WO2015050170A1 - Influenza virus inhibitory drug - Google Patents

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勇作 上村
柏木　孝仁
好勇 原
渡邊　浩
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    • C12N2760/16133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory

Abstract

Provided is an anti-influenza drug that has a completely new action mechanism and is free from defects observed in conventional anti-influenza drugs such as vaccines and NA inhibitory drugs. A PA subunit fragment derived from influenza virus and an influenza virus inhibitory drug that comprises the PA subunit fragment derived from influenza virus.

Description

インフルエンザウイルス阻害薬Influenza virus inhibitor
　本発明は、インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片、および該断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬に関する。 The present invention relates to an influenza virus-derived PA subunit fragment and an influenza virus inhibitor containing the fragment.
　インフルエンザウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡをゲノムとして持つＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスの表現型またはゲノムの塩基配列は頻繁に変異し、場合により種の壁を超えて感染する。 Influenza virus is an RNA virus having minus-strand RNA as a genome. Influenza virus phenotypes or genomic base sequences are frequently mutated, and sometimes infect across species walls.
　インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子を構成するタンパク質の抗原性の違いから、Ａ型、Ｂ型およびＣ型の３属に分類されるが、人に感染を引き起こし、毎年冬期に流行を繰り返すのは、主にＡ型とＢ型である。 Influenza viruses are classified into three genera, type A, type B, and type C, based on the antigenicity of the proteins that make up the virus particles. A type and B type.
　大多数の現在のインフルエンザ薬は、ウイルス表面に存在するノイラミニダーゼ（ＮＡ）を標的とする。ビリオン表面に存在する抗原はヘマグルチニン（ＨＡ）とＮＡの２種類があり（非特許文献１）、１６種類のＨＡサブタイプおよび９種類の異なるＮＡサブタイプが同定されている（非特許文献２）。このサブタイプの組み合わせにより、インフルエンザウイルスの型（例えば、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型、Ｈ５Ｎ１型など）が決定される。例えば、オセルタミビル（「タミフル」として市販）とザナミビル（リレンザ）はＮＡ阻害薬であり、ウイルス粒子が感染細胞から放出されることを防ぐ（非特許文献３～６）。しかしながら、オセルタミビル耐性インフルエンザがすでに出現しており、またこの薬は因果関係が不明であるものの異常行動の報告があるため、１０歳上の未成年には投与を差し控える必要があり、小児においては対象児が投与後に一人にならないように配慮する必要がある。抗インフルエンザ薬のアマンタジンはＭ２タンパク質（ウイルスプロトンチャネル）を標的としており（非特許文献７）、また、別の薬剤が、インフルエンザ由来のＭ２タンパク質の立体構造に基づいて開発されている。しかしながら、Ｍ２タンパク質を標的とした薬物の場合、Ｍ２の単一の残基の変異によってウイルスが耐性を獲得できるため、多くの株に対して役に立たなくなる可能性がある。また、Ｂ型インフルエンザはＭ２を持たない。オセルタミビルとアマンダジンの両者は、単一の知られている機能とウイルス株の間で実質的な配列変異を獲得するタンパク質を標的とする。従って、ウイルスのライフサイクルにおける他のプロセスを破壊する新しいリード分子を開発する必要性がある。 The majority of current influenza drugs target neuraminidase (NA) present on the virus surface. There are two types of antigens present on the virion surface, hemagglutinin (HA) and NA (Non-Patent Document 1), and 16 HA subtypes and 9 different NA subtypes have been identified (Non-Patent Document 2). . The type of influenza virus (for example, H1N1, H3N2, H5N1, etc.) is determined by the combination of the subtypes. For example, oseltamivir (commercially available as “Tamiflu”) and zanamivir (Relenza) are NA inhibitors that prevent virus particles from being released from infected cells (Non-Patent Documents 3 to 6). However, oseltamivir-resistant influenza has already emerged, and this drug has an unknown cause-and-effect relationship, but abnormal behavior has been reported. It is necessary to consider that the target child will not be alone after administration. Amantadine, an anti-influenza drug, targets M2 protein (viral proton channel) (Non-patent Document 7), and another drug has been developed based on the three-dimensional structure of influenza-derived M2 protein. However, drugs that target the M2 protein may be useless for many strains because the virus can gain resistance through mutation of a single M2 residue. In addition, influenza B does not have M2. Both oseltamivir and amandadin target proteins that acquire substantial sequence variation between a single known function and virus strain. Therefore, there is a need to develop new lead molecules that disrupt other processes in the viral life cycle.
　インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、人への感染後、ウイルス増殖に関わる重要な役割を果たしているため、抗インフルエンザ薬のターゲットとなり得る。しかしながら、ウイルスＲＮＡポリメラーゼを標的としている薬物療法は現在のところ唯一、Ｔ７０５（一般名：ファビピラビル：富山化学）がある（非特許文献８）。ウイルスＲＮＡポリメラーゼは、ウイルスが複製するための広範な役割を担っている（非特許文献９）。このポリメラーゼは、ヘテロ三量体の複合体からなり、全分子量がほぼ２５０ｋＤａであり、ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２の３つのサブユニットから構成される（非特許文献１０）。これらの３つのサブユニットのすべてが、転写と複製の両方に必要である（非特許文献１１）。今までのところ、ＲＮＡポリメラーゼの構造に関する情報は、非常に限定されている（非特許文献１２～１４）。 Influenza virus RNA polymerase plays an important role in virus growth after human infection, and can therefore be a target for anti-influenza drugs. However, at present, the only drug therapy targeting viral RNA polymerase is T705 (generic name: favipiravir: Toyama Chemical) (Non-patent Document 8). Viral RNA polymerase plays a broad role for virus replication (Non-patent Document 9). This polymerase consists of a heterotrimeric complex, has a total molecular weight of approximately 250 kDa, and is composed of three subunits of PA, PB1 and PB2 (Non-patent Document 10). All three of these subunits are required for both transcription and replication (Non-Patent Document 11). So far, information on the structure of RNA polymerase is very limited (Non-Patent Documents 12 to 14).
　このように、インフルエンザに対する対策として現在行われているのは、ワクチンによる予防と、ノイラミニダーゼ阻害薬（以下、ＮＡ阻害薬）による治療である。しかしながら、ワクチンによる予防は完全ではなく、特に型予想が外れた場合にはその効果は著しく低下する。また、現在使用可能なＮＡ阻害薬は全て作用機序が同じであり、耐性ウイルスが生じた場合には、全ての薬剤に耐性となる可能性が高い。すなわち、変異ウイルスの生じやすいインフルエンザウイルスに対する対策として不十分である。 Thus, what is currently being implemented as a countermeasure against influenza is prevention with a vaccine and treatment with a neuraminidase inhibitor (hereinafter referred to as an NA inhibitor). However, vaccine protection is not complete, and its effectiveness is significantly reduced, especially when the type is not expected. In addition, all currently available NA inhibitors have the same mechanism of action, and if a resistant virus is generated, there is a high possibility of becoming resistant to all drugs. That is, it is insufficient as a countermeasure against influenza viruses that tend to produce mutant viruses.
　本発明らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットの断片がインフルエンザウイルスの遺伝子複製を停止させ、インフルエンザウイルスの増殖そのものを抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成させるに到った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have the effect that a fragment of the PA subunit, which is a protein of influenza virus itself, stops gene replication of influenza virus and suppresses the proliferation of influenza virus itself. As a result, the present invention has been completed.
　すなわち、本発明は、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットを利用したインフルエンザウイルスの阻害薬であり、現存するＮＡ阻害薬とは作用機序が全く異なる。ＮＡ阻害薬の作用機序は、ウイルスの放出阻害であるため、インフルエンザウイルスの増殖は阻害できない。一方で、本発明による阻害薬ではインフルエンザウイルスの遺伝子複製を停止する作用があるため、インフルエンザウイルスの増殖そのものを止める作用がある。またワクチンが特定の株に対する対抗手段であるのに対して、本発明の阻害薬は多くの株に対して一律に有効である。 That is, the present invention is an influenza virus inhibitor using the PA subunit, which is a protein of the influenza virus itself, and the mechanism of action is completely different from existing NA inhibitors. Since the mechanism of action of NA inhibitors is inhibition of virus release, influenza virus growth cannot be inhibited. On the other hand, since the inhibitor according to the present invention has an action of stopping gene replication of influenza virus, it has an action of stopping the proliferation of influenza virus itself. In addition, while the vaccine is a countermeasure against a specific strain, the inhibitor of the present invention is uniformly effective against many strains.
　本発明は、以下を含む。
［１］インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片。
［２］インフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、［１］に記載のＰＡサブユニット断片。
［３］ＰＡサブユニットのＮ末端断片である、［１］または［２］に記載のＰＡサブユニット断片。
［４］ＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、［１］ないし［３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［５］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［４］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［６］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、［５］に記載のＰＡサブユニット断片。
［７］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［６］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［８］配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、［１］ないし［７］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［９］配列番号４のアミノ酸配列を含む、［１］ないし［８］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１０］配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、［１］ないし［９］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１１］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［６］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１２］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［７］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１３］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［７］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１４］［１］ないし［１３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片をコードする核酸。
［１５］［１４］に記載の核酸を含む組換えベクター。
［１６］［１５］に記載のベクターを含む形質転換細胞。
［１７］インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬。
［１８］ＰＡサブユニット断片の由来するインフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、［１７］に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［１９］ＰＡサブユニット断片がＰＡサブユニットのＮ末端断片である、［１７］または［１８］に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２０］ＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、［１７］ないし［１９］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２１］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２０］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２２］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、［２１］に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２３］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２２］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２４］ＰＡサブユニット断片が配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、［１７］ないし［２３］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２５］ＰＡサブユニット断片が配列番号４のアミノ酸配列を含む、［１７］ないし［２４］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２６］ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、［１７］ないし［２５］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２７］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２２］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［２８］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［２９］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［３０］インフルエンザウイルスの遺伝子複製を阻害することによってウイルス増殖を阻害する、［１７］ないし［２９］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［３１］Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖を阻害する、［１７］ないし［３０］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The present invention includes the following.
[1] Influenza virus-derived PA subunit fragment.
[2] Influenza viruses are A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / HongKong / 156 / The PA subunit fragment according to [1], which is strain 97 (1997 avian H5N1) or A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1).
[3] The PA subunit fragment according to [1] or [2], which is an N-terminal fragment of the PA subunit.
[4] The PA subunit fragment according to any one of [1] to [3], wherein the PA subunit fragment retains endonuclease activity.
[5] The PA subunit fragment contains 28th proline (P), 86th methionine (M), 91st valine (V) and 100th valine (from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit ( The PA subunit fragment according to any one of [1] to [4], which is a PA subunit fragment comprising at least one amino acid selected from the group consisting of V).
[6] The PA subunit fragment contains 28th proline (P), 86th methionine (M), 91th valine (V) and 100th valine (N) from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit. The PA subunit fragment according to [5], which is a PA subunit fragment comprising V).
[7] The PA subunit fragment is a PA subunit fragment containing the 187th leucine (L) and / or the 188th tryptophan (W) from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit, [1] Thru | or the PA subunit fragment | piece in any one of [6].
[8] The PA subunit fragment according to any one of [1] to [7], which comprises the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
[9] The PA subunit fragment according to any one of [1] to [8], comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
[10] The PA subunit fragment according to any one of [1] to [9], which comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
[11] Any of [1] to [6], wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 187th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the natural PA subunit amino acid sequence A PA subunit fragment according to claim 1.
[12] Any of [1] to [7], wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 188th amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the natural PA subunit amino acid sequence A PA subunit fragment according to claim 1.
[13] Any of [1] to [7], wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 192nd amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the natural PA subunit amino acid sequence A PA subunit fragment according to claim 1.
[14] A nucleic acid encoding the PA subunit fragment according to any one of [1] to [13].
[15] A recombinant vector comprising the nucleic acid according to [14].
[16] A transformed cell comprising the vector according to [15].
[17] An influenza virus inhibitor comprising an influenza virus-derived PA subunit fragment.
[18] Influenza viruses derived from PA subunit fragments are A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2) The influenza virus inhibitor according to [17], which is A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian H5N1) or A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1).
[19] The influenza virus inhibitor according to [17] or [18], wherein the PA subunit fragment is an N-terminal fragment of the PA subunit.
[20] The influenza virus inhibitor according to any one of [17] to [19], wherein the PA subunit fragment retains endonuclease activity.
[21] The PA subunit fragment contains 28th proline (P), 86th methionine (M), 91th valine (V) and 100th valine (N) from the amino acid sequence of the natural PA subunit. The influenza virus inhibitor according to any one of [17] to [20], which is a PA subunit fragment comprising at least one amino acid selected from the group consisting of V).
[22] The PA subunit fragment contains 28th proline (P), 86th methionine (M), 91th valine (V) and 100th valine (N) from the amino acid sequence of the natural PA subunit. The influenza virus inhibitor according to [21], which is a PA subunit fragment comprising V).
[23] The PA subunit fragment is a PA subunit fragment containing the 187th leucine (L) and / or the 188th tryptophan (W) from the N-terminus of the amino acid sequence of the natural PA subunit, [17] Thru | or the influenza virus inhibitor in any one of [22].
[24] The influenza virus inhibitor according to any one of [17] to [23], wherein the PA subunit fragment comprises the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
[25] The influenza virus inhibitor according to any one of [17] to [24], wherein the PA subunit fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
[26] The influenza according to any one of [17] to [25], wherein the PA subunit fragment comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Virus inhibitor.
[27] Any of [17] to [22], wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 187th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the natural PA subunit amino acid sequence A PA subunit fragment according to claim 1.
[28] Any of [17] to [23], wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 188th amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the natural PA subunit amino acid sequence A PA subunit fragment according to claim 1.
[29] Any of [17] to [23], wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 192nd amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the natural PA subunit amino acid sequence A PA subunit fragment according to claim 1.
[30] The influenza virus inhibitor according to any one of [17] to [29], which inhibits virus growth by inhibiting gene replication of influenza virus.
[31] A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain ( Any of [17] to [30], which inhibits virus growth against any influenza virus strain selected from the group consisting of 1997 avian H5N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) An influenza virus inhibitor according to claim 1.
　本発明は、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットを利用したインフルエンザウイルスの阻害薬であり、タミフル等のインフルエンザ阻害薬の作用とは全く異なり、インフルエンザウイルス自体の増殖を抑制する画期的な作用を有する。また、その阻害効果も、従来のタミフル等と比較して格段に優れた効果を示し、マイクログラムオーダーの投与で増殖が１／１０００以下に抑制される。さらに、従来のインフルエンザ薬のようにウイルス表面に存在するＨＡやＮＡを標的とせず、遺伝子複製酵素を含むインフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸タンパク質複合体）に作用するため、単一のインフルエンザウイルス株のみを対象とせず、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株にも極端に優れた阻害作用があり、ウイルス株に依存しない幅広い適用が可能である。 The present invention is an influenza virus inhibitor using the PA subunit, which is a protein of the influenza virus itself, and is completely different from the action of an influenza inhibitor such as Tamiflu, and is an epoch-making that suppresses the growth of the influenza virus itself. Has an effect. In addition, the inhibitory effect is much superior to that of conventional Tamiflu and the like, and proliferation is suppressed to 1/1000 or less by administration on the microgram order. Furthermore, it does not target HA and NA existing on the virus surface like conventional influenza drugs, but acts on RNP (nucleic acid protein complex) of influenza virus containing gene replication enzyme. Not applicable, A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain Any influenza virus strain selected from the group consisting of (1997 avian H5N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) has an extremely excellent inhibitory action and has a wide range of applications independent of virus strain Is possible.
図１はインフルエンザウイルスのリバースジェネティクス法（ウイルスの人工合成法）を応用したインフルエンザウイルスのレプリコン構築を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the construction of an influenza virus replicon applying the influenza virus reverse genetics method (virus artificial synthesis method). 図２は本発明の実験系の概要を示す図である。ｍＲＮＡ：ウイルスのｍＲＮＡ；ｖＲＮＡ：ウイルスの遺伝子（ウイルスのゲノムＲＮＡ）；ｃＲＮＡ：ウイルス遺伝子の相補鎖FIG. 2 is a diagram showing an outline of the experimental system of the present invention. mRNA: viral mRNA; vRNA: viral gene (viral genomic RNA); cRNA: complementary strand of viral gene 図３は本発明の概要を示す概略図である。FIG. 3 is a schematic diagram showing an outline of the present invention. 図４は、本発明のＶＮ ＰＡ Ｎ２１２がＷＳＮ ＲＮＰの活性に対して低濃度の段階から著しい阻害活性を有することを示す図である。FIG. 4 is a graph showing that VN PA N212 of the present invention has significant inhibitory activity from the low concentration stage on the activity of WSN RNP. 図５は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２以外の他の株由来のＰＡサブユニット断片も同様の阻害活性を有することを示す図である。図５の左のパネルはルシフェラーゼの活性測定によるもの、図５の右のパネルはPrimer Extension Assayにて測定したものを示す。ＷＳＮ：Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）；ＮＴ：Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）；ＨＫ：Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）；ＶＮ：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株；ＳＷ：Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）FIG. 5 is a diagram showing that PA subunit fragments derived from strains other than VN PA N212 also have the same inhibitory activity. The left panel of FIG. 5 shows the measurement by luciferase activity, and the right panel of FIG. 5 shows the measurement by Primer Extension Extension. WSN: A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1); NT: A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2); HK: A / HongKong / 156/97 strain (1997 avian H5N1); VN: A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain; SW: A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) 図６は、特異性をさらに検証するために、ウミシイタケのルシフェラーゼをコントロールとして用いた測定を行った結果を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the results of measurement using Renilla luciferase as a control in order to further verify the specificity. 図７は、本発明のＶＮ ＰＡ Ｎ２１２がＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）以外の他の株へも同様に著しい阻害効果を有することを示す図である。ＷＳＮ：Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）；ＮＴ：Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）；ＨＫ：Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）；ＶＮ：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株；ＳＷ：Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）FIG. 7 is a diagram showing that VN PA N212 of the present invention has a significant inhibitory effect on other strains other than WSN (H1N1) as well. WSN: A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1); NT: A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2); HK: A / HongKong / 156/97 strain (1997 avian H5N1); VN: A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain; SW: A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) 図８は、インフルエンザウイルスのＲＮＰを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した結果を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing the results of confirming intracellular expression of each subunit constituting the RNP of influenza virus. 図９は、本発明のＶＮ ＰＡ Ｎ２１２ではエンドヌクレアーゼがＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることを示す図である。FIG. 9 is a diagram showing that endonuclease is involved in the loss (inhibition) of RNP in VN PA N212 of the present invention. 図１０は、本発明のＶＮ ＰＡ Ｎ２１２ではエンドヌクレアーゼがＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることを示す図である。FIG. 10 is a diagram showing that endonuclease is involved in the loss (inhibition) of RNP in VN PA N212 of the present invention. 図１１は、本発明のＶＮ ＰＡ Ｎ２１２によるインフルエンザウイルスのＲＮＰ活性を低下させる作用がＲＮＰ自体の喪失によって起こっていることを示す図である。FIG. 11 is a diagram showing that the action of reducing the RNP activity of influenza virus by VN PA N212 of the present invention is caused by the loss of RNP itself. 図１２は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のＮ末端付近でアミノ酸を欠失、あるいは中央部、またはＣ末端付近でアミノ酸を中抜きした各種ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の阻害活性を調べた結果を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing the results of examining the inhibitory activity of various VN PA N212 mutants in which amino acids were deleted near the N-terminus of VN PA 、 N212 or amino acids were omitted in the middle or near the C-terminus. 図１３は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のＣ末端付近でアミノ酸を欠失させた各種ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の阻害活性を調べた結果を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing the results of examining the inhibitory activity of various VN PA N212 mutants in which amino acids were deleted near the C-terminus of VN PA N212. 図１４は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のＮ末端から数えて１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を置換すると阻害活性が低下することを示す図である。FIG. 14 is a graph showing that the inhibitory activity decreases when 187th leucine (L) and 188th tryptophan (W) are substituted from the N-terminus of VNＶPA N212. 図１５は、プラスミドそのものではなく、プラスミドから発現されるＰＡサブユニット断片が阻害活性の本体であることを示す図である。FIG. 15 shows that the PA subunit fragment expressed from the plasmid, not the plasmid itself, is the main body of inhibitory activity. 図１６は、インフルエンザウイルスのＲＮＰを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した結果を示す図（Ａ、Ｃ）、および本発明のＶＮ ＰＡ Ｎ２１２ではエンドヌクレアーゼがＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることを示す図（Ｂ）である。FIG. 16 is a diagram showing the results of confirming intracellular expression of each subunit constituting RNP of influenza virus (A, C), and in the VN PA N212 of the present invention, endonuclease is responsible for the loss (inhibition) of RNP. It is a figure (B) which shows having been involved.
　本発明は、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットを利用したインフルエンザウイルスの阻害薬であり、現存するＮＡ阻害薬とは作用機序が全く異なる。ＮＡ阻害薬の作用機序は、ウイルスの放出阻害であるため、インフルエンザウイルスの増殖は阻害できない。一方、本発明による阻害薬ではインフルエンザウイルスの遺伝子複製を停止する作用があるため、インフルエンザウイルスの増殖そのものを止める作用がある。またワクチンが特定の株に対する対抗手段であるのに対して、本発明の阻害薬は多くの株に対して一律に有効である。 The present invention is an influenza virus inhibitor using the PA subunit, which is a protein of the influenza virus itself, and has a completely different mechanism of action from existing NA inhibitors. Since the mechanism of action of NA inhibitors is inhibition of virus release, influenza virus growth cannot be inhibited. On the other hand, since the inhibitor according to the present invention has an action of stopping gene replication of influenza virus, it has an action of stopping the proliferation of influenza virus itself. In addition, while the vaccine is a countermeasure against a specific strain, the inhibitor of the present invention is uniformly effective against many strains.
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention to this embodiment alone. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
　本発明の原理は以下のとおりである。図１はインフルエンザウイルスのリバースジェネティクス法（ウイルスの人工合成法）を応用したインフルエンザウイルスのレプリコン構築を示す。細胞内に、インフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸・タンパク質複合体）を構成するＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）およびＮＰタンパク質（核蛋白；ＮＰ）と、インフルエンザウイルスの遺伝子を改変（インフルエンザウイルスの遺伝子に代わってホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入）したｖＬＵＣをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドを利用して導入する。それぞれのプラスミドから生じたＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰはタンパク質として細胞内に発現し、ｖＬＵＣはウイルス様ＲＮＡとして細胞内に発現する。それぞれの構成成分は、２９３Ｔ細胞内で集合し、インフルエンザウイルスのＲＮＰ（ただし遺伝子はホタルルシフェラーゼ）を形成する。このＲＮＰは細胞内で自律的に遺伝子複製と転写を行える、つまり、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写を人工的に細胞内に構築したレプリコンである。また、遺伝子をホタルルシフェラーゼに置換しているためこのレプリコンの転写産物から生じてくるタンパク質は、インフルエンザウイルスのタンパク質ではなくホタルルシフェラーゼである。このホタルルシフェラーゼの活性を測定することで、インフルエンザウイルスＲＮＰの細胞内活性を評価できる。本発明では、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２断片を発現するプラスミドを加えることで、遺伝子の複製・転写活性がどのように変化したかを測定している。 The principle of the present invention is as follows. FIG. 1 shows the construction of an influenza virus replicon applying the influenza virus reverse genetics method (virus artificial synthesis method). In the cell, RNA polymerase PB1 subunit (PB1), RNA polymerase PB2 subunit (PB2), RNA polymerase PA subunit (PA) and NP protein (nuclear protein) constituting the RNP (nucleic acid / protein complex) of influenza virus NP) and vLUC modified with an influenza virus gene (introducing a firefly luciferase gene in place of the influenza virus gene) is introduced into HEK293T cells using a plasmid. PB1, PB2, PA and NP generated from each plasmid are expressed in the cell as proteins, and vLUC is expressed in the cells as virus-like RNA. Each component assembles in 293T cells to form the influenza virus RNP (where the gene is firefly luciferase). This RNP is a replicon in which gene replication and transcription can be autonomously performed in a cell, that is, gene replication and transcription of influenza virus are artificially constructed in the cell. In addition, since the gene is replaced with firefly luciferase, the protein generated from the transcript of this replicon is not an influenza virus protein but firefly luciferase. By measuring the activity of this firefly luciferase, the intracellular activity of influenza virus RNP can be evaluated. In the present invention, how a gene replication / transcription activity is changed by adding a plasmid expressing a VN PA N212 fragment is measured.
　同様に、図２を参照しながら本発明におけるＲＮＰ活性測定の原理を説明する。細胞内（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）に人工的にインフルエンザウイルスのＲＮＰを形成すると、このＲＮＰは自律的に遺伝子複製と転写を細胞内で行うことができる（インフルエンザウイルスのレプリコン）。複製・転写産物を細胞から抽出し、それぞれの核酸（ｍＲＮＡ（ウイルスのｍＲＮＡ）、ｖＲＮＡ（ウイルスの遺伝子；ウイルスのゲノムＲＮＡ）、ｃＲＮＡ（ウイルス遺伝 子の相補鎖））を特異的なプライマーを用いてＲＴ反応にて定量することで、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写活性を定量することができる。その際、インフルエンザウイルスの遺伝子配列をルシフェラーゼに置き換えておくと、ＲＮＰの転写活性により、ルシフェラーゼが産生されるため、ルシフェラーゼの活性を測定することで、簡便にＲＮＰの活性を測定することができる。この方法は、ＲＮＰ活性のスクリーニングに特に利用されている。 Similarly, the principle of RNP activity measurement in the present invention will be described with reference to FIG. When an influenza virus RNP is artificially formed in a cell (for example, HEK293T), the RNP can autonomously perform gene replication and transcription in the cell (influenza virus replicon). Extract replication / transcription products from cells and use specific primers for each nucleic acid (mRNA (viral mRNA), vRNA (viral gene; viral genomic RNA), cRNA (viral complementary strand)) By quantifying by RT reaction, gene replication and transcriptional activity of influenza virus can be quantified. At that time, if the gene sequence of the influenza virus is replaced with luciferase, luciferase is produced by the transcriptional activity of RNP. Therefore, the activity of RNP can be easily measured by measuring the activity of luciferase. This method is particularly utilized for screening for RNP activity.
　本発明者らは、上記のＲＮＰ活性測定系に基づいてＶＮ株のＰＡサブユニットのＮ末側断片（ＰＡサブユニットのＮ末端から２１２位アミノ酸までの断片；以下、「ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２」ともいう）をＷＳＮ株インフルエンザウイルスのＲＮＰに加えたところ、著しいＲＮＰ活性の低下が見られることを見出した（図３、図４参照）。一方、ＰＡサブユニットのＣ末側断片（ＰＡサブユニットからＶＮ ＰＡ Ｎ２１２を開裂した後の残りの断片；ＰＡサブユニットのＮ末端から２１３位～Ｃ末端までの断片）では殆ど活性低下は認められなかった。 The present inventors based on the above RNP activity measurement system, the N-terminal fragment of the PA subunit of the VN strain (fragment from the N-terminal to the 212th amino acid of the PA subunit; hereinafter also referred to as “VN PA N212”) ) Was added to the RNP of the WSN strain influenza virus, it was found that a significant decrease in RNP activity was observed (see FIGS. 3 and 4). On the other hand, almost no decrease in activity was observed in the C-terminal fragment of the PA subunit (the remaining fragment after VNＶPA N212 was cleaved from the PA subunit; the fragment from the N-terminal position to the C-terminal position of the PA subunit). There wasn't.
　このように、本発明は、特定の株から単離されたＰＡサブユニットの一部断片に著しい遺伝子複製酵素阻害効果があるとの知見に基づくものである。すなわち、インフルエンザウイルスをもってインフルエンザウイルスを阻害できるという知見である。その作用機序には未だ不明な点が残されているが、遺伝子複製酵素を含むインフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸タンパク質複合体）に作用し、インフルエンザウイルスの遺伝子複製活性および転写活性を喪失させる作用が確認できている。また、その作用にはＰＡサブユニット断片に含まれるエンドヌクレアーゼ部位が関与しており、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが推測されている。この断片は著しい阻害活性を有しており、また現存するＮＡ阻害薬とは全く作用機序が異なることから、次世代のインフルエンザウイルス阻害薬として有望であると考えられる。また、様々な株に対する阻害効果を確認したところ、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）の何れに対しても効果が認められ、株に依存しない幅広い適応が可能であると考えられる。 Thus, the present invention is based on the knowledge that a partial fragment of the PA subunit isolated from a specific strain has a significant gene replication enzyme inhibitory effect. That is, it is the knowledge that influenza virus can be inhibited with influenza virus. The mechanism of action still remains unclear, but it acts on RNP (nucleic acid protein complex) of influenza virus containing gene replication enzyme, and has the effect of losing gene replication activity and transcription activity of influenza virus. Confirmed. In addition, the endonuclease site contained in the PA subunit fragment is involved in the action, and it is speculated that it specifically acts on the influenza virus RNP. This fragment has a remarkable inhibitory activity and has a completely different mechanism of action from existing NA inhibitors, so it is considered promising as a next-generation influenza virus inhibitor. Moreover, when the inhibitory effect with respect to various strains was confirmed, A / WSN / 33 strain (Soviet type H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997) An effect is recognized for any of the avian type H5N1) or the A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1), and it is considered that a wide range of adaptation not depending on the strain is possible.
　本発明のＰＡサブユニット断片は、インフルエンザウイルスのいずれの株に由来するものであってもよい。好ましくは、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株から本発明のＰＡサブユニット断片を得ることができる。他のインフルエンザウイルス株、例えば、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）から本発明のＰＡサブユニット断片を得ることもできる。Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）はインフルエンザの研究で用いられる一般的な株であり、過去に流行していた季節性のソ連型と同系列である。Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）もインフルエンザの研究で用いられる一般的な株であり、現在も流行している季節性の香港型と同系列である。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）は１９９７年にヒトに感染した高病原性トリインフルエンザである。Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）は２００９年に発生したパンデミック株（久留米大学医学部感染医学講座臨床感染医学部門分離）である。 The PA subunit fragment of the present invention may be derived from any strain of influenza virus. Preferably, the PA subunit fragment of the present invention can be obtained from the A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain. Other influenza virus strains, such as A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian H5N1) or The PA subunit fragment of the present invention can also be obtained from the A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1). The A / WSN / 33 strain (Soviet type H1N1) is a common strain used in influenza research, and is in the same series as the seasonal Soviet type that was prevalent in the past. The A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2) is also a common strain used in influenza research and is in the same series as the seasonal Hong Kong type that is still prevalent. The A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian H5N1) is a highly pathogenic avian influenza that infects humans in 1997. The A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) is a pandemic strain (separated from Kurume University School of Medicine, Department of Infectious Medicine, Clinical Infectious Medicine Division) that was developed in 2009.
　本発明のＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末端断片であることが好ましい。そのようなＮ末端断片としては、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片が挙げられる。具体的なアミノ酸配列は以下のとおりである。
MetGluAspPheValArgGlnCysPheAsnProMetIleValGluLeuAlaGluLysAlaMetLysGluTyrGlyGluAspProLysIleGluThrAsnLysPheAlaAlaIleCysThrHisLeuGluValCysPheMetTyrSerAspPheHisPheIleAspGluArgSerGluSerIleIleValGluSerGlyAspProAsnAlaLeuLeuLysHisArgPheGluIleIleGluGlyArgAspArgThrMetAlaTrpThrValValAsnSerIleCysAsnThrThrGlyValGluLysProLysPheLeuProAspLeuTyrAspTyrLysGluAsnArgPheIleGluIleGlyValThrArgArgGluValHisThrTyrTyrLeuGluLysAlaAsnLysIleLysSerGluLysThrHisIleHisIlePheSerPheThrGlyGluGluMetAlaThrLysAlaAspTyrThrLeuAspGluGluSerArgAlaArgIleLysThrArgLeuPheThrIleArgGlnGluMetAlaSerArgGlyLeuTrpAspSerPheArgGlnSerGluArgGlyGluGluThrIleGluGluLysPheGluIleThrGlyThrMetArg（配列番号４） The PA subunit fragment of the present invention is preferably an N-terminal fragment of the PA subunit. Examples of such an N-terminal fragment include a fragment having an amino acid sequence from the N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit. The specific amino acid sequence is as follows.
(SEQ ID NO: 4)
　本発明の他の好ましいＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片である（配列番号５）。本発明のさらに他の好ましいＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末から少なくとも１８８アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片である（配列番号６）。本発明のさらに他の好ましいＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末から少なくとも１９２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片である（配列番号７）。 Another preferred PA subunit fragment of the present invention is a fragment having an amino acid sequence from the N terminus of the PA subunit to at least 187 amino acids (SEQ ID NO: 5). Yet another preferred PA subunit fragment of the present invention is a fragment having an amino acid sequence from the N-terminus of the PA subunit to at least 188 amino acids (SEQ ID NO: 6). Yet another preferred PA subunit fragment of the present invention is a fragment having an amino acid sequence from the N-terminus of the PA subunit to at least 192 amino acids (SEQ ID NO: 7).
　これまでに報告されたＰＡのＮ末端の機能には、エンドヌクレアーゼとプロテアーゼがある。エンドヌクレアーゼは細胞のｍＲＮＡをターゲットとしており、細胞由来のｍＲＮＡキャップを切り取る作用がある。またプロテアーゼの基質は未だ不明である。この何れの機能も活性中心が報告されているので（エンドヌクレアーゼの活性中心：Ｄ１０８位；プロテアーゼの活性中心：Ｔ１５７位）、本発明らは、それぞれの活性中心のアミノ酸を置換した変異体を作成し、阻害効果を確認した。 The functions of PA N-terminal reported so far include endonuclease and protease. Endonucleases target cellular mRNAs and have the effect of cleaving cellular mRNA caps. In addition, the protease substrate is still unknown. Since active centers have been reported for any of these functions (endonuclease active center: D108 position; protease active center: T157 position), the present inventors have created mutants in which the amino acids at the respective active centers are substituted. The inhibitory effect was confirmed.
　その結果、Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ（プロテアーゼ活性欠失体）では阻害効果が維持されたのに対して、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａ（エンドヌクレアーゼ活性欠失体）では阻害活性が失われた（実施例６、図９）。このことからエンドヌクレアーゼがＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることが示唆された。なお、本明細書において「Ｔ１５７Ａ」や「Ｄ１０８Ａ」は特定のアミノ酸残基で別のアミノ酸残基に置換されていることを表し、例えば、「Ｔ１５７Ａ」は１５７位のＴがＡに置換されていることを表す。 As a result, the inhibitory effect was maintained in N212 / T157A (protease activity deficient), whereas the inhibitory activity was lost in N212 / D108A (endonuclease deficient) (Example 6, FIG. 9). ). This suggested that endonuclease is involved in the loss (inhibition) of RNP. In this specification, “T157A” and “D108A” indicate that a specific amino acid residue is substituted with another amino acid residue. For example, “T157A” is a case where T at position 157 is substituted with A. Represents that
　それゆえ、本発明のＰＡサブユニット断片は、そのエンドヌクレアーゼ活性が保持されている限り、ＰＡサブユニットからのどのような断片であってもよい。例えば、本発明のＰＡサブユニット断片は、そのエンドヌクレアーゼ活性が保持されている限り、そのアミノ酸長に制限はなく、上記配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる断片以外にも、Ｎ末端から１８０位、１９０位、２００位、２１０位、２２０位、または２３０位までのアミノ酸からなる断片であってよい。 Therefore, the PA subunit fragment of the present invention may be any fragment from the PA subunit as long as its endonuclease activity is retained. For example, the PA subunit fragment of the present invention is not limited in its amino acid length as long as its endonuclease activity is retained. In addition to the fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the PA subunit fragment of It may be a fragment consisting of amino acids up to position 190, 200, 210, 220, or 230.
　ＰＡサブユニットの各種Ｎ末端断片についてエンドヌクレアーゼ活性をさらに詳細に検討したところ、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうち、Ｎ末から２～１０までのアミノ酸、Ｎ末から２～２２までのアミノ酸、Ｎ末から２～４０までのアミノ酸、Ｎ末から２～６０までのアミノ酸、Ｎ末から２～８０までのアミノ酸、Ｎ末から２～１００までのアミノ酸、およびＮ末から２～１０７までのアミノ酸をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが見出された。このことから、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうちＮ末側のアミノ酸はエンドヌクレアーゼ活性にとって特に重要であることがわかった。 The endonuclease activity of various N-terminal fragments of the PA subunit was examined in more detail. Among the fragments having the amino acid sequence from the N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit, the amino acids from the N-terminal to 2 to 10 amino acids, N Amino acids from the end to 2-22, amino acids from the N end to 2 to 40, amino acids from the N end to 2 to 60, amino acids from the N end to 2 to 80, amino acids from the N end to 2 to 100, and It was found that the inhibitory activity was lost when amino acids from N-terminal to 2 to 107 were deleted respectively. From this, it was found that the amino acid at the N-terminal side of the fragment having the amino acid sequence from the N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit is particularly important for the endonuclease activity.
　さらに、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうち、Ｎ末から７～１０７までのアミノ酸、Ｎ末から２７～１０７までのアミノ酸、Ｎ末から４７～１０７までのアミノ酸、Ｎ末から６７～１０７までのアミノ酸、Ｎ末から８７～１０７までのアミノ酸、Ｎ末から１６～２６までのアミノ酸、Ｎ末から２９～８５までのアミノ酸、Ｎ末から５２～７５までのアミノ酸、Ｎ末から５２～８３までのアミノ酸、Ｎ末から１１０～１３２までのアミノ酸、Ｎ末から１３７～１６４までのアミノ酸およびＮ末から１３６～１８６までのアミノ酸をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが見出され、上記断片のＮ末端付近、中央部、およびＣ末端付近のいずれの部位を中抜きしても阻害活性が喪失することが見出されたことから、エンドヌクレアーゼ活性にとって立体構造が重要であることがわかった。 Furthermore, among the fragments having the amino acid sequence from the N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit, the amino acids from the N-terminal to 7-107, the amino acids from the N-terminal to 27-107, the amino acids from the N-terminal to 47-107 , Amino acids from N-terminal to 67-107, amino acids from N-terminal to 87-107, amino acids from N-terminal to 16-26, amino acids from N-terminal to 29-85, amino acids from N-terminal to 52-75 Inhibitory activity is lost when amino acids from N-terminal to 52-83, amino acids from N-terminal to 110-132, amino acids from N-terminal to 137-164 and amino acids from N-terminal to 136-186 are deleted. The inhibitory activity is lost even if any part of the fragment near the N-terminal, central part, or C-terminal is omitted. Since the bets has been found, it was found that the three-dimensional structure for endonuclease activity is important.
　一方、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうち、１３６からＣ末まで、１５３からＣ末まで、１７３からＣ末まで、１７７からＣ末まで、１８１からＣ末まで、１８５からＣ末まで、１８６からＣ末まで、および１８７からＣ末までのアミノ酸をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失するが、１８８からＣ末まで、１８９からＣ末まで、および１９３からＣ末までのアミノ酸をそれぞれ欠失させても阻害活性は喪失しないことが見出された。このことから、エンドヌクレアーゼ活性にはＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることがわかった。さらに、１８９からＣ末まで、および１９３からＣ末までのアミノ酸を欠失させたものは、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片よりも阻害活性が強くなることもわかった。 On the other hand, among the fragments having an amino acid sequence from N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit, from 136 to C-terminal, from 153 to C-terminal, from 173 to C-terminal, from 177 to C-terminal, from 181 to C-terminal , 185 to C-terminal, 186 to C-terminal, and 187 to C-terminal amino acid deletion, respectively, results in loss of inhibitory activity, but from 188 to C-terminal, 189 to C-terminal, and 193 to C-terminal It was found that the inhibitory activity was not lost even if each amino acid was deleted. From this, it was found that an amino acid sequence from N-terminal to at least 187 amino acids is essential for endonuclease activity. Furthermore, it was also found that the deletion of amino acids from 189 to C-terminal and from 193 to C-terminal had stronger inhibitory activity than the fragment having the amino acid sequence from N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit. It was.
　また、ＰＡサブユニット断片の阻害活性についてさらに詳細に検討したところ、ＰＡサブユニット断片の阻害活性には、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から数えて２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むことが必須であることがわかった。すなわち、これら４つのアミノ酸残基は、ＰＡのエンドヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす必須のアミノ酸といえる。従って、本発明のＰＡサブユニット断片は、そのエンドヌクレアーゼ活性を保持するためには、上記４つのアミノ酸残基の少なくとも１のアミノ酸を含んでいることが必要である。 Further, when the inhibitory activity of the PA subunit fragment was examined in more detail, the inhibitory activity of the PA subunit fragment includes the 28th proline (P), 86 counted from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit. It was found that it was essential to contain at least one amino acid selected from the group consisting of the th methionine (M), the 91 st valine (V) and the 100 th valine (V). That is, these four amino acid residues can be said to be essential amino acids that affect the endonuclease activity of PA. Therefore, the PA subunit fragment of the present invention needs to contain at least one amino acid of the above four amino acid residues in order to retain its endonuclease activity.
　さらに、上記のようにＰＡサブユニット断片の阻害活性には天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることから、Ｎ末端から数えて１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性にとって重要なアミノ酸であることが推測される。そのため、これらアミノ酸残基を置換して阻害活性に影響が出ないか調べたところ、これらアミノ酸残基のアラニン置換体は阻害活性がかなり低減することが認められた（実施例１１）。それゆえ、１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性を保持するために必須であることがわかった。 Furthermore, since the amino acid sequence from the N-terminal to at least 187 amino acids of the amino acid sequence of the natural PA subunit is essential for the inhibitory activity of the PA subunit fragment as described above, the 187th leucine ( L) and 188th tryptophan (W) are speculated to be important amino acids for endonuclease activity. Therefore, when these amino acid residues were substituted to examine whether the inhibitory activity was affected, it was found that the alanine-substituted products of these amino acid residues significantly reduced the inhibitory activity (Example 11). Therefore, the 187th leucine (L) and the 188th tryptophan (W) were found to be essential to retain endonuclease activity.
　本発明のＰＡサブユニット断片はまた、配列番号４のアミノ酸配列において、または上記各種ＰＡサブユニット断片において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むものであってよい。ここで、欠失、置換または付加されるアミノ酸の総数および位置は、得られるＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している限り、特に限定されるものではない。欠失、置換または付加されるアミノ酸の総数は１または複数個、好ましくは１または数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個であり、置換に関しては通常１～２０個、好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～３個であり、付加に関しては通常１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個である。 The PA subunit fragment of the present invention also includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or in the various PA subunit fragments described above. Good. Here, the total number and position of amino acids to be deleted, substituted or added are not particularly limited as long as the obtained PA subunit fragment retains endonuclease activity. The total number of amino acids to be deleted, substituted or added is 1 or more, preferably 1 or several, and the specific range thereof is usually 1 to 10, preferably 1 to 5 for deletion, More preferably, the number is 1 to 2, the substitution is usually 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 3, and the addition is usually 1 to 10, preferably 1 to 5. The number is more preferably 1-2.
　上記の変異型ＰＡを調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。 In order to introduce a mutation into a polynucleotide to prepare the above mutant PA, a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Use Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio) Can do.
　ＰＡを製造する方法としては、ＰＡをコードする遺伝子を、そのタンパク質が発現するのに適した形態で適宜発現用ベクター内に組み込んだベクターを作製し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、あるいは酵母や大腸菌等の微生物のいずれかに導入した形質転換体を作製して、その形質転換体を培養する方法が挙げられる。また、無細胞系タンパク質合成による製造方法を採用することも可能である。無細胞系タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うことができ、そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTMSystem（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。 As a method for producing PA, a vector in which a gene encoding PA is appropriately incorporated into an expression vector in a form suitable for the expression of the protein is prepared, and an animal cell, plant cell, insect cell, or yeast is prepared. And a method of preparing a transformant introduced into any one of microorganisms such as Escherichia coli and Escherichia coli, and culturing the transformant. It is also possible to employ a production method based on cell-free protein synthesis. Cell-free protein synthesis can be performed using commercially available kits. Examples of such kits include reagent kits PROTEIOSTM (Toyobo), TNTTMSystem (Promega), synthesizer PG-Mate TM (Toyobo), RTS (Roche Diagnostics).
　このような形質転換体または無細胞系タンパク質合成により生産されたＰＡは、所望によりその物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作により分離、精製することができる。精製方法としては、例えば通常の塩析法、遠心分離、超音波破砕、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せを例示できる。 Such a transformant or PA produced by cell-free protein synthesis can be separated and purified by various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, etc., if desired. Examples of the purification method include various types of liquid chromatography such as normal salting-out, centrifugation, ultrasonic crushing, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), and dialysis. And combinations thereof.
　また、ＰＡを調製するその他の方法として、ＰＡがアフィニティータグを融合した形になるように形質転換体または無細胞系タンパク質合成で産生させ、ＰＡを分離、精製する方法を例示することができる。 Further, as another method for preparing PA, there can be exemplified a method in which PA is produced by transformant or cell-free protein synthesis so that PA is fused with an affinity tag, and PA is separated and purified.
　本発明はまた、上記ＰＡサブユニット断片をコードする核酸をも提供する。斯かる核酸としては、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸が挙げられる。具体的なヌクレオチド配列は以下のとおりである。
atggaagactttgtgcgacaatgcttcaatccaatgattgtcgagcttgcggaaaaggcaatgaaagaatatggggaagatccgaaaatcgaaacgaacaagtttgctgcaatatgcacacacttggaggtctgtttcatgtattcggattttcactttattgatgaacggagtgaatcaataattgtagaatctggagatccgaatgcattattgaaacaccgatttgaaataattgaaggaagagaccgaacgatggcctggactgtggtgaatagtatctgcaacaccacaggagttgagaaacctaaatttctcccagatttgtatgactacaaagagaaccgattcatcgaaattggagtgacacggagggaagttcatacatactatctggagaaagccaacaagataaaatccgagaagacacatattcacatattctcattcacaggggaggaaatggccaccaaagcggactacacccttgatgaagagagcagggcaagaattaaaaccaggctgttcaccataaggcaggaaatggccagtaggggtctatgggattcctttcgtcaatccgagagaggcgaagagacaattgaagaaaaatttgaaatcactggaaccatgcgctag（配列番号３） The present invention also provides a nucleic acid encoding the PA subunit fragment. Such a nucleic acid includes a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence from the N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit. The specific nucleotide sequence is as follows.
(SEQ ID NO: 3)
　本発明はまた、上記核酸を含む組換えベクターをも提供する。組換えベクターを作製するには、目的とするポリペプチドのコード領域を含む適切な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするポリペプチドのコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。次いで、このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して、組換えベクターを作製することができる（例えば、Molecular Cloning2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989を参照）。 The present invention also provides a recombinant vector containing the nucleic acid. In order to produce a recombinant vector, a DNA fragment of an appropriate length containing the coding region of the target polypeptide is prepared. Nucleotides may be substituted in the nucleotide sequence of the coding region of the polypeptide of interest so as to be the optimal codon for expression in the host cell. This DNA fragment can then be inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector to produce a recombinant vector (eg, Molecular® Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). See).
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。 As expression vectors, plasmids derived from E. coli (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (pUB110, pTP5, pC194, etc.), plasmids derived from yeast (pSH19, pSH15, etc.), bacteriophages such as λ phage, etc. In addition, animal viruses such as retrovirus and vaccinia virus, and insect pathogenic viruses such as baculovirus can be used.
　発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合サイト、種々のシグナル配列（スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルなど）、クローニングサイト、翻訳・転写ターミネーター、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを付加してもよい。このようなベクターの例としては、ｐＧＥＸシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET Expression Syetem（Novagen社）などを例示することができる。 A promoter, enhancer, ribosome binding site, various signal sequences (splicing signal, poly A addition signal, etc.), cloning site, translation / transcription terminator, selection marker, SV40 replication origin, etc. may be added to the expression vector. Examples of such vectors include pGEX series (Amersham Pharmacia Biotech), pET® Expression® System (Novagen), and the like.
　本発明はまた、上記ベクターを含む形質転換細胞をも提供する。組換えベクターを宿主細胞に導入するには、Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。 The present invention also provides a transformed cell containing the above vector. In order to introduce a recombinant vector into a host cell, a method described in Molecular® Cloning® 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 (for example, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, transfection method) , Microinjection method, lipofection method, electroporation method, transduction method, scrape loading method, shotgun method, etc.) or infection.
　宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、植物細胞などを例示することができる。本発明の実施例ではＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。 Host cells include bacterial cells (eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus, etc.), insect cells (eg, S2 cells, Sf cells, etc.), animal cells ( Examples thereof include CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells), plant cells, and the like. In the examples of the present invention, HEK293T cells were used.
　本発明はまた、本発明のインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬をも提供する。上記インフルエンザウイルス阻害薬は、本発明のインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を有効成分として少なくとも１種以上含んでおり、必要に応じて薬学的に許容される添加物を含んでいてもよい。 The present invention also provides an influenza virus inhibitor containing the influenza virus-derived PA subunit fragment of the present invention. The said influenza virus inhibitor contains at least 1 sort (s) or more of the influenza virus origin PA subunit fragment of this invention as an active ingredient, and may contain the pharmaceutically acceptable additive as needed.
　本発明のインフルエンザウイルス阻害薬は、経口、非経口または局所的な経路のいずれかにより投与することができる。投与量は、治療対象動物（哺乳類、特にはヒト）の種およびその薬剤に対する個体の応答性、並びに選択される製剤の剤形および投与時間や間隔などに依存して変化するが、一般には、前記インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片約１０ｍｇから約２００ｍｇ／日、好ましくは約１５ｍｇから約１５０ｍｇ／日、さらに好ましくは約２０ｍｇから約１００ｍｇ／日の範囲の用量で投与することができる。本発明のインフルエンザウイルス阻害薬は、前記のインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片以外に、場合により医薬的に許容することのできる公知の担体若しくは希釈剤との組合せで、経口、非経口または局所的な経路のいずれかにより、単回または複数回で投与することができる。本発明のインフルエンザウイルス阻害薬は、種々の異なる剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー、粉末剤、スプレー剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁剤、注射用溶液剤、エリキシル剤、またはシロップ剤などにすることができる。 The influenza virus inhibitor of the present invention can be administered by any of oral, parenteral or topical routes. The dose varies depending on the species of the animal to be treated (mammals, particularly humans) and the individual's responsiveness to the drug, the dosage form of the selected preparation, and the administration time and interval. The influenza virus-derived PA subunit fragment can be administered at a dose ranging from about 10 mg to about 200 mg / day, preferably from about 15 mg to about 150 mg / day, more preferably from about 20 mg to about 100 mg / day. The influenza virus inhibitor of the present invention, in addition to the above-mentioned influenza virus-derived PA subunit fragment, optionally in combination with a known pharmaceutically acceptable carrier or diluent, orally, parenterally or topically It can be administered in a single dose or multiple doses depending on any route. The influenza virus inhibitor of the present invention has various different dosage forms such as tablets, capsules, lozenges, troches, hard candy, powders, sprays, creams, ointments, suppositories, jelly, gels Preparations, pastes, lotions, ointments, aqueous suspensions, solutions for injection, elixirs, syrups, and the like.
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples.
インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片によるインフルエンザウイルスの増殖抑制
　Ｅ－ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）（日水）培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Human Embryonic Kidney Cell）を７５ｃｍ２フラスコにて８０％コンフルエントまで３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。２９３Ｔ細胞の培地を丁寧に取り除き、１ｍｌの０.２５％トリプシン（１ｍＭ ＥＤＴＡ含む）（Nakarai）で処理し、３０ｍｌのＥ－ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含む）を加え縣濁した。懸濁細胞液を６穴プレートに各２ｍｌ撒いた。 Inhibition of Influenza Virus Growth by Influenza Virus-Derived PA Subunit Fragment Using E-MEM (10% FBS) (Nissui) medium, HEK293T cells (Human Embryonic Kidney Cell) were incubated at 37 ° C. in a 75 cm 2 flask to 80% confluence. The culture was performed in the presence of 5% CO 2 . The medium of 293T cells was carefully removed and treated with 1 ml of 0.25% trypsin (containing 1 mM EDTA) (Nakarai), and 30 ml of E-MEM (containing 10% FBS) was added and suspended. 2 ml of each suspended cell solution was spread on a 6-well plate.
　インフルエンザウイルスのＲＮＰ構築用のプラスミドをそれぞれ０.２μｇ／μｌにて調製した。ＲＮＰ構成タンパク質は、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰの４種類であった。鋳型用ＲＮＡとしては、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）由来のＮＡ遺伝子、またはＮＡ遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置換したものを用いた。各構成タンパク質をコードする核酸はｐｃＤＮＡ３.１（＋）（Invitrogen）に挿入したものを用いた。鋳型用ＲＮＡはｐＰＯＬＩ（Fodor E, et al. J Virol 76: 8989-9001. 2002）に挿入したものを用いた。 Influenza virus RNP construction plasmids were prepared at 0.2 μg / μl, respectively. There were four types of RNP constituent proteins: PB1, PB2, PA, and NP derived from A / WSN / 33 (H1N1). As the template RNA, the NA gene derived from A / WSN / 33 (H1N1), or one obtained by replacing the NA gene with a luciferase gene was used. The nucleic acid encoding each constituent protein was inserted into pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). The template RNA used was inserted into pPOLI (FodorFE, et al. J Virol 76: 8989-9001. 2002).
　阻害薬として利用するＰＡ断片の発現用プラスミドも同様に０.２μｇ／μｌに調製した。この発現用プラスミドは、阻害効果のある目的部位株（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））由来ＰＡのＮ末端２１２アミノ酸（「ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２」）をｐｃＤＮＡ３.１（＋）（Invitrogen）に挿入したものであった。また、阻害効果の比較対象として、ＰＡのＣ末端５０５アミノ酸（ＰＡ Ｃ７１６）を用いた。 Similarly, a plasmid for expression of the PA fragment used as an inhibitor was also prepared at 0.2 μg / μl. In this expression plasmid, the N-terminal 212 amino acids (“VN PA N212”) of PA derived from the target site strain having an inhibitory effect (A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1)) were transferred to pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). It was what was inserted. Moreover, C-terminal 505 amino acids of PA (PA C716) were used as a comparison target of the inhibitory effect.
　１.５ｍｌテューブにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）５０μｌを入れ、上記ＲＮＰ構築用プラスミドを各１μｌずつ加えた。同じテューブに、上記ＰＡ断片の発現用プラスミドを１μｌ加えた。新しい１.５ｍｌテューブにＯｐｔｉ－ＭＥＭ２５０μｌを入れ、Lipofectamine2000（Invitrogen）を２４μｌ加え、軽く縣濁した。これに上記プラスミド溶液を加え、軽く縣濁の後、室温で２０分間インキュベートした。この懸濁液３００μｌ（全量）をプレート上の懸濁細胞液に接種した。細胞を３０時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養液を取り除き、細胞を細胞懸濁液（Cell lysis buffer, Promega）に縣濁したものをルシフェラーゼの活性測定（Luciferase活性測定用キット、Promega）に用いた。活性測定は、Promegaの添付マニュアルに準じて行った（測定機器：EG&G BERTHOLD, Lumat LB 9507）。またはトータルＲＮＡを抽出しＲＮＰ活性をPrimer Extension Assay（T. Kashiwagi, et al. PLoS ONE 4(5): e5473. 2009）にて測定した。 50 μl of Opti-MEM (GIBCO) was placed in a 1.5 ml tube, and 1 μl of each of the above RNP construction plasmids was added. To the same tube, 1 μl of the expression plasmid for the PA fragment was added. In a new 1.5 ml tube, 250 μl of Opti-MEM was added, 24 μl of Lipofectamine2000 (Invitrogen) was added, and lightly suspended. The above-mentioned plasmid solution was added to this, lightly suspended, and incubated at room temperature for 20 minutes. 300 μl (total volume) of this suspension was inoculated into the suspension cell solution on the plate. Cells were cultured for 30 hours at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . The culture solution was removed, and the cells suspended in a cell suspension (Cell lysis buffer, Promega) were used for luciferase activity measurement (Luciferase activity measurement kit, Promega). The activity was measured according to the manual attached to Promega (measuring instrument: EG & G BERTHOLD, Lumat LB 9507). Alternatively, total RNA was extracted and RNP activity was measured by Primer Extension Assay (T. Kashiwagi, et al. PLoS ONE 4 (5): e5473. 2009).
　結果を図４に示す。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２は著しい阻害活性を示しており、低濃度の段階からＷＳＮ ＲＮＰの活性が顕著な低下を示すことがわかった。 The results are shown in FIG. VN PA N212 showed significant inhibitory activity, and it was found that the activity of WSN RNP showed a marked decrease from the low concentration stage.
他のインフルエンザウイルス株由来ＰＡサブユニット断片によるインフルエンザウイルスの増殖抑制
　実施例１と同様の手順により、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株以外の他のインフルエンザウイルス株由来のＰＡサブユニット断片についてインフルエンザウイルスの増殖抑制効果を調べた。他のインフルエンザウイルス株としては、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）を用いた。ルシフェラーゼによるレポーターアッセイによる確認だけでなく、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写活性を特異的に検出できる実験系（Primer Extension Assay）でも確認を行った。 Inhibition of growth of influenza virus with other influenza virus strain-derived PA subunit fragments About PA subunit fragments derived from other influenza virus strains other than A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) by the same procedure as in Example 1. The growth inhibitory effect of influenza virus was examined. Other influenza virus strains include A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian H5N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) was used. In addition to confirmation by luciferase reporter assay, confirmation was also made in an experimental system (Primer Extension Assay) that can specifically detect gene replication and transcriptional activity of influenza virus.
　結果を図５に示す。図５左パネルに示す結果から明らかなように、上記のいずれのインフルエンザウイルス株由来のＰＡサブユニット断片も阻害活性を示したが、Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）由来のＰＡサブユニット断片にＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）と同程度の著しい阻害活性が認められた。Primer Extension Assayによる測定でも同様の結果が得られた（図５右パネル）。また、インターナルコントロールである５Ｓ ｒＲＮＡには変化がないことから、インフルエンザウイルスの遺伝子複製に特異的に作用していることが示唆された。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）とＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）のＰＡサブユニットは分子系統上近縁であり、この２つの株に特有のアミノ酸配列が阻害に関与していることが示唆された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in the left panel of FIG. 5, the PA subunit fragment derived from any of the above influenza virus strains showed inhibitory activity, but PA derived from the A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1). A significant inhibitory activity similar to that of A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) was observed in the subunit fragment. Similar results were obtained by measuring with Primer Extension (Figure 5 right panel). Moreover, since there was no change in 5S rRNA which is an internal control, it was suggested that it specifically acts on gene replication of influenza virus. The PA subunits of A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 (2009 pandemic H1N1) are closely related in molecular lineage, and the amino acid sequences unique to these two strains are involved in inhibition It was suggested that
ウミシイタケルシフェラーゼを用いた阻害活性の測定
　特異性をさらに検証するため、ウミシイタケルシフェラーゼをコントロールとして用いた測定を行った。実施例１に記載のプラスミドに加えて、ウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドとしてpRL-TKを用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。
　ホタルルシフェラーゼは、細胞内の人工インフルエンザウイルスＲＮＰから生成されるのに対し、ウミシイタケルシフェラーゼは、インフルエンザウイルスＲＮＰとは完全に独立して細胞内に発現した（インターナルコントロール）。この２つのルシフェラーゼは発色基質が異なり、PromegaのDual luciferase測定キットを用いることで、２つのルシフェラーゼの活性を区別して測定できた。測定方法はPromegaの添付マニュアルに準じて行った。 In order to further verify the measurement specificity of the inhibitory activity using Renilla luciferase, measurement using Renilla luciferase as a control was performed. In addition to the plasmid described in Example 1, the same procedure as in Example 1 was followed except that pRL-TK was used as a plasmid expressing Renilla luciferase.
Firefly luciferase was generated from intracellular artificial influenza virus RNP, whereas Renilla luciferase was expressed in cells completely independently of influenza virus RNP (internal control). These two luciferases have different chromogenic substrates, and by using Promega's Dual luciferase assay kit, the activities of the two luciferases could be distinguished and measured. The measurement method was performed according to the manual attached to Promega.
　結果を図６に示す。図６に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２を加えた場合には、ホタルルシフェラーゼ（インフルエンザウイルスの遺伝子複製酵素によって産生）は顕著に喪失したのに対して、ウミシイタケルシフェラーゼ（細胞によって産生）は約半分程度の低下に留まった（ＲＮＰ＋ｐＲＬ＋Ｎ２１２）。コントロールとしてC末側のＶＮ ＰＡを加えた場合には、これらの変化は見られなかった（ＲＮＰ＋ｐＲＬ＋Ｃ７１６）。この結果から、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はインフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが確認された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 6, when VN PA N212 was added, firefly luciferase (produced by gene replication enzyme of influenza virus) was significantly lost, whereas Renilla luciferase (produced by cells) ) Remained only about half as low (RNP + pRL + N212). These changes were not seen when C-terminal VN-PA was added as a control (RNP + pRL + C716). From this result, it was confirmed that VN PA N212 specifically acts on RNP of influenza virus.
様々なインフルエンザウイルス株に対する阻害活性の測定
　他のインフルエンザウイルス株へのＶＮ ＰＡ Ｎ２１２の作用を確認した。実施例１で用いたＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）に代えて、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。 Measurement of inhibitory activity against various influenza virus strains The action of VN PAN 212 on other influenza virus strains was confirmed. Instead of A / WSN / 33 (H1N1) used in Example 1, A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian type H5N1), A / The same procedure as in Example 1 was followed except that the WSN / 33 strain (Soviet H1N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) were used.
　結果を図７に示す。図７に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はＡ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）のいずれに対してもＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）に対すると同様の著しい阻害活性を示した。このことから、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はヒトに主に影響を及ぼすであろう何れの株に対しても高い阻害効果を有することがわかった。 Results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 7, VN PA N212 is A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian type H5N1), A / WSN / 33. Both the strain (Soviet type H1N1) and the A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) showed a remarkable inhibitory activity similar to that of A / WSN / 33 (H1N1). From this, it was found that VN２１２PA 高 い N212 has a high inhibitory effect on any strain that would mainly affect humans.
各ＲＮＰ構成サブユニットに対する阻害活性の測定
　阻害メカニズムを探るために、インフルエンザウイルスのＲＮＰを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した。
　実施例４で用いた細胞抽出液の中のタンパク質量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法（１２％ゲル化剤）およびウエスタンブロット法（２０％メタノール、１００Ｖ、１時間、Millipore製ＰＶＤＦ膜）を用いて測定した。ＰＡ、ＰＢ１、ＮＰの検出には、それぞれを認識するウサギ由来のＩｇＧを用いた。インターナルコントロールとして細胞内に恒常的に発現しているベータアクチンを測定した。ベータアクチンの検出用抗体はマウス由来のＩｇＧであった。 Measurement of inhibitory activity for each RNP constituting subunit In order to investigate the inhibition mechanism, intracellular expression of each subunit constituting RNP of influenza virus was confirmed.
The amount of protein in the cell extract used in Example 4 was measured by SDS-PAGE method (12% gelling agent) and Western blot method (20% methanol, 100 V, 1 hour, Millipore PVDF membrane). . For detection of PA, PB1, and NP, IgG derived from rabbits that recognize each of them was used. As an internal control, beta-actin that was constantly expressed in the cells was measured. The antibody for detecting beta actin was mouse-derived IgG.
　結果を図８に示す。図８に示す結果から明らかなように、何れのサブユニット（ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ）も発現が抑制されていることがわかった（パネルＰＡ（上段）、ＰＢ１およびＮＰの矢印）。また、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２自体の発現は正常に検出された（パネルＰＡ（下段）の矢印）。インターナルコントロールとしてのベータアクチンの発現は正常であった（パネルβ-Actinの矢印）。以上から、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２を加えることで、インフルエンザウイルスのＲＮＰ自体が細胞内から喪失していることがわかった。ベータアクチンの発現量は顕著な低下を示していないことから、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが示唆された。 The results are shown in FIG. As is apparent from the results shown in FIG. 8, it was found that the expression of all subunits (PB1, PA, NP) was suppressed (panel PA (upper), arrows of PB1 and NP). In addition, the expression of VN PA N212 itself was detected normally (arrow on panel PA (bottom)). Expression of beta-actin as an internal control was normal (panel β-Actin arrow). From the above, it was found that by adding VN PA N212, RNP itself of influenza virus was lost from the cell. The expression level of beta-actin did not show a significant decrease, suggesting that it specifically acts on influenza virus RNP.
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（１）
　ＰＡサブユニット断片による阻害メカニズムを調べるため、ＰＡサブユニット断片に変異を導入して阻害活性を測定した。
　これまでに報告されたＰＡのＮ末端の機能に、エンドヌクレアーゼとプロテアーゼがある。エンドヌクレアーゼは細胞のｍＲＮＡをターゲットとしており、細胞由来のｍＲＮＡキャップを切り取る作用がある。またプロテアーゼの基質は未だ不明である。この何れの機能も活性中心が報告されているのでそれぞれの変異体を作成し、阻害効果を確認した。 Measurement of inhibitory activity by PA subunit fragment mutant (1)
In order to examine the inhibition mechanism by the PA subunit fragment, mutation was introduced into the PA subunit fragment and the inhibitory activity was measured.
The N-terminal functions of PA reported so far include endonucleases and proteases. Endonucleases target cellular mRNAs and have the effect of cleaving cellular mRNA caps. In addition, the protease substrate is still unknown. Since active centers have been reported for any of these functions, each mutant was prepared and its inhibitory effect was confirmed.
　ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。 The same procedure as in Example 1 was followed except that the VN PA N212 mutant was used instead of VN PA N212. For the preparation of the VN PA N212 mutant, QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used by site-directed mutagenesis method (DpnI treatment method).
　結果を図９に示す。図９に示す結果から明らかなように、Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ（プロテアーゼ活性欠失体）では阻害効果が維持されているのに対して、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａ（エンドヌクレアーゼ活性欠失体）では阻害活性が失われた。このことからＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼ活性がＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることが示唆された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 9, the inhibitory effect was maintained in N212 / T157A (protease activity-deficient), whereas the inhibitory activity was lost in N212 / D108A (endonuclease-deficient). It was broken. This suggested that the endonuclease activity of VN PA N212 is involved in the loss (inhibition) of RNP.
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（２）
　エンドヌクレアーゼの活性中心はＤ１０８だけでなく、Ｋ１３４にも報告がある。そこでさらに深く検証するために、実施例６と同様の手順に従って、１０８位だけでなく１３４位の変異体も作成し確認を行った。 Measurement of inhibitory activity by PA subunit fragment mutant (2)
The active center of endonuclease is reported not only in D108 but also in K134. Therefore, for further verification, not only the 108th position but also the 134th position mutant was prepared and confirmed according to the same procedure as in Example 6.
　結果を図１０に示す。図１０に示す結果から明らかなように、Ｎ２１２／Ｋ１３４ＡでもＮ２１２／Ｄ１０８Ａと同様に阻害活性が失われた。このことからＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼ活性がＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることがさらに確認された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 10, N212 / K134A lost its inhibitory activity similarly to N212 / D108A. This further confirmed that the endonuclease activity of VN PA N212 is involved in the loss (inhibition) of RNP.
ＰＡサブユニット断片変異体を用いたＲＮＰの発現
　ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体を用いてＲＮＰの発現を確認した。実施例７で用いた細胞抽出液の中のタンパク質量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法（１２％ゲル化剤）およびウエスタンブロット法（２０％メタノール、１００Ｖ、１時間、Millipore製ＰＶＤＦ膜）を用いて測定した以外は実施例５と同様の手順に従った。 Expression of RNP using PA subunit fragment mutant The expression of RNP was confirmed using the VN PA N212 mutant. The amount of protein in the cell extract used in Example 7 was measured using SDS-PAGE method (12% gelling agent) and Western blot method (20% methanol, 100 V, 1 hour, Millipore PVDF membrane). Except for this, the same procedure as in Example 5 was followed.
　結果を図１１に示す。図１１に示す結果から明らかなように、エンドヌクレアーゼを欠損したＶＮ ＰＡ Ｎ２１２ではＲＮＰの発現が確認された。このことからも、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼ活性がＲＮＰの喪失に関与していることが確認された。以上のことから、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２には、インフルエンザウイルスのＲＮＰ活性を著しく低下させる作用があり、それはＲＮＰ自体の喪失によって起こっていることがわかった。またそのメカニズムとしてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼが関与していることが示唆された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 11, the expression of RNP was confirmed in VN PA N212 lacking endonuclease. This also confirmed that the endonuclease activity of VN PA N212 is involved in the loss of RNP. From the above, it was found that VN PA N212 has an action of significantly reducing the RNP activity of influenza virus, which is caused by the loss of RNP itself. Moreover, it was suggested that the endonuclease of VN ヌ ク レ ア ー ゼ PA N212 is involved as the mechanism.
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（３）
　ＰＡサブユニット断片による阻害メカニズムをさらに詳細に調べるため、ＰＡサブユニット断片に欠失を導入した各種断片を調製した。具体的には、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、以下のアミノ酸をそれぞれ欠失させた断片を調製した（図１２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 Measurement of inhibitory activity by PA subunit fragment mutant (3)
In order to investigate the inhibition mechanism by the PA subunit fragment in more detail, various fragments in which deletion was introduced into the PA subunit fragment were prepared. Specifically, in VN PAN 212, fragments were prepared by deleting the following amino acids (FIG. 12).
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これら断片の調製は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２欠失変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。 These fragments were prepared in the same manner as in Example 1 except that a VN PA N212 deletion mutant was used instead of VN PA N212. For the preparation of the VN PA N212 mutant, QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used by site-directed mutagenesis method (DpnI treatment method).
　結果を図１２に示す。図１２に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、Ｎ末から２～１０までのアミノ酸（ｄ２－１０）、Ｎ末から２～２２までのアミノ酸（ｄ２－２２）、Ｎ末から２～４０までのアミノ酸（ｄ２－４０）、Ｎ末から２～６０までのアミノ酸（ｄ２－６０）、Ｎ末から２～８０までのアミノ酸（ｄ２－８０）、Ｎ末から２～１００までのアミノ酸（ｄ２－１００）およびＮ末から２～１０７までのアミノ酸（ｄ２－１０７）をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが認められた。このことから、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうちＮ末側のアミノ酸はエンドヌクレアーゼ活性にとって特に重要であることがわかった。 The results are shown in FIG. As is apparent from the results shown in FIG. 12, in VN PA N212, amino acids (d2-10) from the N terminus to 2 to 10, amino acids (d2-22) from the N terminus to 2 to 22, and 2 from the N terminus. Up to 40 amino acids (d2-40), N-terminal to 2-60 amino acids (d2-60), N-terminal to 2-80 amino acids (d2-80), N-terminal to 2-100 amino acids It was found that the deletion of (d2-100) and the amino acid (d2-107) from N-terminal to 2 to 107 lost the inhibitory activity. From this, it was found that the amino acid at the N-terminal side of the fragment having the amino acid sequence from the N-terminal to 212 amino acids of the PA subunit is particularly important for the endonuclease activity.
　また、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、Ｎ末から７～１０７までのアミノ酸（ｄ２－１０７）、Ｎ末から２７～１０７までのアミノ酸（ｄ２７－１０７）、Ｎ末から４７～１０７までのアミノ酸（ｄ４７－１０７）、Ｎ末から６７～１０７までのアミノ酸（ｄ６７－１０７）、Ｎ末から８７～１０７までのアミノ酸（ｄ８７－１０７）、Ｎ末から１６～２６までのアミノ酸（ｄ１６－２６）、Ｎ末から２９～８５までのアミノ酸（ｄ２９－８５）、Ｎ末から５２～７５までのアミノ酸（ｄ５２－７５）、Ｎ末から５２～８３までのアミノ酸（ｄ５２－８３）、Ｎ末から１１０～１３２までのアミノ酸（ｄ１１０－１３２）、Ｎ末から１３７～１６４までのアミノ酸（ｄ１３７－１６４）、およびＮ末から１３６～１８６までのアミノ酸（ｄ１３６－１８６）をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが認められた。このように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のＮ末端付近、中央部、およびＣ末端付近のいずれの部位を中抜きしても阻害活性が喪失することから、エンドヌクレアーゼ活性にとって立体構造が重要であることがわかった。 In VN PA N212, amino acids from N-terminal to 7-107 (d2-107), amino acids from N-terminal to 27-107 (d27-107), amino acids from N-terminal to 47-107 (d47-107) ), Amino acids from N-terminal to 67-107 (d67-107), amino acids from N-terminal to 87-107 (d87-107), amino acids from N-terminal to 16-26 (d16-26), from N-terminal Amino acids from 29 to 85 (d29-85), Amino acids from N-terminal to 52-75 (d52-75), Amino acids from N-terminal to 52-83 (d52-83), N-terminal to 110-132 Amino acids (d110-132), amino acids from N-terminal to 137-164 (d137-164), and amino acids from N-terminal to 136-186 (d1 It was found that the deletion of each of 36-186) lost the inhibitory activity. Thus, it can be seen that the three-dimensional structure is important for the endonuclease activity because the inhibitory activity is lost even if any part of the VNＮPA 、 N212 near the N-terminal, middle part, and C-terminal is omitted. It was.
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（４）
　ＰＡサブユニット断片による阻害メカニズムをさらに詳細に調べるため、ＰＡサブユニット断片に欠失を導入した各種断片を調製した。具体的には、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、以下のアミノ酸をそれぞれ欠失させた断片を調製した（図１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 Measurement of inhibitory activity by PA subunit fragment mutant (4)
In order to investigate the inhibition mechanism by the PA subunit fragment in more detail, various fragments in which deletion was introduced into the PA subunit fragment were prepared. Specifically, fragments were prepared by deleting the following amino acids from VN PAN 212 (FIG. 13).
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これら断片の調製は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２欠失変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。 These fragments were prepared in the same manner as in Example 1 except that a VN PA N212 deletion mutant was used instead of VN PA N212. For the preparation of the VN PA N212 mutant, QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used by site-directed mutagenesis method (DpnI treatment method).
　結果を図１３に示す。図１３に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、１３６からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１３５）、１５３からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１５２）、１７３からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１７２）、１７７からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１７６）、１８１からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８０）、１８５からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８４）、１８６からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８５）、１８７からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８６）をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失するが、１８８からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８７）、１８９からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８８）、および１９３からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１９２）を欠失させても阻害活性は喪失しないことが認められた。特に、Ｎ１８８およびＮ１９２に関しては、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２よりも強い阻害活性が認められた。このことから、エンドヌクレアーゼ活性にはＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることがわかった。 The results are shown in FIG. As is apparent from the results shown in FIG. 13, in VN PA N212, amino acids 136 to C-terminal (N135), 153 to C-terminal (N152), 173 to C-terminal (N172), 177 Amino acid from N to C-terminal (N176), Amino acid from 181 to C-terminal (N180), Amino acid from 185 to C-terminal (N184), Amino acid from 186 to C-terminal (N185), Amino acid from 187 to C-terminal Inhibition activity is lost when each of (N186) is deleted, but amino acids from 188 to C-terminal (N187), amino acids from 189 to C-terminal (N188), and amino acids from 193 to C-terminal (N192) It was found that the deletion did not lose the inhibitory activity. In particular, N188 and N192 were found to have stronger inhibitory activity than VN PA N212. From this, it was found that an amino acid sequence from N-terminal to at least 187 amino acids is essential for endonuclease activity.
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（５）
　実施例１０の結果は、ＰＡサブユニット断片の阻害活性には天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることを示した。このことから、Ｎ末端から数えて１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性にとって重要なアミノ酸であることが推測された。そこで、これらアミノ酸残基を置換して阻害活性に影響が出ないか調べた。具体的には、これらアミノ酸残基をアラニンに置換した断片を調製して阻害活性を調べた（Ｎ２１２／Ｌ１８７ＡおよびＮ２１２／Ｗ１８８Ａ；図１４）。 Measurement of inhibitory activity by PA subunit fragment mutant (5)
The results of Example 10 showed that the amino acid sequence from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit to at least 187 amino acids is essential for the inhibitory activity of the PA subunit fragment. From this, it was speculated that the 187th leucine (L) and the 188th tryptophan (W) counted from the N-terminal are amino acids important for endonuclease activity. Therefore, it was investigated whether substitution of these amino acid residues would affect the inhibitory activity. Specifically, fragments in which these amino acid residues were substituted with alanine were prepared and examined for inhibitory activity (N212 / L187A and N212 / W188A; FIG. 14).
　これら断片の調製は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。 These fragments were prepared in the same manner as in Example 1 except that the VN PA N212 mutant was used instead of VN PA N212. For the preparation of the VN PA N212 mutant, QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used by site-directed mutagenesis method (DpnI treatment method).
　結果を図１４に示す。図１４に示す結果から明らかなように、これらアミノ酸残基のアラニン置換体は阻害活性が完全に喪失するわけではないが、かなり低減することが認められた。それゆえ、１８７番目のロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性を保持するために必須であることが証明された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 14, it was recognized that the alanine substitution products of these amino acid residues did not completely lose the inhibitory activity, but were considerably reduced. Therefore, the 187th leucine (L) and the 188th tryptophan (W) proved essential to retain endonuclease activity.
インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片によるインフルエンザウイルスの増殖抑制（２）
　本発明ではＰＡサブユニット断片を発現させるのに発現ベクターとしてプラスミドを用いているので、本発明の阻害活性がＰＡサブユニット断片によるのでなくプラスミドそのもの、あるいはプラスミドを導入するという行為によるのではないかとの疑念が残る。そこで、斯かる疑念を除くため、以下の実験を行った。
　ＰＡ断片の発現用プラスミドとしては、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２をｐｃＤＮＡ３.１（＋）に挿入したもの、および阻害効果の比較対象として、ＰＡのＣ末端５０４アミノ酸（ＶＮ／ＰＡ／Ｃ５０４）をｐｃＤＮＡ３.１（＋）に挿入したものおよびプラスミド単独のｐｃＤＮＡ３.１（＋）を用いた他は、実施例１と同様に行った。 Inhibition of influenza virus growth by influenza virus-derived PA subunit fragment (2)
In the present invention, a plasmid is used as an expression vector to express the PA subunit fragment, so that the inhibitory activity of the present invention is not due to the PA subunit fragment but to the plasmid itself or the act of introducing the plasmid. The suspicion remains. Therefore, the following experiment was conducted to eliminate such doubts.
As a plasmid for expression of the PA fragment, VN PAN 212 was inserted into pcDNA3.1 (+), and as a comparison target of the inhibitory effect, PA C-terminal 504 amino acids (VN / PA / C504) were pcDNA3.1 ( The procedure was the same as in Example 1, except that the plasmid inserted in (+) and the plasmid alone pcDNA3.1 (+) were used.
　結果を図１５に示す。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２をｐｃＤＮＡ３.１（＋）に挿入したもののみが著しい阻害活性を示しており、プラスミドそのもの、あるいはプラスミドを導入するという行為が阻害効果を示しているのでないことが確認された。このことから、プラスミドから合成されるＰＡサブユニット断片が阻害効果の本体であると推測された。 The results are shown in FIG. Only the insertion of VN PA N212 into pcDNA3.1 (+) showed significant inhibitory activity, confirming that the plasmid itself or the act of introducing the plasmid did not show the inhibitory effect. From this, it was speculated that the PA subunit fragment synthesized from the plasmid was the main body of the inhibitory effect.
各ＲＮＰ構成サブユニットに対する阻害活性の測定（２）、ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（６）およびＰＡサブユニット断片変異体を用いたＲＮＰの発現（２）
　本発明のＰＡサブユニット断片が本当に細胞内に発現して作用しているのかという懸念を解消するため、以下の実験を行った。 Measurement of inhibitory activity for each RNP constituent subunit (2), measurement of inhibitory activity by PA subunit fragment mutant (6), and expression of RNP using PA subunit fragment mutant (2)
In order to eliminate the concern that the PA subunit fragment of the present invention is actually expressed and acting in cells, the following experiment was conducted.
　実施例５に示すように、本発明のＰＡサブユニット断片を作用させると、インフルエンザウイルスのＲＮＰの構成成分（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ）が細胞内から喪失する（図８参照）。
　実施例５と同様にして、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２およびＶＮ／ＰＡ／Ｃ５０４について、インフルエンザウイルスのＲＮＰを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した。２種の濃度について試験した。
　結果を図１６に示す（図１６Ａ）。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２の発現が確認され、また、その濃度に応じて、ＲＮＰの構成成分が全て喪失していた（図１６Ａ）。この結果と上記実施例１２の結果（プラスミド単独の結果）とから、プラスミドから発現したＰＡサブユニット断片が阻害効果を発揮していると確認できた。また、ベータアクチンの発現量は顕著な低下を示していないことから、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが示唆された。
　つぎに、阻害効果には１０８番目と１３４番目のエンドヌクレアーゼの活性中心が必要なことは、実施例６および７に示したとおりである。そこで、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａ、Ｎ２１２／Ｋ１３４ＡおよびＮ２１２／Ｔ１５７Ａについて、実施例５と同様にして発現させた。また、これら変異体について、実施例６と同様にして阻害活性を調べた。その結果を図１６に示す（図１６ＢおよびＣ）。
　Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ、Ｎ２１２／Ｋ１３４Ａ、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａの全ての変異体において発現が確認された。ここで、エンドヌクレアーゼに関与している部位を変異した断片（Ｎ２１２／Ｋ１３４ＡとＮ２１２／Ｄ１０８Ａ）では、ＰＡサブユニット断片が発現されているにも拘わらず、阻害作用は認められなかった（すなわち、ＲＮＰの発現が抑えられなかった）。一方、エンドヌクレアーゼに関わらない部位を変異した断片（Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ）では阻害効果が認められた。これらのことから、エンドヌクレーゼの関与が再度確認され、さらにＰＡサブユニット断片が発現し、ＲＮＰの消失に作用していることが確認された。 As shown in Example 5, when the PA subunit fragment of the present invention is allowed to act, components of influenza virus RNP (PB1, PB2, PA, NP) are lost from the cell (see FIG. 8).
In the same manner as in Example 5, intracellular expression of each subunit constituting the RNP of influenza virus was confirmed for VN PA N212 and VN / PA / C504. Two concentrations were tested.
The results are shown in FIG. 16 (FIG. 16A). The expression of VN PA N212 was confirmed, and all components of RNP were lost depending on the concentration (FIG. 16A). From this result and the result of the above Example 12 (result of the plasmid alone), it was confirmed that the PA subunit fragment expressed from the plasmid exhibited an inhibitory effect. Moreover, since the expression level of beta-actin did not show a significant decrease, it was suggested that it specifically acts on influenza virus RNP.
Next, as shown in Examples 6 and 7, the active centers of the 108th and 134th endonucleases are necessary for the inhibitory effect. Therefore, N212 / D108A, N212 / K134A and N212 / T157A were expressed in the same manner as in Example 5. These mutants were examined for inhibitory activity in the same manner as in Example 6. The results are shown in FIG. 16 (FIGS. 16B and C).
Expression was confirmed in all variants of N212 / T157A, N212 / K134A, and N212 / D108A. Here, in the fragments (N212 / K134A and N212 / D108A) in which the site involved in the endonuclease was mutated, no inhibitory action was observed even though the PA subunit fragment was expressed (that is, RNP expression was not suppressed). On the other hand, a fragment (N212 / T157A) in which a site not related to endonuclease was mutated showed an inhibitory effect. From these facts, it was confirmed that the endonuclease was involved again, and that the PA subunit fragment was further expressed and acted on the disappearance of RNP.
　本発明のＰＡサブユニット断片はインフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸タンパク質複合体）に作用し、インフルエンザウイルスの遺伝子複製活性および転写活性を喪失させる作用が確認できている。また、その作用にはＰＡサブユニット断片に含まれるエンドヌクレアーゼ部位が関与しており、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用している。本発明のＰＡサブユニット断片は著しいインフルエンザウイルス増殖阻害活性を有しており、また現存するＮＡ阻害薬とは全く作用機序が異なることから、次世代のインフルエンザウイルス阻害薬として極めて有望である。また、様々な株に対する阻害効果を確認したところ、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はＡ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）のいずれに対してもＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）に対すると同様の著しい阻害活性が認められ、株に依存しない幅広い適応が可能であると考えられる。 The PA subunit fragment of the present invention has been confirmed to act on RNP (nucleic acid protein complex) of influenza virus and to lose gene replication activity and transcription activity of influenza virus. In addition, the endonuclease site contained in the PA subunit fragment is involved in the action, and specifically acts on the influenza virus RNP. The PA subunit fragment of the present invention has remarkable influenza virus growth inhibitory activity and is quite promising as a next-generation influenza virus inhibitor because it has a completely different mechanism of action from existing NA inhibitors. Moreover, when the inhibitory effect with respect to various strains was confirmed, VN PA N212 was A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian type H5N1), A / WSN. / 33 strain (Soviet H1N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) showed the same significant inhibitory activity as A / WSN / 33 (H1N1), depending on the strain A wide range of adaptation is possible.

Claims (31)

  1. 　インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片。 Influenza virus-derived PA subunit fragment.
  2. 　インフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、請求項１に記載のＰＡサブユニット断片。 Influenza viruses include A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain ( The PA subunit fragment according to claim 1, which is 1997 avian H5N1) or A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1).
  3. 　ＰＡサブユニットのＮ末端断片である、請求項１または２に記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to claim 1 or 2, which is an N-terminal fragment of the PA subunit.
  4. 　ＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、請求項１ないし３のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 3, wherein the PA subunit fragment retains endonuclease activity.
  5. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし４のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 PA subunit fragment is composed of 28th proline (P), 86th methionine (M), 91st valine (V) and 100th valine (V) from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit. The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 4, which is a PA subunit fragment comprising at least one amino acid selected from the group consisting of:
  6. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項５に記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment contains 28th proline (P), 86th methionine (M), 91th valine (V) and 100th valine (V) from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit. The PA subunit fragment according to claim 5, which is a PA subunit fragment.
  7. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし６のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the 187th leucine (L) and / or the 188th tryptophan (W) from the N-terminal of the amino acid sequence of a natural PA subunit. The PA subunit fragment according to any one of the above.
  8. 　配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１ないし７のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 7, comprising an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  9. 　配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１ないし８のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 8, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  10. 　配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 9, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  11. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし６のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 6, wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 187th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the natural PA subunit amino acid sequence. Subunit fragment.
  12. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし７のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 7, wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising an amino acid sequence from the N-terminal to the 188th amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the natural PA subunit amino acid sequence. Subunit fragment.
  13. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし７のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 7, wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 192nd amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the natural PA subunit amino acid sequence. Subunit fragment.
  14. 　請求項１ないし１３のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片をコードする核酸。 A nucleic acid encoding the PA subunit fragment according to any one of claims 1 to 13.
  15. 　請求項１４に記載の核酸を含む組換えベクター。 A recombinant vector comprising the nucleic acid according to claim 14.
  16. 　請求項１５に記載のベクターを含む形質転換細胞。 A transformed cell comprising the vector according to claim 15.
  17. 　インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬。 Influenza virus inhibitor containing a PA subunit fragment derived from influenza virus.
  18. 　ＰＡサブユニット断片の由来するインフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、請求項１７に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 Influenza viruses derived from PA subunit fragments are A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / The influenza virus inhibitor according to claim 17, which is a Hong Kong / 156/97 strain (1997 avian H5N1) or A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1).
  19. 　ＰＡサブユニット断片がＰＡサブユニットのＮ末端断片である、請求項１７または１８に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The influenza virus inhibitor according to claim 17 or 18, wherein the PA subunit fragment is an N-terminal fragment of the PA subunit.
  20. 　ＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、請求項１７ないし１９のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The influenza virus inhibitor according to any one of claims 17 to 19, wherein the PA subunit fragment retains endonuclease activity.
  21. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１７ないし２０のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 PA subunit fragment is composed of 28th proline (P), 86th methionine (M), 91st valine (V) and 100th valine (V) from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit. The influenza virus inhibitor according to any one of claims 17 to 20, which is a PA subunit fragment comprising at least one amino acid selected from the group consisting of:
  22. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項２１に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The PA subunit fragment contains 28th proline (P), 86th methionine (M), 91th valine (V) and 100th valine (V) from the N-terminal of the amino acid sequence of the natural PA subunit. The influenza virus inhibitor according to claim 21, which is a PA subunit fragment.
  23. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１７ないし２２のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 23. The PA subunit fragment comprising the 187th leucine (L) and / or the 188th tryptophan (W) from the N-terminal of the amino acid sequence of a natural PA subunit, according to claim 17-22. The influenza virus inhibitor as described in any one.
  24. 　ＰＡサブユニット断片が配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１７ないし２３に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The influenza virus inhibitor according to claim 17 to 23, wherein the PA subunit fragment comprises an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  25. 　ＰＡサブユニット断片が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１７ないし２４のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The influenza virus inhibitor according to any one of claims 17 to 24, wherein the PA subunit fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  26. 　ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１７ないし２５のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 The influenza virus inhibitor according to any one of claims 17 to 25, wherein the PA subunit fragment comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  27. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１７ないし２２のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 17 to 22, wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising an amino acid sequence from the N-terminal to the 187th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the amino acid sequence of a natural PA subunit. Subunit fragment.
  28. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１７ないし２３のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 The PA subunit fragment according to any one of claims 17 to 23, wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 188th amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the amino acid sequence of the natural PA subunit. Subunit fragment.
  29. 　ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１７ないし２３のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。 24. The PA subunit fragment according to any one of claims 17 to 23, wherein the PA subunit fragment is a PA subunit fragment comprising the amino acid sequence from the N-terminal to the 192nd amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the natural PA subunit amino acid sequence. Subunit fragment.
  30. 　インフルエンザウイルスの遺伝子複製を阻害することによってウイルス増殖を阻害する、請求項１７ないし２９のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 30. The influenza virus inhibitor according to any one of claims 17 to 29, which inhibits virus growth by inhibiting gene replication of influenza virus.
  31. 　Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖を阻害する、請求項１７ないし３０のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。 A / Vietnam / 1194/2004 (H5N1) strain, A / WSN / 33 strain (Soviet H1N1), A / NT / 60/68 strain (Hong Kong type H3N2), A / Hong Kong / 156/97 strain (1997 bird) The influenza according to any one of claims 17 to 30, which inhibits virus growth against any influenza virus strain selected from the group consisting of type H5N1) and A / Kurume / K0910 / 2009 strain (2009 pandemic H1N1) Virus inhibitor.
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