WO2014106988A1 - 신경세포 보호를 위한 안토시아닌의 용도 - Google Patents

신경세포 보호를 위한 안토시아닌의 용도 Download PDF

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cell death
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김명옥
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention is a method for protecting nerve cells from the death of nerve cells induced by kininic acid by pre-treatment of anthocyanin to the nerve cells, and for protecting nerve cell death induced by kainic acid containing anthocyanin as an active ingredient. It relates to a composition.
  • Excitotoxicity and neuronal excitation are important mechanisms and are important factors in the recognition of excited glutamic acid receptors and many neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease, Parkinson's disease and Huntington's disease. The exact mechanism of these neurodegenerative diseases is not yet clear, but it is assumed that excitatory cytotoxicity may be involved.
  • Antioxidants have been extensively studied as potential therapeutic agents for various neurodegenerative diseases. This is why the present inventors have been interested in plant-derived anthocyanin extracted from Korean black soybean as an effective protective agent against KA-induced neuronal cell death.
  • Anthocyanin contained in black soybeans is a common substance in higher plants, and it belongs to the flavonoid family, which is the color of flowers, fruits, and fruits, and is a pigment present in plant vacuoles.
  • Anthocyanins are red, purple, and green depending on the hydrogen ion concentration of the plant. Its functions are known to include UV protection and insect invasion protection for protecting plant tissue cells from UV rays. In the process of food metabolism in our body, free radicals are generated.
  • the generated harmful oxygen reacts with the tissue cells of the body, which is called cell oxidation. It is well known that when a cell is oxidized, the cell is destroyed and causes various diseases or cancer caused by DNA degeneration. A substance that binds harmful oxygen to prevent cellular oxidation is called an antioxidant and its action is called an antioxidant action.
  • Known antioxidants include vitamin C, vitamin E, and beta-carotene, and in recent years, anthocyanins have received attention from the medical community as potent bio-antioxidants, anti-inflammatory and anti-neuroplastic substances. Plants rich in anthocyanins are known as purple carrots, cranberries, blueberries, etc., but the memory of anthocyanins and dementia improvement effects have not been known until now.
  • the present inventors studied natural antioxidants (anthocyanins) containing cyaniding-3-glucoside (C3G) extracted from black soybeans, and then kainic acid (KA) as a main component thereof.
  • anthocyanins natural antioxidants
  • C3G cyaniding-3-glucoside
  • KA kainic acid
  • One object of the present invention is to provide a method of pretreating anthocyanins to neurons to protect neurons from the death of neurons induced by kininic acid.
  • the anthocyanins of the present invention have an effect of protecting neurons from the death of neurons induced by chianoic acid, and thus can be used for drug development and research on the prevention of neurodegenerative diseases related thereto.
  • FIGS. 1A-1D show the effect on cell viability in HT-22 cells (FIGS. 1A and 1C) and hippocampal neurons (FIGS. 1B and 1D) by KA treatment.
  • Figures 1a and 1b shows the difference in viability by the MTT experiment
  • Figures 1c and 1d show the change in the expression level of caspase-3 via Western blot.
  • Figure 2 shows the inhibitory effect of the increase in anthocyanin Ca 2+
  • Figure 2 A shows HT-22 cells
  • B shows the changes in primary fetal neurons.
  • Figure 3 shows the inhibitory effect of anthocyanin on ROS production by KA treatment in HT-22 cells.
  • Figure 4 shows the inhibitory effect of anthocyanin on the activity of AMPK by KA treatment
  • Figure 4A shows HT-22 cells
  • B shows changes in primary fetal neurons.
  • Figures 5a and 5b show the effect of anthocyanin on the expression of Bax and Bcl-2 proteins by KA treatment
  • Figure 5a shows HT-22 cells
  • Figure 5b shows changes in primary fetal neurons.
  • FIG. 6a and 6b show the inhibitory effect of anthocyanin on cytochrome c increase and caspase-3 activity of cytoplasm by KA treatment
  • FIG. 6a shows changes in HT-22 cells
  • FIG. 6b in primary fetal neurons Indicates.
  • FIG. 7A and 7B show the inhibitory effect of anthocyanin on apoptosis by KA treatment in HT-22 cells (FIG. 7A) and primary fetal neurons (FIG. 7B), respectively.
  • the present invention provides a method for pretreating anthocyanin to nerve cells to protect the nerve cells from the death of nerve cells induced by chianoic acid. Specifically, (a) pre-treating anthocyanin to neurons; And (b) treating the nerve cells with kainic acid, which can provide a method of protecting the nerve cells from the death of the nerve cells induced by the kininic acid.
  • nerve cell refers to a major cell constituting the nervous system, a cell that controls the action of other cells including muscle, and unlike other cells, transmits a signal by an electrical method and is no longer provided after the end of development. It means a cell that does not divide. In this way, the nerve cells are almost impossible to recover from damage due to the limitation of the number of divisions, and therefore, it is important to allow normal division to perform normal functions when they occur.
  • the neuronal protective effect using the method of the present invention can protect all neurons irrespective of the location or size of the neurons present, more preferably the neurons may be fetal neurons, even more Preferably, the cells may be neurons present in the hippocampal region or the cerebral cortical region of the fetal brain.
  • the neurons may be fetal neurons, even more
  • the cells may be neurons present in the hippocampal region or the cerebral cortical region of the fetal brain.
  • primary hippocampal neurons of cerebral hippocampus of rat fetuses sacrificed and separated from the amniotic membrane were sacrificed at 17.5 days of gestation, and the neural cells in the HT-22 cell line were used. The protective effect was confirmed.
  • the term "fetal" refers to a fluid that grows in the mother's mother, and there are rats, rabbits, horses, cows, sheep, dogs, cats, and monkeys, and the like. no.
  • the fetus of the present invention may be a fetus of a rat or a human as a fetus of a mammal.
  • such fetuses may be classified into embryos, which are early fetuses, and fetuses, which are fetuses after mid-pregnancy, depending on the gestational age and the degree of fetal development of the mother.
  • the fetus of the present invention is a fetus at the time of neural cell development and growth, in particular an embryo at early pregnancy, known as the early stage of neurogenesis.
  • the effect of anthocyanin in rats 17.5 days of pregnancy corresponding to the initial gestation period was confirmed.
  • anthocyanin refers to a pigment component present in many parts having a fine color in a flower or fruit peel of a plant, and mainly represents red, blue, purple, and the like. This is a compound in which a specific hydroxy group and various functional groups such as alcohols, phenols, and aldehydes in the sugar form an ether bond. Usually, acid turns red and fades quickly. It is known that flowers show a beautiful color tone because the anthocyanins form various complex complexes with metal salts such as potassium and magnesium in plants.
  • the step (a) is a step of pre-treating anthocyanin to the nerve cells, which is a step that can substantially act to protect the nerve cells.
  • the anthocyanin of the present invention serves to protect nerve cells by preventing neuronal cell death that may be caused by the treatment of kinic acid in step (b).
  • anthocyanin increases the cell viability by protecting the neurons from the death of neurons induced by the chininic acid (Fig. 1a and 1b), Ca 2 which can be broken by the kininic acid + It was confirmed that there is an effect that can maintain and restore homeostasis (Fig. 2).
  • anthocyanins may inhibit neuronal cell death through ROS inhibition, and treatment of chinic acid in the phosphorylation of AMPK, apoptosis marker, Bax: Bcl-2 protein ratio, cytochrome c secretion, and caspase-3 activity.
  • Figs. 4 to 6b it was confirmed that the anthocyanin is effective in the protection of neurons induced by the chianoic acid.
  • the step (b) is a step of (b) treating the nerve cell with the kininic acid, the step of inducing excitatory cytotoxicity to the neurons protected by the pretreatment of anthocyanin.
  • the treatment of kininic acid on neurons induces excitatory cytotoxicity through reduction of cell viability, abnormality of Ca 2+ homeostasis, increase of ROS-positive cells, etc., and ultimately has neuronal cell death effects.
  • the anthocyanin can be inhibited through the pretreatment, it was confirmed that the anthocyanin pretreatment had an effect of protecting the neuron from the killing of neurons induced by the kininic acid.
  • the neuronal protective effect in the present invention can be achieved by the following process.
  • the present invention provides a composition for protecting neuronal cell death induced by chiinic acid, comprising anthocyanin as an active ingredient.
  • anthocyanin pretreatment has an effect of protecting the neurons against the death of neurons induced by kinic acid
  • nerve cell death is achieved through the neuron protective effect. It can be used as a composition for inhibiting use.
  • the anthocyanin of the present invention serves to protect neurons, thereby preventing neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's disease, and Huntington's disease.
  • compositions containing anthocyanins of the present invention as an active ingredient may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier a binder, a suspending agent, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a coloring matter, a flavoring agent, etc. may be used for oral administration.
  • bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms.
  • Others may be formulated into solutions, suspensions, tablets, herbs, capsules, sustained release preparations and the like.
  • Suitable carriers, excipients, and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • oral, intravenous, subcutaneous, intradermal, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, etc. of the compositions of the present invention can be administered using a variety of methods, the dosage varies depending on the age, sex, and weight of the patient And can be readily determined by one skilled in the art.
  • the composition of the present invention may be administered orally or parenterally.
  • the dosage of the composition may be determined by a person skilled in the art according to the type of drug, which is the active ingredient, together with various related factors such as the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like, and thus the scope of the present invention Is not limited.
  • GD 0.5 gestational day
  • Cultures were prepared in prenatal rat fetal hippocampus at 17.5 gestation (GD 17.5) days. The resulting hippocampal tissue was treated with 0.25% trypsin-EDTA for 20 minutes and separated by mechanical grinding in an ice cold calcium and magnesium free Hank's balanced salt solution (pH 7.4). After pelleting by centrifugation, cells were plated (1 ⁇ 10 6 cells / ml) in a culture dish pre-coated with poly-lysine (0.02 g / l) and chamber slides.
  • Culture medium was 10% heat inactivated fetal bovine serum, 1 mM pyruvic acid, 4.2 mM sodium bicarbonate, 20 mM HEPES, 0.3 g / l bovine serum albumin, 50 U / ml penicillin and 50 mg / l Incubation was continued in DMEM containing streptomycin. Cell culture was carried out at 37 ° C. with 5% CO 2 and 95% humidified air. Glial cells were inhibited for 12 hours in a medium containing 100 ⁇ M cytosine ⁇ -D-Arabino Furanoside (Sigma).
  • HT-22 cells (subclone of HT4 derived from rat hippocampus) were cultured in high glucose DMEM (Invitrogen, Karlsruche, Germany) medium containing 10% FBS, 1% antibiotic. Cells were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% humidified air.
  • HT-22 and primary hippocampal neuronal cells were divided into 5 groups and cultured for 5 days:
  • Control cells were cultured in normal DMEM medium; 2) Treatment with kininic acid (KA) only: 100 ⁇ M for 12 hours; 3) only anthocyanin (Antho) treatment: 0.2 mg / ml for 12 hours; 4) Antho + KA treatment: cells were pretreated with anthocyanin (0.1 mg / ml) for 12 hours followed by KA (100 ⁇ M for 12 hours); 5) Antho + KA Treatment: Cells were pretreated with anthocyanin (0.2 mg / ml) followed by KA (100 ⁇ M for 12 hours).
  • the cells were cultured for 5 days and used for the experiment.
  • Example 6 Free Ca in Cells 2+ KA-Induced Ca of Anthocyanin by Measurement 2+ Confirmation of inhibitory effect on homeostasis
  • Ca 2+ concentrations in the cytoplasm regulate the secretion of neurotransmitters and neuronal development, and their incorrect regulation results in neuronal death.
  • Abnormal Ca 2+ homeostasis is associated with apoptosis of neurons.
  • Intracellular Ca 2+ concentrations were measured with Fura-2 acetoxymethyl ester, a fluorescent Ca 2+ indicator.
  • both HT-22 cells and primary hippocampal neurons were treated with normal medium (control), KA (100 ⁇ M), antho (0.1 mg / ml), pretreated KA (100 ⁇ M), antho (0.2 mg / ml) Pretreated KA (100 ⁇ M) was treated.
  • cultured neurons including 1 X 10 6 cells
  • the cells were washed twice with Locke's solution (pH 7.8) and the Fura-2 fluorescence signal of [Ca +2 ] c was measured with a luminescence spectrophotometer (LS50B, Perkin Elmer, Boston, Mass.).
  • the stimulus light of the Xenon lamp is converted between 340 and 380 nm band-pass filters and the fluorescence is emitted at 510 nm using a photon-counting photomultiplier. Measured.
  • the 340 nm / 380 nm fluorescence ratio was measured over an average of 2 seconds. Fluorescence signals were collected, stored and analyzed using conventional imaging software or MicroVax II computers and origin 7 software. Intercellular calcium was determined by the ratio of the method described above and the Grynkiewicz equation.
  • Kd dissociation constant of Fura-2 Ca 2+ interaction at 225 nM in the cytoplasmic environment
  • R fluorescence ratio at 340 and 380 nm
  • Rmin ratio of zero Ca 2+
  • Rmax ratio of saturated Ca 2+ (using calcium chloride)
  • Sf2 fluorescence at 380 nm of zero Ca 2+
  • Sb2 Fluorescence at 380 nm of saturated Ca 2+
  • the KA treated group increased free Ca 2+ concentration in the cytoplasm of HT-22 cells up to about 1005 ⁇ 6.37 mM compared to the maximum of 705 ⁇ 8.06 nM of the control group.
  • the Ca 2+ peak concentrations were restored to 677 ⁇ 6.19 nM and 617 ⁇ 4.32 nM, respectively (FIG. 2A).
  • Similar trends were observed in primary neurons, and the KA-treated group had a peak concentration of Ca 2+ of 1000 ⁇ 2.45 mM, compared to the peak concentration of 700 ⁇ 5.06 mM in the control group.
  • the two groups treated with KA after anthocyanin pretreatment recovered to 940 ⁇ 3.21 nM and 705 ⁇ 3.99 nM, respectively (B of Figure 2).
  • anthocyanin inhibits KA-induced neuronal cell death by inhibition of ROS production.
  • DCFH-DA 2,7-dihydrodichlorofluorescein diacetate
  • DCF dichlorofluorecein
  • HT-22 and prenatal rat hippocampal neurons were grown to a density of 80% on a glass chamber slide (Lab-Tek Chamber slide USA), washed with PBS, 0.1 mg / ml and 0.2 anthocyanin prior to 12 hours of KA exposure. Incubated at mg / ml for 12 hours. Cells were washed with PBS, DMSO containing 50 ⁇ M DCFH-DA and incubated at 37 ° C. for 30 minutes in dark conditions.
  • Protein concentration was measured using the Bio-Rad protein assay solution. The same amount of protein (30 ⁇ g per sample) was electrophoresed at 7.5-15% SDS-PAGE gel under reducing conditions and transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, USA). A wide range of (7-240 kDa, multi color, Elpis Biotech Korea) prestained protein markers were run in parallel to determine the molecular weight of the protein.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the membrane was blocked with 5% (w / v) skim milk powder to reduce non-specific binding and the rabbit-derived anti-Bcl-2, anti-Bax, and goat-derived polyclonal anti-cytochrome c (1: Immunoblotting was performed with Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Anti-caspase-3, anti-AMPK, anti-pAMPK rabbit derived antibodies were used for immunoblotting (1: 500; Cell Signaling Technology). Anti- ⁇ actin antibody (1: 1000; Sigma, St. Louis, Mo., USA) was used as a control to confirm uniform loading.
  • the membrane was probed with goat-derived horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and immunized
  • the complex was visualized using a chemiluminescence ECL-detecting reagent spray.
  • X-ray films were scanned and the optical blot optical density was analyzed by densitometry using a computer-based Sigma Gel, version 1.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
  • KA treatment in both HT-22 cells and primary neurons increased phosphorylation of AMPK ⁇ -Thr172 without affecting the total AMPK amount.
  • KA increases Thr172 phosphorylation of AMPK ⁇ , which can be used as an indicator of AMPK activity.
  • pretreatment of anthocyanin inhibited phosphorylation of AMPK ⁇ by KA in both cells (A and B of FIG. 4).
  • Pre-apoptotic Bax protein and anti-apoptotic Bcl-2 protein are members of the Bcl-2 family and are important regulators of apoptosis processes in the mitochondria.
  • An increase in Bax induces the release of pro-apototic factors of mitochondria. Transition to apoptosis was measured by increasing and decreasing the ratio of Bax (pre-apoptotic protein) and Bcl-2 (anti-apoptotic protein) expression.
  • TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling
  • PI propidium iodide
  • Each anthocyanin was pretreated for 12 hours and then treated with KA for 12 hours, then the chamber slides were fixed with 4% paraformaldehyde and washed with 1 ⁇ phosphate buffered saline. Cells were then permeated with 1% Triton X-100.
  • the TNUEL procedure was performed using a Dead-End fluorometric tunel system (Promega). After TUNEL staining, the slide was treated with PBS containing 1 ⁇ g / ml PI freshly prepared at room temperature for 15 minutes, and then rinsed with distilled water. The glass cover slip was mounted on the glass glass with mounting medium.
  • TUNEL-positive (green) and PI-positive (red) forms were obtained using a multifocal laser scanning microscope (Fluoview FV 1000, Olympus, Japan). The number of TUNEL positive cells (green) and PI positive cells (red nuclear staining) was visually counted. All samples analyzed at least two biological copies and three images were taken from each copy to count TUNEL and PI positive cells at 60x magnification. The percentage of TUNEL positive cells was calculated as (TUNEL positive cells / total cell number) X100.
  • anthocyanins of the present invention have an effect of inhibiting the death of fetal neurons induced by chiinic acid (KA) or protecting neurons from cell death.

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Abstract

본 발명은 신경세포에 안토시아닌을 전처리하여 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 방법, 및 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 카이닌산(kainic acid)에 의해 유도된 신경세포 사멸 보호용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 안토시아닌은 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 효과를 가짐으로써, 이와 관련된 신경퇴행성 질환의 예방에 관한 약물 개발 및 연구에 이용될 수 있다.

Description

신경세포 보호를 위한 안토시아닌의 용도
본 발명은 신경세포에 안토시아닌을 전처리하여 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 방법, 및 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 카이닌산(kainic acid)에 의해 유도된 신경세포 사멸 보호용 조성물에 관한 것이다.
생명과학 및 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균 수명이 늘어나며, 장노년 인구의 비중이 점차 늘어남에 따라 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있다. 특히 노인성 신경계 질환들, 예컨대 뇌졸증 (stroke), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병 (Parkinson's disease, PD)은 치명적인 신경계의 기능장 애로 나타나는데, 이를 막을 수 있는 효과적인 방법이 없는 현 실정에서는 삶의 질저하 및 막대한 의료비의 지출 등으로 주변 가족에게 상당한 정신적인 부담을 주고 있다. 이러한 문제의 심각성을 인지하여 세계 각국은 범국민적인 관심속에 집중적인 해결방안을 모색하고 있다.
흥분세포독성 (excitotoxicity)과 신경세포의 흥분은 중요한 기작으로서 흥분 글루탐산 수용체의 인식과 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병을 포함하는 다수의 신경변성질환 (neurodegenerative disease)의 중요한 요인이다. 이들 신경변성질환의 정확한 기작은 아직 명확하게 밝혀지지는 않았지만 흥분세포독성이 관여할 것이라고 추정된다.
한편, 항산화제 (antioxidants)는 다양한 신경변성질환의 잠재적인 치료제로서 광범위하게 연구되어 왔다. 이 점이 본 발명자가 한국산 검정콩에서 추출한 식물 유래 안토시아닌을 KA-유도 신경세포 죽음에 대한 효과적인 보호제로서 관심을 갖게 한 이유이다. 검정콩에 포함된 안토시아닌 성분은 고등식물에서는 보편적인 물질이며, 꽃과 과일, 열매의 색깔을 나타내고 있으며 식물의 액포 속에 존재하는 색소인 플라보노이드 계통에 속한다. 안토시아닌은 식물의 수소이온 농도에 따라 적색, 자색, 녹색등 색깔을 나타낸다. 그 기능은 식물 조직세포를 자외선으로부터 보호하기 위한 자외선 차단 작용과 곤충 침입방어 작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 우리 인체 내에서 음식물이 대사되는 과정에서는 유해산소 (free radical)가 발생한다. 발생된 유해산소는 체내 조직세포 분자와 반응하게 되는데 이것을 세포산화라고 한다. 세포가 산화되면 세포가 파괴되어 각종 질병이 발생되거나 DNA 변성으로 인한 암 발생 등의 원인이 된다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 유해산소와 결합하여 세포산화를 방지하는 물질을 항산화제라 하고 그 작용을 항산화 작용이라 한다. 이미 알려진 항산화제로는 비타민 C, 비타민 E, 베타-케로틴 등이 있으며, 최근 들어 안토시아닌은 강력한 바이오 항산화, 항-염증, 항-신경변성 물질로서 의학계의 주목을 받고 있다. 안토시아닌이 풍부한 식물은 자색당근, 크렌베리, 블루베리 등이 알려져 있으나, 안토시아닌의 기억력, 치매 개선 효과에 대해서는 지금까지 알려진 바 없다.
본 발명자들은 검정콩에서 추출한 시아니딩-3-글루코시드 (cyaniding-3-glucoside; C3G)를 포함하는 천연 항산화물질 (안토시아닌)에 대하여 연구한 끝에, 이를 주요 성분으로 하는 카이닌산(kainic acid, KA)-유도 세포독성과 신경세포 죽음에 대한 강한 보호효과를 갖는 조성물을 분리하였으며, 안토시아닌의 전처리가 신경세포에서 KA에 대한 강력한 보호효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 신경세포에 안토시아닌을 전처리하여 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 카이닌산에 의해 유도된 신경세포 사멸 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 안토시아닌은 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 효과를 가짐으로써, 이와 관련된 신경퇴행성 질환의 예방에 관한 약물 개발 및 연구에 이용될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 KA 처리에 의한 HT-22 세포 (도 1a 및 1c)와 해마 신경 세포 (도 1b 및 1d)에서의 세포 생존능에 미치는 영향을 나타낸다. 도 1a 및 1b는 MTT 실험에 의한 생존능의 차이를 나타내며, 도 1c 및 1d는 웨스턴 블랏을 통한 카스파제-3의 발현량의 변화를 나타낸다.
도 2는 안토시아닌에 의한 Ca2+ 증가의 저해효과를 나타내는 것으로서, 도 2의 A는 HT-22 세포, B는 일차 태아 신경세포에서의 변화를 나타낸다.
도 3은 HT-22 세포에서 KA 처리에 의한 ROS 생산에 대한 안토시아닌의 저해효과를 나타낸다.
도 4는 KA 처리에 의한 AMPK의 활성에 대한 안토시아닌의 저해효과를 나타내는 것으로서, 도 4의 A는 HT-22 세포, B는 일차 태아 신경세포에서의 변화를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 KA 처리에 의한 Bax와 Bcl-2 단백질의 발현에 대한 안토시아닌의 효과를 나타내는 것으로서, 도 5a는 HT-22 세포, 도 5b는 일차 태아 신경세포에서의 변화를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 KA 처리에 의한 세포질의 사이토크롬 c 증가와 카스파제-3의 활성에 대한 안토시아닌의 저해효과를 나타내는 것으로서, 도 6a는 HT-22 세포, 도 6b는 일차 태아 신경세포에서의 변화를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 각각 HT-22 세포(도 7a) 및 일차 태아 신경세포(도 7b)에서 KA 처리에 의한 세포자살에 대한 안토시아닌의 저해효과를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신경세포에 안토시아닌을 전처리하여 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, (a) 신경세포에 안토시아닌을 전처리하는 단계; 및 (b) 상기 신경세포에 카이닌산(kainic acid)을 처리하는 단계를 포함하는, 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어, "신경세포"는 신경계를 구성하는 주된 세포로, 근육을 포함한 타 세포의 작용을 조절하는 세포로서, 일반적 세포와 달리 전기적 방법으로 신호를 전달하며 발생 단계가 끝난 후에는 더 이상 분열하지 않는 세포를 의미한다. 이처럼 신경세포는 분열 횟수의 제한에 의해 손상시 복구가 거의 불가능하며, 따라서 발생시 정상적으로 분열이 완료되어 정상기능을 수행할 수 있게 하는 것이 무엇보다 중요하다.
바람직하게 본 발명의 방법을 이용한 신경세포 보호 효과는 신경세포가 존재하는 위치나 크기에 관계없이 모든 신경세포를 보호할 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 신경세포는 태아의 신경세포일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 태아 뇌의 해마 영역 또는 대뇌 피질 영역에 존재하는 신경세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 임신 17.5일의 스프레그-돌리 랫트를 희생시키고, 양막으로부터 제거 분리한 랫트 태아의 뇌 해마의 일차 해마 신경 세포를 이용하였으며, 이와 함께 HT-22 세포주에 있어서의 신경세포 보호 효과를 확인하였다.
본 발명에서 용어, "태아"는 포유류의 모체 안에서 자라는 유체를 나타내며, 쥐, 토끼, 말, 소, 양, 개, 고양이 및 원숭이 등이 있으며 상기 예에 의해 본 발명의 태아의 종류가 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명의 태아는 포유류의 태아로서 랫트 또는 인간의 태아일 수 있다. 또한 이러한 태아는 모체의 임신 기간 및 태아의 발달 정도에 따라 임신 초기의 태아인 embryo 또는 임신 중기 이후의 태아인 fetus로 분류될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 태아는 신경세포가 발생하고 성장하는 시기의 태아로서, 특히 신경 발생의 초기 단계로 알려진 임신 초기의 태아 (embryo)이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 임신 초기 기간에 대응하는 임신 17.5일 랫트에 있어서의 안토시아닌의 효과를 확인하였다.
본 발명에서 용어, "안토시아닌"은 식물의 꽃이나 과실 껍질 등에서 고운 빛깔을 가지는 부분에 많이 존재하는 색소 성분으로 주로 적색이나 청색, 자색 등을 나타낸다. 이것은 당 중에서 특정한 히드록시기와 각종 알코올, 페놀, 알데히드 등의 작용기가 에테르형 결합을 하여 이루어진 화합물이다. 보통 산을 가하면 적색으로 변하고 빨리 퇴색하는 성질이 있다. 꽃이 천차만별로 아름다운 색조를 나타내는 것은 이 안토시아닌이 식물체 속에서 칼륨, 마그네슘 등인 금속 염과 여러 가지 복잡한 착물을 형성하기 때문인 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 신경세포에 안토시아닌을 전처리하는 단계로서, 실질적으로 신경세포를 보호하기 위한 작용을 할 수 있는 단계이다. 본 발명의 안토시아닌은 (b) 단계에서 카이닌산 처리에 의해 발생할 수 있는 신경세포 사멸을 미연에 방지함으로써, 신경세포를 보호할 수 있는 역할을 한다.
본 발명의 일실시예에서는 안토시아닌이 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호함으로써, 세포 생존능이 증가함을 확인하였으며(도 1a 및 1b), 카이닌산에 의해 깨질 수 있는 Ca2+ 항상성을 유지, 회복시킬 수 있는 효과가 있음을 확인하였다(도 2). 또한, 안토시아닌은 ROS의 저해를 통하여 신경세포 사멸을 저해할 수 있으며, 세포 사멸 마커인 AMPK의 인산화, Bax: Bcl-2 단백질 비율, 사이토크롬 c 분비 및 카스파제-3 활성 등에 있어서도 카이닌산의 처리와 반대되는 효과를 가질 수 있음을 확인함으로써(도 4 내지 6b) 안토시아닌이 카이닌산에 의해 유도되는 신경세포 보호에 효과적임을 확인하였다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 (b) 상기 신경세포에 카이닌산을 처리하는 단계로서, 안토시아닌의 전처리에 의해 보호된 신경세포에 흥분세포독성을 유도하는 단계이다.
본 발명에서는 신경세포에 대한 카이닌산 처리가 세포 생존능의 감소 및 Ca2+ 항상성의 이상, ROS 양성 세포의 증가 등을 통하여 흥분세포독성을 유도함으로써, 궁극적으로 신경세포의 사멸 효과를 가짐을 확인하였으며, 이는 안토시아닌의 전처리를 통하여 억제될 수 있음을 확인함으로써, 안토시아닌의 전처리가 카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 효과를 가짐을 확인하였다.
한편, 본 발명에서 상기 신경세포 보호 효과는 다음과 같은 과정에 의해 달성될 수 있다. 먼저, 카이닌산에 의해 유도될 수 있는 신경세포 사멸 자체를 억제함으로써, 세포의 생존능을 증가시켜 세포를 보호할 수 있다. 또한, Ca2+ 의 항상성을 적절하게 유지시키거나, ROS의 증가를 저해함으로써 달성될 수도 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 카이닌산에 의해 유도된 신경세포 사멸 보호용 조성물을 제공한다.
상기에서 설명한 바와 같이, 안토시아닌의 전처리는 카이닌산에 의해 유도되는 신경세포의 사멸에 대하여 신경세포를 보호하는 효과를 가지기 때문에, 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 경우 신경세포 보호 효과를 통하여 신경세포 사멸을 억제하는 용도의 조성물로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 안토시아닌은 신경세포를 보호하는 역할을 함으로써, 그와 관련된 질환, 예컨대 알츠하이머, 파킨슨병 및 헌팅턴병 등과 같은 신경퇴행성 질환을 예방할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체로, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우 정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 한약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필 하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물의 경구, 정맥 내, 피하, 피 내, 비강 내, 복강 내, 근육 내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 또한 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성 성분인 약물의 종류에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있으므로, 상기 투여량에 의해 본 발명이 범위가 한정되는 것은 아니다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실험 동물 준비 및 처치
스프래그-돌리 암컷 랫트 (n=20)는 14:10 시간의 낮/밤 주기 (낮 6:00-20:00)에서 온도가 유지된 환경에서 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하여 사육하였다. 정액주입을 0.5 임신 기간 (gestational day; GD)으로 계산하여 GD 17.5일이 되었을 때 임신한 스프래그-돌리 랫트를 염화 펜토바비탈을 정맥주사하여 마취시킨 후 단두하여 희생하였다.
실시예 2: 배아 해마세포 배양
임신 기간 17.5(GD 17.5)일의 출생 전 쥐 태아 해마에서 배양을 준비하였다. 얻어진 해마 조직을 0.25% 트립신-EDTA로 20분간 처리하여 주고, 얼음으로 차갑게 한 칼슘과 마그네슘이 함유되지 않은 행크 발란스 염 수용액 (Hank's balanced salt solution, pH 7.4)에서 기계적으로 분쇄하여 분리하였다. 원심분리로 펠렛팅한 후, 세포들을 폴리-라이신 (0.02 g/l)과 챔버 슬라이드로 선-코팅된 배양 접시에 (1×106 세포/ml) 깔아주었다. 배양 배지는 10% 열불활성화 된 소 태아 혈청 (heat inactivated fetal bovine serum), 1 mM 피루브산, 4.2 mM 중탄산나트륨, 20 mM HEPES, 0.3 g/l 소 혈청 알부민, 50 U/ml 페니실린과 50 mg/l 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 계속 배양하였다. 세포 배양은 37℃, 5% CO2와 95%의 가습한 공기를 유지한 상태에서 실시하였다. 신경교세포는 100 μM 시토신 β-D-아라비노 푸라노시드(Cytosine β-D-Arabino Furanoside; Sigma)를 포함하는 배지에서 12시간 동안 저해하였다.
실시예 3: HT-22 세포 배양
HT-22 세포 (쥐 해마에서 유래한 HT4의 서브클론)를 10% FBS, 1 % 항생제를 포함하는 고 포도당 DMEM (Invitrogen, Karlsruche, Germany) 배지에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2와 95%의 가습한 공기에서 배양하였다.
실시예 4: 약물 처리
HT-22와 일차 해마 신경 세포 (primary hippocampal neuronal cell) 모두를 5개의 그룹으로 나누어서 5일간 배양하였다:
1) 대조군 (C): 세포를 일반적인 DMEM 배지에서 배양; 2) 카이닌 산 (KA)만 처리: 100 μM 을 12시간동안 처리; 3) 안토시아닌 (Antho)만 처리: 0.2 mg/ml을 12시간동안 처리; 4) Antho + KA 처리: 세포에 안토시아닌 (0.1 mg/ml)을 12시간동안 전처리 한 다음 KA (100 μM 을 12시간동안) 처리; 5) Antho + KA 처리: 세포에 안토시아닌 (0.2 mg/ml)을 전처리 한 다음 KA (100 μM 을 12시간동안) 처리.
세포들은 5일간 배양한 후 실험을 위해 이용하였다.
실시예 5: 세포 생존능 실험을 통한 안토시아닌의 KA-유도 세포독성 보호 효과 확인
KA 처리에 의한 신경세포의 사멸로부터 안토시아닌의 보호효과를 확인하기 위하여, 세포 독성의 검증을 위해 MTT 실험을 수행하였다. 열량 측정 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 HT-22와 일차 해마 신경교 세포 양쪽에서 수행하였다.
일차 해마세포와 HT-22 세포를 96-웰 플레이트 (1x105 세포/웰)에 200 ㎕ DMEM 배지에서 5일간 깔아주었다. 그 다음, 배양 세포에 실시예 4에서 언급한 것처럼 안토시아닌과 KA를 처리하였다. 배양 후에, 각 웰에 MTT (PBS에 5 mg/ml의 농도)를 넣어주고 37℃에서 4시간 동안 이들 세포를 배양하여 세포의 생존능력을 결정하였다. 후에 유기용매에 용해한 포르마잔 (formazan)을 세포에 넣어준 후, 플레이트를 쉐이커에 놓고 10 분에서 20 분간 흔들어주었다. 플레이트를 550에서 570 nm (L1)과 620에서 650 nm (L2)에서 주사 마이크로플레이트 리더 분광측정기(scanning microplate reader spectrophotometer)에서 읽었다; 620에서 650 nm 흡광도는 세포 부스러기와 작은 파편을 측정한다. 얻어진 최종 광학 농도 (optical density; OD=L1-L2)는 세포 생존의 퍼센트를 계산하는데 이용되고 이것은 처리 웰의 흡광도/대조군 흡광도 ×100% 로 표현하였다.
그 결과, HT-22 세포와 일차 해마세포 모두에서, KA를 처리한 군에서는 세포의 생존능이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 안토시아닌의 전처리에 의하여 KA-유도 세포 생존능 감소가 유의미하게 약화되었음을 확인할 수 있었다 (P<0.05) (도 1a 및 1b). 이러한 결과를 통하여, 안토시아닌이 KA에 의해 유도되는 신경세포의 독성을 약화시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 세포 내 자유 Ca 2+ 측정을 통한 안토시아닌의 KA-유도 Ca 2+ 항상성 이상의 저해 효과 확인
세포질 내의 Ca2+ 농도는 신경 전달 물질의 분비와 신경세포 발생을 조절하는데 이것의 잘못된 조절은 신경세포의 죽음의 결과를 가져온다. 비정상적인 Ca2+ 항상성은 신경세포의 세포사멸과 연결되어 있다.
세포 내 Ca2+ 농도는 형광 Ca2+ 지표인 퓨라-2 아세토시메틸 에스터 (Fura-2 acetoxymethyl ester)로 측정하였다. 5일 간의 배양 후, HT-22 세포와 일차 해마 신경세포 양쪽 모두에 일반 배지 (대조군), KA (100 μM), antho (0.1 mg/ml) 전처리 한 KA (100 μM), antho (0.2 mg/ml) 전처리 한 KA (100 μM)를 처리하였다. 처리 후에, 배양 신경세포들 (각 1 X 106 세포를 포함)을 크렙 완충용액 (Krebs buffer)으로 2번 세척하고 5 μM Fura-2AM을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2의 가습 배양기에서 60분간 배양하였다. 세포를 로크 용액 (Locke's solution; pH 7.8)으로 2번 세척하고, [Ca+2]c의 Fura-2 형광 신호를 발광 분광 측정기 (luminescence spectrophotometer; LS50B, Perkin Elmer, Boston, MA)로 측정하였다. 제논 램프 (Xenon lamp)의 자극 광을 340과 380 nm 밴드-투과 필터 (band-pass filter) 사이에서 변환하고 형광을 510 nm에서 발광시켜 광자-집계 광전자증배기 (photon-counting photomultiplier)를 이용하여 측정했다. 340 nm/380 nm 형광비는 평균 2초의 기간으로 측정되었다. 형광 신호는 수집되고, 저장되었으며 일반적인 이미지 소프트웨어 혹은 MicroVax II 컴퓨터와 origin 7 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 세포간 칼슘은 위에서 언급한 방법과 그린키위크 방정식 (Grynkiewicz equation)의 비로 결정하였다.
Figure PCTKR2013009776-appb-I000001
Kd: 세포기질 환경내의 225 nM 일 경우 Fura-2 Ca2+ 상호작용의 해리 상수; R: 340과 380 nm에서의 형광 비; Rmin: 제로 Ca2+의 비; Rmax: 포화 Ca2+의 비 (염화 칼슘 이용); Sf2: 제로 Ca2+의 의 380 nm에서의 형광; Sb2: 포화 Ca2+의 380 nm에서의 형광
그 결과, KA 처리군은 HT-22 세포의 경우 세포질 내의 자유 Ca2+ 농도가 최고 약 1005 ± 6.37 mM로 대조군의 최고 705 ± 8.06 nM와 비교할 때 증가하였다. 안토시아닌 전처리 후 KA를 처리한 군 2개 모두는 Ca2+ 최고 농도가 각 677 ± 6.19 nM 및 617 ± 4.32 nM로 회복되었다(도 2의 A). 비슷한 경향이 일차 신경세포에서 관찰되었는데 KA 처리군은 Ca2+의 최고 농도가 1000 ± 2.45 mM로 대조군의 최고 농도 700 ± 5.06 mM와 비교할 때 증가하였다. 그러나, 안토시아닌 전처리 후 KA를 처리한 군 2개에서는 각각 940 ± 3.21 nM 및 705 ± 3.99 nM로 회복되었다(도 2의 B).
우리는 세포간 Ca2+ 농도가 KA에 12시간 동안 노출 되었을 때 대조군과 비교하면 현저하게 올라갔고, 이것이 신경 세포의 사멸을 이끈다는 것을 발견하였다. KA는 아마도 막 이온 채널의 기능을 손상시키고 글루탐산 수용체의 활성을 통해 칼슘 조절을 저해할 것이다. 한편, 세포간 KA-유도 증가는 안토시아닌의 전처리에 의해 회복되는 현상이 나타나고 이러한 효과에 의해 안토시아닌이 시험관 내 (in vitro) 모델에서 흥분 세포 독성에서 강력한 보호 물질로서 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 산화 스트레스의 측정을 통한 안토시아닌의 KA-유도에 따른 ROS 생산 증가 저해효과 확인
ROS는 신경세포 사멸에 있어서 KA-유도 흥분 세포 독성의 결과로서 중요한 역할을 한다. 안토시아닌이 ROS 생산의 억제에 의한 KA-유도 신경세포 사멸을 저해하는지 여부를 확인하기 위하여, 우리는 ROS 양의 변화 실험을 수행하였다.
세포에서 세포간 ROS의 발생은 시그마 알드리치 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 구입한 세포 투과성 탐침인 2,7-디하이드로클로로플루오르세인 디아세테이트 (2,7-dihydrodichlorofluorescein diacetate; DCFH-DA)을 이용하여 조사하였다. 비극성 비형광 DCFH-DA 시약을 세포에 넣었을 때, 이것은 세포막을 통해 퍼지고 세포간 에스터라제 (intracellular esterase)에 의해 가수분해되고 비형광 2,7-다이클로로플루오레세인 (nonfluorescent 2,7-dichlorofluorescein; DCFH)으로 변화되고, ROS와 반응하여 높은 형광을 보이는 다이클로로플루오레세인 (dichlorofluorecein; DCF)을 형성한다.
HT-22와 출산전 쥐 해마 신경 세포를 유리 챔버 슬라이드 (Lab-Tek Chamber slide USA)에서 80%의 밀도로 생장시키고, PBS로 세척한 후 12시간의 KA 노출에 앞서서 안토시아닌 0.1 mg/ml 과 0.2 mg/ml로 12시간 동안 배양하였다. 세포들은 PBS로 세척하고, 50 μM DCFH-DA를 포함하는 DMSO를 넣어주고 암조건에서 30분간 37℃에서 배양하였다. 배양 후에, 세포를 로크 완충용액 (Locke's buffer; 154 mM NaCl, 25 mM KCl, 2.3mM CaCl2, 3.6 mM NaHCO3, 8.6 mM HEPES, and 5.6 mM glucose, pH 7.4)으로 세척하였다. 세포는 그 다음에 ROS 양성 세포를 아르곤 레이져와 흥분과 방출 파장이 각각 485와 530 nm의 장비를 갖춘 다중 초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscope; Fluoview FV 1000, Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, KA를 처리한 군에서는 강한 형광 강도, 즉 ROS 양성 세포의 숫자가 대조군에 비하여 현저하게 증가한 결과를 나타내었으나, 안토시아닌을 전처리한 군에서는 KA 처리군과 비교할 때, 현저하게 형광 강도의 감소를 보였다(도 3). 이러한 결과를 통하여 안토시아닌이 그 항산화 특성을 통하여 KA에 의해 유도된 신경세포 사멸을 저해할 수 있다는 것을 확인할 수 수 있었다.
실시예 8: 웨스턴 블랏 분석 (Western blot analysis)
웨스턴 블랏은 공지된 방법에 따라서 수행하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 용액을 이용하여 측정하였다. 같은 양의 단백질 (샘플 당 30 ㎍)을 7.5-15% SDS-PAGE 젤에서 환원 조건에서 전기영동하고 폴리비닐리딘 이불소화 (polyvinylidene difluoride; PVDF) 막으로 옮겨주었다 (Millipore, USA). 범위가 넓은 (7-240 kDa, multi color, Elpis Biotech Korea) 선염색 단백질 마커를 단백질의 분자량을 측정하기 위해 평행하게 런닝하였다. 막은 5% (w/v) 탈지분유로 비-특이적인 결합을 줄이기 위해 블락킹하고 토끼-유래 항-Bcl-2, 항-Bax, 그리고 염소-유래 폴리클로날 항-사이토크롬 c (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 면역블랏팅을 수행하였다. 항-caspase-3, 항-AMPK, 항-pAMPK 토끼 유래 항체를 면역블랏팅에 사용하였다 (1:500; Cell Signaling Technology). 항-β 액틴 항체 (1:1000; Sigma, St. Louis, MO, USA)는 균등 로딩을 확인하기 위하여 대조군으로 사용하였다. 막은 염소-유래 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬케이트 항-토끼 IgG (goat-derived horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG; 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 탐침했고, 면역복합체는 화학발광 ECL-검출 시약 스프레이(chemiluminescence ECL-detecting reagent spray)를 이용하여 시각화하였다. X-ray 필름은 스캐닝하고 웨스턴 블랏의 광학 농도는 컴퓨터를 바탕으로 한 Sigma Gel, 버전 1.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 농도계측 (densitometry)을 하여 분석하였다.
실시예 8-1: KA-유도에 의한 AMPK 활성 분석
AMPK 활성을 측정하기 위하여 Thr172의 인산화 정도를 웨스턴 블랏을 통하여 측정하였다.
그 결과, HT-22 세포와 일차 신경 세포 모두에서 KA 처리에 의해 총 AMPK 양에 영향을 미치치 않고 AMPKα-Thr172의 인산화를 증가시킨다는 것을 확인하였다. HT-22 세포와 일차 신경세포의 흥분세포 독성 모델 양쪽에서 KA는 AMPKα의 Thr172 인산화를 증가시키고, 이 인산화의 증가는 AMPK 활성의 지표로서 사용될 수 있다. 한편, 안토시아닌의 전처리는 KA에 의한 AMPKα의 인산화를 두 가지 세포 모두에서 저해하였다 (도 4의 A 및 B). 이러한 결과를 통하여, KA-유도 산화 스트레스 및 AMPKα 신호의 과활성이 신경세포의 죽음을 이끌고, 오랜기간의 AMPKα 활성은 미토콘드리아에 의한 세포 죽음 기작을 더욱 활성화시키고 신경세포의 세포사멸을 이끌어내는데, 안토시아닌이 이러한 신경세포 사멸을 저해할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8-2: KA-유도 Bax 및 Bcl-2 조절에 대한 안토시아닌의 효과
전-세포사멸 Bax 단백질과 항-세포사멸 Bcl-2 단백질은 Bcl-2 패밀리의 멤버이고 미토콘드리아에서 세포사멸 과정의 중요한 조절자이다. Bax의 증가는 미토콘드리아의 전-세포사멸 인자(pro-apototic factors)들의 방출을 유도한다. 세포사멸에의 이행은 Bax (전-세포사멸 단백질)와 Bcl-2 (항-세포사멸 단백질) 발현의 비율의 증감에 의하여 측정하였다.
그 결과, HT-22 세포와 일차 신경세포에 KA를 처리한 세포에서 Bax는 증가하나 Bcl-2의 발현이 감소하여, Bax: Bcl-2 단백질의 비율이 현저하게 증가함을 확인하였다. 반면, 안토시아닌을 전처리한 세포에서는 Bax가 상대적으로 감소하고 Bcl-2는 상대적으로 증가함을 확인하였다 (도 5a 및 5b). 따라서, 안토시아닌의 전처리는 Bax와 Bcl-2의 변화를 강하게 저해하고 이는 신경세포의 사멸을 방해한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 8-3: 사이토크롬 c 분비 및 카스파제-3 활성에 대한 안토시아닌의 효과
먼저, 세포에 KA를 100 μM 의 농도로 다양한 시간동안 처리하였다 (30분, 2시간, 12시간, 24시간). 12시간 처리군의 웨스턴 블랏 결과에서 나타나듯이 양쪽 세포 모두에서 KA 처리에 의한 카스파제-3의 활성이 현저하게 증가하였다 (도 1c 및 1d). 이러한 중요한 세포사멸 마커에 기초하여 우리는 KA-유도 신경세포 사멸의 선택된 용량의 최적의 시간으로 12시간을 선택하였다.
추가적으로, KA-유도 신경 세포 사멸에 포함되는 하위 이벤트 (downstream event)를 확인하기 위하여, 세포질 부분 (cytosolic fractions)에서 사이토크롬 c와 카스파제-3의 변화를 측정하였다. 그 결과, KA 처리 12시간 후에 양쪽 세포 모두에서 대조군과 비교할 때 사이토크롬 c의 현저한 증가가 나타났다. 반면, 안토시아닌 전처리는 HT-22 세포와 일차 신경세포에서 사이토크롬 c의 감소의 결과를 가져왔다 (도 6a 및 6b). 또한, KA-유도 세포 사멸과 관련한 카스파제-3에 대해서도 동일하게 실험한 결과, KA가 카스파제-3의 활성을 증가시키나, 안토시아닌 전처리는 HT-22와 일차 해마 신경 세포 양쪽에서 카스파제-3 발현을 감소시킴을 확인하였다 (도 6a 및 6b). 이러한 결과를 통하여, KA의 처리는 신경세포의 사멸을 유도하지만, 안토시아닌이 그러한 세포 사멸을 저해할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 9: TUNEL 및 프로피디움 요오드화물 (Propidium Iodide, PI) 염색
KA-유도 세포사멸에 대한 안토시아닌의 보호 효과를 TUNEL과 PI 염색 분석을 이용하여 조사하였다. 세포 자살 세포는 말단 디오시뉴클레오티틸 트랜스퍼라제 dUTP 닉-말단 라벨링 (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling; TUNEL) 분석으로 결정하고 프로피디움 이도디드 (PI)로 대비염색을 하였다. TUNEL 분석은 (DeadEndTM Fluorometric TUNEL System, Promega USA)을 공급자 추천 방법을 따라서 수행하였다.
각 안토시아닌을 12시간동안 전처리 후 KA를 12시간 처리한 후, 챔버 슬라이드를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 1×인산 완충용액 생리식염수로 세척했다. 그 후 세포를 1% 트리톤 X-100으로 투과시켰다. TNUEL 과정을 Dead-End 화학 형광계 터넬 시스템 (Dead-End fluorometric tunel system; Promega)을 이용하여 수행하였다. TUNEL 염색 후에 슬리이드를 신선하게 준비한 1 ㎍/ml PI를 포함하는 PBS로 상온에서 15분간 처리하여 염색한 후 증류수로 헹구어 내었다. 유리 커버 슬립으로 유리 글래스 위에 마운팅 배지로 마운트하였다. PI 필터를 PI 염색 (붉은 색)을 검색하기 위해 사용하고, FITC 필터를 TUNEL 염색 (녹색)을 검색하기 위해 사용하였다. TUNEL-양성 (녹색)과 PI-양성 (붉은색) 형태는 다촛점 레이저 주사 현미경을 이용하여 취득하였다 (Fluoview FV 1000, Olympus, Japan). TUNEL 양성 세포 (녹색)와 PI 양성 세포의 수 (붉은색 핵 염색)은 시각적으로 계수하였다. 모든 샘플들은 최소 두 개 이상의 생물학적 복사본을 분석하였고, 각 복사본으로부터 3개의 이미지를 얻어서 60배의 배율로 TUNEL과 PI 양성 세포를 계수하였다. TUNEL 양성 세포의 퍼센트는 (TUNEL 양성 세포/ 총 세포수) X100으로 계산하였다.
그 결과, HT-22 세포와 일차 신경 세포에서 대조군과 비교할 때 KA 처리군에서의 세포 사멸의 총수가 증가함을 보여주었다. 안토시아닌을 전처리한 군에서는 KA만을 처리한 세포와 비교할 때 세포사멸 세포의 비율을 현저하게 감소시켰다. HT-22 세포와 일차 해마 신경 세포 모두에서 우리는 세포 사멸과 관련하여 같은 경향을 보임을 확인하였다. 세포 사멸 세포들은 도면 7a 및 7b에서 화살표로 표시하였다. 많은 TUNEL 양성 세포 프로파일이 KA 처리 세포에서 나타나는데 반해, 대조군 배양과 안토시아닌 처리 세포는 상대적으로 적은 TUNEL-양성 프로파일을 보여주었다. 이러한 결과들을 통하여 안토시아닌이 세포 사멸로부터 강력한 신경보호세포 역할을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다 (도 7a 및 7b).
이러한 일련의 결과들을 종합할 때, 본 발명의 안토시아닌은 카이닌산 (KA)에 의해 유도된 태아 신경세포의 사멸을 억제하거나, 세포 죽음으로부터 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

  1. (a) 신경세포에 안토시아닌을 전처리하는 단계; 및
    (b) 상기 신경세포에 카이닌산(kainic acid)을 처리하는 단계를 포함하는,
    카이닌산에 의해 유도된 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신경세포는 태아의 신경세포인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신경세포는 HT-22 세포인 것인 방법.
  4. 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 카이닌산(kainic acid)에 의해 유도된 신경세포 사멸 보호용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방 효과를 가지는 것인 조성물.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KELSEY, N. ET AL.: "Neuroprotective effects of anthocyanins on apoptosis induced by mitochondrial oxidative stress", NUTRITIONAL NEUROSCIENCE, vol. 14, no. 6, 2011, pages 249 - 259 *
LIANG, L.P. ET AL.: "Mitochondrial Superoxide Production in Kainate-induced Hippocampal Damage", NEUROSCIENCE, vol. 101, no. 3, 2000, pages 563 - 570 *

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