homogeneously mixed with the isotopically enriched peptide. The first application where isotopically enriched peptides were used was published by Desiderio and Kai (Desiderio DM, Kai M "Preparation of stable isotope-incorporated peptide infernal standards for field desorption mass spectrometry quantification of peptides in biologic tissue" Biol. Mass Spectrom. 10 ( 1983) 471) in 1983 to determine a series of amino acids present in the tissue of the thalamus. Next, Barr et al. (Barr J. R, Maggio VL, Patterson D. G, Cooper GR, Henderson LO, Turner WE, Smith SJ, Hannon WH, Needham LL, Sampson E. J "Isotope dilution-mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein Α-Γ Clin. Chem. 42 (1996) 1676) synthesized peptides of natural abundance and isotopically enriched to carry out the quantification of apoprotein Al. Subsequently, other methodologies such as AQUA and QCONCAT were developed and patented. The acronym AQUA (Absolute QUAantification) refers to the use of chemically synthesized isotopically enriched peptides for protein quantification (Gygi SP, Gerber SA "Absolute Quantification of Proteins and modified forms thereof by multistage mass Spectrometry". Pat. No. US 7,501,286 B2; Gerber SA, Rush J, Stemman O, Kirschner MW, SP Gygi "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MSP PNAS 100 (2003) 6940). Before choosing this work strategy, the selection of the type of Isotopically enriched peptide is crucial and prior studies should be carried out for the selection of the most suitable peptide.The selected peptide must be protein specific and must be detected by mass spectrometer without isobaric interference even when working in tandem mode. direct determination of peptides the method is analogous without the need for hydrolysis of the prote na. Currently, there are companies that offer a wide variety of peptides isotopically enriched to apply AQUA strategy based methods. On the other hand, QconCAT is a more refined strategy capable of performing multiple quantification of proteins ("Artificial protein, method for absolute quantification of proteins and uses thereof Pat. No. WO 2006/128492 Al; Rivers J, Simpson DM, Robertson DHL, Gaskell SJ, Beynon RJ "Absolute Multiplexed Quantitative Analysis of Protein Expression during Muscle Development Using QconCAV Mol. Cell. Proteomics 6 (2007) 1416). This method is based on creating artificial genes (de novo synthesis) that when expressed produce synthetic proteins formed by tryptic peptides. In other words, synthetic genes are expressed by generating concatenated standard peptides, which through a tryptic digestion produce multiple isotopically enriched peptides. In this way, up to 50 tryptic peptides included in QconCAT can be used, allowing multiple and absolute quantification of one or more proteins in a single experiment. The limitations of this strategy are mainly due to the traceability of the QconCAT standard. Calibration requires the amino acid hydrolysis described in the previous section. In addition, as in AQUA, a complete hydrolysis of the protein and a good stability of the peptides throughout the digestion is needed. The AQUA and QconCAT methodologies use multiple isotopic mapping to avoid spectral overlap between isotopically enriched peptides and those of natural isotopic abundance since the final calculation is made by ratio of intensities between the most abundant peak of the natural isotopic abundance peptide and the most abundant isotopically enriched peptide. In addition, for a correct quantification these methodologies require the preparation of a methodological calibration that is usually performed in the absence of matrix, which can cause significant errors in the quantification. The third strategy for the absolute quantification of proteins is based on the use of isotopically enriched proteins. This procedure is called PSAQ {Protein Standard for Absolute Quantification) (Brun V, Dupuis A, Garin J "Method for absolute quantification of polypeptides". Pat. No. US 2010/0173786 Al) and was first applied in the Staphylococcal toxin determination (Brun V, Dupuis A, Adrait A, Marcellin M, Thomas D, Court M, Vandenesch F, Garin J "Isotope-labeled Protein Standards Toward Absolute Quantitative Proteomics" Mol. Cell. Proteomics 6 (2007) 2139 ). The main advantage is the addition of the labeled protein at the beginning of the analysis. This way, errors can be corrected throughout the entire procedure, including non-quantitative digestion or instability of the peptides during the procedure. Another advantage is that having the same chemical properties makes this strategy compatible with any type of fractionation of the sample such as SDS-PAGE or protein immunocapture. Another advantage of this method is that it offers the possibility that the quantification of the protein can be performed with any of the peptides generated in the hydrolysis of the protein. Therefore, interference generated during sample ionization or ionization suppression can be corrected with an appropriate selection of the peptide to be measured (Brun V, Masselon C, Garin J, Dupuis A, "Isotope dilution strategies for absolute quantitative proteomics "J. Proteomics 72 (2009) 740). However, this strategy has two fundamental drawbacks. The first of these is that the certification of protein standards must be carried out by amino acid hydrolysis to obtain a concentration traceable to the SI. As a consequence, protein standards must be purified and contain no peptide or amino acid that does not belong to the protein chain. The second is the high cost of this strategy due to the enormous difficulty of the synthesis and purification of isotopically enriched proteins.
Los métodos descritos hasta la fecha para la cuantificación absoluta de proteínas mediante el uso de péptidos enriquecidos isotópicamente, en concreto el método AQUA, utilizan análogos enriquecidos isotópicamente en un número suficiente de átomos de deuterio, 13C ó 15N, que permita evitar el solapamiento espectral en el espectrómetro de masas entre la distribución isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y el péptido enriquecido isotópicamente. Esto permite obtener una relación isotópica utilizando las intensidades observadas a dos masas (o dos transiciones) libres de solapamiento espectral. Estas intensidades se utilizan junto con la cantidad de péptido enriquecido isotópicamente añadida para realizar la cuantificación absoluta de la proteína. Este tipo de procedimientos pueden conducir a errores significativos en la determinación de proteínas por dos razones: a) El uso de péptidos análogos enriquecidos isotópicamente en varios átomos de la molécula aumenta la probabilidad de efectos isotópicos no solo durante la preparación de la muestra sino también durante la separación cromatográfica y la ionización en la fuente de electroespray (ESI). b) Utilizar relaciones isotópicas calculadas a partir de intensidades de dos masas conduce a errores en la determinación final del péptido de abundancia isotópica natural. La relación isotópica no es igual a la relación de moles ya que las intensidades absolutas no tienen en cuenta el enriquecimiento isotópico del péptido enriquecido isotópicamente ni la abundancia isotópica relativa de cada uno de los isotopólogos constituyentes de los péptidos. Para una conversión correcta de la relación de intensidades a relación de número de moles es necesario realizar un calibrado metodológico que permita establecer una función de correlación entre ambos. Dicho calibrado se suele realizar en ausencia de matriz, lo cual puede provocar errores significativos en las determinaciones utilizando una fuente ESI. The methods described to date for the absolute quantification of proteins through the use of isotopically enriched peptides, in particular the AQUA method, use isotopically enriched analogs in a sufficient number of deuterium atoms, 13 C or 15 N, which allow overlapping to be avoided. spectral in the mass spectrometer between the isotopic distribution of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide. This allows an isotopic relationship to be obtained using the intensities observed at two masses (or two transitions) free of spectral overlap. These intensities are used together with the amount of isotopically enriched peptide added to perform the absolute quantification of the protein. This type of procedure can lead to significant errors in the determination of proteins for two reasons: a) The use of isotopically enriched analog peptides in several atoms of the molecule increases the probability of isotopic effects not only during sample preparation but also during Chromatographic separation and ionization at the source of electrospray (ESI). b) Using isotopic ratios calculated from intensities of two masses leads to errors in the final determination of the natural isotopic abundance peptide. The isotopic ratio is not equal to the mole ratio since the absolute intensities do not take into account the isotopic enrichment of the isotopically enriched peptide or the relative isotopic abundance of each of the constituent isotopologists of the peptides. For a correct conversion of the intensity ratio to the number of moles, it is necessary to perform a methodological calibration that allows establishing a correlation function between the two. Said calibration is usually performed in the absence of a matrix, which can cause significant errors in the determinations using an ESI source.
Los inventores también han desarrollado un modo alternativo de cuantificación en dilución isotópica que hace uso de análogos del compuesto a determinar mínimamente enriquecidos en I3C y regresión lineal múltiple (González-Antuña A, Rodríguez-González P, Centineo G, García Alonso JI. "Evaluation of minimal labellingfor stable isotope dilution in organic analysis". Analyst 2010;135:953-64; González-Antuña A, Rodríguez-González P, Lavandera I, Centineo G, Gotor V, García Alonso JI. "Development of a routine method for the simultaneous conflrmation and determination of clenbuterol in uriñe by minimal labelling isotope pattern deconvolution and GC-El-MS" . Anal. Bioanal. Chem. 2012; 402:1879-88). La utilización de compuestos mínimamente enriquecidos isotópicamente permite evitar efectos isotópicos durante las determinaciones, y la regresión lineal múltiple permite la obtención de la relación de moles entre el compuesto enriquecido isotópicamente y el compuesto de abundancia isotópica natural mediante la medida de las abundancias isotópicas con espectrometría de masas. Sin embargo, cuando se han de utilizar espectrómetros de masas en tándem, como por ejemplo en la determinación de péptidos, el empleo de compuestos mínimamente enriquecidos isotópicamente requiere un cálculo complejo de los perfiles de fragmentación tanto del compuesto de abundancia isotópica natural como del compuesto enriquecido isotópicamente (Ramaley L., Cubero Herrera L. "Software for the calculation of isotope patterns in tándem mass spectrometry" Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 2707-14; Castillo A., Gracia-Lor E., Roig-Navarro A.F., Sancho J.V., Rodríguez-González P., García Alonso J.I.: Isotope pattern deconvolution-tandem mass spectrometry for the determination and confirmation of diclofenac in wastewaters". Anal. Chim. Acta. 765(2013)77-85). The inventors have also developed an alternative mode of quantification in isotopic dilution that makes use of analogs of the compound to be determined minimally enriched in I3 C and multiple linear regression (González-Antuña A, Rodríguez-González P, Centineo G, García Alonso JI. "Evaluation of minimal labellingfor stable isotope dilution in organic analysis". Analyst 2010; 135: 953-64; González -Antuña A, Rodríguez-González P, Lavandera I, Centineo G, Gotor V, García Alonso JI. "Development of a routine method for the simultaneous conflrmation and determination of clenbuterol in uriñe by minimal labelling isotope pattern deconvolution and GC-El-MS ". Anal. Bioanal. Chem. 2012; 402: 1879-88). The use of minimally enriched isotopic compounds makes it possible to avoid isotopic effects during determinations, and multiple linear regression allows obtaining the ratio of moles between the isotopically enriched compound and the natural isotopic abundance compound by measuring isotopic abundances with spectrometry of masses. However, when tandem mass spectrometers are to be used, as for example in the determination of peptides, the use of minimally enriched isotopic compounds requires a complex calculation of the fragmentation profiles of both the natural isotopic abundance compound and the enriched compound. isotopically (Ramaley L., Cubero Herrera L. "Software for the calculation of isotope patterns in tandem mass spectrometry" Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 2707-14; Castillo A., Gracia-Lor E., Roig-Navarro AF, Sancho JV, Rodríguez-González P., García Alonso JI: Isotope pattern deconvolution-tandem mass spectrometry for the determination and confirmation of diclofenac in wastewaters ". Anal. Chim. Acta. 765 (2013) 77-85).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A efectos de la presente invención y su descripción, se definen a continuación algunos conceptos utilizados que pueden ser desconocidos para un experto en la materia o utilizados de una forma poco conocida o diferente de la habitual: DESCRIPTION OF THE INVENTION For the purposes of the present invention and its description, some concepts used that may be unknown to a person skilled in the art or used in a little known or different way than usual are defined below:
• Isotopólogo entidad molecular que difiere solamente en su composición isotópica (numero de sustituciones isotópicas). • Isotopologist molecular entity that differs only in its isotopic composition (number of isotopic substitutions).
· Perfil isotópico: se define como el conjunto de abundancias isotópicas relativas de todos los isotopólogos de una molécula. La suma de todas las abundancias isotópicas relativas de cualquier perfil isotópico es 1. El perfil isotópico de una molécula puede medirse experimentalmente mediante Espectrometría de Masas. · Isotopic profile: defined as the set of relative isotopic abundances of all isotopologists of a molecule. The sum of all the abundances Relative isotopic of any isotopic profile is 1. The isotopic profile of a molecule can be measured experimentally by Mass Spectrometry.
Perfil isotópico natural: es el perfil isotópico de una molécula que se encuentra en la naturaleza. Para la mayoría de los elementos de la Tabla Periódica que constituyen las moléculas, el perfil isotópico natural es constante e invariable en toda la Tierra. Las abundancias isotópicas naturales de los elementos están tabuladas incluyendo sus incertidumbres debidas a la variabilidad natural. Perfil isotópico enriquecido: es el perfil isotópico de una molécula donde la abundancia relativa de uno o varios isótopos estables de uno o varios elementos constituyentes de la molécula es claramente distinta de la natural. En estos perfiles isotópicos enriquecidos, normalmente un isótopo se encuentra en una abundancia isotópica relativa más elevada que en el elemento natural, isótopo enriquecido, mientras que el resto de isótopos tienen una abundancia menor. Esto hace que la abundancia relativa de los isotopólogos de la molécula marcada isotópicamente difiera de la abundancia relativa de los isotopólogos en la molécula natural.  Natural isotopic profile: is the isotopic profile of a molecule that is found in nature. For most of the elements of the Periodic Table that constitute the molecules, the natural isotopic profile is constant and invariable throughout the Earth. The natural isotopic abundances of the elements are tabulated including their uncertainties due to natural variability. Enriched isotopic profile: is the isotopic profile of a molecule where the relative abundance of one or more stable isotopes of one or more constituent elements of the molecule is clearly different from the natural one. In these enriched isotopic profiles, normally an isotope is found in a higher relative isotopic abundance than in the natural, enriched isotope element, while the rest of isotopes have a lower abundance. This causes the relative abundance of isotopologists of the isotopically labeled molecule to differ from the relative abundance of isotopologists in the natural molecule.
Solapamiento espectral: cuando se mezclan en la misma disolución dos perfiles isotópicos distintos del mismo péptido, natural y enriquecido, existirá solapamiento espectral si las abundancias isotópicas en algunas de las masas del perfil isotópico son distintas de cero para los dos perfiles. Cuando se marca un compuesto con un número pequeño de isótopos enriquecidos (n<4) hay una alta probabilidad de solapamiento espectral mientras que cuando se utiliza un número elevado de isótopos en el mareaje (n>4) la probabilidad de solapamiento espectral disminuye.  Spectral overlap: when two different isotopic profiles of the same natural and enriched peptide are mixed in the same solution, there will be spectral overlap if the isotopic abundances in some of the masses of the isotopic profile are different from zero for the two profiles. When a compound with a small number of enriched isotopes (n <4) is marked there is a high probability of spectral overlap while when a high number of isotopes is used in the marking (n> 4) the probability of spectral overlap decreases.
Fracción molar del péptido natural: se define como la cantidad de moles correspondientes al péptido de abundancia isotópica natural dividida por la cantidad de moles totales del péptido (natural y enriquecido) en la muestra analizada. La fracción molar se obtiene a partir de un perfil isotópico de una mezcla del péptido natural y enriquecido obtenido experimentalmente mediante Espectrometría de Masas. Fracción molar del péptido enriquecido: se define como la cantidad de moles correspondientes al péptido enriquecido de abundancia isotópica alterada dividida por la cantidad de moles totales del péptido (natural y enriquecido) en la muestra analizada. La fracción molar se obtiene a partir de un perfil isotópico de una mezcla del péptido natural y enriquecido obtenido experimentalmente mediante Espectrometría de Masas. Molar fraction of the natural peptide: defined as the amount of moles corresponding to the natural isotopic abundance peptide divided by the amount of total moles of the peptide (natural and enriched) in the analyzed sample. The molar fraction is obtained from an isotopic profile of a mixture of the natural and enriched peptide obtained experimentally by Mass Spectrometry. Molar fraction of the enriched peptide: defined as the amount of moles corresponding to the enriched peptide of altered isotopic abundance divided by the amount of total moles of the peptide (natural and enriched) in the analyzed sample. The molar fraction is obtained from an isotopic profile of a mixture of the natural and enriched peptide obtained experimentally by Mass Spectrometry.
Regresión lineal múltiple: es un procedimiento matemático que aquí permite calcular la contribución de los perfiles isotópicos del péptido natural y del péptido enriquecido en el espectro de masas experimental de una mezcla de ambos. El resultado de este proceso matemático es la fracción molar de cada uno de los dos perfiles isotópicos en la muestra. La relación de fracciones molares equivale a la relación de moles entre el péptido natural y el péptido enriquecido.  Multiple linear regression: it is a mathematical procedure that allows us to calculate the contribution of the isotopic profiles of the natural peptide and the enriched peptide in the experimental mass spectrum of a mixture of both. The result of this mathematical process is the molar fraction of each of the two isotopic profiles in the sample. The molar fraction ratio is equivalent to the mole ratio between the natural peptide and the enriched peptide.
Espectrómetro de masas en tándem: es un tipo de espectrómetro de masas que combina dos analizadores de masa y una celda de colisión entre ellos. El primer analizador selecciona un ión característico del analito y lo envía a la celda de colisión donde este ión sufre reacciones de fragmentación por colisión con distintos gases. Los fragmentos cargados son analizados por el segundo analizador de masas.  Tandem mass spectrometer: a type of mass spectrometer that combines two mass analyzers and a collision cell between them. The first analyzer selects a characteristic ion of the analyte and sends it to the collision cell where this ion undergoes collision fragmentation reactions with different gases. The loaded fragments are analyzed by the second mass analyzer.
Monitorización de reacciones múltiples (MRM): es un modo de medida en Espectrometría de Masas que se puede aplicar con espectrómetros en tándem del tipo triple cuadrupolo (QqQ). En el primer cuadrupolo (primer analizador de masas) se transmite solamente los iones con la relación masa/carga im/z) del analito (iones precursores). En la celda de colisión se rompen los iones precursores en iones producto mediante disociación inducida por colisión con moléculas neutras de un gas (normalmente nitrógeno). En el tercer cuadrupolo (segundo analizador de masas) se transmite solamente la relación masa/carga im/z) de uno o varios iones producto del analito. Este modo de medida proporciona una mejor relación señal-ruido y una cuantificación más selectiva y libre de interferencias espectrales. Por tanto, es el modo más adecuado para la medida de péptidos por Espectrometría de Masas. Resolución de un analizador de masas. La resolución de un analizador de masas se puede definir de distintas formas. En el texto de la presente invención se define como "anchura de un pico de masa a mitad de su altura" (Full Width at Half Máximum, FWHM). Al aumentar el valor del FWHM de un analizador aumenta el intervalo de masas que es transmitido por el analizador. Un analizador de masas de tipo cuadrupolo trabaja normalmente con valores de FWHM entre 0.5 y 1. Sin embargo, modificando los parámetros eléctricos del cuadrupolo se pueden aumentar los valores de FWHM lo que permite una transmisión de un intervalo de masas amplio en el cuadrupolo. Multiple reaction monitoring (MRM): is a mode of measurement in Mass Spectrometry that can be applied with tandem spectrometers of the triple quadrupole type (QqQ). In the first quadrupole (first mass analyzer) only ions with the mass / charge ratio im / z) of the analyte (precursor ions) are transmitted. In the collision cell, the precursor ions are broken into product ions by collision-induced dissociation with neutral molecules of a gas (usually nitrogen). In the third quadrupole (second mass analyzer) only the mass / charge ratio im / z) of one or several ions product of the analyte is transmitted. This measurement mode provides a better signal-to-noise ratio and a more selective quantification and free of spectral interference. Therefore, it is the most suitable mode for measuring peptides by Mass Spectrometry. Resolution of a mass analyzer. The resolution of a mass analyzer can be defined in different ways. In the text of the present invention it is defined as "width of a mass peak at half its height" (Full Width at Half Maximum, FWHM). Increasing the FWHM value of an analyzer increases the mass range that is transmitted by the analyzer. A quadrupole mass analyzer normally works with FWHM values between 0.5 and 1. However, by modifying the electrical parameters of the quadrupole, the FWHM values can be increased, which allows a transmission of a wide mass range in the quadrupole.
Digestión prot eolítica: es la degradación de proteínas mediante enzimas específicas, llamadas proteasas, que tiene como resultado su rotura en varios péptidos constituyentes. En la mayoría de los casos se suele utilizar como enzima la tripsina (digestión tríptico), que hidroliza los enlaces peptídicos de la proteína específicamente en el lado carboxilo de Arginina (R) y Lisina (K) generando péptidos de un tamaño adecuado para su análisis por Espectrometría de Masas (1000-2000 Da). La digestión tríptica se realiza normalmente a 37°C durante tiempos no inferiores a 24 horas.  Protolytic digestion: is the degradation of proteins by specific enzymes, called proteases, which results in their breakage in several constituent peptides. In most cases trypsin (tryptic digestion) is used as an enzyme, which hydrolyzes the peptide bonds of the protein specifically on the carboxyl side of Arginine (R) and Lysine (K) generating peptides of a suitable size for analysis. by Mass Spectrometry (1000-2000 Da). Triptych digestion is normally performed at 37 ° C for times not less than 24 hours.
Péptido: cadena lineal de aminoácidos con un número inferior a 50 unidades. Péptido característico de una proteína: es un péptido que procede de la digestión de una proteína y que es exclusivo de la misma de modo que la presencia de dicho péptido en una muestra confirma la presencia de la proteína en dicha muestra y puede utilizarse para su cuantificación.  Peptide: linear chain of amino acids with a number less than 50 units. Characteristic peptide of a protein: it is a peptide that comes from the digestion of a protein and is exclusive of it so that the presence of said peptide in a sample confirms the presence of the protein in said sample and can be used for quantification .
Péptido isotópicamente diluido: es un péptido de abundancia isotópica alterada que resulta de la mezcla del péptido de abundancia isotópica natural y del mismo péptido enriquecido isotópicamente.  Isotopically diluted peptide: it is a peptide of altered isotopic abundance that results from the mixture of the natural isotopic abundance peptide and the same isotopically enriched peptide.
El objetivo de la presente invención es la cuantificación absoluta, exacta, precisa y directamente trazable al Sistema Internacional de unidades de péptidos, entendidos como cadenas de aminoácidos con menos de 50 unidades. El método de la presente invención puede utilizarse también para la determinación de una o varias proteínas presentes en muestras biológicas mediante la cuantificación de sus péptidos característicos tras una hidrólisis de la proteína. El método está basado en la determinación de péptidos de abundancia isotópica natural mediante: i) la adición de una cantidad conocida de análogos de estos péptidos, enriquecidos isotópicamente que presenten solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural (en inglés "Mass Overlapping Peptides"), ii) monitorización de reacciones múltiples a valores de FWHM de entre 2 y 20 en el primer cuadrupolo de un espectrómetro de masas en tándem para la mezcla del péptido de abundancia isotópica natural y del enriquecido isotópicamente, y iii) la determinación de las fracciones molares de cada perfil isotópico utilizando regresión lineal múltiple. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un método para la cuantificación absoluta de péptidos en una muestra mediante espectrometría de masas en tándem que comprende los siguientes pasos: a) Selección de un péptido enriquecido isotópicamente, análogo químicamente al péptido a cuantificar, que presente solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural en un espectro de masas. b) Selección de uno o varios iones precursores y de uno o varios iones producto que permita la detección tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente en un espectrómetro de masas en tándem. c) Medida experimental de la composición isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente utilizando un espectrómetro de masas en tándem con una modificación de la resolución en el primer cuadrupolo de modo que el valor del FWHM esté entre 2 y 20 y la distribución isotópica medida en los iones producto seleccionados en b) se corresponda con las distribuciones isotópicas teóricas para los fragmentos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el enriquecido isotópicamente. d) Adición a la muestra de una cantidad conocida del péptido enriquecido isotópicamente seleccionado en a). e) Separación del péptido isotópicamente diluido de otros componentes de la muestra mediante cualquier técnica de separación física, química o bioquímica que separe el péptido isotópicamente diluido de sus interferentes. f) Medida de la distribución isotópica en iones fragmento del péptido isotópicamente diluido aislado en el paso e) utilizando el modo de medida optimizado en el paso c) en un espectrómetro de masas en tándem. g) Cálculo de las fracciones molares tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente mediante regresión lineal múltiple expresando la distribución isotópica obtenida experimentalmente en el paso f) como una combinación lineal de las composiciones isotópicas del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente medidas en el paso c). h) Cálculo del número de moles de péptido de abundancia isotópica natural a partir de la relación de las fracciones molares determinadas en el paso g) y del número de moles conocido del péptido enriquecido isotópicamente añadidos a la muestra en el paso d). The objective of the present invention is the absolute, exact, precise and directly traceable quantification to the International System of peptide units, understood as amino acid chains with less than 50 units. The method of the present invention can also be used for the determination of one or more proteins present in biological samples by quantifying their characteristic peptides after a protein hydrolysis. The method is based on the determination of peptides of natural isotopic abundance by: i) the addition of a known quantity of analogs of these peptides, isotopically enriched that have spectral overlap with the peptide of natural isotopic abundance (in English "Mass Overlapping Peptides" ), ii) monitoring multiple reactions to FWHM values between 2 and 20 in the first quadrupole of a tandem mass spectrometer for the mixture of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide, and iii) the determination of the fractions molars of each isotopic profile using multiple linear regression. Therefore, one aspect of the present invention is a method for the absolute quantification of peptides in a sample by tandem mass spectrometry comprising the following steps: a) Selection of an isotopically enriched peptide, chemically analogous to the peptide to be quantified, that has spectral overlap with the peptide of natural isotopic abundance in a mass spectrum. b) Selection of one or more precursor ions and one or more product ions that allow the detection of both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide in a tandem mass spectrometer. c) Experimental measurement of the isotopic composition of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide using a tandem mass spectrometer with a resolution modification in the first quadrupole so that the FWHM value is between 2 and 20 and the Isotopic distribution measured in the product ions selected in b) corresponds to the theoretical isotopic distributions for the fragments for both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide. d) Addition to the sample of a known amount of the isotopically enriched peptide selected in a). e) Separation of the isotopically diluted peptide from other components of the sample by any physical, chemical or biochemical separation technique that separates the isotopically diluted peptide from its interferents. f) Measurement of the isotopic distribution in fragment ions of the isotopically diluted peptide isolated in step e) using the optimized measurement mode in step c) in a tandem mass spectrometer. g) Calculation of the molar fractions of both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide by multiple linear regression expressing the isotopic distribution obtained experimentally in step f) as a linear combination of the isotopic compositions of the natural isotopic abundance peptide and the Isotopically enriched peptide measured in step c). h) Calculation of the number of moles of natural isotopic abundance peptide from the ratio of the molar fractions determined in step g) and the known number of moles of the isotopically enriched peptide added to the sample in step d).
En una realización preferida, la muestra es un fluido biológico, un cultivo celular o cualquier otra muestra biológica que contenga péptidos o proteínas, como por ejemplo tejidos de órganos, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico o esperma. En una realización más preferida, el método además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, previo o posterior del paso d) ya que el péptido enriquecido isotópicamente se puede degradar durante el proceso de hidrólisis de la muestra. En otra realización más preferida, el método además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, posterior del paso e) ya que el péptido enriquecido isotópicamente se puede degradar durante el proceso de separación física, química o bioquímica. En una realización aún más preferida, la hidrólisis es enzimática y el péptido constituyente a cuantificar es característico de la proteína. En otra realización preferida, el péptido enriquecido isotópicamente contiene entre 1 y 4 átomos de alguno de los isótopos enriquecidos 13C ó 15N en cualquier combinación. In a preferred embodiment, the sample is a biological fluid, a cell culture or any other biological sample containing peptides or proteins, such as organ tissues, saliva, cerebrospinal fluid, amniotic fluid or sperm. In a more preferred embodiment, the method further comprises a hydrolysis step of the sample to break the proteins and release their constituent peptides, before or after step d) since the isotopically enriched peptide can be degraded during the hydrolysis process of the sample. In another more preferred embodiment, the method further comprises a sample hydrolysis step to break the proteins and release their constituent peptides, after step e) since the isotopically enriched peptide can be degraded during the process of physical, chemical or physical separation. biochemistry. In an even more preferred embodiment, the hydrolysis is enzymatic and the constituent peptide to be quantified is characteristic of the protein. In another preferred embodiment, the isotopically enriched peptide contains between 1 and 4 atoms of any of the 13 C or 15 N enriched isotopes in any combination.
En otra realización preferida, el péptido enriquecido isotópicamente se sintetiza químicamente utilizando distintas combinaciones de aminoácidos enriquecidos isotópicamente en 13C ó 15N. In another preferred embodiment, the isotopically enriched peptide is chemically synthesized using different combinations of isotopically enriched amino acids at 13 C or 15 N.
En otra realización preferida, el ión precursor seleccionado en el paso b) posee carga +2 ó +3 y el ión producto seleccionado posee carga +1. In another preferred embodiment, the precursor ion selected in step b) has a +2 or +3 charge and the selected product ion has a +1 charge.
En una realización especifica, el espectrómetro de masas en tándem es de tipo triple cuadrupolo. En una realización más específica, el espectrómetro de masas en tándem de tipo triple cuadrupolo es con trampa lineal en el tercer cuadrupolo. In a specific embodiment, the tandem mass spectrometer is triple quadrupole. In a more specific embodiment, the triple quadrupole tandem mass spectrometer is with a linear trap in the third quadrupole.
En otra realización especifica, el espectrómetro de masas en tándem es un equipo de tipo cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF). In another specific embodiment, the tandem mass spectrometer is a quadrupole-flight time (Q-TOF) type equipment.
En otra realización especifica del método, en el paso c) además se aumenta la resolución en el tercer cuadrupolo reduciendo el FWHM a un valor entre 0.7 y 0.4, hasta que la distribución isotópica medida en los iones producto se corresponde con las distribuciones isotópicas teóricas. Estas distribuciones isotópicas teóricas se pueden calcular mediante métodos matemáticos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el péptido enriquecido isotópicamente. En otra realización especifica, el método físico para la separación en la etapa e) del péptido a cuantificar del resto de la muestra es la centrifugación. In another specific embodiment of the method, in step c) the resolution in the third quadrupole is also increased by reducing the FWHM to a value between 0.7 and 0.4, until the isotopic distribution measured in the product ions corresponds to the theoretical isotopic distributions. These theoretical isotopic distributions can be calculated by mathematical methods for both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide. In another specific embodiment, the physical method for separation in step e) of the peptide to be quantified from the rest of the sample is centrifugation.
En otra realización específica, el método químico para la separación en la etapa e) del péptido a cuantificar del resto de la muestra es la cromatografía de intercambio iónico, reparto o afinidad. En una realización preferida, la separación del péptido a cuantificar del resto de la muestra se realiza por cromatografía líquida acoplada al espectrómetro de masas en tándem. En una realización mas preferida, la medida de las abundancias isotópicas en el espectrómetro de masas en tándem de los pasos c) y f) se realiza a partir de las áreas de pico obtenidas para el péptido de interés tras la separación cromatográfica. In another specific embodiment, the chemical method for the separation in step e) of the peptide to be quantified from the rest of the sample is ion exchange, distribution or affinity chromatography. In a preferred embodiment, the separation of the peptide to be quantified from the rest of the sample is performed by liquid chromatography coupled to the tandem mass spectrometer. In a more preferred embodiment, the measurement of isotopic abundances in the tandem mass spectrometer of steps c) and f) is made from the peak areas obtained for the peptide of interest after chromatographic separation.
En otra realización preferida, el método bioquímico para la separación en la etapa e) del péptido a cuantificar del resto de la muestra es la inmunoprecipitación. In another preferred embodiment, the biochemical method for the separation in step e) of the peptide to be quantified from the rest of the sample is immunoprecipitation.
En otra realización preferida, en el paso f) se mide un mínimo de 2 y un máximo de 6 transiciones para cada combinación ión precursor - ión producto seleccionado. In another preferred embodiment, in step f) a minimum of 2 and a maximum of 6 transitions are measured for each combination precursor ion - selected product ion.
En otra realización preferida, las abundancias isotópicas para el péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente medidas en el paso c) y utilizadas en la regresión lineal múltiple del paso g) se determinan matemáticamente mediante un programa de ordenador. In another preferred embodiment, the isotopic abundances for the natural isotopic and enriched isotopic abundance peptide measured in step c) and used in the multiple linear regression of step g) are determined mathematically by a computer program.
Otro aspecto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para la cuantificación de un péptido en una muestra como herramienta de diagnóstico clínico. Another aspect of the present invention is the use of the method described above for the quantification of a peptide in a sample as a clinical diagnostic tool.
Otro aspecto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras de alimentos y la certificación de su seguridad alimentaria. Another aspect of the present invention is the use of the method described above for the analysis of food samples and the certification of their food safety.
Otro aspecto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras farmacéuticas. Another aspect of the present invention is the use of the method described above for the analysis of pharmaceutical samples.
Otro objeto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras en biomedicina. Another object of the present invention is the use of the method described above for the analysis of samples in biomedicine.
Otro objeto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras en metrología química. Este método permite obtener directamente la relación de moles entre el péptido a determinar y su análogo enriquecido isotópicamente a partir de la determinación de la composición isotópica de la mezcla. La composición isotópica de la mezcla se mide mediante monitorización de reacciones múltiples en las que se emplea una FWHM entre 2 y 20 en el primer cuadrupolo del espectrómetro de masas. Bajo estas condiciones, el primer cuadrupolo trasmite todo el clúster isotópico de la mezcla de los péptidos (de abundancia natural y su análogo enriquecido isotópicamente) con el objetivo de poder recoger en el segundo analizador todos los fragmentos generados tras la fragmentación del ión precursor en una celda de colisión y realizar una medida exacta de la composición isotópica del péptido isotópicamente diluido midiendo iones producto. La composición isotópica del péptido isotópicamente diluido se expresa como una combinación lineal de la composición isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente, de modo que la fracción molar de ambos en la mezcla se calcula mediante regresión lineal múltiple. A partir de la relación de las fracciones molares, se obtiene la concentración del péptido de interés ya que la cantidad de moles del péptido enriquecido añadida al inicio del proceso es conocida. En el caso del uso de la determinación de un péptido para inferir la concentración de una proteína en la muestra se asume que la concentración molar del péptido es igual a la de la proteína de la que proviene. Another object of the present invention is the use of the method described above for the analysis of samples in chemical metrology. This method allows to obtain directly the mole ratio between the peptide to be determined and its isotopically enriched analogue from the determination of the isotopic composition of the mixture. The isotopic composition of the mixture is measured by monitoring multiple reactions in which an FWHM is used between 2 and 20 in the first quadrupole of the mass spectrometer. Under these conditions, the first quadrupole transmits the entire isotopic cluster of the mixture of the peptides (of natural abundance and its isotopically enriched analogue) in order to be able to collect in the second analyzer all the fragments generated after fragmentation of the precursor ion into a Collision cell and perform an accurate measurement of the isotopic composition of the isotopically diluted peptide by measuring product ions. The isotopic composition of the isotopically diluted peptide is expressed as a linear combination of the isotopic composition of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide, so that the molar fraction of both in the mixture is calculated by multiple linear regression. From the ratio of the molar fractions, the concentration of the peptide of interest is obtained since the amount of moles of the enriched peptide added at the beginning of the process is known. In the case of the use of the determination of a peptide to infer the concentration of a protein in the sample it is assumed that the molar concentration of the peptide is equal to that of the protein from which it comes.
En una realización de la presente invención, se hace uso de la cromatografía líquida acoplada a Espectrometría de Masas en tándem como algunos de los métodos descritos en el estado de la técnica pero, a diferencia de estos métodos, utiliza análogos de los péptidos a determinar enriquecidos isotópicamente en 1JC ó N con un número pequeño de isótopos enriquecidos (entre 1 y 4) que permita obtener un solapamiento espectral entre el perfil isotópico del péptido de abundancia natural y del enriquecido isotópicamente. Este hecho, en combinación con la monitorización de reacciones múltiples (MRM) empleando valores de FWHM entre 2 y 20 en la medida del primer analizador de masas permite la obtención precisa y exacta de perfiles de abundancia isotópica en el péptido de abundancia isotópica natural, en el péptido enriquecido isotópicamente y en el péptido isotópicamente diluido. El uso de la regresión lineal múltiple permite, finalmente, a partir de las abundancias isotópicas del péptido isotópicamente diluido, la obtención de la fracción molar del péptido de abundancia isotópica natural y la fracción molar del péptido enriquecido isotópicamente en la muestra. Además, la presente invención puede ser aplicable a la determinación de proteínas cuando se usa la digestión tríptica para obtener los péptidos característicos de la proteína de interés. La utilización de péptidos enriquecidos isotópicamente con solapamiento espectral tiene dos ventajas: i) se rninimizan los efectos isotópicos entre el péptido de abundancia isotópica natural y el péptido enriquecido isotópicamente, y ii) se favorece la transmisión de todo el clúster de iones precursores del péptido isotópicamente diluido a través del primer analizador de masas cuando se aumenta la FWHM hasta valores entre 2 y 20. Este concepto es totalmente nuevo y contrario a los métodos descritos en el estado de la técnica donde se requiere evitar a toda costa el solapamiento espectral entre el compuesto de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente. Para ello se utilizan péptidos enriquecidos isotópicamente con un número alto de isótopos enriquecidos (por ejemplo, 6 átomos de 13C en el método AQUA) que pueden producir efectos isotópicos durante la preparación de la muestra o la separación cromatográfica. Por tanto, la presente invención supone una mejora cuantitativa respecto a los métodos actuales. In one embodiment of the present invention, liquid chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry is used as some of the methods described in the state of the art but, unlike these methods, it uses analogs of the peptides to be enriched. isotopically in 1J C or N with a small number of enriched isotopes (between 1 and 4) that allow to obtain a spectral overlap between the isotopic profile of the natural abundance peptide and the isotopically enriched peptide. This fact, in combination with the monitoring of multiple reactions (MRM) using FWHM values between 2 and 20 in the measurement of the first mass analyzer allows the accurate and accurate profiling of isotopic abundance profiles in the natural isotopic abundance peptide, in the isotopically enriched peptide and in the isotopically diluted peptide. The use of multiple linear regression allows, finally, from the isotopic abundances of the isotopically diluted peptide, obtaining the molar fraction of the natural isotopic abundance peptide and the molar fraction of the isotopically enriched peptide in the sample. In addition, the present invention may be applicable to the determination of proteins when tryptic digestion is used to obtain the characteristic peptides of the protein of interest. The use of isotopically enriched peptides with spectral overlap has two advantages: i) isotopic effects between the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide are enhanced, and ii) the transmission of the entire cluster of isotopically precursor ions of the peptide is favored. diluted through the first mass analyzer when the FWHM is increased to values between 2 and 20. This concept is totally new and contrary to the methods described in the state of the art where it is required to avoid spectral overlap between the compound at all costs of natural isotopic abundance and isotopically enriched. For this, isotopically enriched peptides with a high number of enriched isotopes are used (for example, 6 atoms of 13 C in the AQUA method) that can produce isotopic effects during sample preparation or chromatographic separation. Therefore, the present invention represents a quantitative improvement over current methods.
Por otro lado, la utilización de regresión lineal múltiple permite obtener directamente las fracciones molares del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente a partir del espectro de masas de iones producto. Esto proporciona dos ventajas fundamentales respecto a los métodos descritos en el estado de la técnica: i) la relación de moles se obtiene a partir de la relación de fracciones molares en lugar de la relación de áreas de pico (método AQUA) proporcionando una mejor exactitud y precisión en las determinaciones, y ii) se evita la realización de un calibrado metodológico para evaluar la dependencia entre relación de intensidades y relación de moles, lo cual disminuye considerablemente el tiempo de análisis. On the other hand, the use of multiple linear regression allows the molar fractions of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide to be obtained directly from the mass spectrum of product ions. This provides two fundamental advantages over the methods described in the prior art: i) the mole ratio is obtained from the molar fraction ratio instead of the peak area ratio (AQUA method) providing better accuracy and precision in the determinations, and ii) avoiding a methodological calibration to assess the dependence between intensity ratio and mole ratio, which considerably decreases the analysis time.
La invención resulta de aplicación en aquellos sectores en los que sea necesaria la cuantificación de péptidos en una muestra, como puede ser en fluidos biológicos o en cultivos celulares, como por ejemplo en los sectores de la agricultura, la química, la farmacia, la biomedicina o la seguridad alimentaria. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS The invention is applicable in those sectors where the quantification of peptides in a sample is necessary, such as in biological fluids or cell cultures, such as in the agriculture, chemistry, pharmacy, biomedicine sectors or food security. DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Ilustración del concepto de solapamiento espectral para un péptido de secuencia ALDFAVGEYNK medido por espectrometría de masas en el ión (M+2H)2+. El eje de ordenadas se corresponde a la abundancia (A) y el eje de abscisas se corresponde a la relación masa/carga (m/z). Las barras negras corresponden con el perfil isotópico de abundancia isotópica natural mientras que las barras blancas corresponden con el perfil isotópico del mismo péptido enriquecido en dos átomos de C enriquecidos al 99%. Se observa que existe solapamiento espectral desde la relación m/z 614.0 hasta la relación m/z 616.0. Las barras grises corresponden con el perfil isotópico del mismo péptido enriquecido en 6 átomos de 13C enriquecidos al 99%. Como se puede observar no existe prácticamente solapamiento espectral con el perfil isotópico natural (barras negras). Para evitar efectos isotópicos a lo largo del proceso, el mareaje con dos átomos de 13C es preferible al mareaje con 6 átomos de 13C (método AQUA y QconCAT). Figura 2. Monitorización de reacciones múltiples a resolución convencionalFigure 1. Illustration of the concept of spectral overlap for an ALDFAVGEYNK sequence peptide measured by ion mass spectrometry (M + 2H) 2+ . The ordinate axis corresponds to the abundance (A) and the abscissa axis corresponds to the mass / load ratio (m / z). The black bars correspond to the isotopic profile of natural isotopic abundance while the white bars correspond to the isotopic profile of the same peptide enriched in two 99% enriched C atoms. It is observed that there is spectral overlap from the ratio m / z 614.0 to the ratio m / z 616.0. The gray bars correspond to the isotopic profile of the same peptide enriched in 6 atoms of 13 C enriched to 99%. As can be seen, there is practically no spectral overlap with the natural isotopic profile (black bars). To avoid isotopic effects throughout the process, the marking with two atoms of 13 C is preferable to the marking with 6 atoms of 13 C (AQUA and QconCAT method). Figure 2. Multiple reaction monitoring at conventional resolution
(FWHM=0.7) utilizando un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo para la medida de un péptido de secuencia ALDFAVGEYNK y abundancias isotópicas naturales con un ión precursor doblemente cargado a m/z 613.5 (Fig.2A), y su análogo enriquecido en dos átomos de 13 C con un ión precursor doblemente cargado a m/z 614.5 (Fig.2B). Ql se refiere al primer cuadrupolo donde se selecciona la relación m/z 613.5 para el péptido natural y la relación m/z 614.5 para el péptido enriquecido isotópicamente. Q2 se refiere a la celda de colisión donde el péptido seleccionado en Ql da lugar a fragmentos de distintas relaciones m/z. Q3 se refiere al tercer cuadrupolo donde se analizan los fragmentos obtenidos en la celda de colisión Q2. Se observa que el perfil isotópico medido en el tercer cuadrupolo da lugar a un solo pico a masas 709 y 1042 para el péptido natural y a masas 711 y 1044 para el péptido enriquecido isotópicamente. (FWHM = 0.7) using a triple quadrupole type mass spectrometer for measuring an ALDFAVGEYNK sequence peptide and natural isotopic abundances with a double charged precursor ion at m / z 613.5 (Fig. 2A), and its analog enriched in two atoms 13 C with a double charged precursor ion at m / z 614.5 (Fig. 2B). Ql refers to the first quadrupole where the ratio m / z 613.5 is selected for the natural peptide and the ratio m / z 614.5 for the isotopically enriched peptide. Q2 refers to the collision cell where the peptide selected in Ql results in fragments of different m / z ratios. Q3 refers to the third quadrupole where the fragments obtained in the collision cell Q2 are analyzed. It is observed that the isotopic profile measured in the third quadrupole gives rise to a single peak at masses 709 and 1042 for the natural peptide and at masses 711 and 1044 for the isotopically enriched peptide.
Figura 3. Monitorización de reacciones múltiples en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo a un valor de FWHM de aproximadamente 13 en el primer cuadrupolo, para la medida de un péptido de secuencia ALDFAVGEYNK y abundancia isotópica natural con un ión precursor doblemente cargado a m/z 613.5 (Fig.3A), y su análogo enriquecido en dos átomos de 13C con un ión precursor doblemente cargado a m/z 614.5 (Fig.3B). Ql se refiere al primer cuadrupolo donde se selecciona la relación m/z 613 tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el péptido enriquecido isotópicamente. Q2 se refiere a la celda de colisión donde las distintas relaciones m/z seleccionadas en Ql dan lugar a fragmentos de distintas relaciones m/z. Q3 se refiere al tercer cuadrupolo donde se analizan los fragmentos obtenidos en Q2. Se observa que el perfil isotópico medido en el tercer cuadrupolo da lugar a cuatro picos para cada fragmento (a relaciones m/z 709-714 y 1042-1047, respectivamente) cuyas abundancias isotópicas se corresponden con las calculadas teóricamente. Figure 3. Multiple reaction monitoring in a triple quadrupole mass spectrometer at an FWHM value of approximately 13 in the first quadrupole, for the measurement of an ALDFAVGEYNK sequence peptide and natural isotopic abundance with a double charged am / z precursor ion 613.5 (Fig. 3A), and its analog enriched in two 13 C atoms with a double charged precursor ion at m / z 614.5 (Fig. 3B). Ql refers to the first quadrupole where the m / z 613 ratio is selected for both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide. Q2 refers to the collision cell where the different m / z relationships selected in Ql give rise to fragments of different m / z relationships. Q3 refers to the third quadrupole where the fragments obtained in Q2 are analyzed. It is observed that the isotopic profile measured in the third quadrupole gives rise to four peaks for each fragment (at m / z 709-714 and 1042-1047 ratios, respectively) whose isotopic abundances correspond to those calculated theoretically.
Figura 4. Espectro de masas obtenido con espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo en el modo barrido de iones precursores seleccionando un rango de relaciones m/z de 600 a 630 m/z en el primer cuadrupolo (Ql) y además, en la Fig.4A, seleccionando en el tercer cuadrupolo (Q3) los iones producto con relaciones m/z 709, 710, 711 y 712 para el péptido de abundancia natural y en la Fig.4B, seleccionando en el tercer cuadrupolo (Q3) los iones producto con relaciones m/z 711, 712, 713 y 714 para el péptido enriquecido isotópicamente en dos átomos de C. El eje de ordenadas indica la abundancia relativa (A) de las señales obtenidas y el eje de abscisas indica la relación masa/carga (m/z). Se observa que los valores de FWHM son de aproximadamente 13, tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el péptido enriquecido isotópicamente. Este hecho permite la selección de una única masa en el primer cuadrupolo para la transmisión simultánea de todo el perfil isotópico tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente. La zona marcada con un rectángulo de trazos indica el intervalo de relaciones m/z que se puede seleccionar en Ql para asegurar una transmisión cuantitativa de todas las relaciones m/z seleccionadas. Figure 4. Mass spectrum obtained with triple quadrupole type mass spectrometer in the scanning mode of precursor ions by selecting a range of m / z ratios of 600 to 630 m / z in the first quadrupole (Ql) and also, in Fig .4A, selecting in the third quadrupole (Q3) the product ions with m / z 709, 710, 711 and 712 ratios for the natural abundance peptide and in Fig. 4B, selecting in the third quadrupole (Q3) the product ions with m / z ratios 711, 712, 713 and 714 for the isotopically enriched peptide in two C atoms. The ordinate axis indicates the relative abundance (A) of the signals obtained and the abscissa axis indicates the mass / charge ratio ( m / z). It is observed that the FWHM values are approximately 13, both for the natural isotopic abundance peptide and for the isotopically enriched peptide. This fact allows the selection of a single mass in the first quadrupole for the simultaneous transmission of the entire isotopic profile of both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide. The area marked with a dashed rectangle indicates the range of m / z ratios that can be selected in Ql to ensure a quantitative transmission of all selected m / z ratios.
Figura 5. El gráfico de la Fig.5A muestra el espectro de masas obtenido con un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo en el modo barrido de iones precursores seleccionando un intervalo de relaciones m/z de 600 a 625 m/z en el primer cuadrupolo (Ql) para una mezcla de un péptido de abundancia isotópica natural y su análogo enriquecido isotópicamente en dos átomos de 13C seleccionando las relaciones m/z 709, 710, 711 y 712 como iones producto en el tercer cuadrupolo (Q3). El eje de ordenadas indica la intensidad medida (I) y el eje de abscisas indica la relación m/z. La flecha indica el intervalo donde se calcularía el valor de FWHM=13 para la relación m/z 709. Se observa que se puede seleccionar una relación m/z determinada en Ql (por ejemplo la masa 610, centro de ventana) que permite la detección de las relaciones m/z 709, 710, 711 y 712 en Q3 en la zona constante del espectro de masas. El gráfico de la Fig.5B muestra las determinación de la concentración (C) del péptido enriquecido isotópicamente mediante el método propuesto utilizando distintos centros de ventana en Ql (desde 605 hasta 616 m/z) y dos fragmentos moleculares (709-712 y 1042-1044) en Q3. Se observa que desde masa 608 hasta 615 aproximadamente todos los centros de ventana dan lugar a la misma concentración para los dos fragmentos considerados. Figure 5. The graph in Fig. 5A shows the mass spectrum obtained with a triple quadrupole type mass spectrometer in the scanning mode of precursor ions by selecting a range of m / z ratios of 600 to 625 m / z in the first quadrupole (Ql) for a mixture of a peptide of isotopic abundance natural and its analog isotopically enriched in two atoms of 13 C selecting the ratios m / z 709, 710, 711 and 712 as product ions in the third quadrupole (Q3). The ordinate axis indicates the measured intensity (I) and the abscissa axis indicates the m / z ratio. The arrow indicates the interval where the value of FWHM = 13 for the ratio m / z 709 would be calculated. It is observed that a determined m / z ratio can be selected in Ql (for example the mass 610, window center) that allows the detection of the m / z 709, 710, 711 and 712 ratios in Q3 in the constant area of the mass spectrum. The graph in Fig. 5B shows the determination of the concentration (C) of the isotopically enriched peptide by the proposed method using different window centers in Ql (from 605 to 616 m / z) and two molecular fragments (709-712 and 1042 -1044) in Q3. It is observed that from mass 608 to 615 approximately all window centers give rise to the same concentration for the two fragments considered.
EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE EXPLANATION OF A PREFERRED EMBODIMENT
Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos de realización preferente, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención. For a better understanding of the present invention, the following examples of preferred embodiment are described, described in detail, which should be understood without limitation of the scope of the invention.
EJEMPLO 1 EXAMPLE 1
Se explica paso por paso la forma de poder cuantificar el péptido de secuencia ALDFAVGEYNK que corresponde a un péptido característico de la proteína cistatina C (biomarcador renal) utilizando como trazador isotópico el mismo péptido enriquecido en dos átomos de C en un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo. De la descripción realizada en este ejemplo se puede deducir la forma general de cuantificación de cualquier otro péptido, con las modificaciones adecuadas en caso de ser necesarias. En el caso de la determinación de una proteína el procedimiento es totalmente análogo pero incluiría un paso de digestión proteolítica, tal como el que se muestra en el ejemplo 2. Cabe destacar que los puntos 1 a 6 de la explicación de una forma de realización preferente incluyen una serie de actividades encaminadas a la puesta a punto de la metodología y sirven para establecer una mejor comprensión del proceso seguido y su validación. El ejemplo de aplicación de la invención propiamente dicha se deduce de todos los pasos anteriores y se recoge en el punto 7. The step-by-step method of quantifying the ALDFAVGEYNK sequence peptide corresponding to a characteristic peptide of the cystatin C protein (renal biomarker) is explained using the same peptide enriched in two C atoms as an isotopic tracer in a mass spectrometer of type triple quadrupole. From the description made in this example, the general form of quantification of any other peptide can be deduced, with the appropriate modifications if necessary. In the case of the determination of a protein the procedure is completely analogous but would include a proteolytic digestion step, such as the one shown in example 2. It should be noted that items 1 to 6 of the explanation of a preferred embodiment include a series of activities aimed at the development of the methodology and serve to establish a better understanding of the process followed and its validation. The application example of the invention itself is deduced from all the previous steps and is collected in point 7.
1. Selección del mareaje isotópico del péptido. 1. Selection of isotopic peptide mapping.
1.1. Para la determinación del péptido de secuencia ALDFAVGEYNK y fórmula química C56H83N13O18 se calcularon las abundancias isotópicas teóricas del péptido de abundancia natural y del enriquecido isotópicamente, suponiendo que se puede obtener el péptido enriquecido isotópicamente en un número cualquiera de isótopos enriquecidos. Para este cálculo se hizo uso de un programa de ordenador desarrollado en el grupo de investigación al que pertenecen los inventores. Por ejemplo, la Fig. 1 muestra el perfil isotópico teórico calculado para el péptido de abundancia natural y para el enriquecido en 2 y 6 átomos de C, respectivamente. Con el objeto de que existiera solapamiento espectral entre el péptido natural y el enriquecido isotópicamente se seleccionó el péptido enriquecido en 2 átomos de 13C. El péptido enriquecido en 6 átomos de C, preferido en otros métodos descritos en el estado de la técnica, no fue adecuado en el contexto de la presente invención ya que no presentaba solapamiento espectral con el péptido de abundancia natural. 1.2 Se adquirió comercialmente el péptido seleccionado en el paso anterior tanto de abundancia isotópica natural como enriquecido en dos átomos de 13C donde la glicina (G) se sustituyó por glicina marcada umversalmente en 13C. Se prepararon sendas disoluciones patrón del péptido de abundancia natural y del enriquecido isotópicamente. 2. Optimización de la medida de la composición isotópica del péptido mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM). 1.1. For the determination of the ALDFAVGEYNK sequence peptide and chemical formula C56H83N13O18, the theoretical isotopic abundances of the natural abundance and isotopically enriched peptide were calculated, assuming that the isotopically enriched peptide can be obtained in any number of enriched isotopes. For this calculation, a computer program developed in the research group to which the inventors belong is used. For example, Fig. 1 shows the theoretical isotopic profile calculated for the natural abundance peptide and for the enriched in 2 and 6 C atoms, respectively. In order for there to be spectral overlap between the natural and the isotopically enriched peptide, the peptide enriched in 2 atoms of 13 C was selected. The peptide enriched in 6 C atoms, preferred in other methods described in the prior art, does not It was suitable in the context of the present invention since it did not exhibit spectral overlap with the natural abundance peptide. 1.2 The peptide selected in the previous step was purchased commercially from both natural isotopic abundance and enriched in two 13 C atoms where glycine (G) was replaced by umversally labeled glycine at 13 C. Standard solutions of the natural abundance peptide were prepared and isotopically enriched. 2. Optimization of the measurement of the isotopic composition of the peptide by multiple reaction monitoring (MRM).
2.1 Se midieron en modo "barrido de iones precursores" (precursor ion sean) los patrones del péptido de interés, tanto de abundancia isotópica natural como enriquecido isotópicamente para la selección, en el primer cuadrupolo (Ql), del ión precursor más adecuado. Se seleccionó un ión precursor doblemente cargado cuyo ión principal aparecía a relación m/z de 613.5 para el péptido de abundancia natural y a m/z 614.5 para el péptido enriquecido en dos átomos de 13C. 2.1 The peptide patterns of interest, both of natural isotopic abundance and isotopically enriched for the selection, in the first quadrupole (Q1), of the most suitable precursor ion were measured in "scanning of precursor ions" mode. A double charged precursor ion whose ion was selected principal appeared at a m / z ratio of 613.5 for the natural abundance peptide and yam / z 614.5 for the peptide enriched in two 13 C atoms.
2.2 Se realizó un análisis en modo "barrido de iones producto" {product ion sean) del ión precursor seleccionado en el paso anterior para la selección tanto de la energía de colisión a utilizar en la celda de colisión (Q2) como de los iones producto que se generasen. En el caso del péptido enriquecido isotópicamente los iones producto debían mantener la marca isotópica. Se seleccionaron dos iones producto con una sola carga positiva a relaciones m/z de 709 y 1042 para evaluar el procedimiento. En estos iones producto, el compuesto enriquecido isotópicamente presentaba su pico principal a relaciones m/z 711 y 1044, lo que confirmó la presencia de la marca isotópica en los iones producto. 2.2 A "product ion scan" {product ion sean) analysis of the precursor ion selected in the previous step was performed to select both the collision energy to be used in the collision cell (Q2) and the product ions They were generated. In the case of the isotopically enriched peptide, the product ions had to maintain the isotopic mark. Two product ions with a single positive charge at m / z ratios of 709 and 1042 were selected to evaluate the procedure. In these product ions, the isotopically enriched compound exhibited its main peak at m / z 711 and 1044 ratios, which confirmed the presence of the isotopic label in the product ions.
2.3 Se seleccionaron distintas transiciones para trabajar en el modo MRM. Estas transiciones se correspondían con los iones producto más abundantes del péptido natural y del enriquecido isotópicamente. En primer lugar se trabajó en el modo convencional de trabajo de un triple cuadrupolo a FWHM de 0.7. La Fig. 2A muestra el esquema del modo MRM convencional para el péptido seleccionado de abundancia isotópica natural con un ión precursor doblemente cargado a m/z 613.5 y para el mismo péptido enriquecido en dos átomos de 13C. El primer y tercer cuadrupolo (Ql y Q3, respectivamente) operaban con la resolución típica para este tipo de espectrómetros de masas con un valor de anchura total a la mitad del máximo del pico (FWHM) de 0.7 unidades de masa. En el cuadrupolo Ql se seleccionó una relación m/z (ión precursor natural, 613.5) que fue filtrada para pasar a la celda de colisión (Q2) donde el ión precursor se fragmentaba produciendo diferentes iones producto (709, 1042 y otros) entre los que se seleccionaron los más sensibles para ser analizados en el tercer cuadrupolo (m/z 709 y 1042). La Fig. 2B muestra el mismo proceso para el péptido enriquecido en dos átomos de I3C, donde los iones producto aparecían a m/z 711 y 1044 respectivamente. Este modo de trabajo convencional en los equipos de triple cuadrupolo es el que se aplica en los métodos de determinación de péptidos y proteínas descritos en el estado de la técnica (por ejemplo en el método AQUA). Estos métodos precisan que no exista solapamiento espectral entre el péptido de abundancia natural y el enriquecido isotópicamente para obtener resultados satisfactorios en la medida de las intensidades pero tienen el problema de los efectos isotópicos, tal como se ha indicado anteriormente. 2.3 Different transitions were selected to work in the MRM mode. These transitions corresponded with the most abundant product ions of the natural peptide and of the isotopically enriched. First, we worked in the conventional way of working a triple quadrupole at FWHM of 0.7. Fig. 2A shows the scheme of the conventional MRM mode for the selected peptide of natural isotopic abundance with a double charged precursor ion at m / z 613.5 and for the same peptide enriched in two 13 C atoms. The first and third quadrupole (Ql and Q3, respectively) operated with the typical resolution for this type of mass spectrometers with a total width value at half the peak maximum (FWHM) of 0.7 mass units. In the quadrupole Ql, an m / z ratio (natural precursor ion, 613.5) was selected, which was filtered to pass into the collision cell (Q2) where the precursor ion was fragmented producing different product ions (709, 1042 and others) between that the most sensitive were selected to be analyzed in the third quadrupole (m / z 709 and 1042). Fig. 2B shows the same process for the peptide enriched in two atoms of I3 C, where the product ions appeared at m / z 711 and 1044 respectively. This conventional mode of work in triple quadrupole equipment is that applied in the methods of determination of peptides and proteins described in the prior art (for example in the AQUA method). These methods require that there is no spectral overlap between the natural abundance peptide and the isotopically enriched peptide to obtain results. satisfactory to the extent of the intensities but have the problem of isotopic effects, as indicated above.
3. Disminución de la resolución del primer cuadrupolo. 3. Decrease of the resolution of the first quadrupole.
La presente invención evita los efectos isotópicos utilizando péptidos enriquecidos isotópicamente que presenten solapamiento espectral con el péptido natural. Para utilizar esta ventaja de modo adecuado, se requería la disminución de la resolución espectral del primer cuadrupolo aumentando la FWHM a valores entre 2 y 20 unidades de masa de forma que, al seleccionar una determinada relación m/z en el primer cuadrupolo, éste fuera capaz de transmitir completamente todo el perfil isotópico del ión precursor seleccionado a la celda de colisión. Se seleccionó un ión precursor con dos cargas positivas para que el intervalo de relaciones m/z de todo el perfil isotópico fuera menor (a más carga, menor intervalo de m/z) y se facilitase su transmisión cuantitativa. El intervalo de valores de FWHM con el que decidió trabajar fue de 2-20 unidades de m/z. En la Fig. 3 se muestra un esquema del análisis de los mismos péptidos de la Fig. 2 cuando se disminuyó la resolución del primer cuadrupolo hasta un valor de FWHM=13 y donde se seleccionó un valor de m/z nominal (ión precursor) de 613 tanto para el péptido natural (Fig. 3 A) como para el péptido enriquecido isotópicamente (Fig. 3B). Esta selección del valor de m/z nominal del ión precursor permitió que, junto con la resolución modificada del primer cuadrupolo, se transmitiera el clúster molecular completo del péptido (desde m/z 613.5 hasta m/z 615.0 para el péptido de abundancia isotópica natural o desde 614.5 a 616.0 para su análogo enriquecido isotópicamente) hacia la celda de colisión donde se fragmentaba. Los iones fragmento generados se transmitieron a través del tercer cuadrupolo para obtener su distribución isotópica. En este caso, los fragmentos más sensibles seleccionados correspondían a valores de m/z 709 -712 y m/z 1042-1045 para el péptido de abundancia natural y m/z 711 -714 con m/z 1044-1047 para el péptido enriquecido isotópicamente. The present invention avoids isotopic effects using isotopically enriched peptides that exhibit spectral overlap with the natural peptide. To use this advantage adequately, the decrease in the spectral resolution of the first quadrupole was required by increasing the FWHM to values between 2 and 20 mass units so that, when selecting a certain m / z ratio in the first quadrupole, it would be capable of completely transmitting the entire isotopic profile of the selected precursor ion to the collision cell. A precursor ion with two positive charges was selected so that the range of m / z ratios of the entire isotopic profile was smaller (at higher charge, lower m / z range) and its quantitative transmission was facilitated. The range of FWHM values with which he decided to work was 2-20 units of m / z. A diagram of the analysis of the same peptides of Fig. 2 is shown in Fig. 3 when the resolution of the first quadrupole was decreased to a value of FWHM = 13 and where a nominal m / z value was selected (precursor ion) 613 for both the natural peptide (Fig. 3 A) and the isotopically enriched peptide (Fig. 3B). This selection of the nominal m / z value of the precursor ion allowed, along with the modified resolution of the first quadrupole, the entire molecular cluster of the peptide (from m / z 613.5 to m / z 615.0 for the natural isotopic abundance peptide) to be transmitted or from 614.5 to 616.0 for its isotopically enriched analogue) towards the collision cell where it was fragmented. The generated fragment ions were transmitted through the third quadrupole to obtain their isotopic distribution. In this case, the most sensitive fragments selected corresponded to values of m / z 709-712 and m / z 1042-1045 for the natural abundance peptide and m / z 711-714 with m / z 1044-1047 for the isotopically enriched peptide.
Dependiendo del rango de masas en el que se trabaje, se podría requerir un aumento de la resolución del tercer cuadrupolo para disminuir la contribución de masas adyacentes y aumentar la exactitud y precisión de la medida de la distribución isotópica del péptido. Por ejemplo, en el caso del péptido de la Fig. 3B, un aumento de la resolución en el tercer cuadrupolo desde el valor convencional de FWHM= 0.7 hasta un valor de 0.6 proporcionaba una mejor exactitud en la medida de la distribución isotópica de los iones fragmento del péptido a m/z 1042-1047. Depending on the mass range in which one works, an increase in the resolution of the third quadrupole may be required to decrease the contribution of adjacent masses and increase the accuracy and precision of the measurement of the isotopic distribution of the peptide. For example, in the case of the peptide of Fig. 3B, an increase in the resolution in the third quadrupole from the conventional value of FWHM = 0.7 to a value of 0.6 provided a better accuracy in the measurement of the isotopic distribution of the fragment ions of the am / z 1042-1047 peptide.
4. Cálculo de las distribuciones isotópicas teóricas de los fragmentos moleculares del péptido natural y enriquecido isotópicamente. 4. Calculation of the theoretical isotopic distributions of the molecular fragments of the natural and isotopically enriched peptide.
El cálculo de la distribución isotópica de los fragmentos moleculares de los péptidos de abundancia isotópica natural y enriquecido isotópicamente se realizó utilizando el mismo programa de ordenador que el señalado en el apartado 1.1 pero no para el péptido completo sino para sus fragmentos. Estas distribuciones isotópicas así calculadas se utilizaron posteriormente en los cálculos de regresión lineal múltiple. Las abundancias isotópicas calculadas matemáticamente para los fragmentos analizados se recogen en la Tabla 1. The calculation of the isotopic distribution of the molecular fragments of the peptides of natural and isotopically enriched isotopic abundance was carried out using the same computer program as indicated in section 1.1 but not for the complete peptide but for its fragments. These isotopic distributions thus calculated were subsequently used in the multiple linear regression calculations. Isotopic abundances calculated mathematically for the analyzed fragments are shown in Table 1.
Tabla 1. Abundancias isotópicas teóricas de los iones producto (1042-1045 y 709- 712) de un péptido de secuencia ALDFAVGEYNK de abundancias isotópicas naturales y de su análogo enriquecido en dos átomos de 13 C. Table 1. Theoretical isotopic abundances of the product ions (1042-1045 and 709-712) of an ALDFAVGEYNK sequence peptide of natural isotopic abundances and their analog enriched in two 13 C atoms.
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5. Comparación de las distribuciones isotópicas teóricas de los fragmentos moleculares del péptido de abundancia isotópica natural y del enriquecido isotópicamente con sus distribuciones isotópicas medidas experimentalmente. Las distribuciones isotópicas del péptido de abundancia natural y de su análogo enriquecido se midieron experimentalmente según las condiciones seleccionadas en el punto 3. Las distribuciones isotópicas experimentales obtenidas se compararon con las teóricas que aparecen en la Tabla 1. Se observó que los valores de FWHM=13 en el primer cuadrupolo y FWHM=0.6 en el tercer cuadrupolo proporcionaban resultados satisfactorios. 5. Comparison of the theoretical isotopic distributions of the molecular fragments of the natural isotopic and isotopically enriched peptide with its experimentally measured isotopic distributions. The isotopic distributions of the natural abundance peptide and its enriched analog were measured experimentally according to the conditions selected in point 3. The experimental isotopic distributions obtained were compared with the theoretical ones shown in Table 1. It was observed that the FWHM values = 13 in the first quadrupole and FWHM = 0.6 in the third quadrupole provided satisfactory results.
6. Selección de la masa nominal en el primer cuadurpolo (Ql) para el péptido de abundancia isotópica natural, el enriquecido isotópicamente y sus mezclas. 6. Selection of the nominal mass in the first quadrupole (Ql) for the peptide of natural isotopic abundance, isotopically enriched and mixtures thereof.
6.1 Se realizó la medida de una disolución patrón del péptido de interés en modo "barrido de iones precursores" {precursor ion sean). Este modo de adquisición permitió la selección de la masa nominal en el primer cuadrupolo (Ql). Tomando como ejemplo el péptido natural de la Fig. 3, se escogió un rango de masas de 600 a 630 en Ql ya que la relación m/z del ión precursor del péptido natural era 613.5 mientras que en el tercer cuadrupolo (Q3) se seleccionaron los iones fragmento de m/z 709, 710, 711 y 712. En la Fig. 4 A se puede observar el resultado de la adquisición del péptido natural en el modo barrido de iones precursores con las resoluciones de Ql y Q3 previamente optimizadas. Se puede ver cómo desde un centro con un m/z de 604 a m/z 617 se transmitía todo el rango de masas 709-712 correspondiente a la distribución isotópica del fragmento molecular de interés. De manera análoga, cuando se analizó el péptido enriquecido en dos átomos de 13C se puede observar en la Fig. 4B que estableciendo un centro de ventana en el intervalo desde 608 a 616, se transmitía completamente el rango de masas desde 711 a 714 correspondiente a la distribución isotópica del fragmento molecular de interés. 6.1 The measurement of a standard solution of the peptide of interest was performed in "precursor ion scavenging mode" {ion precursor sean). This acquisition mode allowed the selection of the nominal mass in the first quadrupole (Ql). Taking as an example the natural peptide of Fig. 3, a mass range of 600 to 630 in Ql was chosen since the m / z ratio of the precursor ion of the natural peptide was 613.5 while in the third quadrupole (Q3) they were selected the fragment ions of m / z 709, 710, 711 and 712. In Fig. 4 A the result of the acquisition of the natural peptide can be observed in the scanning mode of precursor ions with the resolutions of Ql and Q3 previously optimized. You can see how from a center with an m / z of 604 am / z 617 the entire mass range 709-712 corresponding to the isotopic distribution of the molecular fragment of interest was transmitted. Similarly, when the peptide enriched in two 13 C atoms was analyzed, it can be seen in Fig. 4B that by establishing a window center in the range from 608 to 616, the mass range from corresponding 711 to 714 was completely transmitted to the isotopic distribution of the molecular fragment of interest.
El centro óptimo de Ql debía situarse en un valor de m/z que permitiese transmitir completamente y de forma simultánea las distribuciones isotópicas de los fragmentos moleculares del péptido de abundancia isotópica natural y de su análogo enriquecido isotópicamente. Según los espectros de masa de la Fig. 4, el centro de ventana del Ql debería situarse aproximadamente entre 608 y 614 (en la Fig.4 se muestra esta zona, marcada con un rectángulo de trazos). 6.2. Finalmente, y para confirmar la correcta selección del centro de masa en Ql, se mezcló una cantidad conocida de péptido de abundancia isotópica natural con una cantidad conocida de la disolución de péptido enriquecido en 13C. En la Fig. 5A se muestra el espectro de masas obtenido en el modo barrido de iones precursores de la mezcla de péptidos. Las m/z a 709 y 710 proceden mayoritariamente del péptido de abundancia isotópica natural, mientras que las m/z a 711 y 712 proceden mayoritariamente del péptido enriquecido isotópicamente. Como se puede observar, existe un amplio intervalo de relaciones m/z en Ql (entre 608 y 614 aproximadamente) que permitían la transmisión completa de todas las masas seleccionadas. Finalmente, se determinó la relación de fracciones molares entre el péptido de abundancia isotópica natural y el péptido enriquecido en 13C mediante regresión lineal múltiple seleccionando distintos centros de ventana en Ql. En la Fig. 5B se muestran los valores obtenidos en la concentración del péptido enriquecido isotópicamente con los diferentes centros de masa seleccionados. En este experimento se utilizaron los dos fragmentos moleculares (709-712 y 1042-1045) para confirmar los resultados. Se puede observar cómo, desde un centro de m/z en Ql de 608 a 614 unidades de masa, el valor de la concentración obtenida era constante e idéntico para los dos fragmentos seleccionados. Se confirmó que, en ese intervalo, el centro de masas seleccionado en Ql permitía la transmisión cuantitativa tanto del ión precursor del péptido de abundancia isotópica natural como de su análogo enriquecido isotópicamente de forma simultánea, para obtener los correspondientes fragmentos en Q3. Se validó de esta manera el procedimiento y se procedió a su aplicación a muestras reales fortificadas. The optimal center of Ql should be at a value of m / z that would allow the isotopic distributions of the molecular fragments of the natural isotopic abundance peptide and its isotopically enriched analog to be transmitted completely and simultaneously. According to the mass spectra of Fig. 4, the Ql window center should be approximately 608 to 614 (this area is shown in Fig. 4, marked with a dashed rectangle). 6.2. Finally, and to confirm the correct selection of the center of mass in Ql, a known amount of peptide of natural isotopic abundance was mixed with a known amount of the peptide solution enriched at 13 C. In Fig. 5A the spectrum of masses obtained in the scanning mode of precursor ions of the peptide mixture. M / z 709 and 710 come mostly from the natural isotopic abundance peptide, while m / z 711 and 712 mostly come from the isotopically enriched peptide. As can be seen, there is a wide range of m / z ratios in Ql (between approximately 608 and 614) that allowed the complete transmission of all the selected masses. Finally, the ratio of molar fractions between the natural isotopic abundance peptide and the 13 C-enriched peptide was determined by multiple linear regression by selecting different window centers in Ql. The values obtained in the concentration of the isotopically enriched peptide with the different selected centers of mass are shown in Fig. 5B. In this experiment the two molecular fragments (709-712 and 1042-1045) were used to confirm the results. It can be seen how, from a center of m / z in Ql of 608 to 614 mass units, the concentration value obtained was constant and identical for the two selected fragments. It was confirmed that, at that interval, the mass center selected in Ql allowed quantitative transmission of both the precursor ion of the natural isotopic abundance peptide and its isotopically enriched analogue simultaneously, to obtain the corresponding fragments in Q3. The procedure was validated in this way and it was applied to fortified real samples.
7. Cuantificación del péptido de interés en una muestra real. Se describe a continuación el método para la cuantificación absoluta del péptido en una muestra mediante espectrometría de masas en tándem tanto en agua (ausencia de matriz) como en un suero humano (presencia de matriz). 7. Quantification of the peptide of interest in a real sample. The method for absolute quantification of the peptide in a sample by tandem mass spectrometry in both water (absence of matrix) and human serum (presence of matrix) is described below.
7.1 Se seleccionó un péptido enriquecido isotópicamente análogo al péptido a cuantificar y que presentaba solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural en un espectro de masas. En el caso de este ejemplo, se escogió el péptido ALDFAVGEYNK enriquecido en dos átomos de 13C. 7.2 Posteriormente se seleccionaron uno o varios iones precursores y uno o varios iones producto que permitían la detección del péptido de abundancia isotópica natural y de su análogo enriquecido isotópicamente. En el caso de este ejemplo, para la determinación del péptido ALDFAVGEYNK se seleccionó como ion precursor para todas las transiciones el ion a m/z 614, y como iones producto los iones 709, 710, 711, 712, 1042, 1043, 1044 y 1045. 7.1 An isotopically enriched peptide analogous to the peptide to be quantified and exhibiting spectral overlap with the natural isotopic abundance peptide in a mass spectrum was selected. In the case of this example, the ALDFAVGEYNK peptide enriched in two 13 C atoms was chosen. 7.2 Subsequently, one or more precursor ions and one or several product ions were selected that allowed the detection of the natural isotopic abundance peptide and its isotopically enriched analog. In the case of this example, for the determination of the ALDFAVGEYNK peptide the am / z 614 ion was selected as a precursor ion for all transitions, and as ions 709, 710, 711, 712, 1042, 1043, 1044 and 1045 .
7.3 Se determinó experimentalmente la composición isotópica del péptido de abundancia natural y del péptido enriquecido isotópicamente mediante espectrometría de masas en un espectrómetro de masas en tándem de tipo triple cuadrupolo con un aumento de la FWHM de entre 2 y 20 en el primer analizador, de modo que la distribución isotópica medida en los iones producto seleccionados en 7.2 se correspondía con las distribuciones isotópicas teóricas para los fragmentos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el enriquecido isotópicamente. 7.3 The isotopic composition of the natural abundance peptide and the isotopically enriched peptide was determined experimentally by mass spectrometry in a triple quadrupole tandem mass spectrometer with an increase in FWHM of between 2 and 20 in the first analyzer, so that the isotopic distribution measured in the product ions selected in 7.2 corresponded to the theoretical isotopic distributions for the fragments for both the natural isotopic abundance peptide and for the isotopically enriched peptide.
7.4 Posteriormente se realizó la adición de una cantidad conocida del péptido enriquecido isotópicamente seleccionado en 7.1 a la muestra. Para llevar a cabo el procedimiento se pesaron aproximadamente 0.5 g de agua o de un suero libre del péptido y a continuación se añadieron aproximadamente 0.10 g de una disolución de péptido de abundancia isotópica natural de 1.91 μg g'1 y 0.10 g de una disolución de péptido enriquecido isotópicamente de 1.97 μg g"1. En la Tabla 2 se muestran las cantidades exactas tomadas de muestra y las cantidades añadidas de péptido de abundancia isotópica natural y enriquecido isotópicamente, respectivamente. 7.4 Subsequently, a known amount of the isotopically enriched peptide selected in 7.1 was added to the sample. To carry out the procedure, approximately 0.5 g of water or a peptide free serum were weighed and then approximately 0.10 g of a natural isotopic abundance peptide solution of 1.91 μg g '1 and 0.10 g of a peptide solution were added Isotopically enriched of 1.97 μg g "1. Table 2 shows the exact amounts taken from the sample and the added amounts of natural isotopic and isotopically enriched peptide, respectively.
Tabla 2. Cantidades de muestra, péptido de abundancia isotópica natural y análogo enriquecido isotópicamente utilizadas para el desarrollo del procedimiento. Table 2. Sample quantities, natural isotopic abundance peptide and isotopically enriched analog used for the development of the procedure.
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7.5. Posteriormente, se separó el péptido isotópicamente diluido (mezcla de péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente) de otros componentes de la muestra mediante una técnica de separación física, química o bioquímica apropiada. Dependiendo del péptido elegido, su concentración y la complejidad de la muestra, podría ser necesario realizar uno o varios pasos de separación incluyendo separaciones cromatográficas para eliminar interferencias. En este ejemplo, se utilizó una separación por cromatografía líquida. Las muestras disueltas en 0.1 % de ácido trifluoroacético (TFA) se sometieron a dos purificaciones mediante HPLC preparativa (fase reversa e intercambio catiónico). En ambas cromatografías se seleccionaron las fracciones de interés. Tras el intercambio catiónico se eliminaron las sales con columnas de extracción en fase sólida con un recubrimiento C18. Finalmente, las muestras se disolvieron en 0.05 mL de agua con 0.1% de ácido fórmico y se inyectaron en el cromatógrafo de líquidos acoplado al espectrómetro de masas para medir su distribución isotópica. 7.5. Subsequently, the isotopically diluted peptide (mixture of natural isotopic abundance and isotopically enriched peptide) was separated from other components of the sample by a physical, chemical or chemical separation technique. appropriate biochemistry. Depending on the chosen peptide, its concentration and the complexity of the sample, it may be necessary to perform one or more separation steps including chromatographic separations to eliminate interference. In this example, a separation by liquid chromatography was used. Samples dissolved in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) were subjected to two purifications by preparative HPLC (reverse phase and cation exchange). In both chromatographs the fractions of interest were selected. After the cation exchange, the salts were removed with solid phase extraction columns with a C 18 coating. Finally, the samples were dissolved in 0.05 mL of water with 0.1% formic acid and injected into the liquid chromatograph coupled to the mass spectrometer to measure its isotopic distribution.
7.6. Se midió la distribución isotópica del péptido isotópicamente diluido (mezcla de péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente) mediante espectrometría de masas en tándem. El pico cromatográfico correspondiente al péptido de interés se midió en las condiciones seleccionadas de resolución y para las transiciones escogidas en 7.3. No se observaron cambios en los tiempos de retención para el mareaje isotópico seleccionado, lo que indicó que no existían efectos isotópicos. En este caso, la FWHM del primer cuadrupolo se ajustó a 13, la del tercer cuadrupolo a 0.6 y se seleccionaron 4 transiciones para el fragmento de masa 709 (709, 710, 711 y 712) y otras cuatro transiciones para el fragmento 1042 (1042, 1043, 1044 y 1045). La distribución isotópica se calculó dividiendo el área de pico determinada para cada transición por la suma de áreas de pico obtenidas para las cuatro transiciones de cada fragmento correspondiente. 7.6. The isotopic distribution of the isotopically diluted peptide (mixture of natural isotopic abundance and isotopically enriched peptide) was measured by tandem mass spectrometry. The chromatographic peak corresponding to the peptide of interest was measured under the selected resolution conditions and for the transitions chosen in 7.3. No changes in retention times were observed for the selected isotopic marking, which indicated that there were no isotopic effects. In this case, the FWHM of the first quadrupole was set to 13, that of the third quadrupole was 0.6 and 4 transitions were selected for mass fragment 709 (709, 710, 711 and 712) and four other transitions for fragment 1042 (1042 , 1043, 1044 and 1045). The isotopic distribution was calculated by dividing the peak area determined for each transition by the sum of peak areas obtained for the four transitions of each corresponding fragment.
7.7. Se calcularon las fracciones molares del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente mediante regresión lineal múltiple expresando la distribución isotópica del péptido isotópicamente diluido (AmiX) obtenida experimentalmente en el paso 7.6 como una combinación lineal de las composiciones isotópicas del péptido de abundancia isotópica natural (Anat) y del péptido enriquecido isotópicamente (Aenr) respectivamente obtenidas en el paso 7.3. Para este propósito se aplicó la ecuación (1) para la medida de n m/z, donde A se refiere a la abundancia relativa de cada uno de los isotopólogos constituyentes de la molécula. 7.7. The molar fractions of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide were calculated by multiple linear regression expressing the isotopic distribution of the isotopically diluted peptide (A m and X ) obtained experimentally in step 7.6 as a linear combination of the isotopic compositions of the peptide of natural isotopic abundance (A nat ) and of the isotopically enriched peptide (A enr ) respectively obtained in step 7.3. For this purpose, equation (1) was applied for the measurement of nm / z, where A is refers to the relative abundance of each of the constituent isotopologists of the molecule.
O)
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OR)
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Las soluciones a la ecuación (1) fueron las fracciones molares del péptido de abundancia isotópica natural (x„at) y el péptido enriquecido isotópicamente {xenr). The solutions to equation (1) were the molar fractions of the natural isotopic abundance peptide (x „ at ) and the isotopically enriched peptide {x enr ).
7.8. Se calcularon el número de moles de péptido de abundancia isotópica natural (Nmt) a partir de la relación de las fracciones molares determinadas en el paso 7.7 y del número de moles conocido del péptido enriquecido isotópicamente (Nenr) añadidos a la muestra en el paso 7.4. A partir de la relación de estas fracciones molares se obtuvo directamente el número de moles de péptido natural según la ecuación (2).
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7.8. The number of moles of natural isotopic abundance peptide (N mt ) was calculated from the ratio of the molar fractions determined in step 7.7 and the known number of moles of the isotopically enriched peptide (N enr ) added to the sample in the step 7.4. From the ratio of these molar fractions, the number of moles of natural peptide was obtained directly according to equation (2).
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Utilizando este procedimiento no se necesitó recurrir a un calibrado metodológico para el cálculo de la relación de moles entre el péptido de abundancia isotópica natural y su análogo enriquecido isotópicamente, ya que la relación de fracciones molares era igual a la relación de moles. Los resultados finales obtenidos se muestran en la Tabla 3, donde se pueden observar las fracciones molares obtenidas así como el número de moles de péptido determinado y las recuperaciones obtenidas respecto a la cantidad añadida inicialmente. Los datos de la Tabla 3 muestran que se recuperaba aproximadamente el 100% de la cantidad de péptido de abundancia isotópica natural añadida utilizando tanto los iones fragmento del clúster a 709 como los correspondientes al clúster a masa 1042. Tabla 3. Resultados obtenidos en el cálculo del número de moles de un péptido de secuencia ALDFAVGEYNK añadido en una muestra de agua y suero humano. Using this procedure it was not necessary to resort to a methodological calibration for the calculation of the mole ratio between the natural isotopic abundance peptide and its isotopically enriched analog, since the ratio of molar fractions was equal to the mole ratio. The final results obtained are shown in Table 3, where the molar fractions obtained as well as the number of moles of peptide determined and the recoveries obtained with respect to the amount initially added can be observed. The data in Table 3 show that approximately 100% of the amount of natural isotopic abundance peptide added was recovered using both the fragment ions of the cluster at 709 and those corresponding to the mass cluster 1042. Table 3. Results obtained in the calculation of the number of moles of an ALDFAVGEYNK sequence peptide added in a sample of water and human serum.
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EJEMPLO 2 En este ejemplo se describe el método para la cuantificación absoluta de un péptido característico de una proteína que está presente en una muestra. La proteína seleccionada en este ejemplo es la cistatina C y el péptido proteotípico a cuantificar es el de secuencia ALDFAVGEYNK que corresponde a un péptido característico de la proteína cistatina C (biomarcador renal). Se utilizó como trazador isotópico el mismo péptido enriquecido en dos átomos de 13C en un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo. Para esta realización se empleó el mismo método que el descrito en el ejemplo 1 , aunque con un paso de hidrólisis para la romper las proteínas y liberar sus péptidos antes o después de la adición del péptido enriquecido isotópicamente a la muestra. Para ello se realizó una digestión proteolítica con tripsina para simular la fragmentación de proteínas en sus péptidos constituyentes. El proceso de digestión empleado aquí tenía como objetivo la comprobación de la exactitud del procedimiento en condiciones donde debía realizarse una digestión enzimática de proteínas y así asegurar una ausencia de degradación tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente (si se añade antes de la digestión). El procedimiento seguido fue el siguiente: se llevó a cabo la digestión tríptica durante 24 horas. A continuación, se añadió ditioeritritol (agente reductor) y se incubó a 37 °C durante 1 hora. Tras este tiempo, se centrifugó y los sobrenadantes se evaporaron a sequedad. Posteriormente, se reconstituyó en agua (0.7 mL) y se volvió a centrifugar. Se añadió iodoacetamida (agente alquilante) a los sobrenadantes y se agitó en oscuridad durante lh. Se eliminó el exceso de iodoacetamida añadiendo ditioeritritol y finalmente se añadió 0.1 mL TFA al 15 %. EXAMPLE 2 This example describes the method for the absolute quantification of a characteristic peptide of a protein that is present in a sample. The protein selected in this example is cystatin C and the proteotypic peptide to be quantified is that of the ALDFAVGEYNK sequence that corresponds to a characteristic peptide of the cystatin C protein (renal biomarker). The same peptide enriched in two 13 C atoms was used as an isotopic tracer in a triple quadrupole type mass spectrometer. For this embodiment, the same method as described in Example 1 was used, although with a hydrolysis step to break the proteins and release their peptides before or after the addition of the isotopically enriched peptide to the sample. To do this, a proteolytic digestion with trypsin was performed to simulate protein fragmentation in its constituent peptides. The purpose of the digestion process used here was to verify the accuracy of the procedure under conditions where enzymatic protein digestion should be performed and thus ensure an absence of degradation of both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide (if added before of the digestion). The procedure followed was as follows: tryptic digestion was carried out for 24 hours. Next, dithioerythritol (reducing agent) was added and incubated at 37 ° C for 1 hour. After this time, it was centrifuged and the supernatants evaporated to dryness. Subsequently, it was reconstituted in water (0.7 mL) and centrifuged again. Iododotamide (alkylating agent) was added to the supernatants and stirred in the dark for 1 h. Excess iodoacetamide was removed by adding dithioerythritol and finally 0.1 mL 15% TFA was added.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para la cuantificación absoluta de péptidos en una muestra mediante espectrometría de masas en tándem que comprende los siguientes pasos: a) selección de un péptido enriquecido isotópicamente, análogo químicamente al péptido a cuantificar, que presente solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural en un espectro de masas; b) selección de uno o varios iones precursores y de uno o varios iones producto que permita la detección tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente en un espectrómetro de masas en tándem; c) medida experimental de la composición isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente utilizando un espectrómetro de masas en tándem, ajustando la resolución en el primer analizador de masas de modo que el valor del FWHM esté entre 2 y 20 y que la distribución isotópica medida en los iones producto seleccionados en b) se corresponda con las distribuciones isotópicas teóricas para los fragmentos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el enriquecido isotópicamente; d) adición a la muestra de una cantidad conocida del péptido enriquecido isotópicamente seleccionado en a); e) separación del péptido isotópicamente diluido de otros componentes de la muestra mediante cualquier técnica de separación física, química o bioquímica que separe el péptido isotópicamente diluido de sus interferentes; f) medida de la distribución isotópica en iones fragmento del péptido isotópicamente diluido aislado en el paso e) utilizando el modo de medida optimizado en el paso c) en un espectrómetro de masas en tándem; g) cálculo de las fracciones molares tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente mediante regresión lineal múltiple expresando la distribución isotópica obtenida experimentalmente en el paso f) como una combinación lineal de las composiciones isotópicas del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente medidas en el paso c); h) cálculo del número de moles del péptido de abundancia isotópica natural a partir de la relación de las fracciones molares determinadas en el paso g) y del número de moles conocido del péptido enriquecido isotópicamente añadidos a la muestra en el paso d). 1. Method for the absolute quantification of peptides in a sample by tandem mass spectrometry comprising the following steps: a) selection of an isotopically enriched peptide, chemically analogous to the peptide to be quantified, which exhibits spectral overlap with the isotopic abundance peptide natural in a mass spectrum; b) selection of one or more precursor ions and one or more product ions that allow the detection of both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide in a tandem mass spectrometer; c) experimental measurement of the isotopic composition of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide using a tandem mass spectrometer, adjusting the resolution in the first mass analyzer so that the FWHM value is between 2 and 20 and that the isotopic distribution measured in the product ions selected in b) corresponds to the theoretical isotopic distributions for the fragments for both the natural isotopic abundance peptide and for the isotopically enriched peptide; d) adding to the sample a known amount of the isotopically enriched peptide selected in a); e) separation of the isotopically diluted peptide from other components of the sample by any physical, chemical or biochemical separation technique that separates the isotopically diluted peptide from its interferents; f) measurement of the isotopic distribution in fragment ions of the isotopically diluted peptide isolated in step e) using the optimized measurement mode in step c) in a tandem mass spectrometer; g) calculation of the molar fractions of both the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide by linear regression multiple expressing the isotopic distribution obtained experimentally in step f) as a linear combination of the isotopic compositions of the natural isotopic abundance peptide and the isotopically enriched peptide measured in step c); h) calculation of the number of moles of the natural isotopic abundance peptide from the ratio of the molar fractions determined in step g) and the number of known moles of the isotopically enriched peptide added to the sample in step d).
2. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la muestra es un fluido biológico, un cultivo celular o cualquier otra muestra biológica que contenga péptidos o proteínas. 2. Method according to claim 1 characterized in that the sample is a biological fluid, a cell culture or any other biological sample containing peptides or proteins.
3. Método según la reivindicación 2 caracterizado por que además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, previo al paso d). 3. Method according to claim 2 characterized in that it further comprises a step of hydrolysis of the sample to break the proteins and release their constituent peptides, prior to step d).
4. Método según la reivindicación 2 caracterizado por que además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, posterior al paso d). 4. Method according to claim 2 characterized in that it further comprises a step of hydrolysis of the sample to break the proteins and release their constituent peptides, after step d).
5. Método según la reivindicación 2 caracterizado por que además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, posterior al paso e). 5. Method according to claim 2 characterized in that it further comprises a hydrolysis step of the sample to break the proteins and release their constituent peptides, after step e).
6. Método según las reivindicaciones 3, 4 ó 5 caracterizado por que la hidrólisis es enzimática y el péptido constituyente a cuantificar es característico de la proteína. Method according to claims 3, 4 or 5 characterized in that the hydrolysis is enzymatic and the constituent peptide to be quantified is characteristic of the protein.
7. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el péptido enriquecido isotópicamente contiene entre 1 y 4 átomos de alguno de los isótopos enriquecidos 13C ó 15N en cualquier combinación. 7. Method according to claim 1 characterized in that the isotopically enriched peptide contains between 1 and 4 atoms of any of the 13 C or 15 N enriched isotopes in any combination.
8. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el péptido enriquecido isotópicamente se sintetiza químicamente utilizando distintas combinaciones de aminoácidos enriqueci •dos en 113JC ó 1 I5JN. 8. Method according to claim 1 characterized in that the isotopically enriched peptide is chemically synthesized using different combinations of amino acids enriched in 1 1 3 J C or 1 I 5 J N.
9. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el ión precursor seleccionado en el paso b) posee carga +2 ó +3 y el ión producto seleccionado posee carga +1. 9. Method according to claim 1 characterized in that the precursor ion selected in step b) has a +2 or +3 charge and the selected product ion has a +1 charge.
10. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el espectrómetro de masas en tándem es de tipo triple cuadrupolo.  10. Method according to claim 1 characterized in that the tandem mass spectrometer is triple quadrupole.
11. Método según la reivindicación 10 caracterizado por que el espectrómetro de masas en tándem de tipo triple cuadrupolo es con trampa lineal en el tercer cuadrupolo. Method according to claim 10, characterized in that the triple quadrupole tandem mass spectrometer is with a linear trap in the third quadrupole.
12. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el espectrómetro de masas en tándem es un equipo de tipo cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF). 12. Method according to claim 1 characterized in that the tandem mass spectrometer is a quadrupole-flight time (Q-TOF) type equipment.
13. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que en el paso c) además se reduce el FWHM en el tercer cuadrupolo a un valor entre 0.7 y 0.4, hasta comprobar que la distribución isotópica medida en los iones producto se corresponde con las distribuciones isotópicas teóricas calculadas para los fragmentos tanto para el péptido natural como para el enriquecido isotópicamente. 13. Method according to claim 1 characterized in that in step c) the FWHM in the third quadrupole is also reduced to a value between 0.7 and 0.4, until it is verified that the isotopic distribution measured in the product ions corresponds to the theoretical isotopic distributions calculated for the fragments for both the natural and the isotopically enriched peptide.
14. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el método físico para la separación en la etapa e) del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra es la centrifugación. 14. Method according to claim 1 characterized in that the physical method for the separation in step e) of the isotopically diluted peptide from the rest of the sample is centrifugation.
15. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el método químico para la separación en la etapa e) del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra es la cromatografía de intercambio iónico, reparto o afinidad. 15. Method according to claim 1 characterized in that the chemical method for the separation in step e) of the isotopically diluted peptide from the rest of the sample is ion exchange, distribution or affinity chromatography.
16. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la separación del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra se realiza por cromatografía líquida acoplada al espectrómetro de masas en tándem. 16. Method according to claim 1 characterized in that the separation of the isotopically diluted peptide from the rest of the sample is carried out by liquid chromatography coupled to the tandem mass spectrometer.
17. Método según la reivindicación 16 caracterizado por que la medida de las abundancias isotópicas en el espectrómetro de masas en tándem de los pasos c) y f) se realiza a partir de las áreas de pico obtenidas para el péptido isotópicamente diluido tras la separación cromatográfica. 17. Method according to claim 16, characterized in that the measurement of isotopic abundances in the tandem mass spectrometer of steps c) and f) is carried out from the peak areas obtained for the isotopically diluted peptide after chromatographic separation.
18. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el método bioquímico para la separación en la etapa e) del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra es la inmunoprecipitación. 18. Method according to claim 1 characterized in that the biochemical method for the separation in step e) of the isotopically diluted peptide from the rest of the sample is immunoprecipitation.
19. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que en el paso f) se mide un mínimo de 2 y un máximo de 6 transiciones para cada combinación ión precursor - ión producto seleccionado. 19. Method according to claim 1 characterized in that in step f) a minimum of 2 and a maximum of 6 transitions are measured for each precursor ion-selected product ion combination.
20. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que las abundancias isotópicas para el péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente medidas en el paso c) y utilizadas en la regresión lineal múltiple del paso g) se determinan matemáticamente mediante un programa de ordenador. 20. Method according to claim 1 characterized in that the isotopic abundances for the natural isotopic and the isotopically enriched peptide measured in step c) and used in the multiple linear regression of step g) are determined mathematically by a computer program.
21. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 como herramienta de diagnóstico clínico. 21. Use of the method according to claims 1 to 20 as a clinical diagnostic tool.
22. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 para el análisis de muestras de alimentos y la certificación de su seguridad alimentaria. 22. Use of the method according to claims 1 to 20 for the analysis of food samples and the certification of their food safety.
23. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 como herramienta para el análisis de muestras farmacéuticas. 23. Use of the method according to claims 1 to 20 as a tool for the analysis of pharmaceutical samples.
24. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 para el análisis de muestras en biomedicina. 24. Use of the method according to claims 1 to 20 for the analysis of samples in biomedicine.
25. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 para el análisis de muestras en metrología química. 25. Use of the method according to claims 1 to 20 for the analysis of samples in chemical metrology.
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