WO2014069655A1 - 免疫寛容誘導剤 - Google Patents

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WO2014069655A1
WO2014069655A1 PCT/JP2013/079865 JP2013079865W WO2014069655A1 WO 2014069655 A1 WO2014069655 A1 WO 2014069655A1 JP 2013079865 W JP2013079865 W JP 2013079865W WO 2014069655 A1 WO2014069655 A1 WO 2014069655A1
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donor
recipient
cells
immune tolerance
inducer
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敏仁 平井
和也 尾本
一成 田邉
絵美 川口
保之 石井
晴彦 森田
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株式会社レグイミューン
学校法人東京女子医科大学
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    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154

Definitions

  • the present invention relates to an immune tolerance inducing agent used in a therapy for inducing immune tolerance to a donor cell, tissue or organ to a recipient by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient.
  • organ transplantation is recognized as the ultimate and only radical treatment.
  • immunosuppressive agents acute rejection of many transplanted organs has become controllable, but on the other hand, toxicity due to long-term immunosuppressant administration and management with current immunosuppressive agents are difficult Due to chronic rejection, the long-term survival rate of transplanted organs is still not good.
  • Induction of transplantation tolerance is aimed at making the organ transplant recipient's immune system recognize the transplanted organ as its own, and if this tolerance is induced, the administration of immunosuppressants can be significantly reduced. It seems that even chronic rejection can be controlled.
  • Many studies have been reported on the induction of immune tolerance, and several clinical applications have been reported at present. However, the mechanism is still unclear, leading to the establishment of a safe and reliable method. Not in.
  • Ildostad et al. In a mouse experiment, promoted bone marrow graft survival by performing bone marrow transplantation enriched with graft survival promoting cells (Facilitating cells) in donor bone marrow after irradiation with 950 cGy. It was reported that sex T cells (Treg) proliferate and prevent GVHD (Non-patent Document 1). Leventhal et al. Conducted a clinical trial of bone marrow transplantation and kidney transplantation simultaneously using Facilitating cells, replacing all the recipient's blood cells with donor cells, allowing the graft to be engrafted without immunosuppression. And it succeeded in suppressing GVHD (nonpatent literature 2).
  • the radiation they used in the animal experiments was 240 cGyx 10 times, although it was shielding other than the lymphoid organs, and it was quite high capacity, and because it was divided irradiation, the treatment period was long, and Anti-thymocyte globlin ( ATG) is necessary, but its side effects cannot be ignored.
  • a protocol that uses lower doses of radiation and uses as little cytotoxic drugs as ATG is more desirable.
  • Non-patent Document 6 DH. Sachs et al. Reported the induction of immune tolerance in transplanted organs by the introduction of mixed chimera for the first time in 1989 (Non-patent Document 6). After that, they combined thymic irradiation (thymic irradiation) with anti-T cell antibody (non-patent document 7) ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA and bone marrow non-destructive dose (3Gy) whole body irradiation (Total body) Induction of immune tolerance in a less invasive manner by suppressing the function of T cells by combining co-stimulation blockade (CB) with anti-T cell antibodies (Non-patent Documents 8 and 9). I have discovered a protocol.
  • CB co-stimulation blockade
  • Non-patent Document 10 There is a need for a protocol that avoids the use of such drugs, or reduces or avoids as much as possible. Moreover, although their protocol was effective in the combination of MHC mismatched, it has been recognized that the induction rate of chimera drops in Full allo (Non-patent Document 11). However, they applied such a protocol and attempted clinical application in monkeys and humans and succeeded in inducing immune tolerance to some extent (Non-patent Document 12).
  • Non-patent Document 4 reports that NKT cells are important for the induction of thymic chimera
  • NKT for induction of immune tolerance by blocking costimulation. From the report that cells are essential (Non-patent Document 5), it can be inferred that NKT cells also play an important role in the system of Sachs et al. It can be inferred from the report of Ikehara et al.'S cross-species islet transplantation that it is necessary for T cells to create a state superior to NKT cells in order for NKT cells to act to induce tolerance (Non-patent Document 6). ). These reports suggest that mixed chimera can be induced by NKT cell activation.
  • NKT cells are known to have a plurality of costimulatory systems (Non-patent Document 13), and anti-CD40L antibody and CTLA4-Ig described above are NKT cells. It is known to function to suppress the activation of immunity due to (Non-patent Document 14). However, there have been no reports of achieving the control of transplantation immunity by combining NKT cell activation and CB.
  • Non-patent Document 15 Attempts have been made to artificially control this by using a derivative of ⁇ -GalCer, and application to transplantation has also been reported (Non-patent Document 15). However, the effect is limited, and in combination with the immunosuppressant rapamycin, the survival rate of mouse heart transplantation is only slightly prolonged.
  • ⁇ -GalCer liposomal ⁇ -GalCer
  • iNKT cells via CD1d, an antigen-presenting cell
  • GVHD is suppressed by proliferation of Treg even when Full chimera is formed.
  • liposomes containing KRN7000 as ⁇ -GalCer have an IL-10-producing T cell induction effect and an IgE antibody production inhibitory effect that are not exhibited by aqueous ⁇ -GalCer alone, and are allergic, autoimmune and GVHD. It is shown to be useful as a preventive or therapeutic agent (Patent Document 17 and Patent Document 1).
  • NK1.1 + TCR alpha beta + or DX5 + TCR alpha beta + T cells in mice conditioned with fractionated hostsdiseaseise "Natural suppressor” cells.
  • Higuchi M Zeng D, Shizuru J, et al. Immune tolerance to combined organ and bone marrow transplants after fractionated lymphoid irradiation involves regulatory NK T cells and clonal deletion.
  • the object of the present invention is to induce mixed himera by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient, and to induce appropriate immune tolerance to the transplanted organ in the therapy to induce immune tolerance to the donor cell, tissue or organ to the recipient It is to create a safe and practical immune tolerance inducer that can be used and its use.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems.
  • hematopoietic cell chimera by donor hematopoietic cell transplantation is used.
  • the present invention has been completed by further studies based on such knowledge.
  • the present invention provides an immune tolerance inducer, a hematopoietic cell chimera inducer, and the like of the following aspects.
  • Item 1. An immune tolerance inducer used in therapy for inducing immune tolerance to donor cells, tissues, or organs by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient, and a liposome containing ⁇ -galactosylceramide, An immune tolerance inducer comprising a substance that inhibits a stimulation pathway.
  • Item 2. Item 2. The immune tolerance inducer according to Item 1, wherein the costimulatory pathway is the CD40 / CD40L costimulatory pathway.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. The immune tolerance inducing agent according to any one of Items 1 to 3, wherein the donor hematopoietic cells to be transplanted are hematopoietic cells derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood.
  • Item 5. The immune tolerance inducing agent according to any one of Items 1 to 3, wherein the donor hematopoietic cell to be transplanted is bone marrow.
  • Item 7. Item 7.
  • the tolerance-inducing agent according to any one of Items 1 to 6, which is a two-agent form consisting of a preparation containing a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a preparation containing a substance that inhibits a costimulatory pathway.
  • Item 9 A donor cell or tissue comprising administering to a recipient transplanted with donor hematopoietic cells or a recipient transplanted with donor hematopoietic cells a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a substance that inhibits a costimulatory pathway. Or a method of inducing immune tolerance to an organ in a recipient.
  • Item 10 A method of inducing immune tolerance to an organ in a recipient.
  • a liposome containing ⁇ -galactosylceramide for the production of an immune tolerance inducer used in therapy for inducing immune tolerance to donor cells, tissues or organs by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient; Use of substances that inhibit costimulatory pathways.
  • Item 11. A hematopoietic cell chimera-inducing agent comprising a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a substance that inhibits a costimulatory pathway.
  • Item 13 The hematopoietic cell chimera inducer according to Item 12, wherein the donor hematopoietic cell is a hematopoietic cell derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood. Item 14. Item 14. The hematopoietic cell chimera inducer according to any one of Items 11 to 13, wherein the costimulatory pathway is a CD40 / CD40L costimulatory pathway. Item 15. Item 15. The hematopoietic cell chimera inducer according to any one of Items 11 to 14, wherein the substance that inhibits a costimulatory pathway is an anti-CD40 antibody or an anti-CD40L antibody. Item 16.
  • a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a substance that inhibits a costimulatory pathway In a recipient body comprising administering to a recipient transplanted with donor hematopoietic cells or a recipient transplanted with donor hematopoietic cells a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a substance that inhibits a costimulatory pathway.
  • Use of a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a substance that inhibits a costimulatory pathway for the production of a hematopoietic cell chimera inducer.
  • a hematopoietic cell chimera in a recipient body can be used in a therapy for inducing immune tolerance to a donor cell, tissue or organ to a recipient by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient. Can be produced and maintained stably, and immune tolerance in transplantation immunity can be effectively induced. Further, the immunological tolerance inducer of the present invention can facilitate the proliferation of regulatory T cells in the recipient body, and this also contributes to the effective induction of immune tolerance. Conceivable.
  • Immune tolerance in refractory autoimmune diseases such as systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, dermatomyositis, multiple sclerosis, Crohn's disease, autoimmune cytopenia that can be treated by hematopoietic cell transplantation Can be efficiently guided.
  • the hematopoietic cell chimera inducer of the present invention can efficiently produce a hematopoietic cell chimera in the recipient body, it is not only used for the purpose of inducing tolerance in transplantation immunity, but also an experimental model. Hematopoietic cell chimeric non-human animals that can be used as animals can also be produced.
  • Example 1 shows the result of staining MHC class I antigen with both recipient type (H2K d ) and donor type (H2K b ) for peripheral blood monocytes and spleen cells of recipient mice.
  • H2K d recipient type
  • H2K b donor type
  • TBI + anti-CD40L + KRN7000 containing liposome group 200 days after bone marrow transplantation the result of evaluating the engraftment of donor cells in peripheral blood, spleen, lymph node, and bone marrow is shown.
  • the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group 200 days after bone marrow transplantation shows the percentage of donor cells in the thymus (right figure) and the results of evaluating the expression of donor MHC class I antigen in blood cells.
  • Example 1 the result of having measured the weight change after the bone marrow transplantation of the liposome group containing TBI + anti-CD40L + KRN7000 and the TBI + anti-CD40L group is shown.
  • Example 1 the result of having observed that graft rejection is not recognized in the tissue image of the small intestine (left side) and the liver (right side) 100 days after transplantation of the liposome group containing TBI + anti-CD40L + LKRN7000 is shown.
  • the result of having evaluated the expression of the donor MHC (class) I antigen about the CD24 (+) CD4 (-) CD8 (-) T cell recognized in the liposome group containing TBI + anti-CD40L + (KRN7000) in Example 1 is shown.
  • Example 2 TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group and TBI + anti-CD40L group were subjected to heart transplantation and the results of observing the engraftment of the heart graft are shown.
  • Example 2 the result of having observed that rejection is not recognized in the histological image 100 days after heart transplantation of the liposome group containing TBI + anti-CD40L + KRN7000 is shown.
  • Example 3 the results of measuring serum IL-2 for the recipient mice in each group at 2, 24, and 48 hours after bone marrow transplantation are shown.
  • Example 3 the results of measuring serum IL-4 for the recipient mice in each group at 2, 24, and 48 hours after bone marrow transplantation are shown.
  • Example 3 the results of measuring serum IL-10 for the recipient mice in each group at 2, 24, and 48 hours after bone marrow transplantation are shown.
  • Example 3 the results of measuring serum IL-12 for the recipient mice in each group at 2, 24, and 48 hours after bone marrow transplantation are shown.
  • Example 3 the results of measuring IFN- ⁇ in serum for recipient mice of each group at 2, 24, and 48 hours after bone marrow transplantation are shown.
  • it is a figure which shows the result of having measured the ratio and activation of Treg in a splenocyte about the recipient mouse of each group.
  • Example 3 it is a figure which shows the result of having measured the ratio and activation of Treg in a splenocyte about the recipient mouse of each group.
  • Example 3 it is a figure which shows the result of having measured the ratio and activation of Treg in a splenocyte about the recipient mouse of each group.
  • Example 3 it is a figure which shows the result of having measured the ratio and activation of Treg in a splenocyte about the recipient mouse of each group.
  • Example 3 it is a figure which shows that Treg (and activated Treg: aTreg) erase
  • Immune tolerance inducer of the present invention is used in a therapy for inducing immune tolerance to a donor cell, tissue or organ to a recipient by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient.
  • -Characterized in that it contains liposomes containing galactosylceramide and substances that inhibit the costimulatory pathway.
  • the ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer) used in the present invention is a glycosphingolipid in which galactose and ceramide are bonded in the ⁇ -coordination, and specifically, WO94 / 09020, WO94 / 02168, WO94. / 24142, WO98 / 44928, Science, 278, p.1626-1629, 1997 and the like.
  • KRN7000 ie, (2S, 3S, 4R) -1-O- ( ⁇ -D-galactopyranosyl) is used as ⁇ -GalCer.
  • -2-Hexacosanoylamino-1,3,4-octadecanetriol is preferably used.
  • ⁇ -GalCer is used in a state of being included in a liposome. That is, in the present invention, a liposome containing ⁇ -GalCer is used. Since the ceramide portion of ⁇ -GalCer exhibits fat solubility, ⁇ -GalCer included in the liposome usually has a structure in which ⁇ -GalCer is localized in the lipid bilayer of the liposome.
  • a liposome containing ⁇ -GalCer may be referred to as a liposomal ⁇ -GalCer.
  • preferred examples include KRN7000-containing liposomes produced using KRN7000 as ⁇ -GalCer.
  • RGI-2001 manufactured by Reguimun Co., Ltd.
  • KRN7000-containing liposome preparation prepared by the same method as described in Biol Blood Marrow Transplant. 1-15 (2011) can be mentioned as a particularly preferred example.
  • the ratio between the constituent lipid of the liposome and ⁇ -GalCer can be appropriately set according to the use by those skilled in the art, and is not particularly limited.
  • ⁇ -GalCer is 0.05 to 100 parts by weight, preferably 0.5 to 20 parts by weight, per 100 parts by weight of the total lipid constituting the liposome.
  • Lipid (liposome-constituting lipid) used for liposomal ⁇ -GalCer is not particularly limited as long as it can form a bilayer structure.
  • Specific examples of liposome-constituting lipids include diacyl phosphatidylcholines such as dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), and disteroyl phosphatidylcholine (DSPC); (DPPG), diacylphosphatidylglycerols such as dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dimyristoyl phosphatidylglycerol (DMPG), disteroylphosphatidylglycerol (DSPG); cholesterol, 3 ⁇ - [N- (dimethylaminoethane) carbamoyl] Cholesterol (DC-Chol),
  • the above-mentioned liposome-constituting lipids may be used alone or in combination of two or more.
  • Preferred examples of the combination of liposome-constituting lipids include diacylphosphatidylcholines, diacylphosphatidylglycerols and sterols, and diacylphosphatidylcholines and sterols; more preferably DPPC, DOPC, DPPG and cholesterol. And a combination of DOPC and cholesterol and / or DC-Chol.
  • the blending ratio of each lipid is appropriately set in consideration of the size and fluidity required for the liposome.
  • diacylphosphatidylcholines diacylphosphatidylglycerols and sterols
  • diacylphosphatidylcholines diacylphosphatidylglycerols: sterols in a molar ratio of 1: 0.125 to 0.75: 0.125 to 1, preferably 1: 0.14 to 0.4: 0.14 to 0.6.
  • DPPC DOPC
  • DPPG cholesterol in a molar ratio of 1: 0.16 to 1.65: 0.16 to 1. 0: 0.16-1.3, preferably 1: 0.4-0.75: 0.2-0.5: 0.3-0.75.
  • diacylphosphatidylcholines preferably DOPC
  • sterols preferably cholesterol and / or DC-Chol
  • diacylphosphatidylcholines: sterols are in a molar ratio of 1: 0.05 to 4, preferably 1: 0.1 to 1.
  • the liposome may contain a cationic compound such as stearylamine and oleylamine; an anionic compound such as dicetyl phosphate; and a membrane protein, if necessary. Can be set as appropriate.
  • the size of the liposome is not particularly limited, but the average particle size is usually 5 to 1000 nm, preferably 100 to 400 nm.
  • the average particle diameter of the liposome is measured by a dynamic light scattering method.
  • the structure of the liposome is not particularly limited, and may be any of MLV (multilamellar vesicles), DRV (dehydration-rehydration vesicles), LUV (large umilamellar vesicles), or SUV (small unilamellar vesicles).
  • examples of the solution encapsulated in the liposome include pharmaceutically acceptable aqueous carriers such as water, buffer solution, and physiological saline.
  • Liposomal ⁇ -GalCer uses known liposome production methods such as hydration method, ultrasonic treatment method, ethanol injection method, ether injection method, reverse phase evaporation method, surfactant method, and freezing / thawing method. Produced. Moreover, the particle size distribution of the liposome can be adjusted by passing through a filter having a predetermined pore size. Moreover, according to a well-known method, the conversion from MLV to a single membrane liposome and the conversion from a single membrane liposome to MLV can also be performed.
  • the “substance inhibiting the costimulatory pathway” used in the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as an inhibitor) is made between the antigen-presenting cell and the T cell in order to activate the T cell. It is a substance that inhibits the costimulatory pathway.
  • the inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the costimulatory pathway, and low molecular weight compounds, antibodies, proteins, nucleic acids (aptamers, antisense molecules, siRNA, etc.) and the like can be used.
  • the costimulatory pathway include CD86 / CD28 costimulatory route, CD80 / CD28 costimulatory route, CD40 / CD40L costimulatory route, OX40 / OX40L costimulatory route, ICOS / ICOSL costimulatory route, and the like.
  • the inhibitor used in the present invention may be one that inhibits the function of either the costimulatory molecule or the co-stimulatory molecule that constitutes the costimulatory pathway, or that inhibits both of these functions. May be.
  • the inhibitory substance is a low molecular compound capable of inhibiting the function of at least one of CD86, CD28, CD80, CD40, and CD40L; an antibody that binds to at least one of these; Aptamers, antisense molecules, siRNA, etc. for one of these may be mentioned.
  • the CD40 / CD40L costimulatory pathway is preferable as the costimulatory pathway to be inhibited by the inhibitor. That is, as a preferable example of the inhibitory substance, a low molecular compound capable of inhibiting the function against CD40 and / or CD40L; an antibody that binds to CD40 and / or CD40L; an aptamer or an antisense molecule against CD40 and / or CD40L Or siRNA etc. are mentioned. Among these, more preferred are anti-CD40 antibody and anti-CD40L antibody.
  • the production of a hematopoietic cell chimera made by transplantation of donor hematopoietic cells into a recipient is more efficiently induced.
  • immune tolerance to donor cells, tissues or organs can be more effectively induced in the recipient.
  • the ratio between the liposome containing ⁇ -GalCer and the substance that inhibits the costimulatory pathway is not particularly limited, but ⁇ -GalCer is added to the substance that inhibits the costimulatory pathway.
  • the liposome to be contained is 0.001 to 5000 parts by weight, preferably 0.05 to 100 parts by weight, more preferably 0.25 to 20 parts by weight, in terms of ⁇ -GalCer weight.
  • the ⁇ -GalCer-containing liposome and the substance that inhibits the costimulatory pathway may be contained in the same preparation, or in two different preparations. Also good. That is, as one embodiment of the immune tolerance inducing agent of the present invention, a formulation for inducing immune tolerance (one-drug form) containing a liposome containing ⁇ -GalCer and a substance that inhibits a costimulatory pathway can be mentioned. As an embodiment, an immune tolerance induction kit (two-drug form) comprising a preparation containing a liposome containing ⁇ -GalCer and a preparation containing a substance that inhibits a costimulatory pathway can be mentioned.
  • the dosage form of the immune tolerance inducer of the present invention can be appropriately set according to the administration form, and may be any dosage form such as a liquid, powder, granule, tablet, capsule and the like.
  • the preparation containing the liposome containing ⁇ -GalCer and the preparation containing the substance that inhibits the costimulatory pathway may have the same dosage form. It may also be a different formulation.
  • the immune tolerance inducer of the present invention is prepared in a desired dosage form, if necessary, containing a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the ⁇ -GalCer-containing liposome and the substance that inhibits the costimulatory pathway.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include aqueous carriers such as distilled water, physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, and acetate buffer; sucrose, fructose, sucrose, glucose, lactose, mannitol, sorbitol Sugars such as glycerin, propylene glycol, butylene glycol and other polyhydric alcohols; nonionic surfactants, cationic surfactants, negative surfactants, amphoteric surfactants and other surfactants; hydroxypropyl methylcellulose, hydroxy Examples include cellulose derivatives such as propylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, and carboxymethyle
  • the immune tolerance inducing agent of the present invention is administered to a patient (recipient) who transplants donor cells, tissues or organs, and transplants donor cells, tissues or organs by transplanting donor hematopoietic cells to the recipient. Used in therapy to induce immune tolerance to the organ in the recipient. That is, the immunological tolerance inducer of the present invention induces immune tolerance to a donor cell, tissue or organ in a recipient prior to or at the same time as transplantation of a cell, tissue or organ. To be administered when transplanting donor hematopoietic cells.
  • the donor cell, tissue, or organ transplanted into the patient is not particularly limited, and examples thereof include a donor-derived heart, lung, liver, small intestine, skin, kidney, or part or all of the pancreas.
  • the “donor hematopoietic cell” refers to a donor hematopoietic cell transplanted into a recipient and a stem cell that can be differentiated into a blood cell lineage cell.
  • the tissue derived from the hematopoietic cells transplanted into the recipient is not particularly limited, and may be, for example, bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood itself, and hematopoietic cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood. It may be.
  • Hematopoietic cells to be transplanted into the recipient preferably include bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood-derived hematopoietic cells.
  • the donor hematopoietic cell transplantation amount may be an effective amount that can induce immune tolerance, and may be appropriately set according to the symptom, age, etc. of the recipient, and is usually about 1 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 8 cells / kg. It is done.
  • Administration of the immune tolerance inducer of the present invention may be performed between 72 hours before transplantation of donor hematopoietic cells and 72 hours after transplantation, preferably within 24 hours after transplantation of donor hematopoietic cells. .
  • the order of administration of the preparation containing the liposome containing ⁇ -GalCer and the preparation containing the substance that inhibits the costimulatory pathway is not particularly limited. They may be administered simultaneously or in any order.
  • the dosage form of the immune tolerance inducer of the present invention may be either parenteral administration or oral administration. Specifically, intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intraarticular administration And mucosal administration. Among these administration forms, parenteral administration, particularly intravenous administration is preferable from the viewpoint of further improving the induction of immune tolerance.
  • Examples of administration targets of the immunological tolerance inducer of the present invention include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, rabbits, cats, cows, horses, goats; and birds such as chickens and ostriches. Preferably it is a human.
  • the dose of the immune tolerance inducer of the present invention may be an effective amount that can induce immune tolerance, and may be appropriately set according to the symptom, age, etc. of the recipient, but in terms of the amount of ⁇ -GalCer to be administered About 1 to 100 ⁇ g / kg.
  • hematopoietic cell transplantation is performed for a patient having a disease for which it is difficult to produce normal blood.
  • a hematopoietic cell chimera for the production of a hematopoietic cell chimera. That is, by performing transplantation of donor hematopoietic cells and administration of the immune tolerance inducer of the present invention to the recipient, a hematopoietic cell chimera is efficiently produced in the recipient body, and the hematopoietic cell chimera is transplanted into the transplanted cell. It becomes possible to induce immune tolerance against tissues or organs.
  • pretreatment such as whole body irradiation for the recipient is indispensable. Since this pretreatment is performed for the purpose of killing the recipient's hematopoietic cells, a high radiation dose of about 10 to 50 Gy is necessary, and the burden on the recipient is great.
  • irradiation in pretreatment is performed. Even under mild, non-destructive conditions of hematopoietic cells of about 1 to 3 Gy, immune tolerance can be efficiently induced. Therefore, the burden on the recipient can be reduced, and therefore, it may be possible to extend the application to patients who have not been applied so far, such as recipients suffering from refractory autoimmune diseases.
  • hematopoietic cell chimera refers to a state in which donor hematopoietic cells and recipient hematopoietic cells coexist in the recipient body.
  • donor-derived antigen-presenting cells remove donor-reactive T cells in the thymus, so that specific immune tolerance to donor cells, tissues, or organs is established.
  • the amount of a substance that inhibits the costimulatory pathway is small (for example, 50 mg / kg or less and inhibits the costimulatory pathway If the substance to be administered is an anti-CD40L antibody, about 25 mg / kg, that is, 1 mg or less when administered to a mouse weighing 20 g, and about 0.5 mg if the substance that inhibits the costimulatory pathway is an anti-CD40L antibody) Neither is it necessary to have multiple types.
  • the examples described below show that hematopoietic cell chimeras that can still exist stably over a long period of time can be induced. Further, according to the immunological tolerance inducer of the present invention, it is not necessary to prepare ex vivo cells that are easy to introduce tolerance, such as facilitating cells. That is, it can be understood that the immune tolerance inducer of the present invention is an immune tolerance inducer that can be put into practical use for the first time in the induction of hematopoietic cell chimera.
  • the immunological tolerance inducer of the present invention not only requires the use of a low dose of radiation for induction of hematopoietic cell chimeras, but also has a side effect and cytotoxic agent (substance that inhibits costimulatory pathway) as much as possible. It can be seen that this is an immune conventional inducer that can be used for the first time. It is described in any known non-patent literature that the active ingredient of such an immune tolerance inducer having a remarkable effect includes a liposome containing ⁇ -galactosylceramide and a substance that inhibits a costimulatory pathway. Even a person skilled in the art cannot easily conceive.
  • Hematopoietic cell chimera inducer As described above, when transplanting donor hematopoietic cells to a recipient, by administering a combination of a liposome containing ⁇ -GalCer and a substance that inhibits the costimulatory pathway, The production of a hematopoietic cell chimera is promoted. Therefore, the present invention further provides a hematopoietic cell chimera inducing agent comprising a liposome containing ⁇ -GalCer and a substance that inhibits a costimulatory pathway. Furthermore, a method for producing a hematopoietic cell chimeric animal using the hematopoietic cell chimera inducer is also provided.
  • the components, dosage form, administration subject, administration method and the like are the same as in the case of the immune tolerance inducer.
  • the method for producing the hematopoietic cell chimeric animal is also as described in the column of the immunological tolerance inducer.
  • Example 1 Creating a mouse bone marrow transplantation and bone marrow chimeras, Japan Slc, the 12 weeks at 8 weeks of age from Inc. male C57BL / 6NCrSlc (B6, H- 2 b), BALB / cCrSlc (BALB / c, H-2 d ) and C3H / HeSlc (C3H, H-2 k ) were purchased. Mice were bred according to NIH animal management guidelines in the SPF environment of the central laboratory animal facility at Tokyo Women's Medical University.
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
  • mice After euthanizing the donor B6 mouse, the femur and tibia were collected, and the bone marrow was washed out from the bone marrow cavity using a 21 gauge needle. Bone marrow cells were suspended in HBSS, passed through a 70 ⁇ m nylon mesh, and centrifuged at 1800 rpm for 5 minutes. After reacting with 2 ml of ACK Lysing Buffer (Lonza, MD, USA) for 10 minutes at room temperature, resuspend in HBSS, count the number of cells, adjust to 2 x 10 7 bone marrow cells per mouse, recipient Balb / c The mice were intravenously injected via the tail vein (TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group).
  • peripheral blood was collected from recipient BALB / c mice and reacted with ACK Lysing Buffer (Lonza, MD, USA) at room temperature for 5 minutes to disrupt erythrocytes.
  • MHC class I antigen of the obtained peripheral blood monocyte PBMC was stained with both recipient type (PE-conjugated anti-H2K d ) and donor type (FITC-conjugated anti-H2K b ). Furthermore, in order to distinguish the fraction of blood cells, staining was performed using anti-TCR ⁇ , anti-B220, anti-Gr1, and anti-MAC1 (BD Bioscience, CA, USA).
  • the dose of the KRN7000-containing liposome was changed in the same protocol as the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group, as shown in Table 2, the engraftment of donor cells 14 days after bone marrow transplantation was the dose of the KRN7000-containing liposome. It was confirmed that it depends on.
  • the expression of the donor MHC class I antigen was 200,000 days after bone marrow transplantation, and TCR- ⁇ positive cells (T-cells), B220 positive cells (B-cells), MAC Expression was observed in -1 positive macrophages (Mq), Gr-1 positive granulocytes, and all series of blood cells (see FIG. 3).
  • the donor cells are engrafted in each tissue without being rejected by the immune tolerance inducing agent of the present invention, it should be noted that, as shown in FIG.
  • the recipient mice did not show any weight loss or gastrointestinal symptoms suspected of GVHD.
  • donor T cells are observed after bone marrow transplantation, the development of GVHD is a concern.
  • the immunological tolerance inducer of the present invention is used, there is no finding that donor T cells are attacking the host (FIG. 4B).
  • the reactivity of T cells extracted from chimeric mice to the 3rd party is maintained, but it has been confirmed that the reactivity to recipients and donors is reduced. .
  • the reactivity to the recipient of the T cell on the donor side is suppressed at the same time as the T cell that specifically reacts with the donor is suppressed, and the donor cell is not rejected in In vivo, It is consistent with GVHD not occurring.
  • the expression of donor MHC class ⁇ ⁇ I found in the thymus is not only in mature CD4 single positive, CD8 single positive, but also in pre-T cells, CD24 (+) CD4 (-) CD8 (-) T cells. (See FIG. 5), the donor T cells observed in the chimeric mice (the recipient mice after transplantation) are thought to be circulating in the periphery after receiving education in the thymus.
  • cTEC cortical thymic epithelial cell
  • Example 2 Heart transplantation Ectopic heart transplantation from the same donor (B6 mouse) as the bone marrow donor on the 14th day after bone marrow transplantation of the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group and TBI + anti-CD40L group in Example 1 Surgery was performed. Both donor and recipient mice were anesthetized with Pentobarbital (Dainippon Sumitomo Pharma, Osaka, Japan) administered intraperitoneally. The donor mouse was opened, and 1% heparin saline was injected from the abdominal aorta to perfuse the blood, and then the heart was removed by thoracotomy.
  • Pentobarbital Dainippon Sumitomo Pharma, Osaka, Japan
  • Recipient mice were laparotomized and the abdominal aorta and vena cava were end-to-side anastomosed with 10-0 nylon thread to the ascending aorta and pulmonary artery of the donor heart. After the operation, the pulsation of the transplanted heart in the abdomen was confirmed manually, and when the pulsation could not be confirmed, the abdomen was opened and the heartbeat stopped under direct vision.
  • the spleen was removed from the euthanized mouse, the tissue was crushed, and the cells were suspended in CSB. Stain cell surface antigen with anti-CD4, anti-CD25 (BD Bioscience), fix and permeabilize cells using FoxP3 staining kit (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-FoxP3, anti-Ki Intranuclear staining was performed with -67 (eBioscience).
  • ectopic heart transplantation was also performed from a donor different from the bone marrow donor (C3H mouse). The test was conducted under the same conditions.
  • Example 3 Evaluation of cytokine production and regulatory T cells after bone marrow transplantation
  • serum cytokines IL-2, IL-4, IL-, 2, 24 and 48 hours after bone marrow transplantation
  • IL-12, IFN- ⁇ serum cytokines
  • IL-10 slightly increased 2 hours after transplantation, but much less than the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group and the TBI + KRN7000-containing liposome group.
  • these cytokines disappeared 24 hours after transplantation.
  • IL-12 also increased rapidly after transplantation in the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group and TBI + KRN7000-containing liposome group, but in the TBI + KRN7000-containing liposome group, IL-12 production was further enhanced after 24 hours. In contrast, IL-12 also disappeared after 24 hours in the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group.
  • IL-2 and IL-10 that increase in liposomes containing TBI + anti-CD40L + KRN7000 are known as factors that enhance Treg (regulatory T cells), which are considered to play an important role in immune tolerance.
  • Treg regulatory T cells
  • the TBI + anti-CD40L + KRN7000-containing liposome group increased Treg in the spleen cells 28 days after transplantation compared to the other groups (see FIGS. 13A, B and C).
  • the activated Treg shown to be Ki67 positive was also significantly increased in the TBI + anti-CD40L + LKRN7000-containing liposome group (see FIGS. 13A and D). From the above results, it was found that Treg was enhanced both numerically and functionally by using anti-CD40L antibody and KRN7000-containing liposome in combination.
  • anti-CD25 antibody was administered under the conditions shown in Table 3, and the presence or absence of bone marrow chimera and the number of Tregs in splenocytes were evaluated 14 days after bone marrow transplantation. did.

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Abstract

　本発明の目的は、ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられる免疫寛容誘導剤を創製することである。　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームと共刺激経路を阻害する物質を組み合わせて使用することによって、ドナー造血細胞移植による造血細胞キメラをレシピエントに誘導することができ、これによってドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導することが可能になる。

Description

免疫寛容誘導剤
　本発明は、ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられる免疫寛容誘導剤に関する。
　多くの臓器不全に対し、臓器移植は、最終的な、そして唯一の根治的な治療法として認識されている。免疫抑制剤の開発と進歩により、多くの移植臓器の急性拒絶反応はコントロール可能となってきたが、一方で、長期間の免疫抑制剤投与による毒性や、現在の免疫抑制剤では管理が困難な慢性拒絶反応のため、移植臓器の長期生着率は未だに良好とはいえない。移植免疫寛容の誘導は、臓器移植レシピエントの免疫系に、移植臓器を自己のものとして認識させることを目的とし、この免疫寛容が誘導されれば、免疫抑制剤の投与を著しく減じることが可能になり、慢性拒絶反応さえもコントロール可能になると考えられる。免疫寛容の誘導については、多くの研究成果が報告され、現在ではいくつかの臨床応用の報告もなされているが、その機序はまだ不明瞭であり、安全で確実な方法の確立には至っていない。
　Ildostadらはマウスの実験で、950cGyの放射線照射後に、ドナー骨髄中の移植片生着促進細胞（Facilitating cell）を富化した骨髄移植を行うことで骨髄移植片の生着が促進され、さらに調節性T細胞（Treg）が増殖してGVHDが予防されると報告した(非特許文献１)。Leventhalらは、Facilitating cellを利用して骨髄移植と腎移植を同時に行う臨床試験を実施し、レシピエントの血液細胞をすべてドナー細胞に置き換えることで、免疫抑制を用いずに移植片を生着させ、かつGVHDも抑制することに成功した(非特許文献２)。混合血キメラ(mixed chimera)を確立することで移植臓器の免疫寛容を誘導できることが示されたが、彼らの実験ではほぼ骨髄破壊的といえる強力な前処置がなされており、これをすべての臓器不全患者に適応することは難しい。骨髄移植前に細胞を処理しなければならないことも、この治療法を汎用化するのを困難としている。
　S. Stroberらは、分割全リンパ節照射（fractionated total lymphoid irradiation （TLI））後の骨髄移植では移植片対宿主病（GVHD）が起こらず、mixed chimeraの状態が長期間続くことを示し、その要因が前処置後に優性となるナチュラルキラーＴ（NKT）細胞にあると報告している(非特許文献３)。さらに彼らは、TLI後に骨髄移植と心移植を同時に行うことでmixed chimeraと移植心の寛容が得られたとし(非特許文献４)、後に類似のプロトコールでHLA適合腎移植をヒトで施行している(非特許文献５)。彼らが動物実験で使用した放射線照射は、リンパ臓器以外を遮蔽しているとはいうものの240cGyx10回とかなりの高容量であり、また分割照射であるため治療期間も長く、さらにAnti-thymocyte globlin(ATG)の投与も必要であるがその副作用も無視できない。より低線量の放射線を用い、ATGのような細胞障害性のある薬剤をできる限り使わないプロトコールがより望ましい。
　DH. Sachsらは1989年に世界で初めてmixed chimeraの導入による移植臓器の免疫寛容の誘導を報告した(非特許文献６)。その後彼らは、胸腺照射（thymic irradiation）と抗T細胞抗体の併用(非特許文献７) ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA や骨髄非破壊的な線量（3Gy）の放射線全身照射(Total body irradiation;TBI)に共刺激遮断（co-stimulation blockade；CB）と抗T細胞抗体の併用(非特許文献８および９)により、T細胞の機能を抑えることでより低侵襲に免疫寛容を誘導するプロトコールを発見している。彼らはCBとして、抗CD40L抗体を2mgに、時としてCTLA4-Iｇを追加しているが、抗CD40 Ligand (L)抗体は血栓症が問題となることが知られており（非特許文献１０）、またCTLA4-Iｇも易感染性を引き起こすなど、こうしたCBには実用的には問題のある副作用の課題がある。従って、こうした薬剤の使用を回避するか、できるだけ減量または使わないようなプロトコールが必要である。また、彼らのプロトコールはMHC mismatchedの組み合わせでは有効であったが、Full alloではキメラの誘導率は落ちることを認めている(非特許文献１１)。しかしながら、彼らはこうしたプロトコールを応用してサル、及びヒトでの臨床応用を試みてある程度の免疫寛容誘導に成功している(非特許文献１２)。これらの実験ではNKT細胞の関与は調べられていないが、胸腺キメラ（thymic chimera）の誘導にNKT細胞が重要であるとする報告や(非特許文献４)、共刺激遮断による免疫寛容誘導にNKT細胞が必須であるとの報告(非特許文献５)から、Sachsらの系においてもNKT細胞が重要な役割を果たしていると推測することができる。NKT細胞が寛容誘導に働くためには、T細胞がNKT細胞に優位な状態を作り出すことが必要であろうことは、Ikeharaらの異種間膵島移植の報告からも推測されうる(非特許文献６)。これらの報告から、NKT細胞の活性化でmixed chimeraの誘導ができる可能性が示唆される。
　一方で、NierlichらはCB-based mixed chimera modelにおいて、水溶液状（aqua liquid）のα－ガラクトシルセラミド（以下、「α-GalCer」と略記する場合がある）によるNKT細胞の活性化がむしろ免疫寛容の誘導に阻害的に働いたとし(非特許文献７)、またSeinoらは心移植において水溶液状のα-GalCerがわずかな生着延長効果しか示さなかったことを開示している(非特許文献８)。こうした現象は、NKTが免疫を制御する役割を有する一方で、免疫を活性化させる働きも有することが原因と考えられる。NKT細胞がこれらの２つの相反する作用をどのように切り替えているのかの詳細なメカニズムは明らかとはなっていない。一般的なT細胞と同様に、NKT細胞にも複数の共刺激系が存在していることが知られており(非特許文献１３)、先にも述べた抗CD40L抗体やCTLA4-IｇはNKTによる免疫の活性化を抑える働きをすることが知られている(非特許文献１４)。しかしNKT細胞の活性化とCBの併用による移植免疫の制御を達成した報告は未だにない。
　α-GalCerの誘導体を用いることでこれを人為的にコントロールしようとする試みもなされており、移植への応用も報告されている(非特許文献１５)。しかしその効果は限定的であり、免疫抑制剤であるラパマイシンと併用してマウスの心移植の生着率がわずかに延長したのみである。
　本発明者を含むグループは、リポソーム化されたα-GalCer（liposomal α-GalCer）が抗原提示細胞のCD1dを介してiNKT細胞に提示されることで、水溶液状のα-GalCerと比べて免疫制御に関する作用が高いことや（非特許文献１６）、また骨髄破壊的骨髄移植の際にリポソーム化α-GalCerを投与すると、Full chimeraが形成されてもTregが増殖することでGVHDが抑制されることを報告している（非特許文献１１）。さらにα-GalCerとしてKRN7000を含有するリポソームは、水溶液状のα-GalCer単独では発揮されないIL-10産生T細胞の誘導作用とIgE抗体産生抑制作用を有し、アレルギー性疾患、自己免疫疾患およびGVHDの予防ないし治療剤としても有用であることを示している（特許文献１７及び特許文献１）。
国際公開第2005/120574号パンフレット
Cardenas PA, Huang Y, Ildstad ST. The role of pDC, recipient T(reg) and donor T(reg) in HSC engraftment: Mechanisms of facilitation. Chimerism 2011; 2 (3): 65. Leventhal J, Abecassis M, Miller J, et al. Chimerism and tolerance without GVHD or engraftment syndrome in HLA-mismatched combined kidney and hematopoietic stem cell transplantation. Sci Transl Med 2012; 4 (124): 124ra28. Lan F, Zeng D, Higuchi M, Huie P, Higgins JP, Strober S. Predominance of NK1.1+TCR alpha beta+ or DX5+TCR alpha beta+ T cells in mice conditioned with fractionated lymphoid irradiation protects against graft-versus-host disease: "natural suppressor" cells. J Immunol 2001; 167 (4): 2087. Higuchi M, Zeng D, Shizuru J, et al. Immune tolerance to combined organ and bone marrow transplants after fractionated lymphoid irradiation involves regulatory NK T cells and clonal deletion. J Immunol 2002; 169 (10): 5564. Scandling JD, Busque S, Dejbakhsh-Jones S, et al. Tolerance and chimerism after renal and hematopoietic-cell transplantation. N Engl J Med 2008; 358 (4): 362. Sharabi Y, Sachs DH. Mixed chimerism and permanent specific transplantation tolerance induced by a nonlethal preparative regimen. J Exp Med 1989; 169 (2): 493. Sykes M, Szot GL, Swenson KA, Pearson DA. Induction of high levels of allogeneic hematopoietic reconstitution and donor-specific tolerance without myelosuppressive conditioning. Nat Med 1997; 3 (7): 783. Ito H, Kurtz J, Shaffer J, Sykes M. CD4 T cell-mediated alloresistance to fully MHC-mismatched allogeneic bone marrow engraftment is dependent on CD40-CD40 ligand interactions, and lasting T cell tolerance is induced by bone marrow transplantation with initial blockade of this pathway. J Immunol 2001; 166 (5): 2970. Takeuchi Y, Ito H, Kurtz J, Wekerle T, Ho L, Sykes M. Earlier Low-Dose TBI or DST Overcomes CD8+ T-Cell-Mediated Alloresistance to Allogeneic Marrow in Recipients of Anti-CD40L. American Journal of Transplantation 2004; 4 (1): 31. T. Kawai et. al., Nat. Medi. 6: 114, 2000 Bigenzahn S, Blaha P, Koporc Z, et al. The role of non-deletional tolerance mechanisms in a murine model of mixed chimerism with costimulation blockade. Am J Transplant 2005; 5 (6): 1237. Sykes M. Mechanisms of transplantation tolerance in animals and humans. Transplantation 2009; 87 (9 Suppl): S67. van den Heuvel MJ, Garg N, Van Kaer L, Haeryfar SMM. NKT cell costimulation: experimental progress and therapeutic promise. Trends in Molecular Medicine 2011; 17 (2): 65. Hayakawa Y, Takeda K, Yagita H, Van Kaer L, Saiki I, Okumura K. Differential regulation of Th1 and Th2 functions of NKT cells by CD28 and CD40 costimulatory pathways. J Immunol 2001; 166 (10): 6012. Haeryfar SMM, Lan Z, Leon-Ponte M, et al. Prolongation of Cardiac Allograft Survival by Rapamycin and the Invariant Natural Killer T Cell Glycolipid Agonist OCH. Transplantation 2008; 86 (3): 460. Yasuyuki Ishii, Risa Nozawa et al. Alpha-galactosylceramide-driven immunotherapy for allergy. Frontiers in Bioscience 13, 6214-6228 Omar Duramad, Amy Laysang, Jun Li, Yasuyuki Ishii, Reiko Namikawa. Pharmacologic Expansion of Donor-Derived, Naturally Occurring CD41Foxp31 Regulatory T Cells Reduces Acute Graft-versus-Host Disease Lethality Without Abrogating the Graft-versus-Leukemia Effect in Murine Models. Biol Blood Marrow Transplant. 1-15 (2011)
　本発明の目的は、ドナー造血細胞をレシピエントに移植することによりmixed himeraを誘導し、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法において、移植臓器に対する適切な免疫寛容を誘導できる安全且つ実用的な免疫寛容誘導剤及びその使用法を創出することである。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、α-GalCerを含有するリポソームと共刺激経路を阻害する物質を組み合わせて使用することによって、ドナー造血細胞移植による造血細胞キメラをレシピエントに誘導することができ、これによってドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導することが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、以下に掲げる態様の免疫寛容誘導剤、造血細胞キメラ誘導剤等を提供する。
項１．　ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられる免疫寛容誘導剤であって、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を含む、免疫寛容誘導剤。
項２．　共刺激経路が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路である、項１に記載の免疫寛容誘導剤。
項３．　共刺激経路を阻害する物質が、抗ＣＤ４０抗体又は抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、項１又は２に記載の免疫寛容誘導剤。
項４．　移植されるドナー造血細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の造血細胞である、項１～３のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
項５．　移植されるドナー造血細胞が、骨髄である、項１～３のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
項６．　ドナー細胞、組織又は臓器が、ドナー由来の心臓、肺、肝臓、小腸、皮膚、腎臓または膵臓の一部もしくは全部である、項１～５のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
項７．　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質が同一製剤に含まれている、項１～６のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
項８．　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームを含む製剤と、共刺激経路を阻害する物質を含む製剤とからなる２剤形態である、項１～６のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
項９．　ドナー造血細胞が移植されたレシピエント又はドナー造血細胞が移植されるレシピエントに対し、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を投与することを含む、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する方法。
項１０．　ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられる免疫寛容誘導剤の製造のための、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームと、共刺激経路を阻害する物質の使用。
項１１．　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム及び共刺激経路を阻害する物質を含む、造血細胞キメラ誘導剤。
項１２．　ドナー造血細胞が移植されたレシピエント又はドナー造血細胞が移植されるレシピエントに投与される、項１１に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
項１３．　前記ドナー造血細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の造血細胞である、項１２に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
項１４．　共刺激経路が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路である、項１１～１３のいずれか一項に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
項１５．　共刺激経路を阻害する物質が、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、項１１～１４のいずれか一項に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
項１６．　ドナー造血細胞が移植されたレシピエント又はドナー造血細胞が移植されるレシピエントに対し、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を投与することを含む、レシピエント体内で造血細胞キメラの形成を誘導する方法。
項１７．　造血細胞キメラ誘導剤の製造のための、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームと、共刺激経路を阻害する物質の使用。
　本発明の免疫寛容誘導剤によれば、ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法において、レシピエント体内での造血細胞キメラを作製し、これを安定に維持させることができ、移植免疫における免疫寛容を効果的に誘導することができる。また、本発明の免疫寛容誘導剤は、レシピエント体内で、制御性T細胞を増殖し易くすることができ、このことも、免疫寛容を効果的に誘導していることに寄与していると考えられる。
　更に、従来、移植治療では、放射線照射を中心とした前処理が不可欠であるが、本発明の免疫寛容誘導剤を使用する場合、効果的に免疫寛容を誘導できるので、このような前処理を緩やかな条件に設定して、レシピエントの負担の軽減できる可能性もある。
　また、造血細胞移植によって治療を行うことのある全身性硬化症、全身エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性硬化症、クローン病、自己免疫性血球減少症など難治性自己免疫疾患においても免疫寛容を効率的に誘導できる可能性がある。
　加えて、本発明の造血細胞キメラ誘導剤は、レシピエント体内での造血細胞キメラを効率的に作製させることができるので、移植免疫における寛容を誘導する目的に使用されるだけでなく、実験モデル動物として利用できる造血細胞キメラ非ヒト動物の作製も可能になる。
実施例１において、レシピエントマウスの末梢血単球と脾細胞について、MHC classI抗原をレシピエントタイプ(H2Kd)とドナータイプ(H2Kb)の両方で染色した結果を示す。 実施例１において、骨髄移植200日後のTBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群について、末梢血、脾臓、リンパ節、及び骨髄でのドナー細胞の生着を評価した結果を示す。 実施例１において、骨髄移植200日後のTBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群について、胸腺中のドナー細胞の割合（右図）、血液細胞におけるドナーMHC class I抗原の発現を評価した結果を示す。 実施例１において、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群及びTBI+anti-CD40L群の骨髄移植後の体重変化を測定した結果を示す。 実施例１において、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群の移植１００日後の小腸（左側）と肝臓（右側）の組織像において移植片拒絶を認めないことを観察した結果を示す。 実施例１において、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群で認められたCD24(+)CD4(-)CD8(-)T細胞について、ドナーMHC class I抗原の発現を評価した結果を示す。 実施例２において、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群とTBI+anti-CD40L群に、心臓移植を行い、心臓移植片の生着を観察した結果を示す。 実施例２において、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群の心移植100日後の組織像において拒絶を認めないことを観察した結果を示す。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、骨髄移植後2、24、及び48時間後に血清中IL-2を測定した結果を示す。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、骨髄移植後2、24、及び48時間後に血清中IL-4を測定した結果を示す。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、骨髄移植後2、24、及び48時間後に血清中IL-10を測定した結果を示す。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、骨髄移植後2、24、及び48時間後に血清中IL-12を測定した結果を示す。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、骨髄移植後2、24、及び48時間後に血清中IFN-γを測定した結果を示す。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、脾細胞中のTregの割合と活性化を測定した結果を示す図である。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、脾細胞中のTregの割合と活性化を測定した結果を示す図である。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、脾細胞中のTregの割合と活性化を測定した結果を示す図である。 実施例３において、各群のレシピエントマウスについて、脾細胞中のTregの割合と活性化を測定した結果を示す図である。 実施例３において、anti-CD25抗体を投与することでTreg（および活性化Treg:aTreg）が消去したことを示す図である。
１．免疫寛容誘導剤
　本発明の免疫寛容誘導剤は、ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられるものであって、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を含むことを特徴とする。以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明に使用されるα－ガラクトシルセラミド（α-GalCer）とは、ガラクトースとセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、具体的には、ＷＯ９４／０９０２０、ＷＯ９４／０２１６８、ＷＯ９４／２４１４２、ＷＯ９８／４４９２８、Science, 278, p.1626-1629, 1997等に開示されているものを挙げることができる。本発明では、免疫寛容の誘導効果をより一層向上させるとの観点から、α-GalCerとして、所謂KRN7000、即ち（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－Ｏ－（α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－ヘキサコサノイルアミノ－１，３，４－オクタデカントリオールが好適に使用される。
　本発明において、α-GalCerはリポソームに包含された状態で使用される。即ち、本発明では、α-GalCerを含有するリポソームを使用する。α-GalCerのセラミド部分は脂溶性を示すため、リポソームに包含されたα-GalCerは、通常、リポソームの脂質二重膜層にα-GalCerが局在化した構造になる。以下、α-GalCerを含有するリポソームについて、リポソーム化α-GalCerと表記することもある。
　本発明に使用されるリポソーム化α-GalCerとしては、α-GalCerとしてKRN7000を使用して製造されたKRN7000含有リポソームを好ましい例として挙げることができる。またBiol Blood Marrow Transplant. 1-15 (2011)に記載の方法と同様の方法で調製した、KRN7000含有リポソーム製剤であるRGI-2001（株式会社レグイミューン製）を特に好ましい例として挙げることができる。
　本発明においてリポソームに包含されたα-GalCerを使用する場合、リポソームの構成脂質とα-GalCerの比率については、当業者であれば用途に応じて適宜設定することができ、特に制限されないが、例えば、リポソーム構成脂質の総量１００重量部当たり、α-GalCerが０．０５～１００重量部、好ましくは０．５～２０重量部が例示される。
　リポソーム化α-GalCerに使用される脂質（リポソーム構成脂質）は、二重膜構造を形成可能であることを限度として、特に制限されない。リポソーム構成脂質としては、具体的には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）等のジアシルホスファチジルコリン類；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）等のジアシルホスファチジルグリセロール類；コレステロール、３β－[Ｎ－(ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール（ＴＣ－Ｃｈｏｌ）、トコフェロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、チモステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等のステロール類；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ポリエチレングリコールホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）等のホスファチジルエタノールアミン類；ジミリストイルホスファチジン酸等のホスファチジン類；ガングリオシドＧＭ１等のガングリオシド類；ポリエチレングリコールパルミテート、ポリエチレングリコールミリスチレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　上記リポソーム構成脂質は、一種単独で使用してもよいが、二種以上を組み合わせて使用することが好ましい。リポソーム構成脂質の組み合わせの好適な例として、ジアシルホスファチジルコリン類とジアシルホスファチジルグリセロール類とステロール類の組み合わせ、並びにジアシルホスファチジルコリン類とステロール類の組み合わせ；更に好ましくは、ＤＰＰＣとＤＯＰＣとＤＰＰＧとコレステロールとの組み合わせ、並びにＤＯＰＣとコレステロール及び／又はＤＣ－Ｃｈｏｌとの組み合わせが挙げられる。
　２種以上のリポソーム構成脂質を組み合わせて使用する場合、各脂質の配合比率については、リポソームに必要とされる大きさや流動性等を考慮に入れて適宜設定される。例えば、ジアシルホスファチジルコリン類とジアシルホスファチジルグリセロール類とステロール類との組み合わせを採用する場合であれば、ジアシルホスファチジルコリン類：ジアシルホスファチジルグリセロール類：ステロール類が、モル比で１：０．１２５～０．７５：０．１２５～１、好ましくは１：０．１４～０．４：０．１４～０．６が挙げられる。また、例えば、ＤＰＰＣとＤＯＰＣとＤＰＰＧとコレステロールとの組み合わせを採用する場合であれば、ＤＰＰＣ：ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロールが、モル比で１：０．１６～１．６５：０．１６～１．０：０．１６～１．３、好ましくは１：０．４～０．７５：０．２～０．５：０．３～０．７５が挙げられる。また、例えば、ジアシルホスファチジルコリン類（好ましくはＤＯＰＣ）とステロール類（好ましくはコレステロール及び／又はＤＣ－Ｃｈｏｌ）との組み合わせを採用する場合であれば、ジアシルホスファチジルコリン類：ステロール類が、モル比で１：０．０５～４、好ましくは１：０．１～１が挙げられる。
　α-GalCerをリポソーム化する場合、リポソームには、必要に応じて、ステアリルアミン、オレイルアミン等のカチオン性化合物；ジセチルホスフェート等のアニオン性化合物；膜タンパク質を含有させてもよく、これらの配合比率については適宜設定することができる。
　α-GalCerをリポソーム化する場合、リポソームのサイズについては、特に制限されないが、通常は平均粒径が５～１０００ｎｍ、好ましくは１００～４００ｎｍが挙げられる。リポソームの平均粒径は、動的光散乱法により測定される。また、リポソームの構造についても特に制限されず、MLV（multilamellar vesicles）、DRV（dehydration-rehydration vesicles）、LUV（large umilamellar vesicles）、又はSUV（small unilamellar vesicles）のいずれであってもよい。
　α-GalCerをリポソーム化する場合、リポソームに内包される溶液としては、水、緩衝液、生理食塩水等の薬学的に許容される水性担体が挙げられる。
　リポソーム化されたα-GalCerは、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知のリポソームの製造方法を用いて作製される。また、所定のポアサイズのフィルターを通過させることにより、リポソームの粒度分布を調整することができる。また、公知の方法に従って、MLVから一枚膜リポソームへの転換、一枚膜リポソームからMLVの転換を行うこともできる。
　本発明において用いられる「共刺激経路を阻害する物質」（以下、単に阻害物質と表記することもある）とは、Ｔ細胞を活性化するために抗原提示細胞とＴ細胞との間でなされる共刺激経路を阻害する物質である。当該阻害物質としては、共刺激経路を阻害できることを限度として特に制限されず、低分子化合物、抗体、タンパク質、核酸（アプタマー、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ等）等を使用することができる。
　共刺激経路としては、具体的には、ＣＤ８６／ＣＤ２８共刺激経路、ＣＤ８０／ＣＤ２８共刺激経路、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路、OX４０／OX４０L共刺激経路、ICOS／ICOSL共刺激経路等が挙げられる。本発明において用いられる阻害物質は、前記共刺激経路を構成する共刺激分子又は補助刺激分子いずれか一方の機能を阻害するものであってもよく、またこれらの双方の機能を阻害するものであってもよい。当該阻害物質としては、具体的には、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌの中の少なくとも１種に対して機能を阻害できる低分子化合物；これらの少なくとも１種に対して結合する抗体；これらの１種に対するアプタマー、アンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ等が挙げられる。
　当該阻害物質の阻害対象となる共刺激経路として、好ましくはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路が挙げられる。即ち、当該阻害物質の好適な例として、ＣＤ４０及び／又はＣＤ４０Ｌに対して機能を阻害できる低分子化合物；ＣＤ４０及び／又はＣＤ４０Ｌに対して結合する抗体；ＣＤ４０及び／又はＣＤ４０Ｌに対するアプタマー、アンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ等が挙げられる。これらの中でも、更に好ましくは抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体が挙げられる。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路を阻害する物質とリポソーム化されたα-GalCerを同時に用いることによって、ドナー造血細胞のレシピエントへの移植によりなされる造血細胞キメラの製造をより効率的に誘導し、その結果、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容を一層効果的にレシピエントに誘導することが可能となる。
　本発明の免疫寛容誘導剤において、α-GalCerを含有するリポソームと共刺激経路を阻害する物質との比率については、特に制限されないが、共刺激経路を阻害する物質に対して、α-GalCerを含有するリポソームがα-GalCer重量換算で０．００１～５０００重量部、好ましくは０．０５～１００重量部、更に好ましくは０．２５～２０重量部が挙げられる。
　本発明の免疫寛容誘導剤において、α-GalCerを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質は、同一製剤中に含まれていてもよく、また、それぞれ異なる２つの製剤に含まれていてもよい。即ち、本発明の免疫寛容誘導剤の一態様として、α-GalCerを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を含む免疫寛容誘導用製剤（１剤形態）が挙げられ、また他の一態様として、α-GalCerを含有するリポソームを含む製剤と、共刺激経路を阻害する物質を含む製剤からなる免疫寛容誘導用キット（２剤形態）が挙げられる。
　本発明の免疫寛容誘導剤の剤型については、その投与形態に応じて適宜設定でき、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等のいずれの剤型であってもよい。また、本発明の免疫寛容誘導剤が２剤形態である場合、α-GalCerを含有するリポソームを含む製剤と、共刺激経路を阻害する物質を含む製剤は、それぞれ同じ剤型であってもよく、また異なる製剤であってもよい。
　本発明の免疫寛容誘導剤は、α-GalCerを含有するリポソーム及び共刺激経路を阻害する物質以外に、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含み、所望の剤型に調製される。薬学的に許容される担体としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の水性担体；ショ糖、果糖、白糖、グルコース、乳糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類；グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール；非イオン界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰性界面活性剤、両性界面活性剤等の界面活性剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース等のセルロース誘導体；抗酸化剤；ｐＨ調節剤等が挙げられる。
　本発明の免疫寛容誘導剤は、ドナー細胞、組織又は臓器の移植を行う患者（レシピエント）に投与されるものであって、ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、移植細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法において使用される。即ち、本発明の免疫寛容誘導剤は、細胞、組織又は臓器の移植が必要とされているレシピエントにおいて、当該移植に先立ってあるいは同時に、ドナー細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導するためにドナー造血細胞を移植する際に投与される。
　患者に移植されるドナー細胞、組織又は臓器については、特に制限されないが、例えば、ドナー由来の心臓、肺、肝臓、小腸、皮膚、腎臓又は膵臓の一部若しくは全部が挙げられる。
　本発明において、「ドナー造血細胞」とは、レシピエントに移植されるドナー側の造血細胞であって、血球系細胞に分化可能な幹細胞のことをいう。レシピエントに移植される造血細胞の由来組織については、特に制限されず、例えば、骨髄、臍帯血、又は末梢血そのものであってもよく、また骨髄、臍帯血、又は末梢血に由来する造血細胞であってもよい。レシピエントに移植される造血細胞として、好ましくは、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の造血細胞が挙げられる。ドナー造血細胞の移植量については、免疫寛容を誘導できる有効量であればよく、レシピエントの症状、年齢等に応じて適宜設定すればよいが、通常1x106～3x108　cells/kg程度が挙げられる。
　本発明の免疫寛容誘導剤の投与は、ドナー造血細胞の移植前72時間～移植後72時間の間に行えばよいが、好ましくはドナー造血細胞の移植と同時又は移植後24時間以内が挙げられる。
　本発明の免疫寛容誘導剤が２剤形態である場合、α-GalCerを含有するリポソームを含む製剤と、共刺激経路を阻害する物質を含む製剤の投与順については、特に制限されず、これらを同時に又は任意の順で投与すればよい。
　本発明の免疫寛容誘導剤の投与形態については、非経口投与、経口投与のいずれであってもよく、具体的には、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、関節内投与、粘膜投与等が挙げられる。これらの投与形態の中でも、免疫寛容の誘導をより一層向上させるという観点から、非経口投与、とりわけ静脈内投与が好適である。
　本発明の免疫寛容誘導剤の投与対象としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類が挙げられる。好ましくはヒトである。
　本発明の免疫寛容誘導剤の投与量については、免疫寛容を誘導できる有効量であればよく、レシピエントの症状、年齢等に応じて適宜設定すればよいが、投与されるα-GalCer量換算で1～100μｇ／ｋｇ程度が挙げられる。
　通常、造血細胞の移植は、正常な血液を作ることが困難となった疾患を持つ患者に対して行われるが、本発明では、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導するための造血細胞キメラの作製のために行われる。即ち、レシピエントに対して、ドナー造血細胞の移植と本発明の免疫寛容誘導剤の投与を行うことにより、レシピエント体内で造血細胞キメラが効率的に作製され、当該造血細胞キメラが、移植細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容を誘導することが可能になる。
　また通常の移植治療ではレシピエントに対する全身放射線照射などの前処理が不可欠である。そしてこの前処理はレシピエントの造血細胞を死滅させる目的で行われるため１０～５０Ｇｙ程度の高い放射線量が必要であり、レシピエントへの負担が大きい。
　しかしながら、本発明の免疫寛容誘導剤を使用し、移植治療の前提として免疫寛容を誘導して造血細胞キメラを作製する場合においては、後述する実施例で示されるように、前処理における放射線照射が１～３Ｇｙ程度の緩やかな、造血細胞の非破壊的条件であっても効率的に免疫寛容を誘導できる。したがってレシピエントの負担を軽減でき、それゆえ免疫寛容の誘導を難治性自己免疫疾患に羅患したレシピエントなど、これまで適用外であった患者にも適用拡張できる可能性がある。
　本発明において、「造血細胞キメラ」とは、レシピエント体内で、ドナー造血細胞とレシピエント造血細胞が共存する状態を指す。造血細胞キメラの状態では、胸腺でドナー由来抗原提示細胞がドナー反応性T細胞を除去するため、ドナー細胞、組織または臓器に対する特異的な免疫寛容が成立する。
　ところで背景技術の項でも述べたとおり、従来公知の造血細胞キメラの製造では、放射線照射だけでなくＴ細胞の機能を押さえる物質（抗T細胞抗体など）を用い、さらに共刺激経路を阻害する物質を大量に、かつ複数種類用いるようなプロトコールを採用している。しかしながら、それでもなおFull alloではキメラの誘導率が低下するなど、依然として実用に適した製造法は確立していない。
　本発明の免疫寛容誘導剤によれば、免疫寛容誘導の前提となる造血細胞キメラの作製において、共刺激経路を阻害する物質はわずかな量（例えば50mg/kg以下であり、共刺激経路を阻害する物質が抗CD40L抗体であれば、25mg/kg程度。すなわち体重20gのマウスに投与する場合で1mg以下であり、共刺激経路を阻害する物質が抗CD40L抗体であれば0.5mg程度）でよいし、複数種類必要である訳でもない。後述する実施例は、それでも長期間にわたって安定に存在する造血細胞キメラを誘導できることを示している。
　また本発明の免疫寛容誘導剤によれば、Facilitating cellのような、toleranceを導入しやすい細胞をex vivoで調製するといった必要もない。
　すなわち、本発明の免疫寛容誘導剤は、造血細胞キメラ誘導において初めて実用化し得る免疫寛容誘導剤であることが理解できる。
　以上のことから、本発明の免疫寛容誘導剤は、造血細胞キメラの誘導に際し低線量の放射線使用で済むばかりでなく、副作用や細胞障害性のある薬剤（共刺激経路を阻害する物質）をできるだけ使用しないで済むものであり、初めて実用化し得る免疫慣用誘導剤であることが分かる。このような顕著な効果を有する免疫寛容誘導剤の有効成分として、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームおよび共刺激経路を阻害する物質が含まれることは、公知の非特許文献のいずれにも記載が無く、たとえ当業者であっても容易に想到することはできない。
２．造血細胞キメラ誘導剤
　前述するように、ドナー造血細胞をレシピエントに移植する際に、α-GalCerを含有するリポソームと、共刺激経路を阻害する物質を組み合わせて投与することにより、レシピエント体内での造血細胞キメラの作製が促進される。従って本発明は、更に、α-GalCerを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を含む造血細胞キメラ誘導剤をも提供する。更に、当該造血細胞キメラ誘導剤を用いた造血細胞キメラ動物の作製方法をも提供する。
　当該造血細胞キメラ誘導剤について、含有成分、剤型、投与対象、投与方法等については、前記免疫寛容誘導剤の場合と同様である。また、当該造血細胞キメラ動物の作製方法についても、前記免疫寛容誘導剤の欄に記載の通りである。
　以下に実施例を示して本発明を詳細に説明する。但し本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１：骨髄移植および骨髄キメラの作成
　マウスは、Japan Slc, Inc.より8週齢から12週齢の雄のC57BL/6NCrSlc（B6, H-2b）、BALB/cCrSlc(BALB/c, H-2d)、C3H/HeSlc(C3H, H-2k)を購入した。マウスは東京女子医科大学の実験動物中央施設のSPF環境下にて、NIHの動物管理ガイドラインに準じて飼育した。
　骨髄移植の2～3時間前に、レシピエントBALB/cマウスに、TBI（Total body Irradiation）3Gy (X線発生装置(MBR-1520R-3、Hitachi medical Corp. Tokyo, Japan)を照射した。次いでAnti-CD40L抗体をPBS (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)に希釈して、Anti-CD40L抗体0.5mgを骨髄移植直後に腹腔内投与した。Anti-CD40L抗体はBixcell(West Lebanon, NH, USA)より購入した。更に国際公開第2005/120574号パンフレットと同様の方法で得られたKRN7000含有リポソーム（脂質量換算でKRN7000を10%含有する）をHanks' Balanced Salt Solution (HBSS; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)に希釈して、KRN7000換算で0.01μg-100μg/kgの用量で骨髄移植の30分後に尾静脈から静脈内投与した。
　ドナーB6マウスを安楽死させた後に、大腿骨、脛骨を採取し、21ゲージ注射針を用いて骨髄腔より骨髄を洗い出した。骨髄細胞をHBSSに懸濁し、70μmのナイロンメッシュを通した後に1800rpm, 5分間遠心した。2mlのACK Lysing Buffer (Lonza, MD, USA)と室温で10分反応させた後、HBSSに再懸濁して細胞数をカウントし、1匹あたり骨髄細胞2x107個に調整し、レシピエントBalb/cマウスの尾静脈より静注した（TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群）。
　骨髄移植から28～200日後に、レシピエントBALB/cマウスから末梢血を採取し、室温でACK Lysing Buffer(Lonza, MD, USA)と5分間反応させ、赤血球を破砕した。得られた末梢血単球PBMCのMHC class I抗原をレシピエントタイプ(PE-conjugated anti-H2Kd)とドナータイプ(FITC-conjugated anti-H2Kb)の両方で染色した。更に、血球の分画を判別するためにanti-TCRβ, anti-B220, anti-Gr1, anti-MAC1(BD Bioscience, CA, USA)を用いて染色した。染色は1x106の細胞を100μlのCell Staining Buffer(CSB: 5％Fetal Bovine Serum(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)と0.5gのSodium azide(Sigma aldrich, St. Louis, MO, USA)を加えたPBS)に懸濁し、10μLの各種抗体を加え4℃で30分間反応させた。BD FACSCant II(BD Bioscience)にて測定しFACSDiva(BD Bioscience)にて解析した。
　また、比較のために、放射線照射のみで骨髄移植を行った場合（TBI群）、放射線照射とKRN7000含有リポソーム投与を行った場合（TBI+ KRN7000含有リポソーム群）、及び放射線照射とanti-CD40L抗体投与を行った場合（TBI+anti-CD40L群）についても、上記と同様に試験を行った。また、本試験は、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群はn=25、TBI群はn=8、TBI+ KRN7000含有リポソーム群はn=8、TBI+anti-CD40L群はn=22にて実施した。
　得られた結果を表１に示す。表１から明らかなように、TBI群、TBI+ KRN7000含有リポソーム群、及びTBI+anti-CD40L群では、骨髄移植28日後の末梢血上にドナー細胞は認められず、移植片は拒絶されていた。一方、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群では、92.0％のマウスで末梢血（PBL）上にドナー細胞の存在が確認された(図１参照)。また、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群のマウスでは、一度生着したドナー細胞はその後も消失することなく、移植後200日目でもその存在が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群と同一プロトコールにてKRN7000含有リポソームの投与量を変えたところ、表２に示すように、骨髄移植14日後におけるドナー細胞の生着はKRN7000含有リポソームの用量に依存していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　脾臓（SPL）においても、末梢血と同様に、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群でのみドナー細胞の生着が認められた(図１参照)。また、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群において、骨髄移植200日後では、ドナー細胞は、脾臓だけでなく、リンパ節、骨髄、そして胸腺にも生着していることも確認された(図２参照)。また、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群において、骨髄移植200日後には、ドナーMHC class I抗原の発現は、TCR-β陽性細胞（T-cells）、B220陽性細胞（B-cells）、MAC-1陽性マクロファージ（Mq）、Gr-1陽性顆粒球（Granulocyte）と、全ての系列の血液細胞に発現が認められた(図３参照)。
　以上の結果から、anti-CD40L抗体とKRN7000含有リポソームとを骨髄移植後に併用投与することにより、長期間安定な骨髄キメラを作製できることが示された。
　このように、本発明の免疫寛容誘導剤によりドナー細胞は拒絶されることなく各組織に生着しているが、特記すべきは、図４Ａに示すように、本発明の免疫寛容誘導剤を投与したレシピエントマウスにはGVHDを疑わせるような体重減少や消化器症状は一切認められなかったことである。通常、骨髄移植後にドナーT細胞が認められればGVHDの発症が懸念されるが、本発明の免疫寛容誘導剤を用いた場合ではドナーT細胞が宿主を攻撃している所見は認めない（図４Ｂ）。実際に、In vitroにおいても、キメラマウスより抽出されたT細胞の3rd partyに対しての反応性は保たれているものの、レシピエント及びドナーに対する反応性は低下していることが確認されている。即ち、ドナー特異的に反応するT細胞が抑制されるのと同時に、ドナー側のT細胞のレシピエントへの反応性も抑制されていることが示され、In vivoでドナー細胞が拒絶されず、GVHDも起こらないことと一致している。実際に、胸腺内に認められるドナーMHC class Iの発現は、成熟したCD4 single positive, CD8 single positiveだけではなく、pre-T細胞であるCD24(+)CD4(-)CD8(-) T細胞にも認められていたことから(図５参照)、キメラマウス（移植後のレシピエントマウス）に認められるドナーT細胞は胸腺内での教育を受けてから末梢を循環していると考えられる。
　このことから、胸腺内に陽性選択（positive selection）にてドナーT細胞を誘導するドナー由来の皮質胸腺上皮細胞(cortical thymic epithelial cell：cTEC)が存在することが示唆され、またそうであるならば、同時にドナー由来の胸腺上皮細胞（medullary thymicepithelial cell：mTEC）によるホストT細胞の陰性選択（negative selection）が存在することも類推される。こうしたAllo抗原に対する中枢性免疫寛容の獲得が、本発明の免疫寛容誘導剤を用いた造血細胞キメラ成立の機序であると類推される。
実施例２：心臓移植
　実施例１におけるTBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群とTBI+anti-CD40L群の骨髄移植後14日目に、骨髄ドナーと同一ドナー（B6マウス）から異所性心移植術を施行した。ドナー、レシピエントマウスの両方をPentobarbital (Dainippon Sumitomo Pharma, Osaka, Japan)を腹腔内投与して麻酔をかけた。ドナーマウスを開腹して腹部大動脈から1％ヘパリン生理食塩水を注入して血液を灌流したのち、開胸して心臓を摘出した。レシピエントマウスを開腹して腹部大動脈と大静脈に、ドナー心臓の上行大動脈と肺動脈をそれぞれ10-0ナイロン糸にて端側吻合した。術後は用手にて腹部の移植心の拍動を確認し、拍動が確認できなくなった際には開腹して直視下に心拍の停止を確認した。
　安楽死させたマウスから脾臓を摘出し、組織を擦りつぶして細胞をCSBに懸濁した。anti-CD4, anti-CD25(BD Bioscience)にて細胞表面抗原を染色し、FoxP3染色キット(eBioscience, San Diego, CA, USA)を用いて細胞を固定、透過化し、anti-FoxP3, anti-Ki-67(eBioscience)にて核内染色をした。
　また、比較のために、実施例１におけるTBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群の骨髄移植後14日目に、骨髄ドナーと異なるドナー（C3Hマウス）から異所性心移植術も施行し、上記と同条件で試験を行った。
　得られた結果を図６に示す。図６から明らかなように、骨髄キメラにならないTBI+anti-CD40L群では、骨髄移植片と同様にgraftは全例で拒絶されたのに対して、骨髄キメラを形成できたTBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群（実線）では、B6心移植片を拒絶することなく生着していた。移植片の病理所見では、移植後100日経過しても細胞浸潤を認めず、また慢性拒絶を示唆する血管病変も存在しなかった(図７参照)。また、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群（大きい点線）では、C3H心臓を移植した場合には、TBI+anti-CD40L群（細かい点線）と同じように移植片は拒絶され、この移植臓器免疫寛容がドナー特異的であることがわかった。
実施例３：骨髄移植後のサイトカイン産生と制御性T細胞の評価
　実施例１における各群において、骨髄移植後2、24、及び48時間後に、血清サイトカイン（IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ）値を測定した。結果を図８～１２に示す。
　TBI+anti-CD40L群では、IL-10が移植2時間後にわずかに増加しているが、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群及びTBI+ KRN7000含有リポソーム群に比べるとはるかに少ない。しかしながら、これらのサイトカインは移植後24時間後には消退した。IL-12も、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群及びTBI+ KRN7000含有リポソーム群では移植後に速やかに増加しているが、TBI+ KRN7000含有リポソーム群では24時間後にさらにIL-12産生が増強しているのに対し、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群ではIL-12も24時間後に消退していた。TBI+ KRN7000含有リポソーム群では24時間値でのIL-12高値に引き続き、IFN-γの著明な増加が認められた。一方、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群ではこのIFN-γの24時間後の増加は認められなかった。IFN-γの産生はIL-12依存性であり、このIL-12産生がCD40-CD40Lの副刺激系に依存的であることから、anti-CD40L抗体によるこの経路の遮断が、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群でのIFN-γの産生を抑制したと考えられる。
　以上の結果から、anti-CD40L抗体とKRN7000含有リポソームの併用投与により、T細胞をTh1へと誘導するサイトカイン産生が抑えられ、Th2へ誘導するサイトカイン産生が優位となったことが示された。
　TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群で増加するIL-2やIL-10は、免疫寛容において重要な役割を担うとされるTreg（制御性T細胞）を増強する因子として知られている。実際に、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群では他の群と比べて、移植後28日目の脾細胞中のTregが増加していることが確認された(図１３Ａ、ＢおよびＣ参照)。更に、Ki67陽性で示される活性化Tregも、TBI+anti-CD40L+ KRN7000含有リポソーム群で有意に増加していることが示された(図１３ＡおよびＤ参照)。以上の結果から、anti-CD40L抗体とKRN7000含有リポソームを併用することでTregが数的にも機能的にも増強されたことが分かった。
　また、TBI+anti-CD40L+KRN7000含有リポソーム群において、表３に示す条件でanti-CD25抗体を投与し、骨髄移植から14日後に、骨髄キメラの成立の有無と脾細胞中のTreg数について評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　得られた結果を表４及び図１４に示す。骨髄移植-1～18日後までの間に、anti-CD25抗体の投与によりTregを消去すると骨髄キメラが成立しなくなったことから（Ｂ群）、anti-CD40L抗体とKRN7000含有リポソームを用いた免疫寛容の誘導には、Tregの増強が必須であることが推察される。興味深いことに、骨髄移植28日後以降に、anti-CD25抗体の投与によりTregを消去しても、骨髄キメラは解除されなかった（Ｃ群）。即ち、anti-CD40L抗体とKRN7000含有リポソームを用いた免疫寛容の誘導には、一度中枢性寛容が成立すれば、もはやTregによる寛容の維持は必須ではないと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (17)

  1. 　ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられる免疫寛容誘導剤であって、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を含む、免疫寛容誘導剤。
  2. 　共刺激経路が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路である、請求項１に記載の免疫寛容誘導剤。
  3. 　共刺激経路を阻害する物質が、抗ＣＤ４０抗体又は抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項１又は２に記載の免疫寛容誘導剤。
  4. 　移植されるドナー造血細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の造血細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
  5. 　移植されるドナー造血細胞が、骨髄である、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
  6. 　ドナー細胞、組織又は臓器が、ドナー由来の心臓、肺、肝臓、小腸、皮膚、腎臓または膵臓の一部もしくは全部である、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
  7. 　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質が同一製剤に含まれている、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
  8. 　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームを含む製剤と、共刺激経路を阻害する物質を含む製剤とからなる２剤形態である、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫寛容誘導剤。
  9. 　ドナー造血細胞が移植されたレシピエント又はドナー造血細胞が移植されるレシピエントに対し、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を投与することを含む、ドナー細胞、組織または臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する方法。
  10. 　ドナー造血細胞をレシピエントに移植することにより、ドナー細胞、組織又は臓器に対する免疫寛容をレシピエントに誘導する療法に用いられる免疫寛容誘導剤の製造のための、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームと、共刺激経路を阻害する物質の使用。
  11. 　α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム及び共刺激経路を阻害する物質を含む、造血細胞キメラ誘導剤。
  12. 　ドナー造血細胞が移植されたレシピエント又はドナー造血細胞が移植されるレシピエントに投与される、請求項１１に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
  13. 　前記ドナー造血細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の造血細胞である、請求項１２に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
  14. 　共刺激経路が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激経路である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
  15. 　共刺激経路を阻害する物質が、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の造血細胞キメラ誘導剤。
  16. 　ドナー造血細胞が移植されたレシピエント又はドナー造血細胞が移植されるレシピエントに対し、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソーム、及び共刺激経路を阻害する物質を投与することを含む、レシピエント体内で造血細胞キメラの形成を誘導する方法。
  17. 　造血細胞キメラ誘導剤の製造のための、α－ガラクトシルセラミドを含有するリポソームと、共刺激経路を阻害する物質の使用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019107431A1 (ja) * 2017-11-28 2019-06-06 株式会社レグイミューン ハプロ移植増強剤

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018006828A (es) * 2015-12-04 2018-08-09 Hutchinson Fred Cancer Res Usos de poblaciones expandidas de celulas madre/progenitoras hematopoyeticas.
CN111249451B (zh) * 2020-01-20 2022-11-04 成都医学院 一种糖脂类抗原注射液及其制备方法
US20240059781A1 (en) * 2021-01-06 2024-02-22 Tonix Pharma Limited Methods of inducing immune tolerance with modified anti-cd154 antibodies

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002168A1 (en) 1992-07-16 1994-02-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel medicinal composition
WO1994009020A1 (en) 1992-10-22 1994-04-28 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel shingoglycolipid and use thereof
WO1994024142A1 (en) 1993-04-15 1994-10-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel sphingoglycolipid and use thereof
WO1998044928A1 (en) 1997-04-10 1998-10-15 Kirin Beer Kabushiki Kaisha NKT CELL ACTIVATORS CONTAINING α-GLYCOSYLCERAMIDES
JP2005538115A (ja) * 2002-07-31 2005-12-15 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト ＬＦＡ−１インヒビターおよび同時刺激インヒビターおよび／またはｍＴＯＲインヒビターの組合せを用いる寛容誘導
WO2005120574A1 (ja) 2004-06-11 2005-12-22 Riken 調節性細胞リガンドをリポソームに含有させてなる医薬
WO2007080977A1 (ja) * 2006-01-13 2007-07-19 Riken 免疫疾患の予防ないし治療剤および方法
JP2008273842A (ja) * 2005-08-11 2008-11-13 Institute Of Physical & Chemical Research 移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030031652A1 (en) * 2001-04-16 2003-02-13 Bernhard Hering Systems and methods for inducing mixed chimerism
EP1761311A2 (en) * 2004-04-27 2007-03-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
WO2008036374A2 (en) * 2006-09-21 2008-03-27 Medistem Laboratories, Inc. Allogeneic stem cell transplants in non-conditioned recipients
PT2683406T (pt) * 2011-03-11 2019-07-08 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Anticorpos anti-cd40 e utilização dos mesmos
KR20230104990A (ko) * 2011-04-29 2023-07-11 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 치료적 단백질에 대해 면역 반응을 감소시키는 관용원성합성 나노운반체

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002168A1 (en) 1992-07-16 1994-02-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel medicinal composition
WO1994009020A1 (en) 1992-10-22 1994-04-28 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel shingoglycolipid and use thereof
WO1994024142A1 (en) 1993-04-15 1994-10-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel sphingoglycolipid and use thereof
WO1998044928A1 (en) 1997-04-10 1998-10-15 Kirin Beer Kabushiki Kaisha NKT CELL ACTIVATORS CONTAINING α-GLYCOSYLCERAMIDES
JP2005538115A (ja) * 2002-07-31 2005-12-15 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト ＬＦＡ−１インヒビターおよび同時刺激インヒビターおよび／またはｍＴＯＲインヒビターの組合せを用いる寛容誘導
WO2005120574A1 (ja) 2004-06-11 2005-12-22 Riken 調節性細胞リガンドをリポソームに含有させてなる医薬
JP2008273842A (ja) * 2005-08-11 2008-11-13 Institute Of Physical & Chemical Research 移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法
WO2007080977A1 (ja) * 2006-01-13 2007-07-19 Riken 免疫疾患の予防ないし治療剤および方法

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIGENZAHN S; BLAHA P; KOPORC Z ET AL.: "The role of non-deletional tolerance mechanisms in a murine model of mixed chimerism with costimulation blockade", AM J TRANSPLANT, vol. 5, no. 6, 2005, pages 1237
BIOL BLOOD MARROW TRANSPLANT., 2011, pages 1 - 15
CARDENAS PA; HUANG Y; ILDSTAD ST: "The role of pDC, recipient T(reg) and donor T(reg) in HSC engraftment: Mechanisms of facilitation", CHIMERISM, vol. 2, no. 3, 2011, pages 65
HAERYFAR SMM; LAN Z; LEON-PONTE M ET AL.: "Prolongation of Cardiac Allograft Survival by Rapamycin and the Invariant Natural Killer T Cell Glycolipid Agonist OCH", TRANSPLANTATION, vol. 86, no. 3, 2008, pages 460
HAYAKAWA Y; TAKEDA K; YAGITA H; VAN KAER L; SAIKI I; OKUMURA K.: "Differential regulation ofTh1 and Th2 functions of NKT cells by CD28 and CD40 costimulatory pathways", J IMMUNOL, vol. 166, no. 10, 2001, pages 6012, XP002303681
HIGUCHI M; ZENG D; SHIZURU J ET AL.: "Immune tolerance to combined organ and bone marrow transplants after fractionated lymphoid irradiation involves regulatory NK T cells and clonal deletion", J IMMUNOL, vol. 169, no. 10, 2002, pages 5564
ITO H; KURTZ J; SHAFFER J; SYKES M.: "CD4 T cell-mediated alloresistance to fully MHC-mismatched allogeneic bone marrow engraftment is dependent on CD40-CD40 ligand interactions, and lasting T cell tolerance is induced by bone marrow transplantation with initial blockade of this pathway", J IMMUNOL, vol. 166, no. 5, 2001, pages 2970, XP055290729, DOI: doi:10.4049/jimmunol.166.5.2970
LAN F; ZENG D; HIGUCHI M; HUIE P; HIGGINS JP; STROBER S.: "Predominance of NK1.1+TCR alpha beta+ or DX5+TCR alpha beta+ T cells in mice conditioned with fractionated lymphoid irradiation protects against graft-versus-host disease: ''natural suppressor'' cells", J IMMUNOL, vol. 167, no. 4, 2001, pages 2087
LEVENTHAL J; ABECASSIS M; MILLER J ET AL.: "Chimerism and tolerance without GVHD or engraftment syndrome in HLA-mismatched combined kidney and hematopoietic stem cell transplantation", SCI TRANSL MED, vol. 4, no. 124, 2012, pages 124RA28, XP055227708, DOI: doi:10.1126/scitranslmed.3003509
NIERLICH PN ET AL.: "The role of natural killer T cells in costimulation blockade-based mixed chimerism", TRANSPL.INT., vol. 23, 2010, pages 1179 - 1189, XP055255374 *
OMAR DURAMAD; AMY LAYSANG; JUN LI; YASUYUKI ISHII; REIKO NAMIKAWA: "Pharmacologic Expansion of Donor-Derived, Naturally Occurring CD4lFoxp3l Regulatory T Cells Reduces Acute Graft-versus-Host Disease Lethality Without Abrogating the Graft-versus-Leukemia Effect in Murine Models", BIOL BLOOD MARROW TRANSPLANT, 2011, pages 1 - 15
SCANDLING JD; BUSQUE S; DEJBAKHSH-JONES S ET AL.: "Tolerance and chimerism after renal and hematopoietic-cell transplantation", N ENGL J MED, vol. 358, no. 4, 2008, pages 362, XP002562462, DOI: doi:10.1056/NEJMoa074191
SCIENCE, vol. 278, 1997, pages 1626 - 1629
See also references of EP2915535A4 *
SHARABI Y; SACHS DH: "Mixed chimerism and permanent specific transplantation tolerance induced by a nonlethal preparative regimen", J EXP MED, vol. 169, no. 2, 1989, pages 493, XP000942385, DOI: doi:10.1084/jem.169.2.493
SYKES M.: "Mechanisms of transplantation tolerance in animals and humans", TRANSPLANTATION, vol. 87, no. 9, 2009, pages 67
SYKES M; SZOT GL; SWENSON KA; PEARSON DA: "Induction of high levels of allogeneic hematopoietic reconstitution and donor-specific tolerance without myelosuppressive conditioning", NAT MED, vol. 3, no. 7, 1997, pages 783, XP002101605, DOI: doi:10.1038/nm0797-783
T. KAWAI, NAT. MEDI., vol. 6, 2000, pages 114
TAKEUCHI Y; ITO H; KURTZ J; WEKERLE T; HO L; SYKES M.: "Earlier Low-Dose TBI or DST Overcomes CD8+ T-Cell-Mediated Alloresistance to Allogeneic Marrow in Recipients of Anti-CD40L", AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION, vol. 4, no. 1, 2004, pages 31, XP002759435, DOI: doi:10.1046/j.1600-6135.2003.00272.x
TOSHIHITO HIRAI ET AL.: "Ishoku Zoki no Men'eki Kan'yo Yudo Protocol no Kaiseki", TOKYO WOMEN'S MEDICAL UNIVERSITY SOGO KENKYUSHO KIYO, vol. 32, December 2012 (2012-12-01), pages 96 - 97, XP008179265 *
VAN DEN HEUVEL MJ; GARG N; VAN KAER L; HAERYFAR SMM: "NKT cell costimulation: experimental progress and therapeutic promise", TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 17, no. 2, 2011, pages 65, XP028361760, DOI: doi:10.1016/j.molmed.2010.10.007
YASUYUKI ISHII; RISA NOZAWA ET AL.: "Alpha-galactosylceramide-driven immunotherapy for allergy", FRONTIERS IN BIOSCIENCE, vol. 13, pages 6214 - 6228

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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