WO2014156980A1 - 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法 - Google Patents

酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2014156980A1
WO2014156980A1 PCT/JP2014/057817 JP2014057817W WO2014156980A1 WO 2014156980 A1 WO2014156980 A1 WO 2014156980A1 JP 2014057817 W JP2014057817 W JP 2014057817W WO 2014156980 A1 WO2014156980 A1 WO 2014156980A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ammonia
plant biomass
raw material
temperature
saccharification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2014/057817
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
靖敏 井口
雅裕 丹羽
佳功 磯村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eneos Corp
Original Assignee
JX Nippon Oil and Energy Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JX Nippon Oil and Energy Corp filed Critical JX Nippon Oil and Energy Corp
Publication of WO2014156980A1 publication Critical patent/WO2014156980A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a raw material for enzymatic saccharification used when producing sugar from plant biomass containing lignocellulose, a method for producing sugar from the raw material, and a method for producing ethanol from the sugar.
  • ethanol has been produced from plant biomass containing lignocellulose (a complex composed of cellulose, hemicellulose, and lignin), such as woody biomass and herbaceous biomass, and will be used as various fuels and chemical raw materials. Attempts to do so are widely made.
  • plant biomass a plant biomass containing lignocellulose (hereinafter sometimes simply referred to as “plant biomass”) is, for example, a method in which the collected plant biomass is decomposed into monosaccharides in the saccharification step and then the sugar obtained. Can be converted to ethanol by fermentation using a microorganism such as yeast.
  • various chemical raw materials such as organic acids can be produced by subjecting the sugar to fermentation using not only ethanol fermentation but also various microorganisms.
  • lactic acid used as a raw material for biodegradable polymers can be produced by subjecting the sugar to lactic acid fermentation.
  • lignocellulose in plant biomass lignin and hemicellulose are bonded by a covalent bond (such as an ester bond), and hemicellulose and cellulose interact through a hydrogen bond, thereby strengthening cellulose and lignin. It is said that this lignin inhibits the action of the enzyme on cellulose. And, one of the mechanism of action that improves the efficiency of enzymatic saccharification by treating plant biomass with ammonia is that at least a part of lignin is caused by amidation cleavage of the ester bond between the lignin and hemicellulose by ammonia. It is based on being separated from cellulose.
  • the action of improving the efficiency of enzymatic saccharification based on the separation of lignin from cellulose by cleavage of the ester bond between lignin and hemicellulose may be referred to as “chemical action”.
  • the amidation cleavage reaction of the ester bond is more likely to proceed as the treatment temperature for ammonia treatment is higher.
  • Non-patent Document 1 It is known that the physical action is manifested when cellulose type I crystals come into contact with ammonia in a liquid phase or a supercritical state. On the other hand, ammonia in the gas phase has no influence on cellulose from the structural viewpoint (see Non-Patent Document 1). This is thought to be because cellulose-ammonia intermediate cannot be formed with cellulose in the gas phase, so that cellulose I-type crystals cannot be transferred to cellulose III-type crystals (Non-patent Document 2). reference).
  • the plant biomass and ammonia are introduced into the high-pressure vessel to express the chemical action.
  • the inside of the high-pressure vessel is heated, and in order to promote the transition of the cellulose crystals to develop the physical action, ammonia is used in the high-pressure vessel.
  • the treatment was carried out in the liquid phase, or the treatment was carried out in a supercritical state under the condition of higher temperature and pressure.
  • ammonia is usually separated and recovered from the treated plant biomass and reused.
  • an operation of vaporizing liquid phase ammonia or liquefying gas phase ammonia is required, including purification of ammonia.
  • ammonia is a substance having a very large latent heat of vaporization (1262 kJ / kg (0 ° C., 101.3 kPaA)
  • the energy per unit amount of ammonia required for these operations is large, and ammonia per unit amount of plant biomass.
  • the amount used increases, the energy consumption required for the separation, recovery and reuse of the ammonia increases, and the economic rationality of the process is lost.
  • ammonia is usually a gas-liquid mixed phase in the pressure vessel.
  • the pressure in the gas phase saturated vapor pressure of ammonia at that temperature.
  • the amount of ammonia in the gas phase increases and the total amount of ammonia in the container increases. That is, the amount of ammonia required per unit amount of plant biomass to be treated increases.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, an enzyme capable of imparting sufficient reactivity for enzymatic saccharification to plant biomass and capable of sufficiently reducing the amount of ammonia used. It aims at providing the manufacturing method of the raw material for saccharification, the method of manufacturing saccharide
  • the physical action in the treatment of plant biomass with ammonia can be efficiently expressed by bringing plant biomass into contact with liquid phase ammonia in a specific proportion of the amount of plant biomass. found. Further, it has been found that the physical action by the treatment using liquid phase ammonia is hardly affected by the treatment temperature and the treatment time and is sufficiently exhibited even at a low temperature and in a short time. On the other hand, it has been found that the chemical action in ammonia treatment appears even when ammonia is in the gas phase.
  • the present inventors tried to perform ammonia treatment multiple times while aiming to solve the problem of reducing the amount of ammonia used.
  • plant biomass can be given sufficient reactivity for enzymatic saccharification, and the amount of ammonia used can be drastically reduced.
  • the present inventors have compared the case where the treatment is performed only with gaseous ammonia by performing the treatment in the first stage ammonia treatment under the condition that a small amount of liquid phase ammonia exists in addition to the gaseous phase ammonia. Thus, it has been found that the cleavage of the ester bond proceeds more efficiently.
  • the present inventors kept the reaction vessel containing the plant biomass at a relatively low temperature ( ⁇ 40 to 80 ° C.), supplied liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia thereto, After that, the temperature of the reaction vessel is raised to the treatment temperature, so that even when the same treatment temperature and the same amount of ammonia are supplied, the pressure is higher than that when liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia is supplied at the high temperature.
  • the present inventors have found that the amount of liquid ammonia present in the container increases and the ammonia partial pressure decreases, and the present invention has been achieved.
  • the present invention is a method for producing a raw material for enzyme saccharification, in which a plant biomass containing lignocellulose is treated with ammonia to obtain a raw material for enzyme saccharification, Liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia is supplied to a reaction vessel containing plant biomass containing lignocellulose at a reaction vessel temperature of ⁇ 40 ° C. to 80 ° C., and then within a range of 60 ° C. to 135 ° C. The temperature of the reaction vessel is increased to a treatment temperature that is higher than the reaction vessel temperature at the time of supply, and the plant biomass is treated with ammonia containing a gas phase and a liquid phase at the treatment temperature, and lignocellulose is obtained.
  • a first step of cleaving at least part of the ester bond between lignin and hemicellulose constituting After the first step, the inside of the reaction vessel is cooled to a reaction vessel temperature of ⁇ 40 ° C. to 40 ° C., and the ratio of the mass of liquid ammonia to the dry mass of the plant biomass (mass of liquid ammonia / plant biomass).
  • the plant biomass is treated with ammonia containing liquid phase at ⁇ 40 ° C. to 40 ° C. by adding liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia so that the dry mass) becomes 0.1 to 1.1.
  • a second step of obtaining a raw material for enzyme saccharification by transferring at least a part of the crystal form of cellulose constituting lignocellulose from type I to type III, and The manufacturing method of the raw material for enzyme saccharification provided with this is provided.
  • the reaction vessel is adjusted so that the ratio of the mass of liquid ammonia present in the reaction vessel at the treatment temperature to the dry mass of the plant biomass is 0.05 to 0.25. It is preferable to supply liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia. By satisfying the above condition, it is possible to effectively achieve both efficient cleavage of the ester bond and reduction of the amount of ammonia used.
  • the present invention also provides a method for producing sugar, comprising a step of saccharifying the enzyme saccharification raw material obtained by the method for producing a raw material for enzyme saccharification according to the present invention with an enzyme.
  • the present invention also provides a method for producing ethanol, comprising a step of fermenting the sugar obtained by the sugar producing method.
  • ethanol can be efficiently produced from plant biomass as a starting material by using the sugar obtained by the sugar production method.
  • a method for producing a raw material for enzyme saccharification by ammonia treatment of plant biomass containing lignocellulose which can reduce the amount of ammonia used than before and can further reduce the treatment time in a high-pressure vessel ,
  • a method for efficiently producing sugar using the raw material, and a method for producing ethanol from the sugar can be provided.
  • the method for producing an enzyme saccharification raw material according to the first embodiment of the present invention is a method for producing an enzyme saccharification raw material for obtaining a raw material for enzyme saccharification by treating plant biomass containing lignocellulose with ammonia, Liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia is supplied to a reaction vessel containing plant biomass containing lignocellulose at a reaction vessel temperature of ⁇ 40 ° C. to 80 ° C., and then within a range of 60 ° C. to 135 ° C.
  • the temperature of the reaction vessel is increased to a treatment temperature that is higher than the reaction vessel temperature at the time of supply, and the plant biomass is treated with ammonia containing a gas phase and a liquid phase at the treatment temperature, and lignocellulose is obtained.
  • a first step of cleaving at least part of the ester bond between lignin and hemicellulose constituting After the first step, the inside of the reaction vessel is cooled to a reaction vessel temperature of ⁇ 40 ° C. to 40 ° C., and the ratio of the mass of liquid ammonia to the dry mass of the plant biomass (mass of liquid ammonia / plant biomass The plant biomass is treated with ammonia containing liquid phase at ⁇ 40 ° C. to 40 ° C.
  • a second step of obtaining a raw material for enzyme saccharification by transferring at least a part of the crystal form of cellulose constituting lignocellulose from type I to type III, and Is provided.
  • Plant biomass The plant biomass used as a raw material in the method for producing a raw material for enzyme saccharification of the present embodiment is not particularly limited as long as it contains lignocellulose, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • “waste biomass” obtained as a residue resulting from production activities such as agriculture and forestry, “resource crop biomass” obtained by intentionally cultivating for the purpose of obtaining energy and the like can be used.
  • Examples of the “waste biomass” include waste building materials, thinned wood, rice straw, straw, rice husk, bagasse, etc., and the “resource crop biomass” is intended to use, for example, celluloses.
  • Plant biomass is also classified into “woody biomass” derived from trees, “herbaceous biomass” derived from grass, and the like. In the present invention, both woody biomass and herbaceous biomass can be used. Plant biomass may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. In addition, the cellulose which comprises the lignocellulose contained in untreated plant biomass has taken the form of the cellulose I type crystal
  • Plant biomass process As plant biomass, collected ones may be used as they are, but from the viewpoint of ease of handling and ammonia treatment efficiency, it is necessary to use them after they are made into particles of a certain size by cutting or grinding. desirable.
  • the size of the plant biomass particles after granulation is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the ease of handling as particles. The following is preferable, and 3 mm or less is more preferable. If the mesh size of the mesh exceeds 5 mm, the efficiency of ammonia treatment described later may be reduced.
  • pulverization as a unit operation is low in energy efficiency. If plant biomass is pulverized into fine particles, the energy required for pulverization increases and the economic rationality of the process is impaired. Accordingly, the amount of energy consumed for pulverization is preferably, for example, 1 MJ or less per kg of plant biomass dry mass, and the size of the particles may be selected according to the energy consumed for pulverization.
  • Plant biomass drying process Collected plant biomass usually retains moisture.
  • the plant biomass that retains moisture may be subjected to ammonia treatment as it is.
  • plant biomass is used. It is preferable to use after drying.
  • the presence of a certain amount or more of water relative to the amount of plant biomass in the system that treats plant biomass with ammonia tends to suppress the formation of cellulose-ammonia intermediates necessary for crystal transition. Is done. Therefore, in the crystal-type transition step in the method for producing a raw material for enzyme saccharification according to this embodiment, when the amount of water in the system exceeds a predetermined level, the transition of cellulose I-type crystals to cellulose III-type crystals does not proceed sufficiently. . Therefore, in order to advance the transition of the cellulose crystal and to fully develop the physical action, it is preferable to reduce the water content in the system to a predetermined level or less during the crystal type transition in the second step. For this, it is preferable to dry the plant biomass and reduce its water content and use it for ammonia treatment.
  • the amount of water contained in the plant biomass and ammonia preferably satisfies the following formula (1).
  • the water content in the plant biomass satisfies at least the following formula (1).
  • the amount of water contained in the plant biomass and ammonia satisfies the following formula (2).
  • the water content in the plant biomass preferably satisfies at least the following formula (2). Water mass / (dry mass of plant biomass + mass of water) ⁇ 0.15 (2)
  • the method for drying plant biomass is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.However, plant biomass is destroyed or oxidized when dried at high temperatures in the atmosphere. Drying, natural drying, drying by ventilation at 100 ° C. or lower, drying under reduced pressure, drying using dimethyl ether, and the like are preferable.
  • drying may be before or after, but is preferably after granulation for handling.
  • the plant biomass may be dried between the first step and the second step, but is preferably performed before the first step.
  • first step liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia is supplied to a reaction vessel containing plant biomass containing lignocellulose at a reaction vessel temperature of ⁇ 40 ° C. to 80 ° C.
  • the reaction vessel temperature is raised to a treatment temperature within the range of 60 ° C. to 135 ° C. and higher than the reaction vessel temperature at the time of supply.
  • the plant biomass is treated with ammonia containing a gas phase and a liquid phase at the treatment temperature to cleave at least a part of the ester bond between lignin and hemicellulose constituting the lignocellulose.
  • the lignin / hemicellulose bond there is an ether bond in addition to the ester bond, but the cleavage of the ester bond in the first step may involve the cleavage of the ether bond.
  • the liquid ammonia in the reaction tank temperature ⁇ 40 ° C. to 80 ° C. (preferably outside temperature to 60 ° C.) is stored in the reaction tank containing the plant biomass containing lignocellulose.
  • ammonia containing liquid ammonia is supplied, and then the reaction vessel temperature is within the range of 60 ° C. to 135 ° C. (preferably 80 ° C. to 130 ° C.) and is higher than the reaction vessel temperature at the time of supply.
  • the configuration in which the temperature is raised is based on the inventors' original knowledge described later.
  • the cleavage of the ester bond does not necessarily require liquid-phase ammonia, and can proceed even with gas-phase ammonia that does not contain a liquid phase.
  • the cleavage of the ester bond can proceed more efficiently as compared with the case where the treatment is carried out only with gaseous ammonia.
  • the reaction tank in which the plant biomass is stored is kept at a relatively low temperature ( ⁇ 40 to 80 ° C.), and liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia is supplied thereto, and then the treatment temperature is reached.
  • a configuration in which the temperature of the reaction vessel is raised is adopted.
  • the supply amount of liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia in the first step is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, but the mass of liquid ammonia present in the reaction vessel at the treatment temperature is not limited.
  • the reaction vessel so that the ratio of the plant biomass to the dry mass (the mass of ammonia in the liquid phase / the dry mass of the plant biomass) is preferably 0.05 to 0.25, more preferably 0.06 to 0.15. It is preferable to supply liquid ammonia or ammonia containing liquid ammonia. By satisfying the above condition, it is possible to effectively achieve both efficient cleavage of the ester bond and reduction of the amount of ammonia used.
  • the amount of total ammonia in the first step relative to the plant biomass is preferably equal to or less than the amount of total ammonia in the second step relative to the plant biomass.
  • the total amount of ammonia in the first step and the second step satisfies the above condition, the total amount of ammonia used in the first step and the second step can be reduced.
  • the cleavage of the ester bond can proceed and the chemical action can be sufficiently expressed.
  • One preferred embodiment for carrying out the first step is to perform the ammonia treatment in a relatively short time using a pressure vessel as a reaction tank and a relatively high ammonia partial pressure and a relatively high temperature. According to this aspect, it is possible to reduce the capacity of the pressure vessel that increases the equipment cost and to increase the productivity.
  • the ammonia partial pressure is preferably 0.5 MPaA to 4 MPaA, more preferably 1.0 MPaA to 2.0 MPaA.
  • the ammonia partial pressure is less than 0.5 MPaA, the ester bond cleavage tends not to proceed at a sufficient rate.
  • the ammonia partial pressure exceeds 4 MPaA, the amount of ammonia used tends to increase.
  • the treatment temperature is 60 to 135 ° C, preferably 80 to 135 ° C, and most preferably 100 to 135 ° C.
  • the treatment temperature is lower than 60 ° C., it takes a long time for the ester bond cleavage to proceed, and in an apparatus using a pressure vessel with a reduced capacity, the productivity tends to decrease.
  • the processing temperature exceeds 135 ° C., the supply amount of ammonia necessary to make liquid phase ammonia exist increases.
  • the amidation cleavage of the ester bond between lignin and hemicellulose in the ester bond cleavage step can be confirmed by FT-IR spectroscopy. More specifically, the absorption around 1662 cm ⁇ 1 in the FT-IR spectrum is attributed to the amide group formed in the plant biomass after the ester bond cleavage step, and can be used as an indicator of the amidation cleavage of the ester bond. . Furthermore, the ratio of the area of absorption attributed to the amide group to the area of absorption attributed to the aromatic ring of lignin (near 1515 cm ⁇ 1 ) is calculated, and this can be used as an index of the degree of amidation cleavage of the ester bond. it can. In the present invention, NICOLET 380 manufactured by Thermo was used, and the FT-IR spectrum was measured by the reflection method in the wave number range of 400 to 4000 cm ⁇ 1 .
  • the cleavage of the ester bond between lignin and hemicellulose in the ester bond cleavage step can be confirmed by extraction of hemicellulose with hot water.
  • Hemicellulose, whose ester bond with lignin is cleaved by ammonia treatment, is difficult to dissolve in cold water, but easily dissolved in hot water.
  • hemicellulose in plant biomass that has not been subjected to the ester bond cleavage step is not extracted into hot water. Therefore, the plant biomass after being subjected to the ester bond cleavage step is extracted with hot water, and the ratio of the amount of extracted hemicellulose to the total amount of hemicellulose contained in the plant biomass (hereinafter referred to as “extraction rate”).
  • the specific procedure for extraction of hemicellulose with the hot water is as follows. That is, first, 0.5 g of a plant biomass sample after being subjected to the ester bond cleavage step is suspended in 20 mL of 50 mM acetate buffer (pH 4.5) and heated in a 100 ° C. hot water bath for 10 minutes. And extract. Then, about 1 mg of a commercially available enzyme containing hemicellulase as a protein amount is added to 10 mL of the filtrate and shaken at 37 ° C. and 200 rpm for 24 hours to perform enzymatic degradation of the extracted hemicellulose.
  • the concentration of xylose in the obtained enzyme decomposition solution is quantified by high performance liquid chromatography using a Shodex SUGAR SP0810 (trade name) column.
  • the raw material plant biomass is separately saccharified by sulfate saccharification, and the amount of xylose produced is similarly quantified.
  • This xylose can be regarded as having been produced by hydrolysis of substantially all hemicellulose contained in the raw plant biomass.
  • the extraction rate of hemicellulose is calculated by dividing the amount of xylose obtained by hot water extraction and enzymatic saccharification by the amount of xylose derived from total hemicellulose in the raw plant biomass obtained by the sulfate saccharification method.
  • the crystal type transition is performed in the second step for the following reason. That is, when the crystal type transition is performed on the plant biomass in which the ester bond is not cleaved, the cellulose III type crystal once generated by the crystal type transition is easily transferred again to the cellulose I type crystal by coming into contact with moisture. On the other hand, when at least part of the ester bond between lignin and hemicellulose is cleaved by ester bond cleavage, the cellulose type III crystal formed by the crystal type transition becomes relatively stable, and cellulose I type by contact with moisture Transition to the crystal again is suppressed.
  • the plant biomass containing lignocellulose is treated with ammonia containing liquid phase, and at least a part of the crystal form of cellulose constituting lignocellulose is transferred from type I to type III.
  • lignocellulose means not only a complex of lignin, hemicellulose, and cellulose contained in untreated plant biomass, but also at least an ester bond between lignin and hemicellulose by an ester bond cleavage step.
  • the complex partly cleaved and the untreated plant biomass are subjected to a crystal transition process, and include the complex in which at least a part of cellulose type I crystals is transferred to type III crystals.
  • ammonia it is necessary for ammonia to contain a liquid phase. This is because in order to transfer at least a part of the cellulose type I crystal to the type III crystal, it is necessary to produce a cellulose-ammonia intermediate. For the production of the intermediate, the cellulose contacts with liquid phase ammonia. This is because it is necessary. Accordingly, if liquid phase ammonia is present, at least a part of the cellulose I-type crystal can be transferred to the III-type crystal.
  • ammonia containing liquid phase in the second step is usually gas-liquid mixed phase ammonia. This is because it is difficult to make the inside of the pressure vessel filled with liquid ammonia without having a gas phase portion, and in such a case, the amount of ammonia to be used depends on the physical action. Is unfavorable because it tends to increase beyond the minimum amount required to make the best use of.
  • the treatment temperature for crystal transition is ⁇ 40 ° C. to 40 ° C.
  • the ratio of the liquid ammonia mass to the dry mass of the plant biomass at the treatment temperature is 0.1 to 1.1.
  • the amount of ammonia in the liquid phase necessary for crystal type transition is hardly affected by temperature.
  • the amount of ammonia in the gas phase varies depending on the temperature and decreases as the temperature decreases. Furthermore, the progress of the crystal type transition is hardly affected by the temperature, and proceeds rapidly even at a low temperature. Therefore, from the viewpoint of reducing the amount of ammonia used, the temperature in the crystal transition process is preferably low.
  • the energy consumption of the refrigerator increases as the ammonia is cooled to a lower temperature.
  • the ratio of the treatment temperature and the mass of liquid ammonia at that treatment temperature to the dry mass of plant biomass is determined. It is preferable to do.
  • the processing temperature for the crystal transition is ⁇ 40 ° C. to 40 ° C., preferably ⁇ 10 ° C. to 20 ° C.
  • the ratio of the mass of ammonia in the liquid phase to the dry mass of the plant biomass is 0.1 to 1.1 as described above, and preferably 0.4 to 0.8.
  • the processing temperature for the crystal transition may be the same as or different from the temperature when the reaction vessel temperature is cooled after the first step as long as it is within the range of ⁇ 40 ° C. to 40 ° C.
  • the ammonia partial pressure in the second step is not particularly limited as long as it is a partial pressure necessary for the presence of liquid phase ammonia at the treatment temperature.
  • the partial pressure is the saturated vapor pressure of ammonia at the temperature, and naturally varies depending on the processing temperature.
  • the processing time for crystal type transition is not particularly limited. Since the crystal type transition by the ammonia treatment including the liquid phase proceeds rapidly, the treatment time is, for example, 0.01 to 1 hour.
  • the amount of water contained in the plant biomass and ammonia preferably satisfies the following formula (1).
  • the amount of water contained in the plant biomass and ammonia satisfies the following formula (2).
  • the liquid phase ammonia present in the crystal-type transition step is used. Is preferably about 35 to about 50% by weight based on the dry weight of the plant biomass.
  • the ratio of the amount of liquid phase ammonia to the amount of the preferred plant biomass varies depending on the type of plant biomass, the content of cellulose, the apparatus used for ammonia treatment and the operating conditions thereof, etc. It is preferred to determine the amount.
  • the amount of water present in plant biomass and ammonia is expressed by the following formula (3): Water mass / (dry weight of plant biomass + water mass) ⁇ 0.15 (3) It is preferable to satisfy.
  • XRD X-ray diffraction
  • the first step may be replaced with a treatment other than the ammonia treatment for cleaving the ester bond between hemicellulose and lignin, for example, so-called alkali cooking treatment or steaming treatment with pressurized hot water.
  • a treatment other than the ammonia treatment for cleaving the ester bond between hemicellulose and lignin for example, so-called alkali cooking treatment or steaming treatment with pressurized hot water.
  • the efficiency of saccharification can be improved.
  • the plant biomass after treatment includes a lot of water.
  • the crystal form transition step in the present embodiment when the plant biomass contains moisture exceeding a predetermined ratio, the transition of the cellulose type I crystal to the type III crystal tends to be inhibited, It is necessary to dry the plant biomass before this step. Since drying of plant biomass containing a large amount of water requires a large amount of energy, the method of performing ester bond cleavage by a process other than the ammonia treatment tends to impair economic rationality.
  • the sugar production method according to the second embodiment of the present invention includes at least an enzyme saccharification step for enzymatic saccharification of the enzyme saccharification raw material obtained by the enzyme saccharification raw material production method according to the first embodiment. Depending on the situation, other steps are included.
  • the enzyme saccharification step according to the sugar production method of the present embodiment is a step in which the cellulose constituting he biomass and hemicellulose are hydrolyzed to obtain a monosaccharide by bringing the enzyme saccharification raw material into contact with the enzyme.
  • the enzyme saccharification method used in the enzyme saccharification step is not particularly limited as long as an enzyme is used, and a known method can be appropriately selected.
  • a chemical saccharification method using sulfuric acid or the like When a chemical saccharification method using sulfuric acid or the like is used, the yield of monosaccharides tends to decrease due to excessive decomposition, and a substance having an inhibitory action is likely to be produced in the fermentation process following saccharification.
  • mild conditions can be selected in the saccharification method using an enzyme. It tends not to occur.
  • the enzyme used in the enzymatic saccharification step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include cellulase and cellobiase ( ⁇ -glucosidase). An immobilized enzyme in which these enzymes are immobilized on an appropriate carrier or matrix can also be used.
  • the amount of the enzyme used in the enzyme saccharification step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, 0.001 mg to about 1 g of the solid dry mass in the enzyme saccharification raw material 100 mg is preferable, 0.01 mg to 10 mg is more preferable, and 0.1 mg to 1 mg is still more preferable. If the amount of the enzyme used is less than 0.001 mg relative to 1 g of the solid content dry mass in the enzyme saccharification raw material, enzyme saccharification may be insufficient, and if it exceeds 100 mg, saccharification inhibition may occur. May happen. On the other hand, when the amount of the enzyme used is within the further preferable range, it is advantageous in that the amount of sugar obtained is larger than the amount of enzyme used.
  • the temperature in the enzymatic saccharification step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 10 ° C to 70 ° C, more preferably 20 ° C to 60 ° C, and further preferably 30 ° C to 50 ° C. . If the temperature is lower than 10 ° C, enzyme saccharification may not proceed sufficiently, and if it exceeds 70 ° C, the enzyme may be deactivated. On the other hand, when the temperature is within the further preferable range, it is advantageous in that the amount of sugar obtained is larger than the amount of enzyme used.
  • pH in the said enzyme saccharification process There is no restriction
  • glucose is obtained as a monosaccharide from cellulose contained in the enzyme saccharification raw material.
  • hexoses such as glucose, galactose and mannose and pentoses such as xylose and arabinose are produced from hemicellulose contained in the enzyme saccharification raw material.
  • the sugar solution containing the monosaccharide obtained by the above enzymatic saccharification step may be directly subjected to the fermentation step described later.
  • a step of adjusting the pH of the sugar solution, a step of adjusting the sugar concentration, etc. Therefore, the sugar solution may be more suitable for fermentation.
  • the sugar obtained by the sugar production method of the present embodiment can be used not only for the ethanol production method described later, but also as a raw material for producing other substances, for example, organic acids such as lactic acid.
  • the method for producing ethanol according to the third embodiment of the present invention includes at least a fermentation process (ethanol fermentation process) for fermenting sugar obtained by the sugar production method according to the second embodiment, and if necessary. Furthermore, other processes are included.
  • the fermentation process according to the ethanol production method of the present embodiment is a process in which an ethanol fermentation microorganism is added to a sugar solution containing the sugar obtained by the sugar production method of the present invention to perform ethanol fermentation.
  • the ethanol-fermenting microorganism is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, yeast, bacteria of the genus Zymomonas such as Zymomonas mobilis, etc. are preferred, and yeast is more preferred.
  • the yeast is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but yeast of the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae is preferable.
  • yeast of the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae is preferable.
  • hemlockose constituting the plant biomass produces pentoses such as xylose and arabinose by enzymatic saccharification, but natural yeasts of the genus Saccharomyces have the ability to assimilate pentoses and produce ethanol. There is no waste.
  • yeast that has the ability to assimilate pentose and produce ethanol (pentose-utilizing yeast) It is also preferable to use
  • pentose utilization yeast Although it can select suitably according to the objective, Pichia stipitis, Candida shihatae, etc. are preferable.
  • a method of using a yeast of the genus Saccharomyces and the aforementioned pentose-utilizing yeast in combination is also preferably employed.
  • the yeast of the genus Saccharomyces and the above-mentioned pentose-assimilating yeast may be fermented, or glucose in the sugar solution is first assimilated by the yeast of the genus Saccharomyces, and then the above-mentioned pentose-assimilating yeast. You may assimilate pentose sugars.
  • the yeast used in the fermentation process may be a natural yeast or a genetically modified yeast.
  • the fermentation temperature is preferably about 20 ° C. to 37 ° C.
  • thermostable yeast examples include thermostable yeast belonging to the genus Kloyveromyces such as Kleiberymyces marxianas.
  • the temperature of fermentation can be about 37 ° C to 50 ° C.
  • the fermentation step a so-called parallel double fermentation method in which the enzyme saccharification step and the fermentation step are simultaneously performed may be employed.
  • the enzyme saccharification step and the fermentation step can be carried out as a single step, and ethanol can be produced by a simplified step.
  • the enzyme saccharification raw material obtained by the enzyme saccharification raw material production method of the present embodiment is used in the reaction system as it is in the reaction system.
  • a microorganism for ethanol fermentation is added to perform enzymatic saccharification and ethanol fermentation.
  • the ethanol production method according to the present invention preferably further comprises a purification step of separating and purifying ethanol from the medium containing ethanol obtained in the fermentation step.
  • a purification step of separating and purifying ethanol from the medium containing ethanol obtained in the fermentation step.
  • ethanol is separated / purified from various substances contained in the fermentation medium and concentrated.
  • the separation / purification method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the fermentation medium is first subjected to solid-liquid separation by centrifuging and / or filtering solids such as bacterial cells.
  • a method of recovering an aqueous solution containing ethanol and then concentrating and purifying the ethanol by a method such as distillation or membrane separation is preferred.
  • ethanol can be efficiently produced by using sugar obtained using the enzyme saccharification raw material.
  • Ethanol obtained by the ethanol production method can be suitably used as, for example, fuel ethanol, industrial ethanol, and the like.
  • Example 1 ⁇ Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification> (Plant biomass) Elianthus was used as a plant biomass containing lignocellulose. The harvested Eliansus was pulverized using a cutter mill while controlling the particle size with a screen having a mesh opening of 3 mm to obtain Eliansus particles. The average particle diameter of the particles was 678 ⁇ m as a median diameter (d50) measured by a laser diffraction method (apparatus: laser diffraction particle diameter measuring apparatus LMS-2000e (manufactured by Seishin Enterprise Co., Ltd.)). The Elianthus particles were dried in a vacuum dryer at 40 ° C.
  • the temperature of the reaction vessel was raised to 120 ° C., and ammonia treatment was performed for 2.0 hours.
  • the ammonia partial pressure in the reaction tank at the time of the treatment is 1.1 MPaA. From the comparison between the temperature / pressure conditions and the supply amount of ammonia, 5.34 kg of ammonia exists in the liquefied state under the above conditions.
  • the ratio of state ammonia to biomass was 0.103. (Second step) After the first step, the reaction vessel is cooled to about 20 ° C., liquid ammonia is additionally supplied so that the ratio of liquefied ammonia to biomass at 10 ° C. becomes 0.6, and then the biomass is stirred. And treated at 11.0 ° C. for 20 minutes.
  • the enzyme saccharification raw material A precisely weighed so as to have a dry solid content of 500 mg is taken into a 50 mL centrifuge tube, and the sample concentration is 5% (dry mass / volume), and Accelerase DUET (trademark) (trade name)
  • the enzyme saccharification reaction liquid was prepared so that it might become 125% (volume / dry mass) and pH4.5 (acetate buffer) with respect to the raw material for enzyme saccharification. This was subjected to an enzymatic saccharification reaction by shaking for 24 hours using a rotary shaker (200 rpm) in a thermostatic chamber at 50 ° C.
  • Glucose yield (%) [glucose amount in enzyme saccharification reaction solution / (dry mass of enzyme saccharification raw material ⁇ total glucosylation rate / 100)] ⁇ 100 (4)
  • the total glucosylation rate (%) is determined by (amount of glucose obtained when the biomass raw material is completely and completely hydrolyzed / dry mass of the biomass raw material) ⁇ 100, and is based on the biomass raw material standard.
  • Example 2 ⁇ Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification> The first and second steps were carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction vessel temperature at the time of supplying ammonia in the first step was set to 60 ° C. to obtain a raw material B for enzyme saccharification.
  • the ammonia partial pressure in the reaction vessel at 120 ° C. was 1.3 MPaA, and the ratio of liquefied ammonia to biomass was 0.096.
  • Example 3 ⁇ Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification> The first and second steps were carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction tank temperature at the time of supplying ammonia in the first step was set to 80 ° C. to obtain a raw material C for enzymatic saccharification.
  • the partial pressure of ammonia in the reaction vessel at 120 ° C. was 1.3 MPaA, and the ratio of liquefied ammonia to biomass was 0.092.
  • Example 4 ⁇ Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification> The first and second steps were carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction tank temperature at the time of ammonia supply in the first step was 80 ° C. and that the ammonia supply amount was 16.4 kg. A raw material D for saccharification was obtained. The ammonia partial pressure in the reaction vessel at 120 ° C. was 1.1 MPaA, and the ratio of liquefied ammonia to biomass was 0.092.
  • Example 5 Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification> The first and second steps were carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction tank temperature at the time of ammonia supply in the first step was set to 80 ° C. and the ammonia supply amount was set to 15.4 kg. A raw material E for saccharification was obtained. In addition, the ammonia partial pressure of the reaction tank at 120 ° C. was 1.1 MPaA, and the ratio of liquefied ammonia to biomass was 0.075.
  • Example 6 Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification> The first and second steps were carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction tank temperature at the time of ammonia supply in the first step was set to 60 ° C. and the ammonia supply amount was set to 14.6 kg. A raw material F for saccharification was obtained.
  • the ammonia partial pressure in the reaction vessel at 120 ° C. was 1.1 MPaA, and the ratio of liquefied ammonia to biomass was 0.063.
  • Example 7 ⁇ Manufacture of raw materials for enzymatic saccharification>
  • the reaction tank was filled with 75 kg of biomass as a dry mass
  • the reaction tank temperature at the time of ammonia supply was 80 ° C.
  • the ammonia supply amount was 16.4 kg.
  • the first and second steps were carried out to obtain a raw material G for enzymatic saccharification.
  • the ammonia partial pressure in the reaction vessel at 120 ° C. was 1.1 MPaA
  • the ratio of liquefied ammonia to biomass was 0.061.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　リグノセルロースを含有する植物バイオマスが収容された反応槽に、－４０℃～８０℃の状態で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給した後、６０℃～１３５℃かつ供給時の反応槽温度よりも高い温度まで昇温し、気相及び液相を含むアンモニアによる処理を行う（エステル結合の開裂）。その後、反応槽温度－４０℃～４０℃まで反応槽内を冷却し、液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量が０．１～１．１となるように反応槽内に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを追加し、－４０℃～４０℃で液相を含むアンモニアによる処理を行う（結晶型転移）。

Description

酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法
　本発明は、リグノセルロースを含有する植物バイオマスから糖を製造する際に用いられる酵素糖化用原料を製造する方法、前記原料から糖を製造する方法、並びに前記糖からエタノールを製造する方法に関する。
　近年、地球温暖化対策の一環として、木質バイオマスや草本バイオマス等の、リグノセルロース（セルロース、ヘミセルロース、リグニンからなる複合体）を含む植物バイオマスからエタノールを製造し、各種燃料や化学原料として利用しようとする試みが広く行われている。リグノセルロースを含有する植物バイオマス（以下、単に「植物バイオマス」ということもある。）からのエタノールの製造は、例えば、収集した植物バイオマスを、糖化工程において単糖に分解した後、得られた糖を酵母等の微生物を利用した発酵によりエタノールに変換することにより行うことができる。
　また、前記糖を、エタノール発酵だけでなく、各種の微生物を用いる発酵に供することにより、様々な化学原料、例えば有機酸等を製造することもできる。一例として、前記糖を乳酸発酵に供することにより、生分解性高分子の原料等に使用される乳酸を製造することができる。
　植物バイオマスの糖化は、従来、濃硫酸を用いて行われることが多かったが、環境負荷低減の観点から、硫酸の使用量を少なくすることが望まれている。そこで、近年は、濃硫酸による糖化に代わる手段として、酵素を用いる糖化が広く研究されている。酵素による糖化は、環境に対する影響の観点から望ましい手段であるが、この酵素糖化のためには、セルロースに対して酵素を作用させやすくするとの目的から、植物バイオマスに前処理を施して、リグノセルロース中のセルロースとリグニンとを分離することが必要となる。
　この植物バイオマスの前処理方法としては、従来、希硫酸、加圧熱水等による蒸煮処理などが一般的である（例えば、下記特許文献１～４参照。）。しかしながら、前述のように、環境負荷低減の観点から硫酸の使用は好ましくない。
　一方、植物バイオマスをアンモニアで処理することにより、その化学的反応性又は生物化学的反応性が向上することが知られている（例えば、下記特許文献５、６、非特許文献１、２参照。）。
　植物バイオマス中のリグノセルロースにあっては、リグニンとヘミセルロースとが共有結合（エステル結合等）により結合し、ヘミセルロースとセルロースとが水素結合を介して相互作用することにより、セルロースとリグニンとが強固に複合化されており、このリグニンが酵素のセルロースへの作用を阻害するとされる。そして、植物バイオマスをアンモニアにより処理することによって酵素糖化の効率が向上する作用機構のひとつは、前記リグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合がアンモニアによりアミド化開裂する等により、リグニンの少なくとも一部がセルロースから分離されることに基づくとされる。以下、前記リグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合等の開裂によるリグニンのセルロースからの分離に基づく酵素糖化の効率向上の作用を「化学的作用」という場合もある。なお、前記エステル結合のアミド化開裂反応は、アンモニア処理の処理温度が高いほど進行しやすい。
　また、リグノセルロースをアンモニアで処理する際、上記リグニンとセルロースとの分離とは別に、アンモニアによるセルロースの結晶型の転移により酵素糖化の効率が向上することも知られている。すなわち、植物バイオマスを構成するセルロースは、主としてセルロースＩ型結晶として存在するが、このセルロースＩ型結晶がアンモニアと接触することにより、セルロースＩ型結晶よりも低い結晶密度を有し、酵素の作用をより受けやすいセルロースＩＩＩ型結晶に転移することが知られている（例えば、下記特許文献7参照。）。以下、セルロース結晶型の転移に基づく酵素糖化の効率向上の作用を「物理的作用」という場合もある。
　前記物理的作用は、セルロースＩ型結晶が液相あるいは超臨界状態にあるアンモニアと接触することにより発現することが知られている。一方、気相のアンモニアはセルロースに対して構造的観点から何ら影響を与えないとされる（非特許文献１参照。）。これは、気相のアンモニアではセルロースとの間でセルロース－アンモニア中間体を形成することができないため、セルロースＩ型結晶をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることができないためと考えられる（非特許文献２参照）。
　そのため、従来、前記植物バイオマスのアンモニア処理において、化学的作用と物理的作用の両方を同時に有効に利用しようとすると、高圧容器内に植物バイオマスとアンモニアとを導入し、化学的作用を発現させるためのリグニンとヘミセルロースとの間の結合の開裂反応を促進するために高圧容器内を加熱し、且つ、物理的作用を発現させるためのセルロース結晶の転移を進行させるために、高圧容器内でアンモニアを液相に保って処理を行うか、あるいは更に高温高圧の条件として、アンモニアを超臨界状態として処理を行うことが行われていた。
特開２００６－０７５００７号公報 特開２００４－１２１０５５号公報 特表２００２－５４１３５５号公報 特開２００２－１５９９５４号公報 米国特許４，６００，５９０号公報 特開２００８－１６１１２５号公報
Ｓｅｎｄｉｃｈ　Ｅ．，　Ｌａｓｅｒ　Ｍ．，　Ｋｉｍ　Ｓ．，　Ａｌｉｚａｄｅｈ　Ｈ．，　Ｌａｕｒｅａｎｏ－Ｐｅｒｅｚ　Ｌ．，　Ｄａｌｅ　Ｂ．　ａｎｄ　Ｌｙｎｄ　Ｌ．　Ｒｅｃｅｎｔ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｍｍｏｎｉａ　ｆｉｂｅｒ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　（ＡＦＥＸ）　ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｓｅｌｌｉｎｇ　ｐｒｉｃｅ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９９，８４２９－８４３５（２００８） Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｙ，Ｆ．Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ＆Ａ．Ｊ．Ｋｉｎｇ，ｘ－Ｒａｙ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｉｎ　Ｎｏｎ－Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉ．　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ａｍｍｏｎｉａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５８，３３３（１９３６）
　ところで、植物バイオマスのアンモニアによる処理においては、通常、処理済みの植物バイオマスからアンモニアを分離・回収して再使用する。このアンモニアの分離・回収、再使用の工程においては、アンモニアの精製処理を含め、液相のアンモニアを気化させる、あるいは気相のアンモニアを液化させるといった操作を要する。ここで、アンモニアは蒸発潜熱が極めて大きい物質であることから（１２６２ｋＪ／ｋｇ（０℃、１０１．３ｋＰａＡ））、これらの操作に要するアンモニア単位量当りのエネルギーが大きく、植物バイオマス単位量当りのアンモニア使用量が増加すると、前記アンモニアの分離・回収、再使用に要する消費エネルギーが増大し、プロセスの経済合理性を失わせることとなる。また、再生使用するとはいえ、多量のアンモニアを使用すること自体、コストの上昇を招く。従って、アンモニア処理工程を含む植物バイオマスからの酵素糖化用原料の製造、前記原料を用いる糖の製造、並びに前記糖からのエタノールの製造において、アンモニア処理におけるアンモニア使用量の低減は、プロセスの商業化にとって極めて重要な事項である。
　しかしながら、従来の、アンモニア処理工程を含む植物バイオマスからの酵素糖化用原料の製造、前記原料を用いる糖の製造、並びに前記糖からのエタノールの製造においては、アンモニア処理におけるアンモニア使用量の低減については必ずしも十分な検討がなされていない。
　さらに、本発明者らの検討によれば、従来法による場合、経済合理性を満たすまでにアンモニア使用量を低減することが非常に困難であることが判明した。
　例えば、液相のアンモニアによる植物バイオマスの処理においては、アンモニアは通常、圧力容器内で気液混相となっている。この際に、圧力容器内に液相のアンモニアを所定量存在するようにしようとすると、容器内の温度が高温であるほど、気相部の圧力（当該温度におけるアンモニアの飽和蒸気圧）が上昇して蒸気密度が増加するため、気相のアンモニア量が増加して、容器内の全アンモニア量は増加する。すなわち、処理すべき植物バイオマスの単位量当たり必要となるアンモニアの量が増加してしまう。
　一方、圧力容器内の温度を低くすると、容器内に存在する液相アンモニアの量を前記所定量とするために必要な全アンモニアの量は低減されるが、温度の低下に伴い、十分な化学的作用を発現させることが困難となる。仮にこの方法で十分な化学的作用を発現させようとすると、圧力容器内で極めて長時間処理するという、商業的実施に適さない操作が必要となる。
　本発明は、前記事情に鑑みてなされたものであり、植物バイオマスに酵素糖化のために十分な反応性を付与することができ、かつ、アンモニアの使用量を十分に低減することが可能な酵素糖化用原料の製造方法、前記原料を用いて効率的に糖を製造する方法、並びに前記糖からエタノールを製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討を行なった結果、まず、以下の知見を得た。
　すなわち、植物バイオマスのアンモニアによる処理における物理的作用は、植物バイオマスと、植物バイオマスの量に対して特定の割合の量の液相のアンモニアとを接触させることにより効率的に発現させることができることが判明した。また、液相のアンモニアを用いた処理による物理的作用は、処理温度、処理時間の影響を殆ど受けず、低温・短時間でも十分に発現することが判明した。一方、アンモニア処理における化学的作用は、アンモニアが気相であっても発現することが判明した。
　そして、本発明者らは、上記の知見に基づき、アンモニア使用量の低減という課題の解決を目的としつつ、アンモニア処理を複数回行うことを試みた。その結果、驚くべきことに、２種の特定のアンモニア処理を組み合わせることによって、植物バイオマスに酵素糖化のために十分な反応性を付与することができ、かつ、アンモニア使用量を飛躍的に低減させることができることを見出した。すなわち、１段目のアンモニア処理は、相対的に高温のアンモニアで処理を行い、エステル結合開裂反応を進行せしめるものである。また、２段目のアンモニア処理は、相対的に低温で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアによる処理を行い、セルロースの結晶型の転移を進行せしめるものである。
　さらに、本発明者らは、上記１段目のアンモニア処理において、気相アンモニアに加えて少量の液相アンモニアが存在する条件で処理を行うことにより、気相アンモニアのみで処理を行う場合に比較して、エステル結合の開裂がより効率的に進行するとの知見を得た。
　ただし、植物バイオマスが収容された反応槽（圧力容器）への液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアの供給を、８０℃を超える高温（特に処理温度、典型的には１２０℃）に保った状態で行うと、アンモニアの気化が進むために、容器内に液相アンモニアを存在させるためには多量のアンモニアを供給する必要がある。また、アンモニア分圧が上昇するために、反応槽の耐圧性能を高める必要があり、装置コストの上昇を招く。
　そこで本発明者らは、さらに検討を重ねた結果、植物バイオマスが収容された反応槽を比較的低温（－４０～８０℃）に保ち、ここに液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給し、その後処理温度まで反応槽温度を昇温することにより、前記高温で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給した場合に比較して、同一の処理温度、同一のアンモニア供給量であっても、圧力容器内に存在する液体アンモニア量が増加し、アンモニア分圧が低下することを見出し、本発明に到達した。
　すなわち、本発明は、リグノセルロースを含有する植物バイオマスをアンモニアにより処理して酵素糖化用原料を得る酵素糖化用原料の製造方法であって、
　リグノセルロースを含有する植物バイオマスが収容された反応槽に、反応槽温度－４０℃～８０℃の状態で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給し、次いで、６０℃～１３５℃の範囲内でありかつ供給時の反応槽温度よりも高い温度である処理温度まで前記反応槽温度を昇温し、該処理温度下で気相及び液相を含むアンモニアによる前記植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の少なくとも一部を開裂させる第一工程と、
　前記第一工程後、反応槽温度－４０℃～４０℃まで前記反応槽内を冷却し、液相のアンモニアの質量の前記植物バイオマスの乾燥質量に対する比（液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量）が０．１～１．１となるように前記反応槽内に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを追加し、－４０℃～４０℃で液相を含むアンモニアによる前記植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するセルロースの少なくとも一部の結晶型をＩ型からＩＩＩ型に転移させて酵素糖化用原料を得る第二工程と、
を備える酵素糖化用原料の製造方法を提供する。
　前記第一工程においては、前記処理温度下で前記反応槽内に存在する液相のアンモニアの質量の前記植物バイオマスの乾燥質量に対する比が０．０５～０．２５となるように、前記反応槽に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給することが好ましい。前記条件を満たすことにより、効率的なエステル結合の開裂とアンモニアの使用量の低減との両立を有効に達成することができる。
　また、本発明は、上記本発明の酵素糖化用原料の製造方法によって得られた酵素糖化用原料を酵素により糖化する工程を備える、糖の製造方法を提供する。
　本発明の糖の製造方法においては、前記酵素糖化用原料の製造方法によって得られた糖化効率の向上した酵素糖化用原料を用いることで、酵素糖化により効率的に糖を製造することができる。
　また、本発明は、前記糖の製造方法によって得られた糖を発酵させる工程を備える、エタノールの製造方法を提供する。
　本発明のエタノールの製造方法においては、前記糖の製造方法によって得られた糖を用いることにより、出発原料の植物バイオマスから効率的にエタノールを製造することができる。
　本発明によれば、従来における諸問題を解決することができ、化学的作用と物理的作用の両方を有効に利用して、酵素糖化の効率が十分に高められた酵素糖化用原料を与えることができ、従来よりも使用するアンモニアの量を低減することができ、更に高圧容器での処理時間を短縮することができる、リグノセルロースを含有する植物バイオマスのアンモニア処理による酵素糖化用原料の製造方法、前記原料を用いて効率的に糖を製造する方法、並びに前記糖からエタノールを製造する方法を提供することができる。
＜第１実施形態：酵素糖化用原料の製造方法＞
　本発明の第１実施形態に係る酵素糖化用原料の製造方法は、リグノセルロースを含有する植物バイオマスをアンモニアにより処理して酵素糖化用原料を得る酵素糖化用原料の製造方法であって、
　リグノセルロースを含有する植物バイオマスが収容された反応槽に、反応槽温度－４０℃～８０℃の状態で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給し、次いで、６０℃～１３５℃の範囲内でありかつ供給時の反応槽温度よりも高い温度である処理温度まで前記反応槽温度を昇温し、該処理温度下で気相及び液相を含むアンモニアによる前記植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の少なくとも一部を開裂させる第一工程と、
　前記第一工程後、反応槽温度－４０℃～４０℃まで前記反応槽内を冷却し、液相のアンモニアの質量の前記植物バイオマスの乾燥質量に対する比（液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量）が０．１～１．１となるように前記反応槽内に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを追加し、－４０℃～４０℃で液相を含むアンモニアによる前記植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するセルロースの少なくとも一部の結晶型をＩ型からＩＩＩ型に転移させて酵素糖化用原料を得る第二工程と、
を備える。
　以下、本実施形態に係る酵素糖化用原料の製造方法について詳述する。
（植物バイオマス）
　本実施形態の酵素糖化用原料の製造方法において原料として使用する植物バイオマスとしては、リグノセルロースを含有する限りにおいて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、農業や林業等の生産活動に伴う残渣として得られる「廃棄物バイオマス」や、エネルギー等を得る目的で意図的に栽培して得られる「資源作物バイオマス」などを使用することができる。前記「廃棄物バイオマス」としては、例えば、廃建材、間伐材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガスなどが挙げられ、また、前記「資源作物バイオマス」としては、例えば、セルロース類の利用を目的として栽培されるシラカバ、ユーカリ、ポプラ、アカシア、ヤナギ、スギ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ミスカンサス、ススキ、リードカナリーグラスなどが挙げられる。また、植物バイオマスは、木に由来する「木質バイオマス」、草に由来する「草本バイオマス」などにも分類される。本発明においては、木質バイオマス及び草本バイオマス共に使用することができる。植物バイオマスは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。なお、未処理の植物バイオマスに含まれるリグノセルロースを構成するセルロースは、基本的にセルロースＩ型結晶の形態をとっている。
（植物バイオマスの粒子化工程）
　植物バイオマスとしては、収集されたものをそのまま使用してもよいが、裁断や粉砕等によりある程度以下の大きさに粒子化してから使用することが、取り扱いの容易さ及びアンモニア処理の効率の観点から望ましい。この場合、粒子化後の植物バイオマスの粒子の大きさとしては特に制限はなく、粒子としての取り扱いやすさなどに応じて適宜選択することができるが、例えば、通過するメッシュの目開きとして、５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以下がより好ましい。前記メッシュの目開きの大きさが５ｍｍを超えると、後述するアンモニア処理の効率が低下することがある。一方、単位操作としての粉砕はエネルギー効率が低く、植物バイオマスを微細な粒子にまで粉砕すると、粉砕に要するエネルギーが増大して、プロセスの経済合理性を損なうこととなる。従って、粉砕の消費エネルギー量は、例えば、植物バイオマス乾燥質量１ｋｇ当り１ＭＪ以下が好ましく、粉砕に消費するエネルギー見合いで粒子の大きさを選択してもよい。
　粒子化に用いる装置としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウィレーミル、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等を用いることができる。
（植物バイオマスの乾燥工程）
　収集された植物バイオマスは通常水分を保有している。この水分を保有した植物バイオマスをそのままアンモニア処理に供してもよいが、物理的作用を有効に利用して、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化の効率を十分に向上させるためには、植物バイオマスを乾燥して使用することが好ましい。
　植物バイオマスのアンモニア処理を行う系内に、植物バイオマスの量に対して一定以上の量の水が存在すると、結晶型転移に必要なセルロース－アンモニア中間体の生成が抑制される傾向にあると推定される。そのため、本実施形態の酵素糖化用原料の製造方法における結晶型転移工程において、系内の水分量が所定の水準を越えると、セルロースＩ型結晶のセルロースＩＩＩ型結晶への転移が十分に進行しない。そこで、セルロース結晶の転移を進行させ、物理的作用を十分に発現させるためには、第二の工程における結晶型転移の際に系内の水分量を所定の水準以下とすることが好ましく、そのためには、植物バイオマスを乾燥し、その水分含有量を低減させてアンモニア処理に供することが好ましい。
　第二工程において、植物バイオマス及びアンモニア中に含まれる水分量は下記式（１）を満たすことが好ましい。そのためには、植物バイオマスを第二工程に供するに際して、当該植物バイオマス中の水分含有量が少なくとも下記式（１）を満たすことが好ましい。
水分の質量／（植物バイオマスの乾燥質量＋水分の質量）≦０．３０　　　（１）
　更に、第二工程においては、植物バイオマス及びアンモニア中に含まれる水分量が下記式（２）を満たすことが好ましい。そのためには、乾燥後の植物バイオマスを第二工程に供するに際して、当該植物バイオマス中の水分含有量が少なくとも下記式（２）を満たすことが好ましい。
水分の質量／（植物バイオマスの乾燥質量＋水分の質量）≦０．１５　　　（２）
　植物バイオマスの乾燥方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、大気下に高温で乾燥すると、植物バイオマスの組織が破壊されたり酸化されたりするため、例えば、天日乾燥、自然乾燥、１００℃以下での通風による乾燥、減圧乾燥、ジメチルエーテルを用いた乾燥などが好ましい。
　植物バイオマスの粒子化を行う場合、乾燥はその前であっても後であってもよいが、取り扱い上、粒子化の後が好ましい。
　植物バイオマスの乾燥は、第一工程と第二工程との間に行ってもよいが、第一工程の前に行うことが好ましい。
（第一工程）
　第一工程においては、まず、リグノセルロースを含有する植物バイオマスが収容された反応槽に、反応槽温度－４０℃～８０℃の状態で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給する。次いで、６０℃～１３５℃の範囲内でありかつ供給時の反応槽温度よりも高い温度である処理温度まで反応槽温度を昇温する。そして、該処理温度下で気相及び液相を含むアンモニアによる植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の少なくとも一部を開裂させる。リグニン／ヘミセルロース間の結合としては、エステル結合の他にエーテル結合も存在するが、第一工程におけるエステル結合の開裂は、エーテル結合の開裂を伴うものであってもよい。
　ここで、本実施形態の第一工程において、リグノセルロースを含有する植物バイオマスが収容された反応槽に、反応槽温度－４０℃～８０℃（好ましくは外気温～６０℃）の状態で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給し、次いで、６０℃～１３５℃（好ましくは８０℃～１３０℃）の範囲内でありかつ供給時の反応槽温度よりも高い温度である処理温度まで反応槽温度を昇温する、という構成を採用しているのは、後述する本発明者らの独自の知見に基づくものである。
　すなわち、まず、エステル結合の開裂は、必ずしも液相のアンモニアを必要とするものではなく、液相を含まない気相のアンモニアのみであっても進行し得るが、少量の液体アンモニアが存在する条件で処理を行うことにより、気相アンモニアのみで処理を行う場合に比較して、エステル結合の開裂をより効率的に進行させることができる。
　ただし、植物バイオマスが収容された反応槽（圧力容器）への液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアの供給を、８０℃を超える高温（特に処理温度、典型的には１２０℃）に保った状態で行うと、アンモニアの気化が進むために、反応槽内に液相アンモニアを存在させるためには多量のアンモニアを供給する必要がある。また、アンモニア分圧が上昇するために、反応槽の耐圧性能を高める必要があり、装置コストの上昇を招く。
　そこで本実施形態の第一工程では、植物バイオマスが収容された反応槽を比較的低温（－４０～８０℃）に保ち、ここに液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給し、その後処理温度まで反応槽温度を昇温する、という構成を採用している。かかる構成の採用により、前記高温で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給した場合に比較して、同一の処理温度、同一のアンモニア供給量であっても、圧力容器内に存在する液体アンモニア量が増加し、アンモニア分圧が低下するため、効率的なエステル結合の開裂とアンモニア消費量の低減とを両立することが可能となる。
　前記第一工程における液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアの供給量は、本発明の効果が損なわれない限りにおいて特に制限されないが、処理温度下で反応槽内に存在する液相のアンモニアの質量の植物バイオマスの乾燥質量に対する比（液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量）が、好ましくは０．０５～０．２５、より好ましくは０．０６～０．１５となるように、反応槽に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給することが好ましい。前記条件を満たすことにより、効率的なエステル結合の開裂とアンモニアの使用量の低減との両立を有効に達成することができる。
　また、第一工程における全アンモニアの植物バイオマスに対する量は、第二工程における全アンモニアの植物バイオマスに対する量以下であることが好ましい。第一工程及び第二工程における全アンモニアの量が前記条件を満たすことにより、第一工程及び第二工程で使用するアンモニアの総量を低減することができる。また、このような条件を選択しても、エステル結合の開裂を進行させて、化学的作用を十分に発現させることができる。
　第一工程を実施するひとつの好ましい態様は、反応槽として圧力容器を用い、比較的高いアンモニア分圧及び比較的高い温度、比較的短時間でアンモニア処理を行うものである。この態様により、設備コストが高額となる圧力容器の容量を小さくし、且つ生産性を高めることができる。
　前記圧力容器を用いる第一工程の態様において、アンモニア分圧は、好ましくは０．５ＭＰａＡ～４ＭＰａＡ、より好ましくは１．０ＭＰａＡ～２．０ＭＰａＡである。アンモニア分圧が０．５ＭＰａＡ未満である場合には、エステル結合の開裂が十分な速度で進行しない傾向にある。一方、アンモニア分圧が４ＭＰａＡを超える場合には、アンモニア使用量の増大を招く傾向にある。
　前記圧力容器を用いる第一工程の態様において、処理温度は６０～１３５℃、好ましくは８０～１３５℃、最も好ましくは１００～１３５℃である。処理温度が６０℃を下回る場合には、エステル結合開裂の進行に長時間を要し、容量が低減された圧力容器を用いる装置においては、生産性が低下する傾向にある。一方、処理温度が１３５℃を超える場合には液相のアンモニアを存在させるために必要なアンモニアの供給量が増大してしまう。
　エステル結合開裂工程におけるリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合のアミド化開裂は、ＦＴ－ＩＲ分光分析により確認することができる。より具体的には、ＦＴ－ＩＲスペクトルにおける１６６２ｃｍ－１付近の吸収は、エステル結合開裂工程後の植物バイオマス中に生成したアミド基に帰属され、エステル結合のアミド化開裂の指標とすることができる。さらに、リグニンの芳香環に帰属される吸収（１５１５ｃｍ－１付近）の面積に対するアミド基に帰属される吸収の面積の比を算出し、これをエステル結合のアミド化開裂度合いの指標とすることもできる。なお、本発明においては、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＮＩＣＯＬＥＴ３８０を用い、波数４００～４０００ｃｍ－１の範囲について反射法によるＦＴ－ＩＲスペクトルの測定を行った。
　また、エステル結合開裂工程におけるリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の開裂は、熱水によるヘミセルロースの抽出によっても確認することができる。アンモニア処理によりリグニンとの間のエステル結合が開裂したヘミセルロースは冷水には溶解しにくいが、熱水には溶解しやすい。一方、エステル結合開裂工程に供していない植物バイオマス中のヘミセルロースは熱水に抽出されない。そこで、エステル結合開裂工程に供した後の植物バイオマスを熱水により抽出し、植物バイオマス中に含まれる全ヘミセルロースの量に対する抽出されたヘミセルロースの量の割合（以下、「抽出率」という。）をリグニン／ヘミセルロース間のエステル結合の開裂の指標とすることを検討した。なお、リグニンとの間のエステル結合が開裂したヘミセルロースが冷水に溶解しないのは、ヘミセルロースとセルロースとの間の水素結合等が原因であると考えられる。
　上記熱水によるヘミセルロースの抽出の具体的な手順は以下のとおりである。
　すなわち、まず、エステル結合開裂工程に供した後の植物バイオマス試料０．５ｇを、２０ｍＬの５０ｍＭ－酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に懸濁させ、１００℃の熱水浴中で１０分間加熱して抽出を行う。これを過し、ろ液１０ｍＬにヘミセルラーゼを含む市販酵素剤をタンパク量として約１ｍｇ添加し、３７℃、２００ｒｐｍにて２４時間振とうし、抽出されたヘミセルロースの酵素分解を行う。得られた酵素分解液中のキシロースの濃度を、Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＵＧＡＲ　ＳＰ０８１０（商品名）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー法により定量する。一方、別途に原料植物バイオマスを硫酸糖化法により糖化処理し、生成するキシロースの量を同様に定量する。このキシロースは、実質的に原料植物バイオマス中に含まれる全ヘミセルロースが加水分解して生成したと見なすことができる。前記熱水抽出及び酵素糖化により得られるキシロース量を前記硫酸糖化法により得られる原料植物バイオマス中の全ヘミセルロース由来のキシロースの量で除すことにより、ヘミセルロースの抽出率を算出する。
（第二工程）
　前記第一工程後、まず、反応槽温度－４０℃～４０℃まで反応槽内を冷却する。次いで、液相のアンモニアの質量の植物バイオマスの乾燥質量に対する比（液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量）が０．１～１．１となるように、反応槽内に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを追加する。そして、液相を含むアンモニアによる植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するセルロースの少なくとも一部の結晶型をＩ型からＩＩＩ型に転移させて酵素糖化用原料を得る。
　なお、本実施形態において、第一工程においてエステル結合開裂を行った後、第二工程において結晶型転移を行うのは、次の理由による。
　すなわち、エステル結合が開裂していない植物バイオマスについて結晶型転移を行うと、結晶型転移により一旦生成したセルロースＩＩＩ型結晶が水分と接触することにより、セルロースＩ型結晶へと再度転移しやすい。一方、エステル結合開裂によりリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の少なくとも一部が開裂されていると、結晶型転移により生成したセルロースＩＩＩ型結晶は比較的安定となり、水分との接触によりセルロースＩ型結晶へ再度転移することが抑制される。
　第二工程においては、リグノセルロースを含有する植物バイオマスを液相を含むアンモニアにより処理し、リグノセルロースを構成するセルロースの少なくとも一部の結晶型をＩ型からＩＩＩ型に転移させる。なお、本発明において、「リグノセルロース」とは、未処理の植物バイオマスに含まれるリグニンとヘミセルロースとセルロースの複合体だけでなく、エステル結合開裂工程により、リグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の少なくとも一部が開裂した前記複合体、及び、未処理の植物バイオマスを結晶型転移工程に供し、セルロースＩ型結晶の少なくとも一部がＩＩＩ型結晶に転移した前記複合体を含むものとする。
　第二工程においては、アンモニアが液相を含むことが必要である。これは、セルロースＩ型結晶の少なくとも一部をＩＩＩ型結晶に転移させるためには、セルロース－アンモニア中間体の生成が必要であり、該中間体の生成にはセルロースが液相のアンモニアと接触することが必要となるためである。従って、液相のアンモニアが存在すれば、セルロースＩ型結晶の少なくとも一部をＩＩＩ型結晶に転移させることができる。
　なお、第二工程における液相を含むアンモニアとは、通常は気液混相のアンモニアである。これは、圧力容器内を、気相部をもたず液体アンモニアで充満された状態とすることは困難であり、また、そのようにした場合には、使用するアンモニアの量が、物理的作用を最大限に利用するために必要な最小量よりも増加する傾向にあることから好ましくない。
　第二工程において、結晶型転移の処理温度は－４０℃～４０℃であり、その処理温度において液相のアンモニアの質量の植物バイオマスの乾燥質量に対する比（液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量）が０．１～１．１となるように、反応槽内に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを追加する。
　なお、第二工程において、結晶型転移のために必要な液相のアンモニア量は温度の影響を殆ど受けない。一方、アンモニアが気液混相にある場合、気相のアンモニア量は温度によって変化し、低温ほど減少する。更に結晶型転移の進行も温度の影響を殆ど受けず、低温においても速やかに進行する。よって、アンモニア使用量を低減する観点から、結晶型転移工程における温度は低温であることが好ましい。他方、アンモニアをより低温に冷却するほど冷凍機の消費エネルギーが増加する。よって、低温にすることによるアンモニア使用量の低減と、冷凍機の消費エネルギーの増加とのバランスから、処理温度並びにその処理温度での液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量の比を決定することが好ましい。具体的には、結晶型転移の処理温度は、－４０℃～４０℃であり、好ましくは－１０℃～２０℃である。また、液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量の比は、前記のとおり０．１～１．１であり、好ましくは０．４～０．８である。なお、結晶型転移の処理温度は、－４０℃～４０℃の範囲内である限りにおいて、第一工程後に反応槽温度を冷却したときの温度と同一であっても異なっていてもよい。
　第二工程におけるアンモニア分圧は特に限定されず、処理温度において液相のアンモニアが存在するために必要な分圧であればよい。その分圧は当該温度におけるアンモニアの飽和蒸気圧であり、当然処理温度によって変化するが、処理温度が－４０～４０℃である場合の好ましいアンモニア分圧として、０．０７～１．６ＭＰａＡを例示することができる。
　第二工程において、結晶型転移の処理時間は特に限定されない。液相を含むアンモニア処理による結晶型転移は速やかに進行することから、処理時間は例えば０．０１～１時間である。
　第二工程において、植物バイオマス及びアンモニア中に含まれる水分量は下記式（１）を満たすことが好ましい。
水分の質量／（植物バイオマスの乾燥質量＋水分の質量）≦０．３０　　　（１）
　更に、第二工程においては、植物バイオマス及びアンモニア中に含まれる水分量が下記式（２）を満たすことが好ましい。
水分の質量／（植物バイオマスの乾燥質量＋水分の質量）≦０．１５　　　（２）
　更に、原料バイオマスとしてエリアンサスを用いた例においては、植物バイオマスの乾燥質量に対して約４０質量％以上の液相のアンモニアを存在せしめることにより、全てのセルロースＩ型結晶をＩＩＩ型結晶に転移させることができる。従って、ほぼ全てのＩ型結晶をＩＩＩ型結晶に転移せしめて物理的作用を最大限に利用しつつ、使用するアンモニア量を最小量とするためには、結晶型転移工程に存在する液相アンモニアの量を植物バイオマスの乾燥質量に対して約３５～約５０質量％とすることが好ましい。なお、前記の好ましい植物バイオマスの量に対する液相アンモニア量の比率は植物バイオマスの種類、セルロースの含有率、アンモニア処理に使用する装置及びその運転条件等により変化するため、実験により最適な液相アンモニア量を決定することが好ましい。
　「植物バイオマスの乾燥工程」に関する説明において述べたように、結晶型転移工程において系内に存在する水分量が増加すると、セルロースＩ型結晶のＩＩＩ型結晶への転移が抑制される傾向にある。そして、セルロースＩ型結晶のＩＩＩ型結晶への転移を促進するためには、植物バイオマス中及びアンモニア中に存在する水分量は前記式（２）を満たすことが好ましい。前記水分量が前記式（２）を満たさない場合は、植物バイオマスを液相を含むアンモニアで処理しても、セルロースＩ型結晶のＩＩＩ型結晶への転移が殆ど進行しない傾向にある。
　更に、植物バイオマス中及びアンモニア中に存在する水分量は下記式（３）：
水分の質量／（植物バイオマスの乾燥質量＋水分の質量）≦０．１５　　　（３）
を満たすことが好ましい。
　植物バイオマス中及びアンモニア中に存在する水分量は前記式（３）を満たすことにより、リグノセルロースを構成するセルロースにおいて、セルロースＩ型結晶の全てがＩＩＩ型結晶に転移する傾向にあり、物理的作用を十分に発現せしめることができる。
　第二工程におけるセルロースＩ型結晶からＩＩＩ型結晶への転移は、処理前後の植物バイオマスについてＸ線回折（ＸＲＤ）分析を行うことによって確認することができる。より具体的には、ＸＲＤパターンにおいて、２θ＝１６°付近（１０１）及び２θ＝２２°付近（０２０）に検出されるピークがＩ型結晶に帰属されるピークであり、２θ＝１２°付近（１０１）及び２θ＝２１°付近（０２０）に検出されるピークがＩＩＩ型結晶に帰属されるピークであり、これらのピークの有無により、各結晶型の有無を判定することができる。なお、本発明者らは、リグノセルロースを含有する植物バイオマスに気相のアンモニアによる処理を行った場合、処理後の植物バイオマスについてのＸＲＤパターンにおいて、ＩＩＩ型結晶に帰属されるピークが検出されないこと、すなわち気相のアンモニアによる処理では結晶型転移が起こらないことを併せて確認している。
　以上の、本発明の第１実施形態に係る酵素糖化用原料の製造方法によれば、植物バイオマスに酵素糖化のために十分な反応性を付与することができ、かつ、アンモニアの使用量を十分に低減することが可能となる。
　なお、前記第一工程は、ヘミセルロースとリグニンとの間のエステル結合を開裂するアンモニア処理以外の処理、例えば、所謂アルカリ蒸解処理、あるいは加圧熱水による蒸煮処理等に置き換えても、同様に酵素糖化の効率を向上することができる。但し、これらの工程においては多量の水を使用するため、処理後の植物バイオマスが多くの水を包含する。前述のように、本実施形態における結晶型転移工程においては、植物バイオマスが所定の割合を超える水分を含む場合には、セルロースＩ型結晶のＩＩＩ型結晶への転移が阻害される傾向にあり、同工程の前に植物バイオマスの乾燥を行う必要がある。多量の水分を含む植物バイオマスの乾燥には多大なエネルギーを要することから、前記アンモニア処理以外の工程によりエステル結合開裂を行う方法は、経済合理性を損なう傾向にある。
＜第２実施形態：糖の製造方法＞
　本発明の第２実施形態に係る糖の製造方法は、前記第１実施形態に係る酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化する酵素糖化工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
　以下、好ましい実施形態に沿って、本発明の糖の製造方法について詳細に説明する。
（酵素糖化工程）
　本実施形態の糖の製造方法に係る酵素糖化工程は、前記酵素糖化用原料と酵素とを接触させることにより、バイオマスを構成するセルロース、及びヘミセルロースを加水分解して単糖類を得る工程である。
　前記酵素糖化工程に用いられる酵素糖化の方法としては、酵素を用いる限りにおいて特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。硫酸等を用いる化学的な糖化方法を用いた場合には、過分解により単糖の収率が低下する傾向にあること、糖化に続く工程である発酵工程において阻害作用をもつ物質が生成し易い傾向にあること、及び硫酸等の環境負荷物質の排出が生じるなどの問題があるのに対して、酵素を用いる糖化方法においては、温和な条件を選択することが可能であり、前記の問題を生じ難い傾向にある。
　前記酵素糖化工程において使用する酵素としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルラーゼ、セロビアーゼ（β－グルコシダーゼ）などが挙げられる。また、これら酵素を適当な担体又はマトリックスに固定化した固定化酵素を使用することもできる。
　前記酵素糖化工程における酵素の使用量としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記酵素糖化用原料中の固形分乾燥質量１ｇに対して、０．００１ｍｇ～１００ｍｇが好ましく、０．０１ｍｇ～１０ｍｇがより好ましく、０．１ｍｇ～１ｍｇが更に好ましい。前記酵素の使用量が、前記酵素糖化用原料中の固形分乾燥質量１ｇに対して、０．００１ｍｇ未満であると、酵素糖化が不十分となることがあり、１００ｍｇを超えると、糖化阻害が起こることがある。一方、前記酵素の使用量が前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
　前記酵素糖化工程における温度としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃～７０℃が好ましく、２０℃～６０℃がより好ましく、３０℃～５０℃が更に好ましい。前記温度が、１０℃より低い温度であると、酵素糖化が十分に進行しないことがあり、７０℃を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記温度が、前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
　前記酵素糖化工程におけるｐＨとしては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、３．０～８．０が好ましく、３．５～７．０がより好ましく、４．０～６．０が更に好ましい。前記ｐＨが、３．０未満、又は８．０を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記ｐＨが、前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
　前記酵素糖化工程により、単糖としては、前記酵素糖化用原料に含まれるセルロースからはグルコースが得られる。また、前記酵素糖化用原料に含まれるヘミセルロースからはグルコース、ガラクトース、マンノースといった六炭糖及びキシロース、アラビノースといった五炭糖が生成する。
（その他の工程）
　上記の酵素糖化工程により得られる単糖を含む糖液は、そのまま後述する発酵工程に供してもよいが、例えば、糖液のｐＨを調整する工程、糖の濃度を調整する工程などを施すことにより、発酵により適した糖液としてもよい。
　本実施形態の糖の製造方法により得られる糖は、後述するエタノールの製造方法に用いるだけでなく、その他の物質、例えば乳酸等の有機酸の製造の原料として用いることもできる。
＜第３実施形態：エタノールの製造方法＞
　本発明の第３の実施形態に係るエタノールの製造方法は、前記第２実施形態に係る糖の製造方法により得られた糖を発酵する発酵工程（エタノール発酵工程）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
　以下、本実施形態に係るエタノールの製造方法について詳述する。
（発酵工程）
　本実施形態のエタノールの製造方法に係る発酵工程は、前記本発明の糖の製造方法により得られた糖を含む糖液に、エタノール発酵微生物を添加し、エタノール発酵を行う工程である。
　前記エタノール発酵微生物としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、酵母、ザイモモナス・モビリス等のザイモモナス属の細菌等が好ましく、酵母がより好ましい。
　前記酵母としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、サッカロマイセス・セルビシエ等のサッカロマイセス属の酵母が好ましい。但し前述のように、前記植物バイオマスを構成するヘミセルロースからは、酵素糖化によりキシロース、アラビノースといった五炭糖が生成するが、サッカロマイセス属の天然酵母は五炭糖を資化してエタノールを産生する能力をもたない。このため、六炭糖だけでなくヘミセルロース由来の五炭糖も有効に利用してエタノールに変換するためには、五炭糖を資化してエタノールを産生する能力を有する酵母（ペントース資化酵母）を使用することも好ましく行われる。前記ペントース資化酵母としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ピキア・スティピティス、カンジダ・シハタエ等が好ましい。六炭糖及び五炭糖を効率的にエタノールに変換するためには、サッカロマイセス属の酵母と、前述のペントース資化酵母とを組み合わせて使用する方法も好ましく採用される。この場合、サッカロマイセス属の酵母と前述のペントース資化酵母を共存させて発酵を行なってもよいし、まずサッカロマイセス属の酵母により糖液中のグルコースを資化させ、その後前述のペントース資化酵母により五炭糖を資化させてもよい。
　前記発酵工程に用いる酵母は、天然の酵母であってもよいし、遺伝子組換え酵母であってもよい。特に、六炭糖と五炭糖の両方の資化能を有する遺伝子組換え酵母を用いることにより、効率的にセルロース及びヘミセルロース由来の六炭糖及び五炭糖の両方をエタノールに変換することができる。
　前記発酵工程における前記酵母の使用量、糖以外の添加物、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等の条件としては特に制限はなく、公知の条件を適宜選択して用いることができるが、ｐＨは４～７、発酵温度は２０℃～３７℃程度が好ましい。
　また、耐熱性の酵母を用いて、通常よりも高い温度で発酵を行なうことで、冷却のための設備を必要とせず、また雑菌の繁殖を抑制して効率的に発酵を行なうこともできる。前記耐熱性の酵母としては例えば、クロイベロマイセス・マルキシアナス等のクロイベロマイセス属に属する耐熱性酵母が挙げられる。これらの耐熱性酵母を使用する場合は、発酵の温度は３７℃以上５０℃以下程度とすることができる。
　前記発酵工程としては、前述の酵素糖化工程と発酵工程とを同時に行う、所謂並行複発酵法を採用してもよい。この並行複発酵法を採用することにより、前記酵素糖化工程と発酵工程とを単一の工程として実施することができ、簡略化された工程によってエタノールを製造することが可能となる。前記並行複発酵としては、前記本実施形態の酵素糖化用原料の製造方法によって得られた酵素糖化用原料に、酵素糖化のための酵素、及び、酵素糖化により生成する糖をそのまま反応系内でエタノール発酵させるための微生物を添加し、酵素糖化及びエタノール発酵を行う。
（その他の工程）
　本発明に係るエタノールの製造方法は、前記発酵工程において得られたエタノールを含む培地からエタノールを分離・精製する精製工程を更に備えることが好ましい。前記精製工程により、エタノールは発酵培地中に含まれる種々の物質から分離・精製され、また濃縮される。前記分離・精製の方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、まず発酵培地を、菌体等の固形分を遠心分離及び／又はろ過などにより固液分離し、エタノールを含む水溶液を回収し、その後、該水溶液を蒸留、膜分離などの方法によりエタノールを濃縮、精製する方法が好ましい。
　本実施形態のエタノールの製造方法によれば、前記酵素糖化用原料を用いて得られた糖を用いることで、効率的にエタノールを製造することができる。前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノールなどとして好適に利用可能である。
　以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
＜酵素糖化用原料の製造＞
（植物バイオマス）
　リグノセルロースを含有する植物バイオマスとしてエリアンサスを用いた。収穫したエリアンサスを目開き３ｍｍのスクリーンで粒度を制御しながらカッターミルを用いて粉砕し、エリアンサス粒子を得た。該粒子の平均粒子径はレーザー回折法（装置：レーザー回折粒子径測定装置ＬＭＳ－２０００ｅ（セイシン企業社製））で測定したメジアン径（ｄ５０）として６７８μｍであった。このエリアンサス粒子を減圧乾燥器にて、４０℃、５ｋＰａＡの減圧下に一昼夜乾燥した。得られたバイオマスの含水率は、バイオマスの全質量を基準として０．９質量％であった。
（第一工程）
　撹拌装置を備えた反応槽（内容積２０００Ｌの圧力容器）に上記のバイオマスを乾燥質量として５０ｋｇ充填し、反応槽を真空ポンプにて－０．０９５ＭＰａＧまで減圧した後、窒素を０ＭＰａＧまで供給した。次いで、反応槽内を４０℃まで昇温した後、バイオマスを攪拌した状態にてポンプを用いて液体アンモニアを含むアンモニアを１８．３ｋｇ供給した。アンモニアの供給後、反応槽を１２０℃まで昇温し、２．０時間のアンモニア処理を行った。なお、前記処理時の反応槽のアンモニア分圧は１．１ＭＰａＡで、温度・圧力条件及びアンモニアの供給量との対比から、前記条件において、５．３４ｋｇのアンモニアが液化状態で存在し、その液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．１０３であった。
（第二工程）
　前記第一工程の後、反応槽を２０℃程度まで冷却し、１０℃における液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率が０．６になるように液体アンモニアを追加供給した後、バイオマスを攪拌した状態にて１１．０℃で２０分処理した。処理終了後にアンモニアの排気を行った。排気後、反応槽を真空ポンプにて－０．０９５ＭＰａＧまで減圧しバイオマス内に残留しているアンモニアを除去した。アンモニアの除去終了後、反応槽を窒素にて大気圧まで加圧し、反応槽より酵素糖化用原料Ａを抜き出した。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａを用い、以下の操作により、酵素糖化反応を行った。
　内容積５０ｍＬの遠心管に、乾燥固形分として５００ｍｇとなるように精秤した酵素糖化用原料Ａを取り、試料濃度５％（乾燥質量／体積）、酵素としてＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ　ＤＵＥＴ（登録商標）（商品名、ジェネンコア社製）を酵素糖化用原料に対して１２５％（体積／乾燥質量）、ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）となるように酵素糖化反応液を調製した。これを５０℃の恒温室にて、回転振とう機（２００回転／分）を用いて２４時間転倒振とうして酵素糖化反応を行った。反応後、遠心分離によって得られた上澄み液中のグルコース濃度を、グルコースＣＩＩテストワコー（商品名、和光純薬社製）を用いて測定し、酵素糖化率の尺度としてグルコース収率を算出した。
　なお、グルコース収率は下記式（４）で定義される。
　グルコース収率（％）＝［酵素糖化反応液中のグルコース量／（酵素糖化原料の乾燥質量×全グルコース化率／１００）］×１００　　　（４）
　ここで、全グルコース化率（％）は（バイオマス原料を別途化学的に完全に加水分解したときに得られるグルコースの量／バイオマス原料の乾燥質量）×１００によって求められるものであり、バイオマス原料基準のグルコースの理論収率に相当する。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
＜エタノールの製造＞
　酵素糖化原料としてバイオマスＡを用い、上記の＜糖の製造（酵素糖化）＞における遠心管を用いた酵素糖化に相当する条件（但し酵素糖化原料固形分濃度１５ｇ／１００ｍＬ）で酵素糖化を行なって糖液を得た。得られた糖液中のグルコース濃度は４．６ｇ／１００ｍＬ、キシロース濃度は２．６ｇ／１００ｍＬであった。
　次に、容量５０ｍＬの三角フラスコ中にて、前記糖液１５ｍＬに、キシロース資化能を付与したサッカロマイセス酵母を光学密度ＯＤ６００が２０となるよう植菌し、３０℃にて、１４０ｒｐｍで振とう培養して発酵を行なった。グルコースは発酵開始後４時間後に全て消費され、キシロースは４８時間後に全て消費された。エタノール収率は６６％であった。
［実施例２］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を６０℃にしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｂを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．３ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０９６であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｂを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
［実施例３］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を８０℃にしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｃを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．３ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０９２であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｃを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
［実施例４］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を８０℃にしたこととアンモニアの供給量を１６．４ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｄを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．１ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０９２であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｄを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
［実施例５］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を８０℃にしたこととアンモニアの供給量を１５．４ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｅを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．１ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０７５であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｅを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
［実施例６］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を６０℃にしたこととアンモニアの供給量を１４．６ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｆを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．１ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０６３であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｆを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
［実施例７］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程において、反応槽にバイオマスを乾燥質量として７５ｋｇ充填したこと、アンモニア供給時の反応槽温度を８０℃にしたこととアンモニアの供給量を１６．４ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｇを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．１ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０６１であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表１に示す。
［比較例１］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を１２０℃にしたこととアンモニアの供給量を１３．０ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｈを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．２ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０１４であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｈを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表２に示す。
［比較例２］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程における液体アンモニア供給時の反応槽温度を１１０℃にしたこととアンモニアの供給量を１３．０ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｉを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．２ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０１５であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｉを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表２に示す。
［比較例３］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を１１０℃にしたこととアンモニアの供給量を１３．９ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｊを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．２ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０３４であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｊを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表２に示す。
［比較例４］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を１００℃にしたこととアンモニアの供給量を１４．３ｋｇにしたこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程を実施し、酵素糖化用原料Ｋを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．２ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０３７であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｋを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表２に示す。
［比較例５］
＜酵素糖化用原料の製造＞
　第一工程におけるアンモニア供給時の反応槽温度を１２０℃にしたこととアンモニアの供給量を１３．０ｋｇにしたことと１２０℃の気体状態でアンモニアを供給したこと以外は実施例１と同様にして、第一及び第二工程及を実施し、酵素糖化用原料Ｌを得た。なお、１２０℃における反応槽のアンモニア分圧は１．２ＭＰａＡで、液化状態のアンモニアのバイオマスに対する比率は０．０１４であった。
＜糖の製造（酵素糖化）＞
　酵素糖化用原料Ａに代えて酵素糖化用原料Ｌを用いたこと以外は実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行い、グルコース収率を算出した。
　以上得られた結果をまとめて表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示す通り、実施例１～７によれば、アンモニアの使用量を低減しつつ、酵素糖化効率に優れる酵素糖化用原料を製造することが可能であり、また、得られた酵素糖化用原料を用いて酵素糖化を行うことにより、効率的に糖を製造することが可能であり、更に得られた糖を用いて発酵を行うことにより、効率的にエタノールを製造することができることが明らかとなった。

Claims (4)

  1. 　リグノセルロースを含有する植物バイオマスをアンモニアにより処理して酵素糖化用原料を得る酵素糖化用原料の製造方法であって、
    　リグノセルロースを含有する植物バイオマスが収容された反応槽に、反応槽温度－４０℃～８０℃の状態で液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給し、次いで、６０℃～１３５℃の範囲内でありかつ供給時の反応槽温度よりも高い温度である処理温度まで反応槽温度を昇温し、該処理温度下で気相及び液相を含むアンモニアによる前記植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するリグニンとヘミセルロースとの間のエステル結合の少なくとも一部を開裂させる第一工程と、
    　前記第一工程後、反応槽温度－４０℃～４０℃まで前記反応槽内を冷却し、液相のアンモニアの質量の前記植物バイオマスの乾燥質量に対する比（液相のアンモニアの質量／植物バイオマスの乾燥質量）が０．１～１．１となるように前記反応槽内に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを追加し、－４０℃～４０℃で液相を含むアンモニアによる前記植物バイオマスの処理を行い、リグノセルロースを構成するセルロースの少なくとも一部の結晶型をＩ型からＩＩＩ型に転移させて酵素糖化用原料を得る第二工程と、
    を備える酵素糖化用原料の製造方法。
  2. 　前記第一工程において、前記処理温度下で前記反応槽内に存在する液相のアンモニアの質量の前記植物バイオマスの乾燥質量に対する比が０．０５～０．２５となるように、前記反応槽に液体アンモニアまたは液体アンモニアを含むアンモニアを供給する、請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
  3. 　請求項１又は２に記載の酵素糖化用原料の製造方法によって得られた酵素糖化用原料を酵素により糖化する工程を備える、糖の製造方法。
  4. 　請求項３に記載の糖の製造方法によって得られた糖を発酵させる工程を備える、エタノールの製造方法。
PCT/JP2014/057817 2013-03-29 2014-03-20 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法 Ceased WO2014156980A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-072193 2013-03-29
JP2013072193A JP2014195417A (ja) 2013-03-29 2013-03-29 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014156980A1 true WO2014156980A1 (ja) 2014-10-02

Family

ID=51623957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/057817 Ceased WO2014156980A1 (ja) 2013-03-29 2014-03-20 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2014195417A (ja)
WO (1) WO2014156980A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010115162A (ja) * 2008-11-13 2010-05-27 Honda Motor Co Ltd リグノセルロース系バイオマス糖化前処理装置
WO2011142432A1 (ja) * 2010-05-12 2011-11-17 本田技研工業株式会社 糖溶液の製造方法及びそれに用いる糖溶液製造装置
JP2012143179A (ja) * 2011-01-11 2012-08-02 Jx Nippon Oil & Energy Corp 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法
JP2013143918A (ja) * 2012-01-13 2013-07-25 Jx Nippon Oil & Energy Corp 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法、並びにエタノールの製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010115162A (ja) * 2008-11-13 2010-05-27 Honda Motor Co Ltd リグノセルロース系バイオマス糖化前処理装置
WO2011142432A1 (ja) * 2010-05-12 2011-11-17 本田技研工業株式会社 糖溶液の製造方法及びそれに用いる糖溶液製造装置
JP2012143179A (ja) * 2011-01-11 2012-08-02 Jx Nippon Oil & Energy Corp 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法
JP2013143918A (ja) * 2012-01-13 2013-07-25 Jx Nippon Oil & Energy Corp 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法、並びにエタノールの製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNDAWAT ET AL., J AM CHEM SOC, vol. 133, 2011, pages 11163 - 11174 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014195417A (ja) 2014-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Swain et al. Bioethanol production from rice-and wheat straw: an overview
Zhao et al. Bioethanol from lignocellulosic biomass
Krishnan et al. Alkali‐based AFEX pretreatment for the conversion of sugarcane bagasse and cane leaf residues to ethanol
Dubey et al. Bioethanol production from waste paper acid pretreated hydrolyzate with xylose fermenting Pichia stipitis
Cheng et al. Aerobic and sequential anaerobic fermentation to produce xylitol and ethanol using non-detoxified acid pretreated corncob
US8980599B2 (en) Method for the production of alcohol from a pretreated lignocellulosic feedstock
ES2823455T3 (es) Proceso para la preparación de un producto de fermentación de material que contiene lignocelulosa
Liu et al. Bioethanol: New opportunities for an ancient product
Panagiotopoulos et al. Effect of pretreatment severity on the conversion of barley straw to fermentable substrates and the release of inhibitory compounds
Haq et al. Recent progress in bioethanol production from lignocellulosic materials: A review
Smichi et al. Ethanol production from halophyte Juncus maritimus using freezing and thawing biomass pretreatment
Singh et al. Assessment of different pretreatment technologies for efficient bioconversion of lignocellulose to ethanol
Cheng et al. Integrated production of xylitol and ethanol using corncob
WO2014143753A1 (en) Carbon purification of concentrated sugar streams derived from pretreated biomass
WO2014190294A1 (en) Sugar separation and purification from biomass
US12152233B2 (en) Methods for propagating microorganisms for fermentation and related methods and systems
Eloka-Eboka et al. Biobutanol from agricultural and municipal solid wastes, techno-economic, and lifecycle analysis
Keshav et al. Sequential acid and enzymatic saccharification of steam exploded cotton stalk and subsequent ethanol production using Scheffersomyces stipitis NCIM 3498
WO2010077170A2 (en) Process and system for production of organic solvents
Sigoillot et al. Second generation bioethanol
Sudhakar et al. Pretreatment, Hydrolysis and Fermentation of Lignocellulosic Biomass for Bioethanol
WO2014156980A1 (ja) 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法
JP2013143918A (ja) 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法、並びにエタノールの製造方法
López-Linares et al. Production of bioethanol from lignocellulosic materials by non-conventional microorganisms
JP5761682B2 (ja) 酵素糖化用原料の製造方法、糖の製造方法及びエタノールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14775755

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14775755

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1