WO2014112858A1 - Proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas - Google Patents

Proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas Download PDF

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shikimic acid
glyphosate
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Jorge Alejandro Benavides Lozano
Luis Alberto CISNEROS ZEVALLOS
Alejandro BECERRA MORENO
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Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
The Texas A&M University System
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Definitions

  • This invention relates to the development of a process for the overproduction of bioactive compounds such as shikimic acid (AS) and phenolic compounds (CF) in fruit and vegetable crops, through the application of postharvest abiotic stresses.
  • bioactive compounds such as shikimic acid (AS) and phenolic compounds (CF)
  • provitamin A (beta41 1 carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 2000, 287, 303-305] [Niggeweg, R .; Michael, AJ; Martin, C. Engineering pla ⁇ s with increased levéis of the antioxidant chlorogenic acid. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 746-754. 351] as prokaryotes [Johansson, L .; Lindskog, A .; Silfversparre, G .; Cimander, C; Nielsen, KF; Lidén, G. Shikimic acid production by a modified strain of E-coli (W3110.shikl) under phosphate-limited and carbon-limited conditions.
  • Biotechnol Bioen 2005, 92, 541-552] [Diretto, G .; Al-Babili, S .; Tavazza, R .; Papacchioli, V .; Beyer, P .; Giuliano, G. Metabolic engineering of potato carotenoid contained through tuber-specific over expression of a bacterial mini-pathway. PLoS ONE. 2007, 2, e350] have been genetically modified to favor the production and accumulation of metabolites of commercial interest.
  • metabolic engineering is technically complex and commercial scale cultivation of transgenic plant lines is often challenged by the potential risks to the environment and human health [Colwell, RK; Norse, EA; Pimentel, D .; Sharples, FE; Simberloff, D.
  • Caffeoquinic acids are phenolic compounds (CF) with great potential for the prevention and treatment of different degenerative diseases such as HIV [Robinson, WE, Jr .; Cordeiro, M .; Abdel-Malek, S .; Jia, Q .; Chow, SA; Reinecke, MG; Mitchell, WM Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodeficiency and virus integrase: inhibition of the core catalytic domain of human immunodeficiency and virus integrase.
  • HIV Robotson, WE, Jr .; Cordeiro, M .; Abdel-Malek, S .; Jia, Q .; Chow, SA; Reinecke, MG; Mitchell, WM Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodeficiency and virus integrase: inhibition of the core catalytic domain of human immunodeficiency and virus integrase.
  • the main natural sources of AS are plants of the genus Illicium, such as Chinese star anise [Bochkov, DV; Sysolyatin, SV; Kalashnikov, AI; Surmacheva, IA Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources. J. Chem. Biol. 2012, 5, 5-17] and although there are other methods of production and extraction of AS using microorganisms, none of them is as profitable as star anise so far.
  • Glyphosate when applied in plants, inhibits the biosynthesis of aromatic amino acids by blocking the action of the enzyme 5- enolpiruvilshikimato-3-phosphate synthase (EPSP synthase) [Amrhein, N .; Deus, B .; Gehrke, P .; Steinrücken, HC The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate. II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant Physiol 1980, 66, 830-834].
  • ESP synthase 5- enolpiruvilshikimato-3-phosphate synthase
  • Shikimic acid 3-phosphate is the substrate of EPSP synthase, and when this enzyme is inhibited by glyphosate, S3F is not used and is quickly transformed into AS [Harring, T .; Streibig, J. C; Husted, S. Accumulation of shikimic acid: a technique for screening glyphosate efficacy. J Agrie. Food Chem. 1998, 46, 4406-4412]. Protocols for the accumulation of AS in various plant materials using glyphosate have been reported.
  • Iomantas et al (2002 US6436664) describe a method for the production of AS using modified strains of Bacillus subtilis deficient in activity of shikimato kinase and 5-enolpiruvilshikimato-3-phosphate synthase, which produce and accumulate AS in the culture medium .
  • Shirai et al (2001 European Patent Application EP 1092766) report a similar process with a mutant strain of Citrobacter freundii to produce AS through fermentation.
  • carrots (Da cs carota) were selected as a vegetable model, as it is a widely distributed crop around the world and easy to handle.
  • the carrot today is one of the most produced vegetables worldwide. In Mexico around -340,000 tons / year of carrots are grown [FAOSTAT. 2010. FAO Statistical Databases. Agricultural Data].
  • quality standards are compromised, forcing part of the production to be wasted ( ⁇ 10% of annual production in Mexico).
  • Figure 1 Schematic representation of the proposed process for the overproduction of bioactive compounds in fruit and vegetable crops.
  • Figure Ib Schematic representation of the proposed process for the overproduction of bioactive compounds in fruit and vegetable crops, including a drying stage.
  • Figure him. Schematic representation of the proposed process for the overproduction of bioactive compounds in fruit and vegetable crops, including a drying and grinding stage.
  • Figure Id. Schematic representation of the proposed process for the overproduction of bioactive compounds in fruit and vegetable crops, including a glyphosate application stage.
  • Figure lf Schematic representation of the proposed process for the overproduction of bioactive compounds in fruit and vegetable crops, including a glyphosate application stage, dried and ground.
  • Figure lg Schematic representation of the proposed process for the overproduction of bioactive compounds in fruit and vegetable crops, including a glyphosate application stage, drying, and subsequent recovery, purification and polishing stages.
  • Figure 2. Accumulation of shikimic acid during storage of grated carrots. The samples were stored for 48 h at 25 ° C at atmospheric pressure with a relative humidity of 65% in total darkness. The values represent the average of 4 repetitions with their standard error bars. Data with different letters indicate statistically significant differences by the LSD test (p ⁇ 0.05).
  • Peak assignments include: (1) shikimic acid, (2) protocatechic acid, (3) derived from gallic acid, (4) chlorogenic acid, (5) 3.5 acid - medicafeoilqu ⁇ nico; (6) derivative A of p-cumaric acid; (7) 4,5-dicaphenoquinic acid; (8) p-cumaric acid, (9) ferulic acid, (10) derivative B of p-cumaric acid; (1 1) derivative of ferulic acid; (12) isocoumarin.
  • the present patent application describes a novel process to induce the overproduction and accumulation of bioactive compounds such as shikimic acid (AS) and phenolic compounds (CF) in plants whose fruits, seeds, leaves, stems and roots are edible (fruit and vegetable crops), by applying postharvest abiotic stresses to at least one of the aforementioned parts of the fruit and vegetable crop, where said process is enhanced by using glyphosate addition in one of its stages.
  • bioactive compounds such as shikimic acid (AS) and phenolic compounds (CF)
  • the present patent application includes providing a process for the overproduction of shikimic acid and phenolic compounds in a fruit and vegetable crop basically in 2 stages after the harvest of the fruit and vegetable crop.
  • the plant material can come from various industries, this being easily accessible, favoring its exhaustive handling both at the laboratory and industrial level.
  • the plant material discarded by the various industrial sectors may be due to the presence of some factors during its growth and maturation that may affect it and therefore decrease its commercial value as a raw material for human consumption [Pantastico, EB Postharvest physiology, handling and utilization of tropical and subtropical fruits and vegetables. Avi Pub. Co. 1975] [Koda, Y .; Okazawa, Y. Influences of environmental, hormonal and nutritional factors on potato tuberization in vitro. Jap J.
  • Crop Sel 1983, 52, 582-591] [Salunkhe, DK; Kadam, SS Treaty of science and technology of vegetables. Production, composition, storage and processing. Acribia Editorial; Translation by Orlando Pablo Vázquez Yá ⁇ ez and Pilar Calo Nata. 2004].
  • Table 1 Some of the most common factors in various fruit and vegetable crops that reduce their quality during growth are presented in Table 1, taking as examples two of the most common crops worldwide, carrots and potatoes. Table 1. Most common factors in some fruit and vegetable crops during their growth and maturation that reduce their quality and commercial value as raw materials for human consumption.
  • the process for the overproduction of AS and CF in fruit and vegetable crops is represented in Figure 1, and includes the following stages: a) Subsequently post-harvest abiotic stress (100) the previously washed and sanitized fruit and vegetable crop.
  • the vegetable tissue of the fruit and vegetable crop is cut, preferably grated to obtain fragments thereof, where the zest of the crop (101) activates the primary and secondary metabolism of the plant tissue to direct the carbon flow towards the production of AS and CF .
  • the zest of the plant tissue (101) obtained in stage a) is incubated;
  • the incubation is carried out under certain conditions to promote the production and accumulation of AS and CF. Naming the product obtained as nutraceutical scratches.
  • a drying stage can be included, and this is depicted in Figure Ib.
  • This stage is carried out to eliminate excess water, which helps preserve nutraceutical scratches by inhibiting the proliferation of microorganisms and hindering their rot. Water is removed by evaporation to obtain dehydrated nutraceutical scratches.
  • nutraceutical powder In this stage the dehydrated nutraceutical scratches are sprayed with a preferred residence time between 1 to 5 min until reaching a particle size preferably from 0.05 mm to 0.35 mm thus achieving a uniform dispersion of the solid material called nutraceutical powder
  • a drying stage can be included as shown in Figure le. c) Dry (300) the glyphosated zest (202) obtained in b).
  • This stage is carried out to carry out the elimination of water, which helps to preserve glyphosated scratches by inhibiting the proliferation of microorganisms and hindering their rot. Water is removed by evaporation to obtain dehydrated glyphosated zest.
  • stage c a grinding stage shown in Figure lf.
  • the dehydrated glyphosated scratches are pulverized with a preferred residence time between 1 to 5 min until a particle size of preferably 0.05mm to 0.35mm is achieved, thus achieving a uniform dispersion of the solid material called glyphosated powder.
  • the glyphosated zest, the dehydrated glyphosated zest and the glyphosated powder (202, 302, 402), contain unpurified AS and CF so that each of these products are individually subjected to a later stage of recovery, purification and polishing (600) in order to obtain spent plant material (601), pure AS and CF ( Figure lg).
  • the nutraceutical grating obtained in accordance with the process represented in Figure 1 has the following characteristics: rough appearance, dehydration, orange coloration with slight discoloration, slight reduction in size, minimum diameter of 2mm, pH 4-6, humidity 15-95%, ashes 4-7%, fats 0.5- 0.7%, proteins 6.5-9.5%, carbohydrates 30-45%, vitamins and minerals 15-25%, 100-500 mg AS / kg dry base (ppm) and 1000-3000 mg equivalent of chlorogenic acid / kg dry base (ppm CF).
  • Storage for nutraceutical grating is recommended under freezing conditions, preferably at 20 ° C below zero, under conditions of total darkness. Its industrial application is as a raw material for the extraction of nutraceutical compounds with applications in the food and food supplement industry as an additive for the production of processed foods derived from fruits and vegetables (soups, sauces, among others.)
  • the dehydrated nutraceutical zest obtained in accordance with the process described above and represented in Figure Ib has the following characteristics: rough appearance, dehydration, orange coloration, size reduction, minimum diameter of 2mm, pH 4-6, humidity 2- 15%, water activity (25 ° C) 0.3-0.4, ashes 7-8.5%, fats 0.7-0.8%, proteins 9.5-1 1%, carbohydrates 45-50%, vitamins and minerals 25-30%, 100- 500 mg AS / kg dry base (ppm) and 1000-3000 mg equivalent of chlorogenic acid / kg dry base (ppm CF).
  • the recommended storage conditions for nutraceutical grating are refrigeration at 20 ° C below zero, in conditions of total darkness, this before deciding the final destination of industrial application.
  • the nutraceutical powder obtained in accordance with the process described above and represented in Figure le has the following characteristics: orange coloration, granulometry range between 23 and 30% retained at a particle size greater than 0.29mm, between 10 and 23% of retention between 0.10 and 0.29mm, and between 5 and 10% of retention at a particle size less than 0.1 Omm, pH 4- 6, humidity 2-15%, water activity (25 ° C) 0.3- 0.4, ashes 7-8.5%, fats 0.7-0.8%, proteins 9.5-11%, carbohydrates 45-50%, vitamins and minerals 25-30%, 100-500 mg AS / kg dry base (ppm) and 1000-3000 mg equivalent of chlorogenic acid / kg dry base (ppm CF).
  • nutraceutical powder It is recommended to store the nutraceutical powder at a temperature of 20 to 25 ° C in total darkness. Its industrial application is as a raw material for the extraction of nutraceutical compounds with applications in the food supplement industry as well as additive with applications in the meat products industry and in processed vegetables.
  • glyphosated zest obtained in accordance with the process that includes steps a), a ') and b) described above and represented in Figure Id has the following characteristics: rough appearance, slight dehydration, orange coloration with slight discoloration, reduction in size, minimum diameter of 2mm, pH 3-7, humidity 15-95%, ashes 0.2-6%, fats 0.2-0.5%, proteins 0.2-0.5%, carbohydrates 0.5-30%, vitamins and minerals 0.3-15% , 2000-6000 mg AS / kg dry base (ppm) and 1000-3000 mg equivalent of chlorogenic acid / kg dry base (ppm CF).
  • the glyphosate powder obtained in accordance with steps a), a ' ), b), c) and d) described above, and represented in Figure lf, has the following characteristics: orange coloration, granulometry range between 23 and 30% of retained at a particle size greater than 0.29mm, between 10 and 23% retained between 0.10 and 0.29mm, and between 5 and 10% retained at a particle size less than O.
  • the fruit and vegetable crop used in this example consists of carrots in any ripening stage including physiological and commercial maturity as well as all those that have been discarded for human consumption due to factors that decrease their quality such as bumps, dents, or any mechanical damage.
  • which should be washed and sanitized usually carried out using standard protocols with chlorinated water, although any other standard procedure for disinfection of plant material is usable.
  • the volume of water to be used depends on the amount of vegetable material from the fruit and vegetable crop. This amount usually goes from a 1: 2 to 1: 4 ratio (kg of plant tissue: liters of chlorinated water), so that said plant material is completely submerged in the chlorinated water.
  • the chlorine concentration ranges from 150 to 250 ppm at a pH between 6 - 7.
  • the contact time of the water with the plant material usually ranges from 5 to 30 minutes depending on the amount of impurities present on the surface of the plant. Washing and disinfection have as their primary objective the elimination of dirt, fertilizers, bacteria and insects from the surface. Plant materials are susceptible to contamination with pathogens responsible for causing diseases. In the same way, organisms must be eliminated in order to prevent their growth on the plant tissue during the incubation stage. It is essential to eliminate organisms since stressed plant materials can generate different responses during the production process of the compounds bioactive because their growth represents a biotic stress not considered. Additionally, removing solid remains and organisms from the surface of the plant tissue facilitates the subsequent recovery and purification process in which the compounds of interest are isolated based on their application.
  • Additional operations that may be part of this stage of preparation of plant tissue may be oriented to the classification and fractionation of different tissues (removal of spines, seeds, etc.), removal of foreign solid material that cannot be removed by effect of the washing process, as well as any other type of operation that is relevant to favor that the subsequent stages of the process are carried out in an appropriate manner, based on the nature and origin of the plant tissue used.
  • the preparation of the carrot After the preparation of the carrot it is subjected to post-harvest abiotic stress.
  • the abiotic stress selected is shear stress (grated) because it is a typical operation in the processing of plant material, being scalable and economical.
  • other postharvest abiotic stresses such as UV radiation, hyperoxia, application of phytohormones, controlled and modified atmospheres, ethylene gasification (C 2 H 4 ) for maturation, variation in storage temperature and drying can be used in conjunction with stress cutting to further stimulate tissue response.
  • Grating has as its primary objective the induction of cutting stress by activating the primary metabolism of the plant, from which the carbon sources necessary for the biosynthesis of bioactive compounds are synthesized.
  • grating of the plant tissue in a size from 2mm to 17mm in diameter is performed. Said diameter coincides with the average diameter in the commercial grater.
  • this stage is easily scalable at the industrial level since there are commercial graters that can generate grated vegetables from 2 to 17 mm in diameter.
  • the grated carrot in stage a) is incubated under conditions conducive to the overproduction and accumulation of the compounds of interest.
  • the conditions of temperature and incubation time conducive to increasing the concentration of phenolic compounds are known in the state of the art [Jacobo-Velázquez, DA; Mart ⁇ nez-Hernández, GB; Rodr ⁇ guez, S .; Cao, C.-M .; Cisneros-Zevallos, L. Plants as biofactories: Physiological role of reactive oxygen species on the accumulation of phenolic antioxidants in carrot tissue under wounding and hyperoxia stress. J. Agrie. Food Chem.
  • the incubation temperature range is from 22 to 28 ° C, between 12 to 36 hours of storage, with a wide pressure range (10, 132 - 1,013, 250 Pa) with the use of atmospheric pressure ( ⁇ 101,325 Pa) being preferred for practicality, with a relative humidity of 50 to 80%, in the presence or absence of light.
  • Other parameters of the incubation process include, but are not limited to, the atmospheric composition to which the tissue is exposed (particularly when cutting stresses and modified atmospheres are used together), and the nature and intensity of light / radiation to which the tissue indexed in the fruit and vegetable crop is exposed.
  • nutraceutical grating which presents distinctive and unique characteristics that give it commercial value as it is an excellent raw material for the extraction of nutraceutical compounds with applications in the food and food supplement industry as an additive for the production of processed foods derived from fruits and vegetables (soups, sauces, among others).
  • a stage can be included: - Drying of nutraceutical scratches.
  • This stage is carried out to eliminate excessive water, which helps preserve nutraceutical scratches by inhibiting the proliferation of microorganisms and hindering their rot. Water is removed by evaporation to obtain dehydrated nutraceutical scratches.
  • Various industrial equipment can be used for drying nutraceutical scratches the tunnel oven being preferred by natural or forced convection or the tray oven by natural or forced convection.
  • the first allows continuous flows, processing is relatively fast (particularly if the convection is forced), and significant amounts of matter can be processed, preferred residence time between 1 and 60 minutes, moisture differential between the input tissue and the output of 70% to 2%, inlet air temperature preferably not exceeding 120 ° C, inlet air humidity between 0% to 50% humidity and an air flow of 0.05 to 300 m 3 of air / min. To accelerate this stage it is preferred to use the equipment by forced convection.
  • dehydrated nutraceutical grating whose main industrial application is as raw material for the extraction of nutraceutical compounds as food supplement additives as well as a snack for direct human consumption and dehydrated food as an additive for the production of derived processed foods of fruits and vegetables (soups, sauces, to name a few).
  • stage c a stage of:
  • nutraceutical grated ground In this stage the dehydrated nutraceutical scratches are pulverized until they are reduced to very small particles to achieve a uniform dispersion of the solid material thus obtaining a nutraceutical powder.
  • the size reduction is carried out by dividing or fractioning the sample by mechanical means to the desired size.
  • the most commonly used reduction methods in grinding machines are compression, impact, shearing and cutting, where intermediate and fine mills (hammer mill and vertical roller mill) are preferred.
  • the latter is made up of two or more parallel steel rollers between, rotating concentrically and driving nutraceutical scratches. dehydrated to go through the space between them.
  • nutraceutical powder is obtained whose commercial value lies in being an excellent raw material for the extraction of nutraceutical compounds with applications in the food supplement industry as well as additive with applications in the meat products industry and in the of processed vegetables.
  • grated and stressed plant tissue can be subjected to a stage of: - Application of glyphosate in the stressed fruit and vegetable crop. At this stage, the grated and stressed plant tissue is treated with a glyphosate solution by the submerged or sprinkled method.
  • the application is preferred by sprinkling, because it generates higher yields.
  • So grated carrots are treated with a solution of glyphosate (0 - 482 g / L) using one of two different methods of application (submerged and sprinkled), the sprinkling method being preferred for its best yields and stored for 24 h to determine the combined effect of cutting stress and glyphosate application on the accumulation of AS and CF.
  • the scratches are submerged in a 1: 2 to 1: 4 ratio (kg of plant material: liters of glyphosate solution), so that said material is completely submerged in the glyphosate solution. They are subsequently drained for approximately 10-30 min.
  • a second method of application submerged
  • the scratches are submerged in a 1: 2 to 1: 4 ratio (kg of plant material: liters of glyphosate solution), so that said material is completely submerged in the glyphosate solution. They are subsequently drained for approximately 10-30 min.
  • glyphosate solutions to be applied be prepared as safely as possible so as not to favor the development of microorganisms.
  • plant materials are susceptible to contamination with pathogens responsible for causing diseases, especially during the incubation stage of the stressed fruit and vegetable crop, generating different metabolic responses to the production of the bioactive compounds of interest. So these glyphosate solutions must be prepared with double distilled water (H 2 0 bb) with a pH between 6 - 7.
  • a stage can be included: - Drying of the glyphosated zest that is performed as described above in step c) of drying of nutraceutical zest, only in this case this stage is carried out on glyphosated zest.
  • a product called dehydrated glyphosated zest is obtained whose main industrial application is to be a raw material for the extraction of nutraceutical (phenolic) compounds with applications in the food supplement and shikimic acid industry with application in the pharmaceutical industry for Tamiflu production.
  • step d a product called glyphosate powder is obtained, whose main industrial application lies in being, like dehydrated glyphosated grates, a raw material for the extraction of nutraceutical (phenolic) compounds with applications in the food supplement and shikimic acid industry with Application in the pharmaceutical industry for the production of Tamiflu®.
  • the plant material used in this example consisted of Carrots (Daucus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a ratio 1: 3 kg of plant material: Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a) to promote the production and accumulation of AS and CF.
  • the plant material used in this example consisted of Carrots (Daucus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a ratio 1: 3 kg of plant material ⁇ Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a) to promote the production and accumulation of AS and CF.
  • This stage was carried out by placing the nutraceutical scratches in a tunnel oven by forced convection with a residence time of 60 ⁇ 2 minutes inlet air temperature at 80 ° C ⁇ 5, inlet air humidity between 15 ⁇ 5% of humidity and an air flow of 200 m 3 of air / min.
  • the concentration of AS increased during the first hours of storage, observing the maximum concentration at 24 h.
  • the concentration of AS in grated carrot stored for 24 h increased -45% with respect to grated carrot before storage (0 h).
  • the concentration of AS in dehydrated nutraceutical grates stored for 24 h increased -40% compared to grated carrots before storage (0 h).
  • the plant material used in this example consisted of Carrots (Daucus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a ratio 1: 3 kg of plant material rLiters of chlorinated water, for 10 min.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a) to promote the production and accumulation of AS.
  • stage a 300 grams of stressed carrot zest obtained in stage a) were placed in open plastic containers with a capacity of 5.7 L (Sterilite, Townsend, USA) and incubated for 48 hours in an incubator (VWR, Radnor, USA) ) at 25 ° C at atmospheric pressure with a relative humidity of 65% in total darkness and samples were collected every 24 h to confirm the time in which the maximum accumulation of AS existed.
  • Stage c) Drying of the nutraceutical scratches obtained in b) to produce dehydrated nutraceutical scratches.
  • This stage was carried out by placing the nutraceutical scratches in a tunnel oven by forced convection with a residence time of 60 ⁇ 2 minutes inlet air temperature at 80 ° C ⁇ 5, inlet air humidity between 15 ⁇ 5% of humidity and an air flow of 200 m 3 of air / min.
  • the dehydrated nutraceutical scratches are pulverized in a vertical roller mill consisting preferably of two parallel steel rollers and rotating concentric, driving the dehydrated nutraceutical scratches to pass through the space between them with a residence time of 3 min ⁇ 1 and a particle size of 0.20 mm ⁇ 0.05.
  • the concentration of AS increased during the first hours of storage, observing the maximum concentration at 24 h.
  • the concentration of AS in grated carrot stored for 24 h increased ⁇ 48% compared to grated carrot before storage (0 h).
  • the concentration of AS in the nutraceutical powder stored for 24 h increased -37% with respect to the grated carrot before storage (0 h).
  • the plant material used in this example consisted of Carrots ⁇ Daucus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a ratio 1: 3 kg of plant material: Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • Stage a) Submit carrots to post-harvest abiotic stress.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • the grated and stressed plant tissue is treated with a concentrated solution of glyphosate (482 g / L) using two different application methods (submerged and sprinkled).
  • 300 grams of stressed carrot zest obtained in stage a) were placed in open plastic containers with a capacity of 5.7 L (Sterilite, Townsend, E.U.A).
  • the scratches were immersed for 2 min in 500 mL of the glyphosate solution and subsequently drained for 10 min.
  • the second application method 100 mL of the glyphosate solution was sprayed to the grated carrot using a commercial sprinkler.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a ') to promote overproduction and accumulation of AS Finally, the treated scratches were incubated for 24 h at 25 ° C at atmospheric pressure with a relative humidity of 65% in total darkness to determine the combined effect of glyphosate cutting and application stress on the accumulation of AS.
  • EXAMPLE 5 Effect of glyphosate concentration (at a concentration equal to or less than 482 g / L) sprinkled on the overproduction and accumulation of AS and CF in grated fruit and vegetable cultivation after 24 h of storage.
  • the plant material used in this example consisted of Carrots (Da cus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a 1: 3 kg ratio of plant material: Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • Stage a) Submit carrots to post-harvest abiotic stress.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • the grated and stressed plant tissue is treated by spraying with a commercial sprinkler, 100 mL of a glyphosate solution at different concentrations.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a ') to promote overproduction and accumulation of AS. Finally the treated scratches were incubated for 24 h at 25 ° C at atmospheric pressure with a relative humidity of 65% in total darkness to determine the combined effect of glyphosate shear stress and application at different concentrations in the accumulation of AS and CF
  • Figure 4a, 4b and 4c and Table 3 show the identification of the accumulated compounds (AS and various CF) as part of the process of cutting stress and application of glyphosate in carrot tissue, while Table 4 shows the quantification of said compounds when different concentrations of glyphosate were used.
  • shikimic acid AS
  • protocatechic acid AP
  • derivative of gallic acid DAG
  • chlorogenic acid AC
  • 3,5-dicafeoilquinic acid 3,5-diCQA
  • derivative A of p-cumaric acid DAApC
  • 4,5-dicafeoylquinic acid 4,5- diCQA
  • p-cumaric acid ApC
  • ferulic acid AF
  • derivative B of p-cumaric acid DBApC
  • IC isocoumarin
  • shikimic acid AS
  • protocatechic acid AP
  • derivative of gallic acid DAG
  • chlorogenic acid AC
  • 3, f-dicafeoilquinic acid 3,5-diCQA
  • derivative A of p-cumaric acid DAApC
  • 4,5-dicafeoylquinic acid 4,5- diCQA
  • p-cumaric acid ApC
  • ferulic acid AF
  • derivative B of p-cumaric acid DBApC
  • DAF derivative B of p-cumaric acid
  • DBApC derived from ferulic acid
  • IC isocoumarin
  • CFs 3,5-dicafeoylquinic acid (3,5-diCQA), 4,5-dicafeoylquinic acid (4,5-diCQA), and a ferulic acid derivative (DAF) were identified only in the samples treated with glyphosate.
  • Cutting stress induced the accumulation of protocatechic acid (AP), AC, p-cumaric acid (ApC), derivative A of ApC (DAApC), derivative B of ApC (DBApC), ferulic acid (AF) and isocumarin (IC) .
  • AP protocatechic acid
  • ApC derivative A of ApC
  • DBApC derivative B of ApC
  • AF ferulic acid
  • IC isocumarin
  • the CF that showed the highest percentage increase in its concentration was D AApC, followed by DBApC, IC, ApC, AF, and AP.
  • the application of glyphosate in carrot stressed by cutting induced the accumulation of some hydroxycinnamic acids (AC, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA, DBApC, and DAF) at 24 hours of storage when compared with samples in which glyphosate is not applied, while the concentration of AP remains constant.
  • the CF that showed the greatest increase is its concentration due to the application of glyphosate in grated carrots was AC.
  • the application of glyphosate induced the synthesis and accumulation of 3,5-diCQA and 4,5-diCQA, while in treatments where only shear stress was used these compounds were not detected.
  • EXAMPLE 6 Overproduction and accumulation of bioactive compounds through the application of abiotic stress and glyphosate in carrot tissue.
  • the plant material used in this example consisted of Carrots (Daucus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a ratio 1: 3 kg of plant material: Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • Stage a) Submit carrots to post-harvest abiotic stress.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a ') to promote overproduction and accumulation of AS.
  • EXAMPLE 7 Effect of drying on the overproduction and accumulation of bioactive compounds through the application of abiotic stress and glyphosate in carrot tissue.
  • the plant material used in this example consisted of Carrots (Da cus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a 1: 3 kg ratio of plant material: Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • Stage a) Submit carrots to post-harvest abiotic stress. This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater. The grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a ') to promote overproduction and accumulation of AS.
  • the treated scratches were incubated for 24 h at 25 ° C at atmospheric pressure with a relative humidity of 65% in total darkness to determine the combined effect of glyphosate shear stress and application on the accumulation of AS and CF.
  • This stage was carried out by placing the glyphosated scratches in a tunnel oven by forced convection with a residence time of 60 ⁇ 2 minutes inlet air temperature at 80 ° C ⁇ 5, inlet air humidity between 15 ⁇ 5% of humidity and an air flow of 200 m 3 of air / min.
  • the maximum accumulation of AS was obtained when the grated carrot was sprinkled with a solution of 482 g / L of glyphosate. Under these conditions the concentration of AS increased by -1766% at 24 h of storage compared to control samples (0 h). The concentration of AS increased by ⁇ 1550% in dehydrated glyphosated grates stored for 24 h compared to grated carrots before storage (0 h). The CF that showed the greatest increase is its concentration due to the application of glyphosate in grated carrots was chlorogenic acid (AC). The content of CA in the treatment where the solution of 482 g / L of glyphosate was used had an increase of ⁇ 1930% when compared to the control samples at 24 h. AC concentration increased -1700% in dehydrated glyphosated zest stored for 24 hours compared to grated carrots before storage (0 h).
  • EXAMPLE 8 Effect of grinding on the overproduction and accumulation of bioactive compounds through the application of abiotic stress and glyphosate in carrot tissue.
  • the plant material used in this example consisted of Carrots ⁇ Daucus carota) that were obtained from a local supermarket (Monterrey, NL, Mexico), washed and disinfected with chlorinated water at a concentration of 200 ppm, pH 6.5, in a ratio 1: 3 kg of plant material: Liters of chlorinated water, for 10 min.
  • Stage a) Submit carrots to post-harvest abiotic stress.
  • This stage was carried out by grating the carrot with a commercial vegetable grater.
  • the grated carrot zest was obtained with a diameter of 0.7 cm.
  • the grated and stressed plant tissue is treated by spraying (commercial sprinkler) 100 mL of a concentrated solution of glyphosate (482 g / L).
  • Stage b) Incubate grated and stressed carrots in a ') to promote overproduction and accumulation of AS.
  • the treated scratches were incubated for 24 h at 25 ° C at atmospheric pressure with a relative humidity of 65% in total darkness to determine the combined effect of glyphosate shear stress and application on the accumulation of AS and CF.
  • the dehydrated glyphosated zest is sprayed in a vertical roller mill consisting preferably of two steel rollers parallel to each other and rotating concentrically driving the dehydrated nutraceutical scratches to pass through the space between them with a residence time of 3 min ⁇ 1 and a particle size of 0.20 mm ⁇ 0.05.
  • the maximum accumulation of AS was obtained when the grated carrot was sprinkled with a solution of 482 g / L of glyphosate. Under these conditions the concentration of AS increased by -1720% at 24 h of storage compared to control samples (0 h). The concentration of AS increased by ⁇ 1470% in glyphosated powder stored for 24 h compared to grated carrots before storage (0 h).
  • the CF that showed the greatest increase is its concentration due to the application of glyphosate in grated carrots was chlorogenic acid (AC).
  • the content of CA in the treatment where the 482 g / L glyphosate solution was used had an increase of ⁇ 1940% when compared to the control samples at 24 h.
  • the concentration of AC increased ⁇ 1 1620% in dehydrated glyphosated grates stored for 24 h compared to grated carrots before storage (0 h). This demonstrates that overproduction of AS and CF is possible from carrot tissue stressed by cutting, glyphosate, subsequently subjected to a drying process and finally ground.
  • the AS was extracted from the fruit and vegetable crop using two different procedures, based on the detection and quantification method to be used (spectrophotometric or chromatographic). For spectrophotometric analysis of AS, this was extracted using the method reported by Zelaya, IA; Anderson, JA; Owen, MD; Austin, RD Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: models in glyphosate-resistant and susceptible crops. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 2202-2212, with some modifications. Carrot tissue (0.2 g) was homogenized with 0.25 N HC1 (4 mL). Homogenization was performed with a commercial blade homogenizer (Advanced Homogenizing System, VWR, Radnor, USA).
  • AS extracts were analyzed following a method reported by Zelaya, IA; Anderson, JA; Owen, MD; Austin, RD Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: models in glyphosate-resistant and susceptible crops. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 2202-2212.
  • the extracts of AS 250 LL were mixed with an aqueous solution of periodate (0.5% w / v) and sodium m-periodate (0.5% w / v) (250 ⁇ ). The mixtures were vortexed and incubated in the dark in a controlled temperature water bath (37 ° C) for 45 min.
  • ELEMENT 11 Identification and quantification of shikimic acid (AS) and individual phenolic compounds (CF) by HPLC-PDA.
  • the methanolic extracts were analyzed by high performance liquid chromatography coupled to a photodiode array detector (HPLC-PDA).
  • HPLC-PDA photodiode array detector
  • the system consisted of two binary pumps, a self-sampler and photodiode array detector (Waters Corp, Mildford, MA, USA).
  • the AS and the CFs were separated in a reverse phase column Cl 8, 4.6 mm X 250 mm, and 5 ⁇ ⁇ ⁇ in particle diameter (Luna, Phenomenex, Torrance, CA, USA).
  • the mobile phases were water (phase A) and a mixture of methanol: water (60:40, phase B) adjusted to a pH of 2.4 with orthophosphoric acid.
  • the gradient of the mobile phases was 0/100, 3/70, 8/50, 35/30, 40/20, 45/0, 50/0, and 60/100 (min /% phase A) at a volumetric flow constant of 1 mL / min.
  • Data were processed using the Millennium V3.1 program (Waters Corp, Mildford, MA, USA).
  • AS and CF were based on three procedures: a) comparison of retention time and UV-visible spectral characteristics of each peak against commercial standards, b) analysis of UV-visible spectral characteristics and comparison with previous reports, and c) identification by elution order based on reports in literature where chromatographic conditions similar to those used in the present study have been used.
  • Standard curves of various compounds including shikimic acid (AS), chlorogenic acid (AC), ferulic acid (AF), p-cumaric acid (ApC), protocatecholic acid (AP) and gallic acid (AG) were prepared in a range 0.5 - 100 ⁇ 100 concentration. The concentration of each was expressed in mg of each particular compound per kg of carrot BS.

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Abstract

La presente solicitud de patente provee un proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas en la aplicación conjunta de estreses abióticos poscosecha y glifosato sobre cultivo hortofrutícola para la producción de compuestos bioactivos de amplio interés y valor comercial. Se utilizó como modelo de cultivo hortofrutícola zanahoria (Daucus carota). El proceso o permite la producción y acumulación de ácido shikímico (AS) y una gran variedad de compuestos fenólicos (CF) en el cultivo hortofrutícola tratado. La concentración de AS y otros compuestos sobreproducidos y acumulados como resultado de la aplicación de la presente tecnología incrementó en más de un 1000% respecto a la concentración en cultivo hortofrutícola no tratado. El cultivo hortofrutícola estresado puede ser posteriormente procesado para extraer y purificar los compuestos bioactivos de interés.

Description

PROCESO PARA LA SOBREPRODUCCIÓN DE ÁCIDO SHIKÍMICO Y COMPUESTOS FENÓLICOS EN CULTIVOS HORTOFRUTÍCOLAS
DESCRIPCIÓN
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con el desarrollo de un proceso para la sobreproducción de compuestos bioactivos tales como ácido shikímico (AS) y compuestos fenólicos (CF) en cultivos hortofrutícolas, mediante la aplicación de estreses abióticos poscosecha. ANTECEDENTES
En años recientes, la incidencia de enfermedades crónico-degenerativas y pandemias en la población general se ha incrementado significativamente. Como resultado, existe un creciente interés por todas aquellas áreas (identificación, producción, recuperación, etc.) relacionadas al estudio de compuestos bioactivos con aplicación farmacéutica y/o nutracéutica. El uso de plantas para la producción de compuestos quimiopreventivos de alto valor comercial ha sido una de las estrategias más explotadas. La ingeniería genética y metabólica han sido utilizadas para generar cultivos sobreproductores de compuestos con aplicación farmacéutica y nutracéutica. Numerosos cultivos, junto con otros sistemas de expresión tanto eucariotas [Ye, X.; Al-Babili, S.; Kloti, A.; Zhang, J.; Lucca, P.; Beyer, P.; Potrykus I. Engineering the provitamin A (beta41 1 carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science. 2000, 287, 303-305] [Niggeweg, R.; Michael, A.J.; Martin, C. Engineering plañís with increased levéis of the antioxidant chlorogenic acid. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 746-754. 351] como procariotas [Johansson, L.; Lindskog, A.; Silfversparre, G.; Cimander, C; Nielsen, K.F.; Lidén, G. Shikimic acid production by a modified strain of E-coli (W3110.shikl) under phosphate-limited and carbon-limited conditions. Biotechnol. Bioen. 2005, 92, 541-552] [Diretto, G.; Al-Babili, S.; Tavazza, R.; Papacchioli, V.; Beyer, P.; Giuliano, G. Metabolic engineering of potato carotenoid contení through tuber- specifíc over expression of a bacterial mini-pathway. PLoS ONE. 2007, 2, e350] han sido genéticamente modificados para favorecer la producción y acumulación de metabolitos de interés comercial. Sin embargo, la ingeniería metabólica es técnicamente compleja y el cultivo a escala comercial de líneas vegetales transgénicas resulta en muchas ocasiones cuestionado por los potenciales riesgos al ambiente y a la salud humana [Colwell, R.K.; Norse, E.A.; Pimentel, D.; Sharples, F.E.; Simberloff, D. Genetic engineering in agriculture. Science. 1985, 229, 1 1 1-1 12]. Es por esto que los productos genéticamente modificados han generado un enorme debate público concerniente a su estado legal, posicionamiento en el medio ambiente, aceptación social y cuestiones éticas. La percepción general de la población en cuanto al uso de estas líneas vegetales transgénicas se encuentra cargada de una desaprobación tajante debido a que la introducción de genes foráneos a la planta pueda ocasionar la producción de sustancias nocivas a la salud humana, afectando así el medio ambiente circundante mediante variaciones de las mismas especies y perdida de la gran diversidad genética [Kariyawasam, K. Legal liability, intellectual property and genetically modified crops: their impact on world agriculture. Pac. Rim L. & Policy J. 2010, 19, 459-485]. La aplicación de estreses abióticos poscosecha (corte, uso de atmosferas controladas y modificadas, gasificación de etileno (C2H4) para maduración, variación en la temperatura de almacenado y desecación, etc.), es una tecnología práctica y eficiente que permite la acumulación de metabolitos antioxidantes en el cultivo hortofrutícola [Cisneros-Zevallos, L. The use of controlled postharvest abiotic stresses as a tool for enhancing the nutraceutical contení and adding valué of fresh fruits and vegetables. J Food Sci. 2003, 68, 1560-1565] [Toivonen, P.M.A.; Hodges, D.M.; Abiotic stress in harvested fruits and vegetables. In: Abiotic stress in plañís - mechanisms and adaptations. Shanker, A.; Venkateswarlu, B. (Eds.), 2011, 39-58]. Por ejemplo, en zanahorias tratadas con estrés de corte solo [Surjadinata, B. B.; Cisneros-Zevallos, L. Biosynthesis of phenolic antioxidants in carrot tissue increases with wounding intensity. Food Chem. 2012, 134, 615-624] o en combinación con otros estreses abióticos como la radiación ultravioleta UV [Surjadinata, B. B. Wounding and Ultraviolet Radiation Stresses Affect the Phenolic Profile and Antioxidant Capacity of Carrot Tissue. Ph.D. dissertation, Texas A&M University, College Station, TX, 2006], hiperoxia [Jacobo-Velázquez, D. A.; Martínez-Hernández, G. B.; Rodríguez, S.; Cao, C.-M.; Cisneros-Zevallos, L. Plants as biofactories: Physiological role of reactive oxygen species on the accumulation of phenolic antioxidants in carrot tissue under wounding and hyperoxia stress. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 6583-6593], aplicación de fitohormonas [Heredia, j. B.; Cisneros- Zevallos, L. The effect of exogenous ethylene and methyl jasmonate on pal activity, phenolic profiles and antioxidant capacity of carrots {Daucus carota) under different wounding intensities. Postharvest Biol. Technol. 2009, 57, 242-249] [Heredia, J. B.; Cisneros-Zevallos, L. The effect of exogenous ethylene and methyl jasmonate on the accumulation of phenolic antioxidants in selected whole and wounded fresh produce. Food Chem. 2009, 115, 1500-1508], y aplicación de inhibidores enzimáticos como herbicidas [Becerra-Moreno, A.; Benavides, J.; Cisneros-Zevallos, L.; Jacobo- Velázquez, D. A. Plants as biofactories: glyphosate-induced production of Shikimic acid and phenolic antioxidants in wounded carrot tissue J. Agrie. Food Chem. 2012, 60, 1 1378-1 1386] se promueve la producción y acumulación de altos niveles de ácidos cafeilquínicos. Los ácidos cafeoilquínicos son compuestos fenólicos (CF) con gran potencial para la prevención y tratamiento de diferentes enfermedades degenerativas tales como VIH [Robinson, W. E., Jr.; Cordeiro, M.; Abdel-Malek, S.; Jia, Q.; Chow, S. A.; Reinecke, M. G.; Mitchell, W. M. Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodefícieney virus integrase: inhibition of the core catalytic domain of human immunodeficieney virus integrase. Mol. Pharmacol. 1996, 50, 845-855] [Zhu, K.; Cordeiro, M. L.; Atienza, J.; Robinson, W. E., Jr.; Chow, S. A. Irreversible inhibition of human immunodeficieney virus type 1 integrase by dicaffeoylquinic acids. J. Virol. 1999, 73, 3309-3316], Alzheimer [Kim, S.-S.; Park, R.-Y.; Jeon, H.-J.; Kwon, Y.-S.; Chun, W. Neuroprotective effect of 3,5-dicaffeoylquinic acid on hydrogen peroxide-induced cell death in SH-SY5Y cells. Phytother. Res. 2005, 19, 243-245], obesidad [Thom, E. The effect of chlorogenic acid enriched coffee on glucose absorption in healthy volunteers and its effect on body mass when used long-term in overweight and obese people. J. Int. Med Res. 2007, 35, 900-908] y hepatitis B [Wang, G.-F.; Shi, L.-P.; Ren, Y.-D.; Liu, Q.- F.; Liu, H.-.F.; Zhang, R.-J.; Li, Z.; Zhu, F.-H.; He, P.-L.; Tang, W.; Tao, P.-Z.; Li, C; Zhao, W.-M.; Zuo, J.-P. Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid, quinic acid and caffeic acid in vitro and in vivo. Antivir. Res. 2009, 83, 186-190]. En lechuga y zanahoria se ha reportado la acumulación de compuestos fenólicos tras la aplicación de etileno [Ke, D.; Saltveit M. Plant hormone interaction and phenolic metabolism in the regulation of russet spotting in iceberg lettuce. Plant. Physiol. 1988, 88, 1 136-1 140] [Lafuente, T.; Lopez-Galvez, G.; Cantwell, M.; Fa Yang, S. Factors influencing etylene-induced isocoumarin formation and increased respiration in carrots. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 1996, 121, 537-542]. También se ha reportado que la aplicación de luz-UVB así como de luz producida por tubos fluorescentes en papas [Percival, G.; Baird, L. Influence of storage upon light-induced chlorogenic acid accumulation in potato tubers {Solanum tuberosum L.) J Agrie. Food Chem. 2000, 48, 2476-2482], coles [Craker, L.; Wetherbee, P. Ethylene, light and anthocyanin synthesis. Plant Physiol. 1973, 51, 436-438] y manzanas [ eay, P. The role of low temperatures in the development of the red blush on apple fruit (Granny Smith). Sci. Hortic. 1999, 79, 1 13- 1 19] induce la acumulación de ácido clorogénico, antocianinas y quercetina respectivamente.
La biosíntesis de metabolitos secundarios inducida por la aplicación de diversos estreses abióticos poscosecha en frutas y vegetales ha sido estudiada en años recientes. Sin embargo, el efecto del estrés de corte en la acumulación de metabolitos primarios no ha sido completamente caracterizado. El estrés de corte activa rutas metabólicas relacionadas con la síntesis de metabolitos [Dyer, W. E.; Henstrand, J. M.; Handa, A. K.; Herrmann, K. M. Wounding induces the first enzyme of the shikimate pathway in Solanaceae. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 7370-7373] [Sharma, R.; Jain, M.; Bhatnagar, R. K.; Bhalla-Sarin, N. Differential expression of DAHP synthase and chorismate muíase in various organs of Brassica júncea and the effect of external factors on enzyme activity. Physiol. Plant. 1999, 105, 739-745] [Jacobo-Velázquez, D. A.; Cisneros-Zevallos, L.
An alternative use of horticultural crops: stressed plants as biofactories of bioactive phenolic compounds. Agriculture. 2012, 2, 259-271]. Un metabolito primario que se acumula en plantas como respuesta al estrés de corte es el ácido shikímico (AS) [Becerra-Moreno, A.; Benavides, J.; Cisneros-Zevallos, L.; Jacobo-Velázquez, D. Plants as biofactories: glyphosate-induced production of Shikimic acid and phenolic antioxidants in wounded carrot tissue J. Agrie. Food Chem. 2012, 60, 1 1378-11386]. Este compuesto tiene un alto valor en la industria farmacéutica ya que es utilizado en la producción de Oseltamivir (Tamiflu ®). Dicho producto es utilizado como primera línea de defensa en el tratamiento contra la influenza [Fariña, V.; Brown, J. D. Tamiflu: the supply problem. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 7330-7334]. Las principales fuentes naturales de AS son plantas del género Illicium, como el anís estrella chino [Bochkov, D. V.; Sysolyatin, S. V.; Kalashnikov, A. I.; Surmacheva, I. A. Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources. J. Chem. Biol. 2012, 5, 5-17] y a pesar de que existen otros métodos de producción y extracción de AS utilizando microrganismos, ninguno de ellos es tan rentable como el anís estrellado hasta el momento. Esta variedad de anís sólo se da en 4 provincias de China que poseen las condiciones necesarias para su crecimiento y sólo puede ser cosechado una vez al año, alrededor del mes de Mayo, [Payne, R.; Edmonds, M. Isolation of shikimic acid from star aniseed. J. Chem. Educ. 2005, 82, 599-600] [von Itzstein M. The war against influenza: discovery and developments on sialidase inhibitors. Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 967-974] cualquier intento de producir esta planta en otras condiciones ha resultado en un menor rendimiento de AS. Además, debido a que el anís estrella es un producto de consumo humano en China, el gobierno de dicho país regula la cantidad que se puede exportar y la limita a cierto porcentaje de la producción total. De manera que ante las latentes pandemias de influenza, la oferta de las fuentes naturales ricas en AS es insuficiente para suplir la demanda mundial de este compuesto [Fariña, V.; Brown, J. D. Tamiflu: the supply problem. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 7330-7334]. Por lo tanto, es necesario explorar fuentes adicionales de AS.
A pesar de que la aplicación de estrés de corte activa rutas metabólicas relacionadas con la síntesis de AS en plantas, es de esperarse que el tejido acumule una baja concentración de este metabolito ya que es utilizado en reacciones metabólicas subsiguientes para la producción de aminoácidos aromáticos necesarios para la biosíntesis de metabolitos secundarios [Davis, B. D. Aromatic biosynthesis. I. The role of shikimic acid. J. Biol. Chem. 1951, 191, 315-325]. Por lo tanto, resulta interesante desarrollar una estrategia para reducir la velocidad de utilización de AS por efecto del estrés de corte, permitiendo de esta manera su acumulación en el cultivo hortofrutícola. Como parte del presente trabajo de investigación se conceptualizó el uso de glifosato (N- fosfonometilglicina) en combinación con estrés abiótico (particularmente estrés de corte) para inducir la producción y acumulación de AS. El glifosato, al ser aplicado en plantas, inhibe la biosíntesis de aminoácidos aromáticos bloqueando la acción de la enzima 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) [Amrhein, N.; Deus, B.; Gehrke, P.; Steinrücken, H. C. The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate. II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant Physiol. 1980, 66, 830-834]. El ácido shikímico 3-fosfato (S3F) es el sustrato de la EPSP sintasa, y cuando esta enzima es inhibida por el glifosato, el S3F no es utilizado y es rápidamente transformado en AS [Harring, T.; Streibig, J. C; Husted, S. Accumulation of shikimic acid: a technique for screening glyphosate efficacy. J Agrie. Food Chem. 1998, 46, 4406-4412]. Se han reportado protocolos para la acumulación de AS en diversos materiales vegetales utilizando glifosato. Por ejemplo Anderson (2012 US8203020) reporta un método para la acumulación de AS en alfalfa y trigo donde primeramente las plantas son crecidas en ausencia de glifosato durante un tiempo determinado para después ser tratadas con el mismo durante un segundo periodo de tiempo donde la planta incrementa sus niveles de AS. Finalmente, la planta es cosechada y está lista para un proceso posterior de recuperación y purificación del AS. [Bresnahan, G. A.; Manthey, F. A.; Howatt, K. A.; Chakraborty, M. Glyphosate applied preharvest induces shikimic acid accumulation in hard red spring wheat Triticum aestivum. J. Agrie. Food Chem. 2003, 51, 44-47] evaluaron la acumulación y distribución del AS a través de los diversos tejidos en plantas de trigo tratadas con glifosato encontrando altas concentraciones del compuesto. La máxima concentración de AS se presentó 3-7 días después del tratamiento con glifosato y posteriormente ésta decreció hasta el cosechado de la planta. [Zelaya, I. A.; Anderson, j. A.; Owen, M. D.; Landes, R. D. Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: models in glyphosate-resistant and susceptible crops. J Agrie. Food Chem. 2011, 59, 2202-2212] describen un proceso similar en plantas de maíz y soya, donde la concentración de AS se vio incrementada en la planta después de un tiempo de aplicación del herbicida. W
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La aplicación precosecha de glifosato en conjunto con el cambio en los niveles de AS en diversos materiales vegetales también ha sido utilizada como una técnica de monitoreo de cultivos resistentes y no resistentes al herbicida. Por ejemplo [Pline, W. A.; Wilcut, J. W.; Duke, S. O.; Edmisten, K. L.; Wells, R. Tolerance and accumulation of shikimic acid in response to glyphosate applications in glyphosate-resistant and nonglyphosate-resistant cotton {Gossypium hirsutum L.) J Agrie. Food Chem. 2002, 50, 506-512] proponen al aumento en los niveles de AS en respuesta a la inhibición del glifosato como un método rápido y exacto para medir el daño inducido a plantas no resistentes por acción del mismo herbicida. En sus resultados demuestran que el AS no se acumuló en hojas de algodón resistente {Gossypium hirsutum) al herbicida en respuesta a tratamientos con glifosato, pero si se incrementó significativamente en todos los tejidos del algodón no resistente. [Harring, T.; Streibig, J. C; Husted, S. Accumulation of shikimic acid: a technique for screening glyphosate efficacy. J. Agrie. Food Chem. 1998, 46, 4406-4412] determinaron que la acumulación de AS encontrada en las hojas de la planta colza (Brassica napus L. cv. Iris) estaba relacionada con la dosis de glifosato aplicada, inclusive después de 5 horas de tratamiento. Así mismo [Anderson, K. A.; Cobb, W. T.; Loper, B. R. Analytical method for determination of shikimic acid: shikimic acid proportional to glyphosate application rates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 2001, 32(17/18), 2831-2840] encontraron que el AS es directamente proporcional a tasas de aplicación del herbicida glifosato en tejido de trigo.
En la actualidad existen algunos protocolos reportados para inducir la acumulación de AS y otros compuestos de alto valor nutracéutico producidos en diversos materiales vegetales. La mayoría de dichos protocolos son complicados debido a que se desarrolla en una etapa de precosecha de la planta lo cual implica largos tiempos de espera y bajos rendimientos. Consecuentemente, el escalamiento potencial de este tipo de procedimientos agronómicos es percibido negativamente desde el punto de vista económico.
Para minimizar las desventajas atribuidas a los protocolos de acumulación de AS y CF establecidos para sistemas vegetales, se ha propuesto el uso de técnicas alternas, tales como la modificación de organismos procariotas [Fariña, V.; Brown, J. D. Tamiflu: the supply problem. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 7330-7334] y la síntesis química de los compuestos, [Fukuta, Y.; Mita, T.; Fukuda, N.; Kanai, M.; Shibasaki, M. De novo synthesis of Tamiflu via a catalytic asymmetric ring-opening of meso-aziridines with TMSN3. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6312-6313] [Yeung, Y. Y.; Hong, S. S.; Corey, E. J. A short enantioselective pathway for the synthesis of the anti-Influenza neuramidase inhibitor oseltamivir from 1,3-butadiene and acrylic acid. J Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6310-631 1] siendo esta última ineficiente y muy compleja para su escalamiento a nivel industrial. [Draths, K. M.; Knop, D. R.; Frost, J.W. Shikimic acid and quínico acid: replacing isolation from plant sources with recombinant microbial biocatalysis. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1603-1604] Frost et al (2002 US6472169 y 2003 US6613552) reportan la construcción de una cepa de E. coli con diversas modificaciones genéticas para la producción de AS. En conjunto, todas las modificaciones genéticas realizadas incrementan el flujo de metabolitos hacia AS, incrementando así su concentración. Sin embargo, debido a estas mismas modificaciones genéticas, esta cepa es incapaz de sintetizar los aminoácidos aromáticos triptófano, fenilalanina y tirosina, así como otros compuestos esenciales (ácido /7-hidroxibenzoico, ácido p-aminobenzoico, y ácido 2,3- dihidroxibenzoico). Por lo que para poder crecer esta cepa en un fermentador, el medio para fermentación debe ser suplementado con esos 6 componentes esenciales. También es importante considerar que durante esta fermentación también se producen algunos contaminantes en exceso como el ácido quínico, lo cual obliga a utilizar técnicas costosas y/o difíciles de escalar durante el proceso de recuperación y purificación [Draths, K. M.; Knop, D. R.; Frost, J.W. Shikimic acid and quínico acid: replacing isolation from plant sources with recombinant microbial biocatalysis. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1603- 1604]. Mejoras a esta misma cepa han sido reportadas, las cuales principalmente se han enfocado en mejorar el rendimiento de AS durante la fermentación [Knop, D. R.; Draths, K. M.; Chandran, S. S.; Barker, J. L.; Frost, J. W. Hydroaromatic equilibrium during biosynthesis of shikimic acid. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10173-10182] [Bongaerts, J.; Kramer, M.; Müller, U.; Raeven, L.; Wubbolts, M. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metab. Eng. 2001, 3, 289-300] [Chandran, S. S.; Yi, J.; Draths, K. M.; Von Daeniken, R.; Weber, W.; Frost, J. W. Phosphoenolpyruvate availability and the biosynthesis of shikimic acid. Biotechnol Prog. 2003, 19, 808-814] [Kramer, M.; Bongaerts, J.; Bovenberg, R.; Kremer, S.; Müller, U.; Orf, S.; Wubbolts, M.; Raeven, L. Metabolic engmeering for microbial production of shikimic acid. Metab Eng. 2003, 5, 277-283]. Se han realizado trabajos similares en otros organismos procariotas. Por ejemplo Iomantas et al (2002 US6436664) describen un método para la producción de AS utilizando cepas modificadas de Bacillus subtilis deficientes en actividad de shikimato kinasa y 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, las cuales producen y acumulan AS en el medio de cultivo. Shirai et al (2001 European Patent Application EP 1092766) reportan un proceso similar con una cepa mutante de Citrobacter freundii para producir AS a través de una fermentación. Un enfoque distinto en las fermentaciones ha sido reportado por Bogosían et al (201 1 US Patent Application US201 10020885) los cuales desarrollaron un método para producir AS, el cual incluye una fermentación de una cepa recombinante de E.coli en la cual se adiciona glifosato en el medio de cultivo como inhibidor de la EPSP sintasa. Actualmente estas fermentaciones atienden un 30% de la demanda mundial de AS [Fariña, V.; Brown, J. D. Tamiflu: the supply problem. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 7330-7334]. Sin embargo, al día de hoy los rendimientos de AS obtenido en sistemas procariotas son bajos, implicando esto la utilización de complejas etapas para la purificación del compuesto.
Si bien en algunas de los procesos antes mencionados se utiliza glifosato para inducir la acumulación de AS, en ninguna se aplica el glifosato en cultivo hortofrutícola en una etapa de poscosecha. Por lo tanto, como parte de esta investigación, se elucidó cómo el uso conjunto de estreses abióticos poscosecha y glifosato en cultivo hortofrutícola resulta ser una atractiva alternativa a la agricultura intensiva y a la ingeniería genética para la producción de compuestos bioactivos, no limitándose a AS sino abarcando de igual manera otras familias de compuestos con comprobada capacidad nutracéutica y farmacéutica. A pesar de que se ha reportado en la literatura el potencial uso de los estreses abióticos para producir metabolitos secundarios como lo son los compuestos fenólicos [Jacobo-Velázquez, D. A.; Martínez-Hernández, G. B.; Rodríguez, S.; Cao, C.-M.; Cisneros-Zevallos, L. Plants as biofactories: Physiological role of reactive oxygen species on the accumulation of phenolic antioxidants in carrot tissue under wounding and hyperoxia stress. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 6583-6593] la acumulación de AS (metabolito primario) en cultivos hortofrutícolas inducida por estreses abióticos solo ha sido marginalmente caracterizada. Así mismo, el uso de glifosato (generalmente utilizado como herbicida) como un modulador del flujo de carbono del metabolismo primario al secundario para inducir de manera selectiva la acumulación de AS y CF de interés en tejido previamente estresado ha sido recientemente estudiado y caracterizado [Becerra-Moreno, A.; Benavides, J.; Cisneros-Zevallos, L.; Jacobo-Velázquez, D. Plants as biofactories: glyphosate-induced production of Shikimic acid and phenolic antioxidants in wounded carrot tissue. J. Agrie. Food Chem. 2012, 60, 11378-11386] por nuestro grupo de investigación. Como parte del desarrollo de esta tecnología se seleccionó como modelo vegetal la zanahoria (Da c s carota), ya que es un cultivo ampliamente distribuido alrededor del mundo y de fácil manejo. La zanahoria hoy en día es una de las hortalizas más producidas a nivel mundial. En México se cultivan alrededor de -340,000 ton/año de zanahorias [FAOSTAT. 2010. FAO Statistical Databases. Agricultural Data]. Sin embargo, cuando las prácticas poscosecha no son adecuadas, los estándares de calidad se ven comprometidos, obligando a desaprovechar parte de la producción (~10% de la producción anual en México). En dicho estudio de nuestro grupo de investigación, cuya invención es presentada y descrita en este documento, se encontró que en efecto la combinación de estrés abiótico poscosecha y aplicación de glifosato tienen un efecto significativo sobre la acumulación de AS, y adicionalmente de otros compuestos nutracéuticos de gran interés comercial. El asperjado de una solución concentrada de glifosato en tejido de zanahoria estresado por corte incrementó la concentración de AS y ácido clorogénico (AC) en más de 1000 y 5000 %, respectivamente. Por lo tanto, explorar el uso alterno de estas zanahorias, consideradas un desecho, como biofactorías para la producción de fitoquímicos de alto valor farmacéutico y nutracéutico ante su creciente demanda mundial es de vital importancia para el desarrollo de tecnologías alternas en la producción de AS y CF. Si bien las zanahorias fueron utilizadas como sistema modelo vegetal para el desarrollo de esta tecnología es de esperarse que el resultado técnico que se obtendría en otro tipo de cultivo hortofrutícola sería similar, por supuesto considerando que los rendimientos y perfiles de compuestos nutracéuticos sintetizados y acumulados tendrían que ser caracterizados en lo particular. De igual manera, la aplicación de un estrés abiótico poscosecha (diferente al corte) o la combinación de varios estreses abióticos, en conjunto con glifosato puede generar un resultado técnico similar en diversos modelos vegetales. Inclusive, en el caso de la zanahoria, se determinó que la aplicación individual de estrés de corte permite obtener una concentración significativa de AS en el cultivo hortofrutícola después de 24 h de aplicación de dicho estrés. Esto no ha sido reportado por ningún autor. A pesar de esto, como ya ha sido mencionado, la concentración de dicho compuesto es mucho mayor cuando se utiliza estrés de corte se hace en conjunto con la aplicación de glifosato. BREVE DESCRIPCIÓN DE FIGURAS
Figura 1. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas.
Figura Ib. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas, incluyendo una etapa de secado. Figura le. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas, incluyendo una etapa de secado y molido. Figura Id. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas, incluyendo una etapa de aplicación de glifosato.
Figura le. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas, incluyendo una etapa de aplicación de glifosato y secado
Figura lf. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas, incluyendo una etapa de aplicación de glifosato, secado y molido.
Figura lg. Representación esquemática del proceso propuesto para la sobreproducción de compuestos bioactivos en cultivos hortofrutícolas, incluyendo una etapa de aplicación de glifosato, secado, y etapas posteriores de recuperación, purificación y pulimiento. Figura 2. Acumulación de ácido shikímico durante el almacenamiento de zanahoria rallada. Las muestras se almacenaron durante 48 h a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total. Los valores representan la media de 4 repeticiones con sus barras de error estándar. Los datos con letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas por la prueba LSD (p<0.05).
Figura 3. Efecto del método de aplicación de la solución concentrada de glifosato en la concentración de los compuestos bioactivos sobre cultivo hortofrutícola de zanahoria (sumergido y asperjado).
Figura 4. Cromatogramas del HPLC-PDA a 320 nm (A), 280 nm (B) y 215 nm (C). (a) ralladuras de zanahoria antes de su almacenamiento (0 h), (b) ralladuras de zanahoria almacenadas durante 24 horas a 25°C, (c) ralladuras de zanahoria asperjadas con glifosato y almacenadas durante 24 horas a 25°C. La identificación tentativa de los picos cromatográficos se realizó como se indican en la Tabla 2. La asignaciones de picos incluye: (1) ácido shikímico, (2) ácido protocatecuico, (3) derivado de ácido gálico, (4) ácido clorogénico, (5) ácido 3,5-dicafeoilquínico; (6) derivado A de ácido p-cumárico; (7) ácido 4,5-dicafeoilquínico; (8) ácido p-cumárico, (9) ácido ferúlico, (10) derivado B de ácido p-cumárico; (1 1) derivado de ácido ferúlico; (12) isocumarina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente solicitud de patente describe un proceso novedoso para inducir la sobreproducción y acumulación de compuestos bioactivos tales como ácido shikímico (AS) y compuestos fenólicos (CF) en plantas cuyos frutos, semillas, hojas, tallos y raíces son comestibles (cultivos hortofrutícolas), mediante la aplicación de estreses abióticos poscosecha a al menos una de las partes del cultivo hortofrutícola anteriormente mencionadas, donde dicho proceso es potenciado al utilizar en una de sus etapas la adición de glifosato.
La presente solicitud de patente comprende en proveer un proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en un cultivo hortofrutícola básicamente en 2 etapas posteriores a la cosecha del cultivo hortofrutícola. El material vegetal puede provenir de diversas industrias siendo este de fácil acceso, favoreciendo su exhaustiva manipulación tanto a nivel laboratorio como industrial. El material vegetal descartado por los diversos sectores industriales puede deberse a la presencia de algunos factores durante el crecimiento y maduración del mismo que lo pueden afectar y por lo tanto disminuir su valor comercial como materia prima para el consumo humano [Pantastico, E. B. Postharvest physiology, handling and utilization of tropical and subtropical fruits and vegetables. Avi Pub. Co. 1975] [Koda, Y.; Okazawa, Y. Influencias of environmental, hormonal and nutritional factors on potato tuberization in vitro. Jap. J. Crop Sel 1983, 52, 582-591] [Salunkhe, D. K.; Kadam, S. S. Tratado de ciencia y tecnología de las hortalizas. Producción, composición, almacenamiento y procesado. Editorial Acribia; Traducción de Orlando Pablo Vázquez Yáñez y Pilar Calo Nata. 2004]. Algunos de los factores más comunes en diversos cultivos hortofrutícolas que aminoran su calidad durante su crecimiento se presentan en la Tabla 1 tomando como ejemplos dos de los cultivos más comunes a nivel mundial, la zanahoria y la papa. Tabla 1. Factores más comunes en algunos cultivos hortofrutícolas durante su crecimiento y maduración que aminoran su calidad y valor comercial como materias primas para el consumo humano.
Cultivo hortofrutícola Factores
Zanahoria • Heridas debido a heladas y granizadas (< - 1.5 °C).
• Ausencia de color naranja brillante, textura tierna, firmeza, sabor dulce y la presencia de un centro fibroso.
• Raíces deformadas y bifurcadas.
• Presencia de corazón y hombros verdes ocasionados por exposición a la luz solar.
Papa • Heridas debido a heladas y granizadas (< - 1.5 °C).
• Baja duración del período de crecimiento.
• Enfermedades fungosas {Phythopthora infestans) y bacterianas
(Erwinia sp.)
• Insuficiente tamaño del tubérculo.
• Presencia de coloraciones internas y externas verdosas.
El proceso motivo de esta solicitud de patente da valor agregado a cultivos hortofrutícolas, de manera especial cuando estos son descartados por no cumplir con los estándares de calidad de diversos sectores industriales/comerciales. De tal forma que este proceso es aplicable a material vegetal de muy diversa naturaleza [todas aquellas plantas cuyos frutos, semillas, hojas, tallos o raíces son comestibles. Se consideran las raíces (zanahorias, rábano, entre otros), bulbos o tubérculos (papa, cebolla, ajo, por mencionar algunos), flores e inflorescencias (broccoli, coliflor, alcachofa, entre otros), frutos y semillas (manzana, pepino, berenjena, entre otros), hojas (kale, lechuga, repollo, entre otros), y legumbres (frijol, arvejas, guisantes, entre otros)] en cualquier calidad disponible (alta calidad, merma, desecho, bagazo, entre otros.)
De manera general el proceso para la sobreproducción de AS y CF en cultivos hortofrutícolas está representado en la Figura 1, y comprende las siguientes etapas: a) Someter a estrés abiótico poscosecha (100) el cultivo hortofrutícola previamente lavado y sanitizado.
En esta etapa el tejido vegetal del cultivo hortofrutícola es cortado, preferentemente rallado para obtener fragmentos del mismo, donde la ralladura del cultivo (101) activa el metabolismo primario y secundario del tejido vegetal para dirigir el flujo de carbono hacia la producción de AS y CF.
b) Incubar (200) la ralladura del tejido vegetal (101).
En esta etapa se incuba la ralladura del tejido vegetal (101) obtenida en la etapa a); la incubación se realiza bajo condiciones determinadas para propiciar la producción y acumulación de AS y CF. Denominando al producto obtenido como ralladuras nutracéuticas.
Opcionalmente, después de las etapas b) puede incluirse una etapa de secado, y esto está representado en la Figura Ib. c) Secar (300) la ralladura nutracéutica (201) obtenida en b).
Esta etapa se lleva a- cabo para realizar la eliminación del exceso de agua, lo cual ayuda a la conservación de las ralladuras nutracéuticas inhibiendo la proliferación de microorganismos y dificultando su putrefacción. El agua es eliminada mediante evaporación para obtener ralladuras nutracéuticas deshidratadas.
Adicionalmente después de la etapa c); se incluye una etapa de molido, representada en la Figura le.
d) Moler (400) la ralladura nutracéutica deshidratada (301) obtenida en la etapa c).
En esta etapa las ralladuras nutracéuticas deshidratadas son pulverizadas con un tiempo de residencia preferido entre 1 a 5 min hasta alcanzar un tamaño de partícula preferentemente de 0.05 mm hasta 0.35 mm logrando así una dispersión uniforme del material solido denominado polvo nutracéutico
Con la finalidad de proveer una sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos, se propone en esta solicitud de patente que entre las etapas a) y b) anteriormente descritas, se incluya opcionalmente una etapa de aplicación de glifosato representado en la Figura Id.
aa) Aplicar glifosato (500) a la ralladura del tejido vegetal (101) obtenida en la etapa a).En esta etapa el tejido vegetal rallado es tratado con una solución de glifosato para de esta forma obtener ralladuras estresadas (501) las cuales son posteriormente llevadas a la etapa b) previamente descrita para finalmente obtener ralladuras glifosatadas.
Opcionalmente, después de las etapas b) puede incluirse una etapa de secado como está representado en la Figura le. c) Secar (300) la ralladura glifosatada (202) obtenida en b).
Esta etapa se lleva a cabo para realizar la eliminación del agua, lo cual ayuda a la conservación de las ralladuras glifosatadas inhibiendo la proliferación de microorganismos y dificultando su putrefacción. El agua es eliminada mediante evaporación para obtener ralladuras glifosatadas deshidratadas.
Adicionalmente después de la etapa c); opcionalmente se incluye una etapa de molido representada en la Figura lf.
d) Moler (400) la ralladura glifosatada deshidratada (302) obtenida en la etapa c).
En esta etapa las ralladuras glifosatada deshidratadas son pulverizadas con un tiempo de residencia preferido entre 1 a 5 min hasta alcanzar un tamaño de partícula preferentemente de 0.05mm hasta 0.35 mm logrando así una dispersión uniforme del material solido denominado polvo glifosatado.
La ralladura glifosatada, las ralladuras glifosatadas deshidratadas y el polvo glifosatado (202, 302, 402), contienen AS y CF sin purificar da tal forma que cada uno de estos productos son sometidos de manera individual a una etapa posterior de recuperación, purificación y pulimiento (600) a fin de obtener material vegetal gastado (601), AS y CF puros (Figura lg).
Particularmente, la ralladura nutracéutica obtenida de conformidad con el proceso representado en la Figura 1, presenta las siguientes características: aspecto rugoso, deshidratación, coloración anaranjada con una ligera decoloración, ligera reducción de tamaño, diámetro mínimo de 2mm, pH 4-6, humedad 15-95%, cenizas 4-7%, grasas 0.5- 0.7%, proteínas 6.5-9.5%, carbohidratos 30-45%, vitaminas y minerales 15-25%, 100- 500 mg AS/kg base seca (ppm) y 1000-3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm de CF). El almacenamiento para la ralladura nutracéutica se recomienda en condiciones de congelación, preferentemente a 20°C bajo cero, en condiciones de oscuridad total. Su aplicación industrial es como una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y alimento como aditivo para la producción de alimentos procesados derivados de frutas y vegetales (sopas, salsas, entre otros.)
Concretamente la ralladura nutracéutica deshidratada obtenida de conformidad con el proceso descrito anteriormente y representado en la figura Ib, presenta las siguientes características: aspecto rugoso, deshidratación, coloración anaranjada, reducción de tamaño, diámetro mínimo de 2mm, pH 4-6, humedad 2-15%, actividad de agua (25°C) 0.3-0.4, cenizas 7-8.5%, grasas 0.7-0.8%, proteínas 9.5-1 1%, carbohidratos 45-50%, vitaminas y minerales 25-30%, 100-500 mg AS/kg base seca (ppm) y 1000-3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm de CF). Las condiciones de almacenamiento recomendadas para la ralladura nutracéutica son refrigeración a 20°C bajo cero, en condiciones de oscuridad total, esto antes de decidir el destino final de aplicación industrial. La aplicación industrial es como una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios así como una botana para consumo humano directo y alimento deshidratado como aditivo para la producción de alimentos procesados derivados de frutas y vegetales (sopas, salsas, entre otros.) Característicamente, el polvo nutracéutico obtenido de conformidad con el proceso descrito anteriormente y representado en la Figura le, presenta las siguientes características: coloración anaranjada, intervalo de granulometría entre 23 y 30% de retenido a un tamaño de partícula mayor a 0.29mm, entre 10 y 23% de retenido entre 0.10 y 0.29mm, y entre 5 y 10% de retenido a un tamaño de partícula menor a 0.1 Omm, pH 4- 6, humedad 2-15%, actividad de agua (25°C) 0.3-0.4, cenizas 7-8.5%, grasas 0.7-0.8%, proteínas 9.5-11%, carbohidratos 45-50%, vitaminas y minerales 25-30%, 100-500 mg AS/kg base seca (ppm) y 1000-3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm de CF). Se recomienda almacenar el polvo nutracéutico a una temperatura de 20 a 25°C en oscuridad total. Su aplicación industrial es como una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios así como aditivo con aplicaciones en la industria de los productos cárnicos y en la de los vegetales procesados.
Particularmente, ralladura glifosatada obtenida de conformidad con el proceso que incluye las etapas a), a') y b) descritas anteriormente y representadas en la Figura Id, presenta las siguientes características: aspecto rugoso, ligera deshidratación, coloración anaranjada con una ligera decoloración, reducción de tamaño, diámetro mínimo de 2mm, pH 3-7, humedad 15-95%, cenizas 0.2-6%, grasas 0.2-0.5%, proteínas 0.2-0.5%, carbohidratos 0.5-30%, vitaminas y minerales 0.3-15%, 2000-6000 mg AS/kg base seca (ppm) y 1000-3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm de CF). Su aplicación industrial es como una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos (fenólicos) con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y de ácido shikímico con aplicación en la industria farmacéutica para la producción de Tamiflu®. En el caso de la ralladura glifosatada deshidratada obtenida de conformidad con las etapas a), a'), b) y c) descritas anteriormente y representadas en la Figura le, presenta las siguientes características aspecto rugoso, deshidratación, coloración anaranjada, reducción de tamaño, diámetro mínimo de 2mm, pH 3-7, humedad 2-15%, actividad de agua (25°C) 0.3-0.4, cenizas 6-10%, grasas 0.7-0.8%, proteínas 9.5-1 1%, carbohidratos 45-50%, vitaminas y minerales 25-30%, 2000-6000 mg AS/kg base seca (ppm) y 1000- 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm de CF). Su aplicación industrial es como una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos (fenólicos) con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y de ácido shikímico con aplicación en la industria farmacéutica para la producción de Tamiflu®.
El polvo glifosatado obtenido de conformidad con las etapas a), a'), b), c) y d) descritas anteriormente, y representadas en la Figura lf, presenta las siguientes características: coloración anaranjada, intervalo de granulometría entre 23 y 30% de retenido a un tamaño de partícula mayor a 0.29mm, entre 10 y 23% de retenido entre 0.10 y 0.29mm, y entre 5 y 10% de retenido a un tamaño de partícula menor a O. lOmm, pH 3-7, humedad 2-15%, actividad de agua (25°C) 0.3-0.4, cenizas 6-10%, grasas 0.7-0.8%, proteínas 9.5-1 1%, carbohidratos 45-50%, vitaminas y minerales 25-30%, 2000-6000 mg AS/kg base seca (ppm) y 1000-3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm de CF). Su aplicación industrial es como una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos (fenólicos) con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y de ácido shikímico con aplicación en la industria farmacéutica para la producción de Tamiflu. A continuación se describe de manera detallada cada una de las etapas antes mencionadas.
- Preparación del cultivo hortofrutícola
El cultivo hortofrutícola utilizado en este ejemplo consiste en zanahoria en cualquier estadio de maduración incluyendo madurez fisiológica y comercial así como también todas aquellas que han sido descartadas para su consumo humano por presentar factores que disminuyen su calidad tales como golpes, abolladuras, o cualquier daño mecánico, las cuales deben lavarse y sanitizarse, usualmente se lleva a cabo utilizando protocolos estándar con agua clorada, aunque cualquier otro procedimiento estándar de desinfección de material vegetal es utilizable. El volumen de agua a utilizar depende de la cantidad de material vegetal del cultivo hortofrutícola. Dicha cantidad suele ir de una relación 1 :2 a 1 :4 (kg de tejido vegetal: litros de agua clorada), de manera que dicho material vegetal quede totalmente sumergido en el agua clorada. La concentración de cloro va desde 150 a 250 ppm a un pH entre 6 - 7. El tiempo de contacto del agua con el material vegetal suele ir de 5 a 30 minutos dependiendo de la cantidad de impurezas presentes en la superficie del vegetal. El lavado y la desinfección tienen como objetivo primario la eliminación de restos de tierra, abonos, bacterias e insectos de la superficie. Los materiales vegetales son susceptibles de contaminarse con patógenos responsables de causar enfermedades. De igual manera, se deben eliminar organismos para de esa manera evitar su crecimiento sobre el tejido vegetal durante la etapa de incubación. Es fundamental eliminar los organismos dado que los materiales vegetales estresados pueden generar diferentes respuestas durante el proceso de producción de los compuestos bioactivos debido a que el crecimiento de los mismos representa un estrés biótico no considerado. Adicionalmente, eliminar restos sólidos y organismos de la superficie del tejido vegetal facilita el proceso posterior de recuperación y purificación en el cual se aislan los compuestos de interés en base a su aplicación. Otras operaciones adicionales que pueden formar parte de esta etapa de preparación del tejido vegetal pueden estar orientadas a la clasificación y fraccionamiento de los diferentes tejidos (eliminación de espinas, semillas, etc.), eliminación de material sólido extraño que no pueda ser removido por efecto del proceso de lavado, así como cualquier otro tipo de operación que sea pertinente para favorecer que las etapas subsiguientes del proceso se lleven a cabo de manera adecuada, en base a la naturaleza y origen del tejido vegetal que se utilice.
Etapa ) -Someter a estrés abiótico poscosecha el tejido vegetal del cultivo hortofrutícola
Posterior a la preparación de la zanahoria esta se somete al estrés abiótico poscosecha. El estrés abiótico seleccionado es estrés de corte (rallado) por ser una operación típica en el procesado de material vegetal, siendo escalable y económico. Sin embargo, otros estreses abióticos poscosecha como radiación UV, hiperoxia, aplicación de fitohormonas, atmósferas controladas y modificadas, gasificación de etileno (C2H4) para maduración, variación en la temperatura de almacenado y desecación pueden ser utilizados en conjunto con el estrés de corte para estimular aún más la respuesta del tejido.
El rallado tiene como objetivo primario la inducción del estrés de corte activando el metabolismo primario de la planta, a partir del cual se sintetizan las fuentes de carbono necesarias para la biosíntesis de compuestos bioactivos. Para la inducción del metabolismo primario en el tejido vegetal por efecto del estrés de corte, se realiza ralladura del tejido vegetal en un tamaño desde 2mm hasta 17mm de diámetro. Dicho diámetro coincide con el diámetro promedio en el rallador comercial. Como ya se mencionó esta etapa es fácilmente escalable a nivel industrial ya que existen ralladoras comerciales que pueden generar ralladuras de vegetales desde los 2 hasta los 17 mm de diámetro. Una vez obtenidas las ralladuras, estas son colocadas en contenedores abiertos para favorecer, la respiración celular del cultivo hortofrutícola, de manera que el metabolismo aeróbico se induzca, el cual orienta el flujo de carbono hacia la producción de los compuestos bioactivos de particular interés en la presente invención. En esta etapa se obtiene un producto intermedio denominado ralladuras de zanahoria.
Etapa b) - Incubar la ralladura de zanahoria bajo condiciones propicias para la producción y acumulación de los compuestos de interés
La ralladura de la zanahoria en la etapa a) es incubada a condiciones propicias para que ocurra la sobreproducción y acumulación de los compuestos de interés. Se conoce en el estado en el arte las condiciones de temperatura y tiempo de incubado propicias para incrementar la concentración de compuestos fenol icos [Jacobo-Velázquez, D. A.; Martínez-Hernández, G. B.; Rodríguez, S.; Cao, C.-M.; Cisneros-Zevallos, L. Plants as biofactories: Physiological role of reactive oxygen species on the accumulation of phenolic antioxidants in carrot tissue under wounding and hyperoxia stress. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 6583-6593] sin embargo en esta etapa, con solo reproducir la incubación a la temperatura reportada no es suficiente, es necesario combinarlo con otros parámetros de incubación que comprenden: otro tiempo de incubación, el cual se encuentra divulgado por los mismos inventores de la presente solicitud en el periodo que marca la Ley de la 2013/000192
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Propiedad Industrial como divulgación previa [Becerra-Moreno, A.; Benavides, J.; Cisneros-Zevallos, L.; Jacobo-Velázquez, D. Plants as biofactories: glyphosate-induced production of Shikimic acid and phenolic antioxidants in wounded carrot tissue J. Agrie. Food Chem. 2012, 60, 1 1378-1 1386] de tal forma que en esta etapa el rango de temperatura de incubación es de los 22 a los 28 °C, entre 12 a 36 horas de almacenamiento, con un rango amplio de presión (10, 132 - 1,013, 250 Pa) prefiriéndose el uso de presión atmosférica (~101,325 Pa) por practicidad, con una humedad relativa de 50 a 80%, en presencia o ausencia de luz. Otros parámetros del proceso de incubación incluyen, más no se limitan a, la composición atmosférica a la que está expuesto el tejido (particularmente cuando se utiliza en conjunto los estreses de corte y atmosferas modificadas), y la naturaleza e intensidad de la luz/radiación a la que está expuesto el tejido que índice en el cultivo hortofrutícola.
Concluida esta etapa se obtiene un producto denominado ralladura nutracéutica, el cual presenta características distintivas y únicas que le dan un valor comercial al ser una excelente materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y alimento como aditivo para la producción de alimentos procesados derivados de frutas y vegetales (sopas, salsas, entre otros).
Opcionalmente, después de la etapa b) puede incluirse una etapa de: - Secado de las ralladuras nutracéuticas. Esta etapa se lleva a cabo para realizar la eliminación del agua excesiva, lo cual ayuda a la conservación de las ralladuras nutracéuticas inhibiendo la proliferación de microorganismos y dificultando su putrefacción. El agua es eliminada mediante evaporación para obtener ralladuras nutracéuticas deshidratadas. Para el secado de las ralladuras nutracéuticas pueden utilizarse diversos equipos industriales prefiriéndose el horno túnel por convección natural o forzada o el horno de bandejas por convección natural o forzada. El primero de ellos permite flujos continuos, es relativamente rápido el procesado (particularmente si la convección es forzada), y se pueden procesar cantidades significativas de materia, tiempo de residencia preferido entre 1 y 60 minutos, diferencial de humedad entre el tejido de entrada y el de salida de 70% a 2%, temperatura del aire de entrada preferentemente no sobrepasando los 120°C, humedad del aire de entrada entre 0% a 50% de humedad y un flujo de aire de 0.05 a 300 m3 de aire/min. Para acelerar esta etapa se prefiere utilizar el equipo por convección forzada. Concluida esta etapa se obtiene un producto denominado ralladura nutracéutica deshidratada cuya principal aplicación industrial radica como materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos como aditivos de suplementos alimenticios así como una botana para consumo humano directo y alimento deshidratado como aditivo para la producción de alimentos procesados derivados de frutas y vegetales (sopas, salsas, por mencionar algunos).
Adicionalmente después de la etapa c); se incluye una etapa de:
- Molido de las ralladura nutracéutica deshidratada. En esta etapa las ralladuras nutracéuticas deshidratadas son pulverizadas hasta reducirlas a partículas muy pequeñas para lograr una dispersión uniforme del material solido obteniendo así un polvo nutracéutico. La reducción de tamaño se lleva a cabo dividiendo o fraccionando la muestra por medios mecánicos hasta el tamaño deseado. Los métodos de reducción más empleados en las máquinas de molienda son compresión, impacto, frotamiento de cizalla y cortado, donde se prefieren los molinos intermedios y finos (molino de martillos y molino vertical de rodillos). Este último está constituido por dos o más rodillos de acero paralelos entre, girando concéntricos e impulsando a las ralladuras nutracéuticas deshidratadas a pasar por el espacio entre ellos. La principal fuerza ejercida es la de compresión con un tiempo de residencia preferido entre 1 a 5 min hasta alcanzar un tamaño de partícula preferentemente de 0.05mm hasta 0.35mm. Concluida esta etapa se obtiene un producto denominado polvo nutracéutico cuyo valor comercial reside en ser una excelente materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios así como aditivo con aplicaciones en la industria de los productos cárnicos y en la de los vegetales procesados.
Para potencializar la sobreexpresión de AS y CF entre las etapa a) de someter a estrés abiótico poscosecha y etapa b) de incubar, puede someterse al tejido vegetal rallado y estresado a una etapa de: - Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado. En esta etapa el tejido vegetal rallado y estresado es tratado con una solución de glifosato mediante el método de sumergido o asperjado. Prefiriéndose la aplicación por asperjado, debido a que genera mayores rendimientos.
Se determinó que el asperjado resultó en =44% mayor en la acumulación de AS con respecto a las muestras sumergidas, como se muestra en la Figura 3. Esta diferencia se atribuye a la remoción de moléculas señal, que inducen la respuesta al corte como parte del proceso de sumergido. La remoción (al menos parcial) de trifosfato de adenosina extracelular (ATPe, producido por efecto del estrés de corte) ocurre por el sumergido, pudiendo estar esto relacionado con una menor generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) y por lo tanto reduciéndose el rendimiento de AS con respecto a la aplicación por asperjado. El estrés abiótico de corte activa las rutas metabólicas involucradas en la producción de compuestos fenólicos mientras que la aplicación de glifosato permite bloquear el flujo de AS hacia la producción de otros compuestos, de esta manera se logra una acumulación de AS en el cultivo hortofrutícola. De manera que las zanahoria ralladas se tratan con una solución de glifosato (0 - 482 g/L) utilizando alguno de los dos diferentes métodos de aplicación (sumergido y asperjado), prefiriéndose el método de asperjado por sus mejores rendimientos y se almacenan por 24 h para determinar el efecto combinado del estrés de corte y aplicación de glifosato en la acumulación de AS y CF. En el primer método de aplicación (sumergido) las ralladuras se sumergen en una relación 1 :2 a 1 :4 (kg de material vegetal: litros de solución de glifosato), de manera que dicho material quede totalmente sumergido en la solución de glifosato. Posteriormente se drenan por aproximadamente 10 - 30 min. En el segundo
1 1 método de aplicación (asperjado) las ralladuras son asperjadas con una relación 1 :- a 1 : -
(kg de material vegetal: litros de solución de glifosato) utilizando un aspersor comercial. Es de particular interés para la presente invención que las soluciones de glifosato a aplicar sean preparadas con la mayor inocuidad posible para no favorecer el desarrollo de microorganismos. Como se mencionó anteriormente, los materiales vegetales son susceptibles de contaminarse con patógenos responsables de causar enfermedades, sobre todo durante la etapa de incubación del cultivo hortofrutícola estresado, generando respuestas metabólicas diferentes a la producción de los compuestos bioactivos de interés. De manera que dichas soluciones de glifosato deben ser preparadas con agua bidestilada (H20 bb) con un pH entre 6 - 7. Se ha estudiado el efecto del pH del agua en la efectividad de formulaciones comerciales del herbicida glifosato y se ha demostrado que el pH del agua utilizada (1.5 - 6) no influye en el control de malezas, con ninguna de las formulaciones comerciales, como describe Penner, D.; Michael, J. en el artículo denominado "The effect of pH on glyphosate activity and water conditioning" en ASTM Int. 2010, 7, 1 -6. Esto es de vital importancia para la presente invención, debido a que garantiza que la efectividad del glifosato (0 - 482 g/L) utilizado, se mantendrá estable utilizando agua bidestilada con un pH entre 6 - 7.
Como parte de esta investigación se demostró que para el caso particular del tejido de zanahoria es posible obtener una concentración significativa de AS sin necesidad de la aplicación de glifosato, lo cual no se ha encontrado reportado por ningún otro autor. De tal manera que la aplicación de la Etapa de Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado, puede ser opcional en caso de que el objetivo del proceso sea la obtención de AS a partir de tejido de zanahoria. Esto permite la reducción de costos del proceso al eliminar una etapa y evitar el uso de reactivos (glifosato). Sin embargo, el rendimiento de AS por masa de cultivo hortofrutícola es inferior comparando cuando el glifosato es aplicado, ver la Figura 3, donde se muestra la concentración de ácido shikímico en muestras control, es decir sin aplicación de glifosato, y con aplicación de glifosato asperjado o sumergido. Opcionalmente, después de las etapas de la secuencia de etapas a), a') y b); puede incluirse una etapa de: - Secado de las ralladuras glifosatadas que se realiza como se describió anteriormente en la etapa c) de secado de ralladura nutracéutica, solo que en este caso esta etapa se realiza sobre ralladura glifosatada. Concluida esta etapa se obtiene un producto denominado ralladura glifosatada deshidratada cuya principal aplicación industrial radica en ser una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos (fenólicos) con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y de ácido shikímico con aplicación en la industria farmacéutica para la producción de Tamiflu. Adicionalmente después de la secuencia de etapas a), a') b) y c); opcionalmente se incluye una etapa de: - Molido de las ralladura glifosatadas deshidratada que se realiza tal y como se describió anteriormente en la etapa d). Concluida esta etapa se obtiene un producto denominado polvo glifosatado cuya principal aplicación industrial radica en ser al igual que las ralladuras glifosatadas deshidratadas una materia prima para la extracción de compuestos nutracéuticos (fenólicos) con aplicaciones en la industria de los suplementos alimenticios y de ácido shikímico con aplicación en la industria farmacéutica para la producción de Tamiflu®.
EJEMPLOS DE REALIZACION PREFERIDA
EJEMPLO 1 - Efecto del estrés de corte sobre la acumulación de AS.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias (Daucus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1:3 kg de material vegetal:Litros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias previamente lavadas y desinfectadas.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a) para propiciar la producción y acumulación de AS y CF.
Particularmente, a 300 gramos de ralladura de zanahorias estresada obtenida en la etapa a) se colocaron en contenedores de plástico abiertos con capacidad de 5.7 L (Sterilite, Townsend, E.U.A) y se incubaron por 48 h en una incubadora (VWR, Radnor, E.U.A.) a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total y se colectaron muestras cada 24 h para determinar el tiempo en el cual existía la máxima acumulación de AS. La concentración de AS incrementó en las ralladuras nutracéuticas durante las primeras horas de almacenamiento, observándose la concentración máxima a las 24 h (Figura 2). La concentración de AS en zanahoria rallada almacenada por 24 h aumentó -50% con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h). Esto demuestra que es posible la producción de AS a partir de tejido de zanahoria estresado por corte sin la necesidad de llevar a cabo la Etapa de aplicar glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado, aun cuando la concentración obtenida de AS es menor que cuando el glifosato es aplicado al tejido estresado (Tabla 2).
No existen reportes en la literatura que describan el efecto de la aplicación de estreses abióticos en la acumulación de AS en tejidos vegetales. Cuando las zanahorias se exponen al estrés de corte, proteínas y metabolitos secundarios tales como compuestos fenólicos son sintetizados durante el proceso de aclimatación siendo el AS un metabolito primario precursor para la síntesis de aminoácidos aromáticos, los cuales a su vez son utilizados en la síntesis de dichas proteínas y metabolitos secundarios como los compuestos fenólicos. Por lo tanto, es probable que la acumulación de AS a las 24 h de almacenado esté relacionada con una mayor velocidad de síntesis de este compuesto en comparación a su velocidad de utilización para la síntesis de aminoácidos y metabolitos secundarios.
Tabla 2. Diferencia en la concentración de AS y CF de las ralladuras nutracéuticas producidas por estrés, incubación y sin aplicación de glifosato y las ralladuras glifosatadas producidas por estrés, incubación y glifosato.
CF
AS
Producto mg equivalentes de ácido
mg AS/kg base seca (ppm)
clorogénico/kg base seca (ppm)
Ralladura Nutracéutica 100-500 1000-3000
Ralladura Glifosatada 2000-6000 1000-3000 EJEMPLO 2 - Efecto del secado sobre la acumulación de AS.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias (Daucus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal ¡Litros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias previamente lavadas y desinfectadas.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a) para propiciar la producción y acumulación de AS y CF.
Particularmente, a 300 gramos de ralladura de zanahorias estresada obtenida en la etapa a) se colocaron en contenedores de plástico abiertos con capacidad de 5.7 L (Sterilite, Townsend, E.U.A) y se incubaron por 48 h en una incubadora (VWR, Radnor, E.U.A.) a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total y se colectaron muestras cada 24 h para confirmar el tiempo en el cual existía la máxima acumulación de AS.
Etapa c) Secado de las ralladuras nutracéuticas obtenidas en b) para producir ralladuras nutracéuticas deshidratadas.
Esta etapa se llevó a cabo colocando a las ralladuras nutracéuticas en un horno túnel por convección forzada con un tiempo de residencia de 60±2 minutos temperatura del aire de entrada a 80°C ± 5 , humedad del aire de entrada entre 15 ±5 % de humedad y un flujo de aire de 200 m3 de aire/min. La concentración de AS incrementó durante las primeras horas de almacenamiento, observándose la concentración máxima a las 24 h. La concentración de AS en zanahoria rallada almacenada por 24 h aumentó -45% con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h). La concentración de AS en las ralladuras nutracéuticas deshidratadas almacenadas por 24 h aumento -40% con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h).
EJEMPLO 3 - Efecto del molido sobre la acumulación de AS.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias (Daucus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal rLitros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés ab ¡ótico poscosecha las zanahorias previamente lavadas y desinfectadas.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a) para propiciar la producción y acumulación de AS.
Particularmente, a 300 gramos de ralladura de zanahorias estresada obtenida en la etapa a) se colocaron en contenedores de plástico abiertos con capacidad de 5.7 L (Sterilite, Townsend, E.U.A) y se incubaron por 48 h en una incubadora (VWR, Radnor, E.U.A.) a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total y se colectaron muestras cada 24 h para confirmar el tiempo en el cual existía la máxima acumulación de AS. Etapa c) Secado de las ralladuras nutracéuticas obtenidas en b) para producir ralladuras nutracéuticas deshidratadas.
Esta etapa se llevó a cabo colocando a las ralladuras nutracéuticas en un horno túnel por convección forzada con un tiempo de residencia de 60±2 minutos temperatura del aire de entrada a 80°C ± 5 , humedad del aire de entrada entre 15 ±5 % de humedad y un flujo de aire de 200 m3 de aire/min.
Etapa d) Molido de las ralladura nutracéutica deshidratada obtenida en c) para producir un polvo nutracéutico
En esta etapa las ralladuras nutracéuticas deshidratadas son pulverizadas en un molino vertical de rodillos constituido preferentemente por dos rodillos de acero paralelos entre sí y girando concéntricos impulsando a las ralladuras nutracéuticas deshidratadas a pasar por el espacio entre ellos con un tiempo de residencia de 3 min ±1 y un tamaño de partícula de 0.20 mm ± 0.05.
La concentración de AS incrementó durante las primeras horas de almacenamiento, observándose la concentración máxima a las 24 h. La concentración de AS en zanahoria rallada almacenada por 24 h aumentó ~48% con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h).
La concentración de AS en el polvo nutracéutico almacenado por 24 h aumento -37% con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h).
Esto demuestra que es posible la producción de AS a partir de tejido de zanahoria estresado por corte, posteriormente sometido a un proceso de secado y finalmente molido sin la necesidad de llevar a cabo la Etapa de aplicar de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado, aun cuando la concentración obtenida de AS es menor que cuando el glifosato es aplicado al tejido estresado (ver figura 3). EJEMPLO 4 - Efecto del método de aplicación (sumergido o asperjado) de una solución de glifosato (482 g/L) sobre la sobreproducción y acumulación de AS en cultivo hortofrutícola rallado después de 24 h de almacenamiento.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias {Daucus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal: Litros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa a') Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado en a)
En esta etapa el tejido vegetal rallado y estresado es tratado con una solución concentrada de glifosato (482 g/L) utilizando dos diferentes métodos de aplicación (sumergido y asperjado). Particularmente, 300 gramos de ralladura de zanahorias estresada obtenida en la etapa a) se colocaron en contenedores de plástico abiertos con capacidad de 5.7 L (Sterilite, Townsend, E.U.A). En el primer método de aplicación (sumergido) las ralladuras se sumergieron por 2 min en 500 mL de la solución de glifosato y posteriormente se drenaron por 10 min. En el segundo método de aplicación (asperjado) 100 mL de la solución de glifosato se asperjaron a la zanahoria rallada utilizando un aspersor comercial.
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a') para propiciar la sobreproducción y acumulación de AS Finalmente las ralladuras tratadas se incubaron por 24 h a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total para determinar el efecto combinado del estrés de corte y aplicación de glifosato en la acumulación de AS.
La zanahoria rallada asperjada con glifosato mostró un aumento ~44% mayor en la acumulación de AS con respecto a las muestras sumergidas (Figura 3).
EJEMPLO 5 - Efecto de la concentración de glifosato (a una concentración igual o menor a 482 g/L) asperjado sobre la sobreproducción y acumulación de AS y CF en cultivo hortofrutícola rallado después de 24 h de almacenamiento.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias (Da cus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal :Litros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa a') Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado en a).
En esta etapa el tejido vegetal rallado y estresado es tratado asperjando con un aspersor comercial, 100 mL de una solución de glifosato a diferentes concentraciones. Donde cada solución de glifosato con la que se trató la ralladura de manera independiente, presento una concentración de: 100, 200, 300, 400 y 482 g/L; y una muestra control donde se asperjaron 100ml de agua sin glifosato, denominándola como concentración de glifosato
0.
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a') para propiciar la sobreproducción y acumulación de AS. Finalmente las ralladuras tratadas se incubaron por 24 h a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total para determinar el efecto combinado del estrés de corte y aplicación de glifosato a diferentes concentraciones en la acumulación de AS y CF
El contenido de AS y CF en muestras de zanahorias ralladas asperjadas y no asperjadas con soluciones conteniendo distintas concentraciones de glifosato (0, 100, 200, 300, 400
5 y 482 g/L) fue determinado por HPLC-PDA. La Figura 4a, 4b y 4c y la Tabla 3 muestran la identificación de los compuestos acumulados (AS y diversos CF) como parte de proceso de estrés de corte y aplicación de glifosato en tejido de zanahoria, mientras que la Tabla 4 muestra la cuantificación de dichos compuestos cuando diferentes concentraciones de glifosato fueron utilizadas.
10 Tabla 3. Identificación tentativa de ácido shikímico y compuestos fenólicos en el tejido de zanahoria obtenido por HPLC-PDA.
Numero de pico a Identificación Previamente reportado Método de
Xmax b (nm)
(tiempo de retención) tentativa en zanahoria c identificación d
1 (3.7) 215 AS A, B
2 (13.0) 215, 253, 290 AP iv A. B. C
3 (14.8) 217, 271 DAG A
4 (18.1) 217, 242, 320 AC i, ii, iü, iv, v, vi A, B, C
5 (22.2) 217, 238, 325 3,5-diCQA ii, iii, iv, v, vi A, B, C
6 (23.2) 228, 313 DAApC A
7 (24.1) 215, 240, 326 4,5-diCQA i, ii, iii, iv, v, i A,B, C
8 (29.9) 226, 310 ApC i A, B, C
9 (31.4) 217, 237, 323 AF i, iii, iv, v, vi A, B
10 (33.2) 225, 313 DBApC A
11 (45.8) 218, 239, 328 DAF A, B
12 (53.9) 215, 268, 301 1C iii, iv, vi B, C
(a) Número de pico asignado de acuerdo con el orden de elución de la fase estacionaria C18 (Figura 4). (b) Longitudes de onda de máxima absorción en el espectro UV/Vis de cada pico cromatográfico. (c)
15 Previamente reportado (d) Método aplicado para la identificación tentativa del pico: (A) Identificación por comparación con el tiempo de retención y longitudes de onda de máxima absorción en el espectro UV/Vis de estándares comerciales; (B) Identificación por interpretación espectral de las longitudes de onda de máxima absorción en el espectro UV/Vis y su comparación con longitudes de onda de absorción máxima en la literatura (C) Identificación por el orden de elución cromatográfico reportados en la literatura.
20 Abreviaturas: ácido shikímico (AS); ácido protocatecuico (AP); derivado del ácido gálico (DAG), ácido clorogénico (AC), ácido 3,5-dicafeoilquínico (3,5-diCQA), derivado A del ácido p-cumárico (DAApC), ácido 4,5-dicafeoilquínico (4,5-diCQA), ácido p-cumárico (ApC), ácido ferúlico (AF), derivado B del ácido p-cumárico (DBApC), derivado del ácido ferúlico (DAF); isocumarina (IC). Tabla 4. Comportamiento de la concentración de ácido shikímico y compuestos fenólicos individuales en los extractos metanólicos
de ralladuras de zanahorias expuestas a estrés de corte sin y con asperjado con soluciones de glifosato a diferentes concentraciones y almacenadas durante 24 horas a 25°C.
Concentración de ácido shikímico y compuestos fenólicos individuales
(mgkg BS) -"·'
Muestras ralladas almacenadas
deP'c0 Control
Concentraciones de glifosato en la solución de asperjado
Control (g/L)
0 100 200 300 400 482
1 AS 259.1 ±4.7 g 458.8 ±6.3 f 323.1 ±7.1 U 789.8 ±62.3 c 1250.9 ±72.0 d 2538.3 ± 56.9 c 4306.3 ±79.1 b 4755.3 ± 117.9 a
2 AP 111.2 -t 1.1 b 206.5 ±10.1 a 85.7 ±4.0 c 580 ±2.6 de 40.1 ±3.1 f 25.3 ±0.7 g 45.8 ± 1.8 ef 58.8 ±11 d
3 DAG 286.5 ±4.8 a 205.1 ± 1.4 c 167.2 ±3.3 e 198.4 ±1.6 c 196.2 ±2.1 c 220.4 ±7.9 c 229.4 ±8.4 c 254.1 ±8.9 a
4 AC 18.4 ±0.3 e 50.1 ±4,3 e 46.1 ±3.4 e 21.9±2.8 e 147.5 ±5.6 d 346.7 ± 11.8 c 745.0 ±27.1 b 1044.2 ±29.0 a
5 3,5-diCQA ND ND ND 2.8 ±0.0 d 13.0 ±0.2 c 14.9 ±0.4 be 1 .8 ±0.6 b 29.4 ±3.8 a
6 DAApC 24.5 ±1.2 d 204.2 ±13.5 a 212.4 ±19.6 a 25.3 ± 1.0 d 38.6 ±0.9 cd 50.1 ± 1.2 be 6S.4±2.6 b 195.3 ±11.8 a
7 4,5-_iCQA ND ND ND 3.0 ± 0.0 d 6.0 ± 00 c 6.7 ±0.0 c 10.0 ±0.2 b 14.8 ± 0.6 a
8 ApC 27.3 ±0.7 e 78.6 ±1.2 a 46.4 ± 1.6 b 36.7 ± 1.9 c 32.1 ±12 d 1 .9 ±0.9 f U.4±0.4 g 5.7 ±0.1 h
9 AF 5.1 ±0.0 b 13.4 ±0.9 a 4.8 ± 0.0 b 6.5 ± 0.0 c 7.1 ±0.1 c 4.6 ±0.0 c 3.1 ±0.0 d 30±0.0 d
10 DBApC 7.9 ±0.3 f 52.1 ±1.8 d 47.4 ± 1.6 de 14.2±04 f 43.7 ±2.2 e 64.4 ±3.8 c 90.7 ±4.5 b 135.8 ±5.6 a
11 DAF ND ND ND 212.4 ±7.5 e 319.4 ±9.6 d 437.9 ± 13.2 c 548.5 ± 163 b 659.1 ± 15.7 a
12 1C 36.8 ±0.8 D 178.4 ±2.8 a 126.8 ± 1.3 b 22.4 ±0.3 f 17.9 ± 0.2 g 16.9 ±0.3 g 27.6 ±0.6 e 70.6± 1.1 c
(a) Las concentraciones se expresan como equivalentes de ácido clorogénico para los picos 5, 7 y 12; como equivalentes de acido gálico para el pico 3; como 5 equivalentes de ácido p-cumárico para los picos 6 y 10, y como equivalentes de ácido ferúlico para el pico 11. (b) Los compuestos se cuantificaron a 21 nm
(pico 1), 280 nm (picos 2, 3 y 12) y a 320 nm (picos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11). (c) Los valores representan la media de 4 repeticiones ± error estándar de la media, (d) Letras diferentes en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas por la prueba LSD (p<0,05). ND = No detectado. Abreviaturas: ácido shikímico (AS); ácido protocatecuico (AP); derivado del ácido gálico (DAG), ácido clorogénico (AC), ácido 3,f-dicafeoilquínico (3,5- diCQA), derivado A del ácido p-cumárico (DAApC), ácido 4,5-dicafeoilquínico (4,5-diCQA), ácido p-cumárico (ApC), ácido ferúlico (AF), derivado B del 10 ácido p-cumárico (DBApC), derivado del ácido ferúlico (DAF); isocumarina (IC).
Basados en las cuantificaciones con HPLC-PDA se estimó que el aumento en la concentración de AS en zanahoria rallada no asperjada con glifosato fue de ~77% a las 24 h de almacenado. La máxima acumulación de AS fue obtenida cuando la zanahoria rallada se asperjó con una solución de 482 g/L de glifosato.
En cuanto a los CF, el ácido 3,5-dicafeoilquínico (3,5-diCQA), ácido 4,5-dicafeoilquínico (4,5-diCQA), y un derivado del ácido ferúlico (DAF) fueron identificados solamente en las muestras tratadas con glifosato. El estrés de corte indujo la acumulación de ácido protocatecuico (AP), AC, ácido p-cumárico (ApC), derivado A del ApC (DAApC), derivado B del ApC (DBApC), ácido ferúlico (AF) e isocumarina (IC). El CF que mostró mayor porcentaje de incremento en su concentración fue el D AApC, seguido por DBApC, IC, ApC, AF, y AP. La aplicación de glifosato en zanahoria estresada por corte indujo la acumulación de algunos ácidos hidroxicinámicos (AC, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA, DBApC, y DAF) a las 24 h de almacenado al ser comparado con muestras en las que no se aplica glifosato, mientras que la concentración de AP permanece constante. El CF que mostró el mayor incremento es su concentración por efecto de la aplicación de glifosato en zanahoria rallada fue el AC. Adicionalmente, la aplicación de glifosato indujo la síntesis y acumulación de 3,5-diCQA y 4,5-diCQA, mientras que en los tratamientos en donde solo se utilizó estrés de corte dichos compuestos no fueron detectados.
Esta es la primera investigación que evalúa el efecto de la aplicación de glifosato en la acumulación de CF individuales en tejido vegetal estresado por corte. Reportes previos indican que la biosíntesis de CF como los ácidos hidroxicinámicos en plantas tratadas con glifosato es inhibida debido al efecto de dicho herbicida sobre la conversión de AS a L- fenilalanina. Sin embargo en la presente investigación, la aplicación de glifosato en zanahoria estresada por corte indujo una acumulación significativa de algunos ácidos hidroxicinámicos como el ácido clorogénico y sus derivados.
EJEMPLO 6 - Sobreproducción y acumulación de compuestos bioactivos mediante la aplicación de estrés abiótíco y glífosato en tejido de zanahoria.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias (Daucus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal:Litros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa a') Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado en a).
En esta etapa el tejido vegetal rallado y estresado es tratado asperjando (aspersor comercial)
100 mL de una solución concentrada de glifosato (482 g/L).
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a') para propiciar la sobreproducción y acumulación de AS.
Finalmente las ralladuras tratadas se incubaron por 24 h a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total para determinar el efecto combinado del estrés de corte y aplicación de glifosato en la acumulación de AS y CF.
La máxima acumulación de AS fue obtenida cuando la zanahoria rallada se asperjó con una solución de 482 g/L de glifosato. Bajo dichas condiciones la concentración de AS aumentó un -1735% a las 24 h de almacenamiento en comparación a las muestras control (0 h). El CF que mostró el mayor incremento es su concentración por efecto de la aplicación de glifosato en zanahoria rallada fue el ácido clorogénico (AC). El contenido de AC en el tratamiento donde se utilizó la solución de 482 g/L de glifosato tuvo un incremento de -1980% al ser comparado con las muestras control a 24 h. Esto demuestra la sobreproducción de AS y CF al aplicar glifosato después del estrés de corte (Tabla 2).
Tabla 2. Diferencia en la concentración de AS y CF de las ralladuras nutracéutícas producidas por estrés, incubación y sin aplicación de glifosato y las ralladuras glifosatadas producidas por estrés, incubación y glifosato.
Figure imgf000045_0001
EJEMPLO 7 - Efecto del secado sobre la sobreproducción y acumulación de compuestos bioactivos mediante la aplicación de estrés abiótico y glifosato en tejido de zanahoria. El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias (Da cus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal: Litros de agua clorada, durante 10 min. Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias. Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm. Etapa a') Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado en a).
En esta etapa el tejido vegetal rallado y estresado es tratado asperjando (aspersor comercial)
100 mL de una solución concentrada de glifosato (482 g/L).
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a') para propiciar la sobreproducción y acumulación de AS.
Las ralladuras tratadas se incubaron por 24 h a 25 °C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total para determinar el efecto combinado del estrés de corte y aplicación de glifosato en la acumulación de AS y CF.
Etapa c) Secado de las ralladuras glifosatadas obtenidas en b) para producir ralladuras glifosatadas deshidratadas.
Esta etapa se llevó a cabo colocando a las ralladuras glifosatadas en un horno túnel por convección forzada con un tiempo de residencia de 60±2 minutos temperatura del aire de entrada a 80°C ± 5 , humedad del aire de entrada entre 15 ±5 % de humedad y un flujo de aire de 200 m3 de aire/min.
La máxima acumulación de AS fue obtenida cuando la zanahoria rallada se asperjó con una solución de 482 g/L de glifosato. Bajo dichas condiciones la concentración de AS aumentó un -1766% a las 24 h de almacenamiento en comparación a las muestras control (0 h). La concentración de AS aumentó un ~1550% en las ralladuras glifosatadas deshidratadas almacenadas por 24 h con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h). El CF que mostró el mayor incremento es su concentración por efecto de la aplicación de glifosato en zanahoria rallada fue el ácido clorogénico (AC). El contenido de AC en el tratamiento donde se utilizó la solución de 482 g/L de glifosato tuvo un incremento de ~1930% al ser comparado con las muestras control a 24 h. La concentración de AC aumentó un -1700% en las ralladuras glifosatadas deshidratadas almacenadas por 24 h con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h).
EJEMPLO 8 - Efecto del molido sobre la sobreproducción y acumulación de compuestos bioactivos mediante la aplicación de estrés abiótico y glifosato en tejido de zanahoria.
El material vegetal utilizado en este ejemplo consistió en Zanahorias {Daucus carota) que fueron obtenidas de un supermercado local (Monterrey, N.L., México), se lavaron y se desinfectaron con agua clorada a una concentración de 200 ppm, pH 6.5, en una relación 1 :3 kg de material vegetal :Litros de agua clorada, durante 10 min.
Etapa a) Someter a estrés abiótico poscosecha las zanahorias.
Esta etapa se llevó a cabo rallando la zanahoria con un rallador comercial de vegetales. Las ralladuras de zanahoria estresada se obtuvieron con un diámetro de 0.7 cm.
Etapa a') Aplicación de glifosato en el cultivo hortofrutícola estresado en a).
En esta etapa el tejido vegetal rallado y estresado es tratado asperjando (aspersor comercial) 100 mL de una solución concentrada de glifosato (482 g/L).
Etapa b) Incubar la zanahoria rallada y estresada en a') para propiciar la sobreproducción y acumulación de AS.
Las ralladuras tratadas se incubaron por 24 h a 25°C a presión atmosférica con una humedad relativa de 65% en oscuridad total para determinar el efecto combinado del estrés de corte y aplicación de glifosato en la acumulación de AS y CF.
Etapa c) Secado de las ralladuras glifosatadas obtenidas en b) para producir ralladuras glifosatadas deshidratadas. Esta etapa se llevó a cabo colocando a las ralladuras glifosatadas en un horno túnel por convección forzada con un tiempo de residencia de 60±2 minutos temperatura del aire de entrada a 80°C ± 5 , humedad del aire de entrada entre 15 ±5 % de humedad y un flujo de aire de 200 m3 de aire/min.
Etapa d) Molido de las ralladura glifosatadas deshidratada obtenida en c) para producir un polvo glifosatado.
En esta etapa las ralladuras glifosatadas deshidratadas son pulverizadas en un molino vertical de rodillos constituido preferentemente por dos rodillos de acero paralelos entre sí y girando concéntricos impulsando a las ralladuras nutracéuticas deshidratadas a pasar por el espacio entre ellos con un tiempo de residencia de 3 min ±1 y un tamaño de partícula de 0.20 mm ± 0.05.
La máxima acumulación de AS fue obtenida cuando la zanahoria rallada se asperjó con una solución de 482 g/L de glifosato. Bajo dichas condiciones la concentración de AS aumentó un -1720% a las 24 h de almacenamiento en comparación a las muestras control (0 h). La concentración de AS aumentó un ~1470% en el polvo glifosatado almacenado por 24 h con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h).
El CF que mostró el mayor incremento es su concentración por efecto de la aplicación de glifosato en zanahoria rallada fue el ácido clorogénico (AC). El contenido de AC en el tratamiento donde se utilizó la solución de 482 g/L de glifosato tuvo un incremento de ~1940% al ser comparado con las muestras control a 24 h. La concentración de AC aumentó un ~1 1620% en las ralladuras glifosatadas deshidratadas almacenadas por 24 h con respecto a la zanahoria rallada antes del almacenamiento (0 h). Esto demuestra que es posible la sobreproducción de AS y CF a partir de tejido de zanahoria estresado por corte, glifosato, posteriormente sometido a un proceso de secado y finalmente molido.
EJEMPLO 9 - Preparación de muestra para análisis de fitoquímicos.
El AS se extrajo del cultivo hortofrutícola utilizando dos diferentes procedimientos, con base en el método de detección y cuantificación a utilizar (espectrofotométrico o cromatográfico). Para el análisis espectrofotométrico del AS este se extrajo utilizando el método reportado por Zelaya, I. A.; Anderson, J. A.; Owen, M. D.; Landes, R. D. Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: models in glyphosate-resistant and susceptible crops. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 2202-2212, con algunas modificaciones. El tejido de zanahoria (0.2 g) se homogenizó con 0.25 N HC1 (4 mL). La homogenización se realizó con un homogenizador de aspas comercial (Advanced Homogenizing System, VWR, Radnor, E.U.A.). Posteriormente, los homogenizados se agitaron por inversión durante 10 min en un agitador Glas-Col (Terre Haute, IN, E.U.A.) a 60 rpm y subsecuentemente se centrifugaron (10,000 x g, 15 min, 4 °C). El sobrenadante clarificado (extracto de AS) se microfíltró utilizando membranas de nylon de 0.45 μηι (VWR, Radnor, E.U.A.).
Para la identificación y cuantificación cromatográfica (HPLC-PDA) de AS y CF, el tejido de zanahoria (5 g) se homogenizó con metanol (20 mL). Los homogenizados se almacenaron a lo largo de la noche (-12 h, 4 °C) y se centrifugaron (10,000 x g, 15 min, 4 °C). El sobrenadante clarificado (extracto metanólico) se microfíltró utilizando membranas de nylon de 0.45 μηι (VWR, Radnor, E.U.A.). EJEMPLO 10 - Cuantifícación espectrofotométrica de ácido shikímico (AS). Los extractos de AS se analizaron siguiendo un método reportado por Zelaya, I. A.; Anderson, J. A.; Owen, M. D.; Landes, R. D. Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: models in glyphosate-resistant and susceptible crops. J. Agrie. Food Chem. 2011, 59, 2202-2212. Los extractos de AS (250 LL) se mezclaron con una solución acuosa de periodato (0.5% p/v) y m-periodato de sodio (0.5% p/v) (250 μί). Las mezclas se agitaron con vórtex y se incubaron en la obscuridad en baño de agua a temperatura controlada (37 °C) por 45 min. Posteriormente, una solución NaOH 1 M (300 μί) y una solución Na2S03 56 mM (200 \xL) se agregaron a la mezcla. El AS oxidado por efecto de la reacción se detectó a 382 nm utilizando un lector de microplatos (Synergy HT, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, E.U.A.). Se construyó una curva estándar de AS (1-1000 μΜ) para cuantificar el compuesto. La concentración de AS se expresó en mg por kg de zanahoria en base seca (BS). El contenido de humedad en las muestras se determinó mediante el método de secado en horno (AACC 44- 15 A).
ELEMPLO 11 - Identificación y cuantifícación de ácido shikímico (AS) y compuestos fenólicos (CF) individuales mediante HPLC-PDA. Los extractos metanólicos se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de arreglo de fotodiodos (HPLC-PDA). El sistema se conformó por dos bombas binarias, un auto-muestreador y detector de arreglo de fotodiodos (Waters Corp, Mildford, MA, E.U.A.). El AS y los CF se separaron en una columna de fase reversa Cl 8, 4.6 mm X 250 mm, y 5 μηι de diámetro de partícula (Luna, Phenomenex, Torrance, CA, E.U.A.). Las fases móviles fueron agua (fase A) y una mezcla metanol: agua (60:40, fase B) ajustadas a un pH de 2.4 con ácido ortofosfórico. El gradiente de las fases móviles fue 0/100, 3/70, 8/50, 35/30, 40/20, 45/0, 50/0, y 60/100 (min/%fase A) a un flujo volumétrico constante de 1 mL/min. Los datos se procesaron utilizando el programa Millenium V3.1 (Waters Corp, Mildford, MA, E.U.A.). La identificación de AS y CF individuales se realizó con base en tres procedimientos: a) comparación del tiempo de retención y características espectrales UV -visible de cada pico contra estándares comerciales, b) análisis de características espectrales UV-visible y comparación con reportes previos, y c) identificación mediante el orden de elución con base en reportes en literatura en donde se hayan utilizado condiciones cromatográficas similares a las usadas en el presente estudio. Las curvas estándar de diversos compuestos incluyendo el ácido shikímico (AS), ácido clorogénico (AC), ácido ferúlico (AF), ácido p-cumárico (ApC), ácido protocatecuico (AP) y ácido gálico (AG) se prepararon en un rango de concentración de 0.5 - 100 μΜ. La concentración de cada uno se expresó en mg de cada compuesto particular por kg de zanahoria BS.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas caracterizado porque comprende las etapas:
a) Someter a estrés abiótico poscosecha un cultivo hortofrutícola, para obtener fragmentos de tejido vegetal,
b) Incubar el tejido vegetal obtenido en a) para la producción y acumulación de ácido shikímico y compuestos fenólicos.
2. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque posterior a la etapa b), opcionalmente se incluye una etapa de secado.
3. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque posterior a la etapa b), opcionalmente se incluye una etapa de secado y molido.
4. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque entre las etapas a) y b), opcionalmente se incluye una etapa de aplicación glifosato.
5. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque posterior a la etapa b) opcionalmente incluye una etapa de secado.
6. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque posterior a la etapa b) opcionalmente incluye una etapa de secado y molido.
7. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4, 5 y 6 caracterizado porque posterior a alguna de las etapas de: incubar, secar o molido, se incluye una etapa de recuperación, purificación y pulido de ácido shikímico y compuestos fenólicos de manera independiente.
8. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa a) el cultivo hortofrutícola preferentemente es tejido de zanahoria (Daucus carota).
9. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa a) el estrés abiótico es estrés de corte.
10. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 9 caracterizado porque en la etapa a) el estrés abiótico es estrés de corte combinado con uno de entre los siguientes: atmosferas modificadas, gasificación de fitohormonas, radiación UV, radiación fluorescente.
11. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa a) el estrés es de corte es uno de entre ralladura, rodajas, triángulos, picado, y bagazo.
12. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa a) el estrés de corte preferentemente es por ralladura en un rango en el diámetro de 2 hasta los 17 mm, preferentemente 7 mm.
13. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa de aplicación de glifosato, dicho glifosato se encuentra en solución de agua bidestilada o agua de calidad superior, con un rango de concentración de glifosato menor o igual a 482 g/L, con un pH entre 6 y 7.
14. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa de aplicación de glifosato se lleva a cabo preferentemente con en solución a una concentración de glifosato de 482 g/L, y un pH de 6.5.
15. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa de aplicación de la solución de glifosato se lleva a cabo mediante sumergido o asperjado.
16. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa de aplicación de la solución de glifosato se lleva a cabo preferentemente mediante el método de asperjado.
17. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa de aplicación de la solución de glifosato las ralladuras son
i i
asperjadas con una relación 1 :- a 1 : - ; siendo kg de cultivo hortofrutícola:L de
6 2
solución de glifosato.
18. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa de aplicación de la solución de glifosato el asperjado de la solución de glifosato se lleva a cabo preferentemente con una relación de 1 : j ; siendo kg de cultivo hortofrutícula:L de solución de glifosato.
19. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 1 y 4 caracterizado porque en la etapa b) de incubación el cultivo hortofrutícola estresado, la cual puede llevarse a cabo a una temperatura de los 15 a los 40°C, entre 12 a 60 horas de almacenamiento, a una presión entre 0.1 y 10 atm, con una humedad relativa entre 40 y 100%, en presencia o ausencia de luz.
20. El proceso para la sobreproducción de ácido shikímico y compuestos fenólicos en cultivos hortofrutícolas de conformidad con la reivindicación 19 caracterizado porque en la etapa b) de incubación el cultivo hortofrutícola estresado se lleva a cabo preferentemente a 25°C durante 24 h a presión atmosférica con una humedad relativa de 65%.
21. Ralladura nutracéutica obtenida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque presenta un diámetro mínimo de 2 mm, pH en un rango de 4 a 6, humedad 15-95%, una concentración de ácido shikímico de 100 hasta 500 mg/AS/kg de base seca (ppm), y una concentración de fenólicos entre 1000 hasta 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm).
22. Ralladura nutracéutica deshidratada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque presenta un diámetro mínimo de 2 mm, pH en un rango de 4 a 6; humedad 2- 15%, una concentración de ácido shikímico de 100 hasta 500 mg/AS/kg de base seca (ppm), y una concentración de fenólicos entre 1000 hasta 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm).
23. Polvo nutracéutico deshidratado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque presenta un intervalo de granulometría entre 23 y 30% de retenido a un tamaño de partícula mayor a 0.29mm, entre 10 y 23% de retenido entre 0.10 y 0.29mm, y entre 5 y 10% de retenido a un tamaño de partícula menor a 0.1 Omm, pH en un rango de 4 a 6, humedad 2-15%, una concentración de ácido shikímico de 100 hasta 500 mg/AS/kg de base seca (ppm), y una concentración de fenólicos entre 1000 hasta 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm).
24. Ralladura glifosatada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque presenta un diámetro mínimo de 2mm, pH en un rango de 3 a 7, humedad 15-95%, una concentración de ácido shikímico de 2000 hasta 6000 mg/AS/kg de base seca (ppm), y una concentración de fenólicos entre 1000 hasta 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm).
25. Ralladura glifosatada deshidratada de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque presenta un diámetro mínimo de 2mm, pH en un rango de 3 a 7, humedad 2-15%, una concentración de ácido shikímico de 2000 hasta 6000 mg/AS/kg de base seca (ppm), y una concentración de fenólicos entre 1000 hasta 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm).
26. Polvo glifosatado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque presenta un intervalo de granulometría entre 23 y 30% de retenido a un tamaño de partícula mayor a 0.29mm, entre 10 y 23% de retenido entre 0.10 y 0.29mm, y entre 5 y 10% de retenido a un tamaño de partícula menor a 0.1 Omm, pH en un rango de 5 a 6, humedad 2-15%o, una concentración de ácido shikímico de 2000 hasta 6000 mg/AS/kg de base seca (ppm), y una concentración de fenólicos entre 1000 hasta 3000 mg equivalentes de ácido clorogénico/kg base seca (ppm).
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