WO2014096489A2 - Materiales, métodos y dispositivos para estimular y dirigir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico - Google Patents

Materiales, métodos y dispositivos para estimular y dirigir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico Download PDF

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José Luis POLO SANZ
Gabriel Raúl HERNÁNDEZ LABRADO
Concepción GARCÍA RAMA PACHECO
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Universidad De Castilla La Mancha
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Definitions

  • the present invention falls within the technical sector of the development and functionalization of electroconductive materials and scaffolds for applications in biomedicine, biotechnology, electrical engineering, bioengineering, tissue engineering and biochemistry; and provides compounds, methods and devices to induce, stimulate, control and direct the adhesion, proliferation, migration and differentiation of neural progenitors and the growth of axons and dendrites.
  • this invention relates to compositions and methods of preparation and biofunctionalization of electroconductive polymers, methods to induce the proliferation and migration of neural progenitors and axonal and dendritic growth in a directed manner, and devices and cells for cell culture incorporating these methods and compositions for obtaining the neurobiological phenomena mentioned for biomedical research, drug testing, cell therapy research, and in general for the design of therapeutic strategies for nervous system lesions.
  • This invention also relates to devices and scaffolds that incorporate implant methods and compositions in order to promote neural tissue repair in vivo, and neuroprosthetic systems that incorporate biofunctionalized polymers to induce axonal or dendritic growth on or around electrodes
  • this invention finds industrial application in the areas of biotechnology, bioengineering, biochemistry and biomedicine. More specifically, the invention has application in the electrical neuroprosthesis industry to stimulate or record the neural electrical activity and replace the functions losses; as well as in the design of advanced neuroprosthetics to promote the repair of neural tissue and the restoration of neurological functions after nervous system injuries.
  • the present invention also has application in the biotechnology industry, particularly in the design of cell culture devices and cells to induce proliferation, migration and selection of neural progenitors and axonal growth.
  • applications can be extended to the engineering of tissues and organs other than the nervous system, and to the design of biosensors and other bioelectric devices.
  • the development of the nervous system comprises a series of temporally and spatially organized phenomena that include the induction, polarization and regionalization of neural tissue, the proliferation and migration of neural progenitors and their differentiation to neurons or glial cells, the growth and guidance of axons and dendrites , synapse formation and maturation, and axonal myelination.
  • These phenomena are currently very active research areas and there are detailed descriptions of their cellular and molecular mechanisms.
  • the processes of proliferation and migration of neural progenitors and axonal and dendritic growth occur not only during development but also in physiological form in adult organisms, or in response to conditions of the brain or spinal cord, so they are targets of numerous therapeutic strategies that attempt to restore lost neurological functions.
  • CNS lesions are caused by various pathologies that include trauma, hemorrhage, hypoxic and ischemic disorders, neoplasms, infections, and genetic, metabolic, inflammatory, toxic and neurodegenerative diseases.
  • the lesion damages the neurons, glia and blood vessels and presents a series of complex responses that end in the healing of neural tissue without restoring the anatomy and normal functions.
  • the length of CNS lesions associated with trauma or ischemia in humans varies from 1 to 10 cm or even more. In the injured area, cavities and / or fibrotic scars are formed as a result of phagocytosis of the necrotic tissue.
  • axotomy common to all types of injury is the interruption (axotomy) of a variable number of axons from different tracts and the death of neurons and glial cells at the site of injury.
  • dead neurons are not replaced, nor does spontaneous regeneration of their axons occur due to inhibitory molecules present in the area of injury and limitations in the expression of neural growth promoter molecules.
  • fibrotic scars and cavities that form after the injury constitute a mechanical barrier that prevents the regenerative growth of axons and cell migration, and also interfere with the presentation of topographic and molecular signals that would otherwise help the repair.
  • glial cells have been transplanted in rats with C7 cervical spinal contusion, whose lesions are very similar to those in humans with regard to neural damage and cavity formation.
  • the transplantation by injection of the cells led to cell agglomeration within the tissue, which prevented the regeneration of the injured axons and caused aberrant collateralization without direction of uninjured tracts . Therefore, in addition to administering cells or molecules that promote neural growth, to achieve effective tissue repair, three-dimensional structures that support, stimulate and guide axonal growth and cell migration through the area of injury must be implanted.
  • Three-dimensional scaffolds have also been developed that incorporate fibers i or for tissue engineering, with applications proposed for the treatment of lesions of the nervous system.
  • WO 2007/146261 and WO 2007/090102 patents claim scaffolds composed of nanofibers aligned with biodegradable polymers and functionalized with biomolecules for the repair of skin, blood vessels, muscle and peripheral nerve.
  • Patent 15 WO 2006/138718 describes three-dimensional scaffolds for applications in tissue engineering, composed of nanofibers made from extracellular matrix.
  • WO 201 1/123798 specifically claims scaffolds for peripheral nerve or spinal cord repair.
  • the structure is made up of fibers aligned on a support material that curves perpendicular to the general direction of the fibers.
  • the fibers have a diameter between 1 and 1, 2 microns and are manufactured from polylactic acid or poly-lactic-co-glycolic acid.
  • Electrostimulation can act directly on the cells by generating action potentials in the axon or modulating the membrane potential 30 in the progenitors and glial cells, or indirectly influencing them by modifying the molecules present in the inferred electrode / cell e even electrosecret trophic factors or other molecules from the surface electroconductive
  • Neuroprosthetic electrodes are used to record the activity of neurons around the implant or to stimulate it with short-lived current pulses ( ⁇ ). These devices have proven effective for the treatment of various human neurological disorders, including Parkinson's disease. However, some patients develop tolerance to stimulation because inflammation and fibrosis around the electrode increase electrical impedance and, in some cases, impose implant removal. The effectiveness of neuroprostheses will be increased if intimate contact is established between the electrode and the neural cell, so that effective and lasting cellular activation is obtained. A reasonable strategy is to induce neural growth on the electrodes in order to improve and stabilize electrical communication at the interface, a procedure that, as we have mentioned, could be extended to neural repair using electroconductive materials as scaffolding so that neural cells grow through the area of injury.
  • conductive polymers have advantages over metallic materials and inorganic oxides.
  • the CPs decrease the impedance of the metal electrodes 2-3 orders of magnitude due to their nanostructure and their mixed electronic and ionic conductivity, have a density twenty times lower than that of metals and allow the incorporation of molecules of biological interest.
  • derivatives of poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) and polypyrrole (PPy) are the most studied in biomedical applications and as electrodes for neurostimulation, with PEDOT being doped with polystyrene sulfonate (PSS) more stable and conductor than the PPy in liquid electrolytes.
  • CPs for the manufacture of neuroprosthesis have aroused commercial interest for more than a decade, although these materials have not yet been incorporated into approved devices for medical use in humans.
  • the Biotectix company owns patents for electrodes covered by PEDOT and electrobiological hybrid devices (for example, patents WO 2007/028003 and US 2009 0292325), manufactured to stimulate or record the neural electrical activity.
  • designs manufactured by micro-printing or photolithography have allowed the evaluation of certain aspects of axonal and dendritic growth in response to L1 and N-Cadherin that are not easy to discern in conventional substrates, and are also helping to know the influence of the combination and segregation of biomolecules on the growth of neuronal prolongations.
  • the present invention relates to a biofunctionalized material that acts as a bridge or scaffold to induce neural growth and repair of the nervous system
  • the main support and neural guide element consists of a support preferably in the form of microfibers coated with an electroconductive polymer doped with poly [(4-styrene sulfonic acid) -co- (maleic acid)] (PSS-co-MA), where the resulting polymer is directly functionalized with molecules that induce neural growth, or with multilayers of polycations, polyanions or antibodies, to which cell adhesion molecules (CAMs) such as L1 or cadherins bind, growth factors (eg bFGF) and extracellular matrix proteins.
  • CAMs cell adhesion molecules
  • L1 or cadherins growth factors
  • extracellular matrix proteins extracellular matrix proteins
  • the main component is fibers with a preferred diameter of 2 to 15 microns that offer advantages over tubes or gels for manufacturing implants with the aim of repairing the CNS, such as:
  • the tissue growth on them is longitudinal and eccentric, so that the axons and / or migrating neural cells can guide other axons or cells without producing constrictive axonopathy; Y 5) they have no dead spaces, so the risk of infection after implantation is reduced.
  • the main advantage is that they are easily manipulated and can support themselves and insert into the tissue, avoiding the requirement of implanting an additional support for the fibers themselves as in other inventions (for example WO 201 1/123798) and, most importantly, generating the possibility of connecting point to point, with resolution of microns, distant regions of the CNS.
  • composition properties and functionalization of the biofunctionalized material of the invention, its main novelties and advantages over the preceding ones are the following:
  • the material of the present invention can be synthesized on electroconductive supports and used as an electrode, allowing electrical stimuli to be applied to modulate the behavior of neural cells.
  • electroconductive polymers such as the PEDOT doped with stable polyanions that allow the covalent conjugation of biomolecules, so that they combine the good stability of this polymer with the possibility of electrostimulating the tissue in a prolonged way without detaching the molecular layer closest to the surface .
  • the covalent conjugation method allows multiple molecules to simultaneously bind to the polymer without altering its activity, providing molecular combinations that resemble the microenvironment found in cells within the tissue.
  • Another complex contains cell adhesion molecules and induces the direct and extensive growth of axons or dendrites on the surface of the material;
  • Another complex comprises a polycation such as polylysine (PLL) on which heparin / bFGF and extracellular matrix proteins bind.
  • PLL polylysine
  • This second molecular complex promotes the proliferation and migration of glial progenitors and NG2 + precursors on the surface of the material, and in turn these cells promote and guide the axonal growth
  • the promotion of axonal growth on microfibers through the induction of migration of glial progenitors and NG2 + precursors is a unique feature of the present invention and opens up new opportunities for the treatment of neurological pathologies.
  • the biofunctionalized material with PLL / Heparin / bFGF / extracellular matrix proteins also It allows the dynamic control of cellular responses by electrosecretion of the heparin layer and its associated factors. In this way, cells can internalize the released factors while being exposed to a surface with PLL that promotes cell membrane adhesion and axonal growth. This property is based on the fact that the binding of heparin to PLL can be done covalently or electrostatically. When the junction is electrostatic, it is possible to release the heparin by means of galvanostatic or potentiostatic pulses and thereby achieve modulating the neural growth on the conductive surface.
  • a first aspect of the invention relates to a biofunctionalized material comprising:
  • a support that is selected from materials of carbon, glass, plastic, metals or their oxides, metalloids or their oxides, polymers, gels, products derived from the extracellular matrix, or combinations of these materials.
  • Biofunctionalization is defined as a modification of the physicochemical properties of the surface of any material, which allows to influence the behavior of cells that come into contact with the biomaterial (such as it may be an implant or a prosthesis) in order to improve the biological response of the tissue or organism to it.
  • This new concept allows the improvement of the surface properties of biomaterials to obtain beneficial effects such as the decrease of the inflammatory response and fibrosis around the implant, or to obtain selective cell growth on the surface.
  • the support is a microfiber with a diameter between 2 and 15 pm.
  • the support has nano or micro structure.
  • microfibers can have slits as lines (see Figure 1 D) that increase the specific surface and improve the mechanical properties of the material making it more difficult for the polymeric layer to peel off.
  • the support is selected from Au, Si, Pt, Ir, Ti or its oxides, composites or alloys, a composite comprising a heterogeneous mixture of these metals with other synthetic or natural nonmetallic components to form a single compound .
  • the electroconductive polymer is selected from poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT), polypyrrole or polyaniline.
  • the molecule with biological activity is selected from cell adhesion molecules, extracellular matrix molecules, growth factors, guiding factors for axons or dendrites such as netrins, efrines, semaforins, protocadherins or SI it proteins. or Wnt, morphogens such as Sonic Hedgehog, proteoglycans, glycosaminoglycans, gangliosides, proteins, peptides or combinations of these molecules.
  • the bridging molecule is selected from polypeptides, amino acids, peptides, polysaccharides, antibodies, or combinations thereof.
  • the bridging molecule or the molecule with biological activity can be attached to the electroconductive polymer by spontaneous adsorption, electrostatic interactions, hydrophobic interactions or covalent bonds.
  • the biologically active molecule binds to the electroconductive polymer through at least two different types of bridge molecules.
  • the bridging molecule is polylysine and the biologically active molecule is a heparin or heparan sulfate complex and growth factor, and more preferably a growth factor that is selected from bFGF, PDGF-AA or combinations of both.
  • this complex of biological molecules comprises an extracellular matrix molecule bound to the growth factor.
  • this extracellular matrix molecule is selected from fibronectin or derivatives, vitronectin or derivatives or combinations thereof.
  • the bridging molecule is an antibody and more preferably the bridging molecule is IgG.
  • the molecule with biological activity is a cell adhesion molecule that is selected from the family of immunoglobulins, cadhennas, integhnas, and selectins. More preferably the molecule with biological activity is N-cadhe na, L1 or combinations thereof.
  • a second aspect of the present invention relates to materials and methods for the modification of neuroprosthetic electrodes.
  • the material preferably consists of a PEDOT layer doped with PSS-co-MA and functionalized with Cell adhesion molecules such as L1 and cadherins and the method is to use this material in order to promote axonal and dendritic growth and neural migration on the surface of the electrode itself in order to increase the efficiency of electrical communication between the electrode and cell.
  • the binding of the molecules to the polymer can be performed electrostatically or covalently, and the CAMs can be attached directly or through a ligand.
  • the main advantage of coating the neuroprosthetic electrodes with PEDOT: PSS-co-MA is that the polymer improves its electrical performance while allowing the covalent functionalization of the surface so that the molecular layer bound to the polymer does not detach during electrostimulation .
  • the covalent functionalization of PEDOT: PSS-co-MA does not impair its electrical conductivity and multiple molecules can be attached to the surface to obtain the desired cellular effects.
  • multiple molecules can be attached to the surface to obtain the desired cellular effects.
  • the present invention demonstrates that the functionalization of PEDOT: PSS-co-MA with L1 stimulates axonal growth but inhibits dendrites, while its functionalization with N-cadherin induces the growth of both axons and dendrites.
  • Another very novel feature of the present invention is that functionalization with N-cadherin stimulates neuronal migration on the conductive polymer.
  • a third aspect of the present invention relates to the process of obtaining a biofunctionalized material, as described above, which comprises the following steps:
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the biofunctionalized material described above for the manufacture of devices for inducing neural growth, repair of the nervous system, or for neurostimulation electrodes.
  • the device is a cell culture chamber or an implant.
  • a fifth aspect refers to a method for inducing neural growth and repair of the nervous system that comprises bringing tissue of the central nervous system into contact with the biofunctionalized material described to promote proliferation, differentiation and / or migration of glial precursors and which to in turn they stimulate the growth of axons.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a cell culture chamber comprising a base (1) on which a material in the form of electroconductive microfibers (2) is arranged, which are joined at least one of its ends to an electrical contact (3), and further comprising a cell (4) open upper and lower and arranged on the base (1), inside which the microfibers are partially contained.
  • the material disposed in the form of microfibers (2) is the biofunctionalized material of the invention that has been described above.
  • the cell (4) is prismatic
  • the base (1) is transparent to allow direct visualization of the cell growth using an inverted microscope
  • the microfibers (2) are arranged on the base (1) in parallel .
  • the cell (4) further comprises supports (5) arranged on two opposite sides of the base (1).
  • the cell (4) further comprises at least one separating partition (6) arranged transversely to the longitudinal direction of the microfibers (2).
  • the separating partition (6) can be arranged so that it does not rest on the base defining a groove for the passage of the microfibers (2), or the separating partition (6) comprises holes for the passage of the microfibers (2) and of the cellular elements that grow on them.
  • the cell (4) is cylindrical and the microfibers (2) are arranged on the base (1) radially.
  • the cylindrical cell may further comprise an inner ring (7), at least two separating partitions (8) being arranged radially between the cell (4) and said inner ring (7).
  • the inner ring has a groove or a hole for the passage of the microfiber and the cellular elements that grow thereon.
  • microfibers can be easily functionalized with any type of biomolecules and that these can be combined, so that the complex multimolecular environment of living organisms can be simulated more precisely.
  • functionalized microfibers with different cell adhesion molecules can be incorporated into the same cell to study the phenomena of axonal growth and fasciculation.
  • microfibers with complexes of the PLL / Heparin / bFGF / extracellular matrix proteins can be particularly useful for studying axonal regeneration mediated by glial cell precursors, as well as axonal myelination and its modulation by electrical activity , both in the SNC and in the SNP.
  • Another advantage of the culture cells object of the invention is that the microfibers can be cut easily and selectively, which allows studying the cellular responses to the axotomy, as well as separating tissue components (for example the migratory cells) to sub- cultivate them in other cells and use them in other investigations or in implants.
  • the present invention relates to an implant comprising the biofunctionalized material described above.
  • This implant is suitable for inducing neural growth and repair of the nervous system in areas where neural lesions have been caused by various causes.
  • Fig. 1 exemplifies the morphological characteristics of PEDOT: PSS-co-MA 1: 1.
  • Parts A, B, D, E and F are scanning electromicrographs.
  • A) View of the polymer surface.
  • B) Cross-sectional view showing the thickness of the polymer to the right of the Ti / Au layer (displayed as a white line).
  • F) Detail of the morphology of the polymer synthesized on the microfibers. Scales: A, B and F, 500 nm; D and E, 2 m.
  • Fig. 2 shows in part A the infrared spectrum of the PEDOT: PSS-co-MA 1: 1 (solid line) and of the PEDOT: PSS-co-MA 3: 1 (dotted line), prepared on glass coated with Ti / Au. Each line represents the average of nine spectra without additional processing.
  • part B the fluorescence (average of 6 measurements ⁇ standard error) of the PEDOT: PSS-co-MA 1: 1 (black bars) and of the PEDOT: PSS-co-MA 3: 1 (white bars) is shown after processing for covalent bonding of Alexa-488 at different concentrations.
  • the covalent bond is represented by EDC / NHS (black bars) and spontaneous adsorption (gray bars) of Alexa-488 to the surface of the PEDOT: PSS-co-MA 1: 1, depending on the concentration of the antibody.
  • the background fluorescence (approximately 10 ua) of the polymer without antibody has been subtracted for better visualization of the data.
  • Fig. 3 shows the characterization by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of the surfaces of Ti / Au and of the carbon microfibers coated with conductive polymers.
  • EIS electrochemical impedance spectroscopy
  • Fig. 4 shows the characterization by cyclic voltammetry (CV) of the surfaces of Ti / Au and of the carbon microfibers coated with conductive polymers.
  • the polymer has been synthesized with 96 mC / cm 2 and analyzed without functionalization (solid line) or after joining PLL covalently (broken line).
  • Fig. 5 shows the characterization by chronoamperometry of the carbon microfibers coated with conductive polymer by electrosynthesis at 96 mC / cm 2 .
  • a and B show the current density provided by the microfibers when applying a two-phase pulse train with amplitude of 0.2 (short dashed line), 0.3 (dotted line), 0.4 (long striped line) and 0.5 (dashed-dotted line) volts; each phase with duration of 1 ms.
  • solid line the response of carbon microfibers without polymer
  • applying the highest voltage 0.5 V
  • FIG. 6 is a drawing that illustrates two complexes used for multimolecular functionalization of the PEDOT: PSS-co-MA. For simplicity, the final addition of extracellular matrix molecules that bind to the complex formed by heparin or heparan sulfate and the growth factor has been omitted in the scheme on the left.
  • Fig. 7 shows the quantifications of cell adhesion molecules (CAMs) or growth factors attached to the surface of PEDOTPSS-co-MA 1: 1 and detected by immunofluorescence.
  • Fig. 8 illustrates the survival and growth of neural cells cultured at 25,000 cells / cm 2 on PEDOT: PSS-co-MA without any pro-adhesive molecule, or functionalized with PLL.
  • D Fluorescence image of neurons cultured for 5 days on the functionalized polymer by covalent binding of PLL and processed similarly to case C. The scales represent 100 pm.
  • FIG. 9 illustrates the survival and growth of neural cells cultured on PEDOT: PSS-co-MA functionalized with A-HIgG / CAMs.
  • Phase contrast images of neurons are shown in parts A and B cultured at 25,000 cells / cm 2 for 24 h on the polymer with N-Cadherin used at 5 and 20 pg / ml, respectively.
  • Representative examples of the growth of cultured neurons at 1000 cells / cm 2 for 48 h on PEDOT are shown in CF: PSS-co-MA functionalized with A-HIgG and: C) N-Cadherin 10 pg / ml, D) L1 10 pg / ml, E) N-Cadherin and L1, both at 10 pg / ml.
  • Fig. 10 shows the detailed measurements of neuronal growth in low density cultures on PEDOT: PSS-co-MA functionalized with PLL (45 pg / ml) or A-HIgG and CAMs (10 pg / ml).
  • the colors represent the same surface in all the graphs: white, polymer + PLL; dark gray, polymer + A-HIgG / N-Cadherin (NCad); medium gray, polymer + A-HIgG / L1; light gray, polymer + A-HIgG / NCad / L1.
  • growth data on borosilicate glass coated with PLL black is included.
  • Fig. 11 shows the quantifications of cell migration in low density cultures on PEDOT: PSS-co-MA functionalized with PLL (45 pg / ml) or A-HIgG and CAMs (10 pg / ml).
  • Fig. 12 is a series of drawings that exemplify the cell culture cell models with electroconductive microfibers object of the present invention.
  • Fig. 13 shows the quantifications of axonal growth, glial migration and the number of cells on the microfibers that have PEDOT: PSS-co-MA functionalized with A-HIgG and CAMs (L1 or N-Cadherina), fixed and processed for Immunohistochemistry 5 or 10 days after the explant.
  • the data represent the mean ⁇ SEM of the axonal growth length (A), the length traveled by the Vimentin + (B) cells and the number of Vimentin + (C) cells on the microfibers depending on the molecule present on the surface and the duration of the crop.
  • Statistical differences between experimental conditions are described in the text. Note the different scale in the distance of axonal growth and cell migration.
  • Fig. 14 is a series of images obtained by confocal microscopy that exemplify axonal and dendritic growth and neuronal migration from explants of the cerebral cortex after 10 days in contact with microfibers functionalized with A-HIgG / CAMs (L1 or N -Cadherina).
  • A-HIgG / CAMs L1 or N -Cadherina
  • the types and cellular relationships that take place in the proximal area of the microfiber are shown, including the image of transmitted light as well as fluorescence due to axonal growth (Tau) and neuronal dendrites and somas ( MAP2).
  • Tau axonal growth
  • MAP2 neuronal dendrites and somas
  • the scales represent 50 ⁇ .
  • Fig. 15 illustrates neural growth on microfibers that have PEDOT: PSS-co-MA functionalized with PLL alone or with a multimolecular complex of PLL and additional layers of Heparin / bFGF / bovine fetal serum molecules (FBS).
  • the cultures were fixed at 5 days and subsequently they were performed immunohistochemistry for vimentin (glial precursors) and Tau (axons).
  • A), B) and C) are confocal microscopy images that exemplify the three types of relationship between axons (light gray, white arrows) and migratory front cells (dark gray, black arrows).
  • D), E) and F) are electromicrographs of the tip cell (D), and of the cells that go behind the leading front (E, F). The latter have two types of morphology, such as fusiform (E) and polydendritic (F). Note that in the fusiform cell there are also small lateral extensions, and that the cells in E and F intermingle with numerous axons and extensions of other cells.
  • Fig. 17 presents details of the interaction between the glial precursors and the axons on the microfibers, as well as other phenotypic characteristics of the precursors.
  • B) and C immunoreactivity of the cytoplasmic membrane of the precursors for NG2 and PDGFRa, respectively.
  • Fig. 18 shows the quantifications of neural growth on microfibers that have PEDOT: PSS-co-MA functionalized with PLL / Heparin / bFGF / and extracellular matrix molecules from serum or in its purified form. The cultures have been fixed at 5 days. The figure also shows the quantification of the binding of molecules to the surface by immunofluorescence, following the procedure described in example 14.
  • FIG. 19 shows a series of images obtained by confocal microscopy that exemplify neural growth (5 days) on microfibers that have PEDOT: PSS-co-MA functionalized with PLL / Heparin / bFGF and additionally with: A) FBS (10 %); B) NRS (10%); C) FN 20 pg / ml; D) VN 20 pg / ml.
  • the glial precursors are stained for vimentin (gray) and the axons for Tau (white).
  • the scales represent 500 pm.
  • Fig. 20 presents a series of confocal microscopy images in which the relationship between axons and tip cells is compared, as well as the phenotype of the tip cells, on microfibers having PEDOTPSS-co-MA with PLL / Heparin / bFGF and to which FBS or FN is finally added. Note the similarity of growth and phenotype of migratory cells in both conditions. Long arrows indicate the axons (marked for Tau or for ⁇ - ⁇ tubulin), and the short arrows indicate the glial precursors (marked for Vimentin or for PDGFRa.
  • a potentiostat / galvanostat (Autolab PGstat30; Ecochemie, The Netherlands) was used to electrosynthesize poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) doped with poly [(4-styrene sulfonic acid) -co- (maleic acid)] (PSS- co-MA, 20,000 PM), applying anodic constant current (1 ⁇ / mm 2 ).
  • the working electrode consisted of a borosilicate glass slide coated with 10 nm of Au (Phasis, Switzerland; Au layer attached to the glass by means of a Ti nanolayer), or carbon microfibers of 7 pm in diameter (C005722, Goodfellow, UK); using Pt as a counter electrode (CE) and a saturated calomelan electrode (SCE) as a reference electrode (RE).
  • CE counter electrode
  • SCE saturated calomelan electrode
  • RE reference electrode
  • the study of the morphology of the prepared polymers and the quantification of their thickness were performed by scanning electron microscopy (Nova NanoSEM200, FEI Company, USA), using 2-3 kV, spot 2.0, TLD detector and high vacuum conditions.
  • the electrical conductivity of the PEDOT: PSS-co-MA made the use of additional metal coatings unnecessary and allowed the visualization of very small pores ( ⁇ 5 nm) on the surface. Its atomic composition was determined using an X-ray dispersive energy detector (EDX) integrated with the SEM and working at 7.5 kV.
  • EDX X-ray dispersive energy detector
  • composition of the polymer, its relative oxidation status and its homogeneity were also studied using infrared spectrophotometry (FT-IR), for which an automated micro-spectrophotometry system (Spotlight 400; PerkinElmer, USA) equipped with a Spectrum spectrophotometer was used. one (PerkinElmer).
  • FT-IR infrared spectrophotometry
  • spotlight 400 Automated micro-spectrophotometry system
  • Spectrum spectrophotometer Spectrum spectrophotometer
  • the infrared spectrum of the PEDOT: PSS-co-MA prepared on Ti / Au with 96 mC / cm 2 showed the absorption bands corresponding to the chemical groups and the doped state of the PEDOT.
  • the bands of the PEDOT spectrum: PSS-co-MA 3: 1 were quite similar to those of 1: 1 (Fig. 2A) , but the absorbance was greater and the spectrum subtly shifted towards the lower frequencies, indicating a higher oxidation state (Kvarnstróm et al., 1999).
  • PEDOT PSS-co-MA films prepared with 96 mC / cm 2 on Ti / Au were used to assess covalent protein binding to the polymer, through the formation of bonds between the carboxyl groups of PSS-co-MA and amino groups of the protein.
  • the reaction is carried out at 24 ° C by applying on the polymer surface a solution of 1-ethyl-3 (-3-dimethylamine-propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC, Sigma-Aldrich) and N-hydroxysuccinimide (NHS, Sigma -Aldrich), both at 45 pg / ml in MQ water, for 1 h.
  • EDC 1-ethyl-3 (-3-dimethylamine-propyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the solution is removed, washed 3 times in MQ water and immediately afterwards the molecule to be covalently conjugated (for example PLL, antibodies or cell adhesion molecules), dissolved in 50 mM triethanolamine buffer (TEA), pH 8, is applied. 0, also for 1 h.
  • TAA triethanolamine buffer
  • the solution is removed and the surface is washed for 2 hours with water in sterile MQ and then another 12 hours in 5 mM phosphate buffer, with gentle stirring. Finally they are washed with water and for confocal microscopy studies they are mounted with phosphate / glycerol buffer.
  • the PEDOT: PSS-co-MA 1: 1 has twice as many carboxyl groups per molecule compared to 3: 1, it is expected that the former will be more efficient for covalent binding of biomolecules by reactions with EDC / NHS.
  • a fluorescent antibody binding assay IgG conjugated with Alexa-488, Molecular Probes
  • Comparisons were also made between the covalent binding of the antibody and its spontaneous adsorption to the polymer, for which the PEDOT: PSS-co-MA was processed in the same manner as for the covalent conjugation but omitting the EDC / NHS.
  • the surfaces were scanned with a confocal microscope (TCS SP2 SE, Leica Microsystems CMS GmbH) using a 63x 3.5x immersion and zoom lens.
  • TCS SP2 SE Leica Microsystems CMS GmbH
  • Alexa-488 it was excited at 488 nm and the emission was collected between 500-590 nm
  • Alexa-594 it was excited at 594 nm and the emission was collected between 605-750 nm.
  • Six fields were analyzed per sample, and three samples for each experimental situation.
  • the ImageJ program (1.39u, NHI, USA) was used to measure the average green intensity in the images obtained. Fig.
  • 2B shows the fluorescence of the PEDOT: PSS-co-MA 1: 1 (black bars) and of the PEDOT: PSS-co-MA 3: 1 (white bars) after processing for Alexa-488 covalent bonding.
  • the background fluorescence (approximately 10 ua) of the polymer without antibody has been subtracted for a better representation of the data.
  • the properties of the coated electrodes were studied by electrochemical impedance spectroscopy (EIS), cyclic voltammetry (CV) and chronoamperometry using the three electrode configuration and phosphate buffer described in example 1.
  • EIS electrochemical impedance spectroscopy
  • CV cyclic voltammetry
  • chronoamperometry using the three electrode configuration and phosphate buffer described in example 1.
  • sine waves of 5 mV were applied at 26 logarithmically spaced frequency values from 10 kHz to 0.1 Hz.
  • the spectra obtained were modeled using the expression of impedance whose parameters were obtained by a nonlinear method of complex least squares. which was implemented in MatLab (MathWorks, USA).
  • the CV was carried out taking the resting potential at 0 V for 10 s and subsequently recording between -1, 05 and +0.55 V (versus SCE) at 0.05, 0.5, 5 and 50 V / s From the CV the redox phenomena were studied and the anodic and cathodic charge density (Qcv) of the prepared materials was also calculated, integrating the current in each phase of the voltamperogram with respect to time and dividing by the scanning speed. In order to simplify the results, the average of the two charges is presented here.
  • the polymers were electrosynthesized on 100 mm 2 of glass with Ti / Au nanolayer or on carbon microfibers, in the latter case producing electrodes of approximately 0.023 mm 2 (0.92 mm of polymer coated microfiber, with an approximate diameter of 8 pm).
  • Different coating thicknesses were studied, but only those synthesized with 96 mC / cm 2 were characterized in the microfibers, which were used for organotypic cultures.
  • FIG. 3A shows the Nyquist diagram with the impedance spectra of the PEDOT: PSS-co-MA electro-synthesized with different loads.
  • the diagram obtained for the PEDOT: PSS-co-MA is similar to that previously described for the PEDOT: PSS (Collazos-Castro et al., 2010 Biomaterials 31: 9244-9255; Hernández-Labrado et al., 201 1, J. Electroanal. Chem .; 659; 201-204).
  • the Nyquist diagram draws a Warburg diffusion behavior: line that forms an angle of -45 ° with the real axis. As the frequency decreases, a phase shift occurs from 45 ° to 90 ° (detail in Fig. 3A).
  • the diagram shows a capacitor behavior: straight that forms an angle of -90 ° with the real axis.
  • R s is the resistance of the electrolyte and the second sum represents the impedance of sub-fusion of parabolic formulation (Hernández-Labrado et al., 201 1, J. Electroanal. Chem .; 659; 201-204).
  • the expression of the impedance is consistent with the obstruction to the ionic flow caused by the nanoporous and tortuous structure of the polymer, which translates into a slower anomalous ionic diffusion (sub-fusion) than that described by Fick's laws.
  • R d f is a constant (resistance)
  • Od is the characteristic angular frequency linked to the transition between the behaviors of Warburg and condenser.
  • the ionic diffusion coefficient D a is obtained as:
  • C dlf (R dlf a d y 1 Fig. 3A also shows simulated data using the parameters in Table 1. There is excellent agreement between experimental and simulated data. As Table 1 shows, the values of ⁇ are close to 0.8 indicating a subdifferent behavior (0 ⁇ to ⁇ 1). C, Rat and Od vary linearly with L, ( ⁇ x> d L) "1 and L " 1 , respectively.
  • Fig. 3B it is observed how the deposited polymer layer decreases the electrical impedance of the Ti / Au more than two orders of magnitude.
  • the impedance of the CPE is written: where Y p and ⁇ are constants.
  • the true value of the capacity (C d i) of the double layer is estimated using the formula deduced by Brug et al. (1984 J.
  • the PEDOT: PSS-co-MA voltamperograms on the 100 mm 2 Ti / Au electrodes were very similar to those we have published for the PEDOT: PSS (Collazos-Castro et al., 2010, Biomaterials 31: 9244-9255 ), both in the electrochemical processes observed and in the Q C v obtained.
  • the CV is performed at low speeds (0.05 and 0.5 V / s)
  • a significant increase in Q C v can be observed with the increase in the load used for polymerization (Qp 0 /) (Fig. 4A ).
  • the maximum possible Q C v (parameter a) is greater at 0.05 V / s than at 0.5 V / s (24.4 mC / cm 2 vs. 1 1, 6 mC / cm 2 , respectively), but to reach the maximum Q C v a load of Electrosynthesis 2.4 times higher when the CV is done at 0.05 V than when it is done at 0.5 V / s, as reflected by the exponent b (2,127 x 10 "3 and 5, 149 x 10 " 3 , respectively.
  • This phenomenon gives additional support to the interpretation that the charge transfer in the polymer is limited by a sub-fusion process, so that from the optimal values of polymer thickness and potential change rate, the charge transferred will be smaller the higher the speed at which the potential is imposed or the smaller the thickness of the polymer on the surface.
  • the covalent bonding of PLL does not alter the stability of the PEDOT: PSS-co-MA, the percentage of loss of Qcv on the functionalized and non-functionalized surfaces being equal.
  • the PEDOT: PSS-co-MA showed a slightly lower stability on carbon microfibers, with a percentage of Qcv loss of 14% at 100 cycles, which also slowed down to reach only 24% at 500 (Fig. 4D). Therefore, the stability of the PEDOT: PSS-co-MA is good despite to use a dopant with only 20,000 PM and to perform the CV with a wide potential window (-1, 05 and +0.55 V).
  • the Q C v is greater than 5 and 50 V / s compared to 0.5 V / s (Two-factor ANOVA p ⁇ 0.001; Holm-Sidak posttest p ⁇ 0.001 in both cases).
  • the Q C v of the PEDOT: PSS-co-MA is higher than that of the PEDOTPSS at speeds of 0.5 and 5 V / s (Holm-Sidak posttest p ⁇ 0.001 in both cases), and at 50 V / s
  • the Q C v of both polymers is the same.
  • Fig. 5 exemplifies the current densities provided by the carbon microfibers coated with PEDOTPSS or PEDOTPSS-co-MA (electrosynthesized at 96 mC / cm 2 ) during the 1 ms pulses, as well as the charge densities (average of the anodic and cathodic) for 1 and 5 ms pulses.
  • microfibers coated with any of the two polymers produce a much higher current density than uncoated microfibers, and the current remains high during the entire pulse while in uncoated microfibers falls to 0 around 200 s (Fig. 5A-B).
  • the charge density is much higher in the presence of the polymer, increasing more than 50 times for the 1 ms pulses and more than 175 times for the 5 ms pulses, at 0.5 V.
  • the Charge density increases linearly between 0.2 and 0.5 V regardless of the pulse duration (Fig. 5C).
  • PEDOT: PSS-co-MA is a conductive polymer with good performance for the manufacture of electrobiological and neuroprosthetic devices. Although its current response is somewhat lower than that of the PEDOTPSS in electrostimulation protocols with short duration pulses, it presents better load transport in voltage application protocols at slow speeds and also allows easy covalent functionalization through the carboxyl groups without lose its stability
  • the first layer of molecules on its surface was covalently bound, so that they do not detach when electrostimulation is used to control the behavior of neural cells.
  • the main feature of this The first molecular layer is that it has a lot of affinity for other families of specific biomolecules, thus allowing its binding and presentation as a substrate for adhesion and cell growth.
  • two molecular complexes are exemplified to functionalize the PEDOT: PSS-co-MA 1: 1 (Fig.
  • Chimeric recombinant human CAMs with the Fc-lgG fragment were purchased from R&D Systems (1388-NC and 777-NC), the specific IgG against the Fe fragment of human IgG, which we abbreviated A-HIgG, was obtained from Sigma-Aldrich (12136), the human recombinant bFGF was purchased from Invitrogen (PHG0024), and the human recombinant PDGF-AA from Peprotech (100-13A).
  • CAMs can be incorporated directly into the polymer surface by covalent bonding, or the A-HIgG is covalently linked first and then the CAMs are bound by immuno-affinity.
  • the antibody is dialyzed using cellulose ester membranes with a cut-off point of 8 to 10 kDa (Fleet-A-Lyzer G2, Spectrum Laboratories, Inc. USA), and subsequently dissolved at 100 pg / ml in 50 mM TEA buffer, pH 8.0, the remainder of the procedure being similar to that described in Example 3.
  • a heparin solution (average PM 1 1750, Sigma-Aldrich) for 4 minutes, dissolved at 2.7 mg / ml in phosphate buffer pH 7.4, followed by three washes in the same buffer. Subsequently, the solution containing bFGF and / or PDGF-AA (both at a concentration of 1 pg / ml in phosphate buffer pH 7.4) is put on the surface, for 1 hour at 24 ° C, after which the surfaces are washed three times with PBS.
  • the polymer is then incubated for 48 to 72 h at 37 ° C in a solution of PBS or DMEM containing fetal bovine serum (SFB, 10%), normal adult serum (SNA, 10%), fibronectin or vitronectin (20-40 Mg / ml) This solution is removed and the polymer is washed with PBS or culture medium just before plating the dissociated cells or the neural tissue explant.
  • FBS fetal bovine serum
  • SNA normal adult serum
  • fibronectin or vitronectin 20-40 Mg / ml
  • the multimolecular functionalization of the polymer was confirmed by reaction of the surfaces with antibodies against the biomolecules and revealed with fluorescent secondary antibodies.
  • the following antibodies were used: anti-N-Cadherin (Sigma C3865, dilution 1: 200) made in mouse, anti-L1 (Chemicon MAB5272, 1: 50) made in rat, anti-human PDGF-AA (Peprotech 500-P46 , 1: 500) made in rabbit, anti-bFGF (Millipore 05-1 18, 1: 1000) made in mouse, goat IgG with Alexa Fluor ® 488 anti-rat lgG (Molecular Probes A1 1006, 1: 500) , Goat IgG with Alexa Fluor ® 594 anti-mouse IgG (Molecular Probes A1 1005, 1: 500), goat IgG with Alexa Fluor ® 488 anti-mouse IgG (Molecular Probes A1 1001, 1: 500), and Goat IgG with Alexa Fluor ®
  • the surfaces were incubated for 1 h in a phosphate buffer solution with 5% normal goat serum and 0.2% triton, followed by incubation for 2 h in the buffer solution with two primary antibodies (anti- L1 / anti-N-Cadher ⁇ na or anti-bFGF / anti-PDGF-AA) and 0.2% triton, and finally 1 h in the buffer solution with the two corresponding secondary antibodies.
  • the samples were mounted in glycerol phosphate buffer and analyzed by confocal microscopy as described in example 3. This procedure unequivocally demonstrated success in the multiple functionalization of PEDOT: PSS-co-MA 1: 1 with CAMs or growth factors (Fig.
  • Example 7 Culture, fluorescent tide and microscopic study of dissociated neural cells.
  • Dissociated cell cultures were performed on glass slides with Ti / Au coated PEDOT: PSS-co-MA 1: 1, which were used as the basis of polystyrene chambers (1 1 x 1 1 x 20 mm wide, high and bottom, respectively), sealing the edges with medical silicone (MED-4210; NuSil, USA).
  • cells were grown on non-electroconductive surfaces of grade 1 hydrolytic borosilicate glass (Marienfeld GmbH & Co. KG Lauda-Kónigshofen, Germany) coated with PLL.
  • the functionalized polymer Prior to plating the cells, the functionalized polymer was incubated for 48 h in DMEM (Sigma-Aldrich) with 10% fetal bovine serum (FBS, Life Technologies Corporation, USA), at 37 ° C and in a humid atmosphere with 5% CO2, in order to condition them in the ionic and molecular environment of biological tissues.
  • the serum medium was removed and the surface was repeatedly washed with Neurobasal TM (Life Technologies Corp.) just before introducing the cells.
  • the cells were dissociated from the cerebral cortex of embryos (E18) of Wistar rat using trypsin, DNAse (Sigma-Aldrich) and Pasteur pipettes polished with fire, and plated on polymer surfaces at two densities: 25000 cells / cm 2 for general studies of adherence, survival and cell growth; or 1000 cells / cm 2 for studies specific growth and differentiation of neurites, dendrites and axons.
  • Neurobasal TM was always used as a culture medium with a supplement of L-glutamine, B27, penicillin-streptomycin (Life Technologies Corp.) and gentamicin (Normon, Madrid). The cells were kept at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO2.
  • the culture medium was completely replaced after 2 hours of plating the cells, and half after 4 days in the corresponding cases.
  • the cultures were fixed within two or five days by adding paraformaldehyde to the culture medium to a concentration of 2% and leaving it to act for 12 min.
  • the cell quantifications presented were confirmed in at least three different cultures, using a minimum of four polymer samples in each. In the data of individual neurons, a minimum of 100 cells were averaged in each experimental situation.
  • anti-Tau Sigma-Aldrich T-6402, 1: 750
  • anti-MAP2 Sigma-Aldrich M1406, 1: 500
  • anti-Vimentin Neomarkers, MS-129, clone V9, 1: 1000
  • anti-Nestine BD Biosciences 556309, 1: 1, 500
  • anti-GFAP Dako Z- 0334, 1: 500
  • anti-NF Affinity NA-1297, 1: 750
  • anti-NG2 Chemicon AB5320, 1: 500
  • Example 8 Dissociated neural cells: adhesion, growth and survival on the PEDOT: PSS-co-MA functionalized with PLL
  • Figs. 9A and 9B show phase contrast images of neurons at 24 h of culture on the polymer with N-Cadherin used at 5 and 20 pg / ml, respectively.
  • Fig. 8B When visually compared with cells cultured on the polymer with PLL (Fig. 8B), it is evident that from a very early age there is a greater growth of neuronal extensions when N-Cadherin is used (Fig. 9A-B), but cell density prevents the measurement and comparison of individual neurites. Therefore, it was decided to use low density cultures (1000 cells / cm 2 ) to measure and compare the effect of different molecules on neuronal growth.
  • Neurosci .; 8: 1454-1468 in which 1 is equivalent to the formation of lamelipodia, 2 to the development of neurites, 3 to the formation and extension of the axon, 4 to the growth of dendrites, and 5 to the branching of extensions and maturation of the neuron.
  • any cell extension> 10 pm was defined as neurite.
  • the neurite was called> 50 pm axon and measured at least twice as much as the other neurites, and the latter were considered dendrites if they were> 10 pm.
  • the time of fixation more than 97% of the cells were in stages 2 and 3 regardless of the culture substrate. The small remaining percentage corresponded to cells in stage 1, and none were classified in stage 4.
  • Fig. 9C-F PSS-co-MA functionalized with A-HIgG + N-Cadherin (C), L1 (D), or both CAMs (E), always at 10 pg / ml.
  • C N-Cadherin
  • D L1
  • E both CAMs
  • Fig. 9F an example of growth on the covalently linked PLL functionalized polymer is presented in Fig. 9F.
  • the cells have been processed with immunocytochemistry for Tau and MAP2, and the nuclei have been labeled with Hoescht. In these images it is evident that the polymer functionalized with CAMs increases neuronal growth with respect to the polymer functionalized with PLL.
  • N-Cadherin promotes the growth of both dendrites and axons, while L1 significantly increases axonal growth but inhibits dendritic development.
  • Growth measurements are shown in detail in Fig. 10. Comparing each of the seven growth parameters separately (ANOVA of a factor), differences were always found between the functionalization of the polymer with PLL or with CAMs (p ⁇ 0.0001). Functionalization with N-Cadherin significantly increases neural growth in all the parameters evaluated (Fig. 10A-G), that is, its effect takes place independently of the cellular stage and increases both the length of the extensions and their number.
  • the effect of greater relative magnitude occurs in the number of neurites and dendrites, which doubles with respect to polylysine (Holm Sidak posttest, HS, p ⁇ 0.001) and triples with respect to L1 (HS posttest, p ⁇ 0.0001).
  • the dendrites almost double their length over N-Cadherina (HS posttest, p ⁇ 0.001), while parameters such as the length of the primary axon or of the total axonal tree are increased by 29% (HS posttest, p ⁇ 0.05 ) and 40% (HS posttest, p ⁇ 0.001), respectively.
  • L1 decreases the number of neurites and dendrites approximately by half with respect to the PLL (HS posttest, p ⁇ 0.001), but triples the number of axonal collaterals and doubles the length of the total axonal tree (HS posttest , p ⁇ 0.001), although the length of the primary axon is only increased by 50% (HS posttest, p ⁇ 0.001).
  • the presence of L1 does not decrease the increase in neurites and dendrites or the increase in the length of the dendrites produced by N-Cadherin (Fig.
  • N-Cadherin does partially neutralize the action of L1 on the length of neurites (posttest of HS, p ⁇ 0.0001) and the number of axonal collaterals (posttest of HS, p ⁇ 0.0001), although the total axonal tree is not significantly affected.
  • the combination of the two molecules on the polymer achieves a synergistic effect on the growth of neurons, which develop more numerous and longer dendrites and axons.
  • PSS-co-MA functionalized with PLL is similar to that which occurs on glass coated with PLL in aspects such as the number and length of neurites and dendrites, but it is 50% higher regarding the growth of the primary axon (Fig. 10E, HS-posttest p ⁇ 0.01) and of the total axonal tree (Fig. 10G, p ⁇ 0.001).
  • Fig. 1 1 there is an obvious difference in cell migration on the PEDOT: PSS-co-MA functionalized with the different molecules Neurons do not migrate at all on the polymer that has PLL, but 77% of them do so if N-Cadherin is placed and 36% if L1 is placed ( ⁇ 2 , p ⁇ 0.001; Fig. 1 1 A), the difference between N-Cadherin and L1 being also significant ( ⁇ 2 , p ⁇ 0.001). In addition to the fact that fewer cells migrate on L1 than on N-Cadherina, the distance traveled by the cells on L1 reaches only 30% of the value obtained in N-Cadherina (ANOVA, p ⁇ 0.0001).
  • the surface functionalization with the two CAMs increases both the percentage of migration ( ⁇ 2 , p ⁇ 0.001) and the distance traveled (ANOVA, p ⁇ 0.001), although it does not reach 100% of the values produced by N-Cadherin alone (difference with p ⁇ 0.05 in both cases). It is important to highlight that the cell migration on the PEDOT: PSS-co-MA with N-Cadherina is a potent phenomenon, showing maximum speed of 1 10 ⁇ 1 1 pm / h, while in the polymer with L1 it reaches 45 ⁇ 7 pm / h (p ⁇ 0.0001).
  • Example 11 Cell culture chambers with electroconductive microfibers
  • Organotypic cultures were performed in culture chambers designed to assess the behavior of living cells on electroconductive microfibers.
  • FIG. 12 four types of cell culture chambers are exemplified with the common characteristics mentioned above and variations in geometry, arrangement and communication between cells to meet different needs.
  • Design 12A is the simplest, consisting of completely parallel fibers in cells that do not communicate.
  • design 12B the fibers are also parallel, but a partition divides the cell into two symmetrical cavities communicated by the microfibers and a space around it.
  • the function of the partition is to create two compartments that contain different culture media, or the same medium but with different molecules added; and microfibers support cell growth so that axons or migratory cells pass from one compartment to another through the space that communicates them. Space can also be used to create diffusion gradients of molecules from one side to the other.
  • the space that communicates the heme cells is a long strip, with height equivalent to a microfiber; and the model II in which there is a circular space of variable diameter around the microfiber, which allows better use of its surface while restricting as much as possible the communication between the hemicells.
  • the 12C design has radial symmetry, and consists of a central compartment that communicates with several peripherals through microfibers and a small space around it. The tissue under study is placed in the central compartment and the cellular elements that originate in it can choose to grow the different microfibers. Once they pass into the peripheral compartment, they can be treated selectively with different molecules.
  • the microfibers are placed parallel to each other at a distance of approximately 700 pm from the bottom of the cell.
  • the bottom is made of 100 pm thick borosilicate glass and allows direct visualization of the fibers and cells by different microscopy techniques, and the cells are made of polystyrene (1 1 x 1 1 x 20 mm wide, high and deep, respectively), adhered to the glass by medical silicone (MED-4210; NuSil, USA).
  • microfibers rest on a 700 pm high stand that has graphite contacts, which are completely isolated from the inside of the cell.
  • the PEDOT: PSS-co-MA is electrosynthesized on the microfibers once the cell culture chambers are manufactured, applying 96 mC / cm 2 and following the protocol described in example 1.
  • the morphological and electrochemical characterization of microfibers with polymer is presented in examples 2 and 4.
  • the functionalization and conditioning of microfibers for organotypic culture is carried out according to the protocols developed in examples 3, 5 and 6.
  • Example 12 Organotypic cultures of the central and peripheral nervous system: preparation, immunohistochemistry and microscopy techniques for study.
  • rat cerebral cortex or dorsal root ganglia both obtained from embryos (E18) of Wistar rat, and cultured in cameras with microfibers (Fig. 12A) or borosilicate glass coverslips.
  • the tissues are always removed from animals in deep anesthesia after receiving a eutanasic dose of pentobarbital, following the protocols approved by the animal welfare ethics committee.
  • the cerebral cortex is separated from the rest of the brain and sectioned into fragments (explants) 1.5 mm long by 0.5 mm wide, in Hanks solution with calcium and magnesium (Sigma-Aldrich ).
  • the explants are then placed on the microfibers with 100 ⁇ of culture medium (NeurobasalTM with supplements, example 7) and incubated at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO2. After 4 hours, when they have adhered sufficiently to the microfibers, culture medium is added until 1 ml is completed per well and they are incubated again for 5 or 10 days, in the second case replacing half of the culture medium every two days from the fifth.
  • culture medium is added until 1 ml is completed per well and they are incubated again for 5 or 10 days, in the second case replacing half of the culture medium every two days from the fifth.
  • the dorsal root ganglia are removed and placed on the microfibers without sectioning them, and otherwise the procedure is the same as that used to cultivate the cerebral cortex.
  • the explants are fixed at 5 or 10 days by adding paraformaldehyde to the culture medium to a concentration of 2% and leaving them in this solution for 12 min., And are processed for immunohistochemistry and nuclear marking with Hoescht using the same protocols and primary antibodies.
  • anti-PDGFRa Thermo Scientific RB1691, 1: 100
  • anti-N -Cadherina Sigma-Aldrich C3865, 1: 400
  • anti-NG2 R&D Systems FAB2585F, 1: 25
  • anti-NF200 Sigma-Aldrich N0142, 1: 500
  • anti -P75 NGF receiver Millipore AB1554, 1: 500
  • anti-PDGFRa Abcam AB32570, 1: 100
  • anti-p-tubulin isoform III Sigma-Aldrich T8660, 1: 400
  • the explants were scanned in their original position on the microfibers by means of a confocal microscope with resonant scanner (SP5, Leica Microsystems CMS GMBH, Germany), equipped with Argon and HeNe lasers, and also with a laser diode. 405 nm for Hoescht excitation.
  • SP5 Leica Microsystems CMS GMBH, Germany
  • Argon and HeNe lasers 405 nm for Hoescht excitation.
  • the 20x objective and sections at different focal planes were used every 1.5 pm, applying 3.5 zoom prior to image acquisition when necessary for better viewing.
  • the Leica LAS AF Lite software allowed to automatically acquire the series of images that covered the entire explant and join them in a mosaic to proceed to quantify cellular behavior.
  • the explants and the microfibers were removed from the culture chambers and mounted in a mixture of phosphate buffer and glycerol to proceed to their observation in the confocal microscope with the objective of 63x, applying zoom of 2.8 and acquiring sections every 0.4 pm to properly differentiate structures and accurately study the location of cellular tides. All data presented were confirmed in at least 3 different cultures, quantifying cell responses in at least 15 microfibers of each experimental situation per culture. In addition to the confocal microscope, the scanning electron microscope was used to study the behavior and cellular interactions on the microfibers.
  • the cultures were fixed with 3% glutaraldehyde in phosphate buffer (30 min.), Washed three times with buffer and fixed again in 1% osmium tetroxide (one hour) and 1% tannic acid ( 30 min.), And then washed with distilled water. They were subsequently dehydrated using increasing concentrations of ethanol (10 min. Each), ethanol with hexamethyldisilazane (1: 1, 10 min.), And 100% hexamethyldisilazane (2 min.). They were finally air dried, coated with Au by sputtering at 25 mA for 2 min., And visualized at 2-3 kV using the TLD detector at a working distance of 2 mm.
  • Example 13 Axonal growth and cell migration on microfibers having PEDOT: PSS-co-MA functionalized with A-HIgG / CAMs (L1 or N-Cadherin)
  • the functionalization of the microfibers with L1 or N-Cadherin induced a profuse axonal growth on them (Fig. 13), being 4 times higher than that obtained using PLL (ANOVA of a factor, p ⁇ 0.001).
  • the average axonal growth on the microfibers functionalized with PLL was 710 + 82 pm at 5 DIV, while it reached 2777 ⁇ 163 and 3037 ⁇ 317 m on the microfibers functionalized with L1 or N-Cadherina, respectively.
  • axons were observed forming thick fascicles, in which glial progenitors intermingle.
  • distal part farnesoid tissue axons were found that end in small growth cones with few ramifications, indicative of growth axonal fast.
  • the appearance of axonal growth cones was quite similar in microfibers functionalized with L1 or N-Cadherin.
  • MAP2 + cells some neurons that had migrated in the proximal part of the microfiber were observed, as well as dendrites (MAP2 + extensions) growing (Fig. 14).
  • the neurons and dendrites were intermingled with the axons, indicating that they had not migrated on the microfiber itself, while in the microfibers with N-Cadherin they were in contact with the microfiber (Fig. 14). In the latter case, the neurons were fusiform and the dendrites formed fascicles.
  • Example 14 Stimulation of axonal growth by glial precursors that migrate on surfaces and microfibers functionalized with PLL / heparin / bFGF / extracellular matrix proteins
  • microfibers functionalized with L1 and / or N-Cadherina promote extensive axonal growth directly on the PEDOT: PSS-co-MA but very low migration of glial precursors, we wonder if it would be possible to induce axonal growth of indirectly through the migration of glial precursors on substrates that in themselves are not permissive for axon extension.
  • PEDOTPSS functionalized with PLL / Heparin / bFGF inhibits the growth of dissociated neurons from the cerebral cortex but induces extensive proliferation and migration of glial precursors that express vimentin, nestin, and / or NG2. Therefore, we initially investigated whether this phenomenon occurs on flat surfaces coated with PEDOT: PSS-co-MA and PLL / Heparin / bFGF, finding that these compositions also inhibit the axonal growth of dissociated neurons and stimulate the proliferation and migration of parents glial.
  • Fig. 15 illustrates the aforementioned phenomenon and its relevance in quantitative terms.
  • microfibers have only PLL on the surface (without any other type of conditioning)
  • axonal growth ⁇ 700 pm in 5 days
  • precursor migration which they only travel around 150 pm and also in very low numbers (Fig. 15 AB).
  • PLL / Heparin / bFGF is placed on the microfiber
  • the migration of glial precursors is significantly increased both in distance ( ⁇ 500 pm) and in number of cells (Fig. 15 AB), but the axonal growth distance is limited to the distance traveled by migratory cells indicating that such molecular complex does not directly stimulate axonal growth.
  • Fig. 16A Details of the interactions between cells and axons on microfibers are given in Fig. 16.
  • Fig. 16A On the growth tip there is always at least one fusiform cell that leads the migration process and to which the axons accompany in intimate contact (Fig. 16A), frequently climbing on it (Fig. 16B) or following it (Fig. 16C).
  • the study by scanning electron microscopy shows that the tip cell has predominantly bipolar morphology (Fig. 16D), although in many cases they also emit small lateral cytoplasmic extensions.
  • Fig. 16E the cells that are behind the growth front intermingle with the axons and the extensions of other cells and also have bipolar morphology
  • Fig. 16F develop multiple extensions
  • axons and their terminations have areas of contact with the polymeric surface and also with the membrane of the migratory cells.
  • the cells that migrate on the microfibers from the cerebral cortex explants express NG2 and PDGFRa in the membrane cytoplasmic (Fig. 17 BC).
  • migratory cells on microfibers also express Nestine and Vimentin, which are markers of proliferating oligodendrocyte precursors (Almazan et al., Microsc Res Tech 2001; 52: 753-765).
  • Nestine and Vimentin are markers of proliferating oligodendrocyte precursors (Almazan et al., Microsc Res Tech 2001; 52: 753-765).
  • the promoter activity of cell adhesion to surfaces treated with FBS is essentially due to VN, which in FBS has concentrations of 200 to 400 pg / ml (Hayman et al., Exp Cell Res 1985; 160: 245-258), while the concentration of FN is about 10 times lower (between 20 and 40 pg / ml; Hayman et al., J Cell Biol. 1979; 83: 255-259).
  • the NRS has approximately 400 pg / ml of FN ⁇ Sochorová et al., Physiol Bohemoslov 1983; 32: 481-485) and similar amounts of VN.
  • Fig. 19 shows mosaics constructed from confocal microscopy images that illustrate neural growth comparatively on surfaces with different types of functionalization.
  • functionalization with NRS, VN or FN increased the migration and proliferation of glial precursors on microfiber compared to FBS, the precursors were in any case positive for NG2 and PDGFRa and their interactions with axons they were not substantially modified, there being always numerous axons that reached the tip cell (Fig. 20).
  • the elimination of precursors with AraC abolished axonal growth on surfaces with NRS, FN or VN.

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Abstract

La presente invención consiste en composiciones, métodos y dispositivos para inducir, estimular y dirigir la adherencia, proliferación y migración de precursores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico. Comprende sustratos electroconductores en forma de superficies o microfibras biofuncionalizadas para presentar una o varias biomoléculas de interés con el fin de controlar el comportamiento celular. Estos sustratos pueden utilizarse para estudios neurobiológicos, cultivos celulares y ensayos farmacológicos in vitro; así como para implantarse en el sistema nervioso en forma de andamios o dispositivos electrobiológicos, con el fin de promover la reparación del tejido neural o de mejorar la comunicación en la interfaz electrodo/célula neural en sistemas neuroprotésicos. Los efectos celulares se consiguen por el tipo, número y forma de unión de las moléculas a los sustratos, por las propiedades físicas de los mismos y la geometría de los andamios, por la estimulación eléctrica o por la acción combinada de estos factores.

Description

MATERIALES, MÉTODOS Y DISPOSITIVOS PARA ESTIMULAR Y DIRIGIR LA PROLIFERACIÓN Y MIGRACIÓN DE PROGENITORES NEURALES Y EL CRECIMIENTO AXONAL Y DENDRÍTICO. DESCRIPCIÓN
La presente invención se encuadra en el sector técnico del desarrollo y funcionalización de materiales y andamios electroconductores para aplicaciones en biomedicina, biotecnología, ingeniería eléctrica, bioingeniería, ingeniería tisular y bioquímica; y proporciona compuestos, métodos y dispositivos para inducir, estimular, controlar y dirigir la adherencia, proliferación, migración y diferenciación de progenitores neurales y el crecimiento de axones y dendritas. Más específicamente, esta invención se refiere a composiciones y métodos de preparación y biofuncionalización de polímeros electroconductores, a métodos para inducir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico de forma dirigida, y a dispositivos y celdas para cultivo celular que incorporan estos métodos y composiciones para obtener los fenómenos neurobiológicos mencionados con fines de investigación biomédica, ensayos de fármacos, investigación de terapias celulares, y en general para el diseño de estrategias terapéuticas para las lesiones del sistema nervioso. Esta invención también se refiere a dispositivos y andamios que incorporan los métodos y composiciones en implantes con el fin de promover la reparación del tejido neural in vivo, y a sistemas neuroprotésicos que incorporan los polímeros biofuncionalizados para inducir el crecimiento axonal o dendrítico sobre o alrededor de los electrodos.
Por tanto, esta invención encuentra aplicación industrial en las áreas de biotecnología, bioingeniería, bioquímica y biomedicina. Más específicamente, la invención tiene aplicación en la industria de neuroprótesis eléctricas para estimular o registrar la actividad eléctrica neural y sustituir las funciones perdidas; así como en el diseño de neuroprótesis avanzadas para promover la reparación del tejido neural y la restitución de las funciones neurológicas tras lesiones del sistema nervioso. La presente invención también tiene aplicación en la industria biotecnológica, particularmente en el diseño de dispositivos y celdas de cultivo celular para inducir la proliferación, migración y selección de progenitores neurales y el crecimiento axonal. Finalmente, las aplicaciones pueden extenderse a la ingeniería de tejidos y órganos diferentes al sistema nervioso, y al diseño de biosensores y otros dispositivos bioeléctricos. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El desarrollo del sistema nervioso comprende una serie de fenómenos organizados temporal y espacialmente que incluyen la inducción, polarización y regionalización del tejido neural, la proliferación y migración de progenitores neurales y su diferenciación a neuronas o células gliales, el crecimiento y guía de axones y dendritas, la formación y maduración de sinapsis, y la mielinización axonal. Estos fenómenos constituyen áreas de investigación muy activas en la actualidad y existen descripciones pormenorizadas de sus mecanismos celulares y moleculares. Los procesos de proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico ocurren no solo durante el desarrollo sino también de forma fisiológica en los organismos adultos, o como respuesta a las afecciones del cerebro o la médula espinal, por lo cual son dianas de numerosas estrategias terapéuticas que intentan restituir las funciones neurológicas perdidas.
Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) humano se producen por patologías diversas que incluyen el trauma, la hemorragia, trastornos hipóxicos e isquémicos, neoplasias, infecciones, y enfermedades genéticas, metabólicas, inflamatorias, tóxicas y neurodegenerativas. La lesión daña las neuronas, glía y vasos sanguíneos y cursa con una serie de respuestas complejas que terminan en la cicatrización del tejido neural sin que se restauren la anatomía y las funciones normales. La longitud de las lesiones del SNC asociadas con trauma o isquemia en humanos varía desde 1 a 10 cm o incluso más. En la zona lesionada se forman cavidades y/o cicatrices fibróticas como resultado de la fagocitosis del tejido necrótico. Común a todos los tipos de lesión es la interrupción (axotomía) de un número variable de axones de distintos tractos y la muerte de neuronas y células gliales en el sitio de la lesión. En general, en el SNC adulto las neuronas muertas no son remplazadas, ni se presenta regeneración espontánea de sus axones debido a moléculas inhibitorias presentes en la zona de lesión y a limitaciones en la expresión de moléculas promotoras del crecimiento neural. Además de esos factores, las cicatrices fibróticas y las cavidades que se forman tras la lesión constituyen una barrera mecánica que impide el crecimiento regenerativo de los axones y la migración celular, y también interfieren la presentación de señales topográficas y moleculares que de otra forma ayudarían a la reparación. En estudios previos se han transplantado células gliales en ratas con contusión medular cervical C7, cuyas lesiones son muy semejantes a las humanas en lo que respecta al daño neural y la formación de cavidades. A pesar del tamaño pequeño de las lesiones (3 mm), el trasplante por inyección de las células llevó a la aglomeración celular dentro del tejido, lo que impidió la regeneración de los axones lesionados y provocó la colateralización aberrante y sin dirección de tractos no lesionados. Por consiguiente, además de administrar células o moléculas promotoras del crecimiento neural, para conseguir la reparación efectiva del tejido deben implantarse estructuras tridimensionales que den soporte, estimulen y guíen el crecimiento axonal y la migración celular a través de la zona de lesión. En este sentido, diversos autores han señalado la necesidad de implantar un "puente" o "andamio" fabricado con materiales artificiales en forma de tubos o fibras recubiertas de moléculas para estimular la adhesión y el crecimiento axonal y guiarlo a través de la zona de lesión. Se han evaluado distintas estructuras para la reparación de la médula espinal, usualmente compuestas por materiales no electroconductores y sin funcionalización específica para inducir el crecimiento neural, por ejemplo agarosa, hidrogel alginato, polímeros y copolímeros del ácido poli(D,L-láctico) ó péptidos degradables. En general, estos implantes mostraron buena biocompatibilidad pero efectos pequeños en cuanto a la reparación del tejido y la recuperación funcional. Algunas de las patentes y publicaciones existentes relacionadas con andamios para ingeniería tisular incluyen funcionalización de 5 fibras con heparina / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), explotando las múltiples dianas celulares que tiene este factor de crecimiento y su participación en la reparación de diversos tejidos.
También se han desarrollado andamios tridimensionales que incorporan fibras i o para ingeniería tisular, con aplicaciones propuestas para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso. Las patentes WO 2007/146261 y WO 2007/090102 reivindican andamios compuestos por nanofibras alineadas de polímeros biodegradables y funcionalizados con biomoléculas para la reparación de la piel, vasos sanguíneos, músculo y nervio periférico. La patente 15 WO 2006/138718 describe andamios tridimensionales para aplicaciones en ingeniería tisular, compuestos por nanofibras fabricadas a partir de matriz extracelular. La patente WO 201 1/123798 específicamente reivindica andamios para la reparación de nervios periféricos o de la médula espinal. En este caso, la estructura la componen fibras alineadas sobre un material de soporte que se 20 curva de forma perpendicular a la dirección general de las fibras. Las fibras tienen un diámetro entre 1 y 1 ,2 mieras y se fabrican a partir de ácido poli- láctico o ácido poli-láctico-co-glicólico.
La utilidad de los andamios para la reparación neural será mayor si se utilizan 25 materiales electroconductores para su fabricación. De esta forma, sería posible aplicar estímulos eléctricos a través del propio sustrato sobre el que crecen las células neurales, haciendo posible el control dinámico de su comportamiento. La electroestimulación puede actuar directamente sobre las células mediante la generación de potenciales de acción en el axón o la modulación del potencial 30 de membrana en los progenitores y células gliales, o influir indirectamente sobre ellas al modificar las moléculas presentes en la inferíase electrodo/célula e incluso electrosecretar factores tróficos u otras moléculas desde la superficie electroconductora. En la elección de los materiales electroconductores más apropiados para fabricar los andamios o dispositivos electrobiológicos para la reparación neural, resulta útil aplicar algunos de los conocimientos que se han obtenido en el campo de las neuroprótesis. Los electrodos de las neuroprótesis se usan para registrar la actividad de las neuronas que se encuentran alrededor del implante o para estimularla con pulsos de corriente de corta duración (μεβο). Estos dispositivos han resultado efectivos para el tratamiento de diversos trastornos neurológicos humanos, entre ellos la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan tolerancia a la estimulación porque la inflamación y la fibrosis alrededor del electrodo incrementan la impedancia eléctrica y, en algunos casos, imponen la extracción del implante. La eficacia de las neuroprótesis se incrementará si se establece un contacto íntimo entre el electrodo y la célula neural, de tal forma que se obtenga una activación celular efectiva y duradera. Una estrategia razonable consiste en inducir el crecimiento neural sobre los electrodos con el fin de mejorar y estabilizar la comunicación eléctrica en la interfaz, procedimiento que, como hemos mencionado, podría extenderse a la reparación neural utilizando los materiales electroconductores como andamio para que las células neurales crezcan a través de la zona de lesión. Para estas aplicaciones, los polímeros conductores (CPs) presentan ventajas respecto a los materiales metálicos y a los óxidos inorgánicos. Los CPs disminuyen la impedancia de los electrodos metálicos 2-3 órdenes de magnitud debido a su nanoestructura y su conductividad mixta electrónica e iónica, tienen una densidad veinte veces menor que la de los metales y permiten la incorporación de moléculas de interés biológico. De ellos, los derivados del poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT) y del polipirrol (PPy) son los más estudiados en aplicaciones biomédicas y como electrodos para neuroestimulación, siendo el PEDOT dopado con sulfonato de poliestireno (PSS) más estable y conductor que el PPy en electrolitos líquidos. Las interesantes propiedades de los CPs para la fabricación de neuroprótesis han suscitado interés comercial desde hace más de una década, aunque estos materiales aún no se incorporan en dispositivos aprobados para uso médico en humanos. Las patentes WO 97/16545 y WO 2006/127712 reivindican el uso de CPs para inducir el crecimiento neuronal y la reparación del sistema nervioso. Por otra parte, la empresa Biotectix posee patentes de electrodos recubiertos de PEDOT y dispositivos híbridos electrobiológicos (por ejemplo las patentes WO 2007/028003 y US 2009 0292325), fabricados para estimular o registrar la actividad eléctrica neural. Finalmente, han aparecido recientemente al menos dos solicitudes de patente (WO 201 1/100059 y WO 201 1/159923) de microfibras electroconductoras recubiertas de CPs destinadas a usarse como microelectrodos para registrar o estimular la actividad eléctrica neuronal, aunque no para estimular y dirigir el crecimiento, proliferación o migración de células neurales.
Por otra parte, la mayoría de estudios neurobiológicos in vitro emplean células disociadas o cultivos organotípicos sobre sustratos de vidrio o plástico, en los que se estudia el comportamiento celular en función de los factores adicionados al medio de cultivo o de las biomoléculas presentes en el sustrato. En sistemas más sofisticados, se incorporan biomoléculas al sustrato en forma de líneas y se evalúa su permisibilidad para el crecimiento neural. La introducción de técnicas de microfabricación para depositar las biomoléculas en geometrías específicas sobre sustratos de cultivo celular ha aumentado la precisión y generado la posibilidad de producir patrones complejos. Por ejemplo, los diseños fabricados por micro-impresión o fotolitografía han permitido evaluar ciertos aspectos del crecimiento axonal y dendrítico en respuesta a la L1 y la N-Cadherina que no son fáciles de discernir en sustratos convencionales, y también están ayudando a conocer la influencia de la combinación y segregación de biomoléculas sobre el crecimiento de las prolongaciones neuronales. En la última década se ha desarrollado otro tipo de dispositivos que dirigen el crecimiento neurítico de forma restnctiva; es decir, la célula neural crece sobre un sustrato adherente que tiene canales o conductos por los que las prolongaciones tienen que pasar y cuyas dimensiones no le permiten desviarse de su destino (Merz y Fromherz, 2002 Adv Mater 14:141 - 144; Wie nga et al. , 2010 J Neural Eng 7: 16001 ). En cuanto a la investigación en migración celular, se ha extendido el uso de membranas porosas, por ejemplo de policarbonato (Behar, 2001 Assay for neuronal cell migration. In Fedoroff S and Richardson A (Eds): Protocole for Neural Cell Culture. Third Edition. Humana Press Inc.), que las células atraviesan en respuesta a factores quimiotácticos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un material biofuncionalizado que ejerce de puente o andamio para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso, en el cual, el elemento principal de soporte y guía neural consiste en un soporte preferiblemente en forma de microfibras recubierto con un polímero electroconductor dopado con poli[(ácido 4-estireno sulfónico)-co-(ácido maleico)] (PSS-co-MA), donde el polímero resultante se funcionaliza directamente con moléculas que inducen el crecimiento neural, o bien con multicapas de policationes, polianiones o anticuerpos, a los que se unen moléculas de adhesión celular (CAMs) como L1 o cadherinas, factores de crecimiento (por ejemplo bFGF) y proteínas de la matriz extracelular. Este tipo de andamio difiere de las invenciones previas en cuanto a su diseño, método de preparación, composición, propiedades y mecanismo de acción, y presenta una serie de ventajas que se resumen a continuación. Desde el punto de vista mecánico, geométrico y de diseño, el componente principal son fibras con diámetro preferente de 2 a 15 mieras que ofrecen ventajas sobre los tubos o geles para fabricar implantes con el objetivo de reparar el SNC, tales como:
1 ) son más efectivas para promover el crecimiento axonal y la migración celular dirigida por distancias largas;
2) pueden presentar biomoléculas en patrones geométricos con la escala de tamaño celular;
3) ocupan un mínimo espacio y pueden insertarse en el tejido sin proporcionar bordes extensos que aumenten la fibrosis por desacople mecánico;
4) el crecimiento tisular sobre ellas es longitudinal y excéntrico, por lo que los axones y/o células neurales que migren pueden guiar a otros axones o células sin producir axonopatía constrictiva; y 5) no presentan espacios muertos, por lo cual se disminuye el riesgo de infección tras su implante.
Con respecto a las fibras de diámetro menor de 2 mieras, la principal ventaja es que son fácilmente manipulables y pueden sostenerse por sí mismas e insertarse en el tejido, evitando el requerimiento de implantar un soporte adicional para las propias fibras como en otras invenciones (por ejemplo WO 201 1/123798) y, lo más importante, generando la posibilidad de conectar punto a punto, con resolución de mieras, regiones distantes del SNC.
En cuanto a la composición, propiedades y funcionalización del material biofuncionalizado de la invención, sus principales novedades y ventajas respecto a los precedentes son las siguientes:
1 ) El material de la presente invención puede sintetizarse sobre soportes electroconductores y utilizarse como electrodo, permitiendo aplicar estímulos eléctricos para modular el comportamiento de las células neurales.
2) Incluye polímeros electroconductores como el PEDOT dopado con polianiones estables que permiten la conjugación covalente de biomoléculas, de manera que combinan la buena estabilidad de este polímero con la posibilidad de electroestimular el tejido de forma prolongada sin desprender la capa molecular más cercana a la superficie. Además, el método de conjugación covalente permite unir múltiples moléculas simultáneamente al polímero sin alterar su actividad, proporcionando combinaciones moleculares que semejan el microentorno que encuentran las células dentro del tejido.
3) Puede incorporar diversos tipos de complejos biomoleculares con distinto mecanismo de acción. Un tipo de complejo empleado contiene moléculas de adhesión celular e induce el crecimiento directo y extenso de los axones o dendritas sobre la superficie del material; otro complejo comprende un policatión como la polilisina (PLL) sobre el que se une heparina / bFGF y proteínas de la matriz extracelular. Este segundo complejo molecular promueve la proliferación y migración de progenitores gliales y precursores NG2+ sobre la s superficie del material, y a su vez estas células promueven y guían el crecimiento axonal. La promoción del crecimiento axonal sobre las microfibras a través de la inducción de la migración de progenitores gliales y precursores NG2+ es una característica única de la presente invención y abre nuevas oportunidades para el tratamiento de las patologías neurológicas.
4) Además de dar soporte, guía, presentar moléculas en la superficie para promover la adhesión y el crecimiento neural, y proporcionar estímulos eléctricos que modulan directamente el comportamiento celular, el material biofuncionalizado con PLL / Heparina / bFGF / proteínas de la matriz extracelular también permite el control dinámico de las respuestas celulares mediante la electrosecreción de la capa de heparina y sus factores asociados. De esta forma, las células pueden internalizar los factores liberados a la vez que se exponen a una superficie con PLL que promueve la adhesión de la membrana celular y el crecimiento axonal. Esta propiedad se fundamenta en que la unión de la heparina a la PLL puede hacerse de forma covalente o electrostática. Cuando la unión es electrostática, es posible desprender la heparina mediante pulsos galvanostáticos o potenciostáticos y conseguir con ello modular el crecimiento neural sobre la superficie conductora.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un material biofuncionalizado que comprende:
a) un soporte que se selecciona de entre materiales de carbono, vidrio, plástico, metales o sus óxidos, metaloides o sus óxidos, polímeros, geles, productos derivados de la matriz extracelular, o combinaciones de estos materiales.
b) un polímero electroconductor dopado con PSS-co-MA y unido al soporte de (a), y
c) al menos una molécula con actividad biológica unida a la superficie polimérica de forma directa o a través de al menos una molécula puente. La biofuncionalización se define como una modificación de las propiedades fisicoquímicas de la superficie de cualquier material, que permite incidir en el comportamiento de las células que entren en contacto con el biomaterial (como puede ser un implante o una prótesis) a fin de mejorar la respuesta biológica del tejido u organismo ante él. Este nuevo concepto permite la mejora de las propiedades superficiales de los biomateriales para obtener efectos beneficiosos como pueden ser la disminución de la respuesta inflamatoria y la fibrosis alrededor del implante, o bien obtener crecimiento celular selectivo sobre la superficie.
En una realización preferida, el soporte es una microfibra con diámetro entre 2 y 15 pm.
En otra realización preferida, el soporte presenta nano o micro estructura. Por ejemplo, las microfibras pueden tener hendiduras a modo de líneas (ver figura 1 D) que aumentan la superficie específica y mejoran las propiedades mecánicas del material haciendo más difícil que se desprenda la capa polimérica.
En otra realización preferida, el soporte se selecciona de entre Au, Si, Pt, Ir, Ti o sus óxidos, composites o aleaciones, entendiéndose como composite una mezcla heterogénea de estos metales con otros componentes no metálicos sintéticos o naturales para formar un solo compuesto.
En otra realización preferida, el polímero electroconductor se selecciona de entre poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT), polipirrol o polianilina. En otra realización preferida, la molécula con actividad biológica se selecciona de entre moléculas de adhesión celular, moléculas de la matriz extracelular, factores de crecimiento, factores guía para los axones o dendritas tales como netrinas, efrinas, semaforinas, protocadherinas o las proteínas SI it ó Wnt, morfógenos como Sonic Hedgehog, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, gangliósidos, proteínas, péptidos o combinaciones de estas moléculas. En otra realización preferida, la molécula puente se selecciona de entre polipéptidos, aminoácidos, péptidos, polisacáridos, anticuerpos, o combinaciones de los mismos.
La molécula puente o la molécula con actividad biológica se puede unir al polímero electroconductor mediante adsorción espontánea, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas o enlaces covalentes.
En otra realización preferida, la molécula con actividad biológica se une al polímero electroconductor a través de al menos dos tipos diferentes de moléculas puente.
En una realización preferida, la molécula puente es polilisina y la molécula con actividad biológica es un complejo de heparina o heparán sulfato y factor de crecimiento, y más preferiblemente un factor de crecimiento que se selecciona de entre bFGF, PDGF-AA o combinaciones de ambos. Adicionalmente este complejo de moléculas biológicas comprende una molécula de la matriz extracelular unida al factor de crecimiento. Preferiblemente, esta molécula de la matriz extracelular se selecciona de entre fibronectina o derivados, vitronectina o derivados o combinaciones de las mismas. Estas moléculas pueden añadirse al complejo en forma de suero fetal o adulto junto con otras proteínas y componentes característicos del suero o en forma de una preparación de la proteína concreta purificada.
En otra realización preferida, la molécula puente es un anticuerpo y más preferiblemente la molécula puente es IgG. En este caso, preferiblemente la molécula con actividad biológica es una molécula de adhesión celular que se selecciona de entre la familia de inmunoglobulinas, cadhennas, integhnas, y selectinas. Más preferiblemente la molécula con actividad biológica es N- cadhe na, L1 ó combinaciones de ellas. Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a materiales y métodos para la modificación de electrodos neuroprotésicos. El material preferiblemente consiste en una capa de PEDOT dopado con PSS-co-MA y funcionalizado con moléculas de adhesión celular tales como L1 y cadherinas y el método consiste en utilizar este material con el fin de promover el crecimiento axonal y dendrítico y la migración neural sobre la superficie del propio electrodo con el fin de incrementar la eficacia de la comunicación eléctrica entre el electrodo y la célula. La unión de las moléculas al polímero puede realizarse de forma electrostática o covalente, y las CAMs pueden unirse directamente o a través de un ligando. La principal ventaja de recubrir los electrodos neuroprotésicos con PEDOT:PSS-co-MA es que el polímero mejora sus prestaciones eléctricas a la vez que permite la funcionalización covalente de la superficie de manera que la capa molecular unida al polímero no se desprende durante la electroestimulación. Además, la funcionalización covalente del PEDOT:PSS-co- MA no deteriora su conductividad eléctrica y pueden unirse múltiples moléculas a la superficie para obtener los efectos celulares deseados. Por ejemplo, en las neuroprótesis puede resultar fundamental que sobre el electrodo crezcan axones, dendritas o ambos tipos de prolongaciones. En la presente invención se demuestra que la funcionalización del PEDOT:PSS-co-MA con L1 estimula el crecimiento axonal pero inhibe las dendritas, mientras que su funcionalización con N-cadherina induce el crecimiento tanto de axones como de dendritas. Otra característica muy novedosa de la presente invención es que la funcionalización con N-cadherina estimula la migración neuronal sobre el polímero conductor. Finalmente, la funcionalización simultánea con L1 y N- cadherina produce efectos sinérgicos sobre el crecimiento celular que no pueden obtenerse con ninguna de las dos proteínas aisladas. Así, las superficies funcionalizadas con L1 / cadherinas pueden mejorar las prestaciones de las neuroprótesis y también utilizarse para promover la reparación del tejido neural.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de un material biofuncionalizado, según lo descrito anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
a) Síntesis de un polímero electroconductor dopado con PSS-co-MA sobre un soporte que se selecciona de entre materiales de carbono, vidrio, plástico, metales o sus óxidos, polímeros, geles, productos derivados de la matriz extracelular, o combinaciones de estos materiales,
b) Funcionalización del polímero electroconductor mediante electroadsorción, unión covalente o adsorción espontánea. En esta última forma, la molécula se incorpora a la superficie al poner el material en contacto con soluciones que contienen las moléculas de interés pero sin aplicar electricidad ni activar químicamente la superficie para la formación de enlaces covalentes.
c) Unión directa a la superficie del polímero funcionalizado en la etapa
(b) de al menos un tipo de molécula con actividad biológica o unión indirecta de dicha molécula con actividad biológica a través de al menos una molécula puente. Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso del material biofuncionalizado anteriormente descrito para la fabricación de dispositivos para inducir el crecimiento neural, la reparación del sistema nervioso, o para electrodos de neuroestimulación. Preferiblemente el dispositivo es una cámara de cultivo celular o un implante.
Un quinto aspecto se refiere a un método para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso que comprende poner en contacto tejido del sistema nervioso central con el material biofuncionalizado descrito para promover la proliferación, diferenciación y/o migración de precursores gliales y que a su vez ellos estimulen el crecimiento de los axones.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una cámara de cultivo celular que comprende una base (1 ) sobre la que se encuentra dispuesto un material en forma de microfibras electroconductoras (2), las cuales están unidas en al menos uno de sus extremos a un contacto eléctrico (3), y que comprende además una celda (4) abierta superior e inferiormente y dispuesta sobre la base (1 ), en cuyo interior quedan parcialmente contenidas las microfibras.
En una realización preferida, el material dispuesto en forma de microfibras (2) es el material biofuncionalizado de la invención que ha sido descrito anteriormente.
En una realización preferida, la celda (4) es prismática, la base (1 ) es transparente para permitir la visualización directa del crecimiento celular utilizando un microscopio invertido, y las microfibras (2) están dispuestas sobre la base (1 ) de forma paralela.
En otra realización preferida, la celda (4) comprende además unos soportes (5) dispuestos en dos lados opuestos de la base (1 ).
En otra realización preferida, la celda (4) además comprende al menos un tabique separador (6) dispuesto transversalmente a la dirección longitudinal de las microfibras (2). El tabique separador (6) puede disponerse de forma en que no apoya sobre la base definiendo una ranura para el paso de las microfibras (2), o bien el tabique separador (6) comprende unos orificios para el paso de las microfibras (2) y de los elementos celulares que crecen sobre ellas. En otra realización preferida, la celda (4) es cilindrica y las microfibras (2) están dispuestas sobre la base (1 ) de forma radial.
La celda cilindrica puede además comprender un anillo interior (7), estando dispuestos al menos dos tabiques separadores (8) en dirección radial entre la celda (4) y dicho anillo interior (7). Además, el anillo interior tiene una ranura o un agujero para el paso de la microfibra y de los elementos celulares que crecen sobre ella. Estas celdas constituyen una herramienta novedosa para investigar los mecanismos del neurodesarrollo y la biología y fisiología de las células neurales, y también para evaluar tratamientos para las enfermedades del sistema nervioso. Entre las ventajas de estas celdas de cultivo con respecto a las existentes en el mercado se encuentra la posibilidad de aplicar estímulos eléctricos de voltaje o de corriente eléctrica a través del sustrato de crecimiento celular, resultando muy útiles para estudiar la influencia de la actividad neural sobre los procesos de crecimiento y guía axonal, proliferación y diferenciación celular, etc. Además, el crecimiento neuronal y la migración celular sobre las microfibras ocurren de forma sostenida y por distancias largas, de manera que puede registrarse la evolución de estos procesos en escalas de tamaño y tiempo más parecidos a aquellos que tienen lugar en el organismo humano. Otra de sus ventajas es que las microfibras pueden funcionalizarse fácilmente con cualquier tipo de biomoléculas y que estas pueden combinarse, de manera que se puede simular con mayor precisión el complejo entorno multimolecular de los organismos vivos. Por ejemplo, en la misma celda pueden incorporarse microfibras funcionalizadas con diferentes moléculas de adhesión celular para estudiar los fenómenos de crecimiento y fasciculación axonal. Por su parte, las microfibras funcionalizadas con complejos del tipo PLL / Heparina / bFGF / proteínas de la matriz extracelular pueden ser particularmente útiles para estudiar la regeneración axonal mediada por precursores de células gliales, así como la mielinización axonal y su modulación por la actividad eléctrica, tanto en el SNC como en el SNP. Otra ventaja de las celdas de cultivo objeto de la invención es que las microfibras pueden cortarse con facilidad y de forma selectiva, lo que permite estudiar las respuestas celulares a la axotomía, así como separar componentes tisulares (por ejemplo las células migratorias) para sub-cultivarlas en otras celdas y utilizarlas en otras investigaciones o en implantes. Finalmente, el diseño de las celdas las hace muy apropiadas para visualización directa de las microfibras y las células que migran o crecen en su superficie mediante microscopía confocal, ampliando las posibilidades de utilización de las celdas a numerosos campos de la biología. En un último aspecto, la presente invención se refiere a un implante que comprende el material biofuncionalizado descrito anteriormente. Este implante es apto para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso en zonas donde se han producido lesiones neurales por diversas causas.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Fig. 1 ejemplifica las características morfológicas del PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 . Las partes A, B, D, E y F son electromicrografías de barrido. A) Vista de la superficie del polímero. B) Vista transversal que muestra el espesor del polímero a la derecha de la capa de Ti/Au (visualizada como una línea blanca). C) Cuantificación del grosor del PEDOT:PSS-co-MA en función de la carga de electropolimerización. Se representa el promedio ± error estándar, siendo el último más pequeño que el tamaño de los símbolos. D) y E) aspectos de las microfibras de carbono antes y después de la electrodeposición del polímero, respectivamente. F) Detalle de la morfología del polímero sintetizado sobre las microfibras. Escalas: A, B y F, 500 nm; D y E, 2 m.
La Fig. 2 muestra en la parte A el espectro de infrarrojos del PEDOT:PSS-co- MA 1 : 1 (línea continua) y del PEDOT:PSS-co-MA 3: 1 (línea punteada), preparados sobre vidrio recubierto de Ti/Au. Cada línea representa el promedio de nueve espectros sin procesamiento adicional. En la parte B se representa la fluorescencia (promedio de 6 mediciones ± error estándar) del PEDOT:PSS-co- MA 1 : 1 (barras negras) y del PEDOT:PSS-co-MA 3: 1 (barras blancas) tras el procesamiento para unión covalente de Alexa-488 a diferentes concentraciones. En la parte C se representa la unión covalente mediante EDC / NHS (barras negras) y la adsorción espontánea (barras grises) de la Alexa- 488 a la superficie del PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 , en función de la concentración del anticuerpo. En B y C se ha sustraído la fluorescencia de fondo (aproximadamente 10 u.a) del polímero sin anticuerpo para una mejor visualización de los datos.
La Fig. 3 presenta la caracterización mediante espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) de las superficies de Ti/Au y de las microfibras de carbono recubiertas con polímeros conductores. A) Diagrama de Nyquist para los datos obtenidos en el rango 1 kHz a 0,1 Hz de las superficies de Ti/Au recubiertas con PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 sintetizado con 48 (círculos), 96 (cuadrados), 192 (triángulos), 288 (triángulos invertidos) ó 384 (rombos) mC/cm2 Los datos simulados se representan con cruces. B) Diagrama de Bode de módulo de la impedancia de los mismos materiales presentados en A, pero incluyendo además los datos obtenidos de la superficie de Ti/Au sin polímero (triángulos inclinados). C) Diagrama de Bode de módulo de la impedancia del PEDOT:PSS-co-MA sintetizado a 96 mC/cm2 sobre Ti/Au, sin funcionalizar (círculos) o con PLL unida covalentemente (cuadrados). D) Diagrama de Nyquist para los datos obtenidos en el rango 10 kHz a 0, 1 Hz de las microfibras de carbono recubiertas con PEDOT:PSS (cuadrados) o con PEDOT:PSS-co- MA (círculos), ambos sintetizados con 96 mC/cm2 Los datos simulados se representan con cruces. E) Diagrama de Bode de módulo de la impedancia de los mismos materiales presentados en D, pero incluyendo además los datos obtenidos de las microfibras de carbono sin polímero conductor (círculos).
La Fig. 4 presenta la caracterización mediante voltametría cíclica (CV) de las superficies de Ti/Au y de las microfibras de carbono recubiertas con polímeros conductores. A) Densidad de carga obtenida durante la voltametría (Qcv) a velocidad de 0,05 V/s (línea gris) ó 0,5 V/s (línea negra) en función de la carga de electrosíntesis ( QPo/). B) CV (0,05 V/s) del PEDOT:PSS-co-MA sobre Ti/Au. El polímero se ha sintetizado con 96 mC/cm2 y se analiza sin funcionalización (línea continua) o después de unirle PLL covalentemente (línea discontinua). C) CV (0,5 V/s) del PEDOT:PSS-co-MA (96 mC/cm2) sobre Ti/Au. El polímero se analiza sin funcionalización (línea continua) o después de unirle PLL covalentemente (línea discontinua). Nótese la diferente escala de la densidad de corriente respecto a B. D) Degradación del transporte de carga del PEDOT:PSS-co-MA (96 mC/cm2) sintetizado sobre Ti/Au (línea discontinua) o sobre microfibras de carbono (línea continua), en función del número de ciclos de CV a 0,5 V/s en tampón fosfato. E) QCv obtenida a distintas velocidades para las microfibras de carbono sin recubrimiento (línea punteada), recubiertas con PEDOTPSS (línea continua), o con PEDOT:PSS-co-MA (línea a rayas). Los polímeros se electrosintetizaron con 96 mC/cm2 Las barras de error son más pequeñas que los símbolos. F) CV (50 V/s) del PEDOTPSS (línea continua) y del PEDOT:PSS-co-MA (línea discontinua) sintetizados a 96 mC/cm2 sobre microfibras de carbono. Se muestra también el voltamperograma de la microfibra sin recubrimiento (línea punteada). Nótese la diferente escala de la densidad de corriente respecto a B y C.
La Fig. 5 presenta la caracterización mediante cronoamperometría de las microfibras de carbono recubiertas de polímero conductor por electrosíntesis a 96 mC/cm2. A) Microfibras recubiertas de PEDOTPSS. B) Microfibras recubiertas de PEDOTPSS-co-MA. A y B muestran la densidad de corriente aportada por las microfibras al aplicar un tren de pulsos bifásicos con amplitud de 0,2 (línea de rayas cortas), 0,3 (línea de puntos), 0,4 (línea de rayas largas) y 0,5 (línea de rayas-puntos) voltios; cada fase con duración de 1 ms. Para comparación se muestra la respuesta de las microfibras de carbono sin polímero (línea continua) y aplicando el mayor voltaje (0,5 V). C) Densidad promedio de carga por pulso (Qpuiso) aportada por las microfibras recubiertas con PEDOTPSS (líneas grises) o con PEDOTPSS-co-MA (líneas negras) al aplicar pulsos de voltaje de diferente intensidad y duración (líneas continuas, 1 ms; líneas discontinuas, 5 ms). El error estándar es más pequeño que los símbolos. La Fig. 6 es un dibujo que ¡lustra dos complejos utilizados para la funcionalización multimolecular del PEDOT:PSS-co-MA. Por simplicidad, en el esquema de la izquierda se ha omitido la adición final de las moléculas de la matriz extracelular que se unen al complejo formado por la heparina o heparán sulfato y el factor de crecimiento.
La Fig. 7 presenta las cuantificaciones de las moléculas de adhesión celular (CAMs) o de los factores de crecimiento unidos a la superficie del PEDOTPSS- co-MA 1 : 1 y detectados mediante inmunofluorescencia. A) Señal de las CAMs recombinantes unidas al polímero al que previamente se le enlazó IgG específica contra el fragmento Fe de la IgG humana. Cada una de las cuatro superficies se procesó para detectar simultáneamente N-Cadherina y L1 . B) Señal de los factores de crecimiento unidos a la superficie del PEDOT:PSS-co- MA 1 : 1 al que previamente se le enlazó PLL y posteriormente se le adicionó heparina. Cada una de las cuatro superficies se procesó para detectar simultáneamente bFGF y PDGF-AA.
La Fig. 8 ¡lustra la supervivencia y crecimiento de las células neurales cultivadas a 25000 células/cm2 sobre PEDOT:PSS-co-MA sin ninguna molécula pro-adhesiva, o funcionalizado con PLL. A) Microfotografía con contraste de fase de las células cultivadas por 24 h en el polímero sin funcionalizar. B) Microfotografía de las células cultivadas por 24 h en el polímero funcionalizado con PLL enlazada covalentemente. C) Imagen de fluorescencia que muestra las neuronas sobre el polímero funcionalizado mediante electroadsorción de PLL, cultivadas por 5 días y procesadas con inmunocitoquímica para Tau y MAP2. D) Imagen de fluorescencia de las neuronas cultivadas por 5 días sobre el polímero funcionalizado mediante unión covalente de PLL y procesada de forma similar al caso C. Las escalas representan 100 pm. La Fig. 9 ¡lustra la supervivencia y crecimiento de las células neurales cultivadas sobre PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con A-HIgG / CAMs. En las partes A y B se muestran imágenes de contraste de fase de las neuronas cultivadas a 25000 células/cm2 por 24 h sobre el polímero con N-Cadherina utilizada a 5 y 20 pg/ml, respectivamente. En C-F se muestran ejemplos representativos del crecimiento de las neuronas cultivadas a 1000 células/cm2 por 48 h sobre PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con A-HIgG y: C) N- Cadherina 10 pg/ml, D) L1 10 pg/ml, E) N-Cadherina y L1 , ambos a 10 pg/ml. Para su comparación, en F) se presenta un ejemplo del crecimiento sobre el polímero con PLL (45 pg/ml) unida covalentemente. Las imágenes C a F se han procesado con inmunocitoquímica para Tau (axones, flechas largas) y MAP2 (somas y dendritas, flechas cortas). Las escalas representan 100 pm.
La Fig. 10 presenta las mediciones detalladas del crecimiento neuronal en cultivos de baja densidad sobre PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL (45 pg/ml) ó A-HIgG y CAMs (10 pg/ml). Los colores representan la misma superficie en todas las gráficas: blanco, polímero + PLL; gris oscuro, polímero + A-HIgG / N-Cadherina (NCad); gris medio, polímero + A-HIgG / L1 ; gris claro, polímero + A-HIgG / NCad / L1 . Para comparación adicional se incluyen los datos del crecimiento sobre vidrio borosilicato recubierto con PLL (negro). Por simplicidad, solo se indican con asteriscos las diferencias estadísticas (ANOVA de un factor) entre las neuronas crecidas en vidrio con PLL ó polímero con CAMs en comparación con aquellas cultivadas sobre el polímero con PLL, y las otras comparaciones se describen en el texto. *** p < 0.001 ; ** p < 0.01 ; * p< 0.05.
La Fig. 11 presenta las cuantificaciones de la migración celular en cultivos de baja densidad sobre PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL (45 pg/ml) ó A-HIgG y CAMs (10 pg/ml). A) Porcentaje de células que migran en cada superficie. B) Distancia recorrida (media ± SEM) por el subgrupo de células migratorias. En el polímero funcionalizado con PLL no hubo migración celular, definida como el desplazamiento del soma por más de 30 pm. Las diferencias estadísticas entre las superficies tratadas con distintas CAMs se describen en el texto. La Fig. 12 es una serie de dibujos que ejemplifican los modelos de celdas de cultivo celular con microfibras electroconductoras objeto de la presente invención. A) Dibujo de un pozo de una celda de cultivo simple. B) Dibujo de dos pozos que se comunican a través de las microfibras y un pequeño espacio alrededor en una celda de cultivo compuesta. Se ¡lustran también dos modelos de comunicación en función de las necesidades del cultivo. C) Dibujo de una celda de cultivo compartimentalizada con microfibras radiales. Los números indican: 1 - la base; 2 - las microfibras electroconductoras; 3 - los contactos eléctricos; 4 - la pared de la celda; 5 - los soportes; 6 - el tabique separador en la celda B; 7 - el anillo interior en la celda C; 8 - los tabiques separadores en la celda C.
La Fig. 13 presenta las cuantificaciones del crecimiento axonal, la migración glial y el número de células sobre las microfibras que tienen PEDOT:PSS-co- MA funcionalizado con A-HIgG y CAMs (L1 ó N-Cadherina), fijadas y procesadas para ¡nmunohistoquímica a los 5 o 10 días de poner el explante. Los datos representan la media ± SEM de la longitud de crecimiento axonal (A), la longitud recorrida por las células Vimentina+ (B) y el número de células Vimentina+ (C) sobre las microfibras en función de la molécula presente en la superficie y la duración del cultivo. Las diferencias estadísticas entre las condiciones experimentales se describen en el texto. Nótese la diferente escala en la distancia de crecimiento axonal y migración celular.
La Fig. 14 es una serie de imágenes obtenidas por microscopía confocal que ejemplifican el crecimiento axonal y dendrítico y la migración neuronal a partir de explantes de la corteza cerebral tras 10 días en contacto con microfibras funcionalizadas con A-HIgG / CAMs (L1 ó N-Cadherina). Se muestran los tipos y relaciones celulares que tienen lugar en la zona proximal de la microfibra (la zona más cercana al explante), incluyendo la imagen de luz transmitida así como la fluorescencia debida al crecimiento axonal (Tau) y las dendritas y somas neuronales (MAP2). Nótese la diferente morfología y localización que tienen los somas neuronales (flechas cortas) y las dendritas (flechas largas) respecto a las fibras dependiendo de la CAM utilizada. Las escalas representan 50 μηι.
La Fig. 15 ¡lustra el crecimiento neural sobre las microfibras que tienen PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL únicamente o con un complejo multimolecular de PLL y capas adicionales de Heparina / bFGF / moléculas del suero fetal bovino (FBS). Los cultivos se fijaron a los 5 días y posteriormente se les realizó ¡nmunohistoquímica para vimentina (precursores gliales) y Tau (axones). A) Migración de los progenitores gliales (barras negras) y crecimiento axonal (barras blancas) en las microfibras en función del complejo molecular presente en la superficie (PLL, polilisina; Hep, heparina; bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos básico). B) número de precursores en las microfibras. La Fig. 16 muestra las interacciones entre los precursores gliales y los axones sobre las microfibras que tienen PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL / Heparina / bFGF / FBS. A), B) y C) son imágenes de microscopía confocal que ejemplifican los tres tipos de relación existente entre los axones (gris claro, flechas blancas) y las células del frente migratorio (gris oscuro, flechas negras). D), E) y F) son electromicrografías de la célula de la punta (D), y de las células que van detrás del frente de avance (E, F). Estas últimas presentan dos tipos de morfología, como son la fusiforme (E) y la polidendrítica (F). Nótese que en la célula fusiforme también existen pequeñas prolongaciones laterales, y que las células en E y F se entremezclan con numerosos axones y prolongaciones de otras células.
La Fig. 17 presenta detalles de la interacción entre los precursores gliales y los axones sobre las microfibras, así como otras características fenotípicas de los precursores. A) Electromicrografía que muestra como los precursores emiten prolongaciones citoplasmáticas que envuelven a los axones (flechas blancas a la izquierda) y a los conos de crecimiento axonal. En la ampliación de la derecha, nótese como el cono de crecimiento axonal tiene forma de bulbo y escasos filopodios, y está en contacto con el polímero funcionalizado mientras que por encima lo envuelve la prolongación del precursor glial (flecha blanca). B) y C), inmunorreactividad de la membrana citoplasmática de los precursores para NG2 y PDGFRa, respectivamente.
La Fig. 18 presenta las cuantificaciones del crecimiento neural sobre las microfibras que tienen PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL / Heparina / bFGF / y moléculas de la matriz extracelular a partir del suero ó en su forma purificada. Los cultivos se han fijado a los 5 días. La figura también presenta la cuantificación de la unión de las moléculas a la superficie mediante inmunofluorescencia, siguiendo el procedimiento que se describe en el ejemplo 14. A) Migración de los precursores gliales (barras negras) y crecimiento axonal (barras blancas) en las microfibras en función del complejo molecular presente en la superficie (NRS, suero de rata normal; VN, vitronectina; FN, fibronectina; las otras abreviaciones se describen en la Fig. 18). B) número de precursores en las microfibras. C) Cuantificación de la unión de FN a la superficie del PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL / Heparina / bFGF, a partir de medio de cultivo con los suplementos que se indican en la figura. La Fig. 19 muestra una serie de imágenes obtenidas por microscopía confocal que ejemplifican el crecimiento neural (5 días) sobre las microfibras que tienen PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL/Heparina/bFGF y adicionalmente con: A) FBS (10 %); B) NRS (10 %); C) FN 20 pg/ml; D) VN 20 pg/ml. Los precursores gliales están teñidos para vimentina (gris) y los axones para Tau (blanco). Las escalas representan 500 pm.
La Fig. 20 presenta una serie de imágenes de microscopía confocal en las que se compara la relación entre los axones y las células de la punta, así como el fenotipo de las células de la punta, sobre microfibras que tienen PEDOTPSS- co-MA con PLL/Heparina/bFGF y a las que se añade finalmente FBS ó FN. Nótese la similitud del crecimiento y del fenotipo de las células migratorias en ambas condiciones. Las flechas largas señalan los axones (marcados para Tau ó para β-ΙΙΙ tubulina), y las flechas cortas señalan los precursores gliales (marcados para Vimentina o para PDGFRa.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Electrosíntesis de los polímeros conductores
Se utilizó un potenciostato / galvanostato (Autolab PGstat30; Ecochemie, The Netherlands) para electrosintetizar poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT) dopado con poli[(ácido 4-estireno sulfónico)-co-(ácido maleico)] (PSS-co-MA, 20000 de PM), aplicando corriente constante anódica (1 μΑ/mm2). El electrodo de trabajo (WE) consistió en un portaobjetos de vidrio borosilicato recubierto con 10 nm de Au (Phasis, Switzerland; capa de Au unida al vidrio por medio de una nanocapa de Ti), o en microfibras de carbono de 7 pm de diámetro (C005722, Goodfellow, UK); usando Pt como contraelectrodo (CE) y un electrodo de calomelanos saturado (SCE) como electrodo de referencia (RE). Para la electrosíntesis del polímero sobre las microfibras de carbono se colocaron 5 microfibras alineadas en las cámaras de cultivo celular que se describen en el ejemplo 1 1 . El polímero (PEDOT: PSS-co-MA) se sintetizó con éxito sobre ambas superficies electroconductoras, registrándose un potencial cercano a 0,84 V (vs. SCE) y un potencial de circuito abierto para el polímero formado de 0,25 V (vs. SCE) tras 5 minutos de su relajación en tampón fosfato. Para producir polímeros con diferente grosor se suministraron distintas densidades de carga eléctrica entre 48 y 384 mC/cm2 También se compararon las características del PEDOT: PSS-co-MA producido al utilizar PSS-co-MA con relaciones molares de ácido 4-estireno sulfónico:ácido co-maleico de 1 :1 y 3:1 (referencias 434558 y 434566 de Sigma-Aldrich, USA). El monómero y los dopantes se utilizaron a concentraciones de 15 mM (EDOT, Sigma-Aldrich), 0, 172 mM (PSS-co-MA 1 : 1 ) y 0, 189 mM (PSS-co-MA 3: 1 ), respectivamente. Las concentraciones mencionadas de los dopantes equivaldrían a aproximadamente 20 mM si el cálculo se realiza considerando el número total de moléculas de ácido 4-estireno sulfónico y de ácido co-maleico presentes en cada molécula. Como disolvente se usó tampón fosfato 5 mM estéril (1 litro de agua MQ contiene 9 g NaCI, 0,8 g de Na2HP04.2H20, 0, 14 g de KH2P0 ) a 37 °C.
Ejemplo 2: Características morfológicas y químicas del PEDOT:PSS-co- MA
El estudio de la morfología de los polímeros preparados y la cuantificación de su grosor se realizaron mediante microscopía electrónica de barrido (Nova NanoSEM200, FEI Company, USA), utilizando 2-3 kV, spot 2.0, detector TLD y condiciones de alto vacío. La conductividad eléctrica del PEDOT:PSS-co-MA hizo innecesaria la utilización de recubrimientos metálicos adicionales y permitió la visualización de poros muy pequeños (~5 nm) en la superficie. Su composición atómica se determinó utilizando un detector de energías dispersivas de rayos X (EDX) integrado con el SEM y trabajando a 7,5 kV. También se estudió la composición del polímero, su estado relativo de oxidación y su homogeneidad empleando espectrofotometría de infrarrojos (FT- IR), para lo cual se utilizó un sistema automatizado de microespectrofotometría (Spotlight 400; PerkinElmer, USA) equipado con un espectrofotómetro Spectrum-one (PerkinElmer). El sistema se operó en el modo de imagen por reflectancia entre 4000 y 750 cm"1, con resolución de 16 cm"1 números de onda, tamaño de pixel de 50 pm, adquiriendo 16 registros por pixel y finalmente analizando 9 espectros por cada muestra.
Los estudios mediante SEM (Fig. 1 ) confirmaron la formación del polímero sobre los portaobjetos de Ti/Au y sobre las microfibras de carbono, en ambos casos obteniéndose una nanoestructura nodular altamente porosa. La relación entre la carga de electrosíntesis y el grosor del polímero se estudió en las películas preparadas sobre Ti/Au. El aumento gradual de la carga eléctrica suministrada de 48 a 384 mC/cm2 causó un incremento lineal (r = 0.99) en el grosor de la capa de PEDOT:PSS-co-MA desde 0,23 hasta 1 ,37 pm, mostrando una relación de 3,46 ± 0, 1 pm por 1 C/cm2 El análisis mediante EDX del PEDOT:PSS-co-MA recién preparado mostró que estaba compuesto por carbono (62,58 ± 0,67 %), oxígeno (26,58 ± 0,76 %) y azufre (9,56 ± 0, 12 %), junto con un porcentaje pequeño de cloro (1 ,30 ± 0,05 %) incorporado a partir del tampón durante la electrosíntesis oxidativa, pero ausencia de sodio y potasio. Esta composición atómica relativa fue homogénea en la superficie del polímero. El espectro de infrarrojos del PEDOT:PSS-co-MA preparado sobre Ti/Au con 96 mC/cm2 mostró las bandas de absorción que corresponden a los grupos químicos y al estado dopado del PEDOT. Para el PSS-co-MA 1 : 1 fueron prominentes las vibraciones a 1519, 1476, 1394 y 1346 cm"1 (tensión del C = C y C - C), 1204, 1 144, 1087, 1057 y 982 cm"1 (bandas inducidas por el dopaje), y 934 y 840 cm"1 (tensión del C-S). Las bandas del espectro del PEDOT: PSS-co- MA 3: 1 fueron bastante parecidas a las del 1 : 1 (Fig. 2A), pero la absorbancia fue mayor y el espectro se desplazó sutilmente hacia las frecuencias más bajas, indicando un mayor estado de oxidación (Kvarnstróm et al., 1999).
Ejemplo 3: Unión covalente de biomoléculas al PEDOT: PSS-co-MA
Se utilizaron películas de PEDOT: PSS-co-MA preparadas con 96 mC/cm2 sobre Ti/Au para evaluar la unión covalente de proteínas al polímero, a través de la formación de enlaces entre los grupos carboxilo del PSS-co-MA y los grupos amino de la proteína. La reacción se realiza a 24 °C aplicando sobre la superficie del polímero una solución de 1 -etil-3 (-3dimetilam¡no-prop¡l) clorhidrato de carbodiimida (EDC, Sigma-Aldrich) y N-hidroxisuccinimida (NHS, Sigma-Aldrich), ambos a 45 pg/ml en agua MQ, por 1 h. Posteriormente se retira la solución, se lava 3 veces en agua MQ e inmediatamente después se aplica la molécula a conjugar covalentemente (por ejemplo PLL, anticuerpos o moléculas de adhesión celular), disuelta en tampón de trietanolamina (TEA) 50 mM, pH 8,0, también por 1 h. Transcurrido este tiempo se retira la solución y se lava la superficie 2 h agua en MQ estéril y luego otras 12 h en tampón fosfato 5 mM, en agitación suave. Finalmente se lavan con agua y para los estudios de microscopía confocal se montan con tampón fosfato / glicerol. Puesto que el PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 tiene el doble de grupos carboxilo por molécula en comparación con el 3: 1 , resulta esperable que el primero sea más eficiente para la unión covalente de biomoléculas mediante reacciones con EDC / NHS. Con el fin de valorar esta cuestión, realizamos un ensayo de unión de anticuerpos fluorescentes (IgG conjugada con Alexa-488, Molecular Probes) a 5, 25 y 45 g/ml sobre los polímeros conductores. También se realizaron comparaciones entre la unión covalente del anticuerpo y su adsorción espontánea al polímero, para lo cual se procesó el PEDOT:PSS-co-MA de la misma manera que para la conjugación covalente pero omitiendo el EDC / NHS. Tras la reacción, las superficies fueron escaneadas con un microscopio confocal (TCS SP2 SE, Leica Microsystems CMS GmbH) utilizando un objetivo 63x de inmersión y zoom de 3,5. Para la Alexa-488 se excitó a 488 nm y se recogió la emisión entre 500-590 nm, y en el caso de la Alexa-594 se excitó a 594 nm y se recogió la emisión entre 605-750 nm. Se analizaron seis campos por muestra, y tres muestras por cada situación experimental. Se utilizó el programa ImageJ (1.39u, NHI, USA) para medir el promedio de la intensidad de color verde en las imágenes obtenidas. La Fig. 2B muestra la fluorescencia del PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 (barras negras) y del PEDOT:PSS-co-MA 3: 1 (barras blancas) tras el procesamiento para unión covalente de Alexa-488. La fluorescencia de fondo (aproximadamente 10 u.a) del polímero sin anticuerpo ha sido sustraída para una mejor representación de los datos. El análisis de los resultados utilizando ANOVA de dos factores mostró que en ambos polímeros ocurre un claro incremento (p<0.0001 ) de la unión covalente del anticuerpo en función de su concentración, y que el PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 une casi el doble de anticuerpo en comparación con el PEDOT:PSS-co-MA 3: 1 cuando la Alexa- 488 se utiliza a 25 y 45 pg/ml (p<0.01 y p<0.001 , respectivamente). Con los métodos utilizados no se detectó diferencia (p = 0.195) para 5 pg/ml, probablemente debido a que la unión del anticuerpo es escasa y la fluorescencia del polímero se acerca a la señal de fondo. En la Fig. 2C se representa la unión covalente (mediante EDC / NHS, barras negras) y la adsorción espontánea (barras grises) de la Alexa-488 a la superficie del PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 . La unión del anticuerpo al polímero mediada por EDC / NHS fue muy superior a la adsorción espontánea, y este efecto se constató en todas las concentraciones utilizadas (ANOVA de dos factores, p<0.000001 ). También se observó un incremento en la unión de la proteína al polímero dependiente de la concentración, obteniéndose los mayores valores con la máxima concentración evaluada (85 pg/ml). Ejemplo 4: Funcionalización del PEDOT:PSS-co-MA con policationes tipo PLL.
Para la funcionalización del PEDOT:PSS-co-MA con PLL se utilizaron procedimientos de electroadsorción o de unión covalente. La electroadsorción del policatión se realizó mediante reducción galvanostática del polímero, metodología similar a la que desarrollamos para adsorber PLL al PEDOT dopado con sulfonato de poliestireno (Collazos-Castro et al., 2010, Biomaterials 31: 9244-9255). Se utilizó PLL con PM entre 30000 y 70000 (Sigma-Aldrich), disuelta a 45 pg/ml en agua MQ purificada hasta obtener una resistividad de 18,2 ΜΩ/cm2. Para la electroadsorción se utilizó una celda electroquímica en la que el polímero preparado a 96 mC/cm2 funcionaba como WE enfrentado a un contraelectrodo de Pt y referenciado al SCE, y se aplicó corriente constante (- 12,5 μΑ/cm2) hasta una densidad de carga de 3 mC/cm2 Inmediatamente tras la reducción el polímero se lavó con abundante agua MQ y se dejó secar. En otras realizaciones se unió covalentemente la PLL al PEDOT: PSS-co-MA, utilizando el mismo protocolo descrito en el ejemplo 3. Debido a la gran cantidad de grupos amino presentes en la PLL, para su unión covalente se usó solamente la concentración de 45 pg/ml en tampón TEA 50 mM, pH 8,0. Ejemplo 5: Propiedades electroquímicas del PEDOT:PSS-co-MA y comparación con el PEDOT: PSS con el fin de establecer su utilidad para recubrir y funcionalizar electrodos neuroprotésicos
Las propiedades de los electrodos recubiertos se estudiaron mediante espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS), voltametría cíclica (CV) y cronoamperometría usando la configuración de tres electrodos y el tampón fosfato descritos en el ejemplo 1 . Para la EIS se aplicaron ondas sinusoidales de 5 mV a 26 valores de frecuencia espaciados logarítmicamente desde 10 kHz hasta 0, 1 Hz. Los espectros obtenidos se modelaron utilizando la expresión de la impedancia cuyos parámetros se obtuvieron mediante un método no lineal de mínimos cuadrados complejos que se implemento en MatLab (MathWorks, USA). La CV se realizó llevando el potencial de reposo a 0 V por 10 s y posteriormente registrando entre -1 ,05 y +0,55 V (versus SCE) a 0,05, 0,5, 5 y 50 V/s. A partir de la CV se estudiaron los fenómenos redox y también se calculó la densidad de carga (Qcv) anódica y catódica de los materiales preparados, integrando la corriente en cada fase del voltamperograma con respecto al tiempo y dividiendo por la velocidad de barrido. En aras de simplificar los resultados aquí se presenta el promedio de las dos cargas. También utilizamos la CV para evaluar la estabilidad del PEDOT:PSS-co-MA sobre las superficies de Ti/Au y sobre las microfibras de carbono, midiendo la Qcv a 0,5 V/s cada 100 ciclos hasta un total de 500 y comparando los valores relativos. Para la cronoamperometría se aplicaron trenes de pulsos bifásicos rectangulares, llevando previamente el potencial del electrodo a 0 V por 10 s y siempre empezando por la fase negativa. Los pulsos tenían duración de 1 ó 5 ms y amplitudes de 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 V. Los resultados obtenidos fueron muy parecidos para el PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 y 3: 1 . Aquí se presentan sólo los datos del PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 , ya que fue superior al 3:1 en cuanto a la unión covalente de proteínas (ver ejemplo 3) y por consiguiente se seleccionó para todos los estudios celulares. Para su caracterización electroquímica, los polímeros se electrosintetizaron sobre 100 mm2 de vidrio con nanocapa de Ti/Au o sobre microfibras de carbono, en este último caso produciendo electrodos de aproximadamente 0,023 mm2 (0,92 mm de microfibra recubierta con polímero, con un diámetro aproximado de 8 pm). Se estudiaron diferentes grosores de recubrimiento, pero en las microfibras se caracterizaron únicamente los sintetizados con 96 mC/cm2, que fueron los utilizados para los cultivos organotípicos. A efectos comparativos utilizamos PEDOT:PSS electrodepositado en las microfibras con los mismos parámetros usados para el PEDOT:PSS-co-MA. La Fig. 3A muestra el diagrama de Nyquist con los espectros de impedancia del PEDOT:PSS-co-MA electrosintetizado con diferentes cargas. En dichos diagramas se ha representado -X(co) vs. R(co), donde R(co) y X(co) son las partes real (resistencia) e imaginaria (reactancia) de la impedancia Z(jco)=R(co)+jX(co), respectivamente, ω es la frecuencia angular (ω=2πί, f es la frecuencia) y j es la unidad imaginaria. El diagrama obtenido para el PEDOT:PSS-co-MA es similar al descrito previamente para el PEDOT:PSS (Collazos-Castro et al., 2010 Biomaterials 31 : 9244-9255; Hernández-Labrado et al., 201 1 , J. Electroanal. Chem.; 659; 201 -204). A frecuencias elevadas, el diagrama de Nyquist dibuja un comportamiento de difusión de Warburg: recta que forma un ángulo de -45° con el eje real. A medida que la frecuencia disminuye, se produce un desplazamiento de la fase desde 45° a 90° (detalle de la Fig. 3A). A frecuencias bajas, el diagrama muestra un comportamiento de condensador: recta que forma un ángulo de -90° con el eje real. La difusión iónica desde el polímero hacia el electrolito y/o viceversa, mantiene la electroneutralidad de aquél durante la aplicación de un potencial. Obsérvese que la anchura de la región de difusión de Warburg se incrementa con el grosor de la capa de PEDOT:PSS-co-MA. Puesto que la transferencia electrónica es mucho más rápida que la difusión iónica, es razonable asumir que la transferencia de carga en el polímero está controlada por la difusión iónica. Los datos experimentales se interpretan utilizando la siguiente expresión:
Figure imgf000031_0001
donde Rs es la resistencia del electrolito y el segundo sumando representa la impedancia de subdifusión de formulación parabólica (Hernández-Labrado et al., 201 1 , J. Electroanal. Chem.; 659; 201 -204). La expresión de la impedancia es coherente con la obstaculización al flujo iónico causada por la estructura nanoporosa y tortuosa del polímero, lo que se traduce en una difusión iónica anómala más lenta (subdifusión) que la descrita por las leyes de Fick. Rd¡f es una constante (resistencia), α es el parámetro de la subdifusión {a= , difusión normal) y Od es la frecuencia angular característica ligada a la transición entre los comportamientos de Warburg y condensador. El coeficiente de difusión iónica Da se obtiene como:
Da = L2
A bajas frecuencias, la capacidad difusional del condensador obtenido se escribe:
Cdlf = (Rdlfad y1 La Fig. 3A muestra también los datos simulados utilizando los parámetros de la Tabla 1 . Existe una excelente concordancia entre los datos experimentales y los simulados. Según muestra la Tabla 1 , los valores de α están próximos a 0,8 indicando un comportamiento subdifusivo (0<a<1 ). C , Rat y Od varían linealmente con L, (<x>dL)"1 y L"1, respectivamente.
Existe una excelente concordancia entre los datos experimentales y los simulados. Según muestra la Tabla 1 , los valores de α están próximos a 0,8 indicando un comportamiento subdifusivo (0<a<1 ). C y Rat varían linealmente con L y (<x>dL)"1 respectivamente, mientras que Od varía inversamente con el grosor de la capa.
Figure imgf000032_0001
2
48 230 29,50 14,51 0,756 32,39 0,73x 10"8 2, 13
96 394 31 ,51 16,53 0,763 14,66 1 ,2x10"8 4, 12
96 + PLL
394 32,37 14,27 0,789 19,20 1 ,6x10"8 3,65 cova lente
192 764 33,88 19, 13 0,819 6,75 2,8x10"8 7,74
288 1 1 18 36,70 19,86 0,816 4,61 4,3x10"8 10,92
384 1367 38,75 34,41 0,833 1 ,92 3,2x10"8 15, 14
Tabla 1. Parámetros utilizados en la simulación de los datos de EIS determinados en el rango de 1 kHz a 0, 1 Hz para el PEDOT:PSS-co-MA electrosintetizado sobre superficies de Ti/Au de 100 mm2
En la Fig. 3B se observa cómo la capa de polímero depositada hace disminuir la impedancia eléctrica del Ti/Au más de dos órdenes de magnitud. La impedancia del electrodo metálico se describe mediante la resistencia del electrólito (Rs= 48,21 Ω cm2) y un elemento de fase constante (CPE) que modela, en este caso, el condensador de la doble capa. La impedancia del CPE se escribe:
Figure imgf000033_0001
donde Yp y β son constantes. Para el electrodo metálico se obtiene: Yp=10,39 μΡ sp"1/cm2 y β=0,9654. El verdadero valor de la capacidad (Cdi) de la doble capa se estima utilizando la fórmula deducida por Brug y col. (1984 J. Electroanal Chem; 176; 275-295):
Figure imgf000033_0002
= 7,91 μΡ/cm2 Obsérvese que la capacidad aumenta aproximadamente 3 órdenes de magnitud: del orden de μΡ al de mF. En la Fig. 3C puede observarse que la conjugación covalente de PLL sobre el PEDOT:PSS-co-MA esencialmente no modifica el módulo de la impedancia. Los procesos de transferencia de carga descritos mediante EIS para el PEDOT:PSS-co-MA sobre los electrodos de Ti/Au fueron similares cuando el polímero se sintetizó sobre las microfibras de carbono (Fig. 3D-E). En estas figuras se muestra también la comparación de la impedancia del PEDOTPSS- co-MA y el PEDOTPSS; como puede observarse, los dos polímeros tienen un comportamiento muy similar y sus procesos se descnben apropiadamente mediante el modelo de subdifusión (Fig. 3D). Al igual que sobre el Ti/Au, los polímeros sintetizados sobre las microfibras de carbono disminuyeron el módulo de la impedancia 2 órdenes de magnitud (Fig. 3E). Los parámetros determinados para las microfibras de carbono recubiertas de polímero conductor se detallan en la Tabla 2. El aspecto más relevante es la gran capacidad difusional de las microfibras, que para su área aproximada (0,023 mm2) se traduce en 2,7 mF/cm2 para las que tienen PEDOTPSS y 3 mF/cm2 para las recubiertas con PEDOT:PSS-co-MA. En contraste, para la microfibra sin polímero se obtiene: Yp=6,34 nF sp"1 y β=0,9059. El verdadero valor de la capacidad (Cdi) de la doble capa se estima en 2,06 nF, que para el área de las microfibras sin recubrir (0,020 mm2) se traduce en una capacidad de solamente 10, 17 MF/cm2 Tipo de
Figure imgf000034_0001
polímero y _ _ a
Ω Ω rad/s MF
PEDOT SS 3518, 1283, 0,63
1255,63 0,62
96 mC/cm2 5 8 6
PEDOT SS
4162, 4005, 0,80
co-MA 362, 19 0,69
2 5 9
96 mC/cm2
Tabla 2. Parámetros utilizados en la simulación de los datos de EIS determinados en el rango de 10 kHz a 0,1 Hz para los polímeros conductores electrosintetizados sobre microfibras de carbono con superficie de 0,023 mm2
Los voltamperogramas del PEDOT:PSS-co-MA sobre los electrodos de Ti/Au de 100 mm2 fueron muy similares a los que hemos publicado para el PEDOT:PSS (Collazos-Castro et al., 2010, Biomaterials 31 : 9244-9255), tanto en los procesos electroquímicos observados como en la QCv obtenida. Cuando la CV se realiza a velocidades bajas (0,05 y 0,5 V/s), puede constatarse un aumento significativo de la QCv con el aumento de la carga utilizada para la polimerización ( Qp0/) (Fig. 4A). Esta relación presenta un comportamiento exponencial cuya ecuación es QCv = a(1 -e"Ó Qpo/), que se ajusta con r = 0,998 en ambos casos. Sin embargo, la máxima QCv posible (parámetro a) es mayor a 0,05 V/s que a 0,5 V/s (24,4 mC/cm2 vs. 1 1 ,6 mC/cm2, respectivamente), pero para alcanzar la QCv máxima se requiere una carga de electrosíntesis 2,4 veces mayor cuando la CV se hace a 0,05 V que cuando se hace a 0,5 V/s, según lo refleja el exponente b (2,127 x 10"3 y 5, 149 x 10"3, respectivamente). Este fenómeno da soporte adicional a la interpretación de que la transferencia de carga en el polímero se limita por un proceso de subdifusión, de manera que a partir de unos valores óptimos de grosor del polímero y de velocidad de cambio de potencial, la carga transferida será menor cuanto mayor sea la velocidad a la que se impone el potencial o cuanto menor sea el grosor del polímero en la superficie.
Por otra parte, en la CV a 0,05 V/s se distinguen dos picos de reducción en - 0,65 y -0,4 V, y dos picos de oxidación en -0,6 y -0,2 V (Fig. 4B), que pueden corresponder a la aparición y desaparición de los estados polarón / bipolarón en el polímero, o bien a procesos redox de zonas del polímero con distintos grados de solvatación, morfología y longitud de conjugación de sus cadenas. También se detecta un tercer proceso de baja intensidad a -0,9 V, pero éste se debe a la reducción de moléculas presentes en el electrolito líquido, porque también ocurre en los electrodos de Ti/Au o de carbono sin recubrimiento polimérico. En los macroelectrodos de Ti/Au, los procesos redox del polímero son más difíciles de identificar a 0,5 V/s (Fig. 4C) debido al incremento de la corriente capacitiva, y están ausentes a 5 y 50 V/s, velocidades en las cuales la Qcv se aproxima a la producida por la superficie de Ti/Au sin recubrimiento, aunque este último fenómeno parece deberse a la distribución anisotrópica de la corriente eléctrica en los electrodos de 100 mm2 puesto que no se observa al utilizar microelectrodos. En las Figs. 4B-C también puede observarse que la conjugación covalente de PLL al PEDOT:PSS-co-MA no modifica sustancialmente los fenómenos redox de la superficie ni la transferencia de carga, detectándose solo una ligera disminución de la Qcv (4 a 1 1 % según la velocidad de barrido). Además, la unión covalente de PLL no altera la estabilidad del PEDOT:PSS-co-MA, siendo igual el porcentaje de pérdida de Qcv en las superficies funcionalizadas y sin funcionalizar. En las pruebas de estabilidad del polímero sobre electrodos de Ti/Au observamos que la Qcv media decrece aproximadamente el 9 % tras 100 ciclos de voltamperometría, pero posteriormente la pérdida se ralentiza y alcanza solo el 20 % a los 500 ciclos. El PEDOT:PSS-co-MA mostró una estabilidad levemente menor sobre las microfibras de carbono, con un porcentaje de pérdida de Qcv del 14 % a los 100 ciclos, que también se lentificaba para alcanzar solo el 24 % a los 500 (Fig. 4D). Por consiguiente, la estabilidad del PEDOT:PSS-co-MA es buena a pesar de usar un dopante con solo 20000 de PM y de realizar la CV con una ventana de potencial amplia (-1 ,05 y +0,55 V).
A diferencia de los macroelectrodos de Ti/Au, en las microfibras de carbono recubiertas de polímero, bien sea PEDOT:PSS-co-MA ó PEDOTPSS, la QCv es mayor a 5 y 50 V/s comparada con 0,5 V/s (ANOVA de dos factores p<0.001 ; Holm-Sidak postest p<0.001 en ambos casos). Además, la QCv del PEDOT:PSS-co-MA es mayor que la del PEDOTPSS a las velocidades de 0,5 y 5 V/s (Holm-Sidak postest p<0.001 en ambos casos), y a 50 V/s la QCv de ambos polímeros es la misma. En este último caso alcanza 3,4 mC/cm2 y equivale a más de 60 veces la QCv que produce la fibra de carbono sin recubrimiento polimérico (Fig. 4E-F). A pesar de la similitud en los valores de Qcv entre ambos polímeros a 50 V/s, también existen diferencias entre ellos. Por ejemplo, la Qcv para el PEDOTPSS aumenta al pasar de 5 a 50 V/s, mientras que la del PEDOTPSS-co-MA disminuye (Holm-Sidak postest p<0.001 en ambos casos). Además, el voltamperograma (Fig. 4F) muestra que los procesos redox no son exactamente idénticos en los dos polímeros, siendo la diferencia principal un desplazamiento de los picos de oxidación y de reducción hacia valores de potencial más positivos en el PEDOTPSS-co-MA, lo cual probablemente se deba a su mayor afinidad por los cationes presentes en el electrolito.
Finalmente, analizamos la respuesta en corriente que ofrecen las microfibras al aplicar pulsos bifásicos con duración de milisegundos (ms), con el fin de conocer mejor su utilidad para fabricar dispositivos de neuroestimulación. La Fig. 5 ejemplifica las densidades de corriente aportadas por las microfibras de carbono recubiertas de PEDOTPSS ó PEDOTPSS-co-MA (electrosintetizado a 96 mC/cm2) durante los pulsos de 1 ms, así como las densidades de carga (promedio de la anódica y la catódica) para pulsos de 1 y 5 ms. El aspecto más importante a resaltar es que las microfibras recubiertas con cualquiera de los dos polímeros producen una densidad de corriente mucho mayor que las microfibras sin recubrir, y además la corriente se mantiene elevada durante todo el pulso mientras que en las microfibras sin recubrimiento cae a 0 alrededor de los 200 s (Fig. 5A-B). Como consecuencia, la densidad de carga es mucho mayor en presencia del polímero, incrementándose más de 50 veces para los pulsos de 1 ms y más de 175 veces para los pulsos de 5 ms, a 0,5 V. Para los dos polímeros, la densidad de carga aumenta linealmente entre 0,2 y 0,5 V independientemente de la duración del pulso (Fig. 5C). Sin embargo, a pesar del buen comportamiento eléctrico del PEDOT:PSS-co-MA, los picos de corriente y las densidades de carga por pulso que aporta en promedio equivalen al 75 % y al 63 % de las que se obtienen con el PEDOTPSS, respectivamente (ANOVA p<0.0001 en ambos casos). La cronoamperometría también evidenció una caída más rápida de la corriente tras el pico inicial en el PEDOT:PSS-co-MA, que resulta más prominente durante la fase catódica (Fig. 5B). Al igual que lo observado en la CV, este comportamiento puede ser consecuencia de una diferente afinidad y transporte iónico, y es susceptible de optimización variando las concentraciones y el peso molecular del dopante.
En conjunto, los estudios electroquímicos indican que el PEDOT:PSS-co-MA es un polímero conductor con buenas prestaciones para la fabricación de dispositivos electrobiológicos y neuroprotésicos. Aunque su respuesta en corriente es algo inferior a la del PEDOTPSS en protocolos de electroestimulación con pulsos de corta duración, presenta mejor transporte de carga en protocolos de aplicación de voltaje a velocidades lentas y además permite una fácil funcionalización covalente a través de los grupos carboxilo sin perder su estabilidad.
Ejemplo 6: Funcionalización multimolecular del PEDOT:PSS-co-MA con moléculas de adhesión celular o factores de crecimiento y proteínas de la matriz extracelular
Para la funcionalización múltiple del polímero conductor se enlazó de forma covalente la primera capa de moléculas en su superficie, con el fin de que no se desprendan cuando se utilice electroestimulación para controlar el comportamiento de las células neurales. La principal característica de esta primera capa molecular es que tiene mucha afinidad por otras familias de biomoléculas específicas, permitiendo así su unión y presentación como sustrato para la adhesión y crecimiento celular. Aquí se ejemplifican dos complejos moleculares para funcionalizar el PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 (Fig. 6): 1 ) anticuerpos para unir CAMs (N-Cadherina y L1 ) en sus formas recombinantes con el fragmento Fe de la IgG humana; o 2) complejos de polielectrolitos autoensamblados (PLL / heparina) a los que se adicionan factores de crecimiento (bFGF / PDGF-AA) y posteriormente proteínas del suero o de la matriz extracelular (ver ejemplo 14). Las CAMs humanas recombinantes quiméricas con el fragmento Fc-lgG se compraron a R&D Systems (1388-NC y 777-NC), la IgG específica contra el fragmento Fe de la IgG humana, que abreviamos A-HIgG, se obtuvo de Sigma-Aldrich (12136), el bFGF recombinante humano se compró a Invitrogen (PHG0024), y el PDGF-AA recombinante humano a Peprotech (100-13A).
Las CAMs pueden incorporarse a la superficie del polímero de forma directa mediante unión covalente, o bien se enlaza primero el A-HIgG covalentemente y luego se unen las CAMs por inmuno-afinidad. En el segundo caso, se dializa el anticuerpo usando membranas de éster de celulosa con punto de corte de 8 a 10 kDa (Flota-A-Lyzer G2, Spectrum Laboratories, Inc. USA), y posteriormente se disuelve a 100 pg/ml en tampón TEA 50 mM, pH 8,0, siendo el resto del procedimiento similar al descrito en el ejemplo 3. Aunque los efectos celulares de las CAMs se constataron independientemente de que su unión fuera directa o mediada por A-HIgG, la unión de las proteínas recombinantes mediante el anticuerpo permite orientarlas más apropiadamente y de forma homogénea en la superficie, por lo cual aquí solamente describimos los resultados obtenidos utilizando este procedimiento. Tras la unión del A- HlgG, se aplican sobre la superficie del PEDOT:PSS-co-MA las CAMs recombinantes (5, 10 ó 20 pg/ml en tampón fosfato pH 7,4) a 24 °C. Después de 1 h las superficies se lavan tres veces con tampón y se guardan en el mismo a 4 °C. La unión covalente de PLL al polímero se realiza tal como se ha descrito en los ejemplos 3 y 5. Una vez se ha enlazado la PLL, se aplica una solución de heparina (PM promedio 1 1750, Sigma-Aldrich) por 4 minutos, disuelta a 2,7 mg/ml en tampón fosfato pH 7,4, seguida de tres lavados en el mismo tampón. Posteriormente se pone en la superficie la solución que contiene bFGF y/o PDGF-AA (ambos a concentración de 1 pg/ml en tampón fosfato pH 7,4), durante 1 hora a 24 °C, tras la cual las superficies se lavan tres veces con PBS. A continuación se incuba el polímero por 48 a 72 h a 37 °C en una solución de PBS ó DMEM que contiene suero fetal bovino (SFB, 10 %), suero normal adulto (SNA, 10 %), fibronectina o vitronectina (20 - 40 Mg/ml). Esta solución se retira y el polímero se lava con PBS ó medio de cultivo justo antes de plaquear las células disociadas o el explante de tejido neural.
La funcionalizacion multimolecular del polímero se confirmó mediante reacción de las superficies con anticuerpos contra las biomoléculas y revelado con anticuerpos secundarios fluorescentes. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-N-Cadherina (Sigma C3865, dilución 1 :200) hecho en ratón, anti-L1 (Chemicon MAB5272, 1 :50) hecho en rata, anti-PDGF-AA humano (Peprotech 500-P46, 1 :500) hecho en conejo, anti-bFGF (Millipore 05-1 18, 1 : 1000) hecho en ratón, IgG de cabra con Alexa Fluor® 488 anti-lgG de rata (Molecular Probes A1 1006, 1 :500), IgG de cabra con Alexa Fluor® 594 anti-lgG de ratón (Molecular Probes A1 1005, 1 :500), IgG de cabra con Alexa Fluor® 488 anti-lgG de ratón (Molecular Probes A1 1001 , 1 :500), e IgG de cabra con Alexa Fluor® 594 anti-lgG de conejo (Molecular Probes A1 1012, 1 :500). Para la inmunotinción se incubaron las superficies por 1 h en una solución de tampón fosfato con 5 % de suero normal de cabra y 0,2 % de tritón, seguidas de incubación por 2 h en la solución de tampón con dos anticuerpos primarios (anti-L1/anti-N-Cadher¡na ó anti-bFGF/anti-PDGF-AA) y 0,2 % de tritón, y finalmente 1 h en la solución tampón con los dos anticuerpos secundarios correspondientes. Posteriormente las muestras se montaron en tampón fosfato con glicerol y se analizaron por microscopía confocal tal como se ha descrito en el ejemplo 3. Este procedimiento demostró inequívocamente el éxito en la funcionalizacion múltiple del PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 con CAMs o factores de crecimiento (Fig. 7), siendo siempre la fluorescencia en presencia de la molécula diana entre 5 y 10 veces superior al valor de fondo (ANOVA, p<0.001 ). Además, los resultados mostraron que a las concentraciones de CAMs (10 pg/ml) o factores de crecimiento (1 pg/ml) utilizados, el polímero al que se ha enlazado previamente A-HIgG ó PLL/Heparina es capaz de unir por lo menos dos ligandos cuando se aplican simultáneamente sobre la superficie. Resulta notorio que las cantidades de L1/N-Cadherina que se unen son aparentemente ¡guales a las conseguidas cuando se aplica solo un ligando, mientras que la combinación de bFGF / PDGF-AA incrementa su unión en comparación con cada factor aislado (ANOVA p<0.001 ). La demostración de la unión de proteínas de la matriz extracelular sobre las superficies funcionalizadas con PLL/Heparina/bFGF se describe en el ejemplo 14.
Ejemplo 7: Cultivo, mareaje fluorescente y estudio microscópico de las células neurales disociadas.
Los cultivos de células disociadas se realizaron sobre portaobjetos de vidrio con Ti/Au recubiertos de PEDOT:PSS-co-MA 1 : 1 , los cuales se utilizaron como base de cámaras de poliestireno (1 1 x 1 1 x 20 mm de ancho, alto y fondo, respectivamente), sellando los bordes con silicona de uso médico (MED-4210; NuSil, USA). A efectos comparativos se cultivaron células sobre superficies no electroconductoras de vidrio borosilicato hidrolítico grado 1 (Marienfeld GmbH & Co. KG Lauda-Kónigshofen, Germany) recubierto con PLL. Previamente al plaqueo de las células, el polímero funcionalizado se incubó por 48 h en DMEM (Sigma-Aldrich) con 10 % de suero fetal bovino (FBS, Life Technologies Corporation, USA), a 37 °C y en atmósfera húmeda con 5 % CO2, con el fin de acondicionarlas en el ambiente iónico y molecular de los tejidos biológicos. El medio con suero se retiró y la superficie se lavó repetidamente con Neurobasal™ (Life Technologies Corp.) justo antes de introducir las células. En resumen, las células se disociaron a partir de la corteza cerebral de embriones (E18) de rata Wistar utilizando tripsina, DNAsa (Sigma-Aldrich) y pipetas Pasteur pulidas con fuego, y se plaquearon sobre las superficies de polímero a dos densidades: 25000 células/cm2 para estudios generales de adherencia, supervivencia y crecimiento celular; ó 1000 células/cm2 para estudios específicos de crecimiento y diferenciación de las neuritas, dendritas y axones. Siempre se utilizó como medio de cultivo Neurobasal™ con suplemento de L- glutamina, B27, penicilina-estreptomicina (Life Technologies Corp.) y gentamicina (Normon, Madrid). Las células se mantuvieron a 37 °C en atmósfera húmeda con 5 % CO2. El medio de cultivo se reemplazó por completo a las 2 h de plaqueadas las células, y la mitad después de 4 días en los casos correspondientes. Los cultivos se fijaron a los dos o cinco días agregando paraformaldehído al medio de cultivo hasta una concentración del 2 % y dejándolo actuar por 12 min. Las cuantificaciones celulares que se presentan se confirmaron en por lo menos tres cultivos diferentes, utilizando un mínimo de cuatro muestras de polímero en cada uno. En los datos de neuronas individuales se promedió un mínimo de 100 células en cada situación experimental. Para la ¡nmunocitoquímica, las células fijadas se incubaron por 1 h en tampón fosfato pH 7,4 con 5 % de suero normal de cabra y 0,2 % de tritón, y posteriormente se lavaron y se incubaron toda la noche a 4 °C en tampón con 0,2 % de tritón y combinaciones de dos de los siguientes anticuerpos: anti-Tau (Sigma-Aldrich T-6402, 1 :750) hecho en conejo, anti-MAP2 (Sigma-Aldrich M1406, 1 :500) hecho en ratón, anti-Vimentina (Neomarkers, MS-129, clone V9, 1 : 1000) hecho en ratón, anti-Nestina (BD Biosciences 556309, 1 : 1 ,500) hecho en ratón, anti-GFAP (Dako Z-0334, 1 :500) hecho en conejo, anti-NF (Affinity NA-1297, 1 :750) hecho en conejo, o anti-NG2 (Chemicon AB5320, 1 :500) hecho en conejo. Al día siguiente se lavaron y se incubaron 1 h a 24 °C en solución tampón con los anticuerpos secundarios: IgG de cabra con Alexa Fluor® 488 anti-lgG de conejo (Molecular Probes A1 1008, 1 :750), e IgG de cabra con Alexa Fluor® 594 anti-lgG de ratón (Molecular Probes A1 1005, 1 :750). Finalmente se tiñeron los núcleos aplicando Hoescht 33342 (Molecular Probes, 2 pg/ml en tampón) por 50 min. Para las cuantificaciones citológicas se tomaron imágenes con alta resolución (2776 x 2074 pixeles) utilizando un sistema de microscopía digital (Olympus DP50) y se combinaron las señales de los distintos fluorocromos. Se fotografiaron sistemáticamente 16 campos radiales en cada muestra del polímero y los recuentos celulares se interpolaron al área total de superficie macroscópica. Para estudiar la localización celular de los fluorocromos se analizaron las superficies mediante microscopía confocal siguiendo los protocolos descritos en el ejemplo 3 y utilizando un diodo láser de 405 nm para excitación del Hoescht conjuntamente con los láseres para excitación a 488 y 594 nm. Las mediciones de las prolongaciones neuronales se realizaron con el software ImageJ (1 .39u, NHI, USA) sobre las imágenes de fluorescencia de los cultivos crecidos a baja densidad y fijados a los 2 días in vitro (DIV), según se detalla en el ejemplo 9.
Ejemplo 8. Células neurales disociadas: adhesión, crecimiento y supervivencia sobre el PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL
Se realizaron cultivos a 25000 células/cm2 para analizar de forma general el comportamiento celular sobre los materiales electroconductores y el posible éxito de los métodos de funcionalización empleados. El PEDOT:PSS-co-MA sin funcionalizar es muy inhibitorio para el crecimiento de neuronal; algunas células se adhieren pero a las 24 h la mayoría se han retraído y muerto o se han aglomerado (Fig. 8A), y un día más tarde ya no hay células vivas en la superficie. La funcionalización con PLL tiene un efecto positivo muy evidente en la adhesión, crecimiento y supervivencia celular sobre el PEDOT:PSS-co-MA. En este caso, a las 24 h muchas células han comenzado a extender neuritas (Fig. 8B) que continúan su crecimiento y a los 5 DIV se han diferenciado en dendritas y axones, identificares por la tinción inmunocitoquímica para las proteínas MAP2 y Tau, respectivamente (Fig. 8C). La PLL es muy efectiva para promover el crecimiento celular sobre el polímero, independientemente de que se una a la superficie de forma covalente (Fig. 8C) o por electroadsorción (Fig. 8D). Así mismo, la supervivencia neuronal a los 5 DIV fue similar en las dos superficies (27479 ± 2004 células/cm2, vs. 25195 ± 5683 células/cm2, respectivamente). Los experimentos control arrojan datos muy claros sobre la eficacia de la electroadsorción galvanostática de PLL, ya que sobre las superficies de polímero que se ponen en contacto con la solución de PLL por el mismo tiempo pero sin aplicar corriente eléctrica no se encuentran células vivas (0) a los 5 DIV. Estos resultados ponen de manifiesto la versatilidad del PEDOT:PSS-co-MA para ser biofuncionalizado por reacciones químicas o métodos bioelectroquímicos con el fin de controlar el crecimiento neural. Ejemplo 9: Efectos sinérgicos de la funcionalización del PEDOT:PSS-co- MA con N-Cadherina y L1 sobre el crecimiento axonal y dendrítico.
También utilizamos cultivos plaqueados a 25000 células/cm2 para conocer los efectos generales de la funcionalización del polímero con CAMs. Comenzamos evaluando la unión covalente de A-HIgG con adición de N-Cadherina a 5, 10 y 20 pg/ml, obteniendo excelente adherencia y crecimiento neural en los tres casos. En las Figs. 9A y 9B se muestran imágenes de contraste de fase de las neuronas a las 24 h de cultivo sobre el polímero con N-Cadherina utilizada a 5 y 20 pg/ml, respectivamente. Al compararse visualmente con las células cultivadas sobre el polímero con PLL (Fig. 8B), resulta evidente que desde muy temprano hay un mayor crecimiento de las prolongaciones neuronales al utilizarse N-Cadherina (Fig. 9A-B), pero la densidad celular impide la medición y comparación de las neuritas individuales. Por consiguiente, se decidió emplear cultivos de baja densidad (1000 células/cm2) para medir y comparar el efecto de las diferentes moléculas sobre el crecimiento neuronal.
En los cultivos de baja densidad fijados a 2 DIV por lo menos el 98 % de las células presentaba mareaje intenso para MAP2 en el soma y las neuritas o dendritas, siendo por tanto definidas como neuronas. En esta etapa prácticamente la totalidad de las neuronas había desarrollado prolongaciones, pero alrededor del 30 % de ellas aún no tenía un axón claramente identificable y el mareaje para Tau ocurría en el soma y en todas las extensiones celulares dificultando su diferenciación. Por consiguiente, las prolongaciones neuronales se distinguieron por criterios morfológicos y la etapa de desarrollo de la célula se clasificó de 1 a 5 siguiendo la escala propuesta por Dotti et al. (1988, J. Neurosci.; 8: 1454-1468); en la cual 1 equivale a la formación de lamelipodios, 2 al desarrollo de neuritas, 3 a la formación y extensión del axón, 4 al crecimiento de las dendritas, y 5 a la ramificación de las prolongaciones y maduración de la neurona. En las etapas 1 y 2 se definió como neurita toda prolongación celular >10 pm. En las etapas más avanzadas, se denominó axón a la neurita >50 pm y que medía por lo menos el doble que las otras neuritas, y las últimas se consideraban dendritas si eran >10 pm. Para el momento de su fijación, más del 97 % de las células se encontraba en etapas 2 y 3 independientemente del sustrato de cultivo. El pequeño porcentaje restante correspondía a células en etapa 1 , y no se clasificó ninguna en etapa 4. Para comparar los efectos de la funcionalización del polímero sobre el crecimiento neuronal se cuantificaron los siguientes parámetros:
Células en etapa 2:
1 . Número de neuritas.
2. Longitud promedio de las neuritas.
Células en etapa 3:
1 . Número de dendritas.
2. Longitud de las dendritas.
3. Longitud del axón primario.
4. Número de colaterales axonales secundarias y terciarias.
5. Longitud del árbol axonal total. En la Fig. 9C-F se muestran ejemplos representativos del crecimiento de las neuronas cultivadas a baja densidad por 48 h sobre PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con A-HIgG + N-Cadherina (C), L1 (D), o ambas CAMs (E), siempre a 10 pg/ml. Para comparación, en la Fig. 9F se presenta un ejemplo del crecimiento sobre el polímero funcionalizado con PLL enlazada covalentemente. Las células se han procesado con inmunocitoquímica para Tau y MAP2, y los núcleos se han marcado con Hoescht. En estas imágenes resulta evidente que el polímero funcionalizado con CAMs incrementa el crecimiento neuronal con respecto al polímero funcionalizado con PLL. También puede observarse que el efecto de las dos CAMs es diferente, de manera que la N-Cadherina promueve el crecimiento tanto de dendritas como de axones, mientras que la L1 aumenta de forma notoria el crecimiento axonal pero inhibe el desarrollo dendrítico. Las mediciones del crecimiento se muestran pormenorizadamente en la Fig. 10. Comparando cada una de los siete parámetros de crecimiento por separado (ANOVA de un factor), siempre se encontraron diferencias entre la funcionalización del polímero con PLL ó con CAMs (p<0.0001 ). La funcionalización con N-Cadherina aumenta de forma significativa el crecimiento neural en todos los parámetros evaluados (Fig. 10A- G), es decir, su efecto tiene lugar independientemente del estadio celular y aumenta tanto la longitud de las prolongaciones como su número. Sin embargo, el efecto de mayor magnitud relativa ocurre en el número de neuritas y dendritas, que se duplica respecto a la polilisina (postest de Holm Sidak, HS, p<0.001 ) y se triplica respecto a la L1 (postest de HS, p<0.0001 ). Así mismo, las dendritas casi doblan su longitud sobre N-Cadherina (postest de HS, p<0.001 ), mientras que parámetros como la longitud el axón primario o del árbol axonal total se incrementan en 29 % (postest de HS, p<0.05) y 40 % (postest de HS, p<0.001 ), respectivamente. Por su parte, la L1 disminuye aproximadamente a la mitad el número de neuritas y dendritas respecto a la PLL (postest de HS, p<0.001 ), pero triplica el número de colaterales axonales y duplica la longitud del árbol axonal total (postest de HS, p<0.001 ), aunque la longitud del axón primario solo se incrementa en 50 % (postest de HS, p<0.001 ). En las superficies con funcionalización doble, la presencia de L1 no disminuye el aumento de neuritas y dendritas ni el incremento en la longitud de las dendritas que produce la N-Cadherina (Fig. 10 A, C, D); mientras que produce un aumento adicional del 27 % en la longitud del axón primario con respecto a la acción de la N-Cadherina sola (postest de HS, p<0.01 ). Por el contrario, resulta interesante que la N-Cadherina sí neutraliza parcialmente la acción de la L1 sobre la longitud de las neuritas (postest de HS, p<0.0001 ) y el número de colaterales axonales (postest de HS, p<0.0001 ), aunque el árbol axonal total no se afecta significativamente. En resumen, la combinación de las dos moléculas sobre el polímero consigue un efecto sinérgico sobre el crecimiento de las neuronas, que desarrollan dendritas y axones más numerosos y más largos. Para confirmar que los efectos de la acción conjunta de las CAMs son específicos y no se deben simplemente al aumento de moléculas sobre la superficie, comparamos el crecimiento neuronal sobre el polímero funcionalizado con L1 ó N-Cadherina aplicadas a 10 pg/ml (igual que en el experimento anterior), frente al que ocurre en el polímero funcionalizado simultáneamente con las dos CAMs pero aplicadas a 5 pg/ml. A pesar de disminuir la concentración de CAMs a la mitad obtuvimos la misma sinergia sobre el crecimiento neural, indicando una acción combinada de los mecanismos de señalización específicos de cada molécula. También es importante resaltar que el crecimiento neural sobre los sustratos de PEDOT:PSS-co-MA funcionalizados con PLL es similar al que ocurre sobre vidrio recubierto con PLL en aspectos como el número y longitud de neuritas y dendritas, pero es un 50 % superior en cuanto al crecimiento del axón primario (Fig. 10E, HS-postest p<0.01 ) y del árbol axonal total (Fig. 10G, p<0.001 ).
Ejemplo 10: Estudio de la migración de las células neurales sobre PEDOT:PSS-co-MA utilizando videomicroscopía
Registramos la evolución de los cultivos celulares de baja densidad mediante un sistema de videomicroscopía time-lapse (Olympus, Japan) con el fin de evaluar la influencia de la funcionalizacion del PEDOT:PSS-co-MA sobre la migración celular. Utilizamos sustratos de vidrio con Ti/Au recubiertos de polímero que fueron suficientemente transparentes para permitir la visualización de las células con luz transmitida. El seguimiento comenzó a las 2 h de plaquear las células y se tomaron las fotografías cada 20 min. por un total de 48 h. Se empleó un objetivo 10x para contraste de fase, y se adquirieron 7 planos separados 1 ,5 pm arriba y abajo del plano focal. La posición de las células se rastreó con el software ImageJ. Las cuantificaciones se realizaron sobre un total de 70 a 100 células de cada situación experimental, definiendo migración como el desplazamiento del cuerpo celular más de 30 pm. Para la comparación estadística del porcentaje de células migratorias se utilizó la prueba Chi cuadrado (χ2), mientras que la distancia recorrida y la velocidad de migración se compararon mediante ANOVA.
Como puede observarse en la Fig. 1 1 , hay una diferencia ostensible en la migración celular sobre el PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con las distintas moléculas. Las neuronas no migran en absoluto sobre el polímero que tiene PLL, pero el 77 % de ellas lo hace si se coloca N-Cadherina y el 36 % si se pone L1 (χ2, p<0.001 ; Fig. 1 1 A), siendo también significativa la diferencia entre N-Cadherina y L1 (χ2, p<0.001 ). Además de que migran menos células sobre L1 que sobre N-Cadherina, la distancia recorrida por las células sobre L1 alcanza tan solo el 30 % del valor obtenido en la N-Cadherina (ANOVA, p<0.0001 ). En comparación con la L1 sola, la funcionalización de la superficie con las dos CAMs eleva tanto el porcentaje de migración (χ2, p<0.001 ) como la distancia recorrida (ANOVA, p<0.001 ), aunque no llega al 100 % de los valores producidos por la N-Cadherina sola (diferencia con p<0.05 en ambos casos). Es importante resaltar que la migración celular sobre el PEDOT:PSS-co-MA con N-Cadherina es un fenómeno potente, mostrando velocidad máxima de 1 10 ± 1 1 pm / h, mientras que en el polímero con L1 alcanza 45 ± 7 pm / h (p<0.0001 ).
Ejemplo 11 : Cámaras de cultivo celular con microfibras electroconductoras
Los cultivos organotípicos se realizaron en cámaras de cultivo diseñadas para poder evaluar el comportamiento de las células vivas sobre las microfibras electroconductoras. En la presente invención incluimos distintos modelos de cámaras de cultivo que comparten las siguientes características: 1 ) pueden estar compuestas por una o varias celdas que contienen microfibras; 2) las microfibras pueden tener igual o diferente funcionalización; 3) las microfibras usualmente se colocan alineadas al eje mayor de la celda, separadas entre sí por distancias que pueden oscilar desde mieras a milímetros en función de las necesidades del cultivo; 4) las microfibras están en el fondo ó levantadas por una distancia que puede oscilar desde unas pocas mieras hasta 1 mm o más; 5) los extremos de las microfibras terminan en contactos eléctricos que están ubicados fuera del pozo de cultivo celular y a los cuales puede conectarse una fuente de corriente eléctrica o voltaje; 6) el material del fondo es delgado, transparente y de características ópticas apropiadas para distintos tipos de microscopía; 7) las celdas se adhieren al fondo de la cámara mediante cualquier material que selle apropiadamente, que sea un buen aislante eléctrico y que no tenga componentes que se oxiden o reduzcan con facilidad; 8) las paredes de las celdas pueden ser de cualquier material inerte apropiado para cultivos celulares, por ejemplo poliestireno o polipropileno; y 9) las celdas de cada cámara pueden estar aisladas en su totalidad, o comunicarse a través de microfibras y un espacio alrededor de ellas que permita el paso de elementos celulares de un lado al otro.
En la Fig. 12 se ejemplifican cuatro tipos de cámaras de cultivo celular con las características comunes mencionadas anteriormente y variaciones en la geometría, disposición y comunicación entre las celdas para satisfacer distintas necesidades. El diseño 12A es el más simple, constando de fibras completamente paralelas en celdas que no se comunican. En el diseño 12B las fibras también están paralelas, pero un tabique divide la celda en dos cavidades simétricas comunicadas por las microfibras y un espacio alrededor. La función del tabique es crear dos compartimentos que contienen medios de cultivo diferentes, o bien el mismo medio pero con distintas moléculas adicionadas; y las microfibras dan soporte para el crecimiento celular de manera que los axones o las células migratorias pasan de un compartimiento al otro a través del espacio que los comunica. El espacio también puede servir para crear gradientes de difusión de moléculas de un lado al otro. En el diseño 12B consideramos el modelo I, en el cual el espacio que comunica las hem ¡celdas es una franja larga, con altura equivalente a una microfibra; y el modelo II en el que existe un espacio circular de diámetro variable alrededor de la microfibra, que permite aprovechar mejor su superficie a la vez que restringir todo lo posible la comunicación entre las hemiceldas. Finalmente, el diseño 12C tiene simetría radial, y consiste en un compartimiento central que se comunica con varios periféricos por medio de las microfibras y un pequeño espacio alrededor. El tejido bajo estudio se coloca en el compartimiento central y los elementos celulares que se originan en él pueden escoger para crecer las diferentes microfibras. Una vez pasan al compartimiento periférico, pueden tratarse de forma selectiva con distintas moléculas. Alternativamente, pueden colocarse distintos tejidos o células en las celdas periféricas y comparar su respuesta frente a un factor común aplicado en el compartimiento central. Para los cultivos organotípicos del sistema nervioso que se describen en los ejemplos siguientes utilizamos cámaras de cultivo con el diseño que se presenta en la Fig. 12A. En este caso, las microfibras se colocan paralelas entre sí a una distancia aproximada de 700 pm del fondo de la celda. El fondo es de vidrio borosilicato de 100 pm de grosor y permite la visualización directa de las fibras y las células mediante diferentes técnicas de microscopía, y las celdas son de poliestireno (1 1 x 1 1 x 20 mm de ancho, alto y fondo, respectivamente), adheridas al vidrio mediante silicona de uso médico (MED- 4210; NuSil, USA). Las microfibras reposan sobre un soporte de 700 pm de alto que tiene contactos de grafito, los cuales están completamente aislados del interior de la celda. El PEDOT:PSS-co-MA se electrosintetiza sobre las microfibras una vez fabricadas las cámaras de cultivo celular, aplicando 96 mC/cm2 y siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1 . La caracterización morfológica y electroquímica de las microfibras con polímero se presenta en los ejemplos 2 y 4. La funcionalización y acondicionamiento de las microfibras para el cultivo organotípico se realiza según los protocolos desarrollados en los ejemplos 3, 5 y 6.
Ejemplo 12. Cultivos organotípicos de sistema nervioso central y periférico: preparación, inmunohistoquímica y técnicas de microscopía para su estudio
Para los cultivos organotípicos utilizamos explantes de la corteza cerebral de rata o ganglios de la raíz dorsal, ambos obtenidos a partir de embriones (E18) de rata Wistar, y cultivados en cámaras con microfibras (Fig. 12A) o cubreobjetos de vidrio borosilicato. Los tejidos siempre se extraen de animales en anestesia profunda tras recibir una dosis eutanásica de pentobarbital, siguiendo los protocolos aprobados por el comité de ética de bienestar animal. Después de retirar las meninges, la corteza cerebral se separa del resto del cerebro y se secciona en fragmentos (explantes) de 1 ,5 mm de largo por 0,5 mm de ancho, en solución de Hanks con calcio y magnesio (Sigma-Aldrich). A continuación los explantes se colocan sobre las microfibras con 100 μΙ de medio de cultivo (NeurobasalTM con suplementos, ejemplo 7) y se incuban a 37 °C en atmósfera húmeda con 5 % de CO2. Transcurridas 4 h, cuando se han adherido suficientemente a las microfibras, se les adiciona medio de cultivo hasta completar 1 mi por pozo y se incuban de nuevo por 5 ó 10 días, en el segundo caso reemplazándose la mitad del medio de cultivo cada dos días a partir del quinto. Los ganglios de la raíz dorsal se extraen y se colocan sobre las microfibras sin seccionarlos, y por lo demás el procedimiento es igual al utilizado para cultivar la corteza cerebral. Los explantes se fijan a los 5 ó 10 días adicionando paraformaldehído al medio de cultivo hasta una concentración del 2 % y dejándolos en esta solución por 12 min., y se procesan para ¡nmunohistoquímica y mareaje nuclear con Hoescht utilizando los mismos protocolos y anticuerpos primarios (MAP2, Tau, NF, GFAP, NG2, Vimentina y Nestina) y secundarios que se detallan en el ejemplo 7, y usando además los siguientes: anti-PDGFRa (Thermo Scientific RB1691 , 1 : 100) hecho en conejo, anti-N-Cadherina (Sigma-Aldrich C3865, 1 :400) hecho en ratón, anti-NG2 (R&D Systems FAB2585F, 1 :25) hecho en ratón, anti-NF200 (Sigma-Aldrich N0142, 1 :500) hecho en ratón, anti-receptor p75 del NGF (Millipore AB1554, 1 :500) hecho en conejo, anti-PDGFRa (Abcam AB32570, 1 : 100) hecho en conejo, y anti-p-tubulina isoforma III (Sigma-Aldrich T8660, 1 :400) hecho en ratón. En todos los procedimientos se incluyen controles del procedimiento sin los anticuerpos primarios.
Tras el procesamiento ¡nmunohistoquímico, los explantes fueron escaneados en su posición original sobre las microfibras mediante un microscopio confocal con escáner resonante (SP5, Leica Microsystems CMS GMBH, Germany), equipado con láseres de Argón y HeNe, y también con un diodo láser de 405 nm para excitación del Hoescht. Por lo general se usó el objetivo de 20x y secciones a diferentes planos focales cada 1 ,5 pm, aplicando zoom de 3,5 previamente a la adquisición de la imagen cuando resultaba necesario para una mejor visualización. El software Leica LAS AF Lite permitió adquirir automáticamente la serie de imágenes que abarcaban todo el explante y unirlas en un mosaico para proceder a cuantificar el comportamiento celular. Se analizaron tres parámetros: 1 ) extensión del crecimiento axonal sobre las microfibras, con base en la presencia de prolongaciones neuronales positivas para Tau y Neurofilamento; 2) distancia de migración de precursores gliales sobre las microfibras, considerada como el punto más alejado del explante en el que se observaban núcleos celulares marcados con Hoescht y rodeados por citoplasma positivo para Vimentina o Nestina, o por membrana citoplasmática fluorescente para NG2 o PDGFRa (explantes de corteza cerebral) o para el receptor p75 del NGF (ganglios de la raíz dorsal); y 3) Número de precursores gliales presentes en la microfibra, identificados igual que en el punto anterior. Una vez obtenidas las imágenes para las cuantificaciones celulares, los explantes y las microfibras se retiraron de las cámaras de cultivo y se montaron en una mezcla de tampón fosfato y glicerol para proceder a su observación en el microscopio confocal con el objetivo de 63x, aplicando zoom de 2,8 y adquiriendo secciones cada 0,4 pm para diferenciar apropiadamente las estructuras y estudiar con precisión la localización de los mareajes celulares. Todos los datos que se presentan se confirmaron en por lo menos 3 cultivos diferentes, cuantificando las respuestas celulares en por lo menos 15 microfibras de cada situación experimental por cultivo. Además del microscopio confocal, se utilizó el microscopio electrónico de barrido para estudiar el comportamiento y las interacciones celulares sobre las microfibras. Para esto, se fijaron los cultivos con glutaraldehído al 3 % en tampón fosfato (30 min.), se lavaron tres veces con tampón y se fijaron de nuevo en tetróxido de osmio al 1 % (una hora) y ácido tánico al 1 % (30 min.), y luego se lavaron con agua destilada. Posteriormente se deshidrataron usando concentraciones crecientes de etanol (10 min. cada una), etanol con hexametildisilazano (1 : 1 , 10 min.), y hexametildisilazano 100 % (2 min.). Finalmente se secaron al aire, se recubrieron con Au mediante sputtering a 25 mA por 2 min., y se visualizaron a 2 - 3 kV utilizando el detector TLD a una distancia de trabajo de 2 mm. Ejemplo 13. Crecimiento axonal y migración celular sobre microfibras que tienen PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con A-HIgG / CAMs (L1 ó N- Cadherina)
La funcionalización de las microfibras con L1 ó N-Cadherina indujo un profuso crecimiento axonal sobre ellas (Fig. 13), siendo 4 veces superior al que se obtuvo utilizando PLL (ANOVA de un factor, p<0.001 ). El promedio de crecimiento axonal sobre las microfibras funcionalizadas con PLL fue 710 + 82 pm a los 5 DIV, mientras que alcanzó 2777 ± 163 y 3037 ± 317 m sobre las microfibras funcionalizadas con L1 ó N-Cadherina, respectivamente. Estos datos confirman los resultados obtenidos en los cultivos de células disociadas sobre las superficies poliméricas (Ejemplo 9). En los cultivos organotípicos no se detectaron diferencias significativas en el crecimiento axonal en relación con la funcionalización con L1 ó N-Cadherina, ni a los 5 DIV ni a los 10 DIV; pero en ambos casos se constató un incremento del 50 % en la longitud axonal entre los 5 y 10 DIV (ANOVA de dos factores p<0.001 , HS-postest p<0.05; Fig. 13A). A los 5 DIV también se observaron progenitores gliales (células Vimentina+) en las microfibras, aunque la distancia que recorrieron (Fig. 13B) fue tan solo alrededor del 25 % de la distancia de crecimiento axonal y el número de células fue bajo (Fig. 13C) y. Sin embargo, en este aspecto se observaron diferencias según la CAM puesta en la superficie de la microfibra (ANOVA de dos factores p<0.001 ), de manera que el número de células y la distancia a la que se encontraban disminuyó considerablemente entre los 5 y los 10 DIV cuando se usó L1 (HS-postest p<0.01 ), mientras que en las microfibras con N-Cadherina la disminución del número de células no fue tan marcada entre los 5 y 10 DIV y además la distancia de migración celular se incrementó un 50 % (HS-postest p<0.05). Los estudios mediante microscopía confocal permitieron obtener información adicional respecto al crecimiento neural sobre las microfibras. En la zona proximal (más cercana al explante) se observaba un gran número de axones formando gruesos fascículos, en los que se entremezclan progenitores gliales. En la parte distal (más alejada del explante), solo se encontraban axones individuales que terminan en conos de crecimiento pequeños y con pocas ramificaciones, indicativos de crecimiento axonal rápido. La apariencia de los conos de crecimiento axonal fue bastante similar en las microfibras funcionalizadas con L1 ó N-Cadherina. Por otra parte, a los 10 DIV también se observan algunas neuronas (células MAP2+) que habían migrado en la parte proximal de la microfibra, así como dendritas (prolongaciones MAP2+) en crecimiento (Fig. 14). En concordancia con los hallazgos descritos anteriormente, en las microfibras con L1 las neuronas y las dendritas se encontraban entremezcladas con los axones, indicando que no habían migrado sobre la propia microfibra, mientras que en las microfibras con N-Cadherina se encontraban en contacto con la microfibra (Fig. 14). En este último caso, las neuronas eran fusiformes y las dendritas formaban fascículos.
Ejemplo 14. Estimulación del crecimiento axonal por precursores gliales que migran sobre las superficies y microfibras funcionalizadas con PLL / heparina / bFGF / proteínas de la matriz extracelular
Tras haber constatado que las microfibras funcionalizadas con L1 y/ó N- Cadherina promueven un extenso crecimiento axonal de forma directa sobre el PEDOT:PSS-co-MA pero muy escasa migración de precursores gliales, nos preguntamos si sería posible inducir el crecimiento axonal de forma indirecta a través de la migración de precursores gliales sobre sustratos que en sí mismos no son permisivos para la extensión de los axones. En investigaciones anteriores {Collazos-Castro et al., 2010, Biomaterials 31: 9244-9255), observamos que el PEDOTPSS funcionalizado con PLL/Heparina/bFGF inhibe el crecimiento de las neuronas disociadas de la corteza cerebral pero induce una extensa proliferación y migración de precursores gliales que expresan vimentina, nestina, y/o NG2. Por consiguiente, inicialmente investigamos si este fenómeno ocurre sobre las superficies planas recubiertas con PEDOT:PSS-co- MA y PLL/Heparina/bFGF, constatando que estas composiciones también inhiben el crecimiento axonal de las neuronas disociadas y estimulan la proliferación y migración de progenitores gliales. Adicionalmente, observamos que las neuronas, aunque inicialmente retraen sus neuritas, posteriormente reinician el crecimiento sobre los progenitores gliales que proliferan y migran. A continuación evaluamos estas respuestas celulares sobre las microfibras de carbono recubiertas de PEDOT:PSS-co-MA, en donde el crecimiento neural dirigido facilita la cuantificación de los procesos de interés. Estos estudios se llevaron a cabo con explantes de la corteza cerebral usando la metodología descrita en el ejemplo 12. En resumen, los resultados demuestran que las microfibras funcionalizadas son un sistema potente para inducir la proliferación y migración dirigida de los progenitores gliales, y a través de ellos estimular el crecimiento axonal. Sin embargo, el potencial pleno del sistema solo se consigue cuando la funcionalización de la superficie con PLL/Heparina/bFGF se complementa con al menos una molécula de la matriz extracelular. Esta última puede unirse a las superficies a partir de soluciones de la molécula purificada o a partir del suero de sujetos en etapa fetal o adulta.
En primer lugar, la Fig. 15 ¡lustra el fenómeno anteriormente mencionado y su relevancia en términos cuantitativos. Cuando las microfibras tienen solo PLL en la superficie (sin ningún otro tipo de acondicionamiento), existe algo de crecimiento axonal (~700 pm en 5 días), pero este ocurre directamente sobre la microfibra y no se debe a la migración de precursores, que solo se desplazan alrededor de 150 pm y además en números muy bajos (Fig. 15 A-B). Cuando se pone PLL/Heparina/bFGF sobre la microfibra se incrementa significativamente la migración de precursores gliales tanto en distancia (~500 pm) como en número de células (Fig. 15 A-B), pero la distancia de crecimiento axonal se limita a la distancia recorrida por las células migratorias indicando que tal complejo molecular no estimula directamente el crecimiento axonal. De hecho, en este caso los axones se observan siempre en contacto con las células migratorias, asunto que se tratará más adelante. Un resultado sorprendente fue que el número y la distancia de migración de los precursores gliales, así como el crecimiento axonal, se multiplicaron más de tres veces cuando las microfibras funcionalizadas con PLL/Heparina/bFGF se incubaron por 48 h en medio de cultivo con 10 % de suero fetal bovino (FBS, Fig. 15 A-B). El medio se retiró y las microfibras se lavaron varias veces antes de introducir los explantes, de manera que los efectos se debieron a que ciertas moléculas presentes en el FBS se unen a la superficie de las microfibras. Cuando en la funcionalización de la superficie se omitió el bFGF pero se puso FBS hubo un incremento en la proliferación y migración de precursores gliales en comparación con la PLL sola, aunque el crecimiento axonal no fue superior al obtenido sobre PLL. Es decir, las moléculas del suero unidas a la superficie por sí mismas aumentan la proliferación y migración de los precursores gliales, y se obtiene un efecto sinérgico muy potente cuando la superficie tiene bFGF y moléculas del suero.
En la Fig. 16 se proporcionan detalles de las interacciones entre las células y los axones sobre las microfibras. En la punta de crecimiento siempre hay al menos una célula fusiforme que lidera el proceso de migración y a la cual los axones acompañan en íntimo contacto (Fig. 16A), frecuentemente trepándose sobre ella (Fig. 16B) o siguiéndola (Fig. 16C). El estudio mediante microscopía electrónica de barrido muestra que la célula de la punta tiene morfología predominantemente bipolar (Fig. 16D), aunque en muchas ocasiones también emiten pequeñas prolongaciones citoplasmáticas laterales. Por su parte, las células que se encuentran atrás del frente de crecimiento se entremezclan con los axones y las prolongaciones de otras células y también presentan morfología bipolar (Fig. 16E) o bien desarrollan múltiples prolongaciones (Fig. 16F). Al visualizar las células con mayor resolución puede observarse que sus prolongaciones citoplasmáticas abrazan o envuelven parcialmente a los axones y a los conos de crecimiento axonal (Fig. 17A). De esta manera, los axones y sus terminaciones tienen zonas de contacto con la superficie polimérica y también con la membrana de las células migratorias. Estas observaciones sobre la morfología y la capacidad de envolver axones apuntan a que las células que migran e inducen el crecimiento axonal sobre las microfibras son progenitores gliales similares a las células NG2 del sistema nervioso central (Nishiyama et al., Nature Rev Neurosci 2009; 10:9-21), también conocidos como polidendrocitos, precursores de oligodendrocitos o células 02A. En soporte de esta ¡dea observamos que, tal como se ha descrito para las células NG2 del SNC, las células que migran sobre las microfibras a partir de los explantes de corteza cerebral expresan NG2 y PDGFRa en la membrana citoplasmática (Fig. 17 B-C). Además, las células migratorias sobre las microfibras también expresan Nestina y Vimentina, que son marcadores de precursores de oligodendrocitos proliferantes (Almazán et al., Microsc Res Tech 2001; 52:753-765). Para confirmar que el crecimiento axonal sobre las microfibras es inducido por los precursores gliales, aplicamos AraC (3 μΜ) a los explantes con el fin de inhibir la división celular. Los resultados obtenidos con el AraC fueron muy claros, ya que en los explantes que crecían sobre PEDOT:PSS-co-MA funcionalizado con PLL / Heparina / bFGF / FBS esencialmente no habían células sobre las microfibras y concomitantemente se eliminó el crecimiento axonal. Como situación control utilizamos microfibras funcionalizadas con PLL solamente ó con A-HIgG / N-Cadherina ó L1 , en donde los axones crecen directamente sobre la superficie electroconductora. En este caso, el tratamiento con AraC 3 μΜ no disminuyó significativamente el crecimiento axonal. También realizamos el experimento contrario, es decir, eliminamos los axones para evaluar si las células continuaban migrando en su ausencia o por el contrario desaparecían. Para tal efecto cortamos la microfibra en la porción proximal del explante, lo que axotomizó todas las neuronas que extendían su axón sobre la microfibra y eliminó por completo las prolongaciones axonales presentes en la parte distal de la misma, dejando allí las células que ya habían migrado. A pesar de que ya no tenían contacto con los axones, las células continuaron migrando por todo el periodo de tiempo evaluado (10 días). En síntesis, estos experimentos demostraron de forma inequívoca que el crecimiento axonal sobre las microfibras funcionalizadas con PLL / Heparina / bFGF / FBS es dependiente de la proliferación y migración de precursores gliales y no al contrario.
A continuación investigamos algunas de las moléculas presentes en el suero que pueden unirse al polímero conductor funcionalizado con PLL / Heparina / bFGF e inducir la proliferación y migración de las células NG2. Mediante estos experimentos esperábamos encontrar formas de completar la funcionalización de la superficie sin tener que utilizar suero, ya que este es un producto de origen animal y además tiene composición variable, lo que lo hace no deseable para la elaboración de dispositivos implantables de uso humano. En primer lugar, evaluamos si la capacidad para promover el crecimiento neural en las microfibras es exclusiva del suero bovino fetal, o también se consigue utilizando suero de animales adultos. Los procedimientos fueron ¡guales a los descritos anteriormente excepto que se reemplazó el FBS por suero de rata normal (NRS, Sigma-Aldrich) en la última etapa de funcionalización de las microfibras. Sorprendentemente, el tratamiento de las microfibras con NRS duplicó la migración celular, el crecimiento axonal y el número de precursores obtenidos con el FBS (Fig. 18 A, B). Es bien sabido que el suero contiene cantidades grandes de dos moléculas de la matriz extracelular, como son la fibronectina (FN) y la vitronectina (VN). Sin embargo, sus concentraciones son muy diferentes en el FBS en comparación con el NRS. La actividad promotora de la adherencia celular a superficies tratadas con FBS se debe esencialmente a la VN, que en el FBS tiene concentraciones de 200 a 400 pg/ml (Hayman et al., Exp Cell Res 1985; 160: 245-258), mientras que la concentración de FN es alrededor de 10 veces menor (entre 20 y 40 pg/ml; Hayman et al., J Cell Biol. 1979; 83: 255-259). Por su parte, el NRS tiene aproximadamente 400 pg/ml de FN {Sochorová et al., Physiol Bohemoslov 1983; 32: 481-485) y cantidades similares de VN. Por consiguiente, en los protocolos de funcionalización con FBS al 10 % estamos incubando las superficies con VN a concentración > 20 pg/ml y FN a solo 2 a 4 pg/ml; mientras que con el NRS al 10 % tanto la VN como la FN están a concentraciones > 20 pg/ml, y la unión de las dos moléculas a la microfibra funcionalizada con PLL / Heparina / bFGF explicaría que se duplique la proliferación y migración celular y el crecimiento axonal al funcionalizar las superficies con NRS. Con este raciocinio, evaluamos el efecto de funcionalizar las microfibras (PEDOT:PSS-co-MA con PLL/Heparina/bFGF) usando como etapa final VN ó FN purificadas (20 pg/ml) en vez de suero. Ambas proteínas produjeron un excelente crecimiento neural en términos de migración de precursores gliales y crecimiento axonal sobre las microfibras, siendo superior al obtenido con FBS (Fig. 18 A-B). El crecimiento neural fue todavía mayor al usar las proteínas a 40 pg/ml y al combinarlas. Para verificar que las proteínas de la matriz extracelular efectivamente se unen al polímero conductor funcionalizado con PLL/Heparina/bFGF y que la FN puede ser responsable del mayor crecimiento neural al utilizar NRS, incubamos las superficies en medio de cultivo (DMEM) con fibronectina (2, 10 y 20 pg/ml), FBS (10 %) ó NRS (10 %) y las procesamos para inmunotinción con un anticuerpo monoclonal anti-fibronectina (BD Biosciences 610078, 1 :250). Este anticuerpo se detectó con otro anticuerpo marcado con Alexa Fluor® 488. Se adquirieron imágenes RGB de la superficie en el microscopio confocal (63x) con área de 61241 m2 (247,47 x 247,47 pm). Los colores se disociaron y el componente verde se transformó a escala de grises con el fin de estimar el área cubierta con fibronectina. Para esto, se realizó un perfil de intensidad de la señal obtenida de los controles negativos con el fin de estimar el umbral de fluorescencia (60 u.a) a partir del cual consideramos positiva la presencia de la molécula, y se determinó el área con intensidad superior al umbral. Mediante este método estimamos que aproximadamente el 0,4 % de la superficie polimérica se cubre con fibronectina cuando la superficie se pone en contacto con DMEM + 20 pg/ml de la proteína, y el resultado es bastante similar al obtenido con NRS. Como lo esperábamos, la incubación en medio con SFB ó con FN a 2 pg/ml no dio señal detectable de FN unida a la superficie polimérica (Fig. 18C).
En la Fig. 19 se muestran mosaicos construidos a partir de las imágenes de microscopía confocal que ¡lustran el crecimiento neural de forma comparativa en las superficies con distintos tipos de funcionalización. Finalmente, resulta relevante mencionar que aunque la funcionalización con NRS, VN ó FN aumentó la migración y proliferación de los precursores gliales sobre la microfibra en comparación con el FBS, los precursores en cualquier caso fueron positivos para NG2 y PDGFRa y sus interacciones con los axones no se modificaron sustancialmente, existiendo siempre numerosos axones que alcanzaban la célula de la punta (Fig. 20). Además, al igual que en las microfibras funcionalizadas con FBS, la eliminación de los precursores con AraC abolió el crecimiento axonal en las superficies con NRS, FN ó VN.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Material biofuncionalizado que comprende:
a) un soporte que se selecciona de entre materiales de carbono, vidrio, plástico, metales o sus óxidos, metaloides o sus óxidos, polímeros, geles, productos derivados de la matriz extracelular, o cualquiera de sus combinaciones.
b) un polímero electroconductor dopado con PSS-co-MA y unido al soporte de (a),
c) al menos una molécula con actividad biológica unida a la superficie polimérica de forma directa o a través de al menos una molécula puente.
2. Material según la reivindicación anterior donde el soporte se selecciona de entre Au, Si, Pt, Ir, Ti o sus óxidos, composites o aleaciones.
3. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el soporte es una microfibra con diámetro entre 2 y 15 pm.
4. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el soporte presenta nano o micro estructura.
5. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el polímero electroconductor se selecciona de entre pol¡(3,4- etilenedioxitiofeno), polipirrol o polianilina.
6. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula con actividad biológica se selecciona de entre moléculas de adhesión celular, moléculas de la matriz extracelular, factores de crecimiento, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, gangliósidos, proteínas, péptidos, factores guía para los axones o dendritas o cualquiera de sus combinaciones.
7. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula puente se selecciona de entre polipéptidos, aminoácidos, péptidos, polisacáridos, anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones.
8. Material según las reivindicaciones anteriores donde la molécula puente o la molécula con actividad biológica se unen al polímero electroconductor mediante adsorción espontánea, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas o enlaces covalentes.
9. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula con actividad biológica se une al polímero electroconductor a través de al menos dos tipos diferentes de moléculas puente.
10. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula puente es polilisina.
1 1 . Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula con actividad biológica es un complejo de heparina o heparán sulfato y un factor de crecimiento.
12. Material según la reivindicación 1 1 donde el factor de crecimiento se selecciona de entre bFGF, PFGF-AA o combinaciones de ambos.
13. Material según la reivindicación 12 que adicionalmente comprende una molécula de la matriz extracelular unida al complejo molecular heparina o heparán sulfato / factor de crecimiento.
14. Material según la reivindicación antenor donde la molécula de la matriz extracelular se selecciona de entre fibronectina o derivados, vitronectina o derivados o combinaciones de las mismas.
15. Material según la reivindicación 13 donde la molécula de la matriz extracelular se adsorbe sobre la superficie a partir del suero fetal o adulto.
16. Material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la molécula puente es un anticuerpo.
17. Material según la reivindicación 16 donde la molécula puente es IgG.
18. Material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ó 16-17 donde la molécula con actividad biológica es una molécula de adhesión celular que se selecciona de la familia de las inmunoglobulinas, cadhe nas, integrinas, o selectinas.
19. Material según la reivindicación 18 donde la molécula de adhesión celular es N-cadhehna, L1 ó combinaciones de ellas.
20. Procedimiento de obtención de un material biofuncionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende las siguientes etapas: a) Síntesis de un polímero electroconductor dopado con PSS-co-MA sobre un soporte que se selecciona de entre materiales de carbono, vidrio, plástico, metales o sus óxidos, metaloides o sus óxidos, polímeros, geles, productos derivados de la matriz extracelular, o combinaciones de estos materiales.
b) Funcionalización del polímero electroconductor mediante adsorción espontánea, electroadsorción o unión covalente.
c) Unión directa a la superficie del polímero funcionalizado en la etapa (b) de al menos un tipo de molécula con actividad biológica o unión indirecta de dicha molécula con actividad biológica a través de al menos una molécula puente.
21 . Uso del material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de dispositivos para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso.
22. Uso según la reivindicación 21 donde el dispositivo es una cámara de cultivo celular.
23. Uso según la reivindicación 21 donde el dispositivo es un implante.
24. Uso del material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de electrodos que se incorporan en neuroprótesis para electroestimulación del sistema nervioso.
25. Método para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso que comprende poner en contacto tejido del sistema nervioso con el material biofuncionalizado según la reivindicación 1 para promover la proliferación, diferenciación y/o migración de precursores gliales y que a su vez ellos estimulen el crecimiento de los axones.
26. Cámara de cultivo celular que comprende una base (1 ) sobre la que se encuentra dispuesto un material en forma de microfibras electroconductoras (2), las cuales están unidas en al menos uno de sus extremos a un contacto eléctrico (3), y que comprende además una celda (4) abierta superior e inferiormente y dispuesta sobre la base (1 ), en cuyo interior quedan parcialmente contenidas las microfibras.
27. Cámara según la reivindicación anterior donde el material en forma de microfibras (2) es el material biofuncionalizado según la reivindicación 1.
28. Cámara según la reivindicación 26 caracterizada porque la celda (4) es prismática y porque las microfibras (2) están dispuestas sobre la base (1 ) de forma paralela.
29. Cámara según la reivindicación 28 caracterizada porque la celda (4) además comprende al menos un tabique separador (6) dispuesto transversalmente a la dirección longitudinal de las microfibras (2).
30. Cámara según la reivindicación 29 caracterizada porque el tabique separador (6) no apoya sobre la base definiendo una ranura para el paso de las microfibras (2) y de los elementos celulares que crezcan sobre ellas.
31 . Cámara según la reivindicación 29 caracterizada porque el tabique separador (6) comprende unos orificios para el paso de las microfibras (2) y de los elementos celulares que crezcan sobre ellas.
32. Cámara según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31 caracterizada porque comprende además unos soportes (5) dispuestos en dos lados opuestos de la base (1 ).
33. Cámara según la reivindicación 26 caracterizada porque la celda (4) es cilindrica y porque las microfibras (2) están dispuestas sobre la base (1 ) de forma radial.
34. Cámara según la reivindicación 33 caracterizada porque la celda además comprende un anillo interior (7), estando dispuestos al menos dos tabiques separadores (8) en dirección radial entre la celda (4) y dicho anillo interior (7).
35. Cámara según la reivindicación 34 caracterizada porque el anillo interior tiene una ranura o un agujero para el paso de la microfibra y de los elementos celulares que crecen sobre ella.
36. Implante que comprende el material biofuncionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
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