WO2014102439A1 - Método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta al tratamiento de la hepatitis c - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta al tratamiento de la hepatitis c Download PDF

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Rafael GONZÁLEZ FERNÁNDEZ
Antonio RIVERO ROMÁN
Bárbara MANZANARES MARTÍN
Antonio RIVERO JUÁREZ
Ángela CAMACHO ESPEJO
Julián DE LA TORRE CISNEROS
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SERVICIO ANDALUZA DE SALUD
Universidad de Cordoba
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention is within medicine and molecular biology, and refers to a method of obtaining useful data to evaluate the response to hepatitis C treatment, and in particular, the use of the KIR3DS1 gene to predict the response to Hepatitis C treatment with pegylated interferon plus ribavirin analogues.
  • the first available drugs with direct anti-HCV action are Boceprevir (BOC) and Telaprevir (TEL) (Liu et al., 2012. Ann Intern Med. 156: 279-290.). Both drugs are potent inhibitors of HCV NS3 protease. Clinical trials of the development of both drugs have been carried out with different treatment strategies. In the case of clinical trials of BOC, the so - called lead-in strategy has been used, in which patients are treated during the first 4 weeks of treatment with PEG / RBV, adding BOC from the fourth week of treatment. In contrast, in the clinical trials of the development of TEL, the combination PEG / RBV / TEL was used since the beginning of treatment.
  • boceprevir is 800 mg (4 capsules) every 8 hours, administered with food.
  • the dose of telaprevir is 750 mg (2 tablets) every 8 hours, administered with food. In both drugs the Patients should swallow the tablets whole (without chewing, crushing or dissolve).
  • Boceprevir and telaprevir are not currently indicated in the treatment of chronic hepatitis due to HCV caused by other genotypes other than genotype 1.
  • BOC treatment should also be discontinued or TEL.
  • A.- Genotype 1 HCV infection independently that the patient has received or not prior treatment for HCV
  • B.- Fibrosis F3 and F4 confirmed by liver biopsy or liver stiffness measured by Fibroscan> 9.5 Kilopascals. Regardless of the degree of fibrosis, you may consider starting BOC or TEL treatment in patients with extrahepatic manifestations severe HCV infection such as those derived from mixed polyclonal cryoglobulinemia.
  • the HEPAVIR group recommends considering the use of PEG / RBV without FAD in patients with IL28 CC genotype and low HCV viral load (less than 600.00o copies / mL).
  • Null responders are considered to be those who do not have achieved a decrease in HCV-RNA greater than 2 log at 12 weeks of a previous treatment with PEG / RBV.
  • the probability of achieving SVR with a new Treatment with a regimen that includes BOC or TEL is very low. For this reason in Those patients will act according to the risk of progression of their liver disease.
  • cirrhotic patients with a very high probability of decompensation at Short term (liver stiffness> 40 kPa) it is recommended to start treatment now that treatment with BOC or TEL is the only option to avoid, even with Very low probability of success, decompensation of liver disease. At rest of the patient will be considered to defer the start of treatment with narrow patient monitoring pending new options for treatment.
  • BOC and TEL have drug interactions antiretrovirals that limit their joint use. It is currently allowed the use of BOC with the following antiretroviral drugs: Analogs of nucleosides (Abacavir; Emtricitabine, Lamivudine and Tenofovir) and inhibitors of integrase (raltegravir).
  • Analogs of nucleosides Abacavir; Emtricitabine, Lamivudine and Tenofovir
  • raltegravir inhibitors of integrase
  • the use of BOC with non-analogues is not allowed of nucleosides, Protease inhibitors (there are discrepancies between studies of pharmacokinetic interactions conducted in healthy volunteers and the results of clinical trials that have demonstrated high rates of SVR with ATV / r, DRV / r and LPV / r), CCR5 correceptor inhibitors and inhibitors of entry.
  • TEL TEL with the following antiretroviral drugs: Nucleoside analogues (Abacavir; Emtricitabine, Lamivudine and Tenofovir), integrase inhibitors (raltegravir), No Nucleoside Analogs (Efavirenz, increasing the dose of telaprevir at 1,125 mg / 8, Etravirine and Rilpivirine) and inhibitors of protease (Atazanavir / ritonavir).
  • Nucleoside analogues Abacavir; Emtricitabine, Lamivudine and Tenofovir
  • integrase inhibitors raltegravir
  • No Nucleoside Analogs Efavirenz, increasing the dose of telaprevir at 1,125 mg / 8, Etravirine and Rilpivirine
  • inhibitors of protease Atazanavir / ritonavir.
  • the response to HCV treatment is associated with a lower progression of liver fibrosis and, therefore, with a lower probability of death from liver disease in patients co-infected with HIV and HCV.
  • the standard treatment against HCV has been pegylated interferon bite therapy (IFN-Peg) plus ribavirin (RBV).
  • IFN-Peg pegylated interferon bite therapy
  • RBV ribavirin
  • SVR sustained virological response
  • the treatment is not without adverse effects, which can even be serious.
  • HCV genotype HCV baseline viral load and genetic variations of the host. So while the response rate to IFN-Peg plus RBV treatment observed in patients infected by the genotype 2 or 3 ranges between 44-72%, in patients infected by the Genotype 1 or 4, SVR rates are between 17-35%.
  • a baseline plasma viral load of less than 600-800 kUI / ml is associated with a higher rate of SVR in this population.
  • viral kinetics in response to HCV treatment is very useful both to predict the likelihood of response to treatment and to identify the duration, treatment regimen, and its need for discontinuation.
  • the response at week 4 after initiation of treatment is the best predictive factor for both standard treatment and triple therapy (Jacobson et al., 2011. N Engl J Med 364: 2405-16).
  • viral kinetics in the first days of HCV treatment is a very useful tool in the evaluation of predictive response factors and in comparing the efficacy of different treatment regimens (Rivero-Juárez et al. ., 2012. J Antimicrob Chemother. Jan; 67 (1): 202-5,).
  • NK cells play an important role in the innate immune response and at the same time they are the most predominant lymphocytes in the liver [Borrego et al., 2002. Mol Immunol. 38: 637-60]. It has been reported that a decrease in intrahepatic NK cells and in peripheral blood HCV infection [Neukam et al., 2099. Exp Opin Pharmacother 10: 417-433] leads to deficiencies in the activation of NK cells that could favor Chronification of the disease. HCV treatment, however, seems to lead to a massive activation of the innate immune response [Rivero-Juárez et al., 2012. J Antimicrob Chemother.
  • KIR receptors Natural Killer cell receptors
  • S-KIR Natural Killer cell receptors
  • L-KIR L-KIR
  • the KIR3DS1 receptor which we know has an activating action on NK cells, has been described as having a protective role against the development of hepatocellular carcinoma in patients infected with HCV [Borrego et al., 2002. Mol Immunol. 38: 637-60]. However, its impact on the result of HCV treatment has not been described.
  • the present invention provides a method of Obtaining useful data to predict or predict the response to HCV treatment, and specifically, to treatment with Peg-IFN / RBV.
  • the authors of the present invention have found a biomarker useful for predict the response to hepatitis C treatment, which is a key feature of clinical practice to determine the treatment in HCV genotype 1 patients co-infected with HIV, and that could lead to doctors detect those patients with a greater probability than respond to Peg-IFN / RBV therapy.
  • a first aspect of the invention relates to the use of the KIR3DS1 gene to predict an individual's response to HCV treatment with IFN-Peg plus a guanosine analog.
  • the guanosine analog is ribavirin (RBV).
  • the individual is coinfected by HIV and HCV.
  • HCV is genotype 1.
  • Antiviral therapy is basically aimed at achieve virological, biochemical and histological objectives.
  • the evaluation of The response to the treatment is based on its effect on the condition. virological, not only at the end of the treatment but, more importantly, in its follow-up after the end of it.
  • virological response' or 'viral response Sustained '(SVR) viremia negativization (negative viral RNA by polymerase chain reaction techniques -PCR-) that is maintained at least 24 weeks after the end of treatment; or put another way, the absence in serum of HCV-RNA 6 months after the end of treatment.
  • the negativization of viremia at the end of treatment defines the 'virological response with relapse'.
  • the absence of viremia negativization at the end of the treatment define the 'no virological response' to treatment.
  • Interferon alfa' is a cytokine immunomodulatory that possesses antiviral activity, antiangiogenic properties and antiproliferatives IFN-Peg is obtained by physicochemical binding of polyethylene glycol (PEG) to interferon alfa (peginterferon ⁇ -2a and ⁇ -2b) recombinant, which increase their permanence in the blood requiring less frequency of injections
  • peginterferon alfa-2a (Pegasys®, Roche) and peginterferon alfa-2b (Pegintron®, Schering-Plow). These two products are similar with respect to their efficacy and safety but their Dosage regimens differ slightly.
  • Ribavirin (1- ⁇ -D-ribofuranosyl-1H-1 , 2,4-triazol-3-carboxamide) is a synthetic nucleotide analog of guanidine, with antiviral properties and immunoregulatory activity. It was one of the first drugs that proved effective in reducing the ability to virus reproduction It is described in the Merck Index, compound No. 8199, eleventh edition. Its manufacture and formulation are described in the patent of USA n. No. 4,211,771.
  • ribavirin The rapid erythrocyte uptake of ribavirin and their phosphorylation are responsible for the important hemolytic anemia dose dependent.
  • the design of the new drugs contemplates that they are not captured or phosphorylated by the erythrocytes or that are rapidly captured and phosphorylated in the liver. Both of them approaches have the potential disadvantage that they can override steps fundamentals that contribute to the therapeutic efficacy of ribavirin.
  • Ribavirin viramidine and levovirin.
  • Viramidine is a prodrug of RBV, in the The liver is converted into RBV by hepatic adenosinedeaminase.
  • the RBV and viramidine are rapidly eliminated, their molecules and metabolites are excreted by the kidney and have a Tmax of 1.5-3 h.
  • the hepatic retention of RBV derived from an oral dose of viramidine is 3 times greater than oral RBV. Instead, the concentration of RBV phosphates in the red blood cells is much smaller, hence it is possible to maintain a concentration stable hemoglobin. It is a safe drug and is well tolerated.
  • the effects Adverse effects with doses of 200, 600 and 1,200 mg were: 0, 26 and 50%, respectively; mostly mild and disappeared without sequelae.
  • Levovirin is the L-enantiomer of RBV and not causes hemolytic anemia It has an immunomodulatory activity similar to RBV, but has no direct antiviral activity.
  • Ribavirin alone is not effective against HCV, but when combined with interferon, eradication rates viral are much better compared to those achieved only with interferon
  • the 'HCV genotype', or 'viral strain' is determined for a blood test. Hepatitis C virus has been classified in six different genotypes based on differences in their genomes, these genotypes at their Once they are subdivided. The preponderance and distribution of these genotypes varies globally For example, in North America, genotype 1 predominates, followed of 2 and 3. In Europe, genotype 1 predominates, followed by 3, 4 and 2. Genotypes 4 predominates in Egypt, 5 occurs almost exclusively in Africa and genotype 6 in the Southeast Asian.
  • genotype is of clinical importance since determines the potential response of the current therapy and the duration that is going to require the same Genotypes 1 and 4 respond less to such treatment than the others (genotypes 2, 3, 5 and 6).
  • the duration of standard therapy based on Interferon for genotypes 1 and 4 is 48-72 weeks, while for Genotypes 2 and 3 is only 12-24 weeks.
  • some genotypes of HCV, such as types 2 and 3, are easier to eradicate than type one.
  • RNA from HCV ' It is called 'basal plasma viral load of RNA from HCV ', to the amount of HCV RNA in the blood (serum). His presence is indicative of an active infection with ongoing viral reproduction. Load viral is usually expressed in logarithmic units [log10 IU / ml].
  • the answer to antiviral treatment is evaluated with a baseline viral load (pre-treatment) and at least one viral load at the end of it and at 24 weeks post treatment. It is considered a response to antiviral treatment if it is obtained an undetectable viral load at the end of treatment and a viral load undetectable and / or qualitative negative RNA at 24 weeks (viral response sustained). It has also been determined that a drop in viral load early (early viral response), with a decrease of 2 log10 IU / ml or more at 12 intra-treatment weeks, allows to evaluate in advance the probability of obtain a sustained virological response at the end of therapy.
  • Another aspect of the invention relates to the simultaneous use of the KIR3DS1 and IL28B genes to predict or predict an individual's response to HCV treatment with IFN-Peg plus a guanosine analog.
  • the genotyping of the ' IL28B ' gene can be obtained, preferably, but not limited to, by sequencing the complete gene but even more preferably, it is obtained by analyzing the single nucleotide polymorphism ( single nucleotide polymorphism , SNP) rs12979860 (SEQ ID NO: 5) located on chromosome 19, in the vicinity of the interleukin 28B gene (IL28B).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the nuleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is:
  • Another aspect of the invention relates to a method. to obtain useful data to predict or predict SVR for treatment of HCV with IFN-Peg plus a guanosine analogue, from now on first method of the invention, comprising:
  • KIR3DS1 The presence in a patient of the KIR3DS1 gene favors the response to treatment with pegylated Interferon (IFN-PEG) and Ribavirin (or analogues).
  • IFN-PEG pegylated Interferon
  • Ribavirin or analogues
  • Another aspect of the invention relates to a method. to predict or predict SVR for HCV treatment with IFN-Peg plus a guanosine analogue, hereafter second method of the invention, which it comprises steps (a) and (b) of the first method of the invention, and also understands:
  • the method makes it possible to classify the individuals who present the KIR3DS1 genotype and its functional ligand Bw4 , in the group of patients who respond well to the treatment or with a better prognosis.
  • the analog of the Guanosine is ribavirin (RBV).
  • the individual is coinfected by HIV and HCV.
  • HCV is genotype 1.
  • Steps (b) and / or (c) of the methods described previously they can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the amount in the passage (b) or the computerized comparison in step (c).
  • isolated biological sample' includes, but without limiting our to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, such as blood, serum, urine, saliva, cerebrospinal fluid, or a solid sample or semi-solid, such as tissues, feces, and similar, or alternatively, a tissue solid such as those commonly used in histological diagnosis, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • genotyping methods of SNPs there are more than 100 different genotyping methods of SNPs, any one applicable in the present invention.
  • SNPs can be detected using restriction enzymes or by simple sequencing by PCR, ASO probes and hybridization in Micromatrices of DNA or spheres
  • methods of amplification of SNPs find the PCR, the Invader method, the amplification by circle DNA rolling, etc.
  • allelic discrimination methods they can be used, but without limitation, allele specific hybridization, oligonucleotide ligation specific allele, mini-sequencing or extension of probes (SBE, Single Base Extension), invasive allele-specific rupture (Invader), etc.
  • genotyping of KIR3DS1 is performed by PCR, and more preferably, with sequence primers SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, or with primers SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 .
  • genotyping of KIR3DS1 has been performed following the method described in Vilches et al., 2007. Tissue Antigens . Nov; 70 (5): 415-22.
  • each reaction 100 ng of genomic DNA is amplified in 10 ml of PCR buffer (67 mM Tris-HCL pH 8.8, 16 mM (NH4) 2 SO 4 , 2 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20, 100 ⁇ M dNTP containing 0.3 u of Taq polymerase (ECO Taq, Ecogen SRL, Barcelona, Spain).
  • PCR buffer 67 mM Tris-HCL pH 8.8, 16 mM (NH4) 2 SO 4 , 2 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20, 100 ⁇ M dNTP containing 0.3 u of Taq polymerase (ECO Taq, Ecogen SRL, Barcelona, Spain).
  • the PCR conditions were:
  • step (b) of any of the methods of the invention further comprises determining the genotype of the IL28B gene. More preferably, the determination of the IL28B genotype is performed by analyzing the variations in the SNP rs12979860.
  • the KIR3DS1 gene or also killer cell immunoglobulin-like receptor, three domains, short cytoplasmic tail, 1 (KIR-G1; NKAT10; CD158E2; KIR-123FM) belongs to the genes of the KIR family, killer cell immunoglobulin-like receptors ( KIRs) , and are transmembrane glycoproteins expressed by natural killer cells and subsets of T cells.
  • KIR genes are polymorphic and highly homologous, and are found in a cluster on chromosome 19 (19q13.4) in the leukocyte receptor complex (LRC).
  • KIR3DS1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • nucleic acid molecules whose chain complementary hybrid with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose chain complementary hybrid with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KIR3DS1 protein.
  • SEQ ID NO: 2 is the collection in SEQ ID NO: 2.
  • 'prognosis' is understood as the expected evolution of a disease and refers to the assessment of the probability according to which a subject suffers from a disease as well as the assessment of its onset, state of development, evolution, or its regression, and / or the prognosis of the course of the disease in the future. How will the experts in the field, such an assessment, although it is preferred that it be, normally It may not be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. He term, however, requires that a statistically significant part of subjects can be identified as suffering from the disease or having predisposition to it.
  • a part is statistically significant, can be determined by the person skilled in the art using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p values, t test Student, Mann-Whitney test, etc.
  • Preferred confidence intervals they are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at minus 90%, at least 95%.
  • P values are preferably 0.2, 0.1, 0.05
  • 'prediction of the response' is understood, in the context of the present invention, the determination of the probability that the patient responds favorably or unfavorably to a therapy or a certain treatment Especially, the term 'prediction', as used here, it refers to an individual evaluation of any parameter that may be useful in determining the evolution of a patient. How will the subject matter experts, the prediction of the clinical response to treatment, although it is preferred, it does not need to be correct for 100% of the subjects to be diagnosed or evaluated. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as they have an increased probability of having a positive response.
  • He subject matter expert can easily determine if a subject is statistically significant using several evaluation tools well-known statistics, for example, determination of intervals of confidence, determination of p values, Student's t-test, Mann Whitney, etc.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%>, at least 60%>, at least 70%>, at least 80%>, at less than 90%), at least 95%>.
  • P values are preferably 0.2, 0.1 or 0.05.
  • the prediction of the clinical response can be made using any valuation criteria used in oncology and known for The subject matter expert.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the The present invention allows the disease to be detected correctly differential at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably in at least 80%, or even more preferably in al minus 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • the term 'individual' refers to animals, preferably mammals, and more preferably human.
  • the term 'individual' is not intended to be limiting in no aspect, being able to be this of any age, sex and condition physical.
  • kit or device comprising the elements necessary to analyze the genotype of the KIR3DS1 gene
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the KIR3DS1 gene (SEQ ID NO: 1).
  • the kit of the invention comprises sequence oligonucleotides SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 5
  • Initiator or direct primer Initiator or reverse primer cat cgg ttc cat gat gcg (SEQ ID NO: 3) cca cga tgt cca gggga (SEQ ID NO: 5) cat cag ttc cat gat gcg (SEQ ID NO: 4)
  • kits may contain all those reagents necessary to analyze the genotype of the KIR3DS1 gene by means of any of the methods described hereinabove.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a film cell fine silicon) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each stain contains a specific acid sequence nucleic, which normally corresponds to a specific sequence of DNA.
  • another aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising at least one probe for detecting the genotype of the KIR3DS1 gene .
  • oligonucleotide sequences they are built on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the Photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and still more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • oligonucleotides per gene preferably about 40 are used oligonucleotides per gene.
  • In situ synthesis on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but without limited, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or Portas de glass for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample a analyze: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • the kit or device, and / or the microarray further comprises one or more probes necessary to detect the haplotype of the IL28B gene
  • kits or device for predict or predict an individual's response to HCV treatment with IFN-Peg plus a guanosine analog.
  • the analog of guanosine is ribavirin (RBV).
  • Another aspect of the invention relates to a medium of storage readable by a computer comprising instructions program capable of having a computer perform the steps of anyone of the methods of the invention (of the first or second method of the invention).
  • Another aspect of the invention relates to a signal transmissible comprising program instructions capable of making a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • RNA and RNA ribonucleotides
  • DNA or DNA deoxyribonucleotides
  • 'amino acid sequence', 'peptide', 'oligopeptide', 'polypeptide' and 'protein' are used here in a manner interchangeable, and refer to a polymeric form of amino acids of Any length, which may be coding or non-coding, chemical or biochemically modified.
  • Fig. 1 Viral HCV decline for KIR3DS1 and its ligands in patients carrying IL28B-CC ( 1A ) or non-CC IL28B ( 1B ) genotypes.
  • Viral HCV decreases significantly in patients who possess the KIR3DS1 gene and its HLA-Bw4 ligand in patients who possess the IL28B-CC ( 2A ) or IL28B non-CC genotypes (2B) during the first hours of treatment with Peg-IFN / RBV
  • the invention will now be illustrated by the exposure of the results obtained by the inventors. These put on manifest the specificity and efficacy of the invention to obtain data useful in predicting the response to the treatment of individuals co-infected with HIV and HCV.
  • hepatitis C chronic hepatitis C
  • genotype 1 receiving combined therapy of Peg-IFN / RBV.
  • the criteria used to determine hepatitis therapy It was followed by international guidelines (20).
  • Fibrosis status was determined by biopsy or transient hepatic elastography (FibroScan ®, Echosen, Paris).
  • Significant fibrosis is defined as a F3-F4 fibrosis METAVIR score in liver biopsy or a value of liver stiffness ⁇ 11 kPa.
  • Plasma loads of HCV RNA RNA were measured at study start and at weeks 1, 2 and 4, using a PCR assay quantitative (Cobas TaqMan, Roche Diagnostic Systems Inc., Pleasanton, CA, USA), with a detection limit of 15 IU / ml.
  • the sustained virological response is defined as an undetectable level of serum HCV RNA 24 weeks after the completion of HCV therapy. HCV RNA undetectable in plasma at week 4 it is considered a rapid virological response (RVR).
  • DNA was extracted using the MagNA Pure automated DNA extraction method (Roche Diagnostics Corporation. Indianapolis, IN 46250, USA). SNP rs129679860, located 3 kilobases upstream of IL28B and in linkage disequilibrium was genotyped with a non-synonymous coding variant of the IL28B gene (213A> G, K70R; rs81031142). Genotyping was carried out using the usual TaqMan assay (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), on DNA isolated from whole blood samples, using a thermocycler with Stratagene MX3005 MxPro software (Stratagene, La Jolla, California, USA), according to manufacturer's instructions. The researchers responsible for genotyping did not have access to patient data. The IL28B genotype was defined as CC or non-CC (TT / CT).
  • KIR genotyping was performed with sequence specific primers capable of detecting the presence of 16 different KIR genes previously used by Gómez-Lozano et al [21]. This method provides a high degree of resolution, since each pair of primers identifies two linked, cis-located polymorphic sites (Invitrogen Corporation).
  • HLA-B genotyping was performed with the INNO-LiPA HLA-B Multiplex Kit (Innogenetics NV), using multiplex primers HLA-B for nucleic acid amplification of the second to fourth exons of the HLA-B locus, and HLA-Bw4 primers for exon 2 of the HLA-BW4 alleles. This procedure is based on the reverse PCR-SSO method. Next alleles HLA-B and BW4 or Bw6 specificities were determined with LIRASTM software for INNOLIPA HLA. Patients carrying KIR3DS1 were defined on the base of specific ligands Bw4 (KIR3DS1 / Bw4) or Bw6 (KIR3DS1 / Bw6) [22].
  • gagagagagt catcctgcaa tgttggtcag atatcatgtt tgagcacttc tttctgcaca 480

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Abstract

El uso del gen KIR3DS1para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina, preferentemente ribavirina (RBV), método, kit y usos.

Description

Método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta al tratamiento de la Hepatitis C.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento de la hepatitis C, y en concreto, al empleo del gen KIR3DS1 para predecir la respuesta al tratamiento de la hepatitis C con interferón pegilado mas análogos de ribavirina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El tratamiento de la hepatitis crónica causada por VHC genotipo 1 ha experimentado un notable avance en los últimos meses. La disponibilidad de fármacos de acción directa (FAD) frente al VHC ha permitido construir nuevos regímenes de tratamiento que han superado ampliamente en eficacia a los regímenes anteriores basados en la asociación de interferon pegilado (PEG) mas ribavirina (RBV). Sin embargo el uso de FAD supone algunos inconvenientes que pueden llegar a limitar su uso, especialmente entre pacientes coinfectados por el VIH. En primer lugar las formulaciones disponibles en la actualidad incrementan el número de comprimidos que un paciente infectado por el VIH necesita tomar para tratar simultáneamente ambas infecciones, lo que puede dificultar la adherencia a ambos tratamiento. En segundo lugar los FAD disponibles en la actualidad tienen un alto potencial de interacciones con los fármacos antirretrovirales (FAR) que van a limitar las posibilidades de tratamiento simultáneo de ambas infecciones. En tercer lugar el uso simultaneo de FAD y FAR supone un incremento potencial de la incidencia de efectos adversos. Por último el alto coste de los FAD supone una importante limitación a su uso en momentos como el actual, de graves dificultades económicas. Por otro lado los ensayos clínicos de desarrollo de FAD han demostrado una eficacia de los regímenes basados en PEG/RBV en pacientes coinfectados por VIH y VHC superiores a los obtenidos en los ensayos clínicos iniciales de desarrollo de la combinación PEG/RBV. Esta mayor eficacia puede obedecer tanto al uso mas adecuado de los FAR, como a la mayor experiencia en el tratamiento del VHC que supone un mejor manejo de los efectos adversos provocados por el mismo.
La posibilidad de identificar una población de pacientes coinfectados por VIH/VHC con alta probabilidad de respuesta al tratamiento del VHC genotipo 1 sin el uso de FAD supondría evitar el incremento del riesgo de efectos adversos e interacciones y permitiría un importante ahorro económico sin merma en la eficacia. Este hecho, demostrado al menos en el caso de pacientes que alcanzan RVR, justifica en la actualidad la indicación de PEG/RBV como tratamiento electivo del VHC-genotipo 1 en un subgrupo de pacientes.
Tratamiento del VHC genotipo 1 con PEG/RBV
En pacientes monoinfectados por VHC diversos ensayos clínicos demostraron la superioridad de PEG-a 2a y 2b sobre Interferon-a 2a y 2b, y que era posible obtener mayores tasas de respuesta al utilizar PEG en combinación con RBV. Aunque algunos estudios sugirieron mayor eficacia de PEG-a 2a, ensayos clínicos randomizados en los que se enfrentaron head to head ambas formas de PEG no demostraron diferencias significativas en la eficacia entre ambas (McHutchison et al., 2009. P N Engl J Med. 361:580-93). La dosis utilizada y seleccionada como óptima para el tratamiento del VHC genotipo 1 en los ensayos clínicos de desarrollo de PEG-a 2a fue de 180 mg/semana y en los de PEG-a 2b de 1,5 mg/kg/semana.
En pacientes coinfectados, la combinación de PEG/RBV también ha obtenido mejores resultados que Interferon-a 2a y 2b, tanto con PEG-a 2a a dosis de 180 mg/semana, como con PEG-a 2b a dosis de 1,5 mg/kg/semana. Tampoco en pacientes coinfectados se ha demostrado diferencias significativas en la eficacia entre ambas formas de PEG.
En pacientes monoinfectados por VHC, dosificar la RBV ajustándola al peso del paciente (1.000 ó 1.200 mg/día respectivamente para pacientes con <75 kg ó ≥75 kg) obtiene mayores tasas de RVS en comparación a dosis fijas de 800 mg/día. La dosis de RBV utilizada en los ensayos clínicos de pacientes coinfectados no ha sido uniforme. En algunos ha sido de 800 mg por temor a mayores tasas de efectos adversos que en monoinfectados y/o al desarrollo de interacciones medicamentosas. En otros en cambio se han utilizado dosis mayores alcanzando los 1.000 mg/d o ajustando la dosis al peso del paciente peso (<60 kg: 800 mg/d, 60-75 kg: 1.000 mg/d y >75 kg: 1.200 mg/d). En los ensayos clínicos en los que se ha usado RBV ajustada a peso, se han obtenido tasas de RVS más altas, por ello es la estrategia recomendada.
Dosis más elevadas de RBV o PEG como estrategia de inducción durante las primeras semanas del tratamiento no han obtenido tasas de respuesta más altas.
La duración del tratamiento en pacientes monoinfectados por VHC genotipo 1 habitualmente se programa para 48 semanas, aunque en pacientes que alcanzan RVR algunos estudios sugieren que se podría acortar la duración del tratamiento a 24 semanas sin comprometer la eficacia. En pacientes coinfectados por VIH/VHC se desconoce la duración óptima del tratamiento de la hepatitis crónica causada por VHC genotipo 1. Los ensayos clínicos se han diseñado habitualmente para una duración del tratamiento de 48 semanas. Diversos estudios han sugerido que la duración del tratamiento podría estar condicionada por la respuesta al mismo. De tal forma que se ha sugerido en respondedores lentos (pacientes que no alcanzan RVR o pacientes que no consiguen una RVP completa) debería extenderse el tratamiento hasta completar 72 semanas.
La ausencia de RVP (reducción ³2 log10 respecto a la basal ó viremia negativa a las 12 semanas de tratamiento) tiene un alto valor predictivo negativo sobre RVS por lo que, en esta situación, se recomienda la interrupción del tratamiento.
Tratamiento del VHC genotipo 1 con PEG/RBV mas Telaprevir o Boceprevir en monoinfectados.
Los primeros fármacos disponibles con acción directa anti-VHC son Boceprevir (BOC) y Telaprevir (TEL) (Liu et al., 2012. Ann Intern Med. 156:279-290.). Ambos fármacos son potentes inhibidores de la proteasa NS3 del VHC. Los ensayos clínicos de desarrollo de ambos fármacos se han llevado a cabo con distintas estrategia de tratamiento. En el caso de los ensayos clínicos de BOC se ha utilizado la llamada estrategia lead-in, en la cual los pacientes son tratados durante las 4 primeras semanas del tratamiento con PEG/RBV añadiéndose BOC a partir de la cuarta semana de tratamiento. En cambio en los ensayos clínicos de desarrollo de TEL se utilizó desde el inicio del tratamiento la combinación PEG/RBV/TEL.
La dosis de boceprevir es de 800 mg (4 cápsulas) cada 8 horas, administrados con comida. La dosis de telaprevir es de 750 mg (2 comprimidos) cada 8 horas, administrados con comida. En ambos fármacos los pacientes deben tragar los comprimidos enteros (sin masticar, triturar o disolver).
Boceprevir y telaprevir no están actualmente indicados en el tratamiento de la hepatitis crónica por el VHC causada por otros genotipos distintos al genotipo 1.
Evidencias en pacientes 'Naive':
En pacientes monoinfectados por VHC genotipo 1 se han llevado a cabo diversos ensayos clínicos para evaluar la eficacia y seguridad de BOC (SPRINT-1 y SPRINT-2) y TEL (ILLUMINATE) en pacientes naive (Poordad et al., 2011. N Engl J Med 364: 1195-206, Jacobson et al., 2011. N Engl J Med 364: 2405-16).
En los ensayos clínicos de desarrollo de BOC las tasas de RVS fueron significativamente superiores en cada uno de los grupos tratados con la asociación PEG/RBV/BOC [63% en grupo de pacientes con terapia guiada por respuesta (TGR= tiempo de tratamiento establecido en 24 o 48 semanas según se obtuviera o no RVR extendida definida como carga viral del VHC indetectable desde la semana 8 a la 24) y 66% en el grupo de pacientes con tratamiento de 48 semanas] que en los pacientes que recibieron terapia estándar con PEG/RBV (38%). En relación al polimorfismo de IL28B, no se observaron diferencias en términos de RVS entre los grupos experimentales y el grupo control en los pacientes con genotipo CC. Sin embargo si se observaron diferencias significativas en pacientes con genotipos no-CC. Por último no se observaron diferencias entre los grupos experimentales y la terapia estándar en aquellos pacientes que alcanzaron RVR (Poordad et al., 2011. N Engl J Med 364: 1195-206).
En los ensayos clínicos de desarrollo de TEL las tasas de RVS fueron significativamente superiores en los grupos tratados con la asociación PEG/RBV/TEL que en los que recibieron PEG/RBV (75% en el grupo de pacientes que recibieron TEL durante 8 meses, 69% en el que recibieron TEL durante 12 meses vs. 44% en el grupo control). La tasa de RVS aumentó de forma significativa a favor de los grupos que recibieron TEL tanto en pacientes con polimorfismo CC como no-CC de IL28. Por último en pacientes que alcanzaron RVR, el tratamiento con PEG/RBV se alcanzaron tasas superiores de RVS que en los que recibieron TEL (94% y 84% respectivamente) (Jacobson et al., 2011. N Engl J Med 364: 2405-16).
Evidencias en Pacientes con tratamiento previo
En pacientes monoinfectados por VHC genotipo 1 se han llevado a cabo diversos ensayos clínicos para evaluar la eficacia y seguridad de BOC (RESPOND-2) y TEL (ADVANCE y REALIZE) en pacientes pretratados (Bacon et al., 2011. N Engl J Med 364:1207-17; Zeuzem et al., 2011. N Engl J Med 364:2417-28).
En el estudio RESPOND-2, las tasas de RVS fueron significativamente superiores en los pacientes (tanto recidivas como respondedores parciales) tratados con boceprevir. Las tasas de RVS en pacientes con recidiva fueron 59% (terapia guiada por respuesta), 66% (tratamiento 48 semanas) vs. 21% (PEG/RBV). Las tasas de RVS en respondedores parciales fueron 40% (terapia guiada por respuesta), 52% (tratamiento 48 semanas) vs. 7% (PEG/RBV). Se observaron diferencias estadísticamente significativas en términos de RVS entre el grupo experimental (tratamiento 48 semanas) y el grupo PEG/RBV en pacientes con fibrosis F0/F1 (70% vs 25%), F2 (64% vs 15%) y F3/F4 (68% vs. 13%). En este ensayo clínico no se incluyeron pacientes con respuesta nula (null responders) al tratamiento previo.
En el estudio REALIZE las tasas de RVS fueron significativamente superiores en los pacientes tratados con TEL (administrado durante 12 semanas), tanto en recidivas (83% vs 24%), como en respuestas parciales (59% vs. 15%) y en no respondedores (29% vs. 5%). Estas diferencias se observaron con independencia del polimorfismo genético IL28B y del grado de fibrosis (fibrosis mínima: 85% vs. 35%, fibrosis portal: 81% vs. 28% y fibrosis en puentes/cirrosis: 84% vs. 13%).
Reglas de Parada
En el caso de tratamiento con PEG/RBV + TEL se deberá parar todo el tratamiento del VHC si la determinación de ARN-VHC en semana 4 ó 12 es > 1000 UI/mL.
En el caso de tratamiento con PEG/RBV + BOC se deberá parar todo el tratamiento del VHC si la determinación de ARN-VHC en semana 12 es > 100 UI/mL ó si permanece detectable en semana 24.
Si por cualquier razón se tuviera que suspender el tratamiento con PEG/RBV, también se deberá suspender el tratamiento con BOC ó TEL.
Tratamiento de la hepatitis Crónica por VHC con TEL ó BOC en pacientes coinfectados por VIH/VHC genotipo 1
Evidencias. Boceprevir y telaprevir han sido autorizados por la Comisión Europea mediante un procedimiento centralizado para su uso en pacientes monoinfectados por VHC genotipo 1. En la actualidad no esta aprobada su indicación pacientes infectados por el VIH. En España el acceso a los medicamentos en condiciones diferentes a las autorizadas está regulado por el Real Decreto 1015/2009, de 19 de junio. Esta regulación, establece que la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS) «podrá elaborar recomendaciones de uso de medicamentos en condiciones no contempladas en la ficha técnica cuando el uso del medicamento en estas condiciones suponga un impacto asistencial relevante». De este modo la AEMPS ha elaborado unas recomendaciones que regula y permite el uso de Boceprevir y Telaprevir en pacientes coinfectados por VIH/VHC. La experiencia en ensayos clínicos con ambos fármacos es limitada.
En un ensayos clínico, randomizado (2:1) doble ciego, controlado con placebo se comparó la eficacia y seguridad de BOC mas PEG/RBV versus PEG/RBV en pacientes coinfectados por VIH/VHC genotipo 1. Se incluyeron en el estudio 98 pacientes naive de los que 34 recibieron PEG/RBV y 64 BOC/PEG/RBV. Los pacientes que recibieron BOC presentaron una tasas de RVS (medida en semana + 12 de tratamiento) superiores a los que recibieron PEG/RBV (60,7% vs 26.5%, p<0.01). Conviene destacar que en el estudio de los pacientes que recibieron TAR basado en IP/r (Atazanavir, Darunavir ó Lopinavir), el 67% alcanzaron RVS. El porcentaje de pacientes que abandonaron el estudio por efectos adversos fue superior en la rama de BOC (20% vs. 9%).
En un ensayos clínico, randomizado, doble ciego, controlado con placebo se comparó la eficacia y seguridad de TEL mas PEG/RBV versus PEG/RBV en pacientes coinfectados por VIH/VHC genotipo 1. Se incluyeron en el estudio 60 pacientes naive de los que 22 recibieron PEG/RBV y 38 TEL/PEG/RBV. Los pacientes que recibieron TEL presentaron una tasas de RVS (medida en semana + 12 de tratamiento) superiores a los que recibieron PEG/RBV (74% vs 45%). El porcentaje de pacientes que abandonaron el estudio por efectos adversos fue superior en la rama de TEL (8% vs. 0%).
Indicación de tratamiento en pacientes coinfectados por VIH/VHC
Para la utilización de BOC o TEL en pacientes coinfectados por el VIH se requieren los siguientes criterios (10):
Criterios dependientes del VHC
A.- Infección por VHC genotipo 1, independientemente de que el paciente haya recibido o no tratamiento previo para el VHC
B.- Fibrosis F3 y F4 confirmada por biopsia hepática o rigidez hepática medida por Fibroscan >9.5 Kilopascales. Independientemente del grado de fibrosis, se podrá considerar iniciar tratamiento con BOC o TEL en pacientes con manifestaciones extrahepáticas graves de la infección por VHC como por ejemplo aquellas derivadas de la crioglobulinemia mixta policlonal.
C.- Hepatopatía crónica compensada (Child-Pugh grado A)
D.- Concentración de hemoglobina >11 g/dl en mujeres y >12 g/dl en hombres
Criterios dependientes del VIH
E.- Linfocitos CD4+ totales en sangre periférica >100 /ml o porcentaje de linfocitos CD4+ >12%
F.- Carga viral plasmática de VIH <1000 copias/ml (pacientes en TAR)
Estrategia de tratamiento según la realización o no de tratamiento previo y de la respuesta a este.
a) Enfermos naive:
Se recomienda considerar el inicio del tratamiento par el VHC genotipo 1 en todo paciente con un grado de fibrosis F3-F4. Con independientemente del genotipo de la ILB28 y de otras características basales del paciente se recomienda iniciar el tratamiento con PEG/RBV a dosis estándar durante 4 semanas actuando posteriormente en función de la respuesta obtenida. Aquellos pacientes que alcancen RVR (ARN-VHC indetectable en semana 4) podrían continuar el tratamiento con PEG/RBV sin necesidad de añadir TEL o BOC. Aquellos pacientes que no alcancen al menos una disminución del ARN-VHC de 1 log en la semana 4 del tratamiento con PEG/RBV presentan una baja probabilidad de alcanzar RVS. Por ello en estos casos se actuará en función del grado de fibrosis de los pacientes. En aquellos pacientes con alto riesgo de progresión de la hepatopatía (Fibroscan > 40 kPa) se continuará tratamiento añadiendo TEL o BOC ya que esta terapia es la única opción de evitar, aunque sea con muy baja probabilidad de éxito, la descompensación de la hepatopatía. En aquellos pacientes con menor probabilidad de progresión de la hepatopatía (F3 ó rigidez hepática inferior a 40 kPa) se suspenderá el tratamiento en espera de futuras opciones terapéuticas. En aquellos pacientes con descenso del ARN-VHC mayor de 1 log en semana 4 pero que no alcanzan RVR, se continuará el tratamiento añadiendo TEL o BOC.
El grupo HEPAVIR recomienda considerar el uso de PEG/RBV sin FAD en pacientes con genotipo CC de IL28 y carga viral del VHC baja (inferior a 600.00o copias/mL).
b) Recidivas tras un tratamiento con PEG/RBV.
En estos casos también se requerirá un grado de fibrosis F3 ó F4, ó rigidez hepática > 9.5 kPa para considerar iniciar el tratamiento. En caso de recidiva se recomienda iniciar el tratamiento siguiendo las recomendaciones de ficha técnica de cada uno de los medicamentos sin que sea necesario valorar la respuesta a la cuarta semana del tratamiento.
c) Respondedores parciales a un tratamiento con PEG/RBV
Se recomienda iniciar el tratamiento con PEG/RBV a dosis estándar durante 4 semanas actuando posteriormente en función de la respuesta obtenida. Para la toma de decisiones se utilizarán los mismos criterios expresados para el paciente naive.
d) Respondedores nulos a un tratamiento con PEG/RBV
Se consideran respondedores nulos a aquellos que no han alcanzado un descenso del ARN-VHC superior a 2 log a las 12 semanas de un tratamiento previo con PEG/RBV. La probabilidad de alcanzar RVS con un nuevo tratamiento con un régimen que incluya BOC ó TEL es muy baja. Por esta razón en esos pacientes se actuará según el riesgo de progresión de su hepatopatía. En caso de pacientes cirróticos con muy alta probabilidad de descompensación a corto plazo (rigidez hepática > 40 kPa) se recomienda iniciar tratamiento ya que el tratamiento con BOC ó TEL es la única opción de evitar, aunque sea con muy baja probabilidad de éxito, la descompensación de la hepatopatía. En el resto de paciente se considerará diferir el inicio del tratamiento con estrecha monitorización de los pacientes en espera de nuevas opciones de tratamiento.
e) Pacientes con terapia subóptima o respuesta al tratamiento previo desconocida.
En pacientes con tratamiento previo subóptimo (monoterapia con PEG, terapia combinada con Interferon no pegilado mas RBV), abandono del tratamiento sin causa médica, retirada del tratamiento por toxicidad que pudiera ser manejada con éxito en la actualidad (anemia sin uso de Eritropoyetina, reducción de dosis de ribavirina o trasfusiones, neutropenia sin uso de factores estimulantes de colonias de granulocitos, toxicidad por el uso concomitante de DDI, D4T ó AZT, depresión sin tratamiento ni profilaxis…), o respuesta al tratamiento previo desconocida, se recomienda actuar como en el caso de pacientes naive.
Tratamiento antirretroviral compatible con BOC ó TEL
BOC y TEL presenta interacciones con fármacos antiretrovirales que limitan su uso conjunto. En la actualidad se encuentra permitido el uso de BOC con los siguientes fármacos antiretrovirales: Análogos de nucleósidos (Abacavir; Emtricitabina, Lamivudina y Tenofovir) e inhibidores de la integrasa (raltegravir). No está permitido el uso de BOC con no Análogos de los nucleósidos, Inhibidores de la proteasa (existen discrepancia entre los estudios de interacciones farmacocinéticas realizados en voluntarios sanos y los resultados de ensayos clínicos que han demostrado altas tasas de RVS con ATV/r, DRV/r y LPV/r), Inhibidores del correceptor CCR5 e inhibidores de la entrada.
En la actualidad se encuentra permitido el uso de TEL con los siguientes fármacos antiretrovirales: Análogos de nucleósidos (Abacavir; Emtricitabina, Lamivudina y Tenofovir), inhibidores de la integrasa (raltegravir), No Análogos de los nucleósidos (Efavirenz, incrementando la dosis de telaprevir a 1.125 mg/8, Etravirina y Rilpivirina) e inhibidores de la proteasa (Atazanavir/ritonavir). No está permitido el uso de TEL con Inhibidores del correceptor CCR5 e inhibidores de la entrada (10).
Predicción de la Respuesta al tratamiento
La respuesta al tratamiento frente al VHC se asocia con una menor progresión de la fibrosis hepática y, por lo tanto, con una menor probabilidad de la muerte por hepatopatía en el paciente coinfectado por el VIH y el VHC. En la última década, el tratamiento estándar frente al VHC ha sido la biterapia con interferón pegilado (IFN-Peg) más ribavirina (RBV). Sin embargo, las tasas de respuesta virológica sostenida (RVS) que se alcanzan con este régimen son subóptimas (Neukam et al., 2009. Exp Opin Pharmacother 10: 417-433), obteniéndose unas tasas de RVS del 27-50%. Además, el tratamiento no está exento de efectos adversos, que pueden llegar incluso a ser graves. En pacientes coinfectados por el VIH, además, existen interacciones con el tratamiento antirretroviral (TAR), que supone una limitación de gran relevancia clínica. Por todo ello, la estimación de la probabilidad de la respuesta al tratamiento frente al VHC tiene una importante implicación clínica de modo que la identificación de pacientes con una probabilidad muy baja de alcanzar RVS podría ayudar a mejorar el manejo de este tratamiento. Así, se podría posponer el tratamiento en pacientes sin fibrosis hepática avanzada potenciales no respondedores al tratamiento, hasta que se aprueben los nuevos antivirales de acción directa para el paciente coinfectado por VIH/VHC, a fin de conseguir mayor eficacia. Por el contrario, individuos con una probabilidad muy alta de alcanzar RVS con IFN-Peg más RBV, podrían no beneficiarse del uso de los nuevos antivirales y por este motivo podrían ser tratados con biterapia.
Entre los factores predictores pre-tratamiento de RVS descritos en pacientes coinfectados por el VIH y el VHC, aquellos con mayor valor predictivos son el genotipo del VHC, la carga viral basal del VHC y las variaciones genéticas del huésped. Así, mientras que la tasa de respuesta al tratamiento con IFN-Peg más RBV observada en pacientes infectados por el genotipo 2 ó 3 oscila entre un 44-72%, en los pacientes infectados por el genotipo 1 ó 4, las tasas de RVS se encuentran entre el 17-35%. Del mismo modo, una carga viral plasmática basal menor de 600-800 kUI/ml se asocia con una mayor tasa de RVS en esta población.
Por otro lado, recientemente se han descrito varios marcadores genéticos del huésped con alto valor predictivo para respuesta al tratamiento. En este sentido, el polimorfismo (single nucleotide polymorphism, SNP) rs12979860 del nucleótido único situado en el cromosoma 19, en las proximidades del gen de la interleuquina 28B (IL28B), está asociado estrechamente con el aclaramiento del VHC inducido por el tratamiento con IFN-Peg más RBV (12-14). Así, un 71% de los portadores del genotipo CC (definido como genotipo favorable) de IL28B alcanzan RVS frente un 34% observado en portadores del genotipo no-CC. No obstante, las tasas de respuesta observadas en la población infectada por el genotipo 1 ó 4, portadores del genotipo de la IL28B favorable, son de un 50% entre los pacientes, por lo cual, una importante proporción de pacientes queda mal clasificada. Del mismo modo, se ha identificado el SNP rs14158 en el gen del receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL) como un importante predictor de la respuesta al tratamiento con IFN-Peg más RBV en pacientes coinfectados por VIH/VHC (Pineda et al., 2011. AIDS 25:1415-1420). No obstante, la gran importancia de este marcador radica en su efecto sinérgico con el genotipo de IL28B en pacientes infectados por el genotipo 1 ó 4 del VHC. En este sentido, pacientes coinfectados portadores de ambos genotipos favorables de la IL28B y de rs14158 (CC/CC) presentan una tasa de RVS del 70%, mientras que solamente un 14% de los pacientes portadores de los ambos genotipos desfavorables (no-CC/no-CC) alcanzan RVS (15-17).
Por último, la cinética viral en respuesta al tratamiento del VHC es de gran utilidad tanto para predecir la probabilidad de respuesta al tratamiento como para individualizar la duración, régimen de tratamiento, y su necesidad de discontinuación. En este sentido, la respuesta en semana 4 tras inicio del tratamiento es el factor mejor factor predictivo tanto al tratamiento estándar como a la triple terapia (Jacobson et al., 2011. N Engl J Med 364: 2405-16). Por otro lado, se ha observado que la cinética viral en los primeros días del tratamiento del VHC es una herramienta muy útil en la evaluación de factores predictivos de respuesta y en la comparación de la eficacia de distintos regímenes de tratamiento (Rivero-Juárez et al., 2012. J Antimicrob Chemother. Jan;67(1):202-5,).
Las células NK juegan un papel importante en la respuesta inmune innata y a la vez son los linfocitos más predominantes en el hígado [Borrego et al., 2002. Mol Immunol. 38: 637-60]. Se ha informado que una disminución de células NK intrahepática y en sangre periférica la infección por el VHC [Neukam et al., 2099. Exp Opin Pharmacother 10: 417-433] conduce a deficiencias en la activación de las células NK que podría favorecer la cronificación de la enfermedad. El tratamiento del VHC, sin embargo, parece conducir a una activación masiva de la respuesta inmune innata [Rivero-Juárez et al., 2012. J Antimicrob Chemother. Jan;67(1):202-5] y de las células NK debido al hecho de que el IFN-α es un potente activador de estas células[Pineda et al., 2010. Clin Infect Dis. Oct 1; 51(7):788-95]. Los receptores de células Natural Killer (receptores KIR) son receptores que se encuentran en su superficie asociados ya sea con la activación de estas células (S-KIR o con su inhibición L-KIR [Pineda et al., AIDS 2011, 25:1415-1420]. La presencia de varios receptores KIR (2DL2, 2DL3, 2DS1 2DS2 y 3DL1) se ha asociado con el grado de eficiencia del tratamiento del virus HCV [Neukam et al., 2011. J Acquir Immune Defic Syndr. Dec 1;58(4):e115-7]. Así, la expresión de S-KIR en la superficie de la célula NK promueve la citolisis y la producción de IFN-gamma contra células diana que expresan específicamente ligandos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I [Borrego et al., 2002. Mol Immunol. 38: 637-60]. Esto indica que la acción KIR está condicionada por la presencia de un ligando específico en la célula diana, por ello y, con el fin de evaluar la posible influencia de los KIR en la respuesta al tratamiento, es necesario determinar la presencia de su ligando específico.
El receptor KIR3DS1, que sabemos tiene acción activante de las células NK, se ha descrito como poseedor de un papel protector contra el desarrollo del carcinoma hepatocelular en pacientes infectados por el VHC [Borrego et al., 2002. Mol Immunol. 38: 637-60]. Sin embargo, su impacto sobre el resultado del tratamiento del VHC no se ha descrito.
Es importante, por tanto, encontrar nuevos biomarcadores que puedan emplearse para predecir la respuesta al tratamiento del VHC.
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DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento del HCV, y específicamente, al tratamiento con Peg-IFN/RBV. Los autores de la presente invención han encontrado un biomarcador útil para predecir la respuesta al tratamiento de la hepatitis C, que es una característica clave de la práctica clínica para determinar el tratamiento en pacientes VHC del genotipo 1 co-infectados con VIH, y que podrían conducir a los médicos a detectar aquellos pacientes con una probabilidad mayor a responder a la terapia Peg-IFN/RBV.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso del gen KIR3DS1para predecir la respuesta de un individuo al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina. En una realización preferida, el análogo de la guanosina es la ribavirina (RBV).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo está coinfectado por el VIH y el VHC. En otra realización preferida, el VHC es del genotipo 1.
La terapia antiviral va dirigida básicamente a lograr unos objetivos virológicos, bioquímicos e histológicos. La evaluación de la respuesta al tratamiento, se basa en el efecto del mismo sobre el estado virológico, no sólo al terminar el tratamiento sino, lo que es más importante, en su seguimiento después de finalizado el mismo. Tal y como se entiende en esta memoria, se denomina 'respuesta virológica sostenida' o 'respuesta viral sostenida' (RVS) la negativización de la viremia (ARN viral negativo mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa -PCR-) que se mantiene al menos 24 semanas después de finalizado el tratamiento; o dicho de otra manera, la ausencia en el suero del ARN-VHC a los 6 meses de finalizado el tratamiento.
La negativización de la viremia al final del tratamiento, con reaparición del ARN una vez terminado el mismo, define la 'respuesta virológica con recaída'. La ausencia de negativización de la viremia al final del tratamiento define la 'no respuesta virológica' al tratamiento.
El 'interferón alfa' (IFN-α) es una citocina inmunomoduladora que posee actividad antiviral, propiedades antiangiogénicas y antiproliferativas. El IFN-Peg se obtiene mediante la unión fisicoquímica de polietilenglicol (PEG) al interferón alfa (peginterferón α-2a y α-2b) recombinante, lo que aumentan su permanencia en la sangre requiriendo menor frecuencia de inyecciones.
Actualmente existen dos tipos de interferones pegilados comerciales cuya aplicación se ha extendido: peginterferón alfa-2a (Pegasys®, Roche) y peginterferón alfa-2b (Pegintron®, Schering-Plough). Estos dos productos son semejantes con respecto a su eficacia y seguridad pero sus regímenes de dosificación difieren levemente.
La ribavirina (1-β-D-ribofuranosil-1H-1 ,2,4-triazol-3-carboxamida) es un nucleótido sintético análogo de la guanidina, con propiedades antivirales y actividad inmunorreguladora. Fue una de las primeras drogas que demostró su eficacia para reducir la capacidad de reproducción de virus. Está descrita en el Índice Merck, compuesto N º 8199, undécima edición. Su fabricación y formulación se describen en la patente de EE.UU. n. No. 4.211.771.
La rápida captación eritrocitaria de la ribavirina y su fosforilación son responsables de la importante anemia hemolítica dependiente de la dosis. Con el fin de evitar este efecto indeseado, el diseño de los nuevos fármacos contempla que no sean captados o fosforilados por los eritrocitos o que sean captados rápidamente y fosforilados en el hígado. Ambos enfoques tienen la desventaja potencial de que pueden anular pasos fundamentales que contribuyen con la eficacia terapéutica de la ribavirina.
Otros derivados, profármacos o análogos de la ribavirina son la viramidina y la levovirina.
La viramidina es un profármaco de la RBV, en el hígado se convierte en RBV por acción de la adenosindeaminasa hepática. La RBV y viramidina son rápidamente eliminadas, sus moléculas y los metabolitos son excretados por el riñón y tienen una Tmáx de 1,5-3 h. Experimentalmente, la retención hepática de la RBV derivada de una dosis oral de viramidina es 3 veces mayor que la RBV oral. En cambio, la concentración de fosfatos de RBV en los hematíes es mucho menor, de ahí que se pueda mantener una concentración más estable de hemoglobina. Es un fármaco seguro y se tolera bien. Los efectos adversos con dosis de 200, 600 y 1.200 mg fueron: 0, 26 y 50%, respectivamente; la mayoría leves y desaparecieron sin secuelas.
La levovirina es la L-enantiomero de la RBV y no origina anemia hemolítica. Tiene una actividad inmunomoduladora similar a la RBV, pero no tiene actividad antiviral directa.
Otros posibles análogos se describen, por ejemplo, pero sin limitarnos, en la patente WO 2010/135520.
La ribavirina por sí sola no es eficaz contra el VHC, pero cuando se la combina con interferón, los índices de erradicación viral son mucho mejores comparados con aquellos logrados solamente con interferón.
El 'genotipo del VHC', o 'cepa viral' se determina por una prueba de sangre. El virus de la hepatitis C se ha clasificado en seis genotipos distintos en base a diferencias en sus genomas, estos genotipos a su vez se subdividen. La preponderancia y distribución de dichos genotipos varía de modo global. Por ejemplo, en Norte América predomina el genotipo 1, seguido de 2 y 3. En Europa predomina el genotipo 1 seguido de 3, 4 y 2. Los genotipos 4 predomina en Egipto, 5 se da casi exclusivamente en África y genotipo 6 en el sudeste asiático.
El genotipo tiene importancia clínica ya que determina la respuesta potencial de la terapia actual y la duración que va a requerir la misma. Los genotipos 1 y 4 responden menos a dicho tratamiento que los otros (genotipos 2, 3, 5 y 6). La duración de la terapia estándar basada en el interferón para los genotipos 1 y 4 es de 48-72 semanas, mientras que para los genotipos 2 y 3 es solo de 12-24 semanas. En resumen, algunos genotipos del VHC, tales como los tipos 2 y 3, son más fáciles de erradicar que el tipo 1.
Se denomina 'carga viral plasmática basal de ARN del VHC', a la cantidad de ARN del VHC en la sangre (suero). Su presencia es indicativa de una infección activa con reproducción viral en curso. La carga viral suele expresarse en unidades logarítmicas [log10 IU/ml].
Para el pronóstico se considera que a mayor carga viral basal, menor probabilidad de una respuesta sostenida. La respuesta al tratamiento antiviral se evalúa con una carga viral basal (pre-tratamiento) y al menos una carga viral al término de éste y a las 24 semanas post tratamiento. Se considera una respuesta al tratamiento antiviral si se obtiene una carga viral indetectable al término del tratamiento y una carga viral indetectable y/o ARN cualitativo negativo a las 24 semanas (respuesta viral sostenida). Igualmente se ha determinado que una caída de la carga viral temprana (respuesta viral precoz), con descenso de 2 log10 UI/ml o más a las 12 semanas intra-tratamiento, permite evaluar anticipadamente la probabilidad de obtener una respuesta virológica sostenida al término de la terapia.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso simultáneo de los genes KIR3DS1eIL28Bpara predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina.
El genotipaje del gen 'IL28B' se puede obtener, preferiblemente, pero sin limitarnos, secuenciando el gen completo pero aún más preferiblemente, se obtiene analizando el polimorfismo de nucleótido único (single nucleotide polymorphism, SNP) rs12979860 (SEQ ID NO: 5) situado en el cromosoma 19, en las proximidades del gen de la interleucina 28B (IL28B).
La secuencia nuleotídica de SEQ ID NO: 6 es:
CTGAACCAGGGAGCTCCCCGAAGGCG[C/T]GAACCAGGGTTGAATTGCACTCCGC
MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES, MÉTODO DE PRONÓSTICO Y PREDICCIÓN DE LA RESPUESTA VIRAL SOSTENIDA AL TRATAMIENTO DEL VHC CON QUIMIOTERAPIA
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la RVS al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
b) determinar el genotipo del gen KIR3DS1y de su ligandoBw4en la muestra aislada de (a).
La presencia en un paciente del gen KIR3DS1 favorece la respuesta al tratamiento con Interferón pegilados (IFN-PEG) y Ribavirina (o análogos). Además, los autores de la presente invención han determinado que:
  1. 1. La presencia conjunta del gen KIR3DS1 y su ligando HLA-Bw4 supone un factor de mejor respuesta que cuando se presenta sólo el KIR3DS1.
  1. 2. La presencia conjunta del gen KIR3DS1 sin el ligando HLA-Bw4 y de la variante polimórfica de IL28B CC responden mejor que aquellos enfermos que poseen sólo bien el gen KIR3DS1 o bien la variante IL28B CC.
  1. 3. En todo caso la mejor combinación predictiva de buena respuesta se presenta en aquellos enfermos que presentan simultáneamente los genes KIR3DS1, HLA-Bw4 y además IL28B CC.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la RVS al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención, y además comprende:
c) clasificar a los individuos que presentan el genotipo KIR3DS1, en el grupo de pacientes buenos respondedores al tratamiento o con un mejor pronóstico.
En una realización preferida, el método permite clasificar a los individuos que presentan el genotipo KIR3DS1 y su ligando funcional Bw4, en el grupo de pacientes buenos respondedores al tratamiento o con un mejor pronóstico.
En otra realización preferida, el análogo de la guanosina es la ribavirina (RBV).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo está coinfectado por el VIH y el VHC. En otra realización preferida, el VHC es del genotipo 1.
Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).
El término 'muestra biológica aislada' incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, como sangre, suero, orina, saliva, fluido cerebroespinal, o a una muestra sólida o semisólida, como tejidos, heces, y similar, o alternativamente, un tejido sólido tales como aquellos usados habitualmente en diagnóstico histológico, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia.
Existen más de 100 métodos distintos de genotipado de SNPs, siendo cualquiera aplicable en la presente invención. Por ejemplo, sin limitarnos, puede detectarse empleando desde enzimas de restricción o por secuenciación simple mediante PCR, sondas ASO e hibridación en Micromatrices de ADN o esferas. Así, por ejemplo, como métodos de amplificación de SNPs se encuentran la PCR, el método Invader, la amplificación por ADN de círculo rodante, etc. Como métodos de discriminación alélica, pueden emplearse, pero sin limitarnos, hibridación específica de alelo, ligamiento de oligonucleótidos específicos de alelo, minisecuenciación o extensión de sondas (SBE, Single Base Extension), rotura invasiva específica de alelo (Invader), etc. Según el formato de detección, podemos citar, también sin limitarnos, el uso de sondas Taqman, de molecular beacons, scorpion, etc. Respecto a reacciones en un soporte sólido, tenemos, por ejemplo, biochips y microarrays de ADN, u otros métodos que emplean partículas, como por ejemplo, Luminex 100, BeadArray, etc. También existen métodos de detección masiva, como la pirosecuenciación, o la miniaturización.
En otra realización preferida, el genotipado de KIR3DS1 se realiza mediante PCR, y más preferiblemente, con los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, o con los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
En una realización preferida de la presente invención, el genotipado de KIR3DS1 se ha realizado siguiendo el método descrito en Vilches et al., 2007. Tissue Antigens. Nov; 70(5):415-22.
En una realización particular, en cada reacción 100 ng de ADN genómico son amplificados en 10 m l de buffer de PCR (67 mM Tris-HCL pH 8.8, 16 mM (NH4)2 SO4, 2 mM MgCl2, 0.01% Tween 20, 100 μM dNTP conteniendo 0.3 u de Taq polimerasa (ECO Taq, Ecogen SRL, Barcelona, España).
Las condiciones de PCR fueron:
2 min a 95º de desnaturalización seguidos de 10 ciclos de 10 s a 94ºC, 40 s a 65ºC y 20 ciclos de 20 s a 94ºC, 20 s a 61ºC y 30s a 72ºC. 5 m l del producto de amplificación se corrieron en un gel de agarosa al 3% con distancia de migración de 3 cm.
En otra realización preferida, el paso (b) de cualquiera de los métodos de la invención, además comprende determinar el genotipo del genIL28B. Más preferiblemente, la determinación del genotipo de IL28Bse realiza analizando las variaciones en el SNP rs12979860.
El gen KIR3DS1,o también killer cell immunoglobulin-like receptor, three domains, short cytoplasmic tail, 1 (KIR-G1; NKAT10; CD158E2; KIR-123FM) pertenece a los genes de la familia KIR, killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs), y son glicoproteínas transmembranales expresadas por las células natural killer y subconjuntos de células T. Los genes KIR son polimórficos y altamente homólogos, y se encuentran en un cluster en el cromosoma 19(19q13.4) en el complejo del receptor de leucocitos (LRC).
En el contexto de la presente invención, KIR3DS1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR3DS1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 2.
En la presente invención 'pronóstico' se entiende como la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05.
Por 'predicción de la respuesta' se entiende, en el contexto de la presente invención, la determinación de la probabilidad de que el paciente responda de forma favorable o desfavorable a una terapia o a un tratamiento determinado. Especialmente, el término 'predicción', como se usa aquí, se refiere a una evaluación individual de cualquier parámetro que pueda ser útil en determinar la evolución de un paciente. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta clínica al tratamiento, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados o evaluados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que tienen una probabilidad aumentada de tener una respuesta positiva. El experto en la materia puede determinar fácilmente si un sujeto es estadísticamente significativo usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de los valores de p, prueba t de Student, prueba de Mann Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%), al menos del 95%>. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1 ó 0,05. La predicción de la respuesta clínica se puede hacer utilizando cualquier criterio de valoración usado en oncología y conocido por el experto en la materia.
A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos o tratamiento adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
El término 'individuo', tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término 'individuo' no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO, MICROARRAY Y USOS
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de aquí en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar el genotipo del gen KIR3DS1
En otra realización preferida el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen KIR3DS1(SEQ ID NO: 1).
Más preferiblemente, el kit de la invención comprende los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5
Iniciador o cebador directo Iniciador o cebador reverso
cat cgg ttc cat gat gcg (SEQ ID NO: 3) cca cga tgt cca gggga (SEQ ID NO: 5)
cat cag ttc cat gat gcg (SEQ ID NO: 4)
Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar el genotipo del gen KIR3DS1 por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
Es también posible que el (los) oligonucleótido(s) o sondas estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, que normalmente corresponde a una secuencia concreta de ADN,. Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende al menos una sonda para detectar el genotipo del gen KIR3DS1 .
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos son construidas en la superficie de un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehídos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Más preferiblemente, el kit o dispositivo, y/o el microarray además comprende una o varias sondas necesarias para detectar el haplotipo del gen IL28B
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo, la micromatriz, o el microarray de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina. En una realización preferida, el análogo de la guanosina es la ribavirina (RBV).
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención (del primer o del segundo método de la invención).
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Los términos 'polinucleótido' y 'ácido nucleico' se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos 'secuencia aminoacídica', 'péptido', 'oligopéptido', 'polipéptido' y 'proteína' se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra 'comprende' y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Declive viral del HCV para KIR3DS1 y sus ligandos en pacientes portadores de los genotipos IL28B-CC (1A) o IL28B no-CC (1B).
Fig. 2. La HCV viral desciende significativamente en enfermos que poseen el gen KIR3DS1 y su ligando HLA-Bw4 en pacientes que poseen el genotipo IL28B-CC (2A) o IL28B non-CC genotipos (2B) durante las primeras horas del tratamiento con Peg-IFN/RBV
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
A continuación se ilustrará la invención mediante la exposición de los resultados obtenidos por los inventores. Estos ponen de manifiesto la especificidad y eficacia de la invención para obtener datos útiles en la predicción de la respuesta al tratamiento de individuos coinfectados con VIH y HCV.
Pacientes
En el estudio prospectivo se han incluido pacientes con hepatitis C crónica, del genotipo 1, recibiendo terapia combinada de Peg-IFN/RBV. El criterio empleado para determinar la terapia de la hepatitis fue el seguido por las directrices internacionales (20). Se recogieron las características clínicas, virológicas y del hospedador. El estado de fibrosis se determinó se determinó mediante biopsia o elastografía hepática transitoria (FibroScan ®, Echosen, París). La fibrosis significativa se define como una fibrosis F3-F4 puntuación de METAVIR en la biopsia hepática o un valor de rigidez hepática de ≥ 11 kPa.
Regímenes de tratamiento
Todos los individuos fueron tratados con Peg-IFN α2 a dosis de 180 μg, combinada con una dosis de ribavirina ajustada al peso (1000 mg/día para <75 kg, 1200 mg/día para ≥ 75 kg), en concordancia con las directrices internacionales (20), y completado al menos 4 meses de tratamiento.
Evaluación virológica y la definición de la respuesta al tratamiento
Las cargas plasmáticas de ARN VHC ARN se midieron al inicio del estudio y en las semanas 1, 2 y 4, usando un ensayo de PCR cuantitativa (Cobas TaqMan, Roche Diagnostic Systems Inc., Pleasanton, CA, EE.UU.), con un límite de detección de 15 UI / ml.
La respuesta virológica sostenida (SVR RVS) se define como un nivel indetectable de ARN del VHC en suero 24 semanas después de la finalización de la terapia del VHC. ARN del VHC indetectable en plasma del en la semana 4 se considera una respuesta virológica rápida (RVR).
Genotipado de polimorfismos de nucleótido único (SNP)
Se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN automatizado MagNA Pure (Roche Diagnostics Corporation. Indianapolis, IN 46250, EE.UU.). Se genotipó el SNP rs129679860, ubicado a 3 kilobases upstream de la IL28B y en linkage disequilibrium con una variante codificante no-sinónimo del gen IL28B (213A> G, K70R; rs81031142). El genotipado se llevó a cabo utilizando el acostumbrado ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.), en ADN aislado a partir de las muestras de sangre total, utilizando un termociclador con Stratagene MX3005 MxPro software (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.), según instrucciones del fabricante. Los investigadores responsables de genotipado no tuvieron acceso a los datos de los pacientes. El genotipo IL28B se definió como CC o no-CC (TT / CT).
Genotipado KIR
El genotipado KIR se realizó con cebadores específicos de secuencia capaces de detectar la presencia de 16 genes KIR diferentes utilizados previamente por Gómez-Lozano et al [21]. Este método proporciona un alto grado de resolución, ya que cada pareja de cebadores identifica dos sitios polimórficos vinculados, cis-ubicados (Invitrogen Corporation).
Genotipado antígeno leucocitario humano (HLA)-B
La genotipificación HLA-B se realizó con el INNO-LiPA HLA-B Kit Multiplex (Innogenetics NV), utilizando primers múltiplex HLA-B para amplificación de ácido nucleico de los exones segundo a cuarto del locus HLA-B, y los primers HLA-Bw4 para el exón 2 de los alelos HLA-BW4. Este procedimiento está basado en el método de PCR-SSO reversa. Siguiente alelos HLA-B y BW4 o Bw6 especificidades se determinaron con LIRASTM software para INNOLIPA HLA. Los pacientes portadores de la KIR3DS1 se definieron sobre la base de ligandos específicos Bw4 (KIR3DS1/Bw4) o Bw6 (KIR3DS1/Bw6) [22].
Análisis estadístico
Las variables continuas se expresaron como media ± desviación estándar o la mediana y los cuartiles (Q1-Q3) y se analizaron mediante el test de la t de Student, la prueba de Mann-Whitney U-test o el test de Kruskal-Wallis. Las variables categóricas se expresaron como número de casos (en porcentaje). Las frecuencias se compararon mediante la prueba de χ2 o la prueba exacta de Fisher. La significación se fijó a un valor de p menor de 0,05. Las reducciones en plasma de ARN del VHC fueron analizadas por IL28B y KIR3DS1 entre el inicio y la semana 1, semana 2 y a las 4 semanas. Las tasas de RVS y RVR se analizaron en términos de los genotipos KIR3DS1 y IL28B. Para los fines de este análisis, se evaluó la SVR en el enfoque del tratamiento, con exclusión de aquellos que voluntariamente abandonaron o interrumpieron el tratamiento debido a eventos adversos. Se realizó un modelo de regresión lineal de la disminución viral del VHC desde el inicio hasta semanas 1, 2 y 4.
El análisis se realizó con el paquete estadístico SPSS versión 18.0 (IBM Corporation, Somers, NY, EE.UU.).
Aspectos éticos
El estudio se diseñó y llevó a cabo de acuerdo a la Declaración de Helsinki y aprobado por el comité ético del Hospital Reina Sofía, Córdoba, España. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes de participar en el estudio.
RESULTADOS
Características basales de los pacientes
Sesenta pacientes coinfectados por VIH / VHC de genotipo 1 fueron incluidos en este estudio prospectivo. Las características basales se muestran en la Tabla 1. 21 (35%) pacientes portaban el genotipo IL28B-CC y 39 (65%), el genotipo IL28B no CC.
Veinticuatro (40%) pacientes tuvieron KIR3DS1, y 36 (60%) no. Entre los pacientes con KIR3DS1, 13 (54,1%) tenían ligando específico Bw4 y
11 (45,9%) Bw6. La distribución de KIR3DS1 y su ligandos por genotipo IL28B se muestra en la Tabla 2. En nuestro estudio, todos los pacientes IL28B-CC con KIR3DS1 tenido el ligando específico Bw4, mientras que sólo el 38,8% IL28B de no-CC pacientes portadores de KIR3DS1 tenía este ligando (p = 0,016).
Influencia de KIR3DS1 y IL28B en descenso viral del VHC
Como se muestra en la Figura 1, los pacientes con KIR3DS1 y ligando específico Bw4 mostraron una mayor disminución viral del VHC que aquellos que no lleva KIR3DS1 o con KIR3DS1/Bw6 en la semana 1 (KIR3DS1/Bw4: 1,47 ± 0,49; KIR3DS1/Bw6: 0,508 ± 0,41; No KIR3DS1: 0,48 ± 0,37 UI log10/ml, p = 0,01), la semana 2 (KIR3DS1/Bw4: 1,82 ± 0,47; KIR3DS1/Bw6: 1,29 ± 0,61; No KIR3DS1: 0,77 ± 0,49 UI log10/ml, p = 0,038) y la semana 4 (KIR3DS1/Bw4: 2,53 ± 0,56; KIR3DS1/Bw6: 1,71 ± 0,74; No KIR3DS1: 1,47 ± 0,81 UI log10/ml, p = 0,03). Un punto clave de los resultados es que no se encontraron diferencias en ninguno de los puntos de tiempo analizados entre los pacientes portadores de KIR3DS1/Bw6 y los que no tienen KIR3DS1 (semana1: p = 0,527; Semana2: p = 0,173; 4 semanas: p = 0.358) (Fig. 1).
Los portadores del genotipo IL28-CC mostraron una mayor reducción de los niveles plasmáticos de ARN del VHC que los no portadores del genotipo CC en cada momento analizado (semana 1: 0,98 ± 0,72 frente a 0,39 ± 0,51 UI log10/ml, p = 0,017; semana 2: 1,67 ± 0,81 frente a 0,83 ± 0,77 UI log10/ml, p = 0,028; 4 semanas: 2,28 ± 0,62 frente a 1,47 ± 1,06 UI log10/ml, p = 0,037).
Influencia del genotipo tanto IL28B como KIR3DS1 en el aclaramiento viral del VHC
Entre los portadores del genotipo IL28B-CC, los que tienen KIR3DS1/Bw4 tenían mayores tasas de aclaramiento viral del VHC que aquellos que KIR3DS1 no eran portadoras (semana 1: 2,51 ± 0,67 frente a 0,501 ± 0,41 UI log10/ml, p <0,001, semana 2: 2,82 ± 0,73 frente a 1,39 ± 0,72 UI log10/ml, p = 0,01; 4 semanas: 3,62 ± 0,78 frente a 1,98 ± 0,98 UI log10/ml, p = 0,02) (Fig. 2A). Sin embargo, entre los pacientes de genotipo IL28B no-CC, se hubo diferencias de aclaramiento viral del VHC entre los que llevan a KIR3DS1/Bw4 y los que no están llevando KIR3DS1/Bw4 (semana 1: 0,78 ± 0,57 frente a 0,41 ± 0,39 UI log10/ml, p = 0,476; semana 2: 1,01 ± 0,67 frente a 1,03 ± 0,82 UI log10/ml, p = 0,699; 4 semanas: 1,97 ± 0,86 frente a 1,51 ± 0,84 UI log10/ml, p = 0,755) (Fig. 2B)
Cuando la eliminación del virus HCV se comparó en pacientes portadores KIR3DS1/Bw4, aquellos con el genotipo IL28B-CC tenían tasas más altas de disminución viral que aquellos con la IL28B no genotipo CC (semana 1: p < 0,001, semana 2: p = 0,03; 4 semanas: p = 0,037). Por otro lado, cuando se comparó a pacientes que no portaban KIR3DS1/Bw4, no hubo diferencias en la eliminación del virus VHC en las primeras semanas de tratamiento en el base de genotipo IL28B (semana 1: p = 0,827; semana 2: p = 0,725; 4 semanas: p = 0.429).
Los modelos de regresión lineal de disminución viral del VHC desde el inicio hasta las semanas 1, 2 y 4 se muestran en la Tabla 3.
Tratamiento de la tasa de respuesta
Once (18,3%) pacientes abandonaron el tratamiento debido al abandono de la terapia o un acontecimiento adverso. Los pacientes portadores de KIR3DS1/Bw4 lograron mayores tasas de RVR y de RVS que los que no portaban KIR3DS1/Bw4 (RVR: 6 [46.15%] frente a 8 [17,02%], p = 0,012; SVR: 7 [63,6%] frente a 13 [26,5%], p = 0,031). Los pacientes con el genotipo IL28B-CC mostraron tasas más altas de RVR y RVS que los que tienen el IL28B no genotipo CC (RVR: 8 [38.01%] versus 5 [12,8%], p = 0,03; SVR: 10 [55,5%] frente a 10 [32,2%], p = 0,027) RVR y las tasas de RVS según el genotipo IL28B y la presencia de KIR3DS1 se muestran en la Tabla 4.
Sequence List Text
<110> UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
SERVICIO ANDALUZ DE SALUD
<120> Método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta
al tratamiento de la Hepatitis C.
<130> FIBICO-72
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 382
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Leu Leu Met Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Leu Phe Leu Val
1 5 10 15
Gln Arg Ala Gly Pro His Met Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe Leu Ser
20 25 30
Ala Trp Pro Ser Ala Val Val Pro Arg Gly Gly His Val Thr Leu Arg
35 40 45
Cys His Tyr Arg His Arg Phe Asn Asn Phe Met Leu Tyr Lys Glu Asp
50 55 60
Arg Ile His Val Pro Ile Phe His Gly Arg Ile Phe Gln Glu Gly Phe
65 70 75 80
Asn Met Ser Pro Val Thr Thr Ala His Ala Gly Asn Tyr Thr Cys Arg
85 90 95
Gly Ser His Pro His Ser Pro Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro
100 105 110
Met Val Ile Met Val Thr Gly Asn His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala
115 120 125
His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Gly Glu Arg Val Ile Leu Gln Cys
130 135 140
Trp Ser Asp Ile Met Phe Glu His Phe Phe Leu His Lys Glu Trp Ile
145 150 155 160
Ser Lys Asp Pro Ser Arg Leu Val Gly Gln Ile His Asp Gly Val Ser
165 170 175
Lys Ala Asn Phe Ser Ile Gly Ser Met Met Arg Ala Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Thr Pro Tyr Gln Leu Ser Ala
195 200 205
Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Val Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro
210 215 220
Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Lys Val Gln Ala Gly Glu Ser Val
225 230 235 240
Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu Ser
245 250 255
Arg Glu Gly Gly Ala His Glu Arg Arg Leu Pro Ala Val Arg Lys Val
260 265 270
Asn Arg Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly
275 280 285
Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg His Ser Pro Tyr Glu Trp
290 295 300
Ser Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser
305 310 315 320
Ser Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Ser Gly Asn Leu
325 330 335
Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe
340 345 350
Thr Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys
355 360 365
Lys Cys Cys Cys Asn Gly Pro Arg Ala Cys Arg Glu Gln Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 1741
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ccggcagcac catgttgctc atggtcgtca gcatggcgtg tgttgggttg ttcttggtcc 60
agagggccgg tccacacatg ggtggtcagg acaagccctt cctgtctgcc tggcccagcg 120
ctgtggtgcc tcgcggagga cacgtgactc ttcggtgtca ctatcgtcat aggtttaaca 180
atttcatgct atacaaagaa gacagaatcc acgttcccat cttccatggc agaatattcc 240
aggagggctt caacatgagc cctgtgacca cagcacatgc agggaactac acatgtcggg 300
gttcacaccc acactccccc actgggtggt cggcacccag caaccccatg gtgatcatgg 360
tcacaggaaa ccacagaaaa ccttccctcc tggcccaccc aggtcccctg gtgaaatcag 420
gagagagagt catcctgcaa tgttggtcag atatcatgtt tgagcacttc tttctgcaca 480
aagagtggat ctctaaggac ccctcacgcc tcgttggaca gatccatgat ggggtctcca 540
aggccaattt ctccatcggt tccatgatgc gtgcccttgc agggacctac agatgctacg 600
gttctgttac tcacaccccc tatcagttgt cagctcccag tgatcccctg gacatcgtgg 660
tcacaggtct atatgagaaa ccttctctct cagcccagcc gggccccaag gttcaggcag 720
gagagagcgt gaccttgtcc tgtagctccc ggagctccta tgacatgtac catctatcca 780
gggagggggg agcccatgaa cgtaggctcc ctgcagtgcg caaggtcaac agaacattcc 840
aggcagattt ccctctgggc cctgccaccc acggagggac ctacagatgc ttcggctctt 900
tccgtcactc tccctacgag tggtcagacc cgagtgaccc actgcttgtt tctgtcacag 960
gaaacccttc aagtagttgg ccttcaccca cagaaccaag ctccaaatct ggtaacctca 1020
gacacctgca cattctgatt gggacctcag tggtcaaaat ccctttcacc atcctcctct 1080
tctttctcct tcatcgctgg tgctccaaca aaaaaaaatg ctgctgtaat ggaccaagag 1140
cctgcaggga acagaagtga acagcgagga ttctgatgaa caagaccatc aggaggtgtc 1200
atacgcataa ttggaacact gtgttttcac acagagaaaa atcactcgcc cttctcagag 1260
gcccaagaca cccccaacag ataccagcat gtacatagaa cttccaaatg ctgagcccag 1320
atccaaagtt gtcttctgtc cacgagcacc acagtcaggc cttgagggga tcttctaggg 1380
agacaacagc cctgtctcaa aactgggttg ccagctccca tgtaccagca gctggaatct 1440
gaaggcatca gtcttcatct tagggcatcg ctcttcctca caccacaaat ctgaatgtgc 1500
ctctcacttg cttacaaatg tctaaggtcc ccactgcctg ctggagaaaa aacacactcc 1560
tttgcttagc ccacagttct ccatttcact tgacccctgc ccacctctcc aacctaactg 1620
gcttacttcc tagtctactt gaggctgcaa tcacactgag gaactcacaa ttccacacat 1680
acaagaggct ccgtcttaac gcagcactta gacacgtgct gttccacctt ccctcatgct 1740
g 1741
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iniciador o cebador directo
<400> 3
catcggttcc atgatgcg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Iniciador o cebador directo
<400> 4
catcagttcc atgatgcg 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Iniciador o cebador indirecto
<400> 5
ccacgatgtc cagggga 17
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ctgaaccagg gagctccccg aaggcgygaa ccagggttga attgcactcc gc 52

Claims (24)

  1. El uso del gen KIR3DS1para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina.
  2. El uso del gen KIR3DS1según la reivindicación anterior, donde el análogo de guanosina es la ribavirina (RBV).
  3. El uso del gen KIR3DS1según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el individuo está coinfectado por el VIH y el VHC.
  4. El uso del gen KIR3DS1según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el VHC es del genotipo 1.
  5. El uso del gen KIR3DS1según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en combinación con el genIL28B.
  6. Un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la RVS al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
    a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
    b) detectar el genotipo del gen KIR3DS1,en la muestra aislada de (a).
  7. El método según la reivindicación anterior, que comprende detectar el genotipo del gen KIR3DS1, y además el de su ligando Bw4 , en la muestra aislada de (a).
  8. Un método para predecir o pronosticar la Respuesta Viral Sostenida (RVS) al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina, que comprende los pasos (a) y (b) cualquiera de las reivindicaciones 6-7, y además comprende:
    c) clasificar a los individuos que presentan el genotipoKIR3DS1,en el grupo de pacientes buenos respondedores al tratamiento o con un mejor pronóstico.
  9. Un método para predecir o pronosticar la Respuesta Viral Sostenida al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina, que comprende los pasos (a) y (b) cualquiera de las reivindicaciones 6-7, y además comprende:
    c) clasificar a los individuos que presentan el genotipoKIR3DS1,oy su ligando Bw4, en el grupo de pacientes buenos respondedores al tratamiento o con un mejor pronóstico.
  10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde el análogo de la guanosina es la ribavirina (RBV).
  11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el individuo está coinfectado por el VIH y el VHC.
  12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-11, donde el VHC es del genotipo 1.
  13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-12, que además comprende determinar el genotipo del genIL28B.
  14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-13, donde la determinación del genotipo de KIR3DS1se realiza mediante PCR.
  15. El método según la reivindicación anterior, donde la PCR se lleva a cabo empleando los cebadores de secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.
  16. El método según la reivindicación 14, donde la PCR se lleva a cabo empleando los cebadores de secuencias SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
  17. El métodosegún cualquiera de las reivindicaciones 13-16, donde la determinación del genotipo de IL28Bse realiza analizando el SNP rs12979860.
  18. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-17, donde el análogo de la guanosina es la ribavirina (RBV).
  19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-18, donde la muestra biológica es o se obtiene de sangre periférica.
  20. Un kit o dispositivo que comprende una o varias secuencias nucleotídicas necesarias para detectar el genotipo del gen KIR3DS1.
  21. El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.
  22. El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 20-21, que además comprende una o varias sondas necesarias para detectar el genotipo del gen IL28B.
  23. El uso de un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 20-22, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento del VHC con IFN-Peg más un análogo de guanosina.
  24. El uso de un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, donde el análogo de la guanosina es la ribavirina (RBV).
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