WO2014108455A1 - Verfahren zum räumlich hochaufgelösten abbilden einer einen luminophor aufweisenden struktur einer probe - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for spatially high-resolution imaging of a structure of a sample having a luminophore, wherein the sample is exposed to luminescence excitation light in a measuring region which excites the luminophore from a stimulable electronic ground state into an excited luminescent state Measuring range is applied with a local minimum intensity distribution of Lumineszenzabregungslicht that brings back the luminophore from the excited luminescent state in the excitable electronic ground state, wherein luminescence emitted from the measuring range luminescent light is registered and wherein the registered luminescent associated with the position of the local minimum in the sample becomes.
  • the intensity of the luminescent light emitted from the measurement area is a measure of the concentration of the luminophore at the location of the local minimum in the sample.
  • luminescent light refers to any substance from which luminescent light is available as a measuring signal when it is in an excited, luminescent state.
  • fluorescent dyes are included hereunder.
  • the process underlying the emission of the luminescent light does not have to be fluorescence. It may also be scattering, such as Raman scattering, where excited transitional states from which stray light is emitted are considered to be the excited luminescent states.
  • the structure of interest of the sample may comprise the luminophore by itself, i. H. be autoluminescent.
  • the structure of interest of the sample may also be artificially labeled with the luminophore.
  • the artificial marking of the structure with the luminophore can z. B. by so-called antibody staining, d. H. by coupling the luminophore via an immune reaction, or by a genetic modification that results in co-expression of the luminophore with the structure of interest.
  • this is a state, for example a stimulable ground electronic state or an excited luminescent state of the luminophore is concerned, so it is an electronic state of the luminescent capable smallest unit of the luminophore, d. H. a molecule, a complex, a defect, a quantum dot, or the like.
  • a local minimum of an intensity distribution of light for example of the luminescence-depleting light
  • dimensions of a local minimum relate in particular to the dimensions of the volume in which the respective light does not bring about the effect called for by it, for example the transition excited with it, until it reaches saturation.
  • a method of spatially high resolution imaging of a luminophore structure of a sample comprising the above steps of the preamble of independent claim 1 is known as STED (Stimulated Emission Depletion) scanning fluorescence microscopy.
  • the sample is first subjected to the luminescence excitation light in the measuring region, which excites the luminophore from the excitable electronic ground state into the excited luminescent state.
  • the Sample in the measuring region is subjected to a local minimum intensity distribution of luminescent de-excitation light in the form of emission stimulation light, which stimulates the luminophore to emit light at the wavelength of the emission stimulation light, i. H .
  • GSD Gate State Depletion
  • the luminophore before being subjected to luminescence excitation light, is exposed to luminescence-preventing light having an intensity distribution with a local minimum.
  • the luminescence-preventing light converts the luminophore into a dark state, e.g. B. a long-lived triplet state, out of which he is not excited with the luminescence excitation light in a luminescent state. Everywhere outside the local minimum of the intensity distribution of the luminescence-preventing light, this transition into the dark state takes place until saturation. Ie.
  • nu r in the local minimum of the intensity distribution of the Lumineszenzverhi matterssander the luminophore after exposure to the luminescence-preventing light is still in its electronic ground state, from which it is excited with the luminescence excitation light in the luminescent state. Therefore, luminescent light emitted from the luminophore after excitation with the luminescent excitation light comes from the local minimum of the intensity distribution of the luminescence-inhibiting light and can therefore be assigned to the position of the local minimum in the sample.
  • RESOLFT Reversible Saturable Optical Flurorescence Transitions
  • luminophores are switchable by means of luminescence-preventing light from a first conformational state, in which they are effective as luminophores, into a second conformational state in which they are not effective as luminophores, ie in which they are in the first conformational state, at least with the aid of the luminescence excitation light is suitable for exciting the luminescent state, are not excitable in a luminescent state in which they emit the registered as a measurement signal luminescent light.
  • a local minimum of an intensity distribution of the lumi- nance evolution light up to r saturation only comparatively low light intensities are required if the lifetime of the second conformation state is sufficiently long.
  • the invention has for its object to provide a method for spatially high-resolution imaging of a luminophore structure of a sample, in which the high spatial resolution and the high contrast of STED scanning fluorescence microscopy are achieved and in which the luminophore still exposed to a lower risk of photochemical bleaching is as in all previously known methods of STED scanning fluorescence light microscopy.
  • a method according to the invention for spatially high-resolution imaging of a structure of a sample having a luminophore all the steps characteristic of a STED scanning fluorescence microscopy method are carried out; ie, in the method according to the invention is a special method of STED raster luminescence light microscopy:
  • the sample is exposed in a measuring range with luminescence excitation light, which excites the luminophore from a stimulable electronic ground state in an excited luminescent state.
  • the sample is further exposed in the measurement area to a local minimum intensity distribution of luminescent deenergizing light which transmits the luminophore from the excited luminescent state without emission of luminescent light into the excitable electroluminescent light. returns the tronic ground state.
  • Luminescent light emitted from the measuring area is registered; and the registered luminescent light is assigned to the position of the local minimum in the sample.
  • the sample in the measuring area is additionally subjected to an intensity distribution of excitation-preventing light before the luminescence excitation light is applied, which converts the luminophore from the excitable electronic ground state into a protective state.
  • the luminophore is protected from electronic stimulation by the luminescence excitation light and the luminescence depletion light.
  • the intensity distribution of the excitation prevention light also has a local minimum that overlaps with the local minimum of the intensity distribution of the luminescence descent light.
  • the method according to the invention also encompasses the steps used in a RESOLFT scanning fluorescence light microscopy method making use of a switchable luminophore.
  • it is not primarily attempted to improve the effectively effective point mapping function in the sense of an increased spatial resolution by superposing two spatially resolving effective intensity distributions with congruent zeros.
  • the method according to the invention primarily makes use of the fact that the luminophore, for example, in a RESOLFT method with switchable luminophore outside the minimum of the intensity distribution of the excitation prevention light, is converted into a state in which it can not be electronically excited by the luminescence excitation light and the luminescence deactivation light is. This condition is referred to herein as the protective state of the luminophore.
  • the excitation prevention light effectively prevents bleaching of the luminophore by the luminescent excitation light and the luminescent depletion light where it is highest have common intensity.
  • This highest common intensity of the luminescence excitation light and the Lumineszenzabregungslicht is not immediately adjacent to the local minimum of the intensity distribution of Lumineszenzabregungslicht but in some distance.
  • luminescence-depletion light is converted into its protective state to saturation and thus protected from electronic excitation and resulting bleaching by the high common intensities of the luminousence excitation light and the luminescence depletion light.
  • the intensity distribution of the Lumineszenzabregungsetter the high spatial resolution and ultimately the high contrast is realized, namely directly adjacent to the local minimum of the intensity distribution of Lumineszenzabregungsander, the absolute intensity of Lumineszenzabregungsander far less than at a greater distance to the local minimum.
  • the high spatial resolution and the high contrast that can be achieved in STED scanning fluorescence microscopy can be realized without the massive danger of bleaching the luminophore, which is typical of previous STED methods.
  • the local minimum of the intensity distribution of the excitation prevention light be as small as the local minimum of the luminescence descent light.
  • the luminescence excitation light, the Lumineszenzabregungslicht u and the excitation prevention light may have different wavelengths.
  • the wavelengths with respect to the absorption spectrum of the luminophore can be selected such that the luminophore is only transferred or excited with the respective light as intended, and none of the other transitions is addressed.
  • the luminescence-depleting light and the excitation-preventing light may also have the same wavelengths and be applied together to the sample. Ie. in the Lumineszenzabregungslicht and the excitation prevention light may be the same light.
  • a common excitation prevention light and luminescent depletion light wavelength can be chosen so that the light shifts the luminophore beyond the minimum of its intensity distribution both with some likelihood of switching prevents its non-luminescent protective state as well as with a certain second probability by stimulating emission at the emission of luminescent light. Even with this procedure, there is a reduced risk of bleaching the luminophore compared to a pure STE D method, which uses only stimulated emission to increase the spatial resolution.
  • the luminescence excitation light is usually applied in pulses to the sample.
  • the excitation-preventing light and the luminescence-depleting light can basically also be applied continuously to the sample.
  • the Lumineszenzabregungslicht when the Lumineszenzabregungslicht is applied continuously, it is advantageous to register the luminescence light with temporal resolution after each pulse of the Lumineszenzanregungslicht to maximize spatial resolution and contrast, as it is known in principle from WO 2012/069076 A1 for a STE D method is.
  • the excitation-preventing light can convert the luminophore into the protective state by means of a conformational change from the excitable electronic ground state.
  • the luminophore may be a so-called switchable luminophore.
  • the properties of this switchable luminophore need not be as ideal as would be required for RESOLFT scanning fluorescence microscopy, where the spatial resolution is based on the switchability of the luminophore.
  • the switchability of the luminophore is used at least not primarily for increasing the spatial resolution but for protecting the luminophore from the high common intensities of the luminescence excitation light and the luminescence emission light.
  • switchable luminophores can also be used in the process according to the invention, which would not be useful in a RESOLFT process based on switchable luminophores.
  • the luminophore which can be switched off with the excitation prevention light can be a switchable fluorescent protein.
  • the luminophore which can be switched off with the excitation prevention light can spontaneously return from its protective state to the excitable electronic ground state. If such a spontaneous return does not occur or only with an insufficient return rate, it makes sense to apply an intensity distribution of excitation enabling light to the sample in the measuring area prior to application of the excitation prevention light, which defines the luminophore at least in the region of the local minimum of the intensity distribution of the luminescent descent light converted into the excitable electronic ground state. As a rule, this transfer takes place in the entire measuring range, since the intensity distribution of the excitation-enabling light can not be focused more strongly because of the diffraction limit.
  • the excitation-preventing light may disturb the stimulable electronic ground state of the luminophore so that the luminophore in the protective state has an absorption cross-section reduced by at least a factor of 2 for the luminescence excitation light to convert it into the protective state.
  • the protection state is the disturbed electronic ground state of the luminophore in which the perturbation, in particular the steric ordering of the luminophore atoms, significantly reduces its ability to interact with the luminescent excitation light and possibly also with the luminescent depletion light.
  • Such a disturbance of the electronic ground state of the luminophore can be brought about by transmission of motion impulses and / or vibrations.
  • Such motion pulses and / or oscillations may emanate from a shock or vibration relaxation of a modulator unit excited by the excitation-preventing light or also from a cis-trans isomerization of the modulator unit excited by the excitation-preventing light.
  • the modulator unit may be a molecule or a chemical group that may be spatially and / or chemically coupled to the luminophore to ensure the desired momentum and / or vibration transmission.
  • the disturbance of the electronic ground state of the luminophore, by which it is converted into the protective state, can also be seen as an increase in the vibrational energy of the luminophore in be interpreted in its electronic ground state, but this is not an energy state in thermal equilibrium with the environment of the luminophore. Rather, the energy of the luminophore is increased by the motion impulses transmitted by the modulator unit and / or vibrations from the thermal equilibrium with its surroundings.
  • This disturbance of the ground state which corresponds to the desired conversion of the luminophore into its protective state, is lost again as soon as a further thermal balance between the luminophore and its surroundings is established by further molecular transmissions of motion impulses and / or oscillations.
  • the luminescence excitation light and preferably also the luminescence descent light must still be applied to the sample during the persistence of the disturbance of the electronic ground state of the luminophore.
  • FIG. 1 illustrates the method steps of a method according to the invention for the high-resolution spatial imaging of a structure of a sample having a luminophore
  • FIG. 2 illustrates the conditions when the sample is exposed to luminescence emission light in step (c) according to FIG. 1.
  • the sample 3 according to FIG. 1 (a) is exposed to excitation-preventing light 4, which converts the luminophore 1 into a protective state.
  • excitation-preventing light 4 which converts the luminophore 1 into a protective state.
  • This transfer takes place over a measuring range 5 of the sample, with the exception of a local minimum 6 of the intensity distribution of the excitation-preventing light 4.
  • the luminophore 1 remains in an electronic ground state that can be excited for luminescence.
  • the sample 3 is supplied with luminescence excitation light 7 in the entire measuring region 5 including the local minimum 6, which converts the luminophore 1, insofar as it is not in its protective state, from its electronic ground state into an excited luminescent state ,
  • the sample 3 in the measuring region 5 is subjected to luminescence-depleting light 8, this time again with the exception of a local minimum 9 of the intensity distribution of the luminescence-depleting light 8 which coincides with the local minimum 6 of the excitation-preventing light 4 according to FIG. 1 (a). overlaps.
  • the Lumineszenzabregungslicht 8 transfers the luminophore 1 everywhere outside the local minimum 9 of its intensity distribution from its excited luminescent state back to its electronic ground state.
  • the local minimum 9 is smaller than the local minimum 6. That is, where after the step shown in FIG. 1 (c) still luminophore 1 is in its luminescent state, 9 depends on the location of the local minimum.
  • luminescent light 10 is then registered from the measuring region 5, this can be assigned to the position of the local minimum 9 of the intensity distribution of the luminescence emission light 8 according to FIG. 1 (c).
  • the concentration distribution of the luminophore 1 in the sample 3 is detected and thus also the structure 2 in the sample is displayed.
  • the luminophore must quickly return to its excitable electronic ground state not only from its excited luminescent state but also from its protective state. If this is not the case with respect to the protection state, before repeating the steps according to FIGS.
  • Fig. 2 illustrates the intensity distributions of the luminescent excitation light 7 and luminescent depletion light 8 and the probability 1 1 that the luminophore 1, after being exposed to the excitation prevention light 4 of Fig. 1 (a), still in its excitable electronic ground state, ie not in its protective state
  • the probability 1 1 has only a small value that is close to zero.
  • the luminophore is still in its excitable electronic ground state, and everywhere outside the local minimum 6 it is most likely in its protective state.
  • the intensity distributions of the luminescent excitation light 7 and the luminescence descent light 8 have their maximum common intensity outside the local minimum 6. That is, the common maximum intensity hits the luminophore where it is in its protective state and accordingly can not be photochemically bleached.
  • the probability 1 1 is significantly greater than zero, besides the luminescence excitation light 7, only a small intensity of the luminescence excitation light 8 acts on the luminophore, which does not exceed a value l max which remains far below the absolute maximum of this intensity.
  • the spatial intensity distribution of the excitation-preventing light 4 and the luminescence-depleting light 8 around the local minima 6, 9 shown here are only examples. These intensity distributions may take any shape in any spatial direction as known in the art of STED scanning fluorescence microscopy.

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Abstract

Bei einem Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor (1) aufweisenden Struktur (2) einer Probe (3) wird die Probe (3) in einem Messbereich (5) mit Lumineszenzanregungslicht (7) beaufschlagt, das den Luminophor (1) aus einem anregbaren elektronischen Grundzustand in einen angeregten lumineszierenden Zustand anregt. Die Probe (3) wird in dem Messbereich (5) zudem mit einer ein lokales Minimum (9) aufweisenden Intensitätsverteilung von Lumineszenzabregungslicht (8) beaufschlagt, das den Luminophor (1) aus dem angeregten lumineszierenden Zustand in den anregbaren elektronischen Grundzustand zurückbringt. Aus dem Messbereich (5) emittiertes Lumineszenzlicht (10) wird registriert und der Position des lokalen Minimums (9) in der Probe (3) zugeordnet. Vor dem Beaufschlagen mit dem Lumineszenzanregungslicht (7) wird die Probe (3) in dem Messbereich (5) mit einer Intensitätsverteilung von Anregungsverhinderungslicht (4) beaufschlagt, das den Luminophor (1) aus dem anregbaren elektronischen Grundzustand in einen Schutzzustand überführt, in welchem der Luminophor (1) vor elektronischen Anregungen durch das Lumineszenzanregungslicht (7) und das Lumineszenzabregungslicht (8) geschützt ist. Die Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts (4) weist ein lokales Minimum (6) auf, das mit dem lokalen Minimum (9) der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts (8) überlappt.

Description

VERFAHREN ZUM RÄUMLICH HOCHAUFGELÖSTEN ABBILDEN EINER EINEN
LUMINOPHOR AUFWEISENDEN STRUKTUR EINER PROBE
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe, wobei die Probe in einem Messbereich mit Lumineszenzanregungslicht beaufschlagt wird, das den Luminophor aus einem anregbaren elektronischen Grundzustand in einen angeregten lumineszierenden Zustand anregt, wobei die Probe in dem Messbereich mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Lumineszenzabregungslicht beaufschlagt wird, das den Luminophor aus dem angeregten lumineszierenden Zustand in den anregbaren elektronischen Grundzustand zurückbringt, wobei aus dem Messbereich emittiertes Lumineszenzlicht registriert wird und wobei das registrierte Lumineszenzlicht der Position des lokalen Minimums in der Probe zugeordnet wird.
Bei einem solchen Verfahren ist die I ntensität des aus dem Messbereich emittierten Lumineszenzlichts ein Maß für die Konzentration des Luminophors an der Position des lokalen Minimums in der Probe. Durch Abscannen der Probe mit dem lokalen Minimum unter Wiederholung der oben genannten Schritte für jede Position des lokalen Minimums wird die Verteilung des Luminophors in der Probe erfasst und so die mit dem Luminophor markierte Struktur abgebildet.
Mit dem Begriff "Luminophor" wird hier jede Substanz bezeichnet, von der Lumineszenzlicht als Messsignal erhältlich ist, wenn sie sich i n ei nem angeregten l u mi neszierenden Zustand befindet. I nsbesondere fallen hierunter Fluoreszenzfarbstoffe. Der der Emission des Lumi- neszenzlichts zugrunde liegende Vorgang muss aber keine Fluoreszenz sein . Es kann sich auch um Streuung, beispielsweise Raman-Streuung, handeln, bei der angeregte Übergangs- zustände, aus denen Streulicht emittiert wird, als die angeregten lumineszierenden Zustände angesehen werden.
Die interessierende Struktur der Probe kann den Luminophor von sich aus aufweisen, d. h. autolumineszent sein . Die interessierende Struktur der Probe kann jedoch auch mit dem Luminophor künstlich markiert sein. Die künstliche Markierung der Struktur mit dem Luminophor kann z. B. durch sogenannte Antikörperfärbung, d. h. durch Ankoppeln des Luminophors über eine Immunreaktion, oder durch eine gentechnische Veränderung vorgenommen werden, die zu einer gemeinsamen Exprimierung des Luminophors mit der interessierenden Struktur führt.
Wenn hier von einem Zustand, beispielsweise einem anregbaren elektronischen Grundzustand oder einem angeregten lumineszierenden Zustand des Luminophors die Rede ist, so handelt es sich um einen elektronischen Zustand der zur Lumineszenz fähigen kleinsten Einheit des Luminophors, d. h. eines Moleküls, eines Komplexes, einer Fehlstelle, eines Quantum Dot oder dergleichen.
Wenn hier von einem lokalen Minimum einer Intensitätsverteilung von Licht, beispielsweise des Lumineszenzabregungslicht, die Rede ist, so ist hiermit insbesondere eine durch I nterferenz erzeugte Nullstelle der I ntensitätsverteilung gemeint. Dabei mag es sich um eine echte Nullstelle handeln, in der die Intensität des Lichts tatsächlich auf Null zurückgeht, oder aber um eine solche, in der die Intensität des Lichts mangels idealer optischer Verhältnisse nur im Wesentlichen auf Null zurückgeht. Wenn hier von Abmessungen eines lokalen Minimums die Rede ist, so beziehen sich diese Abmessungen insbesondere auf die Abmessungen des Volumens, in dem das jeweilige Licht den mit ihm angestrengten Effekt, beispielsweise den mit ihm angeregten Übergang, nicht bis zur Sättigung herbeiführt.
STAND DER TECHNIK
Ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe, das die oben angegebenen Schritte des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 umfasst, ist als STED (Stimulated Emission Depletion)-Rasterfluoreszenz- lichtmikroskopie bekannt. Die Probe wird in dem Messbereich zunächst mit dem Lumineszenzanregungslicht beaufschlagt, das den Luminophor aus dem anregbaren elektronischen Grundzustand heraus in den angeregten lumineszierenden Zustand anregt. Dann wird die Probe in dem Messbereich mit einer ein lokales Minimum aufweisenden I ntensitätsverteilung von Lumineszenzabregungslicht in Form von Emissionsstimulationslicht beaufschlagt, das den Luminophor zur Emission von Licht mit der Wellenlänge des Emissionsstimulationslichts, d . h . mit einer anderen Wellenlänge als derjen igen des Lumineszenzlichts stimuliert und damit wieder in seinen Grundzustand abgeregt. Wenn das Lumineszenzabregungslicht den Luminophor aus dem angeregten lumineszierenden Zustand überall außerhalb des lokalen Minimums durch stimulierte Emission wieder abgeregt hat, kann anschließend aus dem Messbereich emittiertes Lumineszenzlicht n ur aus dem lokalen Mi ni mu m der I ntensitätsverteil u ng des Lumineszenzabregungsslichts stammen und damit der Position des lokalen Minimums in der Probe zugeordnet werden.
Bei dem unter dem Stichwort STED bekannten Verfahren wird auch praktisch eine sehr hohe Ortsauflösung mit hohem Kontrast beim Abbilden einer mit dem Luminophor markierten Struktur einer Probe erreicht. Dabei wird der Luminophor jedoch erheblich photochemisch belastet und neigt daher stark zum Bleichen . Ursache ist, dass das Lumineszenzabregungslicht, das zum Einengen des lokalen Minimums in Form einer Nullstelle seiner I ntensitätsverteilung mit hoher absoluter Intensität aufgebracht werden muss, den bereits in seinem angeregten lumineszierenden Zustand befindlichen Luminophor beaufschlagt. Da h er si n d n eben d er gewünschten stimulierten Emission, die den Luminophor in seinen Grundzustand zurückführt, auch andere Vorgänge, insbesondere weitergehende und zum Bleichen führende elektronische Anregungen des Luminophors, nicht unwahrscheinlich. Auch erneute Anregungen des durch stimulierte Emission zunächst abgeregten Luminophors können durch das eigentlich zur Lumineszenzabregung vorgesehene Licht auftreten.
Ein weiteres Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe ist als GSD (Ground State Depletion)-Rasterfluoreszenzlicht- mikroskopie bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren wird der Luminophor, bevor er m it Lumineszenzanregungslicht beaufschlagt wird, mit Lumineszenzverhinderungslicht beaufschlagt, das eine Intensitätsverteilung mit einem lokalen Minimum aufweist. Das Lumineszenzverhinderungslicht überführt den Luminophor in einen Dunkelzustand, z. B. einen langlebigen Triplettzustand, aus dem heraus er mit dem Lumineszenzanregungslicht nicht in einen lumi- neszierenden Zustand angeregt wird . Überall außerhalb des lokalen Minimu ms der I ntensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts erfolgt diese Überführung in den Dunkelzustand bis zur Sättigung. D. h . , nu r in dem lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts liegt der Luminophor nach der Beaufschlagung mit dem Lumineszenzverhinderungslicht noch in seinem elektronischen Grundzustand vor, aus dem heraus er mit dem Lumineszenzanregungslicht in den lumineszierenden Zustand angeregt wird. Nach der Anregung mit dem Lumineszenzanregungslicht von dem Luminophor emittiertes Lumineszenzlicht stammt deshalb aus dem lokalen Minimum der I ntensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und kann daher der Position des lokalen Minimums in der Probe zugeordnet werden.
Auch bei dem unter dem Stichwort GSD bekannten Verfahren besteht eine erhebliche Gefahr des Bleichens des Luminophors, weil dieser in seinem langlebigen Dunkelzustand, in den er mit dem Lumineszenzverhinderungslichts überführt wird , in erhöhtem Maße zu chemischen Reaktionen beispielsweise mit Sauerstoff neigt und/oder der Gefahr ausgesetzt ist, dass er durch das Lumineszenzverhinderungslicht oder das Lumineszenzanregungslicht weiter angeregt wird, so dass es zu einem photochemischen Bleichen des Luminophors kommt.
Ein weiteres Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe ist als Variante von RESOLFT (Reversible Saturable Optical Flurorescence Transitions)-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie bekannt, die von sogenannten schaltbaren Luminophoren Gebrauch macht. Diese Luminophore sind mit Hilfe von Lumineszenzverhinderungslichts aus einem ersten Konformationszustand, in dem sie als Luminophore wirksam sind, in einen zweiten Konformationszustand umschaltbar, in dem sie nicht als Luminophore wirksam sind, d. h. in dem sie zumindest mit Hilfe des Lumineszenzanregungslichts, welches in dem ersten Konformationszustand zur Anregung des lumineszierenden Zustande geeignet ist, nicht in einen lumineszierenden Zustand anregbar sind, in welchem sie das als Messsignal registrierte Lumineszenzlicht emittieren. Um dieses Umschalten überall außerhalb eines lokalen Minimums einer I ntensitätsverteilung des Lumi- neszenzverh inderungslichts bis zu r Sättigung zu treiben , sind bei ausreichend langer Lebensdauer des zweiten Konformationszustands nur vergleichsweise geringe Lichtintensitäten erforderlich. Zudem besteht keine signifikante Gefahr, dass der in seinen anderen Konformationszustand überführte Luminophor aus diesem anderen Konformationszustand heraus bleicht, weil er in diesem Konformationszustand auf das Lumineszenzverhinderungslicht und das Lumineszenzanregungslicht nicht anspricht. ln der praktischen Umsetzung der RESOLFT-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie mit schaltbaren Luminophoren werden eine Ortsauflösung und ein Kontrast beobachtet, die hinter denjenigen bei der STE D-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie zurückbleiben. Dies mag darauf zurückzuführen sein, dass auch dann, wenn das Umschalten des schaltbaren Luminophors in seinen nicht lumineszenzfähigen Konformationszustand bis zur Sättigung getrieben wird, immer noch ein merklicher Anteil des Luminophors in seinem lumineszenzfähigen Konformationszustand ist.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe aufzuzeigen, bei dem die hohe Ortsauflösung und der hohe Kontrast von STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie erreicht werden und bei dem der Luminophor dennoch einer geringeren Gefahr des photochemischen Bleichens ausgesetzt ist als bei allen bislang bekannten Verfahren der STED-Raster- fluoreszenzlichtmikroskopie.
LÖSUNG Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe, werden alle für ein STED-rasterfluoreszenz- lichtmikroskopisches Verfahren charakteristischen Schritte durchgeführt; d. h., bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein spezielles Verfahren der STED- Rasterlumineszenzlichtmikroskopie: Die Probe wird in einem Messbereich mit Lumineszenzanregungslicht beaufschlagt, das den Luminophor aus einem anregbaren elektronischen Grundzustand in einen angeregten lumineszierenden Zustand anregt. Die Probe wird in dem Messbereich weiterhin mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Lumineszenzabregungslicht beaufschlagt, das den Luminophor aus dem angeregten lumineszierenden Zustand ohne Emission von Lumineszenzlicht in den anregbaren elek- tronischen Grundzustand zurückbringt. Aus dem Messbereich emittiertes Lumineszenzlicht wird registriert; und das registrierte Lumineszenzlicht wird der Position des lokalen Minimums in der Probe zugeordnet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Probe in dem Messbereich vor dem Beauf- schlagen mit dem Lumineszenzanregungslicht zusätzlich mit einer Intensitätsverteilung von Anregungsverhinderungslicht beaufschlagt, das den Luminophor aus dem anregbaren elektronischen Grundzustand in einen Schutzzustand überführt. In diesem Schutzzustand ist der Luminophor vor elektronischen Anregungen durch das Lumineszenzanregungslicht und das Lumineszenzabregungslicht geschützt. Die Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungs- lichts weist ebenfalls ein lokales Minimum auf, das mit dem lokalen Minimum der I ntensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts überlappt.
Das erfindungsgemäße Verfahren u mfasst dam it auch d ie Sch ritte, wie sie bei ei nem RESOLFT-rasterfluoreszenzlichtmikroskopischen Verfahren angewandt werden, das von einem schaltbaren Luminophor Gebrauch macht. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch primär nicht versucht, die effektiv wirksame Punktabbildungsfunktion im Sinne einer erhöhten Ortsauflösung zu verbessern, indem zwei ortsauflösend wirksame Intensitätsverteilungen mit deckungsgleicher Nullstelle überlagert werden. Vielmehr wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren primär ausgenutzt, dass der Luminophor zum Beispiel bei einem RESOLFT- Verfahren mit schaltbarem Luminophor außerhalb des Minimums der Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts in einen Zustand überfü h rt wi rd , i n dem er durch das Lumineszenzanregungslicht und das Lumineszenzabregungslicht nicht elektronisch anregbar ist. Dieser Zustand wird hier als Schutzzustand des Luminophors bezeichnet.
Selbst wenn das lokale Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts bei dem erfindungsgemäßen Verfahren weniger scharf lokalisiert, d. h. größer ist als das lokale Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts, so verhindert das Anregungsverhinderungslicht effektiv das Bleichen des Luminophors durch das Lumineszenzanregungslicht und das Lumineszenzabregungslicht dort, wo diese ihre höchste gemeinsame Intensität aufweisen. Diese höchste gemeinsame Intensität des Lumineszenzanregungslichts und des Lumineszenzabregungslichts liegt nicht unmittelbar angrenzend an das lokale Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts sondern in gewissem Abstand dazu vor. In diesem Abstand zu dem lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts ist aber auch bei einem etwas größeren lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts der Luminophor bis zur Sättigung in seinen Schutzzustand überführt und damit vor einer elektronischen Anregung und einem daraus resultierenden Bleichen durch die hohen gemeinsamen Intensitäten des Lu mines- zenzanregungslichts und des Lumineszenzabregungslichts geschützt.
Dort, wo mit der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts die hohe Ortsauflösung und letztlich auch der hohe Kontrast realisiert wird, nämlich direkt angrenzend an das lokale Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts, ist die absolute Intensität des Lumineszenzabregungslichts viel geringer als in größerer Entfernung zu dem lokalen Minimum. Dass der Luminophor hier zumindest zu wesentlichen Anteilen nicht in seinem Schutzzustand ist, erhöht daher das Risiko des Bleichens des Luminophors nicht wesentlich.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können demnach die hohe Ortsauflösung und der hohe Kontrast, die bei der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie erreichbar sind, ohne die massive Gefahr des Bleichens des Luminophors realisiert werden, die für bisherige STED-Ver- fahren typisch ist. H ierfür ist es nicht erforderlich , dass das lokale Minimum der I ntensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts genauso klein ist wie das lokale Minimum des Lumineszenzabregungslichts. Damit ist es auch leichter, das lokale Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts mit dem lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts zur Überlappung zu bringen. D. h., ein gewisser Versatz zwischen den Zentren dieser Minima kann durch ein größeres lokales Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts kompensiert werden.
Es versteht sich, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Lumineszenzanregungslicht, das Lumineszenzabregungslicht u nd das Anregungsverhinderungslicht unterschiedliche Wellenlängen aufweisen können. Dabei können die Wellenlängen in Bezug auf das Ab- sorptionsspektrum des Luminophors so gewählt werden, dass der Luminophor mit dem jeweiligen Licht nur so wie vorgesehen überführt bzw. an- oder abgeregt wird und dabei keiner der anderen Übergänge angesprochen wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können das Lumineszenzabregungslicht und das Anregungsverhinderungslicht aber auch gleiche Wellenlängen aufweisen und gemeinsam auf die Probe aufgebracht werden. D. h. bei dem Lumineszenzabregungslicht und dem Anregungs- verhinderungslicht kann es sich um dasselbe Licht handeln. So kann bei Verwendung eines bekannten schaltbaren fluoreszierenden Proteins, wie beispielsweise rsEGFP oder rsEGFP2, als Luminophor eine gemeinsame Wellenlänge für das Anregungsverhinderungslicht und das Lumineszenzabregungslicht so gewählt werden, dass das Licht den Luminophor außerhalb des Minimums seiner Intensitätsverteilung sowohl mit einer gewissen ersten Wahrscheinlichkeit durch Schalten in seinen nicht zur Lumineszenz fähigen Schutzzustand als auch mit einer gewissen zweiten Wahrscheinlichkeit durch Stimulieren von Emission an der Emission von Lumineszenzlicht hindert. Auch bei diesem Vorgehen ergibt sich gegenüber einem reinen STE D-Verfahren, das sich nur stimulierter Emission zur Erhöhung der Ortsauflösung bedient, eine reduzierte Gefahr des Bleichens des Luminophors.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Lumineszenzanregungslicht in aller Regel in Pulsen auf die Probe aufgebracht. Das Anregungsverhinderungslicht und das Lumineszenzabregungslicht können grundsätzlich auch kontinuierlich auf die Probe aufgebracht werden. Insbesondere wenn das Lumineszenzabregungslicht kontinuierlich aufgebracht wird, ist es vorteilhaft, das Lumineszenzlicht mit zeitlicher Auflösung nach jedem Puls des Lumineszenzanregungslichts zu registrieren, um Ortsauflösung und Kontrast zu maximieren , wie d ies grundsätzlich aus der WO 2012/069076 A1 für ein STE D-Verfahren bekannt ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Anregungsverhinderungslicht den Luminophor mittels einer Konformationsänderung aus dem anregbaren elektronischen Grundzustand in den Schutzzustand überführen . D. h . , bei dem Luminophor kann es sich, wie bereits angesprochen wurde, um einen sogenannten schaltbaren Luminophor handeln. Dabei müssen die Eigenschaften dieses schaltbaren Luminophors nicht so ideal sein, wie es für RESOLFT- Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie erforderlich wäre, bei der die Ortsauflösung auf der Schaltbarkeit des Luminophors basiert. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Schaltbarkeit des Luminophors zumindest primär nicht für die Erhöhung der Ortsauflösung sondern für den Schutz des Luminophors vor den hohen gemeinsamen I ntensitäten des Lumineszenzanregungslichts und des Lumineszenzabregungslichts genutzt. Dieser Schutz wird bereits dann im Wesentlichen erreicht, wenn der Luminophor m it dem Anregungsverhinderungslicht nicht vollständig, aber doch im Wesentlichen in seinen Schutzzustand überführt wird. Anders gesagt sind auch schaltbare Luminophore bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar, die bei einem RESOLFT-Verfahren auf der Basis schaltbarer Luminophore nicht sinnvoll einsetzbar wären. Der mit dem Anregungsverhinderungslicht ausschaltbare Luminophor kann insbesondere ein schaltbares fluoreszierendes Protein sein.
Der mit dem Anregungsverhinderungslicht ausschaltbare Luminophor kann spontan aus seinem Schutzzustand in den anregbaren elektronischen Grundzustand zurückkehren. Wenn eine solche spontane Rückkehr nicht oder nur mit unzureichender Rückkehrrate auftritt, ist es sinnvoll, die Probe in dem Messbereich vor dem Beaufschlagen mit dem Anregungsverhinderungslicht mit einer Intensitätsverteilung von Anregungsermöglichungslicht zu beaufschlagen, das den Luminophor zumindest im Bereich des lokalen Minimums der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts definiert in den anregbaren elektronischen Grundzustand überführt. In aller Regel erfolgt diese Überführung in dem gesamten Messbereich, da sich die Intensitätsverteilung des Anregungsermöglichungslichts wegen der Beugungsgrenze nicht stärker fokussieren lässt.
Das erfi ndu ngsgemäße Verfahren ist jedoch nicht nu r unter Verwendu ng schaltbarer Luminophore durchführbar. So kann das Anregungsverhinderungslicht den anregbaren elektro- nischen Grundzustand des Luminophors au ch so stören, dass der Luminophor in dem Schutzzustand einen um mindestens einen Faktor 2 reduzierten Absorptionsquerschnitt für das Lumineszenzanregungslicht aufweist, um ihn in den Schutzzustand zu überführen. In diesem Fall ist der Schutzzustand der gestörte elektronische Grundzustand des Luminophors, in dem die Störung, insbesondere der sterischen Ordnung der Atome des Luminophors, seine Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem Lumineszenzanregungslicht und möglichst auch mit dem Lumineszenzabregungslicht signifikant reduziert. Eine solche Störung des elektronischen Grundzustands des Luminophors kann durch Übertragung von Bewegungsimpulsen und/oder Schwingungen herbeigeführt werden. Solche Bewegungsimpulse und/oder Schwingungen können von einer Stoß- oder Vibrationsrelaxation einer mit dem Anregungsverhinderungslicht angeregten Modulatoreinheit oder auch einer mit dem Anregungsverhinderungslicht angeregten cis-trans-lsomerisierung der Modulatoreinheit ausgehen. Die Modulatoreinheit kann ein Molekül oder eine chemische Gruppe sein, die räumlich und/oder chemisch an den Luminophor gekoppelt sein, um die gewünschte Bewegungsimpuls- und/oder Schwingungsübertragung sicherzustellen. Die Störung des elektronischen Grundzustands des Luminophors, durch die er in den Schutzzustand überführt wird, kann auch als Erhöhung der Vibrationsenergie des Luminophors in seinem elektronischen Grundzustand interpretiert werden, wobei es sich jedoch nicht um einen Energiezustand im thermischen Gleichgewicht mit der Umgebung des Luminophors handelt. Vielmehr wird die Energie des Luminophors durch die von der Modulatoreinheit übertragenen Bewegungsimpulse und/oder Schwingungen gegenüber dem thermischen Gleichgewicht mit seiner Umgebung erhöht. Diese Störung des Grundzustands, die der gewünschten Überführung des Luminophors in seinen Schutzzustand entspricht, geht wieder verloren, sobald sich durch weitere molekulare Übertragungen von Bewegungsimpulsen und/oder Schwingungen wieder ein thermisches Gleichgewicht zwischen dem Luminophor und seiner Umgebung einstellt. Um den Schutzzustand in Form des gestörten elektronischen Grundzustands zu nutzen, muss das Lumineszenzanregungslicht und vorzugsweise auch das Lumineszenzabregungslicht noch während des Fortbestehens der Störung des elektronischen Grundzustands des Luminophors auf die Probe aufgebracht werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Element die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Element, zwei Elemente oder mehr Elemente vorhanden sind. Diese Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, aus denen das jeweilige Erzeugnis besteht.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Um- fangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter erläutert und beschrieben. Fig. 1 illustriert die Verfahrensschritte eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe; und
Fig. 2 illustriert die Verhältnisse beim Beaufschlagen der Probe mit Lumineszenzab- regungslicht im Schritt (c) gemäß Fig. 1.
FIGURENBESCHREIBUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor 1 aufweisenden Struktur 2 einer Probe 3 wird die Probe 3 gemäß Fig. 1 (a) mit Anregungsverhinderungslicht 4 beaufschlagt, das den Luminophor 1 in einen Schutzzustand überführt. Diese Überführung erfolgt über einen Messbereich 5 der Probe hinweg mit Aus- nähme eines lokalen Minimums 6 der Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts 4. In diesem lokalen Minimum 6 verbleibt der Luminophor 1 in einem zur Lumineszenz anregbaren elektronischen Grundzustand.
Gemäß Fig. 1 (b) wird die Probe 3 in dem gesamten Messbereich 5 einschließlich des lokalen Minimums 6 mit Lumineszenzanregungslicht 7 beaufschlagt, das den Luminophor 1 , soweit er sich nicht in seinem Schutzzustand befindet, aus seinem elektronischen Grundzustand in einen angeregten lumineszierenden Zustand überführt. Dies bedeutet, dass nur der in dem Bereich des lokalen Minimums 6 des Anregungsverhinderungslichts 4 befindliche Luminophor 1 in den lumineszierenden Zustand angeregt wird.
Gemäß Fig. 1 (c) wird die Probe 3 in dem Messbereich 5 mit Lumineszenzabregungslicht 8 beaufschlagt, diesmal wieder mit Ausnahme eines lokalen Minimums 9 der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts 8, die mit dem lokalen Minimum 6 des Anregungsverhinderungslichts 4 gemäß Fig. 1 (a) überlappt. Das Lumineszenzabregungslicht 8 überführt den Luminophor 1 überall außerhalb des lokalen Minimums 9 seiner I ntensitätsverteilung aus seinem angeregten lumineszierenden Zustand zurück in seinen elektronischen Grundzustand. Dabei ist das lokale Minimum 9 kleiner als das lokale Minimum 6. D. h., wo sich nach dem Schritt gemäß Fig. 1 (c) noch Luminophor 1 in seinem lumineszierenden Zustand befindet, hängt von der Lage des lokalen Minimums 9 ab.
Wenn anschließend gemäß Fig. 1 (d) Lumineszenzlicht 10 aus dem Messbereich 5 registriert wird, kann dieses der Position des lokalen Minimums 9 der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts 8 gemäß Fig. 1 (c) zugeordnet werden. Durch Abtasten der Probe mit dem Messbereich 5 bzw. mit dem lokalen Minimum 9 wird die Konzentrationsverteilung des Luminophors 1 in der Probe 3 erfasst und so auch die Struktur 2 in der Probe abgebildet. Um dieses Scannen zu ermöglichen, muss der Luminophor nicht nur aus seinem angeregten lumineszierenden Zustand sondern auch aus seinem Schutzzustand schnell in seinen anregbaren elektronischen Grundzustand zurückkehren. Wenn dies in Bezug auf den Schutzzustand nicht zutrifft, kann vor der Wiederholung der Schritte gemäß Fig. 1 (a) bis (d) an der nächsten Position des Messbereichs 5 bzw. des lokalen Minimums 9 der Luminophor 1 in dem Messbereich 5 mit Anregungsermöglichungslicht beaufschlagt werden, das ihn aus seinem Schutzzustand definiert zurück in seinen anregbaren elektronischen Grundzustand überführt. Fig. 2 illustriert die Intensitätsverteilungen des Lumineszenzanregungslichts 7 und des Lumineszenzabregungslichts 8 sowie die Wahrscheinlichkeit 1 1 , dass sich der Luminophor 1 nach der Beaufschlagung mit dem Anregungsverhinderungslicht 4 gemäß Fig. 1 (a) noch in seinem anregbaren elektronischen Grundzustand, d. h. nicht in seinem Schutzzustand befindet, in einem Schnitt durch den Messbereich 5. Überall außerhalb des lokalen Minimums 6 gemäß Fig. 1 (a) weist die Wahrscheinlichkeit 1 1 nur einen kleinen Wert auf, der nahe null liegt. D. h., nur innerhalb des lokalen Minimums 6 ist der Luminophor noch in seinem anregbaren elektronischen Grundzustand, und überall außerhalb des lokalen Minimums 6 befindet er sich höchstwahrscheinlich in seinem Schutzzustand. Die Intensitätsverteilungen des Lumineszenzanregungslichts 7 und des Lumineszenzabregungslichts 8 weisen ihre maximale gemeinsame Intensität außerhalb des lokalen Minimums 6 auf. D. h., die gemeinsame maximale Intensität trifft dort auf den Luminophor, wo er sich in seinem Schutzzustand befindet und entsprechend nicht photochemisch gebleicht werden kann. Innerhalb des lokalen Minimums 6, wo die Wahrscheinlichkeit 1 1 deutlich größer als null ist, wirkt neben dem Lumineszenzanregungslicht 7 nur eine geringe Intensität des Lumineszenzabregungslichts 8 auf den Luminophor ein, die einen weit unter dem absoluten Maximum dieser Intensität bleibenden Wert lmax nicht überschreitet. Diese geringe Intensität ist zwar für das STED-typische Einengen des lumi- neszierenden angeregten Zustand des Luminophors auf das lokale Minimum 9 ausreichend, aber nicht für das STED-typische Bleichen des Luminophors, das bei den hohen absoluten gemeinsamen Intensitäten des Lumineszenzanregungslichts 7 und des Lumineszenzabregungslichts 8 auftritt. So werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zwar die hohe Ortsauflösung und der hohe Kontrast eines STED-Verfahrens erreicht, ohne jedoch die damit üblicherweise verbundene Gefahr des Bleichens des Luminophors in Kauf nehmen zu müssen.
Die hier gezeigten räumlichen Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungslichts 4 und des Lumineszenzabregungslichts 8 um die lokalen Minima 6, 9 sind nur beispielhaft. Diese Intensitätsverteilungen können jede beliebige Form in jeder Raumrichtung annehmen, wie sie auf dem Gebiet der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie bekannt sind.
BEZUGSZEICHENLISTE Luminophor
Struktur
Probe
Anregungsverhinderungslicht
Messbereich
lokales Minimum
Lumineszenzanregungslicht
Lumineszenzabregungslicht
lokales Minimum
Lumineszenzlicht
Wahrscheinlichkeit

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor (1 ) aufweisenden Struktur (2) einer Probe (3),
- wobei die Probe (3) in einem Messbereich (5) mit Lumineszenzanregungslicht (7) beauf- schlagt wird , das den Luminophor (1 ) aus einem anregbaren elektronischen Grund- zustand in einen angeregten lumineszierenden Zustand anregt;
- wobei die Probe (3) in dem Messbereich (5) mit einer ein lokales Minimum (9) auf- weisenden Intensitätsverteilung von Lumineszenzabregungslicht (8) beaufschlagt wird, das den Luminophor (1 ) aus dem angeregten lumineszierenden Zustand in den an- regbaren elektronischen Grundzustand zurückbringt;
- wobei aus dem Messbereich (5) emittiertes Lumineszenzlicht (10) registriert wird und - wobei das registrierte Lumineszenzlicht (10) der Position des lokalen Minimums (9) in der Probe (3) zugeordnet wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (3) in dem Messbereich (5) vor dem Beaufschlagen mit dem Lumineszenzanregungslicht (7) mit einer Intensitätsverteilung von Anregungsverhinde- rungslicht (4) beaufschlagt wird, das den Luminophor (1 ) aus dem anregbaren elektronischen Grundzustand in einen Schutzzustand überführt, in welchem der Luminophor (1 ) vor elek- tronischen Anregungen durch das Lumineszenzanregungslicht (7) und das Lumineszenz- abregungslicht (8) geschützt ist, wobei die Intensitätsverteilung des Anregungsverhinderungs- lichts (4) ein lokales Minimum (6) aufweist, das mit dem lokalen Minimum (9) der Intensitäts- Verteilung des Lumineszenzabregungslichts (8) überlappt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, d ass das Lumineszenz- anregungslicht (7), das Lumineszenzabregungslicht (8) und das Anregungsverhinderungslicht (4) unterschiedliche Wellenlängen aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, d ass das Lumineszenz- abregungslicht (8) und das Anregungsverhinderungslicht (4) gleiche Wellenlängen aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, d ass das Lumineszenz- abregungslicht (8) und das Anregungsverhinderungslicht (4) gemeinsam auf die Probe (3) aufgebracht werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzanregungslicht (7) in Pulsen auf die Probe (3) aufgebracht wird und dass das Anregungsverhinderungslicht (4) u n d d as Lumineszenzabregungslicht (8) unabhängig voneinander in Pulsen oder kontinuierlich auch die Probe (3) aufgebracht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (10) mit zeitlicher Auflösung nach jedem Puls des Lumineszenzanregungslichts (7) registriert wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungsverhinderungslicht (4) den Luminophor (1 ) mittels einer Konformationsänderung aus dem anregbaren elektronischen Grundzustand in den Schutzzustand überführt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Luminophor (1 ) ein mit dem Anregungsverhinderungslicht (4) ausschaltbarer Luminophor (1 ) ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Luminophor (1 ) ein schaltbares fluoreszierendes Protein ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (3) in dem Messbereich (5) vor dem Beaufschlagen mit dem Anregungsverhinderungs- licht (4) mit einer Intensitätsverteilung von Anregungsermöglichungslicht beaufschlagt wird, das den Luminophor (1 ) zumindest im Bereich des lokalen Minimums (9) der Intensitätsverteilung des Lumineszenzabregungslichts (8) in den anregbaren elektronischen Grundzustand über- führt.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungsverhinderungslicht (4) den anregbaren elektronischen Grundzustand des Lumi- nophors (1 ) so stört, um ihn in den Schutzzustand zu überführen, dass der Luminophor (1 ) in dem Schutzzustand einen um mindesten einen Faktor (2) reduzierten Absorptionsquerschnitt für das Lumineszenzanregungslicht (7) aufweist.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, d ass der elektronische Grundzustand des Luminophors (1 ) durch Übertragung von Bewegungsimpulsen und/oder Schwingungen gestört wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegungsimpulse und/oder Schwingungen von einer mit dem Anregungsverhinderungslicht (4) angeregten Modu- latoreinheit ausgehen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass in dem gestörten elektronischen Grundzustand eine atomare Ordnung in dem Luminophor (1 ) gestört ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Luminophor (1 ) in dem gestörten elektronischen Grundzustand nicht in einem thermischen Gleichgewicht befindet.
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