WO2014158005A1 - 원심력을 이용한 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치 - Google Patents

원심력을 이용한 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치 Download PDF

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WO2014158005A1
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filter
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microvesicles
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PCT/KR2014/002699
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박재성
조원주
김준호
조시우
정화평
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포항공과대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a cell-derived artificial microvesicle production apparatus, and more particularly to an apparatus for producing cell-derived artificial microvesicles efficiently using centrifugal force.
  • Microvesicles are a kind of cell organelles generally having a size of 0.03 to 1 ⁇ m and are naturally released from cell membranes in almost all kinds of cells, and have a form of a double phospholipid membrane, which is the structure of the cell membrane, mRNA, Contains cytoplasmic components such as DNA and proteins.
  • microvesicles are the basic tools of cells for metabolism, transport of metabolites, enzyme storage, chemical reactions, and the like, and mediate intercellular signaling by delivering mRNA, miRNA and proteins between cells.
  • microvesicles derived from cancer cells may induce changes in normal cells by delivering cancer proteins or miRNAs to surrounding normal cells.
  • by directly releasing from the cell membrane it retains the antigenic body of the parental cell as it is, and is used for research for vaccine development.
  • microvesicles also play a role in the removal of by-products resulting from structural misfolded proteins, cytotoxic substances, and intracellular metabolism.
  • the phospholipids used in the preparation of artificial microvesicles have been extracted from soybeans or eggs, and the artificial microvesicles prepared using these phospholipids do not contain membrane proteins and thus are not suitable for inducing cell fusion.
  • the surfactants and organic solvents used at this time are toxic, so the process of removing the organic solvent is essential. Therefore, there is a need for a method of preparing artificial microvesicles that is more friendly to cell experiments.
  • the artificial microvesicle is derived from the cell membrane has the advantage of mimicking the structure of the cell membrane as it is, but the method is used in the manufacturing process (buffer) is included in the artificial microvesicle Due to the dilution of the cytoplasm itself, the concentration of the target substance is lowered, which requires more artificial microvesicles to accurately diagnose the disease and deliver a certain amount of the target substance, as well as causing loss of intracellular material. I have a problem.
  • the present inventors have developed an artificial microvesicle manufacturing apparatus using centrifugal force to solve the problems that may occur when manufacturing an existing artificial microvesicle, and the artificial microvesicle manufactured by the apparatus is artificial micro
  • the present invention was completed by confirming that it retains more components in the cytoplasm than the vesicle.
  • the present invention is a cell suspension is injected, the main body portion 100 for injection;
  • the filter 200 is connected to the body portion for injection, the cell is broken while the cell suspension passes;
  • a cell-derived artificial microvesicle manufacturing apparatus comprising a body portion 300 for collecting, collecting the artificial microvesicles generated by passing through the filter.
  • the injection body portion 100 and the collection body portion 300 are made symmetrically with the filter portion 200 to play the same role as the injection body portion and the collection body portion, and makes it possible to pass through the liquid several times.
  • the present invention comprises the steps of injecting the cell suspension into the device; And preparing artificial microvesicles in the cells using centrifugal force, providing a method for producing cell-derived microvesicles using the device.
  • inject the cells into the main body 100 for injection place the cells on the filter and place them in a centrifuge and turn them over a certain speed so that the piston is driven by centrifugal force and the piston pushes the cell suspension to allow the cells to pass through the filter.
  • the injection body portion 100 is characterized in that the lid 110, the piston 120 and the body 130 is in the form of sequentially connected.
  • the filter unit 200 is characterized in that the filter 220 is disposed in contact with the injection body portion 100 is located in the interior of the filter support (220). .
  • the filter 220 is characterized in that it is located between two O-rings 210.
  • the filter 220 is characterized by having a hole of 0.2 to 30 size.
  • the filter 220 is characterized in that the polycarbonate material.
  • the filter support 230 is characterized in that it has a hole 231 of 0.1 to 2mm size.
  • the collection body 300 is characterized in that the main body 330, the piston 320 and the lid 310 are sequentially connected to the filter unit 200.
  • one O-ring 210 is located between the filter support 230 and the collecting body 300.
  • Cell-derived artificial microvesicle manufacturing apparatus by manufacturing a microvesicle through a porous filter in a state in which the cells are concentrated using centrifugal force, not only can maintain the structure of the cell membrane as it is manufactured The loss of cytoplasm by the buffer used in the test can be minimized. Therefore, the device of the present invention is expected not only to efficiently manufacture large quantities of cell-derived artificial microvesicles, but also to be widely used for basic research, diagnosis of diseases, and drug delivery techniques using the prepared microvesicles.
  • FIG. 1 is an overall structural diagram of a device provided by the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged view (a) and sectional view (b) of the filter support shown in FIG. 1.
  • FIG. 3 is an enlarged view (a) and a cross-sectional view (b) of the main body shown in FIG.
  • FIG. 4 is an enlarged view (a) and sectional view (b) of the lid shown in FIG.
  • FIG. 5 is an enlarged view (c) and sectional view (d) of the piston shown in FIG.
  • Figure 6 is a transmission electron micrograph of the artificial microvesicle prepared in the present invention.
  • Figure 7 is a diagram showing the size of the artificial microvesicle prepared in the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram comparing the amount of RNA contained in the artificial microvesicles prepared using a commercially available extruder and the artificial microvesicles prepared in the present invention (artificial microvesicles manufactured with a commercialized extruder is an Extruder, Bon Artificial microvesicles prepared according to the invention are designated Centrifugal Extruder.
  • FIG. 9 is a diagram comparing the amount of protein contained in the artificial microvesicles prepared in the present invention and artificial microvesicles made using a commercially available extruder
  • the present invention is a cell suspension is injected, the main body portion 100 for injection; A filter unit 200 in which cells are broken while the cell suspension passes; And it provides a cell-derived artificial microvesicle manufacturing apparatus comprising a body portion 300 for receiving, the microvesicles generated by passing through the filter portion (see Fig. 1).
  • the cell may be a mammalian nucleated cell or a transformed cell thereof, but any cell capable of producing an artificial microvesicle through the manufacturing apparatus may be used.
  • the transformed cells include, but are not limited to, transformed cells consisting of cells transformed to express a specific protein, a target-inducing substance, or a substance necessary for cell membrane fusion with a target cell, and two or more combinations thereof. It is not.
  • the membrane of the artificial microvesicle may further include components other than the cell membrane of the cell.
  • components other than the cell membrane may include a targeting molecule, a substance necessary for cell membrane fusion with a target cell, a fudexogen, a cyclodextrin, polyethylene glycol, and the like. Can be added by various methods, including but not limited to chemical modification of the cell membrane.
  • artificial microvesicles were prepared using HeLa cells obtained from cervical cancer tissues (see Example 1).
  • the main body 100 for injection is characterized in that the lid 110, the piston 120 and the body 130 are sequentially connected.
  • the body 130 is a space for receiving the cell suspension, and the piston 120 serves to push the cell suspension in the body to the filter unit 200 when centrifugal force is applied.
  • the outer diameter of the piston and the inner diameter of the main body are the same, and when the cell suspension is injected into the main body, a cell can be prevented from leaking and a sealing member can be added to fill the minute gap between the piston and the main body.
  • the filter unit 200 is characterized in that the filter 220 is disposed in contact with the injection main body portion 100 is located inside the filter support 220. At this time, the filter is placed in contact with the main body for injection, when the centrifugal force is applied, the cell suspension is broken while passing through the filter.
  • the pore size of the filter is preferably 0.2 to 30, but is not limited thereto.
  • the material of the filter can be generally used as a material such as hydrophobic material, metal, polymer, glass, silicon, etc., through which water can pass, preferably a polycarbonate material, but can be processed to the pore size, Any material can be used as long as it does not denature the physicochemical properties of the cell.
  • O-rings 210 are disposed on both sides of the filter 220 for sealing, and O-rings are disposed on the other side of the filter support 230 in which the filter is not disposed. At this time, a mesh support structure may be disposed between the filter and the O-ring to support the filter.
  • the filter support 230 serves to support the filter, and is connected to the main body 100 for injection and the main body 300 for collection on each side. At this time, the filter support and each of the main body (130, 330) is connected using a screw thread, it is possible to add a sealing member to fill the minute gap, it is possible to connect through a common method known in the art.
  • the filter support may have a hole of 0.1 to 2mm in size so that the suspension crushed by the filter can pass through, but is not limited thereto (see FIG. 2).
  • Collection body portion 300 is a space for receiving the crushed suspension while passing through the filter support 230, the body 330, the piston 320 and the lid 310 is sequentially connected to the filter portion 200 It is characterized by that.
  • the main body 100 for injection and the main body 300 for collection are made symmetrically identical so that cells can pass through the filter several times.
  • the suspension from the injection body portion to the collection body portion can be passed through the centrifugal force again from the collection for injection to the injection, in which case the role of the injection body portion and the collection body portion is changed. That is, the body 330 of the body portion 300 for collecting the cell suspension and the piston 320 serves to push the cell suspension in the body to the filter unit 200 when centrifugal force is applied.
  • the main body of the main body for injection allows the inlet to enter the syringe inlet to put the cell suspension at a time
  • the main body for injection and the main body of each of the collection body portion 130, 330 is the filter support Connected symmetrically on both sides with reference to 230, the cells are arranged to allow passage through the filter multiple times, so as to accommodate cell suspension and suspension that have passed through the filter, respectively.
  • the artificial microvesicles produced by the above apparatus are distinguished from the inside and the outside by phospholipid bilayers composed of cell membrane components of the derived cells, and have cell membrane lipids, cell membrane proteins, nucleic acids and cellular components of the derived cells, Means smaller than the original cell, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of injecting cells into the device; And producing artificial microvesicles from the cells using centrifugal force, to provide a method for producing cell-derived artificial microvesicles using the device.
  • Centrifugal force applied in the manufacturing method may be provided using a centrifuge, the size of the centrifugal force is preferably 1000 to 2,000g, the time for operating the centrifuge is 1 to 3 minutes, but is not limited thereto.
  • the centrifugation method may be repeated to prepare an artificial microvesicle of uniform size, and preferably, the cell suspension may pass through the filter by repeating 2 to 5 times, but is not limited thereto. .
  • each containing 50 ml of Optiprep 400 l 10% Optiprep 600l and 1 ml of the suspension passed through the 5m polycarbonate filter prepared in Example 1-1 above. Then, ultracentrifugation was performed at 100,000 g for 1 hour. At this time, in the layer between 50% Optiprep and 10% Optiprep generated after centrifugation, artificial microvesicles were finally obtained.
  • the artificial microvesicles prepared from HeLa cells consisted of phospholipid bilayers, 100-200 nm in size, and were generally spherical.
  • the artificial microvesicles were diluted in 1 ml of PBS at a concentration of 5 g / ml, placed in a cuvette, and analyzed by a dynamic light scattering particle size analyzer. 7 is shown.
  • the size of the artificial microvesicle is 25 ⁇ 100nm, the average size was confirmed to be about 50nm.
  • artificial microvesicles prepared in the apparatus of the present invention and the cellular components in the artificial microvesicles prepared in a commercially available extruder were compared.
  • artificial microvesicles prepared in HeLa cells were prepared according to the method of Example 1.
  • HeLa cells were suspended in 1 ml of PBS (phosphate buffered saline) solution at a concentration of 5 x 10 7 cells / ml, and the suspension was used using a commercially available extruder (mini extruder, Avanti). After three passes through a polycarbonate filter with a pore size of 10m, it was passed three times through a polycarbonate filter with a pore size of 5m. In a 2.2 ml ultracentrifuge tube, each containing 400 l of 50% Optiprep, 600 l of 10% Optiprep and 1 ml of the suspension passed through the 5m filter. Then, ultracentrifugation was performed at 100,000 g for 1 hour. The resulting artificial microvesicle was obtained in the layer between 50% Optiprep and 10% Optiprep.
  • PBS phosphate buffered saline
  • RNA was separated based on 200 ug of protein.
  • Trizol Life Technologies
  • RNA was added to each sample to dissolve the membrane of the artificial microvesicle for 5 minutes.
  • add 0.2 ml of chloroform solution mix well, and leave it at 4 for 5 minutes to separate RNA from other substances (protein, DNA).
  • IPA isopropyl alcohol
  • RNA was precipitated by centrifugation at 13,500 g for 10 minutes to completely precipitate the RNA, and the supernatant was removed. 75% ethanol was added to the precipitate, followed by centrifugation at 13,500 g for 10 minutes to completely remove ethanol, and then dried at room temperature for at least 5 minutes. DI water was added to dissolve the dried material, and RNA was measured using a spectrophotometer (Genova) (FIG. 8).
  • the artificial microvesicles (Extruder) manufactured using a commercially available extruder contains more than twice as much RNA I could confirm that there is.
  • the cell-derived artificial microvesicles produced by the method of Example 1 contain about twice as many proteins as artificial microvesicles prepared using a commercially available extruder. there was.
  • lid 320 piston
  • the microvesicles prepared through the device not only maintain the cell membrane structure, but also minimize the loss of cytoplasm It shows the properties containing the cytoplasm. Therefore, the problems related to the difficulty of inducing cell fusion induction of the Michael vesicles prepared by the existing apparatus, the surfactant used and the removal of the organic solvent were overcome.
  • Microvesicles manufactured using the device of the present invention can be usefully used not only for basic research, but also for applied research such as disease diagnosis and drug delivery technology.

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Abstract

본 발명은 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치에 관한 것으로, 보다 구체적로는 원심력을 이용하여 세포를 농축시킨 상태에서 다공성의 필터를 통과시키는 방법을 통해 인공 마이크로베시클을 제조하는 장치에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 인공 마이크로베시클은 세포막의 구조를 그대로 유지할 뿐만 아니라, 제조시 사용되는 완충액에 의한 세포질의 손실을 최소화하여 세포질을 함유하는 특성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 장치를 이용하여 제조된 마이크로베시클은 기초 연구 뿐만 아니라 질병의 진단 및 약물전달 기술 등의 응용 연구에도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

원심력을 이용한 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치
본 발명은 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치에 관한 것으로, 보다 구체적로는 원심력을 이용하여 효율적으로 세포유래 인공 마이크로베시클을 제조하는 장치에 관한 것이다.
마이크로베시클(microvesicles)은 일반적으로 0.03~1um의 크기를 가지는 세포 소기관의 일종으로서 거의 모든 종류의 세포에서 세포막으로부터 자연적으로 유리되어, 세포 막의 구조인 이중 인지질(phospholipid) 막 형태를 가지고, mRNA, DNA 및 단백질 등의 세포질 내 성분을 함유하고 있다.
이러한 마이크로베시클은 물질 대사, 대사물질의 운송, 효소 저장, 화학 반응 등을 위한 세포의 기본 도구로서, 세포 간에 mRNA, miRNA 및 단백질 등을 전달함으로써 세포 간 신호전달의 매개 역할을 수행한다. 일례로, 암세포에서 유래된 마이크로베시클의 경우, 주위의 정상세포로 암 단백질이나 miRNA를 전달함으로써 정상세포의 변화를 유도하기도 한다. 또한, 세포막에서 직접적으로 유리됨으로써 모세포의 항원체를 그대로 보유하고 있어, 백신 개발을 위한 연구에도 활용되고 있다. 이 외에도, 마이크로베시클은 단백질의 구조적 변성체(misfolded protein)나 세포독성 물질, 세포 내 대사로 인해 발생하는 부산물들을 제거하는 역할을 담당하기도 한다.
마이크로베시클의 세포 간 신호전달 기능에 착안하여, 인공적인 이중 인지질 막을 이용해 약물이나 생체 재료를 세포에 전달하는 기술에 대한 개발이 활발하게 이루어지고 있으며, 이러한 인공 마이크로베시클의 경우, 전달효율이 높고 전달하고자 하는 물질을 외부환경으로부터 잘 보호한다는 장점 때문에 생물학적 실험에서 많이 활용되고 있다.
그러나, 기존에 인공 마이크로베시클 제조시 사용되는 인지질은 콩이나 달걀에서 추출하여 정제된 것으로, 이들 인지질을 사용하여 제조한 인공 마이크로베시클에는 막 단백질이 존재하지 않으므로 세포 융합을 유도하기에는 적절하지 않은 단점이 있다. 또한, 이 때 사용되는 계면활성제 및 유기용매들은 독성을 가지고 있어, 유기용매를 제거해야 하는 과정이 필수적이다. 따라서, 세포 실험에 좀 더 친화적인 인공 마이크로베시클의 제조방법이 필요한 실정이다.
최근에, 세포 현탁액에 통상적인 압출법 또는 초음파 분해 등의 방법을 적용하여 세포를 작은 형태로 부수어 인공 마이크로베시클을 제조하고, 이를 질병 진단 또는 약물 전달에 활용하는 기술이 공개되었다(발명의 명칭: 포유류의 유핵세포에서 유래된 마이크로베시클 및 이의 용도, 발명자 : 고용송. 출원번호 : 10-2010-0063372). 또한, 본 발명자들도 통상적인 압출법을 통해 배아줄기세포에서 인공 마이크로베시클을 제조한 후, 이를 체세포에 처리하여 체세포를 유도만능줄기세포로 유도하는 방법을 개발하였다(발명의 명칭 : 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용한 유도만능줄기세포의 제조 방법. 발명자 : 박재성. 출원번호 : 10-2011-0040202).
상기와 같은 제조 방법의 경우, 제조된 인공 마이크로베시클이 세포막에서 유래하기 때문에 세포막 구조를 그대로 모방한다는 장점이 있으나, 이 방법은 제조시 사용되는 완충액(buffer) 등이 인공 마이크로베시클 안에 포함되어 세포질 자체가 희석되기 때문에 타겟 물질의 농도가 낮아지게 되어, 정확한 질병의 진단 및 일정량의 타겟 물질을 전달하기 위해서는 더 많은 양의 인공 마이크로베시클이 필요할 뿐만 아니라 세포 내부 물질의 손실을 야기할 수 있는 문제점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존 인공 마이크로베시클 제조시 일어날 수 있는 문제점을 해소하기 위하여 원심력을 이용한 인공 마이크로베시클 제조 장치를 개발하였으며, 상기 장치를 통해 제조된 인공 마이크로베시클이 기존 제조법에 의한 인공 마이크로베시클에 비해 세포질 내 성분을 더 많이 보유하고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 원심력을 이용하여 세포유래 인공 마이크로베시클을 제조하는 장치, 및 이를 이용하여 세포유래 인공 마이크로베시클을 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 세포 현탁액이 투입되는, 주입용 본체부(100);상기 세포 현탁액이 통과하면서 세포가 파쇄되는, 상기 주입용 본체부와 연결된 필터부(200); 및 상기 필터부를 통과하여 생성되는 인공 마이크로베시클을 수거하는, 수거용 본체부(300)를 포함하는 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치를 제공한다. 주입용 본체부(100)와 수거용 본체부(300)는 필터부(200)와 대칭적으로 만들어 져서 주입용 본체부와 수거용 본체부가 같은 역할을 하게 되며, 액체를 여러번 통과 할 수 있도록 만들어준다.
또한, 본 발명은 상기 장치에 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및 원심력을 이용하여 상기 세포에서 인공 마이크로베시클을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 장치를 이용하여 세포유래 마이크로베시클을 제조하는 방법을 제공한다. 세포를 주입용 본체부(100)에 주입 하여 세포가 필터위에 위치하게 한 뒤 원심분리기에 넣고 일정 속도 이상으로 돌리면 피스톤이 원심력을 받아 내려오게 되고 이 피스톤이 세포 현탁액을 밀어 세포가 필터를 통과 하게 만든다. 세포는 이 필터를 통과 하게 되면서 파쇠되고 세포막의 자가 배열 특성에 의해 세포유래 마이크로베시클을 형성한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 주입용 본체부(100)는 뚜껑(110), 피스톤(120) 및 본체(130)가 순차적으로 연결된 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 필터부(200)는 상기 주입용 본체부(100)와 접하도록 배치된 필터(220)가 필터지지대(220)의 내부에 위치하는 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 필터(220)는 두 개의 O-링(210) 사이에 위치하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 필터(220)는 0.2 내지 30 크기의 구멍을 갖는 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 필터(220)는 폴리카보네이트 재질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 필터지지대(230)는 0.1 내지 2mm 크기의 구멍(231)을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 수거용 본체부(300)는 상기 필터부(200)에 본체(330), 피스톤(320) 및 뚜껑(310)이 순차적으로 연결된 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 필터지지대(230)와 수거용 본체부(300) 사이에 하나의 O-링(210)이 위치하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치는 원심력을 이용하여 세포를 농축시킨 상태에서 다공성의 필터를 통과시키는 방법을 통해 마이크로베시클을 제조함으로써, 세포 막의 구조를 그대로 유지할 수 있을 뿐만 아니라 제조시 사용되는 완충액에 의한 세포질의 손실을 최소화 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 장치는 세포유래 인공 마이크로베시클을 효율적으로 다량 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 제조된 마이크로베시클을 이용한 기초 연구, 질병의 진단 및 약물 전달 기술에 광범위하게 활용가능할 것으로 기대된다
도 1은 본 발명에서 제공하는 장치에 대한 전체 구조도이다.
도 2는 도 1에서 도시된 필터 지지대의 확대 도면(a)과 단면도(b)이다.
도 3은 도 1에서 도시된 본체의 확대 도면(a)과 단면도(b)이다.
도 4는 도 1에서 도시된 뚜껑의 확대 도면(a)과 단면도(b)이다.
도 5는 도 1에서 도시된 피스톤의 확대 도면(c) 및 단면도(d)이다.
도 6는 본 발명에서 제조된 인공 마이크로베시클의 투과 전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명에서 제조된 인공 마이크로베시클의 크기를 나타내는 그림이다.
도 8은 상용화된 압출기를 이용하여 제조된 인공 마이크로베시클과 본 발명에서 제조된 인공 마이크로베시클 내에 함유된 RNA 양을 비교한 그림이다(상용화된 압출기로 제조된 인공 마이크로베시클은 Extruder, 본 발명에 따라 제조된 인공 마이크로베시클은 Centrifugal Extruder로 표기).
도 9은 상용화된 압출기를 이용하여 만든 인공 마이크로베시클과 본 발명에서 제조된 인공 마이크로베시클 내에 함유된 단백질 양을 비교한 그림이다
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 세포 현탁액이 투입되는, 주입용 본체부(100); 상기 세포 현탁액이 통과하면서 세포가 파쇄되는, 필터부(200); 및 상기 필터부를 통과하여 생성되는 마이크로베시클을 수용하는, 수거용 본체부(300)를 포함하는 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치를 제공한다(도 1 참조).
상기 세포는 포유류의 유핵세포 또는 이의 형질전환된 세포를 사용할 수 있으나, 상기 제조장치를 통해 인공 마이크로베시클의 제조가 가능한 세포는 모두 이용될 수 있다. 상기 형질 전환된 세포는 특정 단백질, 표적유도 물질, 또는 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질을 발현하도록 형질전환된 세포 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 형질 전환된 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 인공 마이크로베시클의 막은 상기 세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포막 이외의 성분은 표적유도 물질(targeting molecule), 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질(fusogen), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있고, 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 자궁경부암 조직에서 얻어낸 헬라세포(HeLa cell)를 이용하여 인공 마이크로베시클을 제조하였다(실시예 1 참조).
상기 주입용 본체부(100)는 뚜껑(110), 피스톤(120) 및 본체(130)가 순차적으로 연결된 형태인 것을 특징으로 한다. 상기 본체(130)는 세포 현탁액을 수용하는 공간이고, 상기 피스톤(120)은 원심력이 작용할 경우, 상기 본체에 있는 세포 현탁액을 필터부(200)로 밀어주는 역할을 한다. 이 때, 피스톤의 외경과 본체의 내경을 동일하게 하여, 세포 현탁액을 본체에 주입하였을 때, 세포가 새지 않도록 하고, 피스톤과 본체의 미세한 틈을 메우기 위해 실링부재를 추가할 수 있다.
상기 필터부(200)는 상기 주입용 본체부(100)와 접하도록 배치된 필터(220)가 필터지지대(220)의 내부에 위치하는 형태인 것을 특징으로 한다. 이 때, 상기 필터는 주입용 본체부와 접하게 위치하고, 원심력이 작용할 경우, 세포 현탁액이 상기 필터를 통과하면서 파쇄된다. 필터의 구멍 크기는 0.2 내지 30인 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 필터의 재질은 일반적으로 물이 통과 할 수 있는 소수성의 물질, 금속, 폴리머, 유리, 실리콘 등의 재질로 사용가능하며,폴리카보네이트 재질인 것이 바람직하나, 상기 구멍 크기로 가공이 가능하고, 세포의 물리화학적 특성을 변성하지 않는 것이라면 어떠한 재질이라도 사용할 수 있다.
상기 필터(220)의 양쪽에는 실링을 위하여 O-링(210)이 배치되고, 필터가 배치되지 않은 필터지지대(230)의 다른 한 쪽면에도 O-링이 배치된다. 이 때, 필터와 O-링 사이에 필터를 지지하기 위해 그물망 구조의 지지막을 배치할 수도 있다.
상기 필터지지대(230)는 필터를 지지하는 역할을 하며, 양쪽 측면에 각각 주입용 본체부(100), 수거용 본체부(300)와 연결된다. 이 때, 필터지지대와 각각의 본체(130, 330)는 나사산을 이용하여 연결되고, 미세한 틈을 메우기 위해 실링 부재를 추가할 수 있으나, 당 업계에 공지된 일반적인 방법을 통해 연결이 가능하다. 또한, 필터지지대는 필터에 의해 파쇄된 현탁액이 통과할 수 있도록 0.1 내지 2mm 크기의 구멍을 가질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다(도 2 참조).
수거용 본체부(300)는 상기 필터지지대(230)를 통과하면서 파쇄된 현탁액을 수용하는 공간으로 상기 필터부(200)에 본체(330), 피스톤(320) 및 뚜껑(310)이 순차적으로 연결된 형태인 것을 특징으로 한다.
주입용 본체부(100)과 수거용 본체부(300)는 대칭적으로 똑같이 만들어져 세포가 필터를 여러번 통과 할 수 있도록 하였다. 주입용 본체부에서 수거용 본체부로 넘어온 현탁액은 다시 수거용에서 주입용으로 다시 원심력을 받아 통과 될 수 있으며 이때는 주입용 본체부와 수거용 본체부의 역할이 바뀌게 된다. 즉 수거용 본체부(300)의 본체(330)는 세포 현탁액을 수용하는 공간이고 상기 피스톤(320)은 원심력이 작용할 경우, 상기 본체에 있는 세포 현탁액을 필터부(200)로 밀어주는 역할을 한다.
본 발명에 따른 주입용 본체부의 본체는 입구를 주사기입구가 들어갈 수 있게 만들어 주사기로 한 번에 세포 현탁액을 넣을 수 있으며, 주입용 본체부와 수거용 본체부의 각각의 본체(130, 330)는 필터지지대(230)를 기준으로 양측에 대칭되도록 연결되어, 각각 세포 현탁액 및 필터를 통과한 현탁액을 수용할 수 있도록 함으로써, 세포가 필터를 여러 번 통과할 수 있도록 배치된다.
상기 장치에 의해 제조되는 인공 마이크로베시클은 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 인지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 유래한 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 장치에 세포를 주입하는 단계; 및 원심력을 이용하여 상기 세포에서 인공 마이크로베시클을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 장치를 이용하여 세포유래 인공 마이크로베시클을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조 방법에서 적용되는 원심력은 원심분리기를 이용하여 제공될 수 있고, 원심력의 크기는 1000 내지 2,000g, 원심분리기를 작동하는 시간은 1 내지 3분인 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 균일한 크기의 인공 마이크로베시클을 제조하기 위하여 상기 원심분리방법을 반복하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 2 내지 5회 반복하여 세포 현탁액이 필터를 통과 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명의 장치를 이용한 인공 마이크로베시클의 제조
1-1. 본 발명의 장치를 이용한 인공 마이크로베시클의 생성
먼저 필터지지대(230)에 10m의 구멍 크기를 갖는 폴리카보네이트 필터를 넣은 후 본체(130)와 조립하고 알코올을 수회 통과시켜 세척한 후, 다시 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 수회 통과시켜 세척하였다. 자궁경부암 조직에서 얻어낸 헬라세포(HeLa cell)를 5 x 107 cells/ml 농도로 PBS(phosphate buffered saline) 용액 1ml에 현탁(resuspension)하였다. 상기 현탁액을 본체에 주입한 후, 원심분리기에 넣고, 1,300g로 1분 45초 동안 작동하고, 이를 3회 반복 작동하였다. 별도의 필터지지대에 구멍 크기가 5m인 폴리카보네이트 필터를 넣고 조립한 후 상기 과정과 동일하게 알코올과 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 상기 10m 폴리카보네이트필터를 통과한 헬라세포를 다시 본체에 넣고, 원심분리기를 1,300g로 1분 45초 동안 작동하고, 이를 3회 반복 작동하였다.
1-2. 인공 마이크로베시클 수득
2.2 ml 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙 400 l 10% 옵티프렙 600l 및 상기 실시예 1-1에서 준비된 5m 폴리카보네이트 필터를 통과한 현탁액 1 ml를 차례로 담았다. 이후 100,000g에서 1시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하였다. 이 때, 원심분리 후 생성되는 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서, 최종적으로 인공 마이크로베시클을 수득하였다.
실시예 2. 인공 마이크로베시클의 특성 분석
실시예 1의 방법에 따라 헬라세포에서 제조한 인공 마이크로베시클을 글로 방전 탄소코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grid)에 3분간 흡착시켰다. 상기 그리드를 증류수로 세척한 후, 2% 우라닐아세테이트(uranylacetate)로 1 분 동안 염색(staining)하여, JEM101(Jeol, Japan) 투과전자현미경으로 관찰하였다.
도 6에서 나타난 바와 같이, 헬라세포로부터 제조한 인공 마이크로베시클은 인지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100 ~ 200 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있었다.
상기 인공 마이크로베시클의 크기를 확인하고자, 인공 마이크로베시클을 5g/ml의 농도로 PBS 1ml에 희석(dilution)하고, 큐벳(cuvette)에 넣은 후, 동적 광산란 입도 분석기로 분석하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 인공 마이크로베시클의 크기는 25 ~ 100nm이며, 평균 크기는 약 50nm로 확인되었다.
실시예 3. 인공 마이크로베시클 내 세포질 비교 분석
본 발명의 장치에서 제조된 인공 마이크로베시클과 상용화된 압출기에서 제조된 인공 마이크로베시클 내 세포질 성분을 비교분석하였다. 먼저, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포에서 제조한 인공 마이크로베시클을 준비하였다.
상용화된 압출기를 이용하기 위하여, 헬라세포를 5 x 107cells/ml 농도로 PBS(phosphate buffered saline) 용액 1ml에 현탁(resuspension)하였고, 상기 현탁액을 상용화된 압출기(mini extruder, Avanti)를 이용하여 구멍 크기가 10m 인 폴리카보네이트 필터에 3회 통과시킨 후, 다시 구멍 크기가 5m인 폴리카보네이트 필터에 3회 통과시켰다. 2.2ml 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙 400l, 10% 옵티프렙 600l 및 상기 5m 필터를 통과한 현탁액 1ml를 차례로 담았다. 이후 100,000g에서 1시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하였다. 이를 통해 생성된, 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서 인공 마이크로베시클을 수득하였다.
3-1. RNA 양 확인
각각의 방법으로 제조된 마이크로베시클 내 존재하는 RNA 양을 비교하기 위해 단백질 양을 BCA protein assay Kit (Thermo scientific)를 이용하여 측정한 후 단백질 200ug을 기준으로 하여 RNA를 분리하였다. 샘플 각각에 0.6ml의 Trizol (Life Technologies)을 넣고 5분 동안 인공 마이크로베시클의 막을 용해하였다. 다음으로 0.2 ml의 chloroform 용액을 넣고 잘 섞어준 뒤 5분 동안 4에 두어 RNA를 다른 물질(단백질, DNA)과 층분리를 하였다. 13,500g에서 10분 동안 원심분리하여 층을 구분한 후, 분리된 상층액(RNA층)을 따로 옮겨 담고, 같은 부피의 IPA(isopropyl alcohol)를 넣어 -20 에서 20분 동안 RNA를 침전시켰다. RNA를 완벽히 침전시키기 위해 13,500g에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 침전시키고, 상층액을 제거하였다. 상기 침전물에 75% ethanol을 넣은 후, 13,500g에서 10분 동안 원심분리하여 ethanol을 완전히 제거한 다음, 5분 이상 상온에서 건조시켰다. DI water를 넣어 상기 건조물을 용해하고, spectrophotometer (Genova)를 이용하여 RNA양을 측정하였다(도 8).
도 8에 나타난 바와 같이, 상용화된 압출기를 사용하여 제조한 인공 마이크로베시클(Extruder)에 비해, 실시예 1의 방법으로 만들어진 인공 마이크로베시클(Centrifugal Extruder)이 2배 이상으로 많은 RNA를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
3-2. 단백질 양 확인
또한, 각각의 방법으로 제조된 인공 마이크로베시클 내 존재하는 단백질 양을 비교하기 위해 단백질 양을 BCA protein assay kit (Thermo scientific)를 이용하여 측정한 후, 단백질 200ug을 기준으로 하여 2% Trion X-100 (Sigma)을 이용하여 인공 마이크로베시클의 막을 분해하였다. 인지질을 분리하기 위해 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 분리된 상층액을 BCA protein assay kit (Thermo scientific)를 이용하여 측정하였다(도 9).
도 9에서 나타난 바와 같이, 상용화된 압출기를 사용하여 제조한 인공 마이크로베시클에 비해, 실시예 1의 방법으로 만들어진 세포유래 인공 마이크로베시클이 약 2배 정도의 많은 단백질을 함유하고 있는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
100 : 주입용 본체부 110 : 뚜껑
120 : 피스톤 130 : 본체
200 : 필터부 210 : O-링
220 : 필터 230 : 필터지지대
231 : 필터지지대의 구멍 300 : 수거용 본체부
310 : 뚜껑 320 : 피스톤
330 : 본체
본 발명의 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치는 원심력을 이용하여 세포를 농축시킨 상태에서 다공성 필터를 통과시킴으로서 상기 장치를 통해 제조된 마이크로베시클은 세포막구조를 그대로 유지할 뿐만 아니라, 세포질의 손실을 최소화하여 세포질을 함유하는 특성을 나타낸다. 따라서 기존의 장치를 통해 제조된 마이클로베시클의 세포융합 유도의 난해성, 사용되는 계면활성제 및 유기용매 제거의 필요성에 관한 문제점을 극복하였다.
본 발명의 장치를 이용하여 제조된 마이크로베시클은 기초연구뿐만 아니라, 질병의 진단 및 약물전달 기술 등의 응용 연구에도 유용하게 사용 될 수 있다.

Claims (10)

  1. 세포 현탁액이 투입되는, 주입용 본체부(100);
    상기 세포 현탁액이 통과하면서 세포가 파쇄되는, 상기 주입용 본체부와 연결된 필터부(200); 및
    상기 필터부를 통과하여 생성되는 인공 마이크로베시클을 수거하는, 수거용 본체부(300)를 포함하는 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 주입용 본체부(100)는 뚜껑(110), 피스톤(120) 및 본체(130)가 순차적으로 연결된 형태인 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 필터부(200)는 상기 주입용 본체부(100)와 접하도록 배치된 필터(220)가 필터지지대(230)의 내부에 위치하는 형태인 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 필터(220)는 두 개의 O-링(210) 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 필터(220)는 0.2 내지 30 크기의 구멍을 갖는 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 필터(220)는 폴리카보네이트 재질인 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 필터지지대(230)는 0.1 내지 2mm 크기의 구멍(231)을 갖는 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 수거용 본체부(300)는 상기 필터부(200)에 본체(330), 피스톤(320) 및 뚜껑(310)이 순차적으로 연결된 형태인 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 필터지지대(230)와 수거용 본체부(300) 사이에 하나의 O-링(210)이 위치하는 것을 특징으로 하는, 세포유래 인공 마이크로베시클 제조 장치.
  10. 제 1항의 장치에 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및
    원심력을 이용하여 상기 세포에서 인공 마이크로베시클을 제조하는 단계를 포함하는, 제 1항의 장치를 이용하여 세포유래 인공 마이크로베시클을 제조하는 방법.
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