WO2014088292A1 - 카르보닐기 환원효소 １ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

카르보닐기 환원효소 １ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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carbonyl
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of colon cancer including an inhibitor of the expression or activity of carbonyl reductase 1 protein
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer, comprising a novel cancer treatment target carbonyl reductase Ucarbonyl reductase 1) protein expression or activity inhibitor.
  • Colorectal cancer is a refractory disease that causes 1 million cases worldwide and 530,000 deaths annually. The rate is rapidly increasing to 3rd place in Korea with .12.7% of all cancers due to aging and changes in dietary patterns. Doing. Anti-cancer agents that are currently effective against colorectal cancer are widely used by drugs such as 5-F-U, U-F, and capecitabine (Zeloda), poloropyrimidine-based drugs, irinotecan (Gamputo) and oxaliplatin. The market for colorectal cancer drugs is expected to grow rapidly from $ 900 million to $ 7.7 billion in 2017 in the seven major pharmaceutical markets, including the US and Europe. The constant use of these drugs has always been a problem of increased resistance and side effects, and it is time to study the development and diagnosis of new therapeutic agents.
  • drugs such as 5-F-U, U-F, and capecitabine (Zeloda), poloropyrimidine-based drugs, irinotecan (Gamput
  • Cancer Fetal Antigen currently used as a diagnostic marker for colorectal cancer, is a type of glycoprotein that is normally produced during fetal period, and is higher in fetal sex than adults in newborns because production of this material is normally stopped before birth. If levels of the antigen (CEA) are present, this suggests that there may be colorectal cancer or other cancers, but these levels may be associated with cirrhosis, liver disease, alcoholic pancreatitis, and smokers. It is also being used as a supplementary situation.
  • CBR 1 Human carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1, hereinafter CBR 1 belongs to the short chain dehydrogenase / reductase family (SDR) family and is a ubiquitous NADPH dependent enzyme. It is composed of 277 amino acid residues and also catalyzes the majority of biologically and pharmacologically active substrates, including a variety of endogenous and biobiotic carbonyl compounds (Hoffmann F, Maser E. Car bony 1 reductases and pluri potent). hydroxysteroid dehydrogenases of the short -chain dehydrogenase / reductase super f ami ly.
  • CBR 1 inactivates highly reactive lipid aldehydes, such as 4-oxonone-2-enal (ONE), and can regulate DNA and protein (Oppermann U. Car bony 1 reductases: the complex relationships of mamma 1 i an carbonyl- and qui none ⁇ reducing enzymes and their role in physiology.Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007; 47: 293-322.).
  • CBR 1 carbonyl reductase 1, hereinafter CBR 1 increases cell survival of leukemia cells (Jang et al., Cancer Res. (2012) 72 (16); 1-11), The ability to inhibit the death of liver cancer cells (Tak et al., Jouornal of hepatology (2011) 54: 328-339) has been reported.
  • CBR 1 in cancer cells may be unclear or may vary according to the type of tumor.
  • the use of CBR 1 to regulate colon cancer cell metastasis is currently unknown.
  • the role of CBR 1 as a colon cancer growth and metastasis inducing factor was first identified. As a result, CBR 1 overexpressed in colorectal cancer cell lines and inhibited the expression of CBR 1 in colorectal cancer cell lines.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting colon cancer, comprising carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1, hereinafter CBR 1) protein expression or activity inhibitor as an active ingredient.
  • CBR 1 carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1, hereinafter CBR 1
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a colorectal cancer therapeutic agent or metastasis inhibitor candidate using the expression or activity level of CBR 1 protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer containing carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1) protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate substance for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for measuring the expression or activity level of a protein for providing information on monitoring or diagnosing colorectal cancer development or metastasis, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for preventing colorectal cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of a carbonyl group reductase Kcarbonyl reductase 1) protein to a subject suffering from colorectal cancer.
  • the present invention provides a method for treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer comprising administering a pharmaceutically effective amount of a carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1) protein to an individual suffering from colorectal cancer.
  • the present invention also provides a carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1) protein expression or activity inhibitor for use as a pharmaceutical composition for the prevention, treatment or metastasis of colorectal cancer.
  • the carbonyl group reductase 1 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • Gene ID of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 873, NCBI Reference seqence is # _001757, NP_001748.
  • the expression inhibitor of the carbonyl group reductase 1 is a group consisting of antisense nucleotides, short hairpin RNA (sh NA) and small interfering RNA (siRNA) complementary to the mRNA of the carbonyl group reductase 1 gene. It may be any one selected from, but is not limited thereto.
  • the activity inhibitor of the carbonyl group reductase 1 protein protein may be any one selected from the group consisting of peptides, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers, and antibodies that bind to the carbonyl group reductase 1 protein. Not determined
  • CBR 1 protein was confirmed in HEK293E cells transiently transformed with cancer cell lines and CBR1 expression vectors. It was confirmed that CBR1 is expressed in g minutes of colorectal cancer cell line (see FIG. 1).
  • CBR 1 is interpreted to function to induce colon cancer cell invasion and growth by regulating the c-Src signaling pathway.
  • the expression of CBR 1 was induced as a result of suppressing the expression of C12orf59, which confirmed that the present inventor was a colon cancer metastasis suppressor by siRNA on SW480 cells (see FIG. 5B).
  • the efficacy of C12orf59 to inhibit the colorectal cancer cell metastasis means that it may be mediated by a decrease in the expression of CBR 1.
  • CBR 1 overexpressed in colorectal cancer cell line inhibited the expression of CBR 1 in colorectal cancer cell line, and resulted in decreased cell growth, cancer cell invasion and cell mobility, matrix adhesion, FAK / c—Src related cell signaling. Since it is confirmed that this decrease, a substance that inhibits the expression or activity of CBR 1 can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer.
  • the pharmaceutical composition containing an inhibitor of the expression or activity of the carbonyl group reductase 1 protein of the present invention as an active ingredient preferably contains 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, textose solution maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes and one or more of these components.
  • Agents, buffers, bactericides and other conventional additives can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants can be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsion suspensions, pills, capsules, granules or tablets.
  • Target organ specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier so that they can act. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or by a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Com any, East on PA. .
  • Nucleotide or nucleic acid used in the present invention can be prepared for oral, topical, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal administration.
  • the nucleic acid or vector is used in injectable form.
  • the area to be treated may be combined with any pharmaceutically acceptable vehicle for injectable compositions for direct infusion.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may in particular comprise isotonic sterile solutions or lyophilized compositions which allow the composition of injectable solutions upon the addition of dry, in particular sterile water or appropriate physiological saline. Direct injection of nucleic acid into a patient's tumor is advantageous because it allows the treatment efficiency to be focused on the infected tissue.
  • the dosage of nucleic acid used can be adjusted by various parameters, in particular genes, vectors, mode of administration used, disease in question or alternatively desired duration of treatment.
  • the range varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and the severity of the disease.
  • Daily dose g is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times daily.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally during clinical administration and intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine dural injection, cerebrovascular injection or thoracic injection during parenteral administration. It can be administered by internal injection and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate substance for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for screening a candidate substance for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer, comprising the following steps:
  • the cell line of step 1) is colon cell or colon cancer cell line g can be.
  • the expression level of the protein of step 2) is determined by immunoprecipitation, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, RT-PCR, Western blotting, and It is preferred to measure with any one selected from the group consisting of flow cytometry (FACS), but any method of measuring the amount of transcript or protein encoded therefrom known to those skilled in the art can be used.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate substance for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer, comprising the following steps:
  • the cell line of step 1) may be a colorectal cell or a colorectal cancer cell line.
  • the activity of the protein of step 2) is preferably measured by any one selected from the group consisting of SDS-PAGE, immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA), mass spectrometry and protein chip, but not limited thereto. It doesn't work.
  • the present invention provides a method for measuring the level of expression or activity of a protein for providing information on monitoring or diagnosing colorectal cancer development or metastasis, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for diagnosing colon cancer by measuring the expression or activity level of carbonyl reductase 1 protein from cells or tissues isolated from a subject.
  • the subject is a vertebrate and preferably a mammal, more preferably a viable animal such as a rat, a rabbit, a guinea pig, a hamster, a dog, a cat, and most preferably a chimpanzee, a gorilla, It is the same anthropoid animal.
  • the cell line of step 1) may be a colorectal cell or a colorectal cancer cell line.
  • CBR 1 overexpressed in colorectal cancer cell lines inhibited the expression of CBR 1 in colorectal cancer cell lines, reduced cell growth, cancer cell invasion and cell mobility, substrate adhesion, FAK / c-Src-related cell signaling Since it was confirmed that this decrease, the expression or activity level of CBR 1 can be used in the screening method for candidates for preventing, treating or inhibiting metastasis of colorectal cancer.
  • the expression or activity level of CBR 1 may be used in a method for measuring the expression or activity level of the protein to provide information on the development or monitoring or diagnosis of colorectal cancer.
  • the present invention provides a kit for diagnosing colorectal cancer comprising an antibody that specifically binds to a carbonyl group reductase 1 protein.
  • the carbonyl group reductase 1 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • Gene ID of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 873, NCBI Reference seqence is ⁇ _001757, ⁇ _00 ⁇ 748.
  • Antibodies that can be used in the kit include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, fragments capable of binding to epitopes, and the like.
  • the polyclonal antibody may be produced by a conventional method of injecting any one of the peptide markers into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from a host of any animal, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog.
  • the monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the production of antibody molecules through the culture of continuous cell lines. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B-cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler G et al., Nature 256: 495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 1983; and Cole SP et al., Mol Cell Biol 62: 109-120; 1984).
  • antibody fragments containing specific binding sites for any of the peptide markers can be prepared (Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989). As described above, a method for preparing an antibody against a peptide having a specific sequence is obvious to those skilled in the art.
  • Antibodies that can be used in the kit can be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex.
  • the kit may additionally include a detection antibody that specifically binds to the peptide marker.
  • the detection antibody may be a conjugate labeled with a detector such as a chromophore, a fluorescent substance, a radioisotope or a colloid, and is preferably a secondary antibody capable of specifically binding to the marker. It doesn't work.
  • the kit may further include a wash solution or an eluent which can remove enzymes, color reaction reaction substrates, unbound proteins, and the like and retain only bound peptide markers.
  • CBR 1 carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1, hereinafter CBR 1
  • CBR 1 is a diagram analyzing the expression of carbonyl reductase Kcarbonyl reductase 1, hereinafter CBR 1) in various colorectal cancer cell lines:
  • pcDNA-CBR 1 Lysate of cells which transiently transformed CBR 1 expression vector into HE 293E cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of invasion and cell migration assay of colorectal cancer cell line by inhibition of expression of CBR 1:
  • siGL3 control siRNA.
  • Figure 3 is a diagram showing the cell growth results of colorectal cancer cell line by inhibiting the expression of CBR 1:
  • Figure 4 is a diagram confirming the degree of cell-substrate adhesion (ceU-matrix adhesion assay) by inhibiting the expression of CBR 1.
  • FIG. 5A is a diagram confirming the reduction of FAK / c—Src related cell signaling by inhibition of CBR-1 expression.
  • Figure 5B is a diagram confirming the increased expression of CBR 1 by inhibiting the expression of C12orf59 in colorectal cancer cells. [Best form for implementation of the invention]
  • SW480, HCT116, HCT15, HT29, and Colo205 cell lines were cultured in RPMI1640 (GIBCO, USA) medium containing 10% FBS, penicillin-straptomycin L-glutamine, sodium pyruvate.
  • WiDr, Caco-2 cell line 10% FBS (fetal bovine serum: GIBCO, USA), penicillin-streptomycin (penici 11 in-streptomycin), L-glutamine (Lg hit amine), sodium pyruvate, non-essential amino acids (nonessent ial amino acids) 0] contain the minimal essential medium MEM: GIBCO, USA) and cultured in a culture medium.
  • HEK293E was incubated in DMEM medium.
  • Cell lines were cultured at 37 ° C, 5% C0 2 conditions.
  • SW480 sub is the subpopulat ion obtained by the inventors from SW80.
  • the pcDNA-CBR 1 vector was constructed to express the wild type CBR1 protein by introducing the CBR 1 gene into the pcDNA (invitrogen) vector.
  • the prepared pcDNA-CBR 1 vector was introduced into HEK293E cells for transient transfection.
  • the pcDNA-CBRl vector was added to Lipofectamine 2000 reagent in HEK293E cells. After 48 hours, HEK293E cells with pcDNA-CBRl vector were introduced into RIPA buffer (10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium). orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, com lete protease inhibitor) and used for Western blot analysis.
  • RIPA buffer 10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium.
  • orthovanadate 50 mM NaF, 1 mM PMSF, com lete protease inhibitor
  • the cell lines obtained in Examples 1 and 2 were prepared using RIPA buffer (10 mM).
  • Tris pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor).
  • Cell lysates were quantified by commercially available modified Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cell lysate 30 was heated in combination with SDS sample buffer and run on 8% SDS-PAGE gel. The isolated protein was transferred to nitrocellulose membrane and blocked with 5% skim milk.
  • CBR 1 was confirmed in HEK293E cells in which the pcDNA-CBR 1 vector expressing wild type CBR 1 was used as a positive control, and CBR 1 was expressed in most colorectal cancer cell lines. It was confirmed that it is expressed (Fig. 1).
  • the method for transforming cancer cell lines with CBR 1 specific siRNA is as follows.
  • SW480 cells were transformed with microporation (Neon Transfection system, Invitrogen) using the manufacturer's instructions. Briefly, cells were harvested, washed with PBS, resuspended in R buffer at a concentration of 3 ⁇ 10 5 cells / 12, 40 ⁇ siRNA 2 was added and a microporator instrument. Transformation was performed using. After 48 hours, cells were harvested for invasion / cell mobility, cell growth, cell-substrate adhesion loss, or lysis and western blot experiments were performed.
  • siRNA of CBR 1 (5'-cacagaauuacucccucua-3 ': SEQ ID NO: 2) used at this time was custom-made in estifamp.
  • C12orf59-siRNA (Dharmacon) used the one described in patent application No. 2011-00896.
  • the control siRNA (siGL3; sense strand 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG ATT-3 ': SEQ ID NO: 3, anti-sense strand 5' -UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTT- 3 ': SEQ ID NO: 4, estifam) is also the transformation method described in ⁇ Example 4>
  • the siRNA used was a siRNA consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4, not CBR-1 specific siRNA. 48 hrs post-transfection of S 80 year old pouch and invasion assay and cells Cell migration assays were performed.
  • Invasion assays were performed specifically for 100 ⁇ Matrigel (BD Biosciences, USA) with 250 fig / dilution of porous membranes in 24-well transwell plates (8 pore size; Costar, USA) diluted with serum free medium. ) it was coated with was performed to solidify and left at room temperature for 1 hour.
  • the lower layer of the transwell plate is a chemical handout
  • a chemoat tract ant As a chemoat tract ant, it was coated using collagen type I (Sigma) 100 ⁇ at a concentration of 5 ⁇ g / ⁇ i. 3 ⁇ 10 4 cells resuspended in serum-free medium were dispensed into the upper chamber and allowed to migrate from the upper chamber to the lower chamber while incubating for 48 hours at 37 ° C., 5% CO 2 conditions. Unmoved cells were removed from the surface of the upper chamber. Cells transferred to the lower layer chamber were fixed with 3.7% paraformaldehyde dissolved in PBS and stained with 2% crystal violet solution. The excess crystal vial solution was washed with distilled water and photographed of the selected area (X100), and the number of cells moved was counted at five selected areas. The average value of the counted numbers was calculated and the relative% was obtained. Cell mobility experiments were performed by dispensing 1.5 ⁇ 10 4 cells into the upper chamber without Matrigel coating.
  • SW480 cells transformed with siRNA were harvested and dispensed at 1 ⁇ 10 4 cells / well into coated 24-well plates. After incubation for 20 minutes at 37 ° C, 5% C0 2 conditions, it was fixed with 3.7% paraformaldehyde dissolved in PBS, and stained with 2 >> crystal vial solution. The excess crystal violet solution was washed with distilled water and photographed of the selected area (X100) and the number of cells adhered to the substrate (matrixXcollagen I or fibronectin) was counted.
  • CBR 1 is interpreted as a function of inducing colon cancer cell invasion and growth by regulating the c—Src signaling pathway.
  • C12orf59 is a colorectal cancer metastasis suppressor whose function has been verified by the present inventors (Patent Application 2011—0089601).
  • Patent Application 2011—0089601 the expression of CBR 1 was confirmed by inhibiting the expression of C12ori59 by siRNA in SW480 cells.

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Abstract

본 발명에서는 CBR 1의 대장암 성장 및 전이 유도 인자로서의 역할을 최초로 규명하였고, CBR 1이 대장암 세포주에서 과발현하고, 대장암 세포주에서 CBR 1의 발현을 저해한 결과, 세포성장, 암세포 침윤 및 세포이동성, 기질부착이 감소하고, FAK/c-Src 관련 세포신호전달이 감소함을 확인하였으므로, CBR 1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 대장암 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

Description

l
【명세서】
【발명의 명칭]
카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장 암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 신규한 암 치료 표적인 카르보닐기 환원효소 Ucarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
대장암은 전 세계적으로 연간 100만 명의 환자가 발생하고 53만 명이 사망 하는 난치성 질환으로， 노령화와 식이패턴의 변화에 따라 우리나라에서도 전체 암 발생의 .12.7 %로 3위를 차지할 정도로 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 대장암에 효과적인 항암제로는 5-에프유， 유에프티， 카페시타빈 (상품명: 젤로다)과 같은 폴 루오로피리미딘계 약물, 이리노테칸 (상품명: 갬푸토) 및 옥살리플라틴과 같은 약물 이 널리 이용되고 있으며， 미국， 유럽 등 세계 7대 제약시장에서 대장암 치료제 시 장은 현재 9억 달러 규모에서 2017년 78억 달러로 급성장할 전망이다. 이러한 약 물의 지속적인 사용은 내성의 증가 및 부작용을 나타낼 수 있다는 문제점을 항상 지니고 있어， 새로운 치료제의 개발 및 진단에 대한 연구가 필요한 시점이다.
현재 대장암의 진단 마커로 이용되고 있는 암태아성항원 (CEA)은 태아 시기 에 정상적으로 만들어지는 일종의 당단백질로， 정상적으로는 태어나기 전에 이 물 질의 생산이 중단되기 때문에， 성인에게서 신생아보다도 더 높은 암태아성항원 (CEA)의 수치가 나타난다면 이것은 대장암이나 다른 암이 있을 가능성이 있음을 제 시하나， 이 수치는 간경변증， 간질환， 알코올성 췌장염 환자나 그리고 흡연자에게 서도 증가할 수 있어ᅳ 보조적으로 사용되고 있는 실정이다. 인간 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1， 이하 CBR 1)은 단쇄 디 하이드로게나아제 /리덕타제 계열 (short chain dehydrogenase/reductase, SDR) family)에 속하며 편재해 있는 NADPH 의존효소이다. 277개의 아미노산 잔기로 구 성되어 있으며 또한 내생적이며 생체이물적인 다양한 카보닐 화합물들을 포함하여 생물학적이고 약리학적으로 활성 기질 대다수에 촉매 작용을 미친다 (Hoffmann F, Maser E. Car bony 1 reductases and pluri potent hydroxysteroid dehydrogenases of the short -chain dehydrogenase/reductase super f ami ly. Drug
Metab Rev 2007;39:87-144. ) . CBR 1은 4-옥소논 -2-에날 (ONE)와 같이 크게 반웅하는 지질 알데하이드를 비활성시키며 DNA와 단백질을 조절할 수 있다 (Oppermann U. Car bony 1 reductases: the complex relationships of mamma 1 i an carbonyl- and qui none一 reducing enzymes and their role in physiology. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007；47：293-322.). 한편， CBR 1의 암세포에서의 기능은 불분명하거나， 흑은 종양 유형에 따라 다른 것이 알려져 있다. 예를 들면， 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1， 이하 CBR 1)은 백혈병 세포 (leukemia cell)의 세포생존을 증가시키고 (Jang et al. , Cancer Res. (2012) 72(16)； 1-11)， 간암세포 (liver cancer cell)의 사멸을 억제시 키는 (Tak et al. , Jouornal of hepatology (2011)54:328-339) 기능이 보고된 바 있 다.
반면， 자궁내막 선암 세포 (endometrial adenocarcinoma cell) 및 자궁 경부 편평상피암 세포 (uterine cervical squamous carcinoma cells)에서는， CBR 1의 발 현억제에 의해 암세포 침윤이 증가하고， 전이억제인자인 E-캐드헤린 (E-cadherin) 발현이 감소하며， CBR 1의 발현 유도에 의해 암세포 침윤이 감소함이 보고됨으로써 , CBR 1이 전이억제인자로서의 가능성이 제시되었다 (Cancer Letters (2012) 323： 69- 76； Cancer Letters(2011) 311:77-84).
이와 같이， CBR 1의 암세포에서의 기능은 불분명하거나， 혹은 종양 유형에 따라 다론 것으로 보이며， 아직까지 CBR 1과 대장암과의 직접적인 연관성 및 대장 암에서의 기능은 보고된 바 없다. 특히， CBR 1의 대장암 세포 전이 조절기능을 규 명한 용도는 현재 밝혀지지 않았다. 본 발명에서는 CBR 1의 대장암 성장 및 전이 유도 인자로서의 역할을 최초 로 규명하였고， CBR 1이 대장암 세포주에서 과발현하고， 대장암 세포주에서 CBR 1 의 발현을 저해한 결과， 세포성장， 암세포 침윤 및 세포이동성， 기질부착이 감소하 고， FAK/c-Src 관련 세포신호전달이 감소함을 확인하였으므로， CBR 1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 대장암 예방 및 치료에 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1， 이하 CBR 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는， 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 목적은 CBR 1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하여 대장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러， 본 발명의 또 다른 목적은 CBR 1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 이용히여 대장암 치료제 또는 전이 억제제 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공 하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 대장암 예방, 치료 또는 전이 억 제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단 계;
2) 상기 단계 1)의 발현 세포주에 대해 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발 현 정도를 측정하는 단계 ; 및
3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.
또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는， 대장암 발달 또는 전이의 모니터 링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한， 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정 방법을 제공한다:
1) 피검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조 군에 비해 감소한 피검 개체를 선별하는 단계; 및
3),상기 선별된 피검개체가 대장암에 걸릴 위험 또는 암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계 . 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또 는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는， 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약 학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 ¾성 억제제를 대장암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 예방방법을 제공한다.
또한， 본—발명은 약학적으로 유효한 양의 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 대장암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 대장암 대장암 예방， 치료 또는 전이 의제용 약학적 조성 물로 사용하기 위한， 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 제공한다.
상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성 된 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 Gene ID는 873이고， NCBI Reference seqence는匪 _001757， NP_001748이다.
상기 카르보닐기 환원효소 1의 발현 억제제는 카르보닐기 환원효소 1 유전 자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 R A( short hairpin RNA, sh NA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질 단백질의 활성 억제제는 카르보닐기 환 원효소 1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드， 펩티드 미메틱스， 기질 유사체， 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나， 이에 한 정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 암세포주 및 CBR1 발현 백터로 일시적으 로 형질전환된 HEK293E세포에서 CBR 1 단백질의 발현을 확인하였고， 그 결과， 대부 g 분의 대장암 세포주에서 CBR1이 발현되는 것을 확인하였다 (도 1 참조).
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서는, CBR-1 발현억제에 의해 SW480 세 포의 침윤 (invasion) 및 세포 이동 (migration)이 각각 51%， 45% 감소하는 것을 확 인하였고 (도 2 참조)， 혈청이 존재하는 조건 (with serum) 및 무혈청 조건 (without serum) 에서의 세포성장을 분석한 결과， 세포의 성장이 각각 48%， 32% 감소함을 확 인하였으며 (도 3 참조)， 타입 I 콜라겐 (collagen type I) 및 피브로넥틴 (fibronectin)에의 세포부착을 분석하였을 때， 세포 -기질 부착이 각각 53%, 53% 감 소하는 것을 확인하였다 (도 4 참조 i.
CBR-1 발현 억제에 의하여 FAK 및 c-Src의 인산화 (phosphorylat ion)가 감소 하는 것을 확인하였다 (도 5A 참조). 따라서， CBR 1은 c-Src 신호 경로 (signaling pathway)를 조절함으로써， 대장암세포 침윤 및 성장 등을 유도하는 기능을 하는 것 으로 해석된다.
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서는, SW480 세포에 siRNA로 본 발명자 가 대장암 전이억제인자인 것을 검증한 C12orf59의 발현을 억제한 결과, CBR 1의 발현이 유도됨을 확인하였다 (도 5B 참조). 따라서， C12orf59의 대장암세포 전이억 제 효능은, CBR 1의 발현의 감소에 의해 매개될 가능성이 있음을 의미한다.
본 발명에서는 CBR 1이 대장암 세포주에서 과발현하고， 대장암 세포주에서 CBR 1의 발현을 저해한 결과, 세포성장， 암세포 침윤 및 세포이동성， 기질부착이 감소하고, FAK/c— Src 관련 세포신호전달이 감소함을 확인하였으므로， CBR 1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 의 유효성분으로 사용할 수 있다. 본 발명의 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 %로 포함하는 것아 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은， 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약 제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수， 멸균수， 링거액， 완충 식염수, 텍스트로즈 용액 말토 덱스트린 용액， 글리세를， 에탄올， 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이 상을 흔합하여 사용할 수 있으며， 필요에 따라 항산화제， 완충액， 정균제 둥 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제， 분산제， 계면활성제， 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액， 유탁액 둥과 같은 주사용 제형 , 환 약， 캡슐， 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용 할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Com any , East on PA)에 개 시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은， 경구， 국소， 비경구， 비 내， 정맥 내, 근육 내， 피하， 안 내， 경피 등꾀 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는， 핵산 또는 백터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라 서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임 의의 약학적으로 허용되는 매개체와 흔합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따 라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도 록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터， 특히 유전자， 백터， 사용되는 투여 방식， 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중， 연령, 성별, 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법， 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량 g 은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고， 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며， 하루 1 회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사， 직장내주사， 피하주사, 정맥주사， 근육내주사， 자궁내 경막주사， 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고， 일반적인 의약 품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 대장암 예방， 치료 또는 전이 억 제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단 계;
2) 상기 단계 1)의 발현 세포주에 대해 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발 현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계 .
또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 대장암 예방， 치료 또는 전이 억 제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질 및 C12orf59 단백질의 발현 세포주에 피 검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포주에 대해 카르보닐기 환원효소 1 단백질 및
C12orf59 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하고， C12orf59 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하 지 않은 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계.
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 세포주는 대장 세포 또는 대장암 세포주일 g 수 있다.
상기 방법에 있어서， 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법 (immunoprecipitation), 방사능면역분석법 (RIA)， 효소면역분석법 (ELISA)， 면역조직 화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어 진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 대장암 예방, 치료 또는 전이 억 제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하 지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 세포주는 대장 세포 또는 대장암 세포주일 수 있다.
상기 방법에 있어서， 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광 법， 효소면역분석법 (ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되 는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 아울러， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는， 대장암 발달 또는 전이의 모니 터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한， 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정 방법 을 제공한다:
1) 피검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조 군에 비해 감소한 피검 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 선별된 피검개체가 대장암에 걸릴 위험 또는 암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계 .
또한， 본 발명은 피검체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하여 대장암을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서， 상기 피검 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동 물이며， 그보다 바람직하게는 쥐， 래빗， 기니아피그， 햄스터， 개， 고양이와 같은 실함동물이고， 가장 바람직하게는 침팬지， 고릴라와 같은 유인원류 동물이다. 상기 방법에 있어서， 단계 1)의 세포주는 대장 세포 또는 대장암 세포주일 수 있다.
본 발명에서는 CBR 1이 대장암 세포주에서 과발현하고, 대장암 세포주에서 CBR 1의 발현을 저해한 결과， 세포성장， 암세포 침윤 및 세포이동성， 기질부착이 감소하고, FAK/c-Src 관련 세포신호전달이 감소함을 확인하였으므로， CBR 1의 발현 또는 활성 수준을 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법 에 사용할 수 있다. 아울러， CBR 1의 발현 또는 활성 수준을 대장암 발달 또는 전 이의 모니터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한， 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정 방법에 사용할 수 있다. 아울러， 본 발명은 카르보닐기 환원효소 1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.
상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성 된 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 Gene ID는 873이고， NCBI Reference seqence는蘭 _001757， ΝΡ_00Γ748이다. 상기 기트에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체， 단클론 항체 및 에피토프 와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 다클론 항체는 상기 펩티드 마커 중 어느 하나를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알 려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고， 염소， 토끼， 양， 원숭이， 말, 돼지， 소， 개 등 임의의 동물 중 숙주로부터 만들어질 수 있다. 상기 단클론 항체는 연 속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술， 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다 (Kohler G et al. , Nature 256:495-497, 1975； Kozbor D et al. , J Immunol Methods 81:31-42, 1985； Cote RJ et al. , Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983； 및 Cole SP et al. , Mol Cell Biol 62:109-120， 1984) . 또한， 상기 펩티드 마커 중 어느 하나에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다 (Huse WD et al . , Science 254： 1275-1281, 1989). 상기와 같이 특정 서열을 갖는 펩티드에 대한 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 자명한 일이다.
상기 키트에 사용될 수 있는 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형기질 (solid substrate)에 결합될 수 있다.
상기 키트는 추가적으로 상기 펩티드 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 포함할 수 있다. 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질， 방사성 동위원 소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체 (conjugate)일 수 있고, 상기 마커 에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서， 상기 키트는 추가적으로 효소와 발색 반웅할 기질 및 결 합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 펩티드 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다.
· 【유리한 효과】
본 발명에서는 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1， 이하 CBR 1) 의 대장암 성장 및 전이 유도 인자로서의 역할을 최초로 규명하였고， CBR 1이 대장 암 세포주에서 과발현하고， 대장암 세포주에서 CBR 1의 발현을 저해한 결과， 세포 성장, 암세포 침윤 및 세포이동성, 기질부착이 감소하고， FAK/c-Src 관련 세포신호 전달이 감소함을 확인하였으므로， CBR 1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 대장 암 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명]
도 1은 다양한 대장암 세포주에서 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1， 이하 CBR 1) 발현을 분석한 도이다:
pcDNA-CBR 1： HE 293E 세포에 CBR 1 발현 백터를 일시적으로 형질전환 (transient transfect ion)한 세포의 용해물 (lysate).
도 2는 CBR 1의 발현 억제에 의한 대장암 세포주의 침윤 (Invasion), 세포이 동 분석 (migration assay) 결과를 나타낸 도이다:
siGL3: 대조군 siRNA.
도 3은 CBR 1의 발현 억제에 의한 대장암 세포주의 세포성장 결과를 나타낸 도이다:
with serum: 혈청 (serum)이 존재하는 조건;및
without serum:무혈청 (serum— free) 조건.
도 4는 CBR 1의 발현 억제에.의한 세포 -기질 접착 (ceU-matrix adhesion assay) 정도를 확인한 도이다.
도 5A는 CBR-1 발현 억제에 의한 FAK/c— Src 관련 세포신호전달의 감소를 확 인한 도이다. 도 5B는 대장암세포에서 C12orf59의 발현 억제에 의한 CBR 1의 발현 증가를 확인한 도이다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예， 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발 명의 내용이 하기 실시예, 실험예ᅳ및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>세포주 배양
모든 인간 세포주는 American Type Culture Col lect ion(USA)에서 제공받았 다. SW480, HCT116, HCT15, HT29, Colo205 세포주는 10% FBS, 페니살린-스트랩토 마이신 L-글루타민， 소디움 피루베이트가 포함된 RPMI1640(GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. WiDr, Caco-2 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum: GIBCO, USA), 페니실린-스트렙토마이신 (penici 11 in-streptomycin)， L-글루타민 (L-g hit amine)， 소 디움 피루베이트 (sodium pyruvate), 비필수 아미노산 (nonessent ial amino acids)0] 포함된 MEM minimal essential medium: GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. HEK293E는 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포주는 37°C , 5% C02 조건에서 배양하였 다. 여기서 SW480 sub는 본 발명자들이 SW80으로부터 얻은 부분집단 (subpopulat ion) 이다.
<실시예 2> HEK293E 세포에 CBR 1 발현 백터의 일시적인 형질전환 (transient transfection)
pcDNA-CBR 1 백터는 pcDNA( invitrogen) 백터에 CBR 1 유전자를 도입하여 야 생형 (wild type) CBR1 단백질이 발현되도록 제작하였다. 상기 제작된 pcDNA-CBR 1 벡터를 HEK293E 세포에 도입하여 일시적인 형질전환 (transient transfection)을 하 였다.
구체적으로, HEK293E 세포에 pcDNA-CBRl 백터를 Lipofectamine 2000 시약으 로 도입하고 48 시간 후에， pcDNA-CBRl 백터가 도입된 HEK293E 세포를 RIPA buffer(10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl , 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, com lete protease inhibitor)으로 용해시키고 웨스턴 블랏 분석에 사용하였다.
<실시예 3> 암세포주에서 CBR 1 단백질의 발현 조사
암세포주 및 CBR 1 발현 백터로 일시적으로 형질전환된 HEK293E세포에서 CBR 1 단백질의 발현을 확인하고자， 아래와 같이 웨스턴 블랏 분석 (Western blot analysis)을 실시하였다.
상기 <실시예 1〉 및 〈실시예 2>에서 수득된 세포주를 RIPA buffer (10 mM
Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)에서 용해 (lysis)하였다. 세포 용해물 (Cell lysate)은 commercially available modified Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 정량하였다. 세 포 용해물 (Cell lysate) 30 을 SDS 시료 버퍼와 흔합하여 가열하였고, 8% SDS- PAGE 겔에 영동하였다. 분리된 단백질은 니트로셀를로오스 막 (nitrocellulose membrane)에 이동시키고, 5% 스킴 밀크 (skim mi lk)로 차단하였다. 이 후 anti— beta-act in(Santa Cruz), anti -CBR 1( Santa Cruz)와 함께 반응시켰고， 홀스레디쉬 퍼올시데이즈 (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반웅시켰다. 이 후 ECL 키트 (ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하였다.
그 결과， 양성대조군 (positive control)으로 사용한 야생형 (wild type) CBR 1을 발현하는 pcDNA-CBR 1 백터를 도입한 HEK293E 세포에서 CBR 1의 발현을 확인하 였고, 대부분의 대장암 세포주에서 CBR 1이 발현되는 것을 확인하였다 (도 1).
<실시예 4> 암세포주에 카르보닐기 환원효소 carbonyl reductase 1， CBR 1)특이적 siRNA형질전환
암세포주에서 과발현하는 CBR 1을 대장암 세포주인 SW480 세포에 siRNA 형 질전환하여 CBR 1 발현을 억제하였을 때， 대장암 세포의 침윤， 세포 이동성， 세포- 기질 부착 정도 및 FAK/c-Src 관련 세포신호전달 정도를 확인하고자 하였다.
구체적으로， 암세포주에 CBR 1 특이적 siRNA로 형질전환하는 방법은 아래와 같다. SW480 세포에 마이크로포래이션 (microporation) 기법 (Neon Transfection system, Invitrogen)을 제조업자의 지시대로 이용하여 형질전환 (transfect ion) 하 였다. 간략하게 설명하면, 세포를 수확한 뒤， PBS로 세척하고， R buffer에 3X105 세포 /12 의 농도로 재부유 (resuspension)한 뒤， 40 μΜ siRNA 2 를 첨가하고 마 이크로포래이터 (microporator) 기기를 이용하여 형질전환하였다. 48시간 후， 세포 를 수확하여 침윤 /세포이동성, 세포성장， 세포-기질부착 실함을 하거나， 세포를 용 해 (lysis)하여 western blot 실험을 수행하였다.
이때 사용한 CBR 1의 siRNA(5' -cacagaauuacucccucua-3 ' ： 서열번호 2)는 에스티팜에서 주문제작하였다. C12orf59-siRNA(Dharmacon社)는 특허출원 제 2011- 00896이호에 서술되어 있는 것을 사용하였다.
<실험예 1> CBR 1의 발현 억제에 의한 대장암 세포의 침윤 및 이동성 억제 효과 확인
CBR 1의 발현 억제에 의한 암세포 침윤능 및 세포이동성의 변화를 분석하기 위하여， <실시예 4>와 같이 CBR 1-특이적 siRNA로 형질전환하였고， 대조군 siRNA (siGL3; sense strand 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG ATT-3'： 서열번호 3， anti- sense strand 5' -UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTT—3'： 서열번호 4, 에스티팜)도 역시 <실시예 4>에 기재된 형질전환 방법으로 형질전환 하였고， 이때， 사용된 siRNA는 CBR-1 특이적 siRNA가 아닌 상기 서열번호 3 및 4로 구성된 siRNA이다. S 80 세 포주를 형질전환 (transfection)하고 48시간 뒤 침윤 분석 (invasion assay) 및 세포 이동성 분석 (cell migration assay)을 수행하였다.
침윤분석실험은， 구체적으로， 24-웰 트렌스웰 플레이트 (8 pore size; Costar,미국)의 다공성 막을 무혈청 (serum free) 배지로 희석된 250 fig/ 농도의 100 μί 마트리젤 (BD Biosciences, 미국)로 코팅하였고， 실온에서 1시간 동안 방치 '하여 고형화시켜 실시하였다. 트렌스웰 플레이트의 하층은 화학유인물
(chemoat tract ant)로서 5 βg/Άi 농도의 콜라겐 타입 I (Sigma) 100 ^를 이용하여 코팅하였다. 무혈청 배지에서 재부유한 3X104 개의 세포를 상층 챔버에 분주하 였고， 37°C, 5% C02 조건에서 48시간 동안 배양하면서 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동하도록 하였다. 이동하지 않은 세포는 상층 챔버의 표면에서 제거하였다. 하 층 챔버로 전이한 세포는 PBS에 녹인 3.7% 파라포름알데하이드로 고정하였고， 2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이을렛 용액을 증류 수로 세척한 뒤， 선택 면적 (X100)의 사진을 찍었고， 이동한 세포수는 5개의 선택 면적에서 계수하였다. 상기 계수된 수의 평균값을 구하고 상대적 %를 구하였다. 세포 이동성 실험은， 마트리젤 코팅없이 1.5X104개의 세포를 상층 챔버에 분주하여 수행하였다.
그 결과， CBR— 1 발현억제에 의해 침윤 (invasion) 및 세포 이동 (migrat ion) 이 각각 51%， 45% 감소하는 것을 확인하였다 (도 2).
<실험예 2> CBR 1의 발현 억제에 의한 대장암세포 성장 감소의 확인
CBR 1의 발현 억제에 의한 대장암세포 성장 감소를 확인하고자， 상기 <실시 예 4>에서 서열번호 2의 siRNA로 형질전환한 SW480 세포를 수확하여 24-웰 플레이 트 (well plates)에 3X104 개의 세포를 분주하였다. 37°C， 5% C02 조건에서 72시 간 동안 배양한 후， 세포를 수확하여 세포의 개수를 계수하였다. 또한， 24-웰 플 레이트에 세포를 분주한 지 24시간 후 무혈청 배지 (serum-free medium)로 바꾸고 48 시간 후 세포를 수확하여 세포의 개수를 계수하였다. 대장암 세포주 SM80에 CBR 1-특이적 siRNA를 형질전환한 후， 혈청이 존재 하는 조건 (with serum) 및 무혈청 조건 (without serum) 에서의 세포성장을 분석한 결과， 세포의 성장이 각각 48%, 32% 감소하였다 (도 3). <실험예 3> CBR 1의 발현 억제에 의한 세포 -기질 접착 (cell"matrix adhesion assay) 정도 확인
세포 -기질 부착은 암세포의 침윤 및 이동에 있어 중요한 역할을 하는 것으 로 알려져 있기 때문에， <실시예 4>에 기재된 방법으로 CBR 1의 발현을 억제하고， 세포 -기질 접착 정도를 확인하였다.
24-웰 플레이트를 5 μg/m\ Collagen type I 또는 10 /ml fibronectin
(500 ≠) 로 코팅하고， 3% BSA 로 차단 (blocking) 하였다. siRNA로 형질전환한 SW480 세포를 수확하여， 코팅한 24-웰 플레이트에 1X104 세포 /웰로 분주하였다. 37°C, 5% C02 조건에서 20 분 간 배양 (incubation)한 후， PBS에 녹인 3.7% 파라포 름알데하이드로 고정하였고， 2Ά> 크리스탈 바이을렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이올렛 용액을 증류수로 세척한 뒤， 선택 면적 (X100)의 사진을 찍었고, 기질 (matrixXcollagen I 또는 fibronectin)에 접착한 세포의 개수를 계수하였다. 대장암 세포주 SM80에 CBR 1-특이적 siRNA를 형질전환한 후, 타입 I 콜라 겐 (collagen type I) 및 피브로넥틴 (fibronectin)에의 세포부착을 분석하였을 때， 세포 -기질 부착이 각각 53¾， 53% 감소하는 것을 확인하였다 (도 4).
<실험예 4> CBR-1 발현 억제에 의한 FAK/c-Src 관련 세포신호전달의 감소 확인
CBR1 넉다운 (knockdown)에 의한 대장암세포 침윤， 세포이동성， 성장 감소에 대한 기작을 규명하기 위한 하나의 방법으로 세포내 주요 신호전달체계의 변화를 확인하였다. SW480 세포에서 siRNA로 CBR 1의 발현을 억제한 후, <실시예 3>의 웨스턴 블랏 방법을 사용하여 FAK 및 c-Src의 인산화 ( phosphorylation ) 정도를 확인하였다. 이때, 1차 항체는 <실시예 3>에 기재된 anti-be -actin과 anti-CBR 1( Santa Cruz) 과 더불어 ant i-phospho-c-src(Cel 1 signaling), ant i -phospho-FAK(Y397) , ant i~c~ src(Santa Cruz)를 사용하였다.
그 결과， CBR-1 발현 억제에 의하여 FAK 및 c-Src의 인산화 (phosphorylation)가 감소하는 것을 확인하였다 (도 5A). 따라서， CBR 1은 c— Src 신호 경로 (signaling pathway)를 조절함으로써, 대장암세포 침윤 및 성장 등을 유 도하는 기능을 하는 것으로 해석된다.
<실험예 5> 대장암세포에서 C12orf59의 발현 억제에 의한 CBR 1의 발현 증 가 확인
C12orf59는 본 발명자가 기능을 검증한 대장암 전이억제인자이다 (특허출원 제 2011— 0089601호). 상기 C12orf59과 CBR 1과의 관련성을 확인하고자, SW480 세포 에 siRNA로 C12ori59의 발현을 억제하여， CBR 1의 발현 정도를 확인하였다.
SW480 세포에 siRNA로 C12orf59의 발현을 억제한 결과， CBR 1의 발현이 유 도됨을 확인하였다 (도 5B). 따라서， C12orf59의 대장암세포 전이억제 효능은， CBR 1의 발현의 감소에 의해 매개될 가능성이 있음을 의미한다.

Claims

[청구의 범위】
【청구항 1】
카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억 제제를 유효성분으로 함유하는， 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성 물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질은 서열번호 1의 아미 노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는， 대장암 예방， 치^ 또는 전이 억제용 약 학적 조성물.
[청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 카르보닐기 환원효소 1의 발현 억제제는 카르보닐기 환원효소 1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 해 어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로하는 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
[청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질 단백질의 활성 억제 제는 카르보닐기 환원효소 1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드， 펩티드 미메틱 스， 기질 유사체， 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 5] 1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단 계;
2) 상기 단계 1)의 세포주에 대해 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 정 도를 측정하는 단계 ; 및
3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는, 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방 법.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법 (i隱 unoprecipitation), 방사능면역분석법 (RIA)， 효소면역분석법 (ELISA) , 면역조직 화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어 진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방， 치 료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법 .
【청구항 71
1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하 지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계 ;
를 포함하는， 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방 법.
【청구항 8] 제 7항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법， 효소면역분석법 (ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 후 보물질의 스크리닝 방법.
【청구항 9】
1) 카르보닐기 환원효소 1 단백질 및 C12orf59 단백질의 발현 세포주에 피 검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포주에 대해 카르보닐기 환원효소 1 단백질 및 C12orf59 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하고， C12orf59 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하 지 않은 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는， 대장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방 법.
【청구항 10】
1) 피검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 카르보닐기 환원효소 1 단백질의 활성 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 피검 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 선별된 피검개체가 대장암에 걸릴 위험 또는 암 전이 위험이 높은 것을 판단하는 단계 ;
를 포함하는， 대장암 발달 또는 전이의 모니터링 또는 진단의 정보를 제공 하기 위한, 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정 방법.
[청구항 11】
피 검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카르보닐기 환원효소 1 단 백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하여 대장암을 진단하는 방법 .
【청구항 12】
카르보닐기 환원효소 1 단백질에 특이 적으로 결합하는 항체를 포함하는 대 장암 진단용 키트 .
【청구항 13】
약학적으로 유효한 양의 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단 백질의 발현 또는 활성 억 제제를 대장암에 걸린 개체에 투여 하는 단계를 포함하는 대장암 예방방법 .
[청구항 14】
약학적으로 유효한 양의 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단 백질의 발현 또는 활성 억 제제를 대장암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억 제방법 .
【청구항 15]
대장암 대장암 예방， 치료 또는 전이 억 제용 약학적 조성 물로 사용하기 위 한， 카르보닐기 환원효소 Kcarbonyl reductase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억 제 제 .
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