WO2015111248A1 - 単位ｄｎａ組成物の調製方法及びｄｎａ連結体の作製方法 - Google Patents

単位ｄｎａ組成物の調製方法及びｄｎａ連結体の作製方法 Download PDF

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WO2015111248A1
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dna
unit
sequence
ligation
unit dna
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柘植　謙爾
板谷　光泰
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学校法人慶應義塾
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a unit DNA composition and a method for producing a DNA conjugate.
  • the base sequence is usually determined by an automatic fluorescence sequencer using the Sanger method, but according to this method, a base sequence having a length of about 800 bases can be confirmed by one base sequence determination. Is possible.
  • unit DNA synthesized by chemical synthesis or PCR method is confirmed in the base sequence before gene accumulation, if the number of base sequence determinations is small, time and money costs can be reduced. Therefore, the shorter unit DNA synthesized by chemical synthesis or PCR used for gene accumulation is preferable.
  • Patent Document 1 discloses a method for preparing plasmid DNA for Bacillus subtilis cell transformation using the OGAB method.
  • the OGAB method uses a so-called multimer plasmid in which a plurality of plasmid units exist in one DNA molecule by homologous recombination between plasmid molecules.
  • the DNA molecule for transformation does not need to be circular DNA, but can be tandemly repeated so that one unit of the plasmid and each unit DNA used for accumulation appear repeatedly in the same direction. For example, plasmid transformation is possible.
  • the weight is proportional to the length of the unit DNA, and particularly when the measured value of the weight differs by several times or more. In many cases, the value calculated based on the measurement value includes a large error.
  • an attempt is made to adjust the molar ratio of each unit DNA to be 1. However, since the length distribution of each unit DNA is wide, the molar ratio should be strictly controlled. I can't.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for preparing a unit DNA composition in which the number of moles of a plurality of unit DNAs is more uniform and a method for preparing a DNA ligated body.
  • the present inventors have found that errors in measurement results are reduced by measuring the number of moles of unit DNA in a state in which an additional sequence is linked to each unit DNA, and the present invention has been completed. . More specifically, the present invention provides the following.
  • the unit DNA is used for producing a DNA ligation containing an integrated DNA composed of the unit DNA
  • the integrated DNA was equally divided so that each base length was equal when the base length of the sequence of the integrated DNA was divided by the number of types of the unit DNA.
  • the preparation of the unit DNA composition according to any one of (1) to (5), comprising the step of designing the unit DNA having a non-palindromic sequence at the end with a non-palindromic sequence in the vicinity of the sequence at the position as a boundary.
  • a method for producing a DNA ligation for microbial cell transformation comprising more than one integrated DNA unit comprising a vector DNA containing an effective replication origin in a host microorganism and integrated DNA, A step of preparing a unit DNA composition by the method according to any one of (1) to (6); Preparing the vector DNA; Removing each additional sequence from the unit DNA to which the additional sequence in the solution after preparation has been ligated using a restriction enzyme; After the removing step, the step of connecting the vector DNA and each unit DNA to each other, The vector DNA and each unit DNA have a structure that can be repeatedly linked with each other in the order,
  • the integrated DNA is a method for producing a DNA conjugate, wherein the unit DNAs are DNAs linked to each other.
  • the present invention it is possible to provide a method for preparing a unit DNA composition in which the number of moles of a plurality of unit DNAs is more uniform, and a method for preparing a DNA conjugate.
  • Example 1 of the present invention after transforming the DNA ligation product after ligation of unit DNA and vector DNA into Bacillus subtilis, a plasmid is extracted from the plurality of Bacillus subtilis after the transformation, and the plasmid is restricted. It is a figure which shows the photograph of the electrophoresis after carrying out an enzyme process.
  • a plasmid is extracted from a plurality of Bacillus subtilis after transformation, and a result of electrophoresis after the plasmid is treated with a restriction enzyme, a Bacillus subtilis clone containing the target integrated DNA is obtained.
  • FIG. 2 is a diagram showing a photograph of electrophoresis after screening and restriction enzyme treatment.
  • Example 1 of this invention shows that the selected integrated DNA in Example 1 of this invention formed the plaque of lambda phage DNA. It is a figure in Example 1 of this invention which shows the photograph after carrying out the restriction enzyme process with the genome of the selected integrated DNA and wild type lambda phage with AvaI. It is a figure which shows the photograph of the electrophoresis after carrying out the restriction enzyme process for the plasmid containing the unit DNA after the refinement
  • Example 2 of the present invention after transforming the DNA ligation product after ligation of the unit DNA and the vector DNA into Bacillus subtilis, a plasmid is extracted from the plurality of Bacillus subtilis after the transformation, and the plasmid is restricted. It is a figure which shows the photograph of the electrophoresis after carrying out an enzyme process.
  • a plasmid was extracted from a plurality of transformed Bacillus subtilis, and from the results of electrophoresis after the plasmid was treated with a restriction enzyme, a Bacillus subtilis clone containing the target integrated DNA was obtained.
  • FIG. 2 is a diagram showing a photograph of electrophoresis after screening and restriction enzyme treatment.
  • FIG. 1 is a diagram showing a photograph of electrophoresis after screening and restriction enzyme treatment.
  • 3 shows photographs of electrophoresis of DNAs (A) to (H) used in Test Example 1.
  • 3 is a graph showing the number of transformant appearances of Bacillus subtilis competent cells transformed with DNAs (A) to (H) used in Test Example 1. It is a graph which shows the relationship between the variation CV (%) of a unit DNA fragment density
  • FIG. (A) shows a graph for 6 fragment accumulation
  • (b) shows a graph for 13 fragment accumulation
  • (c) shows a graph for 26 fragments
  • (d) shows a graph for 51 fragment accumulation. Indicates.
  • (a) is a graph of the ⁇ function for the variation CV (%) of the concentration of the unit DNA fragment derived from the fitting to the exponential distribution curve in Simulation 1
  • (b) is the N value of the virtual ligation product. It is a graph of a lambda function about CV (%) of variation of concentration of a unit DNA fragment obtained from an average value. The figure which shows the misligation site about # 1, # 2, # 5, # 7, # 8, # 9, # 10, # 11 among the aggregates obtained in the experiment of ⁇ phage genome reconstruction in simulation 1 It is.
  • FIG. 6 is a graph comparing the actual ligated efficiency in simulation 1 and the ligation efficiency by ligation simulation.
  • A) is a graph compared with a simulation with 95% ligation capability
  • (b) is a graph compared with a simulation with 96% ligation capability
  • (c) is compared with a simulation with 97% ligation capability.
  • (D) is a graph compared with a simulation with a ligation capability of 98%
  • (e) is a graph compared with a simulation with a ligation capability of 99%
  • (f) is a graph with a ligation capability of 100%.
  • Graphs compared with the simulations are shown respectively.
  • the method for preparing a unit DNA composition of the present invention comprises a step of preparing a solution containing a plurality of unit DNAs to which additional sequences are linked for each type of unit DNA, and after each solution is prepared, additional sequences are added to the unit DNA.
  • the concentration of the unit DNA in each solution is measured, and based on the result, each solution is fractionated to bring the number of moles of the unit DNA in each solution close to each other.
  • the type of “unit DNA” is distinguished for each base sequence.
  • the “unit DNA” includes both those with a restriction enzyme recognition site added and those without a restriction enzyme recognition site.
  • the concentration of unit DNA in a solution containing the unit DNA when measuring the concentration of each unit DNA in a solution containing the unit DNA, an additional sequence is linked to each unit DNA. Then, since the additional sequence is linked, the distribution of the length of the base sequence becomes small when measuring the concentration of the solution. Therefore, an error in the number of moles of each unit DNA calculated based on the measurement result is reduced. Therefore, by separating each solution based on this measurement result and adjusting the number of moles of unit DNA in each solution to be the same, the molar ratio in each solution can be easily brought close to 1. .
  • the “concentration of unit DNA in solution” to be measured refers to the molar concentration of unit DNA.
  • the method for measuring the molar concentration of the unit DNA in the solution is not particularly limited.
  • the mass% of the unit DNA in the solution is measured, and from the measured numerical value of the mass% of the unit DNA in the solution, The molar concentration of the unit DNA may be calculated.
  • a method for measuring the molar concentration of unit DNA in a solution it is preferable to measure by using means capable of measuring the DNA weight concentration with an accuracy within ⁇ 20%, more specifically, by a microspectrophotometer. It is preferable to use an ultraviolet absorption spectrum.
  • the step of preparing the solution containing the unit DNA to which the additional sequence is linked is not particularly limited, and for example, the unit DNA may be prepared and then the additional sequence may be linked to the unit DNA.
  • the preparation of the unit DNA may be performed by using a previously synthesized one, or may be performed by preparing the unit DNA.
  • the unit DNA can be prepared by a conventionally known method, for example, by polymerase chain reaction (PCR) or chemical synthesis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a primer prepared by adding a restriction enzyme recognition sequence that generates each protruding end to the base sequence on the template DNA is prepared by PCR, or in advance It can be produced by incorporating a restriction enzyme recognition sequence so as to generate an arbitrary protruding sequence at the end and performing chemical synthesis.
  • the base sequence of the prepared unit DNA can be confirmed by a conventionally known method. For example, it can be confirmed by incorporating the unit DNA into a plasmid and determining the base sequence by an automatic fluorescent sequencer using the Sanger method. Can do.
  • the additional sequence is not particularly limited, and may be linear DNA or a circular plasmid.
  • the unit DNA to which the additional sequence is linked has a circular structure, so that it can be transformed into a host such as Escherichia coli.
  • the kind of plasmid DNA is not particularly limited, but in order to replicate plasmid DNA in a transformed host, the plasmid DNA sequence preferably has an origin of replication.
  • pUC19 which is a high copy plasmid vector of E. coli, or a derivative plasmid thereof is preferable.
  • all the unit DNAs are cloned into the same kind of plasmid vector in that the length distribution between the DNAs to which the additional sequences are ligated can be reduced and the number of moles of the unit DNAs can be made closer to each other. Preferably it is.
  • the ligation of the additional sequence to the unit DNA may be performed, for example, by ligation using DNA ligase, and may be performed by the TA cloning method when ligating to the plasmid DNA.
  • the standard deviation of the total length distribution of each base length of the unit DNA and the base length of the additional sequence linked to each unit DNA is not particularly limited. However, the smaller the standard deviation of the concentration of the DNA in the solution, Since the error in the number of moles of each unit DNA calculated based on the measurement result is reduced, the number of moles of unit DNA in each solution can be made closer to each other.
  • the standard deviation of the total length distribution with the base length of the additional sequence linked to each unit DNA is preferably within ⁇ 20% of the average total length, and ⁇ 15 Is more preferably within ⁇ 10%, even more preferably within ⁇ 10%, even more preferably within ⁇ 5%, still more preferably within ⁇ 1%, and within ⁇ 0.5%. Most preferably.
  • the average base length of the additional sequence linked to each unit DNA is not particularly limited, but the longer one than the average base length of the unit DNA is calculated based on the measurement result of the concentration of DNA in the solution. Since the error in the number of moles of each unit DNA is reduced, the number of moles of unit DNA in each solution can be made closer to each other.
  • the average base length of the additional sequence linked to each unit DNA is preferably 2 times or more, more preferably 5 times or more with respect to the average base length of the unit DNA, The ratio is more preferably 10 times or more, and most preferably 20 times or more.
  • the average base length of the additional sequence linked to the unit DNA is too long, it becomes difficult to operate the unit DNA to which the additional sequence is linked.
  • the average base length of the additional sequence linked to each unit DNA is 10000 times or less (specifically, 5000 times or less, 3000 times or less, 1000 times or less, 500 times or less) with respect to the average base length of the unit DNA.
  • it is preferably 250 or less, 100 times or less, and the like.
  • the length of each unit DNA is not particularly limited, but when confirming the base sequence of the unit DNA, it is preferable that the number of times of base sequence determination is smaller, the time and money costs can be reduced. Therefore, the length of each unit DNA is preferably shorter, specifically, it is preferably 1600 bp or less, and more preferably 1200 bp or less. In particular, when base sequence determination is performed by an automatic fluorescent sequencer using the Sanger method, it is possible to confirm a base sequence of about 800 bases in length by one base sequence determination.
  • the thickness is most preferably 800 bp or less (specifically, 600 bp or less, 500 bp or less, 400 bp or less, 200 bp or less, 100 bp or less, etc.).
  • the length of each unit DNA is preferably 20 bp or more, more preferably 30 bp or more, and further preferably 50 bp or more.
  • the unit DNA composition prepared by the preparation method of the present invention is a DNA ligation containing integrated DNA constituted by the unit DNA. Can be used to make a body.
  • a unit DNA composition prepared by the method of the present invention is used to prepare a DNA conjugate by the method described below, many unit DNAs (for example, 50 or more types) can be linked. This is considered to be because in the unit DNA composition prepared by the preparation method according to the present invention, the number of moles of each unit DNA is more accurately close to the same.
  • the step of preparing a solution containing unit DNA may include a step of designing unit DNA.
  • the design of the unit DNA is not particularly limited.
  • the base length of the sequence of the integrated DNA is divided by the number of types of the unit DNA.
  • the non-pain sequence near the sequence at the position where the integrated DNA is equally divided may be used as a boundary so that each base length becomes equal.
  • unit DNA is designed in this way, the length of each unit DNA becomes substantially the same length.
  • DNA when used for the preparation of a DNA ligation described below, it appears as a band at substantially the same position in the size fraction after electrophoresis after removing the additional sequence with a restriction enzyme. It is preferable in that DNA can be recovered and work efficiency is improved.
  • the “near the sequence in the position where the integrated DNA is equally divided” is not particularly limited, but may be appropriately set based on the length of the base sequence.
  • each unit DNA is 1000 bp, from “position where the accumulated DNA is equally divided”, within 100 bp (specifically, within 90 bp, within 80 bp, within 70 bp, within 60 bp, within 50 bp, 30 bp Within 20 bp, within 10 bp, within 5 bp, etc.).
  • unit DNA when designing unit DNA as described above, when preparing a DNA ligation containing the target integrated DNA, it is necessary to have a non-palindromic sequence (sequence that is not a palindromic sequence) at the end of the unit DNA. It is preferable to design to.
  • the unit DNA designed in this way has a structure that can be repeatedly linked while maintaining the order as will be described later, when the non-papillary sequence is a protruding sequence.
  • the present invention also includes a method for producing a DNA conjugate.
  • the method for producing a DNA ligated product of the present invention is limited by the above-described method for preparing a unit DNA composition, a step for preparing vector DNA, and a unit DNA to which additional sequences in the prepared solution are linked. A step of removing each additional sequence using an enzyme; and a step of linking the vector DNA and each unit DNA to each other after the removal step.
  • the DNA conjugate contains more than one integrated DNA unit and is used for microbial cell transformation.
  • the integrated DNA unit is composed of vector DNA and integrated DNA.
  • the number of integrated DNA units in the DNA ligation is not particularly limited as long as it exceeds 1, but in order to increase the transformation efficiency, it is preferably 1.5 or more, more preferably 2 or more, and still more preferably 3 Or more, and most preferably 4 or more.
  • the vector DNA contains an effective replication origin in the host microorganism to be transformed.
  • the vector DNA is not particularly limited as long as it has a sequence that allows DNA replication in a microorganism into which a DNA conjugate can be transformed. For example, it is effective in Bacillus bacteria (Bacillus subtilis) described later.
  • the sequence of the replication origin effective in Bacillus subtilis is not particularly limited.
  • pTB19 Imanaka, T., et al. J. Gen. Microbioi. 130, 1399 has a ⁇ -type replication mechanism. -1408. (1984)
  • pLS32 Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246. (1998)
  • pAM ⁇ 1 Singlefield, T. J., et al. Gene 87, 79-90 (1990)
  • other sequences such as replication origins.
  • Accumulated DNA consists of DNA in which the above unit DNAs are linked to each other.
  • the DNA in the present invention is a DNA to be cloned, and the type and size are not particularly limited. Specifically, it may be a naturally occurring sequence such as a prokaryote, a eukaryote, or a virus, or an artificially designed sequence.
  • the method of the present invention as described above, since many unit DNAs can be ligated on a plasmid, it is preferable to use DNA having a long base length. Examples of the DNA having a long base length include a group of genes constituting a series of metabolic pathways, the entire genomic DNA such as phage, or a part of the genomic DNA.
  • the integrated DNA unit may or may not contain an appropriate base sequence as necessary in addition to vector DNA and integrated DNA.
  • a base sequence that controls transcription and translation such as a promoter, an operator, an activator, and a terminator may be included.
  • a promoter when Bacillus subtilis is used as a dormitory, specifically, Pspac (Yansura, D. and Henner, D. J. Pro. Natl. Acad.), Whose expression can be controlled by IPTG (isopropyl s-D-thiogalactopyroside). Sci, USA 81, 439-443. (1984)), or Pr promoter (Itaya, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 602-604. (1999)).
  • the vector DNA and each unit DNA have a structure that can be repeatedly linked while maintaining the order.
  • “join together while maintaining their order” means that unit DNAs or vector DNAs having sequences adjacent to each other on an integrated DNA unit are bonded in the same order and orientation.
  • “Repeatedly connect” means that the 5 ′ end of a unit DNA or vector DNA having a base sequence at the 5 ′ end and the 3 ′ end of a unit DNA or vector DNA having a base sequence at the 3 ′ end are combined.
  • Specific examples of such unit DNA include, for example, those having ends that can be repeatedly linked to each other while maintaining their order using the complementarity of the base sequences of the protruding ends of the fragments.
  • the structure of this overhang is not particularly limited as long as it is a non-batch sequence, including the difference in the shape of the 5 'end overhang and the 3' end overhang.
  • the above protruding end is preferably produced by removing each additional sequence from the unit DNA using a restriction enzyme. Therefore, when a DNA conjugate is prepared by the method of the present invention, the unit DNA preferably has a restriction enzyme recognition sequence in order to remove an additional sequence by the restriction enzyme.
  • the vector DNA can be prepared, for example, by performing a restriction enzyme treatment so that the vector DNA is provided with a protruding end for repeated ligation with the unit DNA while maintaining the order.
  • the restriction enzyme used for the removal of the additional sequence is not particularly limited, but is preferably a type II restriction enzyme, more preferably AarI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI , BtgZI, FokI, SfaNI, and the like are type IIS restriction enzymes capable of producing a protruding end of an arbitrary sequence at a predetermined distance away from the recognition sequence.
  • a type IIS restriction enzyme is used, the protruding ends of the unit DNA can be made different at each ligation site, so that the order of ligation is maintained.
  • type IIS restriction enzyme it is preferable to prepare using type IIS restriction enzyme so as to provide protruding ends for repeated ligation with unit DNA while maintaining the order. preferable.
  • each unit DNA is classified into groups for each type of restriction enzyme used to remove the additional sequence, a solution containing two or more types of unit DNA can be mixed for each group before the removal step. .
  • the restriction enzyme treatment can be performed once for each group of restriction enzymes.
  • the unit DNA is fractionated by electrophoresis, for example, Since the unit DNA can be collected by drawing, the work efficiency is improved.
  • an error may occur in the recovery amount between the groups. Errors can occur.
  • the number of groups is smaller, that is, it is preferable that the number of types of restriction enzymes used for removal of additional sequences is smaller. Therefore, the number of restriction enzymes to be used is preferably 5 or less, more preferably 3 or less, and most preferably 1 type. That is, if only one type of restriction enzyme is used, a solution containing all the unit DNAs can be mixed, so that the efficiency of the work is dramatically improved and the number of moles aligned between the unit DNAs is not improved. Is unlikely to occur. Since restriction enzymes are mixed in an approximately equimolar state, a large number of unit DNAs can be ligated even if such a mixture is used.
  • the restriction enzyme recognition sequence of the unit DNA is designed so as not to recognize the sequence of each unit DNA. That is, when an attempt is made to use a certain type IIS restriction enzyme, if the type IIS restriction enzyme does not recognize the sequence of one unit DNA but recognizes the sequence of the other unit DNA, Design a restriction enzyme recognition sequence for each unit DNA so that a type IIS restriction enzyme different from the type IIS restriction enzyme is used. In such a design, the type IIS restriction enzyme used for each unit DNA is different, but the unit DNA can be used for classification of the above group depending on the type of the type IIS restriction enzyme. If there is a type IIS restriction enzyme that does not recognize any sequence of each unit DNA, the restriction enzyme recognition sequence is added to design the unit DNA, whereby the additional sequence is combined from the unit DNA by one type IIS restriction enzyme. Can be removed.
  • the step of linking the vector DNA and each unit DNA to each other is not particularly limited. After the restriction enzyme treatment, the additional sequence after the restriction enzyme treatment and the unit DNA are fractionated, and the fractionated unit DNA and vector are fractionated. It can be performed by ligation using DNA and DNA ligase or the like. Thereby, the DNA coupling body for microorganism transformation can be produced.
  • the unit DNA in the ligation step is one to which no restriction enzyme recognition sequence is added.
  • the method of fractionating the additional sequence and the unit DNA is not particularly limited, but is preferably a method in which the relationship of the molar ratio of each unit DNA after the restriction enzyme treatment is not disrupted, specifically by agarose gel electrophoresis. Is preferred.
  • the method for linking unit DNA and vector DNA is not particularly limited, but it is preferably performed in the presence of polyethylene glycol and a salt.
  • the salt is more preferably a monovalent alkali metal salt. More specifically, it is more preferable to carry out with a ligation reaction solution containing 10% polyethylene glycol 6000 and 250 mM sodium chloride.
  • the concentration of each unit DNA in the ligation reaction solution is not particularly limited, and is preferably a concentration of 1 fmol / ⁇ l or more.
  • the reaction temperature and time for ligation are not particularly limited, but are preferably 30 minutes or more at 37 ° C.
  • the vector DNA in the ligation reaction solution is preferably adjusted so that it is equimolar with the unit DNA by measuring the DNA concentration of the solution containing the vector DNA before the reaction.
  • the method for preparing a DNA ligation according to the present invention comprises the yield of a DNA fragment having a target ligation number expressed by the product of the number of unit DNAs constituting the accumulation unit and the number of accumulation units, and the concentration of the DNA fragment.
  • the concentration of the vector DNA and each unit DNA in the ligation step is determined.
  • the step of adjusting the coefficient of variation (hereinafter referred to as “variation coefficient 2” in this specification) may or may not be included, but it is preferable to include it.
  • the coefficient of variation 1 is a coefficient of variation used for convenience in the relational expression
  • the coefficient of variation 2 is a coefficient of variation in the concentrations of unit DNA and vector DNA in the actual linking process.
  • the target ligation number refers to the number of desired DNA fragments to be ligated in the ligation step, and more specifically is represented by the product of the number of unit DNAs constituting the ligated accumulation unit and the number of accumulation units.
  • the “yield of DNA fragments of the target ligation number” means the ratio of the number of DNA fragments constituting the integrated DNA unit after ligation to the total number of DNA fragments used for ligation.
  • the relational expression according to the present invention is an expression showing the relation between the yield of DNA fragments of the target ligation number and the coefficient of variation 1.
  • an expression obtained from a ligation simulation by a computer can be used. More specifically, for example, the relational expression is obtained by performing a ligation simulation in a unit DNA fragment population (for example, 10-30 population) in which the coefficient of variation 1 is changed every 1% of 0 to 20%, and The distribution (for example, exponential distribution) of the number of unit DNA fragments is examined, a fitting curve for this distribution is created, and the fitting curve can be used for setting.
  • the tool used for the specific ligation simulation is not particularly limited, and a conventional known means can be used.
  • VBA Visual Basic for Applications
  • spreadsheet software Excel registered trademark 2007
  • the fitting curve can be created by, for example, an exponential approximate curve function of spreadsheet software Excel (registered trademark) 2007 software.
  • Adjustment of the coefficient of variation 2 based on the relational expression is performed, for example, by designing the relational expression and then substituting the yield of the desired DNA fragment into the relational expression so that the DNA fragment at the time of ligation becomes the calculated coefficient of variation 1. It can be performed by adjusting the operation in each step before connection.
  • the adjustment method is not particularly limited.
  • each step such as a step of preparing vector DNA, a step of preparing unit DNA, a step of linking vector DNA and each unit DNA to each other, vector DNA or each unit DNA
  • the concentration of the sample measure it in advance so that the coefficient of variation 2 becomes the desired coefficient of variation when selecting the measurement equipment (spectrophotometer, spectrofluorometer, real-time PCR device, etc.) used for the measurement. You may select a measuring instrument with known error.
  • the coefficient of variation 2 is not particularly limited, but more unit DNA can be linked if the unit DNA concentration error when linked is smaller. Accordingly, the coefficient of variation 2 is preferably 20% or less, more preferably 15% or less, still more preferably 10% or less, and even more preferably 8% or less. % Is most preferred.
  • the method for preparing a DNA conjugate of the present invention may further include a step of inactivating the restriction enzyme after the removing step and before the linking step. If there is a restriction enzyme cleavage site used for cutting off the additional sequence of other unit DNA inside the unit DNA, it is difficult to mix the unit DNA population having the additional sequence before inactivating the restriction enzyme. Therefore, the unit DNA cannot be fractionated at once by integrating them. However, by inactivating the restriction enzyme, it is possible to integrate a unit DNA population having an additional sequence after the inactivation, so that unit DNA can be fractionated in a lump.
  • the inactivation of the restriction enzyme can be performed by a conventionally known method, for example, by phenol / chloroform treatment.
  • the host microorganism to be transformed is not particularly limited as long as it has a natural transformation ability.
  • the natural transformation ability include those that are processed into single-stranded DNA when DNA is incorporated.
  • Specific examples include Bacillus genus bacteria, Streptococcus genus bacteria, Haemophilus genus bacteria, and Neisseria genus.
  • Bacillus bacteria include B. subtilis, Bacillus subtilis. megaterium (Bacteria), B. stearothermophilus (medium hyperthermophile) and the like.
  • the most preferred microorganism is Bacillus subtilis excellent in natural transformation ability and recombination ability.
  • the DNA conjugate produced by the method of the present invention can be used for transformation of microbial cells, but the method of making the microorganism to be transformed competent is a known method suitable for each microorganism. You can choose. Specifically, for example, in the case of Bacillus subtilis, Ananostopoulou, C.I. And Spizzen, J.M. J. Bacteriol. 81, 741-746 (1961).
  • the transformation method a known method suitable for each microorganism can be used.
  • the amount of ligation product to be given to competent cells Preferably, the amount is from 1/20 to the equivalent, more preferably half the amount of the competent cell culture medium.
  • a known method for purifying the plasmid from the transformant a known method can be used.
  • Whether the plasmid purified from the transformant has accumulated DNA can be confirmed by the size pattern of fragments generated by restriction enzyme cleavage, the PCR method, or the nucleotide sequence determination method. Further, when the inserted DNA has a function such as substance production, it can be confirmed by detecting the function.
  • Bacillus subtilis was used as a microbial cell to be transformed.
  • Bacillus subtilis RM125 strain (Uozumi, T., et al. Moi. Gene. Genet., 152, 65-69 (1977)) and its derivative strain BUSY9797 were used.
  • PGET118 Kaneko, S., et al. Nucleic Acids Res. 31, e112 (2003) was used as a vector DNA replicable in Bacillus subtilis, and pGETS118-AarI-pBR (SEQ ID NO: 1 was constructed as described below) was used.
  • PGETS151-pBR see SEQ ID NO: 2.
  • lambda phage DNA manufactured by Toyobo
  • SEQ ID NO: 3 The antibiotic carbenicillin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used for selection of E. coli having plasmid DNA into which unit DNA was incorporated.
  • Antibiotic tetracycline (Sigma) was used for selection of Bacillus subtilis.
  • type IIS restriction enzymes AarI (Thermo), BbsI (NEB), BsmBI (NEB), and SfiI (NEB) were used.
  • HindIII, PvuII, and T4 DNA ligase were manufactured by Takara Bio Inc.
  • Takara Ligation Kit (Mighty) (Takara Bio Inc.) was used for general ligation for plasmid construction in E. coli.
  • KOD plus polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used for the PCR reaction for preparing unit DNA.
  • Ex-Taq HS manufactured by Takara Bio Inc. was used for colony PCR for determining the base sequence of DNA cloned into the plasmid.
  • PMD-19 (simple) (Takara Bio Inc.) was used as the plasmid DNA which is an additional sequence for incorporating the unit DNA.
  • the enzyme for plasmid purification Plasmid Safe, manufactured by EPICENTER was used.
  • As the agarose gel for electrophoresis 2-Hydroxyethyl agarose (Sigma) or UltraPure Agarose (Invitrogen), which is a low melting point agarose gel for DNA electrophoresis, was used.
  • phenol: chloroform: isoamyl alcohol 25: 24: 1 and TE saturated phenol (containing 8-quinolinol) manufactured by Nacalai Tesque, Inc. were used.
  • Lambda termiase manufactured by EPICENTER was used.
  • Gigapack III Plus Packaging Extract from Agilent Technologies was used for packaging of lambda phage.
  • the lysozyme manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • As the medium components and agar of the LB medium those manufactured by Becton Dickington were used.
  • IPTG (isopropyl s-D-thiogalactopyranoside) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. All other medium components and biochemical reagents other than those described above were manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • any one of E. coli DH5 ⁇ strain, JM109 strain and TOP10 strain was used.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen was used for small-scale purification of the constructed plasmid from Escherichia coli, and QIAfilter Midi Kit from the company was used for large-scale purification.
  • MinElute Reaction Cleanup Kit from Qiagen or QIAquick PCR purification Kit from Qiagen was used.
  • MinElute Gel Extraction Kit manufactured by Qiagen was used.
  • Nano-drop 2000 manufactured by Thermo was used as the ultra-trace spectrophotometer.
  • PGETS118-AarI-pBR (Construction of vector DNA used for accumulation)
  • PGETS118-AarI-pBR (SEQ ID NO: 1), which is a vector DNA used for accumulation of lambda phage DNA, is an Escherichia coli-Bacillus subtilis strain having an origin of replication oriS of the F factor of Escherichia coli and an origin of replication repA that functions in Bacillus subtilis. 1 is a plasmid constructed through a multistep process based on the inter-shuttle plasmid vector pGETS118 (Kaneko, et. Al., Nucleic Acids Res., 31, e112. (2003).), And has the structure shown in FIG. .
  • the cloning site of the integrated gene is between two AarI cleavage sites, and multiple copies of E. coli are used between these two AarI cleavage sites, which are removed during accumulation, in order to facilitate the acquisition of the vector in E. coli.
  • a plasmid pBR322 origin of replication and an ampicillin resistance gene have been introduced.
  • the natural AarI cleavage site present in the tetracycline resistance gene inside pGETS118 is deleted by introducing a single base mutation that does not affect the amino acid sequence of the tetracycline resistance gene (tetL). It was.
  • PGETS151-pBR (SEQ ID NO: 2), which is a vector DNA used for accumulation of the mevalonate pathway artificial operon, is composed of three sets of primers PartA (5′-TAGGGTCTCaagcggcccccagcttt-3 ′) using the above-described DNA of pGETS118-AarI-pBR as a template. (See SEQ ID NO: 5) and 5'-TAGGGTCTCAGGCggccagagaagcc-3 '(see SEQ ID NO: 6), Part B (5'-TAGGGTCTCACCccCCTCTCCCGGTCCGATAT-3CT (see SEQ ID NO: 7) and 5'-TAGGGTCTCATTGATCATTGATCATTGATCATGT No.
  • the diversity of overhangs of 4 bases is 256 to the 4th power.
  • the protruding array used in the present invention was selected according to the following criteria. First, all 16 sequences (group 0) (AATT, ATAT, TATA, TTAA, CCGG, CGCG, GCGC, GGCC, ACGT, AGCT, TCGA, TGCA, CATG, CTAG, GATC, GTAC) which become palindrome are these Since the complementary sequence of the sequence also becomes the same sequence and the fragments of the same species can be linked, they are excluded because they cannot be used in the present invention.
  • Example 1 the boundary between the vector DNA and the unit DNA was selected from Group 1 from the groups divided above.
  • a total of 60 protruding combinations of group III (44 combinations) and group IV (16 combinations) were selected as candidates.
  • group III 44 combinations
  • group IV 16 combinations
  • a complete base sequence of a sequence to be accumulated was first determined, and then an ideal division boundary that equally divides this total length was set.
  • the base sequence used in Example 1 will be described as a specific example.
  • Example 1 48522 bp obtained by adding a cos site 16 bp and an overhanging sequence 4 bp necessary for accumulation to the total length of lambda phage genome 48502 bp was targeted for reconstruction.
  • Table 1 is a table showing ideal divided units, actual divided units, and protruding base sequences of the integrated DNA in Example 1.
  • the unit DNA except the accumulation plasmid vector was prepared by dividing it into 50 almost identical sizes, and reconstitution was attempted by ligating them. Although it is desirable to divide all 50 fragments so that they are ideally equal in length, in order not to introduce any base change in the sequence to be accumulated, it depends on the original sequence. Thus, it is necessary to create a 4 base 5 ′ terminal overhang used for accumulation.
  • the projection combination assignment simulation is performed so that the length is as close to the ideal division unit as possible.
  • 970 bp obtained by dividing the full length (48522 bp) by 50 was an ideal division unit, and the unit DNA of a region having a small absolute base number was named as the 01st fragment, the 02th fragment, the 03th fragment,... .
  • Selection of specific protrusions from the protrusion candidates existing in each sequence is performed first from extraction sequences with a low total number of protrusion combination candidates as described above, from protrusion combination sequences with a low frequency of appearance in all extracted sequences. By assigning, a unique protruding combination was assigned to every division unit.
  • Lambda phage is a bacteriophage that infects E. coli and is the best studied molecular biological. The genome consists of double-stranded DNA with a total length of 48502 bp, and all base sequences have been clarified. The existence of various mutants has also been revealed. In this example, an attempt was made to produce a lambda phage point mutant from a short unit DNA of about 1 kb.
  • lambda phage As lambda phage, ⁇ phage DNA manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used. This product is linear at the cos site.
  • 6 sites g. 138delG, g.14266_14267insG, g.37589C> T, g with respect to the nucleotide sequences registered in the database (accession number J02459.1).
  • SEQ ID NO: 3 (the total length of SEQ ID NO: 3 is a total length of 48526 bp including the above-mentioned 48522 pb and the other four protruding terminal bases) .
  • Type IIS restriction enzymes that generate any overhang sequence of 4 bases include AarI (5′-CACCCTGC (N) 4 / ⁇ 3 ′, 5 ′ ⁇ / (N) 8GCAGGGTG-3 ′), BbsI (5′ ⁇ GAAGAC (N) 2 / -3 ′, 5 ′ ⁇ / (N) 6GTCTTC-3 ′), BbvI (5′-GCAGC (N) 8 / ⁇ 3 ′, 5 ′ ⁇ / (N) 12GCTGC-3 ′) BcoDI (5'-GTCTCN / -3 ', 5'-/ (N) 5GAGAC-3 '), BfuAI (5'-ACCCTGC (N) 4 / -3', 5 '-/ (N) 8GCAGGT-3 '), BsaI (5'-GGTCTCN / -3', 5 '-/ (N) 5GAGACC-3'), B
  • restriction enzymes are not present in the E. coli plasmid vector (pMD19, Simple, TAKARA) used for subcloning the gene fragment, or the size of the generated fragment is sufficiently larger than the ideal split unit even if it exists.
  • pMD19 Simple, TAKARA
  • pMD19 Simple, TAKARA
  • BsmBI restriction enzyme
  • restriction enzyme sites of these candidates the distribution of the restriction enzyme sites in the entire lambda phage from the first fragment to the 50th fragment was examined. As a result, there were 12 sites for AarI, 24 sites for BbsI, and 41 sites for BfuAI. Thus, there were 38 BsmFI, 45 BtgZI, and 14 BsmBI, and there was no restriction enzyme recognition site that was not present in the lambda phage genome for any of the restriction enzymes. Therefore, it was decided to select and use restriction enzymes that do not cleave the interior for each unit DNA.
  • BbsI is a total of 33 fragments of Nos. 01-08, 12, 16-22, 24, 27, 28, 33-39, 43, 45-50, -A total of 9 fragments of 13, 23, 25.30, 32, and 44 fragments
  • BsmBI was a total of 8 fragments of the 14th, 15th, 26th, 29th, 31th, 40th to 42th fragments.
  • the amplified unit DNA is 1 ⁇ TAE buffer containing 2 mg / ml Crystal Bio Red (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) “Tris-acetate-EDTA buffer stock solution (concentration 50 times) pH 8.3 (at concentration)” manufactured by Nacalai Tesque.
  • the spin column was transferred to a 5 ml centrifuge tube. 30 ⁇ l of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) was added to the spin column, allowed to stand for 2 min, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 1 min to recover the DNA solution. This recovered DNA was stored at ⁇ 20 ° C. until use. The obtained unit DNA was cloned into an E. coli plasmid vector by the TA cloning method shown below.
  • a synonym substitution mutant (g.9515G> C) in the coding region of gene V was present as one of the mutants obtained for the tenth fragment. Due to this mutation, a restriction enzyme AvaI recognition site newly appears in the phage genome (FIG. 2). In this example, for the purpose of clearly showing that the constructed phage was artificially produced, the synonym substitution mutant (g.9515G> C) was not used for the tenth fragment, but the wild type. ).
  • Plasmid Safe (Epicenter) 10 ⁇ reaction buffer, 2.4 ⁇ l of 25 mM ATP solution and 2 ⁇ l of Plasmid Safe enzyme solution were added and mixed, and BI-526T (ASTEC), a programmable block incubator, The mixture was incubated at 37 ° C. for 1 h, and then incubated at 75 ° C. for 30 minutes for enzyme deactivation.
  • the resulting solution was purified by PCR purification kit (Qiagen). In the final stage of purification of the kit, the DNA adsorbed on the column was eluted with 25 ⁇ l of TE buffer (pH 8.0) instead of the elution buffer attached to the kit to obtain a high purity plasmid solution.
  • DNA electrophoresis was performed using the plasmid having the 01st fragment before and after purification and the plasmid having the 21st fragment (UltraPure Agarose, Invitrogen), and it was confirmed that the target fragment (unit DNA) was incorporated (Fig. 3).
  • the obtained DNA solution was again measured with an ultra-trace spectrophotometer to determine the concentration of the high purity plasmid solution.
  • the concentration of each sample was in the range of approximately 100 ng / ⁇ l to 200 ng / ⁇ l reflecting the degree of purification of the crude plasmid solution against the theoretical maximum of 200 ng / ⁇ l.
  • 15 ⁇ l of each plasmid solution is placed in a 1.5 ml tube, TE is added to each solution so that each plasmid has a concentration of 100 ng / ⁇ l, and the obtained high-purity plasmid solution is again added to the ultrapure solution.
  • the total volume of the integrated equimolar plasmid solution was about 165 ⁇ l for the BbsI group, about 45 ⁇ l for the AarI group, and about 40 ⁇ l for the BsmBI group. Double sterilized water was added to each group to obtain 495, 135, and 120 ⁇ l of high-purity plasmid solutions, which were cleaved as follows for each type of restriction enzyme.
  • the electrophoresis gel was stained with 100 ml of 1 ⁇ TAE buffer containing 1 ⁇ g / ml ethidium bromide (Sigma) for 30 min and visualized by illuminating with long-wave ultraviolet light (366 mn), so that the first to 50th fragments
  • the band formed by (about 1 kb) was cut out with a razor and collected in a 1.5 ml tube.
  • 1 ⁇ TAE buffer was added to make the total volume about 700 ⁇ l, and this was incubated at 65 ° C. for 10 minutes to dissolve the gel.
  • FIG. 6 shows the distribution of the number of molecules of each unit DNA before and after size fractionation
  • FIG. 7 shows the change rate of the number of molecules of each unit DNA.
  • the DNA weight concentration of the equimolar mixture of the 01st to 50th fragments is 98 ng / ⁇ l, the total base sequence is 48,522 bp, while the vector DNA (pGETS118-AarI / AarI) is 190 ng / ⁇ l with a total length of 15, 139 bp.
  • vector DNA was mixed at a ratio of 1.00 ⁇ l to 6.21 ⁇ l of the equimolar mixture of the 01st to 50th fragments.
  • plasmid For these four strains, a large amount of plasmid was prepared by cesium chloride-ethidium bromide density gradient ultracentrifugation, and the structure of the plasmid was confirmed by electrophoresis after performing 13 types of restriction enzymes. (Fig. 10). Furthermore, when the nucleotide sequence of the entire region except the vector portion of this plasmid was determined, all of the four plasmids were completely identical to the expected nucleotide sequence.
  • each integrated plasmid of # 3, # 4, # 6, and # 12 is cleaved with lambda terminase (Lambda terminator, Epicenter) to divide it into a vector and an integrated gene portion, and this is divided into lambda packaging extract. (Gigapack III Plus Packing Extract, Agilent Technologies). When this was infected with Escherichia coli (VCS257 strain), spread on an LB plate and cultured at 37 ° C. overnight, plaques were confirmed.
  • the shape of the obtained plaque was confirmed to be the same form as that obtained with TOYOBO lambda phage DNA performed in parallel (FIG. 11).
  • Phage DNA was purified from plaques obtained from each plasmid, and it was confirmed whether the introduced mutation was present by digestion with restriction enzyme AvaI.
  • FIG. 12 it was different from lambda phage DNA manufactured by TOYOBO.
  • the cleavage pattern was shown, and it was confirmed that the AvaI site was present in all the phages as scheduled.
  • the lambda phage genome produced by accumulating all 50 fragments of the 01 to 50 fragments was complete in both base sequence and plaque forming ability.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • this size is an ideal division unit, and a specific sequence (two in total of A and T is C and C and 44 combinations excluding 8 combinations of palindrome out of all 52 combinations in which the total of G is 2 (Group III above), and 32 combinations in which the total of A and T is 1 and the total of C and G is 3 Among them, it was examined whether any one kind of array appears in all ideal division units among all 16 combinations (total 60 types of the above-mentioned group IV) in which C and G are not 3 consecutive. It was found that any one kind of specific sequence appeared within a range of ⁇ 7 bp from the unit. Based on this, the entire length was divided into 55 98-115 bp fragments.
  • Table 2 is a table showing the division units and protruding base sequences of the integrated DNA in Example 2.
  • the protrusion (ATTA and AAAA) which consists only of A and T was utilized.
  • PCR prepared to hybridize to the AarI recognition sites at both ends in order to amplify the double-stranded unit DNA obtained by hybridization of these two synthetic DNAs and subsequent template-dependent extension reaction by the PCR method.
  • the concentration of 1 ⁇ l of these was measured with an ultra-trace spectrophotometer, the concentration was 108 to 213 ng / ⁇ l. From this, 20 ⁇ l of high-purity plasmid solution was taken in a separate tube, and TE was added to the tube so that the concentration of each plasmid was calculated to be 100 ng / ⁇ l for dilution. The concentration of this purified plasmid solution is again calculated with a microspectrometer, and the volume of each high-purity plasmid based on this concentration is calculated with a precision of 1 ⁇ l of 2 digits after the decimal point. About 5 ⁇ l) was taken from each plasmid solution and pooled into a single tube.
  • ⁇ Batch size fraction of 55 unit DNA> An equal amount of phenol, chloroform, and isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added to the reaction solution to inactivate AarI, followed by centrifugation. The supernatant was purified by ethanol precipitation, and 20 ⁇ l of the precipitate was purified. Dissolved in TE. To this, xylene cyanol was added as a dye for electrophoresis, and electrophoresis was performed with 2.5% agarose gel using TAE as a buffer at 100 V for 30 minutes to separate vector DNA pMD19 and insert unit DNA. (FIG. 13). The electrophoresed gel was divided with a razor, a portion thereof was stained with ethidium bromide, and the target DNA band was cut out from the unstained gel while confirming the positions of the target 55 equimolar mixed fragment bands. .
  • DNA was purified from the obtained gel fragment using MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN) as shown below.
  • Example 1 the standard deviation of the distribution of the total length of each base length of the unit DNA and the base length of the additional sequence linked to each unit DNA is 3691.4 ⁇ 6.6 bp. , ⁇ 0.18% with respect to the average total length.
  • Example 2 the standard deviation of the distribution of the total length of each base length of the unit DNA and the base length of the additional sequence linked to each unit DNA is 2828.2 ⁇ 4.5 bp, and the average The total length is ⁇ 0.16%.
  • Examples 1 and 2 since the standard deviation is thus small with respect to the average total length, there is an error in the number of moles of each unit DNA calculated based on the measurement result of the concentration of DNA in the solution. It is thought that it was less.
  • the ratio of the average base length of the additional sequence linked to each unit DNA to the average base length of the unit DNA is about 2.7 in Example 1 and about 27 in Example 2.
  • the integrated DNA is equally divided so that each base length is equal when the unit DNA design is divided by the number of types of unit DNA. Since the unit DNA was designed in this way, the length of each unit DNA was substantially the same because the non-pain sequence near the sequence at the position was used as a boundary. Therefore, in the size fraction after electrophoresis after the additional sequence is removed by the restriction enzyme, it appears as a band at substantially the same position, and unit DNA can be recovered by one size fraction, which improves working efficiency. Indicated.
  • Example 1 the restriction enzymes used for removal of additional sequences are classified into groups (3 types in Example 1 and 1 type in Example 2). Therefore, before the removal step, a solution containing two or more types of unit DNA can be mixed for each group, and it is not necessary to perform restriction enzyme treatment for each unit DNA.
  • the restriction enzyme treatment was completed in one round. That is, it was confirmed that this improves the efficiency of the production of the DNA ligated product. Moreover, even when using such a mixture, it was confirmed that a large number of unit DNAs can be linked because they are mixed in an approximately equimolar state as described above.
  • pGETS118-t0-Pr-SfiI-pBR was transformed into E. coli.
  • the plasmid obtained from this transformant is mainly the DNA of (A), but contains a small amount of multimer (multimer).
  • this plasmid was subjected to low melting point agarose gel electrophoresis.
  • the DNA of (A) was prepared by cutting out and purifying only the monomer plasmid DNA region from the gel by the DNA size fractionation according to 1.
  • the DNA of (B) was prepared by treating the DNA of (A) with the restriction enzyme BlpI (recognition site is (5′-GC / TNAGC-3 ′)).
  • the DNA in (C) is a tandem repeat linear multimeric plasmid DNA with a redundancy r> 1.
  • BlpI used when preparing the DNA of (B) above forms a non-palindromic 3-base overhang at the 5 ′ end. Therefore, the DNA of (B) was prepared by ligating the DNA of (B) with DNA ligase to prepare the DNA of (C), which is a linear multimeric plasmid DNA in which plasmid units are continuous in the same direction.
  • the DNA of (D) was prepared by treating the DNA of (A) with the restriction enzyme EcoRI (recognition site is (5′-G / AATTC-3 ′)).
  • the DNA of (E) is a linear multimeric plasmid DNA in which the DNA of (D) is linked in a random orientation, partially including a portion of redundancy r> 1.
  • EcoRI used when preparing the DNA of (D) above forms a palindromic 3-base overhang at the 5 ′ end.
  • plasmid DNA cleaved with EcoRI is ligated, it is possible to prepare multimeric plasmid DNA in which plasmid units are ligated in random orientations.
  • the DNA of (E) was prepared by ligating the DNA of (D) with a DNA ligase.
  • ⁇ Preparation of DNA of (F)> The DNA of (F) is cleaved with the restriction enzyme KasI that cleaves the DNA of (A) only at one position, dephosphorylated and then cleaved with BlpI in the vicinity thereof, and the DNA of (A) is converted to 1 It is an r ⁇ 1 linear quasi-monomer mixture obtained by cleaving with a restriction enzyme AfeI that cleaves only at a site, dephosphorylated, and then mixed with an equal amount of DNA cleaved with BlpI nearby. In any of the DNA fragments in the mixture of (F), the redundancy r is slightly less than 1.
  • the cutting sites of (B) and (D) are separated from each other.
  • the DNA of (H) is a mixture in which the DNAs of (B) and (D) are mixed without being linked so as to be equimolar.
  • the DNAs (C) and (E) are distributed in a wide range on the lane, so that the bands are difficult to distinguish.
  • N indicates the number of unit DNA fragments contained in one molecule of the ligated DNA fragment in the virtual ligation
  • L indicates the sequence of the protruding end on the left side of the ligation product expressed as an arbitrary natural number
  • R like “L” represents the value of the sequence of the protruding end on the right side of the ligation product expressed by an arbitrary natural number.
  • the simulation of ligation was performed as follows.
  • a random number j satisfying i ⁇ j is multiplied by a uniform random number between 0 and 1 generated by the RAND () method and m (described later). This was generated by rounding to an integer, thereby selecting an F j (N j , L j , R j ) fragment. Whether or not the two fragments can be linked is determined using the following discriminant. If they can be linked, the parameters of the fragments are changed as shown below.
  • the sort function of VBA command Excel2007 (Sort method), by performing the rearrangement of F i fragment as L i value is in descending order, F (0,0,0) fragment The total number of other Fi fragments was counted, and the total number was inserted as new m, and virtual ligation of the next cycle was performed.
  • Virtual ligation cycle there is no protruding pieces that are complementary to, and carried to the minimum fragment number m min can not perform any more virtual ligation.
  • the mmin value was obtained by the following calculation using information of the initial unit DNA fragment before the start of ligation.
  • ⁇ Ligation simulation> A hypothesis having a coefficient of variation (CV) set in increments of 1% in the range of 0 to 20% with an average number of DNA fragments of the same unit 640 in each integration scale up to 6 fragments, 13 fragments, 26 fragments, and 51 fragments.
  • the unit DNA fragment population was prepared as follows.
  • each temporary unit DNA fragment population was prepared by adding the average value of the number of fragments to the value obtained by multiplying (fragment average value * CV (%) / 100) by The random number population for each CV (%) values for each of the integrated scale, to prepare a separate 20 population, by the simulation for each random population, was carried out virtual ligation to m min.
  • FIG. 19 shows the distribution of the size of the initial unit DNA fragment incorporated into the ligation product.
  • (a) shows a graph for 6 fragment accumulation
  • (b) shows a graph for 13 fragment accumulation
  • (c) shows a graph for 26 fragments
  • (d) shows for 51 fragment accumulation. The graph of is shown.
  • the patterns of each bar graph in each redundancy (0 ⁇ r ⁇ 1, 1 ⁇ r ⁇ 2, 2 ⁇ r ⁇ 5, 5 ⁇ r ⁇ 10) are represented by N of each redundancy for each pattern.
  • the histogram of the number of molecules of the ligation product for each N value showed an index decreasing tendency as the N value increased as a whole, and at first glance showed a distribution close to a geometric distribution which is one type of discrete probability distribution.
  • this histogram shows a periodic structure with a period of the number of gene accumulations or one redundancy (6 in the case of 6-fragment accumulation), and in particular, the N value is an integral multiple of the gene accumulation scale. In the part corresponding to, the characteristic structure that no fragment appears was shown. This feature does not completely match the exponential distribution when considered as a geometric distribution or a continuous probability distribution.
  • each component distinguished by the remainder obtained by dividing N by the integration scale is linear from the molecular value obtained by logarithmic transformation of about three cycles.
  • the slope of the straight line obtained by approximation was determined as - ⁇ , and ⁇ was calculated from this value.
  • ⁇ was calculated from this value.
  • ⁇ (CV (%)) for each CV (%) was calculated from the reciprocal.
  • the ligation products are sampled at various reaction times. A qualitative analysis was performed on the 51 connected portions.
  • the average concentration of the unit DNA fragment used for ligation is about 0.2 fmol / ⁇ l.
  • T4 DNA ligase After adding T4 DNA ligase to the solution of the unit DNA fragment, 37 ° C., 0, 1.25, 2.5, 5 After 10, 20, 40, 80, 160, and 320 minutes, a part of each reaction solution is sampled, and DNA is designed to be amplified across the ligation part of two unit DNA fragments that are normally ligated.
  • a commercially available ⁇ phage genomic DNA (Toyobo) or an already constructed PCR primer set for quantitative PCR and a primer set for quantitative PCR designed so that only the inside of each unit DNA fragment is amplified.
  • the integrated plasmid was cleaved with a restriction enzyme, and the degree of progress of ligation of each fragment was examined using a dilution series of linearized DNA as an index. As a result, under these reaction conditions, the ligation was completed in about 10 minutes in any connected part, and the ligation was almost completely completed in the actual reaction time of 4 hours (240 minutes). Was confirmed.
  • a ligation simulation was performed. In this simulation, not only m min indicating a reaction rate of 100% but also 100 independent values for m values when ligation was possible at 95%, 96%, 97%, 98%, and 99%.
  • a random number group was prepared, and the reaction was continued to each designated m value.
  • the obtained 100 ligation product distributions were integrated, and the length of the DNA of each virtual ligation product of each unit DNA fragment was determined in bp using parameters of F (N, L, R).
  • the actual molecular weight distribution of the DNA is 0.5 ⁇ TBE, 5 V / cm, 30 sec using a CHEF type pulse field gel electrophoresis apparatus (manufactured by Biocraft). Electrophoresis was performed for 16 hours under periodic electrophoresis conditions. A photograph of the electrophoresis is shown in FIG.
  • the DNA density distribution of the obtained electrophoretic photograph was obtained by NIHimage software, and the resulting DNA distribution map for each ligation efficiency obtained by the simulation was compared with the obtained figure for comparison.
  • the result is shown in FIG. According to FIG. 24, the molecular weight distribution of the DNA by electrophoresis substantially coincided with the expected DNA distribution diagram in the case of ligation efficiency of 98% -100%, and in particular, the ligation efficiency where the maximum molecular weight showing the maximum concentration is 98%. And a good match.
  • the simulation results showed that almost all ligations were completed in a 4-hour ligation reaction, and although approximately 2% misligation could occur, the entire ligation state could be reproduced.

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Abstract

　複数の単位ＤＮＡのモル数がより揃えられた単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法を提供する。　単位ＤＮＡ組成物の調製方法は、付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、各々の溶液の準備後、単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する。ＤＮＡ連結体の作製方法は、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、ベクターＤＮＡを準備する工程と、調製後の溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、除去工程後、ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程とを有する。

Description

単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法
　本発明は、単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法に関する。
　近年、ゲノムレベルの長鎖ＤＮＡの構築等を目的とする、ＤＮＡ合成技術の開発が盛んに行われている。ＤＮＡの合成技術としては、化学合成ＤＮＡやＰＣＲ法により増幅した単位ＤＮＡを集積する技術が知られている。しかし、化学合成ＤＮＡの合成過程や、ＰＣＲ法においては、合成されたＤＮＡにランダムに変異が導入されることが知られている。そのため、遺伝子集積においては、最終段階までのいずれかの段階で必ずＤＮＡの配列を確認し、望ましい配列のものを選択する過程が必要となる。
　塩基配列の確認のためには、通常、サンガー法を用いた自動蛍光シーケンサーによって塩基配列決定をするが、この方法によると、１回の塩基配列決定で連続８００塩基程度の長さ塩基配列を確認することが可能である。化学合成やＰＣＲ法により合成した単位ＤＮＡを遺伝子集積前に塩基配列に確認する場合、塩基配列決定の回数が少なければ、時間的、金銭的コストを削減できることになる。そのため、遺伝子集積に用いる化学合成やＰＣＲ法により合成した単位ＤＮＡは、短い方が好ましい。
　しかしながら、遺伝子集積に用いる単位ＤＮＡが短いと、多くの単位ＤＮＡを集積する必要がある。
　現在、複数の単位ＤＮＡを集積する方法の１つとして、枯草菌のプラスミド形質転換系を利用した遺伝子集積法（ＯＧＡＢ法）が知られている。例えば、特許文献１には、ＯＧＡＢ法を用いた枯草菌細胞形質転換用プラスミドＤＮＡの作製方法が開示されている。
　ＯＧＡＢ法では、プラスミド分子間で相同組み換えすることにより１つのＤＮＡ分子中に複数のプラスミドの単位が存在する、いわゆるマルチマープラスミドを用いる。ＯＧＡＢ法によると、形質転換用のＤＮＡ分子は、環状のＤＮＡである必要はなく、同じ方向にプラスミドの１単位と、集積に用いる各単位ＤＮＡとが繰り返し現れるようにタンデムリピート状になっていれば、プラスミドの形質転換は可能である。
　ＯＧＡＢ法では、上記のとおり、タンデムリピート状にライゲーションされたＤＮＡ分子を調製する必要があるため、複数の単位ＤＮＡを使用する場合、これらとプラスミドとを連結する必要がある。しかし、単位ＤＮＡの種類が多くなるほど、これらを連結してタンデムリピートを作製するのが困難になり、多数の単位ＤＮＡを連結させるためには、ライゲーション時の各単位ＤＮＡのモル比を１に近づけることが望ましい。
特許第４４７９１９９号公報
　しかしながら、現実に各単位ＤＮＡのモル数を精密に制御することは困難である。これは、ＳＹＢＲＧｅｅｎＩ等の蛍光の二本鎖ＤＮＡインターカレーターを利用したＤＮＡ測定法では、測定時の蛍光物質の退色等により分子数を±２０％程度の再現性でしか測定することができないことがその一因である。また、これらの測定方法は、ＤＮＡの単位体積当たりの重量を測定するものであるが、ＯＧＡＢ法では、単位体積あたりのモル数を基準に単位ＤＮＡ量を算出するため、上記測定方法による測定値のＤＮＡの重量からモル濃度への変換が必要となる。そのため、単位ＤＮＡ分子の長さの分布が広い場合には、同じモル数のＤＮＡ分子であっても、重量が単位ＤＮＡの長さに比例し、特に重量の測定値が数倍以上異なる場合は、測定値に基づいて算出される値に大きな誤差が含まれる場合が多い。上記特許文献１の方法においても、各単位ＤＮＡのモル比が１となるように調整することが試みているが、各単位ＤＮＡの長さの分布が広いため、厳密にモル比を制御することができない。
　本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、複数の単位ＤＮＡのモル数がより揃えられた単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、各単位ＤＮＡのそれぞれに付加配列が連結した状態で、単位ＤＮＡのモル数を測定することによって、測定結果における誤差が少なくなることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、より具体的には以下のようなものを提供する。
　（１）付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、
　前記各々の溶液の準備後、前記単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
　（２）前記付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有し、前記付加配列が複製開始点を有するプラスミドＤＮＡ配列である（１）記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
　（３）前記単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差が、平均の前記合計長さに対して±２０％以内である（１）又は（２）記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
　（４）前記各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、前記単位ＤＮＡの平均塩基長の２倍以上である、（１）から（３）いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
　（５）前記単位ＤＮＡの各々の長さが１６００ｂｐ以下である（１）から（４）いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
　（６）前記単位ＤＮＡは、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いられるものであり、
　前記単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、前記集積ＤＮＡの配列の塩基長を前記単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位ＤＮＡを設計する工程を含む、（１）から（５）いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
 
　（７）宿主微生物中で有効な複製開始点を含むベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる集積ＤＮＡユニットを、１を超えて含む微生物細胞形質転換用ＤＮＡ連結体の作製方法であって、
　（１）から（６）いずれかに記載の方法によって、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、
　前記ベクターＤＮＡを準備する工程と、
　調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
　前記除去工程後、前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有し、
　前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
　前記集積ＤＮＡは、前記各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる、ＤＮＡ連結体の作製方法。
　（８）集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される標的連結数のＤＮＡ断片の収率と、該ＤＮＡ断片の濃度の変動係数との関係式に基づいて、前記連結工程における前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡの濃度の変動係数を調節する工程を含む、（７）記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
　（９）前記制限酵素は、タイプＩＩ制限酵素である（７）又は（８）記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
　（１０）前記除去工程の前に、調製後の単位ＤＮＡを含む溶液のうち、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合する工程を更に有する、（７）から（９）いずれかに記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
　（１１）前記除去工程後、前記連結工程の前に、前記制限酵素を失活させる工程を更に有する、（７）から（１０）いずれかに記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
　（１２）前記微生物が枯草菌である（７）から（１１）いずれか記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
　本発明によれば、複数の単位ＤＮＡのモル数がより揃えられた単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法を提供することができる。
本発明の一実施例に係るベクターＤＮＡを示す図である。 本発明の実施例１における単位ＤＮＡのうち、第１０断片の同義語コドン変異体の構造を示す図である。 本発明の実施例１における単位ＤＮＡのうち、第０１断片又は第２１断片を含む粗プラスミドと、該粗プラスミドの精製後の高純度プラスミドの制限酵素処理後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例１における精製後の単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で処理した後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例１における精製後の単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で制限酵素処理し、各グループを統合した後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例１における単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で処理し、各グループを統合した後の、サイズ分画前後の、各単位ＤＮＡの分子数の分布を示す図である。 本発明の実施例１における単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で処理し、各グループを統合した後の、サイズ分画前後の、各単位ＤＮＡの分子数の変化率を示す図である。 本発明の実施例１における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例１における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後のＤＮＡ連結体を枯草菌に形質転換した後に、該形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例１における、形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真の結果から、目的とする集積ＤＮＡを含む枯草菌のクローンを選別し、制限酵素処理を行った後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例１における、選別された集積ＤＮＡがラムダファージＤＮＡのプラークを形成したことを示す図である。 本発明の実施例１における、選別された集積ＤＮＡのゲノムと、野生型ラムダファージをＡｖａＩで制限酵素処理を行った後の写真を示す図である。 本発明の実施例２における、精製後の単位ＤＮＡを含むプラスミドをＡａｒＩにより一括で制限酵素処理した後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例２における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例２における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後のＤＮＡ連結体を枯草菌に形質転換した後に、該形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真を示す図である。 本発明の実施例２における、形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真の結果から、目的とする集積ＤＮＡを含む枯草菌のクローンを選別し、制限酵素処理を行った後の電気泳動の写真を示す図である。 試験例１において用いた（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡの電気泳動の写真を示す図である。 試験例１において用いた（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡが形質転換された枯草菌コンピテントセルの形質転換体出現数を示すグラフである。 シミュレーション１の各遺伝子集積規模における、単位ＤＮＡ断片濃度のバラつきＣＶ（％）と、各単位ＤＮＡ断片の相対量の関係を示すグラフである。（ａ）は、６断片集積についてのグラフを示し、（ｂ）は、１３断片集積についてのグラフを示し、（ｃ）は２６断片についてのグラフを示し、（ｄ）は５１断片集積についてのグラフを示す。 シミュレーション１の６断片集積において、ＣＶ＝２０％である場合における、Ｎ（１ライゲーション産物に含まれる単位ＤＮＡの数）と、ライゲーション産物分子数との関係を示すグラフである。 (ａ)は、シミュレーション１における指数分布曲線へのフィッティングから導き出した、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきＣＶ（％）についてのλ関数のグラフであり、（ｂ）は、仮想ライゲーション産物のＮ値の平均値から求めた、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきＣＶ（％）についてのλ関数のグラフである。 シミュレーション１におけるλファージゲノム再構成の実験において得られた集積体のうち、＃１、＃２、＃５、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１についてのミスライゲーションサイトを示す図である。 シミュレーション１における、λファージゲノムの再構成の実験におけるＣＶ＝６．６％の断片数のバラつきの単位ＤＮＡ５１断片のライゲーション産物についてのパルスフィールドゲル電気泳動の写真を示す図である。 シミュレーション１における、実際のライゲーションした効率と、ライゲーションシミュレーションによるライゲーション効率とを比較したグラフである。（ａ）は、ライゲーション可能数９５％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｂ）は、ライゲーション可能数９６％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｃ）は、ライゲーション可能数９７％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｄ）は、ライゲーション可能数９８％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｅ）は、ライゲーション可能数９９％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｆ）は、ライゲーション可能数１００％のシミュレーションと比較したグラフを、それぞれ示す。 一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（－０．０５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて得られた、シミュレーション１の各遺伝子集積規模における、単位ＤＮＡ濃度断片のバラつきＣＶ（％）と、各単位ＤＮＡ断片の相対量の関係を示すグラフである。 一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（－０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて得られた、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきと１ライゲーション産物の平均単位ＤＮＡ断片数との関係を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　＜単位ＤＮＡ組成物の調製方法＞
　本発明の単位ＤＮＡ組成物の調製方法は、付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、各々の溶液の準備後、単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程とを有する。本明細書において、「単位ＤＮＡ」の種類は、それぞれの塩基配列毎に区別する。また、「単位ＤＮＡ」には、制限酵素認識部位を付加したものと、付加していないもののいずれも含むものとする。
　本発明においては、単位ＤＮＡを含む溶液において、それぞれの単位ＤＮＡの濃度を測定する際に、それぞれの単位ＤＮＡには、付加配列が連結されている。すると、付加配列が連結されている分、溶液の濃度の測定時においては塩基配列の長さの分布が小さくなる。そのため、測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなる。よって、この測定結果に基づいて各々の溶液を分取し、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一となるように調整することによって、各々の溶液中のモル比を１に近づけやすい。なお、上記測定する「溶液中の単位ＤＮＡの濃度」とは、単位ＤＮＡのモル濃度を指す。溶液中の単位ＤＮＡのモル濃度を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、溶液中の単位ＤＮＡの質量％を測定し、測定された溶液中の単位ＤＮＡの質量％の数値から、溶液中の単位ＤＮＡのモル濃度を算出してもよい。溶液中の単位ＤＮＡのモル濃度を測定する方法は、ＤＮＡ重量濃度を±２０％以内の正確さで測定可能な手段を用いて測定するのが好ましく、より具体的には、微量分光光度計による紫外線吸収スペクトルを用いるのが好ましい。
　付加配列が連結された単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、特に限定されず、例えば、単位ＤＮＡを準備し、その後に付加配列を単位ＤＮＡに連結することによって行ってよい。
　単位ＤＮＡの準備は、予め合成されたものを用いることにより行ってもよく、また、単位ＤＮＡを作製することによって行ってもよい。単位ＤＮＡは従来の公知の方法によって作製でき、例えば、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）や化学合成により作製することができる。また、単位ＤＮＡに制限酵素認識配列を付加する場合は、例えば、鋳型ＤＮＡ上の塩基配列に各突出末端を生成する制限酵素認識配列を付加したプライマーを用い、ＰＣＲにより作製するか、あるいは、予め末端に任意の突出配列を生成するように制限酵素認識配列を組み込んで化学合成を行うことによって作製することができる。作製した単位ＤＮＡは、従来の公知の方法により塩基配列を確認することができ、例えば、単位ＤＮＡをプラスミドに組みこみ、サンガー法を用いた自動蛍光シーケンサーによって塩基配列決定をすることによって確認することができる。
　付加配列は、特に限定されず、直鎖状ＤＮＡであってもよく、環状のプラスミドであってもよい。環状のプラスミドＤＮＡ配列を使用すると、付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有するため、例えば、大腸菌等の宿主に形質転換することができる。
　プラスミドＤＮＡの種類は、特に限定されないが、形質転換した宿主中でプラスミドＤＮＡを複製するためには、プラスミドＤＮＡ配列が複製開始点を有するのが好ましい。具体的には、大腸菌の高コピープラスミドベクターであるｐＵＣ１９、又はその派生プラスミドが好ましい。また、付加配列が連結されたＤＮＡ間の長さの分布を小さくし、より単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づけることができる点で、全ての単位ＤＮＡが同一種類のプラスミドベクターにクローニングされていることが好ましい。
　単位ＤＮＡへの付加配列の連結は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションにより行ってもよく、プラスミドＤＮＡに連結する場合は、ＴＡクローニング法により行ってもよい。
　単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、特に限定されないが、少ない方が、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなるので、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いにより同一近づけることができる。具体的には、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、平均の合計長さに対して±２０％以内であるのが好ましく、±１５％以内であるのがより好ましく、±１０％以内であるのがより一層好ましく、±５％以内であるのが更に好ましく、±１％以内であるのがなお更に好ましく、±０．５％以内であるのが最も好ましい。
　各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長は、特に限定されないが、単位ＤＮＡの平均塩基長と比較して長い方が、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなるので、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いにより同一近づけることができる。具体的には、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長は、単位ＤＮＡの平均塩基長に対して、２倍以上であるのが好ましく、５倍以上であるのが更に好ましく、１０倍以上であるのが更に好ましく、２０倍以上であるのが最も好ましい。また、単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が長すぎると、付加配列が連結された単位ＤＮＡの操作を行いにくくなる。そのため、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長は、単位ＤＮＡの平均塩基長に対して、１００００倍以下（具体的には、５０００倍以下、３０００倍以下、１０００倍以下、５００以下、２５０以下、１００倍以下等）等であるのが好ましい。
　単位ＤＮＡの各々の長さは、特に限定されないが、単位ＤＮＡの塩基配列を確認する際に、塩基配列決定の回数が少ない方が、時間的、金銭的コストを削減できることになるのが好ましい。そのため、単位ＤＮＡの各々の長さは、短い方が好ましく、具体的には、１６００ｂｐ以下であるのが好ましく、１２００ｂｐ以下であるのが更に好ましい。特に、サンガー法を用いた自動蛍光シーケンサーによって塩基配列決定をする場合、１回の塩基配列決定で連続８００塩基程度の長さ塩基配列を確認することが可能であるので、単位ＤＮＡの各々の長さは、８００ｂｐ以下（具体的には、６００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、１００ｂｐ以下等）であるのが最も好ましい。このように、単位ＤＮＡの各々の長さが短いと、これを後述するＤＮＡ連結体の作製に用いる場合、多数の単位ＤＮＡを必要とする。しかし、本発明の方法で調製した単位ＤＮＡを用いると、後述のとおり、多数の単位ＤＮＡの連結が可能である。また、単位ＤＮＡの各々の長さが短すぎると、単位ＤＮＡ数が多くなり、作業効率が落ちる。そのため、単位ＤＮＡの各々の長さは、２０ｂｐ以上であるのが好ましく、３０ｂｐ以上であるのがより好ましく、５０ｂｐ以上であるのが更に好ましい。
　本発明の調製方法により、単位ＤＮＡ組成物の用途は、特に限定されないが、本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物は、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いることができる。本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物を用い、後述の方法によりＤＮＡ連結体を作製した場合、多くの単位ＤＮＡ（例えば５０種以上）を連結することができる。これは、本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物において、各々の単位ＤＮＡのモル数がより正確に同一に近いためであると考えられる。
　本発明において、単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、単位ＤＮＡを設計する工程を含んでもよい。単位ＤＮＡの設計は、特に限定されないが、例えば、単位ＤＮＡ組成物を、集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いる場合、集積ＤＮＡの配列の塩基長を単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として行ってもよい。このように単位ＤＮＡの設計を行った場合、それぞれの単位ＤＮＡの長さが略同一の長さとなる。そのため、後述のＤＮＡ連結体の作製に用いる場合、制限酵素により付加配列を除去した後の電気泳動後のサイズ分画において、略同一の位置のバンドとして現れるため、１回のサイズ分画で単位ＤＮＡを回収でき、作業効率が向上する点で好ましい。「集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍」は、特に限定されないが、塩基配列の長さから適宜設定してもよい。例えば、各々の単位ＤＮＡの塩基長が１０００ｂｐである場合、「集積ＤＮＡを等分した位置」から、１００ｂｐ以内（具体的には、９０ｂｐ以内、８０ｂｐ以内、７０ｂｐ以内、６０ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、３０ｂｐ以内、２０ｂｐ以内、１０ｂｐ以内、５ｂｐ以内等）であってもよい。
　また、上記のとおりに単位ＤＮＡの設計を行う場合、目的とする集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体の作製を行う場合、単位ＤＮＡの端部に非回文配列（パリンドローム配列でない配列）を有するように設計するのが好ましい。このように設計された単位ＤＮＡは、その非回文配列を突出配列にした場合、後述の互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造となる。
　＜ＤＮＡ連結体の作製方法＞
　本発明は、ＤＮＡ連結体の作製方法も包含する。本発明のＤＮＡ連結体の作製方法は、上述の方法による、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、ベクターＤＮＡを準備する工程と、調製後の溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、除去工程後、ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有する。
　ＤＮＡ連結体は、集積ＤＮＡユニットを１を超えて含み、微生物細胞形質転換用である。集積ＤＮＡユニットは、ベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる。ＤＮＡ連結体の集積ＤＮＡユニット数は、１超であれば特に限定されないが、形質転換効率を上げるためには、好ましくは１．５以上であり、より好ましくは２以上であり、更に好ましくは３以上であり、最も好ましくは４以上である。
　ベクターＤＮＡは、形質転換の対象となる宿主微生物中で有効な複製開始点を含む。ベクターＤＮＡは、ＤＮＡ連結体が形質転換されうる微生物中で、ＤＮＡの複製を可能とする配列を有するものであれば、特に限定されず、例えば、後述するＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌（枯草菌）中で有効な複製開始点の配列が挙げられる。枯草菌中で有効な複製開始点の配列は、特に限定されないが、例えば、θ型の複製機構を有するものとしては、ｐＴＢ１９（Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ．　１３０，　１３９９－１４０８．　（１９８４））やｐＬＳ３２（Ｔａｎａｋａ，　Ｔ　ａｎｄ　Ｏｇｒａ，　Ｍ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４２２，　２４３－２４６．　（１９９８））、ｐＡＭβ１（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ，　Ｔ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　８７，　７９－９０．　（１９９０））等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。
　集積ＤＮＡは、上述の各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる。本発明におけるＤＮＡとは、クローニングの対象となるＤＮＡであり、その種類や大きさは特に限定されない。具体的には、原核生物、真核生物、ウイルス等の天然由来配列、人工設計配列等であってよい。本発明の方法においては、上述のとおり、プラスミド上に多数の単位ＤＮＡを連結できるので、塩基長の長いＤＮＡを用いるのが好ましい。塩基長の長いＤＮＡとしては、例えば、一連の代謝経路を構成する遺伝子群や、ファージ等のゲノムＤＮＡ全体又はゲノムＤＮＡの一部分等が挙げられる。
　集積ＤＮＡユニットは、ベクターＤＮＡや集積ＤＮＡ以外にも、必要に応じて適当な塩基配列を含んでもよく、含まなくてもよい。例えば、集積ＤＮＡに含まれる遺伝子を発現するためのプラスミドを作製する場合、プロモーター、オペレーター、アクチベーター、ターミネーター等の転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。枯草菌を宿所とした場合のプロモーターとしては、具体的には、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｓ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Ｙａｎｓｕｒａ，　Ｄ．　ａｎｄ　Ｈｅｎｎｅｒ，　Ｄ．　Ｊ．　Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ，　ＵＳＡ　８１，　４３９－４４３．（１９８４．））、あるいはＰｒプロモーター（Ｉｔａｙａ，　Ｍ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６３，　６０２－６０４．　（１９９９））等が挙げられる。
　ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡは、互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する。本明細書において、「互いにその順序を保ったまま連結する」とは、集積ＤＮＡユニット上で隣り合う配列を有する単位ＤＮＡ又はベクターＤＮＡとがその順序及び向きを保って結合することをいう。また、「繰り返し連結する」とは、５’末端の塩基配列を有する単位ＤＮＡ又はベクターＤＮＡの５’末端と、３’末端の塩基配列を有する単位ＤＮＡ又はベクターＤＮＡの３’末端が結合することをいう。このような単位ＤＮＡとして、具体的には、例えば、断片の突出末端の塩基配列の相補性を利用して、お互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得るような末端を有するものが挙げられる。この突出の構造は、非回分配列であれば、５’末端突出、３’末端突出の形状の違いも含めて、特に制限はない。
　上記突出末端は、単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程によって、作製されるのが好ましい。したがって、本発明の方法によりＤＮＡ連結体を作製する場合、単位ＤＮＡは、該制限酵素によって付加配列を除去するために、制限酵素認識配列を有するのが好ましい。ベクターＤＮＡの準備は、例えば、ベクターＤＮＡが、単位ＤＮＡとお互いに順序を保ったまま繰り返し連結するための突出末端を設けるように、制限酵素処理を行うことよってすることができる。
　上述の付加配列の除去に用いる制限酵素は、特に限定されないが、好ましくはタイプＩＩ制限酵素、より好ましくはＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＦｏｋＩ、ＳｆａＮＩ等の、認識配列の外側の定まった長さ離れた場所に任意の配列の突出末端を作製可能であるタイプＩＩＳ制限酵素である。タイプＩＩＳ制限酵素を用いると、単位ＤＮＡの突出末端が各連結部位で異なるものにできるため、その連結する順序が保たれる。また、ベクターＤＮＡの準備においても、単位ＤＮＡの準備と同様に、単位ＤＮＡとお互いに順序を保ったまま繰り返し連結するための突出末端を設けるように、タイプＩＩＳ制限酵素を用いて準備するのが好ましい。
　各単位ＤＮＡについて、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類毎にグループに分類した場合、除去工程の前に、各グループ毎に、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合することができる。これにより、単位ＤＮＡ毎に制限酵素処理を行う必要がなく、制限酵素のグループ毎に一回で制限酵素処理ができ、更に、例えば電気泳動により単位ＤＮＡの分画を行う場合、一回の分画で単位ＤＮＡを回収可能であるので、作業の効率が向上する。また、複数の単位ＤＮＡのグループがある場合、グループ毎に分画を行い、単位ＤＮＡを回収した際に、グループ間で回収量に誤差が生じうるため、単位ＤＮＡ間で揃えられたモル数に誤差が生じうる。そのため、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類毎にグループに分類した場合、そのグループは少ない方が好ましく、すなわち、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類は少ない方が好ましい。よって、使用する制限酵素の種類は、好ましくは５種以下であり、より好ましくは３種以下であり、最も好ましくは１種である。すなわち、使用する制限酵素が一種であれば、全ての単位ＤＮＡを含む溶液を混合することができるので、作業の効率が飛躍的に向上し、更に、単位ＤＮＡ間で揃えられたモル数に誤差が生じにくい。なお、制限酵素は、略等モルの状態で混合されるので、このように混合したものを用いても、多数の単位ＤＮＡが連結可能である。
　単位ＤＮＡにタイプＩＩＳ制限酵素認識配列を付加する場合、各単位ＤＮＡが有する配列を認識しないように、単位ＤＮＡの制限酵素認識配列の設計を行う。すなわち、あるタイプＩＩＳ制限酵素を用いようとした場合、そのタイプＩＩＳ制限酵素が一方の単位ＤＮＡの配列を認識しなくても、他方の単位ＤＮＡの配列を認識する場合、該他方の単位ＤＮＡについてはそのタイプＩＩＳ制限酵素とは異なるタイプＩＩＳ制限酵素を使用するように、それぞれの単位ＤＮＡの制限酵素認識配列の設計を行う。このように設計した場合、単位ＤＮＡ毎に使用するタイプＩＩＳ制限酵素が異なるが、このタイプＩＩＳ制限酵素の種類によって、単位ＤＮＡを上記グループの分類に使用できる。各単位ＤＮＡのいずれの配列も認識しないタイプＩＩＳ制限酵素があれば、その制限酵素認識配列を付加して単位ＤＮＡを設計することにより、１つのタイプＩＩＳ制限酵素によってまとめて単位ＤＮＡから付加配列を除去できる。
　ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程は、特に限定されないが、制限酵素処理を行った後に、制限酵素処理後の付加配列と単位ＤＮＡとを分画し、分画した単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとＤＮＡリガーゼ等を用いて連結（ライゲーション）することにより行うことができる。これにより、微生物形質転換用ＤＮＡ連結体を作製することができる。なお、連結工程における単位ＤＮＡは、制限酵素認識配列が付加されていないものである。
　付加配列と単位ＤＮＡとの分画法は、特に限定されないが、制限酵素処理後の各単位ＤＮＡのモル比率の関係が崩れない方法であるのが好ましく、具体的には、アガロースゲル電気泳動によるのが好ましい。
　単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとの連結方法は、特に限定されないが、ポリエチレングリコールと塩の存在下で行うことが好ましい。塩としては、より好ましくは、１価のアルカリ金属の塩である。より具体的には、１０％のポリエチレングリコール６０００と２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むライゲーション反応液で行うのが更に好ましい。また、各単位ＤＮＡのライゲーション反応液中の濃度は、特に限定されない、好ましくは、各々１ｆｍｏｌ／μｌ以上の濃度であるのが好ましい。ライゲーションの反応温度、時間は、特に限定されないが、好ましくは、３７℃で３０分以上である。なお、ライゲーション反応液中のベクターＤＮＡは、反応前にベクターＤＮＡを含む溶液のＤＮＡ濃度を測定し、単位ＤＮＡと等モルになるように調整するのが好ましい。
　本発明に係るＤＮＡ連結体の調製方法は、集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される標的連結数のＤＮＡ断片の収率と、該ＤＮＡ断片の濃度の変動係数（以下、本明細書において「変動係数１」という）との関係式（以下、本明細書において「関係式」という）に基づいて、連結工程におけるベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡの濃度の変動係数（以下、本明細書において「変動係数２」という）を調節する工程を含んでもよく、含まなくてもよいが、含むことが好ましい。なお、変動係数１は、関係式において便宜的に使用される変動係数であり、変動係数２は、実際の連結工程における単位ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの濃度の変動係数である。この調節工程を含むことにより、連結工程において、所望の数の単位ＤＮＡの数（例えば、５０断片数の単位ＤＮＡ）を連結させることを試みる場合に、変動係数２を、上記関係式が示す範囲に調節することで、その連結を達成することができる。
　標的連結数は、連結工程において連結させたい所望のＤＮＡ断片の数を指し、より具体的には、連結集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される。「標的連結数のＤＮＡ断片の収率」とは、連結に使用されるＤＮＡの全断片数に対する、連結後の集積ＤＮＡユニットを構成するＤＮＡの断片数の割合を意味する。
　本発明に係る関係式は、標的連結数のＤＮＡ断片の収率と変動係数１との関係を示した式であり、例えば、コンピュータによるライゲーションシミュレーションから求めた式を使用することができる。より具体的には、関係式は、例えば変動係数１を０～２０％の１％毎に変化させた単位ＤＮＡ断片集団（例えば、１０～３０集団）において、ライゲーションシミュレーションを行い、ＤＮＡ連結体の単位ＤＮＡ断片数の分布（例えば、指数分布）を調べ、この分布に対するフィッティングカーブを作製し、そのフィッティングカーブを用いて、設定することができる。具体的なライゲーションシミュレーションに用いるツールとしては、特に限定されず、従来の公知の手段を用いることができるが、例えば、表計算ソフトＥｘｃｅｌ（登録商標）２００７のＶＢＡ（Ｖｉｓｕａｌ　Ｂａｓｉｃ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いることができ、これを用いてプロミングを行い、所要のアルゴリズムを設定することによって、シミュレーションを行うことができる。また、フィッテイングカーブは、例えば表計算ソフトＥｘｃｅｌ（登録商標）２００７ソフトウェアの指数近似曲線機能により作製することができる。関係式に基づく変動係数２の調整は、例えば、関係式を設計した後、所望のＤＮＡ断片の収率を関係式に代入し、連結時のＤＮＡ断片が算出された変動係数１になるように、連結前の各工程における操作を調整することによって行うことができる。その調整方法は、特に限定されないが、例えば、ベクターＤＮＡを準備する工程、単位ＤＮＡを調製する工程、ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程等の各工程において、ベクターＤＮＡ又は各単位ＤＮＡの濃度を測定する場合、その測定に使用する測定機器（分光光度計、分光蛍光光度計、リアルタイムＰＣＲ装置等）を選択する際に、変動係数２が所望の変動係数となるように、予め測定誤差が判明している測定機器を選択してもよい。
　変動係数２は、特に限定されないが、連結される際の単位ＤＮＡの濃度の誤差が少ない方が、より多くの単位ＤＮＡを連結することができる。このことから、変動係数２は、２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、８％以下であることがより一層好ましく、５％以下であることが最も好ましい。
　本発明のＤＮＡ連結体の調製方法は、除去工程後、連結工程の前に、制限酵素を失活させる工程を更に有してもよい。単位ＤＮＡ内部に、他の単位ＤＮＡの付加配列の切り離しに用いる制限酵素切断部位が存在すると、制限酵素失活前においては、付加配列を持つ単位ＤＮＡ集団を混合することが困難な関係にある。そのため、これらを統合することで一括して単位ＤＮＡの分画をすることができない。しかし、制限酵素を失活させることにより、失活後に、付加配列を持つ単位ＤＮＡ集団を統合することが可能であるため、一括して単位ＤＮＡの分画が可能である。これにより、連結工程の際に、より多くの集積ＤＮＡユニット含むＤＮＡ連結体を作製しやすくなり、結果として、枯草菌の形質転換を行いやすくなる。制限酵素の失活は、従来の公知の方法に行うことができ、例えば、フェノール・クロロフォルム処理により行うことができる。
　形質転換の対象となる宿主微生物としては、自然形質転換能を有するものであれば、特に限定されない。自然形質転換能としては、例えば、ＤＮＡを取り込む際に一本鎖ＤＮＡに処理して取り込むもの等が挙げられる。具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ属等が挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）等が挙げられる。このうち最も好ましい微生物としては、自然形質転換能及び組換え能に優れた枯草菌が挙げられる。
　本発明の方法により作製したＤＮＡ連結体は、微生物細胞の形質転換に使用することができるが、形質転換の対象とする微生物をコンピテントとする方法は、それぞれの微生物に適した公知の方法を選択することができる。具体的には、例えば、枯草菌の場合には、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｕ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，　Ｊ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　８１，　７４１－７４６（１９６１）に記載の方法を用いることが好ましい。また、形質転換の方法もそれぞれの微生物に適した公知の方法を用いることができる。コンピテント細胞に与えるライゲーション産物の液量も特に制限はない。好ましくは、コンピテント細胞培養液に対し、１／２０の量から等量であり、より好ましくは、半量である。形質転換体からプラスミドを精製する方法としても公知の方法を用いることができる。
　形質転換体から精製したプラスミドが集積ＤＮＡを有していることは、制限酵素切断により発生する断片のサイズパターンや、ＰＣＲ法、塩基配列決定法により確認することができる。また、挿入ＤＮＡが物質生産等の機能を有する場合は、その機能を検出することにより確認することが可能である。
　以下に示す実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の一例を示すものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
　（材料）
　形質転換の対象となる微生物細胞として枯草菌を使用した。枯草菌としては、ＲＭ１２５株（Ｕｏｚｕｍｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｉ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　１５２，　６５－６９（１９７７））と、その派生株のＢＵＳＹ９７９７株を用いた。枯草菌で複製可能なベクターＤＮＡとして、ｐＧＥＴ１１８（Ｋａｎｅｋｏ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３１，　ｅ１１２　（２００３））を用い、後述のとおりに構築したｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ－ｐＢＲ（配列番号１を参照）、ｐＧＥＴＳ１５１－ｐＢＲ（配列番号２を参照）を使用した。集積ＤＮＡとしては、ラムダファージＤＮＡ（東洋紡社製）（配列番号３を参照）と、後述するメバロン酸経路人工オペロン（配列番号４を参照）を用いた。単位ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを有する大腸菌の選択には、抗生物質カルベニシリン（和光純薬工業社）を用いた。枯草菌の選択には、抗生物質テトラサイクリン（シグマ社）を用いた。タイプＩＩＳ制限酵素は、ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）、ＢｂｓＩ（ＮＥＢ社）、ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ社）、ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）を用いた。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅは、タカラバイオ社製のものを使用した。大腸菌のプラスミド構築用の一般的なライゲーションには、Ｔａｋａｒａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｍｉｇｈｔｙ）（タカラバイオ社）を用いた。単位ＤＮＡ調製用のＰＣＲ反応には、東洋紡社製のＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。プラスミドにクローニングされたＤＮＡの塩基配列決定のためのコロニーＰＣＲには、タカラバイオ社製のＥｘ－Ｔａｑ　ＨＳを用いた。単位ＤＮＡを組み込む付加配列であるプラスミドＤＮＡとしては、ｐＭＤ－１９（ｓｉｍｐｌｅ）（タカラバイオ社）を用いた。環状プラスミド精製用酵素Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓａｆｅは、ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製のものを使用した。電気泳動用アガロースゲルは、ＤＮＡ電気泳動用の低融点アガロースゲルである２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ａｇａｒｏｓｅ（シグマ社）、又はＵｌｔｒａＰｕｒｅ　Ａｇａｒｏｓｅ（インビトロジェン社）を使用した。制限酵素の失活には、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール　２５：２４：１と、ＴＥ飽和フェノール（８－キノリノール含有）は、ナカライテスク社製のものを使用した。ラムダターミアーゼは、ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製のものを使用した。ラムダファージのパッケージングには、アジレント・テクノロジーズ社のＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｐｌｕｓ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔを用いた。リゾチームは和光純薬工業社製のものを使用した。ＬＢ培地の培地成分及び寒天には、ベクトンディッキントン社製のものを使用した。ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｓ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）は、和光純薬工業社製のものを使用した。上記以外の他の全ての培地成分及び生化学試薬は、和光純薬工業社製のものを使用した。特記以外のプラスミドの構築には、大腸菌ＤＨ５α株、ＪＭ１０９株又はＴＯＰ１０株のいずれかを使用した。構築したプラスミドの大腸菌からの少量精製には、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用い、大量精製には、同社のＱＩＡｆｉｌｔｅｒ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔを用いた。酵素反応液からのＤＮＡのクリーンアップには、キアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔ、又はキアゲン社のＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いた。通常のアガロースゲル電気泳動で分離して得られたゲルブロックを精製する場合は、キアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いた。超微量分光光度計は、Ｔｈｅｒｍｏ社のｎａｎｏ－ｄｒｏｐ　２０００を用いた。塩基配列決定には、アプライドバイオシステムズ社製の蛍光自動シーケンサーの３１３０ｘｌジェネティックアナライザーを用いた。他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９））にしたがって行った。枯草菌の形質転換とプラスミド抽出は、既法のとおり行った（Ｔｓｕｇｅ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３１，　ｅ１３３．（２００３））。
　（集積に用いたベクターＤＮＡの構築）
　ラムダファージＤＮＡの集積に用いたベクターＤＮＡであるｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ－ｐＢＲ（配列番号１）は、大腸菌のＦ因子の複製開始点ｏｒｉＳと、枯草菌で機能する複製開始点ｒｅｐＡを有する大腸菌―枯草菌間シャトルプラスミドベクターｐＧＥＴＳ１１８（Ｋａｎｅｋｏ,　ｅｔ.　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　３１，ｅ１１２．　（２００３）.）を元に多段階の過程を経て構築されたプラスミドであり、図１に示す構造である。集積遺伝子のクローニングサイトは、２つのＡａｒＩ切断部位間となっており、集積の際に取り除くこの２つのＡａｒＩ切断部位間には、大腸菌中でのベクターの取得を容易にする目的で大腸菌の多コピープラスミドのｐＢＲ３２２の複製開始点と、アンピシリン耐性遺伝子が導入されている。また、ｐＧＥＴＳ１１８内部のテトラサイクリン耐性遺伝子中に存在する天然のＡａｒＩ切断部位については、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＬ）のアミノ酸配列に影響を与えないような１塩基の変異を導入することにより認識部位を消失させた。メバロン酸経路人工オペロンの集積に用いたベクターＤＮＡであるｐＧＥＴＳ１５１－ｐＢＲ（配列番号２）は、上述のｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ－ｐＢＲのＤＮＡを鋳型に、３組のプライマーＰａｒｔＡ（５’－ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡａａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔ－３’（配列番号５を参照）と５‘－ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣｇｇｃｃａａｇａａｇｇｃｃ－３’（配列番号６を参照））、ＰａｒｔＢ（５’－ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡｃｃＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＴＡＴ－３’（配列番号７を参照）と５’－ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡｔａＴＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ－３’（配列番号８を参照））、ＰａｒｔＣ（５’－ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡｔａａｃｔｇｇａａａａａａｔｔａｇｔｇｔｃｔｃａｔｇｇｔｔｃｇ－３’（配列番号９を参照）と５’－ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡｇｃｔｔａａｇｔｇｇｔｇｇｇｔａｇｔｔｇａｃｃ－３’（配列番号１０を参照））により増幅した断片を連結することにより作製したベクターＤＮＡであり、元のプラスミドに比較して大腸菌中でしか機能しない遺伝子領域（ｃａｔ～ｏｒｉＳ間、ｐａｒＡ～ｐａｒＣ間）を除去している（図１）。このベクターＤＮＡは、遺伝子を集積した際には、枯草菌中でしか複製できないが、遺伝子集積においては、ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ－ｐＢＲと同一の性質を示す。これらのプラスミド溶液約１０μｌ（５μｇ相当）に、滅菌水２９μｌ、制限酵素に付属する１０×Ｂｕｆｆｅｒ＿ｆｏｒ＿ＡａｒＩを５μｌと、同じく制限酵素に付属する切断活性化用の５０×Ｏｌｉｇｏｎｃｌｅｏｔｉｄｅを１μｌ、制限酵素ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）５μｌを添加し３７℃で２時間反応を行った。得られた液体を、低融点アガロースゲル電気泳動により分離後、ベクター本体の約１５ｋｂの断片（ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ－ｐＢＲの場合）、又は４．３ｋｂの断片（ｐＧＥＴＳ１５１－ｐＢＲの場合）をゲルから切り出し、目的のベクターＤＮＡを精製し、２０μｌのＴＥに溶解した。ベクターＤＮＡの濃度の測定は、このＴＥ溶液１μｌを取り、超微量分光光度計により測定することにより行った。
　（単位ＤＮＡ分割領域の設定）
　４塩基の突出の多様性は、４の４乗で、２５６とおり存在する。これらのうち本発明に使用する突出配列を以下の基準で選定した。まず、パリンドロームとなる全１６配列（グループ０）（ＡＡＴＴ，ＡＴＡＴ，ＴＡＴＡ，ＴＴＡＡ，ＣＣＧＧ，ＣＧＣＧ，ＧＣＧＣ，ＧＧＣＣ，ＡＣＧＴ，ＡＧＣＴ，ＴＣＧＡ，ＴＧＣＡ，ＣＡＴＧ，ＣＴＡＧ，ＧＡＴＣ，ＧＴＡＣ）は、これらの配列の相補配列も同一配列となり、同一種断片同士の連結が可能となるため、本発明では使用できない為除外した。残りの２４０配列については、一方の配列（例えば、ＣＣＴＡ）に対して、その相補配列（ＴＡＧＧ）を包含するため、ＤＮＡ連結に使用可能な突出配列の組み合わせは理論上、２４０÷２＝１２０組合せである。これらのうち、ＧＣ含量の違いとそのＧＣ塩基の出現順序の違いから、以下の基準で突出組合せのグループ化を行った。
　（グループＩ）突出がＡとＴのみからなる突出６組合せ（ＡＡＡＡ／ＴＴＴＴ，ＴＡＡＡ／ＴＴＴＡ，ＡＴＡＡ／ＴＴＡＴ，ＡＡＴＡ／ＴＡＴＴ，ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ，ＡＴＴＡ／ＴＡＡＴ）。
　（グループＩＩ）ＡとＴの合計が３個でＣとＧの合計が１個となる全３２組合せ（ＣＡＡＡ／ＴＴＴＧ，ＡＣＡＡ／ＴＴＧＴ，ＡＡＣＡ／ＴＧＴＴ，ＡＡＡＣ／ＧＴＴＴ，ＧＡＡＡ／ＴＴＴＣ，ＡＧＡＡ／ＴＴＣＴ，ＡＡＧＡ／ＴＣＴＴ，ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ，ＣＡＡＴ／ＡＴＴＧ，ＡＣＡＴ／ＡＴＧＴ，ＡＡＣＴ／ＡＧＴＴ，ＡＡＴＣ／ＧＡＴＴ，ＧＡＡＴ／ＡＴＴＣ，ＡＧＡＴ／ＡＴＣＴ，ＡＡＧＴ／ＡＣＴＴ，ＡＡＴＧ／ＣＡＴＴ，ＣＡＴＡ／ＴＡＴＧ，ＡＣＴＡ／ＴＡＧＴ，ＡＴＣＡ／ＴＧＡＴ，ＡＴＡＣ／ＧＴＡＴ，ＧＡＴＡ／ＴＡＴＣ，ＡＧＴＡ／ＴＡＣＴ，ＡＴＧＡ／ＴＣＡＴ，ＡＴＡＧ／ＣＴＡＴ，ＣＴＴＡ／ＴＡＡＧ，ＴＣＴＡ／ＴＡＧＡ，ＴＴＣＡ／ＴＧＡＡ，ＴＴＡＣ／ＧＴＡＡ，ＧＴＴＡ／ＴＡＡＣ，ＴＧＴＡ／ＴＡＣＡ，ＴＴＧＡ／ＴＣＡＡ，ＴＴＡＧ／ＣＴＡＡ）。
　（グループＩＩＩ）ＡとＴの合計が２つでＣとＧの合計が２つとなる全５２組合せ中パリンドロームの８組合せを除く４４組合せ（ＡＡＣＣ／ＧＧＴＴ，ＡＡＣＧ／ＣＧＴＴ，ＡＡＧＣ／ＧＣＴＴ，ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ，ＡＣＡＣ／ＧＴＧＴ，ＡＣＡＧ／ＣＴＧＴ，ＡＣＣＡ／ＴＧＧＴ，ＡＣＣＴ／ＡＧＧＴ，ＡＣＧＡ／ＴＣＧＴ，ＡＣＴＣ／ＧＡＧＴ，ＡＣＴＧ／ＣＡＧＴ，ＡＧＡＣ／ＧＴＣＴ，ＡＧＡＧ／ＣＴＣＴ，ＡＧＣＡ／ＴＧＣＴ，ＡＧＧＡ／ＴＣＣＴ，ＡＧＴＣ／ＧＡＣＴ，ＡＧＴＧ／ＣＡＣＴ，ＡＴＣＣ／ＧＧＡＴ，ＡＴＣＧ／ＣＧＡＴ，ＡＴＧＣ／ＧＣＡＴ，ＡＴＧＧ／ＣＣＡＴ，ＣＡＡＣ／ＧＴＴＧ，ＣＡＡＧ／ＣＴＴＧ，ＣＡＣＡ／ＴＧＴＧ，ＣＡＧＡ／ＴＣＴＧ，ＣＡＴＣ／ＧＡＴＧ，ＣＣＡＡ／ＴＴＧＧ，ＣＣＴＡ／ＴＡＧＧ，ＣＧＡＡ／ＴＴＣＧ，ＣＧＴＡ／ＴＡＣＧ，ＣＴＡＣ／ＧＴＡＧ，ＣＴＣＡ／ＴＧＡＧ，ＣＴＧＡ／ＴＣＡＧ，ＣＴＴＣ／ＧＡＡＧ，ＧＡＡＣ／ＧＴＴＣ，ＧＡＣＡ／ＴＧＴＣ，ＧＡＧＡ／ＴＣＴＣ，ＧＣＡＡ／ＴＴＧＣ，ＧＣＴＡ／ＴＡＧＣ，ＧＧＡＡ／ＴＴＣＣ，ＧＧＴＡ／ＴＡＣＣ，ＧＴＣＡ／ＴＧＡＣ，ＧＴＧＡ／ＴＣＡＣ，ＴＣＣＡ／ＴＧＧＡ）。
　（グループＩＶ）ＡとＴの合計が１個でＣとＧの合計が３個となる全３２組合せ中、ＣとＧが３連続で並ばない全１６組合せ（ＣＡＣＣ／ＧＧＴＧ，ＣＣＡＣ／ＧＴＧＧ，ＣＴＣＣ／ＧＧＡＧ，ＣＣＴＣ／ＧＡＧＧ，ＣＡＣＧ／ＣＧＴＧ，ＣＣＡＧ／ＣＴＧＧ，ＣＴＣＧ／ＣＧＡＧ，ＣＣＴＧ／ＣＡＧＧ，ＣＡＧＣ／ＧＣＴＧ，ＣＧＡＣ／ＧＴＣＧ，ＣＴＧＣ／ＧＣＡＧ，ＣＧＴＣ／ＧＡＣＧ，ＧＡＧＣ／ＧＣＴＣ，ＧＧＡＣ／ＧＴＣＣ，ＧＴＧＣ／ＧＣＡＣ，ＧＧＴＣ／ＧＡＣＣ）。
　（グループＶ）ＡとＴの合計が１個でＣとＧの合計が３個となる全３２組合せ中、ＣとＧが３連続する全１６組合せ（ＡＣＣＣ／ＧＧＧＴ，ＣＣＣＡ／ＴＧＧＧ，ＴＣＣＣ／ＧＧＧＡ，ＣＣＣＴ／ＡＧＧＧ，ＡＣＣＧ／ＣＧＧＴ，ＣＣＧＡ／ＴＣＧＧ，ＴＣＣＧ／ＣＧＧＡ，ＣＣＧＴ／ＡＣＧＧ，ＡＣＧＣ／ＧＣＧＴ，ＣＧＣＡ／ＴＧＣＧ，ＴＣＧＣ／ＧＣＧＡ，ＣＧＣＴ／ＡＧＣＧ，ＡＧＧＣ／ＧＣＣＴ，ＧＧＣＡ／ＴＧＣＣ，ＴＧＧＣ／ＧＣＣＡ，ＧＧＣＴ／ＡＧＣＣ）。
　（グループＶＩ）突出がＣとＧのみからなる全６組合せ（ＣＣＣＣ／ＧＧＧＧ，ＧＣＣＣ／ＧＧＧＣ，ＣＧＣＣ／ＧＧＣＧ，ＣＣＧＣ／ＧＣＧＧ，ＣＣＣＧ／ＣＧＧＧ，ＣＧＧＣ／ＧＣＣＧ）。
　以上に分割したグループの中から、実施例１及び２では、ベクターＤＮＡと単位ＤＮＡとの境界をグループ１から選んだ。また、単位ＤＮＡ間の境界は、グループＩＩＩ（４４組合せ）とグループＩＶ（１６組合せ）の合計６０の突出組合せを候補に選定した。各突出組合せの指定は、集積対象の配列の完成塩基配列をまず決定してから、この全長を等分する理想分割境界を設定した。以下、実施例１で用いた塩基配列を具体例に挙げて説明する。
　実施例１では、ラムダファージゲノム全長４８５０２ｂｐにｃｏｓサイト１６ｂｐと集積に必要な突出配列４ｂｐを付加した４８５２２ｂｐを再構成の対象とした。以下の表１は、実施例１における集積ＤＮＡの理想分割単位、実際の分割単位及び突出塩基配列を示す表である。集積用プラスミドベクターを除く単位ＤＮＡを５０個のほぼ同一のサイズに分割して準備し、これらを連結することで再構成を試みた。全５０個の断片は、理想的には均等な長さになるように分割することが望ましいが、集積対象の配列に一切の塩基の変更を導入しないためには、元から存在する配列に依存して集積に用いる４塩基の５’末端突出を作製する必要がある。しかしながら、全ての理想的な分割境界上に上記記載の突出配列が過不足なく存在する可能性は０に等しく、理想的な分割境界で単位ＤＮＡを等分割することは不可能である。本実施例では、出来るだけ理想的な分割単位に近い長さとなるように、突出組合せの割り当てシミュレーションを行った。まず、全長（４８５２２ｂｐ）を５０で割って得られる９７０ｂｐを理想分割単位とし、絶対塩基番号の小さい領域の単位ＤＮＡから第０１断片、第０２断片、第０３断片、…、第５０断片と命名した。この理想分割境界の絶対位置（すなわち、９７０と９７１塩基の間、１９４０と１９４１塩基の間、２９１０と２９１１塩基の間、…、４７５３０と４７５３１塩基の間）の位置からこの理想分割境界を中心に、４塩基、６塩基、８塩基、１０塩基、１２塩基、１４塩基、１６塩基、１８塩基、２０塩基、２２塩基、２４塩基と順次左右に１塩基ずつ拡大して、上記の突出候補となる４塩基配列の存在の有無を調べた。具体的な一例を挙げて説明する（表１）。第０１断片と第０２断片の理想分割境界は、９７０と９７１塩基の間である。この理想分割境界を中心とした１６塩基（９６３塩基から９８８塩基までの塩基配列５‘－ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴ－３’）については、上記突出組合せ候補が７個（ＡＣＡＣ／ＧＴＧＴ，ＡＧＣＡ／ＴＧＣＴ，ＡＴＧＣ／ＧＣＡＴ，ＣＡＣＣ／ＧＧＴＧ，ＣＡＧＣ／ＧＣＴＧ，ＣＣＡＧ／ＣＴＧＧ，ＣＴＧＣ／ＧＣＡＧ）存在する。この操作を指定した幅で抜き出した全４９本の理想分割単位周辺の塩基配列に対して、その内部に最低１つでも突出候補の配列が存在するか否かを調べた。その結果、抜き出しの幅を２４ｂｐまで拡大すると全ての抜き出し塩基配列について最低１個は突出候補の４塩基が存在することが確認された。各配列に存在する突出候補からの特定の突出の選抜は、まず、上記のように突出組合せ候補の総数が少ない抜き出し配列から、全抜き出し配列中での出現頻度の低い突出組合せ配列から優先的に割り当てるようにすることで、全ての分割単位に対して唯一となる突出組合せを割り振った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例１、５０の単位ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの集積によるラムダファージの点突然変異体の作製）
　＜ラムダファージ＞
　ラムダファージは、大腸菌に感染するバクテリオファージで、分子生物学的に最も良く研究されているファージである。ゲノムは全長４８５０２ｂｐの二本鎖ＤＮＡからなり、全ての塩基配列が明らかになっている。また、様々な変異体の存在も明らかになっている。本実施例では、１ｋｂ程度の短い単位ＤＮＡからラムダファージ点突然変異体の作製を行うことを試みた。
　＜ラムダファージゲノムの分断化デザイン＞
　ラムダファージは、東洋紡社製のλｐｈａｇｅＤＮＡを使用した。本製品は、ｃｏｓサイトで直鎖状になっている。ファージゲノムの全長の塩基配列を調べたところ、データベースに登録されている塩基配列（アクセッションナンバーＪ０２４５９．１）に対して６か所（ｇ．１３８ｄｅｌＧ，ｇ．１４２６６＿１４２６７ｉｎｓＧ，ｇ．３７５８９Ｃ＞Ｔ，ｇ．３７７４３Ｃ＞Ｔ，ｇ．４３０８２Ｇ＞Ａ，ｇ．４５３５２Ｇ＞Ａ）が異なっていた（配列番号３）（配列番号３の全長は、上記４８５２２ｐｂに更にもう一方の突出末端４塩基を含む全長４８５２６ｂｐ）。得られた塩基配列を用いて、全長４８５２２ｂｐ（ｃｏｓサイトの重複を含む）をほぼ均等の長さに分割するために、理想分割境界を９７０ｂｐ毎に設定し、上述の（単位ＤＮＡ分割領域の設定方法）により行った結果、表１に示す切断部位の右側４塩基により構成される５’末端突出が単位ＤＮＡ集団中でそれぞれ特異的になるように割り振ることができた。
　＜突出を生成する制限酵素の種類の選定＞
　４塩基の任意の突出配列を生成するタイプＩＩＳ制限酵素には、ＡａｒＩ（５’－ＣＡＣＣＴＧＣ（Ｎ）４／－３’，５’－／（Ｎ）８ＧＣＡＧＧＴＧ－３’）、ＢｂｓＩ（５’－ＧＡＡＧＡＣ（Ｎ）２／－３’，５’－／（Ｎ）６ＧＴＣＴＴＣ－３’）、ＢｂｖＩ（５’－ＧＣＡＧＣ（Ｎ）８／－３’，５’－／（Ｎ）１２ＧＣＴＧＣ－３’）、ＢｃｏＤＩ（５’－ＧＴＣＴＣＮ／－３’，５’－／（Ｎ）５ＧＡＧＡＣ－３’）、ＢｆｕＡＩ（５’－ＡＣＣＴＧＣ（Ｎ）４／－３’，５’－／（Ｎ）８ＧＣＡＧＧＴ－３’）、ＢｓａＩ（５’－ＧＧＴＣＴＣＮ／－３’，５’－／（Ｎ）５ＧＡＧＡＣＣ－３’）、ＢｓｍＡＩ（ＢｃｏＤＩのイソジマー）、ＢｓｍＢＩ（５’－ＣＧＴＣＴＣＮ／－３’，５’－／（Ｎ）５ＧＡＧＡＣＧ－３’）、ＢｓｍＦＩ（５’－ＧＧＧＡＣ（Ｎ）１０／－３’，５’－／（Ｎ）１４ＧＴＣＣＣ－３’）、ＢｓｐＭＩ（ＢｆｕＡＩのイソジマー）、ＢｔｇＺＩ（５’－ＧＣＧＡＴＧ（Ｎ）１０／－３’，５’－／（Ｎ）１４ＣＡＴＣＧＣ－３’）、ＦｏｋＩ（５’－ＧＧＡＴＧ（Ｎ）９／－３’５’－／（Ｎ）１３ＣＡＴＣＣ－５’）、ＳｆａＮＩ（５’－ＧＣＡＴＣ（Ｎ）９／－３’，５’－／（Ｎ）１３ＧＡＴＧＣ－５’）等が挙げられる。これらの制限酵素のうち、遺伝子断片をサブクローニングするために使用する大腸菌プラスミドベクター（ｐＭＤ１９，Ｓｉｍｐｌｅ，ＴＡＫＡＲＡ）に存在しないか、あるいは、存在しても発生する断片の大きさが理想分割単位よりも十分に大きい断片と十分に小さい断片とを発生させる制限酵素を調べたところ、全く切断サイトのないものが、５種類（ＡａｒＩ，ＢｂｓＩ，ＢｆｕＡＩ，ＢｓｍＦＩ，ＢｔｇＺＩ）と、ベクター内部に認識配列が存在するが、理想分割単位よりも十分に大きい断片と十分に小さい断片とを発生させる制限酵素１種類（ＢｓｍＢＩ）とが存在し、合計６種類の候補が存在した。これらの候補の制限酵素サイトについて、第０１断片から第５０断片のラムダファージ全体に対してその制限酵素サイトの分布を調べたところ、ＡａｒＩは１２か所、ＢｂｓＩは２４か所、ＢｆｕＡＩは４１か所、ＢｓｍＦＩは３８か所、ＢｔｇＺＩは４５か所、ＢｓｍＢＩは１４か所であり、いずれの制限酵素についても、ラムダファージゲノムに存在しない制限酵素認識部位はなかった。そこで、単位ＤＮＡ毎に内部を切断しない制限酵素をそれぞれ選択して用いることにした。使用する制限酵素の種類を出来るだけ少なくするために制限酵素の組合せを検討したところ、ＢｂｓＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｍＢＩの３種類のみの使用で十分であることを確認した。各単位ＤＮＡの切り出しに用いるタイプＩＩＳ制限酵素の割り振りは、以下のようになった。
　ＢｂｓＩで切断するグループは、第０１～０８・１２・１６～２２・２４・２７・２８・３３～３９・４３・４５～５０断片の合計３３断片、ＡａｒＩで切断するグループは、第０９～１１・１３・２３・２５．３０・３２・４４断片の合計９断片、ＢｓｍＢＩで切断するグループは、第１４・１５・２６・２９・３１・４０～４２断片の合計８断片とした。
　＜遺伝子断片のクローニング＞
　第０１断片から第５０断片までの全５０断片については、ＰＣＲ法を用いてラムダファージゲノム全長から増幅した。まず、上記で決定した突出組合せ間のＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーの５’末端に上記で決定した制限酵素認識部位を望ましい突出を切り出す位置に付加し、更に５’末端にＴＡＧの配列を付加したプライマーを使用した。これらのプライマー組を用いて、ラムダファージゲノム全長から指定領域のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、１反応（５０μｌ）につき、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ１０×ｂｕｆｆｅｒ　Ｖｅｒ．２５μｌ、２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４３μｌ、ｄＮＴＰ（２ｍＭ　ｅａｃｈ）５μｌ、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ（１ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ、ラムダファージＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ）４８ｐｇ、プライマー（ＦプライマーとＲプライマーのそれぞれ）１５ｐｍｏｌ、滅菌水を添加して作製し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のプログラムにより行った。
　９４℃で２ｍｉｎインキュベーション後、９８℃で１０ｓ、５５℃で３０ｓ、６８℃で１ｍｉｎを１サイクルとしてこれを３０サイクル行い、その後に６８℃で７ｍｉｎインキュベートした。増幅した単位ＤＮＡは、２ｍｇ／ｍｌのクリスタルバイオレッド（和光純薬工業社）を含む１×ＴＡＥバッファー（ナカライテスク社製の「トリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝原液（５０倍濃縮）ｐＨ８．３（ａｔ　２５℃）」をｍｉｌｌｉＱ水で５０倍に希釈して作製）で作製した１％アガロースゲル（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　Ａｇａｒｏｓｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、電気泳動装置（ｉ－ＭｙＲｕｎ．ＮＣ，　コスモバイオ）を用いて印加電圧を１００Ｖとし、１０ｍｉｎの泳動時間により分離後、泳動ゲル中の目的のＤＮＡのバンドをカミソリにより２００ｍｇ程度のゲル断片として回収した。このゲル断片からＣｏｎｃｅｒｔ　Ｒａｐｉｄ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を用いて単位ＤＮＡを精製した。具体的には、ゲル断片にその重量の３倍容のＬ１　Ｂｕｆｆｅｒを添加して、４５℃のプロックインキュベーターで１０ｍｉｎ程度溶解し、その溶液を付属のスピンカラムカートリッジ（２ｍｌ遠心チューブにスピンカラムを装着した物）に添加し、２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心してフロースルーを捨てた後、そのスピンカラムに７５０μｌのＬ２　Ｂｕｆｆｅｒを添加して２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心してフロースルーを捨てた。スピンカラム中に残存しているＬ２　Ｂｕｆｆｅｒ等の残渣をより確実に取り除く目的でカラムを再度２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心後、それまでに使用していた２ｍｌ遠心チューブを捨てて、新しい１．５ｍｌ遠心チューブにスピンカラムを移した。そのスピンカラムに３０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を添加して２ｍｉｎ放置後、２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心することで、ＤＮＡ溶液を回収した。この回収ＤＮＡは、使用まで－２０℃で保存した。得られた単位ＤＮＡは、以下に示すＴＡクローニング法により大腸菌プラスミドベクター中にクローニングした。
　単位ＤＮＡ溶液８μｌに、ＴＡＫＡＲＡ社のＰＣＲ反応用酵素Ｅｘ－Ｔａｑに付属する１０×Ｅｘ－Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　１μｌ、１００ｍＭ　ｄＡＴＰ　０．５μｌ、Ｅｘ－Ｔａｑ　０．５μｌを添加して、６５℃で１０ｍｉｎ恒温することで、単位ＤＮＡの３‘末端にＡの突出を付加した。この単位ＤＮＡ溶液１μｌに、ＴＡＫＡＲＡ社のｐＭＤ１９－Ｓｉｍｐｌｅ　１μｌと滅菌水３μｌとを混合し、ＴＡＫＡＴＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ）Ｍｉｘ　５μｌを加え、１６℃で３０ｍｉｎ恒温した。このライゲーション溶液５μｌを５０μｌの大腸菌ＤＨ５αのケミカルコンピテントセルに添加して、氷上で１５ｍｉｎ恒温後、４２℃で３０ｓｅｃ熱ショックを与え、２ｍｉｎ氷上で放置後、ＬＢ培地を２００μｌ添加して、３７℃で１ｈ恒温後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）と１．５％寒天とを含むＬＢプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養することによりプラスミドの形質転換体を得た。得られたコロニーを、ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ調製試薬（シカジーニアスＤＮＡ調製試薬、関東化学社）を用いて調製した。具体的には、試薬キット内の試薬ａと試薬ｂとを１：１０の比率で混合した溶液を２．５μｌ用意し、これにプレート上のコロニーをつまようじで少量採取したものを懸濁後、７２℃、６ｍｉｎ処理し、その後９４℃で３ｍｉｎ処理した。得られた液体に、ＴＡＫＡＲＡ　Ｅｘ－Ｔａｑ用１０×酵素２．５μｌ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ溶液　２μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのＭ１３Ｆプライマー０．２５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのＭ１３Ｒプライマー０．２５μｌ、滅菌水１７μｌ、Ｅｘ－ＴａｑＨＳ　０．５μｌを添加して、９４℃、５ｍｉｎインキュベーション後、９８℃で２０ｓｅｃ、５５℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを１サイクルとして、３０サイクル行うことでＤＮＡを増幅し、このＰＣＲ産物の塩基配列を調べることで、望ましい配列と完全に一致するかどうか調べた。最終的に全てのクローンから正しい配列が得られた。この過程で、第１０断片について得られた変異体の１つに、遺伝子Ｖのコード領域内の同義語置換変異体（ｇ．９５１５Ｇ＞Ｃ）が存在した。この変異により、ファージゲノム中に制限酵素ＡｖａＩ認識部位が新たに出現する（図２）。本実施例においては、構築したファージが人為的に作製されたものであることを明確に示す目的で、第１０断片については、野生型ではなく、この同義語置換変異体（ｇ．９５１５Ｇ＞Ｃ）を用いることにした。
　＜単位ＤＮＡを有するプラスミドの高純度精製＞
　望ましい配列を有する第０１～５０の断片をクローンするプラスミドを有する大腸菌形質転換体全５０種類をそれぞれ５０ｍｌの１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン入りＬＢ培地において３７℃、１２０ｓｐｍで一晩終夜培養し、得られた菌体を、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、精製した。得られた粗プラスミド溶液５０μｌに、５μｌの３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）と、１２５μｌのエタノールを添加して、２００００×ｇで１０ｍｉｎ遠心し、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、得られた沈殿を７０％エタノールでリンスした後、残渣を取り除き、５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に再溶解した。濃度測定のためにこの粗プラスミド溶液１μｌをとり、超微量分光光度計（ＮＤ－２０００、サーモ社）で、ＤＮＡ濃度を測定した。この時点で粗プラスミド溶液のＤＮＡ量は、概ね０．５～４μｇ／μｌであった。測定値を参考に、各粗プラスミド溶液から、５μｇのＤＮＡを１．５ｍｌチューブに採取し、これに全体積が５０μｌになるように滅菌水を添加した。これにＰｌａｓｍｉｄ　Ｓａｆｅ（エピセンタ社）の１０×反応バッファーを６μｌ、２５ｍＭ　ＡＴＰ溶液を２．４μｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓａｆｅ酵素溶液を２μｌ添加して混合し、プログラマブルブロックインキュベーターであるＢＩ－５２６Ｔ（ＡＳＴＥＣ社）により、３７℃で１ｈ恒温し、続いて酵素失活のために７５℃、３０ｍｉｎ恒温した。得られた溶液を、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（キアゲン社）により精製した。本キット精製最終段階では、カラムに吸着したＤＮＡをキット付属の溶出バッファーではなく、２５μｌのＴＥバッファー（ｐＨ８．０）により溶出することで、高純度プラスミド溶液を得た。精製前後の第０１断片を有するプラスミドと、第２１断片を有するプラスミドとを用いＤＮＡ電気泳動を行い（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　Ａｇａｒｏｓｅ、インビトロジェン社）、目的断片（単位ＤＮＡ）が組み込まれていることを確認した（図３）。
　＜単位ＤＮＡを有するプラスミドの精密濃度調整と等モル統合＞
　得られたＤＮＡ溶液を再度、超微量分光光度計で測定することで、高純度プラスミド溶液の濃度を求めた。各サンプルの濃度は、理論上の最大値の２００ｎｇ／μｌに対して粗プラスミド溶液の精製度合を反映しておおよそ１００ｎｇ／μｌ～２００ｎｇ／μｌの範囲になった。測定結果に基づいて各プラスミド溶液１５μｌを１．５ｍｌチューブにとり、それぞれの溶液に、それぞれのプラスミドが１００ｎｇ／μｌの濃度になるようにＴＥを添加し、得られた高純度プラスミド溶液を再度、超微量分光光度計で濃度を測定すると、目標値の１００ｎｇ／μｌに対して数パーセント程度の範囲でズレが存在したので、各高純度プラスミドについて、５００ｎｇのＤＮＡの体積量を小数点以下２ケタのμｌの精度で計算し、この体積量（約５μｌ）でそれぞれのＤＮＡ溶液を分取し、後の切り出しに用いる制限酵素の種類別（ＢｂｓＩグループ、ＡａｒＩグループ、ＢｓｍＢＩグループ）に、それぞれの単位ＤＮＡのモル数が略等モルになるように統合した。
　＜制限酵素による等モル統合プラスミドの一括切断＞
　統合した等モルプラスミド溶液の合計体積は、ＢｂｓＩグループが約１６５μｌ、ＡａｒＩグループが約４５μｌ、ＢｓｍＢＩグループが約４０μｌとなった。各グループに２倍の滅菌水を添加して、それぞれ４９５、１３５、１２０μｌの高純度プラスミド溶液を得て、制限酵素の種類毎に以下のように切断した。
　ＢｂｓＩグループは、１０×ＮＥＢｂｕｆｆｅｒ♯２を５５μｌと、制限酵素ＢｂｓＩ（ＮＥＢ社）２７．５μｌを添加し、全約５７７μｌを３７℃で２ｈ反応させた。ＡａｒＩグループは、制限酵素に付属する１０×Ｂｕｆｆｅｒ＿ｆｏｒ＿ＡａｒＩを１５μｌと、同じく制限酵素に付属する切断活性化用の５０×Ｏｌｉｇｏｎｃｌｅｏｔｉｄｅを３μｌ、制限酵素ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）７．５μｌを添加し、全約１６０μｌを３７℃で２ｈ反応させた。ＢｓｍＢＩグループは、１０×ＮＥＢＢｕｆｆｅｒ♯３を１３．３μｌと、制限酵素ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ社）を６．３μｌ添加し、全約１４０μｌを５５℃で２ｈ反応させた。２ｈ経過後、各サンプルから等モルの関係を損なわないように、すなわち、ＢｂｓＩグループからは３３μｌ、ＡａｒＩグループからは９μｌ、ＢｓｍＢＩグループからは８μｌのプラスミド溶液を採取し、そのうちの５μｌをＤＮＡ電気泳動により、各制限酵素でプラスミドが切断されていることを確認した（図４）。
　＜アガロースゲル電気泳動による５０個の単位ＤＮＡの一括分画と精製＞
　確認後、各グループに等量のフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ナカライテスク社）を添加し、よく混合することで制限酵素を失活した。ここで各グループのフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合物を１つのチューブに統合したのち、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりフェノール相と水相に分離し、水相（約９００μｌ）を別の１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１－ブタノール（和光純薬工業社）を５００μｌ添加し、よく混合し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により分離し、水分を飽和した１－ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を５０μｌと、エタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）することにより、ＤＮＡを沈殿させ、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥに溶解した。これに電気泳動用の１０×Ｄｙｅを２μｌ添加し、その全量を０．７％の低融点アガロースゲル（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　Ａｇａｒｏｓｅ　ＴｙｐｅＶＩＩ，シグマ社）で、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ）バッファー存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置（ｉ－ＭｙＲｕｎ．Ｎ　核酸用電気泳動システム、コスモバイオ社）で、３５Ｖ（約２Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、４ｈ泳動することにより第０１～５０断片とプラスミドベクターとを分離した（図５）。この電気泳動ゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（シグマ社）を含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍｌで３０ｍｉｎ染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）で照らすことにより可視化することで、第０１～５０断片がなすバンド（約１ｋｂ付近）をカミソリで切り出し、１．５ｍｌチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）に、１×ＴＡＥバッファーを添加することにより全体積を約７００μｌとし、これを６５℃で１０ｍｉｎ恒温することにより、ゲルを溶解した。得られたゲル溶液に、５００μｌの１－ブタノールを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により水相とブタノール相を分離し、水飽和ブタノールを捨てることを水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返した。得られた液体に、５０μｌの３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）と、９００μｌのエタノールを添加して、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）によりＤＮＡの沈殿を得て、これを７０％エタノールでリンスした後に、２０μｌのＴＥに溶解した。そのうちの１μｌを取り、超微量分光光度計で濃度を測定した。
　サイズ分画前後の各グループのモル数を確認するために、定量ＰＣＲを行った。図６はサイズ分画前後の、各単位ＤＮＡの分子数の分布を示し、図７は、各単位ＤＮＡの分子数の変化率を示す。これにより、５０個の断片が、略等モル比率であることと、モル比を損なわずに回収されていることが確認された。
　＜遺伝子集積＞
　第０１～５０断片の等モル混合物のＤＮＡ重量濃度は、９８ｎｇ／μｌであり、合計塩基配列は４８，５２２ｂｐで、一方ベクターＤＮＡ（ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ／ＡａｒＩ）は、１９０ｎｇ／μｌで全長は１５，１３９ｂｐである。この長さの重量の比率にしたがって、両ＤＮＡの等モル混合物を得るために、第０１～５０断片の等モル混合物６．２１μｌに対して、ベクターＤＮＡを１．００μｌの比率で混合した。得られた等モル混合溶液７．２μｌに２×ライゲーションバッファーを８．２μｌ添加し、全体を３７℃で５ｍｉｎ間恒温した後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。その一部を取って電気泳動することにより、ライゲーションされていることを確認した（図８）。これを８μｌ新しいチューブに採取し、枯草菌コンピテントセルを１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎダックローターで回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーは、２５０個得られた。
　＜形質転換体のプラスミド構造確認＞
　ランダムに１２株のコロニーを選択して、２ｍｌの１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して更に３７℃で３ｈ培養した。得られた菌体からプラスミドを抽出して、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｆｉＩによるダブルダイジェスチョンし、電気泳動により確認したところ、１２株中４株について望ましい切断パターンを示した（図９）。この４株については、塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法によりプラスミドを大量調製し、プラスミドの構造を１３種類の制限酵素を行った後、電気泳動により確認したところ、いずれも予想される断片と一致した（図１０）。更に、本プラスミドのベクター部分を除く全領域について塩基配列決定したところ、４株のプラスミドとも予想塩基配列と完全に一致した。
　＜集積遺伝子の機能確認＞
　４株のプラスミドについて、ラムダファージとしての機能を確認するために、プラーク形成能の確認を以下のように行った。まず、♯３、♯４、♯６、♯１２の各集積プラスミドをラムダターミアーゼ（Ｌａｍｂｄａ　ｔｅｒｍｉｎａｓｅ，Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ社）により切断することで、ベクターと集積遺伝子部分に分割し、これをラムダパッケージングエキストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｐｌｕｓ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ、アジレント・テクノロジー社）に添加した。これを大腸菌（ＶＣＳ２５７株）に感染させて、ＬＢプレートに広げ３７℃で一晩培養したところ、プラークが確認された。得られたプラークの形状は、並行して行ったＴＯＹＯＢＯ社製ラムダファージＤＮＡで得られるものと同様の形態であることが確認された（図１１）。各プラスミドから得られたプラークからファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＡｖａＩで切断することにより導入した変異が存在するかどうかを確認したところ、図１２に示すようにＴＯＹＯＢＯ社製ラムダファージＤＮＡとは異なる切断パターンを示し、全てのファージに予定どおりＡｖａＩサイトが存在していることを確認した。これにより、第０１～５０断片の全５０断片を集積して作製したラムダファージゲノムが塩基配列とプラーク形成能においてともに完全であることが確認された。
　これらの結果より、ラムダファージＤＮＡを構成する５０の単位ＤＮＡと、ベクターＤＮＡ（ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ／ＡａｒＩ）との合計５１のＤＮＡ断片を連結できたことが示された。
　（実施例２、５５の単位ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの集積によるメバロン酸経路人工オペロンの構築）
　イソプレンの単位を骨格として持つ物質のイソプレノイドには、多くの物質が知られているが、これらはイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）という共通の材料から合成される。解糖系からＩＰＰに至る経路には２つの経路、すなわち、メバロン酸経路と非メバロン酸経路とが存在することが知られており、１つの生物の中に両経路を有する生物も存在するが、大腸菌には非メバロン酸経路しか存在しない。大腸菌のＩＰＰ生産能を増強する目的で、真核生物である酵母のメバロン酸経路の一部の遺伝子について、大腸菌のコドン使用頻度に適合した人工遺伝子の構築を、合成ＤＮＡ断片から集積することにより作製することを試みた。
　＜人工メバロン酸オペロンの配列設計＞
　酵母のメバロン酸経路の前半部分となるアセチルＣｏＡ～メバロン酸までの代謝経路に必要な３つの遺伝子（ＥＲＧ１０（１．２ｋｂ）、ＥＲＧ１３（１．５ｋｂ）、ＨＭＧ１（３．２ｋｂ））を大腸菌のコドン使用頻度に基づいてコドンを変換した３つの人工遺伝子を並べた人工オペロン（５，９５１ｂｐ）（配列番号４）（ただし配列番号４の全長は、突出に用いる４塩基の配列を含む５，９５５ｐｂ）の作製を試みた。酵母遺伝子の大腸菌コドンへの変換は、酵母の同義語コドン中で、酵母全遺伝子中の出現頻度に順位を付け、同様に大腸菌の同義語コドン中で大腸菌全遺伝子中の出現頻度の順位を付け、同じ順位の者同士で変換することにより行った。
　＜単位ＤＮＡの設計＞
　同義語コドン変換を行った５，９５１ｂｐのＤＮＡ配列について、実施例１と同様にこれを切断しない制限酵素サイトを検索したところ、制限酵素ＡａｒＩの認識配列がなく、ＡａｒＩでは切断されないことが判明したので、全てのクローンはＡａｒＩを利用して調製することにした。全長５，９５１ｂｐを５５個の断片に分割すると、平均１０８ｂｐの断片となるので、この大きさを理想分割単位とし、この分割単位近傍で特定の配列（ＡとＴの合計が２つでＣとＧの合計が２つとなる全５２組合せ中パリンドロームの８組合せを除く４４組合せ（前述のグループＩＩＩ）と、ＡとＴの合計が１個でＣとＧの合計が３個となる全３２組合せ中、ＣとＧが３連続しない全１６組合せ（前述のグループＩＶ）との合計６０種類）のうち全ての理想分割単位でいずれか１種類の配列が出現するかどうかを調べたところ、理想分割単位から±７ｂｐの範囲で何れか一種の特定配列が出現することが判明した。これを元に全長を５５個の９８～１１５ｂｐの断片に分割した。表２は、実施例２における集積ＤＮＡの分割単位及び突出塩基配列を示す表である。なお、メバロン酸遺伝子群と遺伝子集積ベクターの境界については、ＡとＴからのみなる突出（ＡＴＴＡとＡＡＡＡ）を利用した。
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　＜合成ＤＮＡによる単位ＤＮＡの作製＞
　分割して得られた各断片は、Ｒｏｓｓｉらの方法（Ｒｏｓｓｉ，　Ｊ．Ｊ．，　ａｎｄ　Ｉｔａｋｕｒａ，　Ｋ．　１９８２．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　９２２６－９２２９（１９８２））により、８０塩基の化学合成ＤＮＡ２本により作製した。具体的には、２つの化学合成ＤＮＡが３’末端で数１０ｂｐがハイブリダイズするようにし、５’末端には、ＡａｒＩ切断部位よりも５’末端側に上記で設計した突出がＡａｒＩ消化により出現するように認識部位を付加した。これらの２つの合成ＤＮＡのハイブリダイゼーションと続く鋳型依存的伸長反応の結果得られる二本鎖の単位ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅するために、両末端のＡａｒＩ認識部位にハイブリダイズするように作製したＰＣＲプライマー１種類の計３種類のＤＮＡを添加して、ＰＣＲの反応によりＡａｒＩの切断サイトに囲まれた単位ＤＮＡを得て、これをＴＡクローニング法により、大腸菌プラスミドベクターｐＭＤ１９に連結し、大腸菌に形質転換することによりクローニングした。これをシーケンシングすることにより各断片について塩基配列の望ましいクローンを選択した。
　＜単位ＤＮＡを有するプラスミドの等モル混合＞
　得られた望ましいクローンを持つ大腸菌５５株を培養し、Ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりそれぞれから粗プラスミド溶液５０μｌを得た。これから各１μｌを取り超微量分光光度計によりＤＮＡ濃度を測定したところ、８２～１８０ｎｇ／μｌであった。概ね各５μｇのプラスミドを取りＰｌａｓｍｉｄ　Ｓａｆｅにより処理し、酵素の熱失活後、Ｍｉｎｉ－ｅｌｕｔｅ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製して、２５μｌの高純度プラスミド溶液を得た。このうちの１μｌを超微量分光光度計により濃度を測定したところ、１０８～２１３ｎｇ／μｌの濃度であった。ここから各々２０μｌの高純度プラスミド溶液を別のチューブに取り、このチューブに各プラスミドの濃度が計算上１００ｎｇ／μｌになるようにＴＥを添加して希釈した。この精製プラスミド溶液を再度微量分光光度計で濃度を算出し、この濃度に基づいて各高純度プラスミドの重量が５００ｎｇになる体積量を小数点以下２ケタのμｌの精度で算出し、その体積量（約５μｌ）をそれぞれのプラスミド溶液から分取し、を一本のチューブにプールした。合計で約２７５μｌの等モルプラスミド混合溶液に２倍溶の滅菌水と１３７．５μｌの１０×Ｂｕｆｆｅｒ＿ｆｏｒ＿ＡａｒＩと、６７．５μｌの制限酵素ＡａｒＩを添加して、３７℃で一晩反応させた。
　＜５５個の単位ＤＮＡの一括サイズ分画＞
　この反応液に等量のフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加してＡａｒＩを失活させた後、遠心し、その上清をエタノール沈殿により精製して、沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。これに電気泳動用の色素としてキシレンシアノールを添加して、２．５％アガロースゲルでＴＡＥをバッファーとして１００Ｖで、３０分間電気泳動することにより、ベクターＤＮＡのｐＭＤ１９とインサートの単位ＤＮＡとを分離した（図１３）。泳動したゲルをカミソリで分割し、その一部をエチジウムブロマイドで染色し、目的の５５個の等モル混合断片のバンドの位置を確認しながら、無染色のゲルから目的のＤＮＡのバンドを切り出した。
　＜等モル単位ＤＮＡ集団の精製＞
　得られたゲル断片からＤＮＡの精製は、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて以下に示すように行った。
　ゲルの体積を重量により測定後、その体積の１５倍容のＣＧ　Ｂｕｆｆｅｒを添加して、５０℃で１０ｍｉｎ恒温することによりゲルを溶解した。そこに、ゲルの体積の５倍容のイソプロピルアルコールを添加して、付属のカラムにその液体を入れて遠心することによりカラムにＤＮＡを吸着させた。このカラムを５００μｌのＣＧ　Ｂｕｆｆｅｒを添加して遠心することにより洗浄後、更に、ＰＥ　Ｂｕｆｆｅｒを７５０μｌ添加して遠心することにより洗浄した。完全に残渣を取り除くために１回遠心後、このカラムに、１０μｌのＴＥバッファーを添加後遠心することにより５５断片の単位ＤＮＡが略等モルの混合溶液を得た。
　＜等モル単位ＤＮＡ混合溶液への複製開始点を有するＤＮＡの添加＞
　このＤＮＡ濃度を超微量分光光度計により濃度測定を行ったところ、２０ｎｇ／μｌであった。並行して調製したｐＧＥＴ１５１／ＡａｒＩの濃度は、６７ｎｇ／μｌであったので、これらの長さの比率（５９５５ｂｐ：４３０６ｂｐ）を考慮に入れて４．６３：１の比率になるように５５断片等モル混合溶液とｐＧＥＴＳ１５１／ＡａｒＩとを混合した。
　＜遺伝子集積＞
　得られた等モル混合溶液５．６３μｌに２×ライゲーションバッファーを６．６３μｌ添加し、全体を３７℃、５ｍｉｎ間恒温した後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。一部をとって電気泳動することにより、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡがタンデムリピート状にライゲーションされているか否かを確認した（図１４）。ライゲーション後の溶液８μｌを別のチューブに採取し、これに枯草菌コンピテントセルを１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎダックローターで回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げた。
　＜形質転換と集積体の構造確認＞
　得られたコロニー１５４個から、ランダムに２４個のクローンを選択し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢに植菌した。対数増殖期に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して、定常期まで培養後、プラスミドＤＮＡを抽出して制限酵素ＰｖｕＩＩで処理し、電気泳動により切断パターンを調べた（図１５）。その結果、２クローン（♯１０と＃２０）について予想される塩基配列と一致することが確認されたので、このプラスミドについて他の制限酵素処理を行い、電気泳動により詳細な構造確認を行ったところ、目的の構造と一致した（図１６）。このプラスミドについてシーケンシングすることで、最終的にクローン１０と２０は、設計とおりの塩基配列を有していたことを確認した。
　これらの結果より、メバロン酸経路人工オペロンを構成する５５の単位ＤＮＡと、ベクターＤＮＡ（ｐＧＥＴＳ１５１－ｐＢＲ）との合計５６のＤＮＡ断片を連結できたことが示された。
　以上より、本発明のＤＮＡ連結体の作製方法によると、５０以上のＤＮＡ断片を連結し得ることが確認された。このように、多数のＤＮＡ断片を連結できたのは、本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物において、各々の単位ＤＮＡのモル数がより正確に同一に近いためであると考えられる。
　本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物において、各々の単位ＤＮＡのモル数がより正確に同一に近い理由は、以下のとおりに推察される。
　上記実施例１、２では単位ＤＮＡを含む溶液において、それぞれの単位ＤＮＡの濃度を測定する際に、それぞれの単位ＤＮＡには、付加配列（具体的には環状プラスミドＤＮＡ）が連結されている。すると、単位ＤＮＡの種類間において、それぞれの塩基配列の長さの分布が大きくても、付加配列が連結されている分、溶液の濃度の測定時においては塩基配列の長さの分布が小さくなる。そのため、測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなる。これにより、この測定結果に基づいて各々の溶液を分取し、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一となるように調整することによって、各々の溶液中のモル比を１に近づけやすくなり、より正確に、各々の単位ＤＮＡが略等モルになったものと推察される。
　また、実施例１において、単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、３６９１．４±６．６ｂｐであり、平均の合計長さに対して±０．１８％である。実施例２において、単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、２８２８．２±４．５ｂｐであり、平均の合計長さに対して±０．１６％である。実施例１、２では、該標準偏差が、平均の合計長さに対してこのように少ないため、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差がより少なくなったものと考えられる。
　各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長の単位ＤＮＡの平均塩基長に対する比は、実施例１では約２．７、実施例２では約２７である。このように、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、単位ＤＮＡの平均塩基長と比較して長いため、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が更に少なくなり、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が更に少なくなったものと考えられる。
　また、実施例１、実施例２では、単位ＤＮＡの設計を集積ＤＮＡの配列の塩基長を単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として行ったため、このように単位ＤＮＡの設計を行った場合、それぞれの単位ＤＮＡの長さが略同一の長さとなった。そのため、制限酵素により付加配列を除去した後の電気泳動後のサイズ分画において、略同一の位置のバンドとして現れ、１回のサイズ分画で単位ＤＮＡを回収でき、作業効率が向上することが示された。
　上記実施例１では、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類毎にグループに分類している（実施例１では３種類、実施例２では１種類）。そのため、除去工程の前に、各グループ毎に、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合することができ、単位ＤＮＡ毎に制限酵素処理を行う必要がなく、制限酵素のグループ毎に、一回で制限酵素処理ができた。すなわち、これにより、ＤＮＡ連結体の作製の作業の効率が向上することが確認された。また、このように混合したものを用いても、上記のとおり、略等モルの状態で混合されるので、多数の単位ＤＮＡが連結可能であることが確認された。
　（試験例１　枯草菌プラスミドＤＮＡの形質転換において必要な集積ＤＮＡユニットの数の繰り返し単位の冗長性（リダンダンシー（ｒ））の確認）
　枯草菌プラスミド形質転換において必要とされる、集積ＤＮＡユニットの数の繰り返し数（リダンダンシー）ｒを確認するために、以下の試験を行った。
　枯草菌において有効な複製開始点を有するプラスミドｐＧＥＴＳ１１８－ｔ０－Ｐｒ－ＳｆｉＩ－ｐＢＲ（配列番号１）を用いて、以下の（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡを準備した。
　＜（Ａ）のＤＮＡの調製＞
　（Ａ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＝１の環状モノマープラスミドＤＮＡである。まず、ｐＧＥＴＳ１１８－ｔ０－Ｐｒ－ＳｆｉＩ－ｐＢＲを大腸菌に形質転換した。この形質転換体から得られるプラスミドは、（Ａ）のＤＮＡが主ではあるが、若干量の多量体（マルチマー）が含まれるので、これらを除去する目的で、このプラスミドを低融点アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡサイズ分画により、モノマープラスミドＤＮＡの領域のみゲルより切り出し、精製することによって、（Ａ）のＤＮＡを調製した。
　＜（Ｂ）のＤＮＡの調製＞
　（Ｂ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＝１の直線上のモノマープラスミドＤＮＡである。この（Ｂ）のＤＮＡは、上記（Ａ）のＤＮＡを制限酵素ＢｌｐＩ（認識部位は（５’－ＧＣ／ＴＮＡＧＣ－３‘））により処理することで、調製した。
　＜（Ｃ）のＤＮＡの調製＞
　（Ｃ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＞１のタンデムリピートの直線状マルチマープラスミドＤＮＡである。上記（Ｂ）のＤＮＡを調製した際に使用したＢｌｐＩは、５‘末端に非パリンドロームの３塩基突出を形成する。よって、上記（Ｂ）のＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼにより連結することによって、プラスミド単位が同一方向に連続した直線状マルチマープラスミドＤＮＡである（Ｃ）のＤＮＡを調製した。
　＜（Ｄ）のＤＮＡの調製＞
　（Ｄ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＝１の直線上のモノマープラスミドＤＮＡである。この（Ｄ）のＤＮＡは、上記（Ａ）のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（認識部位は（５’－Ｇ／ＡＡＴＴＣ－３‘である））により処理することで、調製した。
　＜（Ｅ）のＤＮＡの調製＞
　（Ｅ）のＤＮＡは、部分的にリダンダンシーｒ＞１の部分を含む、上記（Ｄ）のＤＮＡがランダムな向きで連結した直線状マルチマープラスミドＤＮＡである。上記（Ｄ）のＤＮＡを調製した際に使用したＥｃｏＲＩは、５’末端にパリンドロームの３塩基突出を形成する。ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドＤＮＡを連結すると、プラスミド単位が、ランダムな向きで連結したマルチマープラスミドＤＮＡを作製することが可能となる。（Ｅ）のＤＮＡは、上記（Ｄ）のＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼにより連結することによって調製した。
　＜（Ｆ）のＤＮＡの調製＞
　（Ｆ）のＤＮＡは、（Ａ）のＤＮＡを１か所のみ切断する制限酵素ＫａｓＩで切断し、脱リン酸化した後にその近傍のＢｌｐＩで切断したＤＮＡ断片と、（Ａ）のＤＮＡを１か所でのみ切断する制限酵素ＡｆｅＩで切断し、脱リン酸化した後にその近傍のＢｌｐＩで切断したＤＮＡとを等量混合した、ｒ≒１直鎖状準モノマー混合物である。この（Ｆ）の混合物中のいずれのＤＮＡ断片もリダンダンシーｒは、１を若干下回っている。
　＜（Ｇ）のＤＮＡの調製＞
　（Ｇ）のＤＮＡは、上記（Ｆ）の２つのＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼにより連結することによって、ＢｌｐＩサイトのみで方向性を指定した連結されたリダンダンシーｒ＝１．９８の直線上の準ダイマープラスミドＤＮＡである。
　＜（Ｈ）のＤＮＡの調製＞
　上記（Ｂ）と（Ｄ）は、互いに切断サイトが離れている。（Ｈ）のＤＮＡは、これら（Ｂ）と（Ｄ）のＤＮＡを等モルとなるように、連結せずに混合した混合物である。
　＜（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡの枯草菌コンピテントセルへの形質転換＞
　上記（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡを、枯草菌コンピテントセルに形質転換して、得られたテトラサイクリン耐性株の出現数を指標に１μｇ当たりの形質転換体を求めた。（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡはライゲーション反応の有無にかかわらず、ライゲーションバッファー中に溶解し、形質転換に用いた。（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡの電気泳動の写真を図１７に示し、（Ａ）～（Ｈ）のＤＮＡの枯草菌コンピテントセルの形質転換体出現数を、図１８に示す。なお、図１７の電気泳動写真において、（Ｃ）と（Ｅ）のＤＮＡは、様々なサイズのものがレーン上の広い範囲で分布しているため、バンドが判別しにくくなっている。また、図１７の「Ｇ」において、上のバンドが、リダンダンシーｒ＝１．９７の（Ｇ）のＤＮＡであり、下のバンドが、（Ｇ）のＤＮＡに混ざっていたリダンダンシーｒ＝０．９５のＤＮＡである。
　これらの結果から、Ａの環状ＤＮＡを除くと、形質転換体が得られたものは、ＤＮＡをライゲーションにより連結した（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）のＤＮＡのみであったことが確認された。これにより、リダンダンシーｒ＝１、又はｒ＜１の場合、仮に切断サイトが異なっており、切断サイトの配列を補完できる関係にある２種類の直線状プラスミド分子が混合していたとしても、形質転換体が得られないことが示され、少なくとも直線状のＤＮＡにおいては、最低限リダンダンシーは、ｒ＞１を満たす必要があることが示された。
　（シミュレーション１　ライゲーションシミュレーション）
　＜ライゲーションシミュレーションアルゴリズムの設定＞
　シミュレーションプログラミングは、表計算ソフトＥｘｃｅｌ（登録商標）２００７のＶＢＡを用いて行った。仮想ライゲーション中のＤＮＡ断片Ｆは、３つのパラメーターＦｉ（Ｎｉ，Ｌｉ，Ｒｉ）を用いて表現した。ここで、「ｉ」は断片識別番号を意味し、より具体的には、Ｅｘｃｅｌ上のｉ列セルを意味する。「Ｎ」は、仮想ライゲーション中のライゲーションＤＮＡ断片１分子中に含まれる単位ＤＮＡ断片数を示し、「Ｌ」はライゲーション産物の左側の突出末端の配列を任意の自然数で数値化したものを示し、「Ｒ」は、「Ｌ」と同じくライゲーション産物の右側の突出末端の配列を任意の自然数で数値化したものを示す。ここで、Ｌ＝Ｒである場合、２つの突出配列は相補関係にあり、Ｌ＝Ｒは、ライゲーション可能であることを定義する。ライゲーションのシミュレーションは以下のように行った。
　Ｆｉ（Ｎｉ，Ｌｉ，Ｒｉ）断片に対して、ｉ≠ｊを満たす乱数ｊを、ＲＡＮＤ（）メソッドにより発生される０～１間の一様乱数にｍ（後述する）を掛けて、四捨五入で整数化することで発生させ、これによってＦｊ（Ｎｊ，Ｌｊ，Ｒｊ）断片を選択した。この２つ断片が連結可能かどうかを以下の判別式を用いた判別し、連結可能な場合は、断片のパラメーターを以下に示すように変更した。
　Ｌｉ＝Ｒｊを満たす場合、すなわち、Ｆｉの左末端とＦｊの右末端が連結可能な場合は、Ｆｉ（ｎｅｗ）（Ｎｉ（ｏｌｄ）＋Ｎｊ（ｏｌｄ），Ｌｊ（ｏｌｄ），Ｒｉ（ｏｌｄ））断片とＦｊ（ｎｅｗ）（０，０，０）断片に変換した。逆にＲｉ＝Ｌｊを満たす場合、すなわちＦｉ断片の右末端とＦｊ断片の左末端が連結可能な場合は、Ｆｉ（ｎｅｗ）（Ｎｉ（ｏｌｄ）＋Ｎｊ（ｏｌｄ），Ｌｉ（ｏｌｄ），Ｒｊ（ｏｌｄ））断片とＦｊ（ｎｅｗ）（０，０，０）断片を変換した。Ｌｉ≠ＲｊかつＲｉ≠Ｌｊの場合は、無変換（Ｆｉ（ｎｅｗ）（Ｎｉ（ｏｌｄ），Ｌｉ（ｏｌｄ），Ｒｉ（ｏｌｄ））断片かつＦｊ（ｎｅｗ）（Ｎｊ（ｏｌｄ），Ｌｊ（ｏｌｄ），Ｒｊ（ｏｌｄ））断片）とし、仮想ライゲーションは起きないものとした。仮想ライゲーションは、これらの計算をｉ＝１→ｍまで行ったものを１サイクルと定義した。ここでｍは、仮想ライゲーションサイクル中のＤＮＡ断片の総数を示す変数で、シミュレーション１サイクル目の場合は、初発の単位ＤＮＡ断片数の合計を意味する。仮想ライゲーション１サイクルを計算後、Ｅｘｃｅｌ２００７のＶＢＡコマンドのソート機能（Ｓｏｒｔメソッド）により、Ｌｉ値が降順になるようにＦｉ断片の並び変えを行うことで、Ｆ（０，０，０）断片以外のＦｉ断片の総数を数え、その総数を新しいｍとして挿入し、次のサイクルの仮想ライゲーションを行った。仮想ライゲーションサイクルは、相補関係にある突出断片が無くなり、これ以上仮想ライゲーションを行えない最小断片数ｍｍｉｎまで行った。ここでｍｍｉｎ値は、ライゲーション開始前の初発の単位ＤＮＡ断片の情報を用いて、以下の計算により求めた。
　ｍｍｉｎ＝（総単位ＤＮＡ断片数）―（Ｌ＝Ｒを満たす関係にある２種類の単位ＤＮＡ断片のうち少ない単位ＤＮＡの断片数の、系全体における合計数）
　＜ライゲーションシミュレーション＞
　６断片、１３断片、２６断片、５１断片集積までの各集積規模において、同一単位ＤＮＡ断片数の平均６４０で、０～２０％の範囲で１％刻みに設定した変動係数（ＣＶ）を持つ仮想単位ＤＮＡ断片集団は以下のように作製した。
　Ｅｘｃｅｌの一様乱数コマンドＲＡＮＤ（）で発生させた各集積規模の数に相当する０～１の乱数集団を発生させて、その乱数集団を平均値０、分散１に標準化した後、各標準化乱数に（断片平均値＊ＣＶ（％）／１００）を掛けた値に、断片数の平均値を加えることで、各仮単位ＤＮＡ断片集団を作製した。この乱数集団は、各集積規模の各ＣＶ（％）値について、独立した２０集団を作製し、それぞれの乱数集団に対して上記シミュレーションにより、ｍｍｉｎまで仮想ライゲーションを実施した。得られた２０個の各仮想ライゲーション断片を統合し、Ｎ値毎にライゲーション断片数を集計し、その（Ｎ値×ライゲーション断片数）が、ライゲーションに用いた単位ＤＮＡ断片総数に占める割合を求め、Ｎ値の大きい分子の値ほど下に来るように１００％積み上げグラフを作製した。そのグラフを、図１９に示す。この図１９は、初発の単位ＤＮＡ断片が最終的にどのような大きさのライゲーション産物中に取り込まれたのかについての分布を示す。図１９中、（ａ）は６断片集積についてのグラフを示し、（ｂ）は１３断片集積についてのグラフを示し、（ｃ）は２６断片についてのグラフを示し、（ｄ）は５１断片集積についてのグラフを示す。６断片集積の場合、ｎ＝６で、リダンダンシーｒ＝１となり、リダンダンシーｒ＜１領域は、右上の領域を示す。この結果から、６断片集積では、そのＣＶの値においてもほとんどの単位ＤＮＡ断片がリダンダンシーｒ＞１領域のＤＮＡ断片に取り込まれることが示され、逆に、５１断片集積においては、ＣＶが０％に近い領域を除き、ほとんどの領域がリダンダンシー１未満の領域であることが示された。
　＜ライゲーションシミュレーションからのライゲーション理論式の導出＞
　上記のライゲーションシミュレーションの数値解析から、ライゲーションのメカニズムについて一般化された式を求めるにあたって、各集積規模の各ＣＶ値におけるライゲーション産物の分布のフィッティングカーブを算出可能か否かを検証した。６断片集積平均６４０断片の場合についての、ＣＶ＝２０％におけるライゲーション産物の単位ＤＮＡ断片含有数の分布を図２０に示す。図２０において、各リダンダンシー（０＜ｒ＜１、１＜ｒ＜２、２＜ｒ＜５、５＜ｒ＜１０）中の各棒グラフの模様は、各模様毎にそれぞれのリダンシーのＮをｒで割った際に区別される成分（６断片集積の場合、余りが０、１、２、３、４、５の６成分のうち、Ｎ値が０のため対数変換が出来ない余り０の成分を除いた５成分）の種類を示し、異なるリダンダンシーにおいて、同一の模様である棒グラフは、Ｎをｒで割った際に区別される成分が同一の種類であることを示す。また、図２０のグラフ中の線形近似曲線は、それぞれの模様の成分の種類毎に求められたものである。
　各Ｎ値に対するライゲーション産物の分子数のヒストグラムは、全体的にみるとＮ値増加に伴って指数減少傾向を示し、一見すると離散型確率分布の１種である幾何分布に近い分布を示した。しかしながら、このヒストグラムは、微視的には、遺伝子集積の規模数、あるいは１リダンダンシー（６断片集積の場合６）を周期とした周期的な構造を示し、特にＮ値が遺伝子集積規模の整数倍に相当する部分では、断片が全く現れないという特徴的構造を示した。この特徴は、幾何分布、あるいは、連続型確率分布と見なした場合の指数分布とは完全には一致しない。しかし、ライゲーション産物分子数軸を対数表示に変換し、その微視的周期構造の各成分、すなわち、Ｎを集積規模６で割った余りで区別される成分をそれぞれ各周期から取り出して、線形近似曲線を求めると極めて高い相関係数の２乗値（０．９４以上）を示すため、それぞれの成分が指数分布に近似しても問題はないものと考えられる。この分布は、図２０に示す６断片集積の濃度バラつきのＣＶが２０％である例以外の他の集積規模及び他のＣＶ値の例においても認められた。以後、本メカニズムをヒューリスティックに指数分布に近似できるものと仮定し、指数分布関数（ｆ（ｎ）＝λ＊ｅｘｐ（－λ＊ｎ））へのフィッティングを行った。
　具体的には、（１）まず、上記で述べた各集積規模のすべてのシミュレーションにおいて、Ｎを集積規模で割った余りで区別される成分それぞれについて、３周期程度の対数変換した分子数値から線形近似で得られる直線の傾きを－λとして求め、この値からλを算出した。（２）次に、指数分布関数においてはパラメーターλの逆数の１／λがｆ（Ｎ）の平均値となるため、２０の乱数集団におけるライゲーション産物のＮ値の平均を求め、この平均値の逆数から各ＣＶ（％）毎のλ（ＣＶ（％））を算出した。上記（１）及び（２）の結果を、横軸を単位ＤＮＡ断片の濃度バラつきのＣＶ（％）値、縦軸をλ値に設定してプロットすると、遺伝子集積規模に関わらず、全てのプロットが、ある原点を通る正比例の直線上に存在することが確認された。これらのプロットについてそれぞれ線形近似曲線を求め、そのグラフを図２１に示した。図１中、（ａ）は、上記（１）の３周期から求めた傾きλと、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラツキとの関係を示したグラフであり、（ｂ）は、上記（２）のＮ値の平均値の逆数から求めたλと、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラツキとの関係を示したグラフである。より精度の高い（２）より得られたこの線形近似曲線の一般式は、ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（－０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）であった。また、図２１から、λ＝０．００５８＊ＣＶ（％）に相関係数の２乗値が、０．９９という高い相関性で表現できることを見出した。よって、この一般式は、問題がないことが確認された。
　＜ライゲーションの反応速度の定性的解析＞
　上記のライゲーションシミュレーションは、正規な突出組合せ同士のライゲーションが全て完了した状態を想定したものである。これに対し、実際に遺伝集積する際のライゲーション反応条件がどの程度シミュレーションの反応条件に近いのかを検討するために、ライゲーション反応のキネティックスを調べた。
　まず、実際に遺伝子集積する条件で行うライゲーション反応において、様々な反応時間でライゲーション産物をサンプリングし、実際にどの程度の割合で連結が行われるかをλファージ再構成の５１断片連結を用い、全ての５１の連結箇所について、定性解析を行った。ライゲーションに使用した単位ＤＮＡ断片の平均濃度は、約０．２ｆｍｏｌ／μｌであり、この単位ＤＮＡ断片の溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを添加してから、３７℃、０、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０分後に、それぞれの反応溶液の一部をサンプリングし、正規に連結される２つの単位ＤＮＡ断片の連結部分をまたいだＤＮＡが増幅されるように設計された定量ＰＣＲ用のプライマーセットと、各単位ＤＮＡ断片の内部のみが増幅されるように設計された定量ＰＣＲ用のプライマーゼットとを用いて、市販のλファージゲノムＤＮＡ（東洋紡）又は既に構築された集積プラスミドを制限酵素で切断し、直鎖化したＤＮＡの希釈系列を指標として、各断片のライゲーションの進捗度合いを調べた。その結果、本反応条件においては、どの連結部分においてもライゲーションが概ね１０分程度で終了しており、実際の４時間（２４０分）という反応時間においては、略完全にライゲーションが完了していることが確認された。また、十分に時間が経過した後（４０分以降）のほとんどの連結点の反応度合が、それぞれの単位ＤＮＡ断片の少ない方を基準とした値に対して略１の割合で存在することから、ライゲーションされたＤＮＡ断片は、ほとんどがそれぞれの正しい連結相手と連結していることが確認された。
　＜ミスライゲーション割合の推定＞
　より詳細にライゲーションの状況を確認するために、上記のλファージゲノム再構成の実験において得られた集積体のうち、全塩基配列を完全決定した＃３、＃４、＃６、＃１２を除く全てのクローンについて（＃１、＃２、＃５、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１）、誤った組み合わせでライゲーションされている箇所の同定を目的として塩基配列決定を行った。それぞれのクローンについてのミスライゲーションサイトを、図２２に示す。この結果から、＃１１クローンを除く７クローンについては、その内部に１個もしくは２個のミスライゲーションが存在していることが確認され、全てのミスライゲーションを同定できた。一方、＃１１クローンについては、集積ＤＮＡ内に同じ単位ＤＮＡ断片が繰り返し存在していることが確認され、完全な構造確認を行うことはできなかったが、全６か所のミスライゲーションサイトが存在していることが確認された。＃１１は、詳細な単位ＤＮＡ断片数が不明であるため、＃１１は除外して、全てのクローンのミスライゲーション出現頻度を算出した結果、連結点４６箇所に１箇所程度の割合でミスライゲーションが存在していることが確認され、２．２％程度という比較的低い割合でミスライゲーションが出現することが確認された。この結果は、上記の定量ＰＣＲの結果と矛盾しない結果であった。
　＜実際のライゲーション産物の大きさ分布とシミュレーションとの一致性の検証＞
　上記ミスライゲーション割合の推定と、ライゲーションの反応速度の定性的解析の２つの検証によって、実際のライゲーション反応においては、４時間という十分な時間が経過した後では、略全てのライゲーションが完了しており、またミスライゲーションが生じる確率は少ないと推定された。そこで、初発の単位ＤＮＡ断片に濃度のバラつきが存在する実際の単位ＤＮＡ断片集団について、シミュレーションによって実際のライゲーション産物の大きさ分布が予測可能か否かを以下の方法で検証した。
　まず、定量ＰＣＲで７．５％のＣＶの単位ＤＮＡ断片濃度のバラつきが観測されたλファージゲノム再構成実験で用いた集団を材料に用いた。この定量ＰＣＲの観測値は、測定誤差としてＣＶ＝３．６％の数値を含むので、真の単位ＤＮＡ断片のバラつきのＣＶは、ＣＶ＝７．５％よりも低い可能性があると推測された。そこで、真の値として可能性のあるＣＶをシミュレーションによって求めた結果、真のＣＶが６．６％であった場合に、測定誤差のＣＶ＝３．６％により観測値がＣＶ＝７．５％となる可能性が推定された。そこで、この集団の真の単位ＤＮＡ断片のバラつきをＣＶ＝６．６％として、ＲＡＮＤ（）メソッドに用意した平均６４０断片、ＣＶ＝６．６％の条件を満たす、初発の単位ＤＮＡ断片５１種類のライゲーションのシミュレーションを行った。このシミュレーションにおいては、１００％の反応割合を示すｍｍｉｎのみならず、ライゲーション可能数９５％、９６％、９７％、９８％、９９％におけるライゲーションした際のｍ値について、それぞれ１００個の独立した乱数集団を準備し、それぞれ指定したｍ値まで反応を継続させた。得られたライゲーション産物の分布１００集団分を統合して、Ｆ（Ｎ，Ｌ，Ｒ）のパラメーターを利用して、単位ＤＮＡ断片各仮想ライゲーション産物のＤＮＡの長さをｂｐ単位で求めた。次に、ＣＶ＝６．６％の断片数のバラつきの存在するλファージゲノム再構成実験の実際の単位ＤＮＡ断片集団について、上記の「ライゲーションの反応速度の定性的解析」で述べたとおり、３７℃で４時間反応させ、反応後、ＣＨＥＦ型パルスフィールドゲル電気泳動装置（バイオクラフト社製）により、ＤＮＡの実際の分子量分布がどのようになるかを０．５×ＴＢＥ、５Ｖ／ｃｍ、３０ｓｅｃ周期の泳動条件で１６時間泳動した。その電気泳動の写真を図２３に示す。得られた電気泳動写真のＤＮＡ密度分布をＮＩＨｉｍａｇｅソフトウェアにより得て、得られた図に対してシミュレーションで得られた各ライゲーション効率における予想ＤＮＡ分布図を重ね合わせて比較した。その結果を、図２４に示す。図２４により、電気泳動によるＤＮＡの分子量分布が、９８％－１００％のライゲーション効率の場合の予想ＤＮＡ分布図と概ね一致したこと、特に最大の濃度を示す極大値の分子量が９８％のライゲーション効率と良好に一致することが確認された。これにより、シミュレーションの結果は、４時間のライゲーションの反応で略全てのライゲーションを完了し、２％程度のミスライゲーションは起こりうるものの、概ね全体のライゲーションの様子を再現できることが示された。
　＜ライゲーションシミュレーションの一般化＞
　実際に集積に用いる単位ＤＮＡ断片は、濃度のバラつきが避けられないが、実際にはどの程度の単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきに抑えなければならないのかを、上記で求められた一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（－０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて総括した図を、図２５に示す。現在の遺伝子集積実験では、概ねＤＮＡ濃度のバラつきがＣＶ（％）＝６．６程度であるが、図２５によると、ＣＶ（％）＝６．６の場合、５１断片の集積において、用いた単位ＤＮＡ断片の約４０％が、ｒ値が１より大きいライゲーション産物に取り込まれていることが示される。また、図２５によると、仮に、これの２倍の集積規模の１０２断片集団による新規な遺伝子集積を計画する場合、５１断片と同程度の集積効率を期待するなら、ＣＶ（％）＝３．３を実現する必要があることが示された。また、一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（－０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきと１ライゲーション産物の平均単位ＤＮＡ断片数との関係を求めた。その結果を図２６に示す。これにより、一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（－０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いることで、ＣＶ（％）値による、１ライゲーション産物中の平均単位ＤＮＡ断片含有数を容易に推測することが可能となることが示された。

Claims (12)

  1. 　付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、
    　前記各々の溶液の準備後、前記単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
  2. 　前記付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有し、前記付加配列が複製開始点を有するプラスミドＤＮＡ配列である請求項１記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
  3. 　前記単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差が、平均の前記合計長さに対して±２０％以内である請求項１又は２記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
  4. 　前記各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、前記単位ＤＮＡの平均塩基長の２倍以上である、請求項１から３いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
  5. 　前記単位ＤＮＡの各々の長さが１６００ｂｐ以下である請求項１から４いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
  6. 　前記単位ＤＮＡは、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いられるものであり、
    　前記単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、前記集積ＤＮＡの配列の塩基長を前記単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位ＤＮＡを設計する工程を含む、請求項１から５いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
  7. 　宿主微生物中で有効な複製開始点を含むベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる集積ＤＮＡユニットを、１を超えて含む微生物細胞形質転換用ＤＮＡ連結体の作製方法であって、
    　請求項１から６いずれかに記載の方法によって、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、
    　前記ベクターＤＮＡを準備する工程と、
    　調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
    　前記除去工程後、前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有し、
    　前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
    　前記集積ＤＮＡは、前記各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる、ＤＮＡ連結体の作製方法。
  8. 　集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される標的連結数のＤＮＡ断片の収率と、該ＤＮＡ断片の濃度の変動係数との関係式に基づいて、前記連結工程における前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡの濃度の変動係数を調節する工程を含む、請求項７記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
  9. 　前記制限酵素は、タイプＩＩ制限酵素である請求項７又は８記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
  10. 　前記除去工程の前に、調製後の単位ＤＮＡを含む溶液のうち、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合する工程を更に有する、請求項７から９いずれかに記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
  11. 　前記除去工程後、前記連結工程の前に、前記制限酵素を失活させる工程を更に有する、請求項７から１０いずれかに記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
  12. 　前記微生物が枯草菌である請求項７から１１いずれか記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
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