WO2014172764A1

WO2014172764A1 - Método de detecção da atividade metabólica de protozoários

Info

Publication number: WO2014172764A1
Application number: PCT/BR2014/000120
Authority: WO
Inventors: José EUCLIDES STIPP PATERNIANI; Samuel RICARDO DOS SANTOS; Cristiano DE MELLO GALLEP; Jéssica BEZERRA DA SILVA; Regina MAURA BUENO FRANCO; Nilson BRANCO
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2014-10-30
Also published as: BR102013009768B1; BR102013009768A2

Abstract

O presente pedido de patente de invenção refere-se a um método de detecção da atividade metabólica de protozoários. O método permite a detecção da atividade metabólica, com potencial estimativa de infectividade, dispensando o uso de incubação em modelos animais, reduzindo assim os custos envolvidos e a infraestrutura laboratorial. Ele pode ser aplicado no campo de monitoramento ambiental através de dispositivos portáteis, apresentando um reduzido tempo de análise após o isolamento dos organismos de interesse.

Description

MÉTODO DE DETECÇÃO DA ATIVIDADE METABÓLICA DE PROTOZOÁRIOS

Campo da invenção

O presente pedido de patente de invenção refere-se a um método de detecção da atividade metabólica_de_protozoários_^

O método permite a detecção da atividade metabólica, com potencial estimativa da infectividade, dispensando o uso de incubação em modelos animais, reduzindo assim os custos envolvidos e a infraestrutura laboratorial. Ele pode ser aplicado no campo de monitoramento ambiental através de dispositivos portáteis, apresentando um reduzido tempo de análise após o isolamento dos protozoários de interesse.

Fundamentos da invenção

Problemas de qualidade da água configuram-se como um grande desafio que a humanidade enfrenta no século XXI. Doenças de veiculação hídrica, a urgente necessidade de saneamento básico e a falta de água potável afetam atualmente mais de um terço da população mundial.

O uso da água para diversas finalidades requer o atendimento de parâmetros microbiológicos visando à segurança dos seres vivos, que podem ser infectados por organismos patogênicos presentes nela. Dentre os diferentes géneros de organismos patogênicos que podem ser encontrados na água, Cryptosporidium e Giardia têm ganhado atenção especial de pesquisadores e autoridades, por serem capazes de propagarem enfermidades podendo em alguns casos, levarem os indivíduos a óbito.

Sendo assim, esses organismos permanecem como uma constante preocupação para os sistemas produtores de água e métodos de monitoramento rápidos e efetivos são ainda necessários para determinar a ocorrência e infectividade tanto na água bruta captada para consumo humano como para água tratada.

Quanto aos testes de infectividade, estes permitem avaliar a capacidade de infecção, e são de grande utilidade principalmente na análise da eficiência dos tratamentos para inativação/desinfecção nas mais diversas metodologias. Porém, o tempo para obtenção de resultados, a dificuldade laboratorial e os custos envolvidos dificultam o emprego desses métodos no cotidiano de uma estação de tratamento de água.

Embora haja vários métodos aplicados à detecção de protozoários, eles não são capazes de informarem a atividade metabólica do.s. organismos isolados. Éxiste a dificuldade de se obter informações precisas indicando se tais organismos após serem detectados estão mortos.

Os ensaios de infectividade efetuados em modelo animal utilizam a inoculação do parasito em estudo, que após completar o seu ciclo de vida são eliminados nas fezes do hospedeiro para posteriormente serem confirmados através das técnicas de detecção.

O documento (Craik, Stephen A. et al., "Inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts using médium and low pressure ultraviolet radiation", Water Research, v. 35, n. 6, p.1387-1398, 2001 ) relata testes de infectividade em camundongos para avaliar a eficiência de inativação do Cryptosporidium com o uso de luz UV. Os ensaios foram efetuados com camundongos neonatais (5 dias de idade), sendo os organismos inoculados intragastricamente. Após 7 dias as fezes foram analisadas e a infectividade do Cryptosporidium confirmada.

Com o objetivo de demonstrar a infectividade de Cryptosporidium em águas de reuso, o documento (Gennaccaro, Angela L. et al. "Infectious Cryptosporidium parvum Oocysts in Final Reclaimed Effluent. Applied And Environmental Microbiology", v. 69, n. 8, p.4983-4984, 2003) utiliza meio celular HCT-8 para incubação do Cryptosporidium isolado e purificado em amostras de efluente bruto, efluente de tratamento secundário, pós-filtração e pós- desinfecção. Os testes foram conduzidos com média de 48 horas de duração e a confirmação da infectividade efetuada com o uso de microscopia de fluorescência.

Analisando os métodos que avaliam infectividade, tais como a infecção in vitro em modelo celular ou teste de infectividade em modelo animal, podemos dizer que eles são caros, demorados e requerem infraestrutura sofisticada. Esses testes são sujeitos à variabilidade já que pressupõem uma resposta diferenciada do animal ou da célula escolhida como modelo para o teste de infectividade in vitro.

O documento ("A device for Gated Autosynchronous Luminescence Detection", Connally, Russell, Analytical chemistry, Vol. 83, N°. 12, (201 1 ), p.4782-4787) apresenta um método aplicado à microscopia de epifluorescência. A utilização de dispositivos construídos pelo autor permite a redução daquilo que ele chama de luminescência retardada proveniente de possíveis interferentes na amostra que podem apresentar autofluorescência. O método é então utilizado para reduzir o ruído de fundo das amostras. De acordo com o autor, o procedimento melhora a sensitividade no procedimento microscópio e aumenta a capacidade captura da imagem com o uso de câmera CCD. O autor argumenta também que procedimentos que utilizam marcadores a base de europium e terbium são beneficiados pela técnica. O autor utilizou cistos de Giardia para demonstrar o emprego da técnica na detecção do organismo. Nada é comentado acerca da medida da atividade metabólica envolvendo Giardia. O método proposto neste pedido de patente refere-se à detecção da emissão ultra-fraca de luz envolvendo cistos de Giardia spp. previamente purificados e incubados em marcadores fluorescentes capazes de detectar a presença de atividade metabólica de células. Comparando-se ambos os métodos, não é possível vislumbrar semelhanças no que diz respeito a detecção de atividade metabólica, como proposto neste pedido de patente.

^' O documento ("Spectral analysis of laser-induced ultraweak delayed luminescence in cultured normal and tumor human cells: temperature dependence", Musumeci F, Applegate LA, Privitera G, Scordino A, Tudisco S, Niggli HJ., J Photochem Photobio B.; 79(2):93-9. 2005 Jan 22) descreve a aplicação da luminescência retardada na diferenciação entre células tumorais e sadias. A luminescência retardada é induzida através de um laser e sua medida é efetuada através de válvulas fotomultiplicadoras. Os resultados são analisados com base na cinética de decaimento da luminescência retardada, tendo sido empregado modelos matemáticos do tipo probabilístico. O método demonstra a aplicabilidade da luminescência retardada como tecnologia inovadora na distinção entre células tumorais e sadias, com futuras aplicabilidades em oncologia e não se aplica em protozoários, dado que tais organismos diferem daquelas células tumorais. Já o método aqui proposto vale-se do uso de reagentes químicos medidores de atividade_-metabólica- combinado com o fenómeno de luminescência retardada permitindo diferenciar protozoários metabolicamente ativos daqueles sem atividade metabólica.

O documento ("Influence of presence of antrazine in water on the in-vivo delayed luminescence of Acetubelaria acetabulum", A. Scordino, A. Triglia, F. Musumeci, F. Grasso, Z. Rajfur, Journal of Photochemistry and Photobiology Volume 32, Issues 1 -2, January 1996, Pages 1 1-17) apresenta a aplicação da luminescência retardada na detecção de alterações metabólicas, proveniente de estresse químico, nas células da alga Acetubelaria acetabulum. Demonstra-se que quando induzidas via excitação com luz verde, células sadias apresentam decaimento luminescente diferente daquelas estressadas com antrazina. Novamente aqui o método proposto se difere deste na aplicabilidade. Aspectos ecotoxicologicos são analisados pela técnica proposta por Scordino et. al., ao passo que propomos diferenciação entre organismos metabolicamente ativos daqueles não ativos. Tal método não pode ser utilizado para análise metabólica de protozoários dado que vale-se da excitação em 565 nm durante 2s e diferencia células sadias daquelas com toxicidade aguda na presença de agrotóxicos.

Na literatura, encontram-se métodos que utilizam citometria de fluxo e valem-se de equipamentos dotados de válvulas fotomultiplicadoras onde a excitação é feita por fonte luminosa de alta intensidade. O sinal é analisado e é captado por espalhamento onde é feita a contagem e a diferenciação de células e protozoários. Embora tais equipamentos utilizem válvulas fotomultiplicadoras os sinais analisados após a excitação com laser são da ordem de 10³ a 10⁶ fótons, estando, portanto associados a fenómenos meramente físicos, e aptos apenas a contar o número de indivíduos. O método aqui proposto detecta a interação entre os protozoários e os marcadores de atividades enzimáticas com válvulas fotomultiplicadoras sensíveis no visível e capazes de realizarem contagens da ordem de dezenas de fótons (luminescência ultra-fraca), ainda assim capaz de diferenciar amostras vivas daquelas mortas. Esse por sua vez difere dos métodos baseados em citometria que não avaliam o comportamento do organismo do ponto de vista de luminescência retardada.

Diante do exposto seria útil que o estado da técnica dispusesse de um método de detecção da atividade metabólica em protozoários, que seja de baixo custo e que apresente resposta rápida.

Breve descrição da invenção

O presente pedido de patente de invenção refere-se a um método de detecção da atividade metabólica de protozoários via luminescência retardada com uso de marcadores fluorescentes.

O método proposto neste pedido de patente utiliza uma fonte luminosa com emprego de marcadores celulares como indicadores de presença de atividade metabólica. Além disso, soluciona-se a estimativa da atividade metabólica do parasito através da análise da emissão ultra-fraca de luz.

Atualmente os métodos aceitos para inferir a infectividade de parasitos necessitam de incubação em modelos animais e requerem dias para obtenção de resultado. O método proposto apresenta solução alternativa para a estimativa da atividade metabólica sem a necessidade de incubação do parasito em modelo animal.

O método aqui proposto aplica-se a protozoários e permite distinguir a atividade metabólica dos mesmos com a vantagem de uma análise rápida, possuindo ampla aplicação no campo do monitoramento ambiental. Breve descrição das figuras e anexos

O invento passará a ser descrito a seguir com referência aos desenhos apensos, nos quais:

A Figura 1 apresenta as etapas para o desenvolvimento do ensaio com o uso da luminescência retardada. Nela as etapas consistem na coleta da amostra, isolamento, eluição, purificação, incubação, fóton-contagem, análise de dados e confirmação dos protozoários de interesse.

O anexo 1 apresenta os resultados da microscopia de epifluorescência com testes envolvendo organismos vivos de Giardia lamblia e estressados com terop_e/.atuca_(-oiganismo-s_mo.rtQs_a__1_0.0- .C-)_I além de cistos estressados com lâmpada UV-254 nm pelo período de 1 hora.

O anexo 2 mostra os gráficos do comportamento dos grupos testados com base na cinética de decaimento luminescente e parâmetros estatísticos de contagem. Os dados são analisados com base nos parâmetros estatísticos e cinética do decaimento luminescente, distinguindo protozoários metabolicamente ativos daquele sem atividade metabólica.

Descrição detalhada da invenção

Refere-se o presente pedido de patente de invenção a um método de detecção da atividade metabólica em protozoários com o uso luminescência retardada e marcadores fluorescentes.

O método é baseado no princípio da emissão ultra-fraca de luz por todos os seres vivos e, principalmente correlacionado com a atividade metabólica das células. Uma vez vivas, células interagem com substratos e emitem fótons de natureza ultra-fraca que podem ser detectados com dispositivos fotônicos dotados de válvulas fotomultiplicadoras sensíveis em diversas regiões do espectro eletromagnético.

A emissão ultra-fraca de luz ou biofótons (10¹ a 10³ fótons- cm^"2 -s^" ¹) é encontrada em compostos orgânicos em conjunto com a atividade dos sistemas biológicos. Ela se relaciona também com a luminescência retardada, que reflete o comportamento do sistema biológico em termos da re-emissão de luz ultra-fraca após a excitação por fonte luminosa. Esta emissão espontânea de fótons é influenciada pela temperatura e pelas funções biológicas como a permeabilidade seletiva da membrana celular e as reações bioquímicas, refletindo diretamente no comportamento biofotônico.

O método proposto neste pedido de patente compreende as seguintes etapas (Figura 1 ): a) Preparar a amostra,

b) Adicionar à amostra o reagente marcador,

c) Homogeneizar a amostra,

d) Incubar a amostra,

e-)-Conduzir--a_-amostra para a câmara de fóton-contagem_e- acionar o dispositivo de iluminação,

f) Realizar uma fóton-contagem da amostra,

g) Comparar os dados provenientes da fóton-contagem com as curvas de luminescência retardada provenientes do controle positivo (microrganismos vivos),

h) Realizar um ajuste de Bolztman e curva integral dos gráficos da amostra e do controle positivo e obter os coeficientes, i) Comparar os coeficientes Ak obtidos pelo gráfico da amostra e do controle positivo, caso o coeficiente da amostra seja maior, a mesma contém protozoários vivos.

Na etapa (a) a amostra deve ser preparada empregando qualquer processo conhecido do estado^ãTécnica. Mais especificamente o isolamento e purificação podem ser efetuados de acordo com metodologia descrita pela Environmental Protection Agency, Method 1623.1 : Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water, Washington DC, 2012. É recomendado que a amostra seja homogeneizada vigorosamente para que os organismos de interesse fiquem suspensos no meio aquoso.

Na etapa (b) alguns exemplos de reagentes que podem ser utilizados são Resazurin-C12, 6-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFDA-SE) e SYTOX (SYTO-9). Tais reagentes podem ser comercialmente adquiridos em empresas especializadas. A concentração ótima para a total marcação do organismo dependerá do tipo de organismo em estudo. No geral, recomenda-se análise de varredura em concentrações variando em escala de até 10 vezes. Uma faixa de concentração do reagente marcador a ser utilizada é de 0,5 μΜοΙ.Ι_^"1 a 5,0 μΜοΙ.ί ¹. A concentração do reagente marcador celular pode variar também em função do tipo de marcador bem como o organismo de interesse. Recomenda-se que seja feita a prévia verificação da fluorescência do marcador utilizado verificando-se a melhor concentração a ser utilizada. A concentração ótima é aquela que apresente fluorescência satisfatória observada em organismo vivos.

A incubação da amostra na etapa (d) deve ser feita em uma câmara escura de incubação bacteriológica ou em dispositivos de fóton- contagem dotados de controle de temperatura. A temperatura da câmara deve estar compreendida na faixa de 33°C a 38°C e 5% de atmosfera de C0₂. O tempo de incubação pode variar em função do organismo de interesse. Intervalos de 15 - 45 minutos permite a completa reação bioquímica para a marcação celular e fluorescência. O analista poderá aferir o melhor tempo de incubação em função da escolha da melhor concentração do reagente.

O dispositivo de iluminação na câmara de fóton-contagem na etapa (e) deve ser acionado por um tempo compreendido na faixa de 1 a 30 segundos para a excitação da amostra.

A análise dos dados de fóton-contagem na etapa (h) é realizada com base no Fitting não-linear proveniente do modelo matemáticos Boltzman Fitting Decay como na equação (1 ):

y = *2 + ¾¾ d)

onde ai refere-se ao valor inicial, a₂ ao valor final, t o tempo (s) e dt é a constante temporal de decaimento. O coeficiente a ser analisado é Ak = a_t - a₂.

A diferenciação pode ser efetuada com base na integral da curva de decaimento da luminescência retardada conforme equação (2):

∑?=₀ DL (2)

onde i = 0 é o instante inicial do decaimento luminescente, n é o instante final da curva de decaimento e DL é a fóton-contagem da luminescência retardada no intervalo i = 0 até n.

Exemplo de concretização

A avaliação da atividade metabólica dos cistos foi efetuada com o uso do reagente Carboxifluorceina succinimidil diacetato éster (CFDA-SE) que permite analisar a presença de atividade metabólica de células viáveis. A estimativa da quantidade de organismos foi efetuada com base na reação de imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais e corante marcador disponíveis em kit comercial. O kit utilizado possuía reagente de detecção contendo Isotiocianato de Fluorceína (FITC) combinados com anticorpos anti-Cryptosporidium e anti-Giardia, permitindo a identificação e a contagem dos cistos em microscopia de fluorescência.

Ensaios de varredura com CFDA-SE foram efetuados com o intuito de avaliar a melhor concentração do marcador fluorescente.

As soluções foram preparadas transferindo 90 μΙ_ de DMSO à 547 pg de CFDA-SE e posterior adição de 910 pL de tampão fosfato salino (PBS), totalizando volume de 1 mL de uma solução estoque de 1 mM. Diluições a partir da solução estoque foram efetuadas nas concentrações de: 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 e 100 μΜ.

Cistos de Giardia lamblia foram incubados em CFDA-SE nas concentrações de: 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 e 100 μΜ. Primeiramente, alíquotas contendo aproximadamente: 2.5x 0², 2.5x 0³, 5x10³ , 2x10⁴ e 2.5x10⁴ cistos foram transferidas para microtubos e homogeneizadas por 2 minutos em vortex. Posteriormente, CFDA-SE foi adicionado a cada alíquota de organismos. A suspensão foi novamente homogeneizada e o volume total foi transferido para lâminas microscópicas. Em seguida, as lâminas foram conduzidas para câmara de incubação pelo período de 30 minutos a 37°C e 5% de C0₂.

Ao longo da incubação, efetuou-se a medida de fóton-contagem, tendo sido iniciada imediatamente após a transferência da lâmina contendo os cistos para a câmara, acionando a placa de contagem num intervalo de aquisição de 1 s pelo período de 30 minutos.

Após a incubação, efetuou-se a medida da luminescência retardada excitando os organismos em câmara escura dotada de válvula fotomultiplicadora. No dispositivo de fóton-contagem os organismos foram excitados com lâmpada halogênica e filtros passa-banda (50 nm de largura) com os seguintes comprimentos de onda e respectiva intensidade média em lux: 375 nm (2,3 lux), 460 nm (120 lux), 582 nm (3070 lux) e luz branca (sem filtro 5120 lux). Em outro dispositivo de fóton-contagem efetuou-se excitação a partir de LEDs (-20 nm de banda) com comprimentos de onda de 680 nm e 700 nm, além de luz branca.

A excitação dos organismos foi efetuada pelo intervalo de 30 s e em seguida efetuou-se a leitura da fóton-contagem no intervalo de aquisição de 100 ps e tempo de contagem de 10 s.

Os dados de fóton-contagem foram analisados em seu parâmetro temporal expressos em photon-counts per 100 ps (cp100ps). As análises estatísticas foram efetuadas em seu parâmetro de frequência de contagem, média, mínimos, máximos e desvio padrão das amostragens. Transformadas de Fourier foram efetuadas para avaliar o sinal de decaimento da luminescência retardada, sendo esse parâmetro avaliado com base na frequência e amplitude.

Leitura da fluorescência

Após os ensaios de incubação, as lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência com excitação em 490 nm e verificação da fluorescência decorrente da atividade metabólica dos cistos em microscópio de epifluorescência com filtros FITC.

Para a confirmação da presença de cistos bem como a estimativa da quantidade quando do preparo das alíquotas, efetuou-se a leitura da fluorescência com o uso de kit comercial. Ao passo que os ensaios efetuados com CFDA-SE acompanhados por fóton-contagem foram analisados sob as mesmas condições.

Análise Microscópica e captura de imagens

Após a análise do comportamento da fluorescência, os organismos foram analisados e imagens foram coletadas com uso de microscópio de epi-fluorescência com filtro FITC, DIC e objetivas de 40, 100 e 400x, lâmpada halogênica e software de captura comercial. As imagens foram coletadas nos campos FITC e DIC e posteriormente justapostas para análise dos padrões de fluorescência proveniente do reagente CFDA-SE. Resultados

Testes efetuados com cepa sem estresse demonstram que o CFDA-SE nas concentrações acima de 0,5 μΜ apresentam fluorescência satisfatória e facilmente detectável com uso de microscopia de epi- fluorescência. No anexo 1 está descrito, o comportamento da fluorescência de cistos de Giardia lamblia incubados em CFDA-SE. Observa-se que para concentrações de 0,5 μΜ (quadros (1 1 ) (12) e (13)), apenas cistos vivos apresentam fluorescência. O aumento da concentração do reagente promove o aumento da intensidade da fluorescência. Cistos estressados com UV-254nm apresentaram fluorescência para concentrações de CFDA-SE acima de 2,5 μΜ. Contudo tal fluorescência possui intensidade menor que aquela apresentada por cistos vivos. Esse fato pode ser observado nos quadros (13), (16) e (19) na anexo 1 .

Cistos mortos não apresentam fluorescência quando analisados em microscopia, demonstrando comportamento de ruído.

A análise dos padrões de fóton-contagem provenientes da luminescência retardada, demonstram que grupos estressados com luz UV-254 nm, grupos contendo cistos mortos à 100°C e cistos vivos sem estresse, apresentam comportamentos biofotônicos diferentes entre si.

Cistos vivos possuem decaimento da luminescência retardada com taxas de fóton-contagem superiores aos cistos sem atividade metabólica. As análises estatísticas demonstram que grupos vivos e sem estresse possuem frequências de contagem superiores quando comparados com grupos mortos e estressados.

No anexo 2 encontra-se a descrição dos comportamentos de cistos de Giardia lamblia mortos a 100°C, estressados com luz UV-254nm, comparando-os com cistos vivos e sem estresse. As curvas de (20) a (23) demonstram o decaimento luminescente de cistos incubados em CFDA-SE 5,0μΜ, analisados com base nas médias dos 100 pontos locais. As curvas de (24) a (27) referem-se ao ajuste exponencial nos dados de fóton-contagem. Já as curvas de (28) a (31 ) referem-se às análises estatísticas com base na média das frequência de contagem, mínimos e máximos.

Com base no anexo 2, demonstra-se que o método aplica-se na distinção entre organismos vivos e sem estresse e aqueles mortos ou estressados com luz UV.

O decaimento luminescente parte de poucas dezenas de fótons medidos em intervalos de 100 s. Posteriormente, o decaimento atinge o ruído de escuro a ordem de 1 ,0 cplOO s. Esse decaimento difere entre os grupos analisados em função do estado metabólico do organismo.

Os ensaios podem ser conduzidos com poucas horas de análise

(1h no exemplo citado) com uso de reagentes e vidrarias facilmente obtidos no mercado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de detecção da atividade metabólica de protozoários caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) Preparar a amostra,

b) Adicionar à amostra o reagente marcador,

c) Homogeneizar a amostra,

d) Incubar a amostra,

e) Conduzir a amostra para a câmara de fóton-contagem e acionar o dispositivo de iluminação,

f) Realizar uma fóton-contagem da amostra,

h) Realizar um ajuste de Bolztman e curva integral dos gráficos da amostra e do controle positivo e obter os coeficientes, i) Comparar os coeficientes Δ/C obtidos pelo gráfico da amostra e do controle positivo, caso o coeficiente da amostra seja maior, a mesma contém protozoários vivos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pela etapa (a) constituir-se de isolar, purificar e centrifugar a amostra.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pela concentração do reagente marcador estar compreendida na faixa de 0,5 μΜοΙ a 5,0 μΜοΙ.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pela concentração do reagente marcador ser preferencialmente de 5,0 μΜ.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pela etapa (d) ser realizada em câmara escura de incubação à uma temperatura compreendida na faixa de 33°C a 38°C e 5% de C0₂ por um período na faixa de 15 a 45 minutos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por o período de incubação na etapa (d) ser preferencialmente 30 minutos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo tempo de acionamento do dispositivo de iluminação estar compreendido na faixa de 1 a 30 segundos.

8. Método de detecção da atividade metabólica de protozoários caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) Isolar, purificar e centrifugar a amostra,

b) Adicionar à amostra a solução contendo o reagente marcador a uma concentração de 0,5 μΜοΙ a 5,0 μΜοΙ e homogeneizar a mistura,

c) Encaminhar a solução para a câmara escura de incubação à uma temperatura compreendida na faixa de 33°C a 38°C e 5% de CO2 por um período na faixa de 15 a 45 minutos,

d) Conduzir a amostra para a câmara de fóton-contagem e acionar o dispositivo de iluminação por um tempo compreendido na faixa de 1 a 30 segundos para a excitação da amostra,

e) Realizar uma fóton-contagem da amostra,

f) Comparar os dados provenientes da fóton-contagem com as curvas de luminescência retardada provenientes do controle positivo (microorganismos vivos),

g) Realizar um ajuste de Bolztman e curva integral dos gráficos da amostra e do controle positivo e obter os coeficientes,

h) Comparar os coeficientes Δ/ obtidos pelo gráfico da amostra e do controle positivo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela concentração do reagente marcador na etapa (b) ser preferencialmente de 5,0 μΜ.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o período de incubação na etapa (c) ser preferencialmente 30 minutos.