WO2014020226A1 - Aditivos para alimentación de animales acuáticos que contienen probióticos - Google Patents

Aditivos para alimentación de animales acuáticos que contienen probióticos Download PDF

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WO2014020226A1 PCT/ES2013/070573 ES2013070573W WO2014020226A1 WO 2014020226 A1 WO2014020226 A1 WO 2014020226A1 ES 2013070573 W ES2013070573 W ES 2013070573W WO 2014020226 A1 WO2014020226 A1 WO 2014020226A1
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cect
aquatic animals
amyloliquefaciens
ecobiol
additive
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Enrique PABLOS PÉREZ
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Norel SA
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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics

Definitions

  • the present invention discloses additives for feeding aquatic animals, additives containing at least one probiotic which, in addition, may be accompanied by at least one salt of an organic acid. These additives are used as promoters or growth stimulants and enhancers of the animal's health status. Therefore, the present invention is encompassed within the field of aquaculture and more specifically within animal production, food and health.
  • aquatic animals differ from terrestrial animals in the level of interaction between the intestinal microbiota and the surrounding environment.
  • the bacteria present in the aquatic environment influence the composition of the microflora of the intestine of aquatic animals and vice versa.
  • the composition of the bacterial community of the intestinal tract of aquatic animals is different from what is found in terrestrial animals.
  • Gram negative bacteria predominate in the marine environment and Gram positive in a smaller proportion; these usually constitute the majority of the bacteria that normally occur in the microflora associated with wild and cultivated shrimp.
  • the vast majority of microbes present in the marine environment bacteria are harmless or are successfully controlled by the internal defense mechanisms of organisms in culture.
  • probiotics are useful for promoting the health of an animal, they are often difficult to store, handle and administer to these animals, especially when such administration is done by dissolving the additive, along with the usual food of the animals, in The aquatic environment.
  • the food formulation not only has to complete the requirements of the animals, it must also produce a very stable food in the water because the aquatic animals are introduced continuously and continuously.
  • the shrimp detects the food at a distance by chemoreception, so that this food must also be attractive (that attracts the animal) and palatable (that likes the taste), and must also have a uniform shape and composition. In this sense, the use of attractive substances allows food to be located and consumed faster by animals.
  • the present invention describes a new food additive for aquatic animals comprising at least two bacterial strains, preferably in spore form, belonging to the genus Bacillus and selected from among Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus.
  • Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 is a bacterial strain isolated by NOREL S.A., Spain deposited on April 25, 2001 in the Spanish Collection of Crops type sita in the Scientific Park of the University of Valencia. Calle Agust ⁇ n Escardino Professor, 9 de Paterna (Valencia) and, which is marketed as the probiotic ECOBIOL.
  • ECOBIOL is a probiotic in the form of resistant spores capable of surviving even the process of granulation and / or pelletization of feed. Once in the animal, where the bacterium finds a suitable medium for its development in terms of temperature and humidity nutrients, the spores that make up the ECOBIOL germinate, then passing the bacteria to produce all the beneficial effects for the animal. Said probiotic is also characterized in that it has a better reproduction ratio compared to other Bacillus spp spores and is also capable of releasing chemical compounds that have an inhibitory effect on the pathogenic population.
  • Bacillus cereus CECT 953 is a bacterial strain isolated by NOREL SA, Spain deposited on October 25, 1988 in the Spanish Collection of Crops type sita in the Science Park of the University of Valencia. Calle Agust ⁇ n Escardino Professor, 9 de Paterna (Valencia) and, which is marketed as the probiotic ESPORAFEED.
  • ESPORAFEED is a probiotic in the form of resistant spores capable of surviving even the process of granulation of feed for animal feed. Said probiotic is characterized by resisting high granulation temperatures, as well as physical and acidifying agents. In addition, ESPORAFEED produces enzymes that improve the digestibility of the diet.
  • the additives described in the present invention are added to the diet of aquatic animals, preferably in those animals farmed by aquaculture and which are selected, among others, from any of the following list: crustaceans, molluscs, tilapia, gilthead sea bass and salmonids.
  • the additive of the invention acts as a natural growth promoter, showing an improvement in the feed conversion factor, an increase in the growth of animals and biomass, as well as an increase in the survival of the animals to which these additives are administered to animals fed without the additive.
  • the additive of the invention may also contain other ingredients capable of strengthening the immune system and improving the digestibility of the food resulting in an increase in the action of probiotics.
  • these ingredients are salts of organic acids, with sodium salt of butyric acid being preferred.
  • Organic short-chain acids are capable of reducing the pH at the intestinal level, which limits the development of pathogens and helps in the digestion of proteins and, on the other hand, they have the ability to enter the bacteria, specifically those pathogens and block their metabolism. Its bactericidal action is exerted preferably between the genera: Escherichia, Campylobacter, Clostridium and Salmonella, among others.
  • the Norel SA Spain product marketed under the name of GUSTOR BP-70 is used, from here and, throughout the entire invention we will call it BP-70.
  • the BP-70 is formed by the sodium salt of protected butyric acid, against early digestion, with a matrix of vegetable fats, which protect only a part of the active ingredient and allow the slow release of the product, thus ensuring its potentiating action growth and bactericide throughout the digestive tract of the animal.
  • This partial protection ensures that a part of the butyrate reaches the farthest parts of the digestive tract of animals, thus exercising its action.
  • unprotected sodium butyrate will exert its action on the nearest parts of the digestive tract.
  • the protected sodium butyrate will exert its action on the most distal parts of the digestive tract, once the protective layer that prevents its action has hydrolyzed throughout the digestive process.
  • the additives described in the present invention further favor the specific activity of digestive enzymes, preferably of lipases, proteases, amylases and chymotrypsins, as well as the food conversion factor, which results in greater use of the food and consequently greater biomass of animals.
  • concentrations of each of the ingredients purchased by the additives of the invention are incorporated in amounts sufficient to achieve the beneficial properties thereof, such as improving the food conversion factor, a better utilization of the food, an increase in its biomass. and an increase in the longevity of individuals.
  • Another object described in the present invention relates to the use of the additives of the invention as promoters of the growth of aquatic animals, as well as promoter of their health and well-being, by providing the additives of the invention to fed animals. with them from a reinforced immune system.
  • the white spot syndrome virus WSSV
  • the white spot syndrome virus is the main pathogen of shrimp and outbreaks kill all shrimp populations in a few days, being by therefore responsible for large production / profit losses in this industry worldwide.
  • the virus has a wide range of hosts, such as crustaceans such as crabs, spiny lobsters, crayfish, etc.
  • the clinical signs of "white spot” include a sudden reduction in food consumption, lethargy, cuticle loss, discoloration and presence of white spots of 0.5 to 2.0 mm in diameter on the inner surface of the shell, appendages and on the cuticle of the abdominal segments.
  • Another object of the present invention relates to a method for promoting the growth of aquatic animals by administering the additive described in the invention, since said additive is capable of giving greater use to the food consumed.
  • aquaculture refers to the set of technical activities and knowledge of cultivation of aquatic plant and animal species. It is an important economic activity of food production, raw materials for industrial and pharmaceutical use, and living organisms for repopulation or ornamentation. Cultivation systems can be freshwater or seawater. The most common crops correspond to planktonic organisms (microalgae and Artemia), macroalgae, molluscs, crustaceans and fish.
  • dietary additive refers to a composition intended to be ingested together with the normal diet of the animal.
  • the additive described in the invention may comprise at least one probiotic, alone or in combination with other ingredients, preferably salts of organic acids.
  • promoters or stimulants of Growth can be administered in different ways, whether injected, in implants or as an additive in animal feed or feed. Administration as an additive in the food or feed is preferred. In the present invention, the effect on growth is measured as an increase in biomass.
  • organic acid refers to compounds that contain in its formula one or more carboxylic groups (-COOH), proton generators, which may also have different functional groups such as hydroxy acids, keto acids, aromatic acids , heterocyclic compounds, as well as amides and lactones.
  • the organic acids used in the present invention are preferably volatile fatty acids, preferably short chain and from which can be selected: butyric acid, propionic acid, formic acid, lactic acid, citric acid, lauric acid, cupric acid, caprylic acid, caproic acid, acetic acid, among others.
  • the proportions in which the organic acid is found in the animal feed additive described in the present invention usually vary between 30 and 70% by weight of total wet product, the preferred proportion being 50%.
  • probiotic refers to any type of viable microorganism applied to an animal or human host, and which beneficially affects the host, due to its beneficial effects, on health or on the increase of the resistance to diseases, which it may have on its consumer.
  • Probiotics may exhibit one or more of the following, non-limiting characteristics: non-pathogenic or non-toxic to the host; they are present as viable cells, capable of surviving in the intestinal environment (for example, at low pH and acids and gastrointestinal secretions), adhesion to epithelial cells, particularly to epithelial cells of the gastrointestinal tract, microbicidal or microbiostatic activity or effect towards pathogenic bacteria; anticancer activity; immune modulation activity; activity modulating the activity towards the endogenous flora; improvement of the health of the urogenital tract; antiseptic activity in or around wounds; diarrhea reduction; reduction of allergic reactions; reduction in neonatal necrotizing enterocolitis; reduction in inflammatory bowel disease and reduction of intestinal permeability.
  • the term "viable” refers to a living microorganism capable of reproducing and / or colonizing.
  • the singular forms “a”, “a”, and “the” include plural reference unless the context clearly indicates otherwise.
  • the shrimp were fed with the standard food to which the different additives of the invention were added to the concentration of 2g / Kg standard diet: ECOBI OL containing the probiotic CECT 5940 (first column-grid bar), or ECOBIOL PLUS containing the CECT 5940 + BP70 probiotic (second column-white bar), or ECOBIOL SUPER containing the combination of CECT 5940 + CECT 953 + BP70 probiotics (third column-black bar) or exclusively the standard diet (control group) (fourth column- striped bar).
  • the time expressed in days is shown on the X axis and the biomass expressed in grams on the Y axis. * p ⁇ 0.05 vs control.
  • FIG. 4 Litopenaeus vannamei biomass of approximately 7.0 g weight, analyzed every 10 days, for a total period of 60 days.
  • the shrimp were fed with the standard food to which the different additives of the invention were added to the concentration of 2g / kg of standard diet: ECOBIOL containing the probiotic CECT 5940 (first column-grid bar), or ECOBIOL PLUS containing the CECT 5940 + BP70 probiotic (second column-white bar), or ECOBIOL SUPER containing the combination of CECT 5940 + CECT 953 + BP70 probiotics (third column-black bar) or exclusively the standard diet (control group) (fourth column- striped bar).
  • the time expressed in days is shown on the X axis and the biomass expressed in grams on the Y axis. * p ⁇ 0.05.
  • Figure 5. Litopenaeus vannamei survival percentage of approximately 7.0 g weight, analyzed every 10 days, for a total period of 60 days feeding shrimp with a standard diet to which the different additives of the invention were added to the concentration of 2g / kg of standard diet: ECOBIOL containing the probiotic CECT 5940 (broken line with rhombus), or ECOBIOL PLUS containing the probiotic CECT 5940 + BP70 (continuous line with circle), or ECOBIOL SU PER containing the combination of CECT 5940 + CECT 953 + BP70 probiotics (dashed line with triangle) or exclusively the standard diet (control group) (continuous line with a cross).
  • the time expressed in days is shown on the X axis and the survival expressed as a percentage on the Y axis.
  • Figure 7 Response of the digestive enzyme activity in the hepatopancreas of the shrimp Litopenaeus vannamei, given the stimulation of diets containing the different types of probiotics: ECOBIOL containing the probiotic CECT 5940 (dashed line with rhombus), or ECOBIOL PLUS containing the probiotic CECT 5940 + BP70 (continuous line with circle), or ECOBIOL SUPER containing the combination of the probiotics CECT 5940 + CECT 953 + BP70 (dashed line with triangle) or exclusively the standard diet (control group) (continuous line with square). In time 0 the shrimp still did not receive the food; 1, 2, 3, 4 and 5h correspond to the time after the shrimp received the food.
  • the bars indicate the initial body weight (IBW), the final body weight after 30 days (FBW1), the final body weight after 60 days (FBW2), weight gain after 30 days (WG1), and Weight gain after 60 days (WG2).
  • B The figure shows the specific growth rate (SGR) of each of the study groups in the two months of the study.
  • SGR specific growth rate
  • PER protein efficacy ratio
  • Figure 9 Intestinal morphology of Nile Tilapia O. niloticus after 2 months fed with the probiotic of the invention ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940).
  • FIG. 1 Photograph of a cross-section of the proximal part of the intestine stained with hematoxylin & Eosin (H&E) showing the height of folding (double arrows), mucus-secreting cells (arrowheads) and intraepithelial lymphocytes (I EL) (arrows). Scale bar: 50 ⁇ .
  • B The figure shows the height of the villi (mean ⁇ SD) in the proximal, middle and distal parts of the intestine.
  • the asterisk (*) indicates a significantly greater height of hairiness in the proximal part of the large intestine compared to other parts of the intestine, within the same group.
  • G1 control group fed a basal diet.
  • a cross section of the distal part of the intestine stained by staining of alcian blue showed few mucus-secreting cells (arrow) in the control group (C) and numerous mucus-secreting cells in the group supplemented with the probiotic ECOBIOL ( ⁇ . amyloliquefaciens CECT 5940) (D).
  • A red blood cell count.
  • B Hemoglobin content.
  • C % PCV (Packed Cell Volume).
  • D White blood cell count.
  • E Glucose level.
  • G1 control group fed a basal diet.
  • G2 group fed a basal diet supplemented with the probiotic
  • B. amyloliquefaciens CECT 5940 at a spore concentration of 1x10 9 cfu / kg.
  • G3 group fed a basal diet supplemented with the probiotic B. amyloliquefaciens CECT 5940 at a spore concentration of 1x10 7 cfu / kg.
  • FIG. 11 Constituents of the body of Nile Tilapia O. niloticus fed with different concentrations of the ECOBIOL additive containing the probiotic B. amyloliquefaciens CECT 5940, for 2 months. The bars indicate% crude protein (A),% crude lipids (B), ash content (dust or impurities) (C) and% moisture (D).
  • G1 control group fed a basal diet.
  • T1 43% fishmeal (HP) and 25% soy cake (TS)
  • T1 43% fishmeal (HP) and 25% soy cake (TS)
  • T8 TS + ECOBIOL + BP-70 Figure 14. Food consumption (expressed in Kg) of the rainbow trout O.mykiss analyzed 60 days after starting treatment. The experimental design is explained in Example 6. Each of the treatments analyzed comprises:
  • T1 43% fishmeal (HP) and 25% soy cake (TS)
  • T1 43% fishmeal (HP) and 25% soy cake (TS)
  • T1 43% fishmeal (HP) and 25% soy cake (TS)
  • One aspect of the present invention relates to an additive for feeding aquatic animals comprising the combination of at least two species belonging to the genus Bacillus, selected from B. amyloliquefaciens and Bacillus cereus.
  • the additive of the invention comprises the CECT 5940 strains of Bacillus amyloliquefaciens and the CECT 953 strain of Bacillus cereus.
  • the additive for feeding aquatic animals may further comprise other probiotics selected from any of the following genera: Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostcococus, , Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus and Lactobacillus.
  • probiotics selected from any of the following genera: Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostcococus, , Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weis
  • the probiotics comprise at least one suitable strain or subspecies from among: Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium and Pediococcus and / or combinations thereof.
  • the strain is selected from the genus Pediococcus, preferably from the species Pediococcus acidilactici, and in a more preferred embodiment, the most preferred probiotic is Pediococcus acidilactici strain CNCM MA 18/5 M, deposited in the Collection National Crops of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute in Paris.
  • the additives described in the present invention include probiotics in an amount suitable to improve the immune system, to increase the beneficial effects of the probiotics and / or to increase the biomass of the animals and / or extend their life.
  • food additives comprise approximately 10 5 to 10 10 CFU / g of feed for each of the probiotics used, with a concentration of approximately 10 6 CFU / g of feed being preferred, of each of the probiotics used.
  • the person skilled in the art can determine the appropriate amount of probiotics that is added to the additive of the invention. These factors that can be taken into account are the average consumption of certain types of compositions of different animals, if the animal that intends to ingest dietary supplements has a particular health problem, well-being or nutritional needs, or suffers of a disease or disorder, the age, sex, size or species of the animal.
  • concentrations of the probiotics to be added to the additive of the invention can be calculated based on the energy and nutrient requirements of the animal.
  • the additive further comprises at least one salt of an organic acid.
  • the organic acids are selected from any of the following: butyric, propionic, formic, lactic, citric, lauric, cupric, caprylic, caproic or acetic.
  • the salts of the organic acids are selected from any of the list: sodium, calcium, cupric or potassium.
  • the proportions in which the organic acid salt is found in the additive for animal feed described in the present invention usually varies between 30 and 70% by weight of the final wet additive, the preferred proportion being 60%.
  • the organic acid salt comprising the additive of the invention is the sodium salt of butyric acid (sodium butyrate), although any of the salts of the acids described previously may be used.
  • the additive of the invention is characterized in that it comprises a combination of the CECT 5940 probiotics of B. amyloliquefaciens and CECT 953 of B. cereus together with sodium salt of butyric acid.
  • the additives of the invention may additionally also comprise substances such as: minerals, vitamins, proteins, amino acids, dyes, preservatives, etc.
  • minerals include for example: calcium, phosphorus, potassium, sodium, iron, chlorine, copper, zinc, magnesium, manganese, selenium, etc.
  • vitamins include for example: Vitamin A, different types of Vitamin B (niacin, pantothenic acid, folic acid, biotin) Vitamin D and Vitamin K.
  • Another of the objects described in the present invention relates to the use of the additives described herein in the breeding of aquatic animals, as growth promoters of said animals, being able to favor the food conversion factor, as well as the specific activity of digestive enzymes, preferably of lipases, proteases, amylases and chymotrypsins.
  • the additives described herein are used to promote the health and welfare of aquatic animals.
  • the probiotics described herein preferably the probiotics selected from B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. subtilis and B. licheniformis and / or combinations thereof, are used in animal husbandry aquatic
  • the probiotics used for the breeding of aquatic animals are preferably the CECT 5940 probiotic of B. amyloliquefaciens and the CECT 953 probiotic of B. cereus.
  • the probiotics used for the breeding of aquatic animals are characterized in that they can also include an additional probiotic of the genus Pediococcus, preferably the species Pediococcus acidilactici and more preferably the strain CNCM MA 18/5 M, deposited in the Collection National Crops of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute in Paris.
  • the probiotics used for the breeding of aquatic animals are characterized in that they further comprise at least one salt of an organic acid, said salt of the organic acid being preferably in a proportion of between 30-70% in wet weight, a proportion of 60% being more preferable.
  • the organic acids are selected from any of the following: butyric, propionic, formic, lactic, citric, lauric, cupric, caprylic, caproic or acetic.
  • the salts of organic acids are selected from any of the list: sodium, calcium, cupric or potassium.
  • the probiotics used for the breeding of aquatic animals are characterized in that the organic acid salt is the sodium salt of butyric acid.
  • the probiotics used for the breeding of aquatic animals comprise a combination of the CECT 5940 probiotics of B. amyloliquefaciens and CECT 953 of B. cereus together with sodium salt of butyric acid.
  • the probiotics used for the breeding of aquatic animals also have the ability to modulate the immune response and exert a bactericidal effect against pathogenic microorganisms.
  • the probiotics described herein also have the ability to exert a bioremediating action, thus helping to maintain the environment of the surfaces on which they are located, preferably thanks to secretion. of exo-enzymes that break down organic matter and decrease the COD (chemical oxygen demand) accepted parameter as an indicator of water quality.
  • aquatic animals are selected from any of the list: mollusks, crustaceans, tilapia, gilthead sea bass, and salmonids, with crustaceans being preferred, preferably shrimp. All percentages expressed herein are by weight of the additive composition based on dry matter unless specifically indicated otherwise.
  • Example 1 Growth response and survival of the white shrimp Litopenaeus vannamei fed with a standard diet supplemented with the additives of the invention.
  • Shrimp of the species Litopenaeus vannamei randomly selected, with an average weight of 0.85 g were used. These shrimp were previously acclimatized for 72 hours in a 2500 liter tank of seawater with 36.0 UPS (practical salinity units), constant aeration (> 4.0 mg / l oxygen), controlled temperature (30 to 34 ° C) and pH from 7.5 to 8.0.
  • the shrimp were grown in 10 L aquariums, with sea water and keeping the quality variables mentioned above.
  • the tests were carried out with a total of 8 shrimp per aquarium with six replications for each of the food additives used in the present invention. The experiment lasted 60 days, with biometrics every 10 to 10 days in order to assess growth, survival and biomass rates.
  • Biomass refers to the sum of the individual weights of shrimp present in each of the treatments with the different dietary additives.
  • a commercial feed / feed commonly used for feeding shrimp with 35% protein was used, which was ground and sieved at 200 microns.
  • the different probiotics were added as an additive to the standard diet at a rate of 2g / kg of food. Once the additive was incorporated into the standard diet, the mixture was homogenized and passed through a meat grinder and finally by a drying oven at 40 ° C for 12 hours. The food was placed in feeders; food not consumed after two hours was removed and subsequently weighed for analysis.
  • the four analyzed diets containing the dietary supplements or additives described in the present invention are described in Table 1.
  • this term includes both the standard diet supplied to the controls, formed by the commercial food indicated above, and the mixture thereof with the different additives of the invention.
  • the ECOBIOL probiotic comprises the bacteria B. amyloliquefaciens strain CECT 5940, the probiotic ECOBIOL PLUS containing the bacteria B. amyloliquefaciens strain CECT 5940 together with the sodium salt of the butyric acid BP70.
  • the sodium salt of butyric acid specifically the composition of Norel, SA called BP-70, is made up of 70% by weight of sodium butyrate and 30% by weight of vegetable fats. 30% of vegetable fat protects approximately 43% of total sodium butyrate, so the BP-70 product can be said to be made up of 30% protected sodium butyrate and 40% unprotected sodium butyrate .
  • He ECOBIOL SUPER probiotic contains the combination of bacteria B. amyloliquefaciens strain CECT 5940, together with B. cereus strain 953 and together with BP-70.
  • the food was added to satiety three times a day using feeders.
  • the food conversion factor (FCA) was calculated in grams of food per gram of biomass extracted; using the values of the food added daily, the unconsumed and the shrimp biomass obtained at the end of the 60 days of the experiment.
  • Shrimp growth and survival were evaluated every 10 days by recording the average weight and the number of shrimp respectively.
  • the expression and activity of digestive enzymes is affected by a series of limiting factors such as: physical-chemical parameters of water (pH, oxygen, salinity and temperature), age and size of shrimp, ontogenetic changes, fasting, diet ingredients , level and protein source, level and type of binders, growth promoting additives, quantity and frequency of feeding, circadian cycles, molting cycle and even the cultivation water.
  • physical-chemical parameters of water pH, oxygen, salinity and temperature
  • age and size of shrimp ontogenetic changes, fasting, diet ingredients , level and protein source, level and type of binders, growth promoting additives, quantity and frequency of feeding, circadian cycles, molting cycle and even the cultivation water.
  • ECOBIOL ECOBIOL PLUS and ECOBIOL SUPER, juvenile L vannamei shrimp were used, with an average weight of 6 g, which were maintained fasting for 12 hours and previously selected in intermuda stages.
  • the intermuda is known as the sequence of transformations between two molts (elimination of the old exoskeleton and the formation of a new and generally larger tegument), in which period a complete cycle of morphological, physiological and biochemical modifications, responsible for the increase.
  • the measurements of said enzymatic activity were carried out in intervals of one hour, for a time of 5 hours.
  • the activity and production of digestive enzymes in the hepatopancreas of crustaceans is mainly controlled by hormones.
  • the hepatopancreas unlike the intestine and stomach, has a greater enzymatic activity, suggesting the importance of this organ in the synthesis and secretion of digestive enzymes.
  • the protease, lipase, amylase and chymotrypsinase activity was determined in the enzymatic extracts prepared by the methodology proposed by Galgani F. (Galgani, F. PhD. Thesis liable ⁇ ix-Marseille //. Etude des digestive proteases of crevettes peneides (Crustacean Pickled) France. 1983) in hepatopancreas extracted from shrimp, at the indicated intervals previously and that were stored, for said analysis, at a temperature of - 48 ° C.
  • the concentration of proteins present in said enzymatic extracts was determined by the Bradford method.
  • Clostridia All strains of Clostridia were grown in agar-clostridium medium at an approximate concentration of 10 6 CFU / plaque. With the exception of B. amyloliquefaciens CECT 5940, which was grown at 30 ° C, the rest of the strains were incubated at 37 ° C in the absence of oxygen, inside anaerobiosis bottles.
  • the plates are incubated at the corresponding temperatures for each of the pathogenic microorganisms, to allow the growth of the target organism. After 24 hours, the presence or absence of a growth inhibition halo is determined. All sampling was done in duplicate, both in the collection of supernatants, and in the sowing of plates.
  • the concentration of pathogenic bacteria 10 6 U FC / plaque was inoculated with the appropriate medium.
  • Several notches of a size of 6 mm in diameter were made in the culture plates of the pathogenic microorganisms and the supernatant of B. amyloliquefaciens CECT 5940 was introduced in each (50 ⁇ ).
  • the plates were incubated at 4 ° C for 2 hours to allow the different components of the supernatant to diffuse into the plate culture medium. After that, all plates were incubated at 37 ° C for 24 hours and the inhibition halo was determined in order to demonstrate the bactericidal effect.
  • the pathogenic strains evaluated were:
  • Yersinia enterocolitica CECT 754 All strains of E. coli were selected according to the phenotype (0: 147 H: 7). The rest are pathogenic strains known according to the CECT (Spanish Crop Collection Type), except Enterococcus, which were selected as lactic acid bacterial strains (LAB).
  • Vibrio genus bacteria are Gram-negative bacteria commonly found in estuaries and marine waters, usually in temperate and tropical climates. Some species, such as the V. parahaemolyticus species, can cause gastroenteritis in humans. Natural guests of V. parahemolyticus include crabs, shrimp, turtles, oysters, lobsters and fish. The species V. gastroenteritis is often associated with infection in shrimp.
  • the two strains were grown in Nutrient Broth medium (Biokar) supplemented with 3% v / v NaCI, and incubated in an orbital shaker at the temperatures recommended in each case by the CECT for 16 hours.
  • the results show that the supernatants obtained from the cultures of ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940), as previously described, showed halos of inhibition around the traces made on cultures of the pathogenic species V. parahemolyticus CECT 511, but not, against the cultures of V. harveyi CECT 525.
  • the results indicate that the strain V.
  • B. amyloliquefaciens CECT 5940 contains some compound, bacteriocin type, that inhibits the growth of Vibrio parahaemolyticus CECT 511.
  • the numbers shown in Table 4 indicate the diameter of the inhibition halo in corresponding millimeters to each of the supernatants tested (it should be noted that the well in which the sample is applied has a diameter of 6 mm which is also included in the size of the halo).
  • Example 4 Production capacity of organic acids by B. amyloliquefaciens CECT 5940 under anaerobic conditions.
  • the objective of the present example is to evaluate the production capacity of lactic acid of the additive of the invention ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940) under self-generated anaerobiosis conditions.
  • ECOBIOL ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940
  • the production of lactic acid excreted to the lumen of the intestine causes acidification of the medium resulting in a preferential growth of the acidophilic flora, having a beneficial effect on health intestinal.
  • the preferential growth of this type of microorganisms displaces the pathogenic bacteria through the known mechanism of competitive exclusion.
  • the growth and culture conditions of the strains of B. amyloliquefaciens CECT 5940 have already been described throughout this document.
  • the composition of the experimental medium is as follows:
  • composition of the medium described above mimics the proportion of proteins and carbohydrates in the intestinal lumen of the animals.
  • CFU / ml According to the technique of serum dilution and subsequent colony counting in the appropriate culture medium of B. amyloliquefaciens CECT 5940.
  • Lactic acid production The methods used in the process. n spectophotometric, and the determination of the presence of NADH at an absorbance of A340 in centrifugal and cell-free fermentation extract samples, with the Boehringer Mannheim enzyme systems.
  • Acetic acid production The method used was spectophotometric and the determination of the presence of NADH at A340 in samples of centrifugal and cell-free fermentation extracts, with Boehringer Mannheim enzymatic systems.
  • Example 5 Growth response, intestinal morphology, hematology and body composition of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus (L.)) fed a standard diet supplemented with the additives of the invention.
  • the use of the additive of the invention ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940) as a probiotic in Nile tilapia is evaluated.
  • a total of 120 O. niloticus (L.) fry (average weight of 9.4 ⁇ 0.3 g) They were divided into 3 groups (20 fish / group) in duplicate.
  • the group called G1 was fed a basal diet as the control group; while the groups called G2 and G3 were fed the basal diet to which the additive ECOBIOL ( ⁇ . amyloliquefaciens CECT 5940) was added in the final levels at a spore concentration of 1x10 9 and 1x10 7 cfu / kg respectively.
  • ECOBIOL ⁇ . amyloliquefaciens CECT 5940
  • the use of a higher concentration of probiotics in the animals' diet increased the height of the intestinal villi, especially in the proximal part of the intestine.
  • the G2 group presented a significantly higher number of mucus-secreting cells (goblet cells), in the proximal and distal parts of the intestine, than the G3 or G1 groups ( Figure 9A-E).
  • Example 6 Evaluation of the additive of the invention ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) and Gustor BP-70 as growth promoters in diets with fishmeal or soy cake for rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss).
  • the objective of the present example is to evaluate the addition to a diet of rainbow trout fry (O. mykiss), two growth promoters, ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940) and Gustor BP-70, alone or in combination, at the level 0.1%, in diets based on fishmeal or soy cake, on the productive behavior, taking into account the parameters of growth (weight gain and height), food conversion and survival of these animals.
  • the facilities of the Vinchos Fish Production Center located in the district of Canchayllo, belonging to the SAIS "Tupac Amaru", in the department of Jun ⁇ n (Peru) were used.
  • the experimental diets were prepared at the Balanced Food Plant of the Social Research and Projection Program in Food, School of Zootechnics, of the National Agrarian University La Molina (Lima, Peru), during the months of March, April and May of 2012, with a duration of 60 days.
  • 170000 rainbow trout fry were installed in 30 ponds of 5 x 0.60 meters (experimental units), with capacity for 5000 fish each.
  • Three entries were made, in periods of 15 days (replicas); the first with fish with an average weight of 2.2 g and 6.0 cm in size; after 15 days, fish with an average weight of 0.15 g and 2.25 cm in size were installed and after 15 days, fish with an average weight of 0.08 g and 1.90 cm in size.
  • Two commercial diets were formulated, one based on fishmeal (43%) and one based on soybean cake (50%), linear programming was used at minimum cost, according to the recommendations of the NRC (1993). To each experimental diet 0.1% of
  • ECOBIOL ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940
  • BP-70 BP-70 or the mixture of both, giving rise to 8 treatments.
  • Each of the treatments includes:
  • T1 43% fishmeal (HP) and 25% soy cake (TS)
  • Example 7 Use of ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) as a bioremediation agent.
  • Water quality and soil quality management is considered one of the most important aspects of pond aquaculture. While water quality parameters, such as dissolved oxygen, pH, or ammonia concentrations affect essential functions of the body, the state of the bottom of the ponds and the exchange of substances between the soil and water greatly affects water quality
  • the accumulation of waste will increase the demand for oxygen by bacteria in order to perform their metabolism and degrade organic matter, favoring the development of anaerobic areas.
  • These anoxic sediments will be in contact with the oxygen-rich water column, producing an alteration of the environmental conditions suitable for a healthy development of the organisms that inhabit these ponds.
  • ammonia can diffuse in the water column not only as a result of fish excretion, but also after microbial decomposition of organic matter.
  • Bacillus spp. They are considered as bioremediation agents, a concept that refers to the use of microorganisms that help in maintaining the environment of the appropriate pond thanks to the secretion of exo-enzymes that break down organic matter.
  • the purpose of the present example is to evaluate the in vitro capacity of ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940) as a bioremediation agent.
  • COD chemical oxygen demand
  • the soluble COD measurements in the supernatant were made after 15 min of sedimentation after homogenization of the media, while the total COD measurements were made immediately after homogenization. The measurements were carried out on day 0 (initial), day 3 and day 7. The temperature was maintained at 25 ° C. The results revealed that the total COD was progressively reduced in the treatment groups, especially in those treated with ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940). In addition, the layer of water and mud was reduced to 4 cm deep. This indicates lower levels of waste, and consequently, better environmental conditions, due to the bioremediation action of treatment with ECOBIOL ( ⁇ . Amyloliquefaciens CECT 5940) (See Table 8).

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Description

ADITIVOS PARA ALIMENTACIÓN DE ANIMALES ACUÁTICOS QUE CONTIENEN PROBIÓTICOS.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención divulga aditivos para la alimentación de animales acuáticos, aditivos que contienen al menos un probiótico que, además, puede ir acompañado de al menos una sal de un ácido orgánico. Dichos aditivos son utilizados como promotores o estimulantes del crecimiento y mejoradores del estado sanitario del animal. Por tanto, la presente invención se engloba dentro del campo de la acuicultura y más específicamente dentro de la producción, alimentación y salud animal.
ESTADO DE LA TÉCNICA La acuicultura ha tenido en los últimos años adelantos significativos en la producción de una amplia variedad de organismos acuáticos tanto de consumo humano como de especies de ornamentación. Debido a las condiciones de cría, como por ejemplo las altas densidades de animales y a las variaciones en la calidad del agua, los organismos están sujetos a un estrés constante que se traduce en una elevada tasa de mortalidad, así como en bajas tasas de crecimiento y de eficiencia alimenticia, además de incrementarse la presencia e incidencia de enfermedades ocasionadas por patógenos oportunistas. La necesidad de una acuicultura sostenible y rentable ha impulsado la búsqueda de soluciones aceptables para optimizar la producción de una manera natural y respetuosa con el medio ambiente.
Para sobrellevar estos problemas se han utilizado suplementos y/o aditivos alimenticios que evitan la aparición de enfermedades y que además operan como promotores del crecimiento. Entre dichos suplementos se encuentran las hormonas, los antibióticos y algunas sales. Sin embargo, su uso inapropiado puede presentar efectos adversos en el animal o en el consumidor final, así como dar lugar a resistencia cruzada en los animales de cría, frente a bacterias patógenas, produciendo desequilibrios ambientales y pérdidas económicas de las explotaciones acuícolas. Por lo tanto, la tendencia en la actualidad en acuicultura, es la búsqueda de una dieta que no sólo cubra las necesidades alimenticias de los animales, sino que además refuerce su estado inmunológico y sanitario, en general y reduzca los problemas patológicos sin utilizar medicamentos, para así conseguir mejorar su producción, evitar problemas con la seguridad de los alimentos obtenidos a partir de los animales de cría e incrementar los rendimientos económicos de las explotaciones. Para la consecución de estos objetivos, una de las vías de obtención ha sido el control de la flora intestinal de los animales de cría, utilizándose para ello los probióticos (Robertson, P.A.W. et al. Aquaculture 2000; 185: 235-243; Verschuere, L, G. et al. Microbiological Molecular 2000; 64: 655-671 ; Gullian, . et al., Aquaculture 2004; 233: 1-14; Balcázar, J.L.,et al. Veterinary Microbioiogy 2006; 114: 173-186; Gatesoupe, F.J. Journal of Molecular Microbiologlcal Bioiechnology. 2008;14: 107-114) que pueden definirse como microorganismos viables que administrados en la dieta promueven el bienestar de los organismos de cría por medio de la estimulación del sistema inmune, así como del establecimiento del balance microbiano intestinal en dichos animales de cría, mediante la exclusión de microorganismos potencialmente patógenos (I rianto, A. y B. Journal of Fish Diseases 2002; 25: 333-342; Irianto, A. y B. Austin. Journal of Flsh Diseases 2003; 26: 59-62; Lara-Flores, M., et al. Aquaculture 2003; 216: 193-201.). El uso de probióticos en la producción animal es una forma eficaz de control de la microflora intestinal de los animales de cría y ha demostrado ser, tanto un buen sustituto como un buen complemento, a los antibióticos promotores del crecimiento. Los probióticos son ampliamente utilizados en la cría de cerdos y aves, pero poco se ha hecho para incorporarlos en la acuicultura.
En este sentido, los animales acuáticos difieren de los animales terrestres en el nivel de interacción entre la microbiota intestinal y el ambiente que los rodea. Las bacterias presentes en el ambiente acuático influyen en la composición de la microflora del intestino de los animales acuáticos y viceversa. La composición de la comunidad bacteriana del tracto intestinal de los animales acuáticos es diferente a lo que se encuentra en los animales terrestres. En el ambiente marino predominan las bacterias Gram negativas y en menor proporción las Gram positivas; estas usualmente constituyen la mayoría de las bacterias que normalmente se presentan en la microflora asociada a los camarones silvestres y de cultivo. La gran mayoría de los microbios presentes en el ambiente marino (bacterias, virus, hongos o parásitos) son inocuos o son controlados exitosamente por los mecanismos internos de defensa de los organismos en cultivo. Las etapas tempranas del ciclo de vida de los organismos acuáticos suelen ser más susceptibles a los ataques de dichos agentes, sobre todo cuando se llevan cultivos larvarios en forma intensiva, que por efecto del estrés provocado por las altas densidades, reduce el potencial de defensa de los organismos. La ruptura del equilibrio dinámico de la flora intestinal es provocada por el estrés que se genera por las condiciones intensivas de la producción animal, mencionadas previamente. Cuando descienden las concentraciones de bacterias beneficiosas, aparece la oportunidad para las bacterias menos deseables ó para que los patógenos potenciales se instalen y se multipliquen.
Existen diferentes especies bacterianas utilizadas como probióticos en acuicultura destacando, sobre todo, las bacterias acidolácticas, preferentemente pertenecientes al género Lactobacillus (Nikoskelainen, 8.A. et al. Fish Sellfísh Immunology 2003; 15: 443- 452; Balcázar, J.L. et al. British Journal of Nutrítion 2007; 97: 522-527; Gatesoupe, FJ. Journal of Molecular Microbioiogical Biotechnology. 2008; 14: 107-114). Bacterias de dicho género forman parte de la flora microbiana natural que se encuentran acompañando a los camarones en todos sus estadios de vida y parte de dichas bacterias presentan potencial para usarse como probióticos en la acuacultura. Sin embargo, debido a que esta práctica aún es reciente en la acuicultura, son pocas las especies de microorganismos que se usan, por lo que en la actualidad es necesario continuar seleccionando cepas con características probióticas. Además, puede ser beneficioso para complementar el sistema inmune, particularmente en el tracto gastrointestinal de los animales acuáticos, utilizar, en combinación con los probióticos, otros ingredientes o aditivos que potencien el beneficio de dichos probióticos en la salud y producción en acuicultura.
Mientras que los probióticos son útiles para la promoción de la salud de un animal, a menudo son difíciles de almacenar, manejar y administrar a dichos animales, más cuando dicha administración se realiza disolviendo el aditivo, junto con el alimento habitual de los animales, en el medio acuático. En este sentido, la formulación de alimentos no solo tiene que completar los requerimientos de los animales, debe también producir un alimento muy estable en el agua porque los animales acuáticos se al i m entan l enta y continuamente. Específicamente, el camarón detecta el ali mento a distancia por quimiorecepción, por lo que dicho alimento debe ser además atractante (que atraiga al animal) y palatable (que le guste el sabor), debiéndose además presentar una forma y composición uniforme. En este sentido, el uso de sustancias atractantes permite que los alimentos sean localizados y consumidos más rápido por los animales. Estos compuestos son moléculas muy solubles en agua y son de bajo peso molecular; como: aminoácidos, compuestos cuaternarios de amonio, trimetilamina, betaina (trimetilglicina), nucleótidos, aminas biogénicas y ácidos orgánicos. De manera comercial se encuentran disponibles en el mercado harinas solubles y aceites de pescado, moluscos ó crustáceos; que funcionan como excelentes atractantes.
Existe, por tanto, una necesidad de nuevos aditivos para la alimentación de animales acuáticos, que contengan probióticos capaces de reforzar el sistema inmune evitando así la invasión por patógenos oportunistas y dando lugar a un incremento en la longevidad de los animales criados en cautividad mediante técnicas de acuicultura. Otro de los objetivos, de los aditivos incorporados en la dieta de los animales acuáticos es conseguir un mayor aprovechamiento del alimento y una actividad incrementada de las enzimas digestivas que se traduzca en un incremento en el crecimiento de los animales de cría y por consiguiente redunde en los beneficios económicos para las explotaciones acuícolas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención
La presente invención describe un nuevo aditivo alimenticio para animales acuáticos que comprende al menos dos cepas bacterianas, preferentemente en forma de espora, pertenecientes al género Bacillus y que se selecciona de entre Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus cereus.
La cepa bacteriana Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 es una cepa bacteriana aislada por NOREL S.A., España depositada el 25 de Abril del 2001 en la Colección Española de Cultivos tipo sita en el Parque Científico de la Universidad de Valencia. Calle Catedrático Agustín Escardino, 9 de Paterna (Valencia) y, que se comercializa como el probiotico ECOBIOL.
El ECOBIOL es un probiotico en forma de esporas resistentes capaces de sobrevivir incluso al proceso de granulación y/o peletización del pienso. Una vez en el animal, donde la bacteria encuentra un medio adecuado para su desarrollo en términos de nutrientes temperatura y humedad, las esporas que componen el ECOBIOL germinan, pasando entonces la bacteria a producir todos los efectos beneficiosos para el animal. Dicho probiotico se caracteriza además porque presenta un mejor ratio de reproducción en comparación a otras esporas de Bacillus spp y además, es capaz de liberar compuestos químicos que tienen un efecto inhibidor en la población patógena. La cepa bacteriana Bacillus cereus CECT 953 es una cepa bacteriana aislada por NOREL S.A., España depositada el 25 de Octubre de 1988 en la Colección Española de Cultivos tipo sita en el Parque Científico de la Universidad de Valencia. Calle Catedrático Agustín Escardino, 9 de Paterna (Valencia) y, que se comercializa como el probiotico ESPORAFEED.
El ESPORAFEED es un probiotico en forma de esporas resistentes capaces de sobrevivir incluso al proceso de granulación de los piensos para alimentación animal. Dicho probiotico se caracteriza por resistir altas temperaturas de granulación, así como agentes físicos y acidificantes. Además, ESPORAFEED produce enzimas que mejoran la digestibilidad de la dieta.
Los aditivos descritos en la presente invención se adicionan a la dieta de los animales acuáticos, preferentemente en aquéllos animales de cría mediante acuicultura y que se seleccionan, entre otros, de entre cualquiera de la siguiente lista: crustáceos, moluscos, tilapia, dorada, lubina y salmónidos.
El aditivo de la invención actúa como promotor natural del crecimiento, al mostrar una mejora en el factor de conversión del alimento, un incremento en el crecimiento de los animales y en la biomasa, así como un incremento en la supervivencia de los animales a los que se les administra dicho aditivo frente a los animales alimentados sin el aditivo.
El aditivo de la invención puede contener además otros ingredientes capaces de reforzar el sistema inmune y mejorar la digestibilidad del alimento dando lugar a un aumento en la acción de los probióticos. Entre dichos ingredientes se encuentran las sales de los ácidos orgánicos, siendo preferida la sal sódica del ácido butírico.
Los ácidos orgánicos de cadena corta son capaces de reducir el pH a nivel intestinal lo que limita el desarrollo de patógenos y ayuda en la digestión de proteínas y, por otro lado, presentan habilidad para entrar en las bacterias, específicamente en aquéllas patógenas y bloquear su metabolismo. Su acción bactericida se ejerce preferentemente entre los géneros: Escherichia, Campylobacter, Clostridium y Salmonella, entre otros. En la presente invención se utiliza el producto de Norel S.A. España comercializado con el nombre de GUSTOR BP-70, a partir de aquí y, a lo largo de toda la invención lo llamaremos BP-70. El BP-70 está formado por la sal sódica del ácido butírico protegida, frente a una digestión temprana, con una matriz de grasas vegetales, que protegen solo una parte del ingrediente activo y permiten la liberación lenta del producto, asegurando así su acción potenciadora del crecimiento y bactericida en todo el tracto digestivo del animal. Esta protección parcial asegura que una parte del butirato llegue a las partes más lejanas del tracto digestivo de los animales, ejerciendo así su acción. Por una parte, el butirato sódico desprotegido ejercerá su acción en las partes del tracto digestivo más próximas. Por otra, el butirato sódico protegido, va a ejercer su acción en las partes del tracto digestivo más distales, una vez la capa protectora que impide su acción, se haya hidrolizado a lo largo del proceso digestivo.
Los aditivos descritos en la presente invención favorecen además la actividad específica de las enzimas digestivas, preferentemente de las lipasas, proteasas, amilasas y quimiotripsinas, así como el factor de conversión alimenticia, lo que da lugar a un mayor aprovechamiento del alimento y en consecuencia a una mayor biomasa de los animales.
Las concentraciones de cada uno de los ingredientes que compren los aditivos de la invención, se incorporan en cantidades suficientes para conseguir las propiedades beneficiosas de los mismos, tales como mejorar el factor de conversión alimenticia, un mejor aprovechamiento del alimento, un incremento en su biomasa y un incremento en la longevidad de los individuos.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso de los aditivos de la invención como promotores del crecimiento de los animales acuáticos, así como promotor de la salud y el bienestar de los mismos, al dotar los aditivos de la invención a los animales alimentados con los mismos de un sistema inmune reforzado. En este sentido, el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV, white spot syndrome virus, en sus siglas en inglés) es el principal patógeno del camarón y los brotes matan en pocos días a la totalidad de las poblaciones de camarones, siendo por lo tanto el responsable de grandes pérdidas de producción/ganancias en esta industria a nivel mundial. Además de infectar a los camarones, el virus tiene una amplia gama de huéspedes, como por ejemplo, crustáceos como cangrejos, langostas espinosas, cangrejos de río, etc. que pueden ser infectados con gravedad variable dependiendo de la etapa vital del crustáceo y de la presencia de factores estresantes externos (temperatura, salinidad, enfermedades bacterianas, contaminantes, etc). Los signos clínicos de la "mancha blanca" incluyen una súbita reducción del consumo de alimentos, letargo, pérdida de cutícula, decoloración y la presencia de manchas blancas de 0,5 a 2,0 mm de diámetro en la superficie interior del caparazón, apéndices y sobre la cutícula de los segmentos abdominales. Hasta ahora no existe ningún tratamiento efectivo para controlar la infección provocada por dicho virus, pero los animales acuáticos alimentados con los diferentes aditivos descritos aquí, al tener reforzado su sistema inmune gracias a los aditivos de la invención, no muestran signos de la enfermedad, por lo tanto, los aditivos de la invención son capaces de prevenir la infección por el virus de la mancha blanca.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para promover el crecimiento de los animales acuáticos mediante la administración del aditivo descrito en la invención, dado que dicho aditivo es capaz de dar lugar a un mayor aprovechamiento del alimento consumido.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.
A efectos de la presente invención se definen los siguientes términos:
El término "acuicultura" se refiere al conjunto de actividades técnicas y conocimientos de cultivo de especies acuáticas vegetales y animales. Es una importante actividad económica de producción de alimentos, materias primas de uso industrial y farmacéutico, y organismos vivos para repoblación u ornamentación. Los sistemas de cultivo pueden ser de agua dulce o agua de mar. Los cultivos más habituales corresponden a organismos planctónicos (microalgas y Artemia), macroalgas, moluscos, crustáceos y peces.
El término "aditivo dietético", "aditivo alimenticio" , "aditivo para alimentación" o "suplemento dietético", a efectos de la presente invención se refiere a una composición destinada a ser ingerida junto con la dieta normal del animal. El aditivo descrito en la invención puede comprender al menos un probiótico, solo o en combinación con otros ingredientes, preferentemente, sales de ácidos orgánicos.
A efectos de la presente invención se denominan "promotores o estimulantes del crecimiento" a los aditivos que forman parte de la dieta animal y que cumplen con la función de mejorar el aumento de peso diario de los animales (GDP), así como el factor de conversión alimenticia. En la presente invención, los promotores o estimulantes del crecimiento pueden ser administrados de diferentes maneras, ya sean inyectados, en implantes o como un aditivo en el alimento o piensos de los animales. Se prefiere la administración como un aditivo en el alimento o pienso. En la presente invención, el efecto sobre el crecimiento se mide como incremento de la biomasa.
A los efectos de la presente invención, el término ácido orgánico se refiere a compuestos que contienen en su fórmula uno o más grupos carboxílicos (-COOH), generadores de protones, que pueden tener además diferentes grupos funcionales tales como hidroxiácidos, cetoácidos, ácidos aromáticos, compuestos heterocíclicos, así como amidas y lactonas. Los ácidos orgánicos utilizados en la presente invención son preferentemente ácidos grasos volátiles, preferentemente de cadena corta y entre los que se pueden seleccionar: ácido butírico, ácido propiónico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido láurico, ácido cúprico, ácido caprílico, ácido caproico, ácido acético, entre otros. Las proporciones en las que se encuentra el ácido orgánico en el aditivo para alimentación animal descrito en la presente invención, suelen variar entre un 30 y un 70% en peso de producto total húmedo, siendo la proporción preferida de un 50%.
En el contexto de la presente invención, "probiótico", se refiere a cualquier tipo de microorganismo viable aplicado a un huésped animal u hombre, y que afecta beneficiosamente al huésped, debido a sus efectos beneficiosos, en la salud o en el aumento de la resistencia a enfermedades, que éste pueda tener sobre su consumidor. Los probióticos pueden exhibir una o más de las características siguientes, no limitantes: no patógenos o no tóxicos para el huésped; están presentes como células viables, capaces de sobrevivir en el medio intestinal (por ejemplo, a bajo pH y a los ácidos y las secreciones gastrointestinales), adherencia a las células epiteliales, particularmente a las células epiteliales del tracto gastrointestinal, actividad microbicida o microbiostática o efecto hacia las bacterias patógenas; actividad anticancerígena; actividad de modulación inmune; actividad moduladora de la actividad hacia la flora endógena; mejoramiento de la salud del tracto urogenital; actividad antiséptica en o alrededor de las heridas; reducción de la diarrea; reducción de las reacciones alérgicas; reducción en la enterocolitis necrotizante neonatal; reducción en la enfermedad inflamatoria intestinal y reducción de la permeabilidad intestinal.
A efectos de la presente invención, el término "viable" se refiere a un microorganismo vivo capaz de reproducirse y/o de colonizar. Tal como se utiliza en el presente documento, las formas singulares "un", "un", y "el" incluyen referencia plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa.
Del mismo modo, las palabras "comprender" y "comprende" deben ser interpretados de manera inclusiva y no exclusiva, abarcando, recíprocamente, los términos "consistir" y "consiste".
Descripción de las figuras Figura 1. Biomasa del camarón Litopenaeus vannamei de aproximadamente 0.85 g de peso, analizada cada 10 días, durante un periodo total de 60 días. Los camarones fueron alimentados con el alimento estándar al que se añadieron los diferentes aditivos de la invención a la concentración de 2g/Kg dieta estándar: ECOBI OL que contiene el probiotico CECT 5940 (primera columna-barra cuadriculada), o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+BP70 (segunda columna-barra blanca), o ECOBIOL SUPER que contiene la combinación de los probioticos CECT 5940+CECT 953+BP70 (tercera columna-barra negra) o exclusivamente la dieta estándar (grupo control) (cuarta columna-barra rayada). En el eje X se muestra el tiempo expresado en días y en el eje Y la biomasa expresada en gramos. * p<0.05 vs control.
Figura 2. Porcentaje de supervivencia de Litopenaeus vannamei de aproximadamente 0.85 g de peso, analizado cada 10 días, durante un periodo total de 60 días alimentando a los camarones con una dieta estándar a la que se añadieron los diferentes aditivos de la invención a la concentración de 2g/Kg dieta estándar: ECOBIOL que contiene el probiotico CECT 5940 (línea discontinua con rombo), o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+BP70 (línea continua con círculo) , o ECOBIOL SU PER que contiene la combinación de los probioticos CECT 5940+CECT 953+BP70 (línea discontinua con triángulo) o exclusivamente la dieta estándar (línea continua con cuadrado). En el eje X se muestra el tiempo expresado en días y en el ej e Y la supervivencia expresada en forma de porcentaje. * p<0.05 vs control.
Figura 3. Factor de conversión alimenticia (gramos de alimento por gramo de biomasa cosechada) de Litopenaeus vannamei de aproximadamente 0.85 g de peso, al final de los 60 días del cultivo, alimentados con su dieta estándar más los aditivos descritos en la invención, ECOBIOL que contiene el probiotico CECT 5940, o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+ BP70, o ECOB I O L SU PE R q ue contiene la combinación de los probioticos CECT 5940+CECT 953+BP70 o exclusivamente la dieta estándar (grupo control).
Figura 4. Biomasa de Litopenaeus vannamei de aproximadamente 7.0 g de peso, analizada cada 10 días, durante un periodo total de 60 días. Los camarones fueron alimentados con el alimento estándar al que se añadieron los diferentes aditivos de la invención a la concentración de 2g/Kg de dieta estándar: ECOBIOL que contiene el probiotico CECT 5940 (primera columna-barra cuadriculada) , o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+BP70 (segunda columna-barra blanca), o ECOBIOL SUPER que contiene la combinación de los probioticos CECT 5940+CECT 953+BP70 (tercera columna-barra negra) o exclusivamente la dieta estándar (grupo control) (cuarta columna-barra rayada). En el eje X se muestra el tiempo expresado en días y en el eje Y la biomasa expresada en gramos. * p<0.05. Figura 5. Porcentaje de supervivencia de Litopenaeus vannamei de aproximadamente 7.0 g de peso, analizado cada 10 días, durante un periodo total de 60 días alimentando a los camarones con una dieta estándar a la que se añadieron los diferentes aditivos de la invención a la concentración de 2g/Kg de dieta estándar: ECOBIOL que contiene el probiotico CECT 5940 (línea discontinua con rombo), o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+BP70 (línea continua con círculo) , o ECOBIOL SU PER que contiene la combinación de los probioticos CECT 5940+CECT 953+BP70 (línea discontinua con triángulo) o exclusivamente la dieta estándar (grupo control) (línea continua con un aspa). En el eje X se muestra el tiempo expresado en días y en el eje Y la supervivencia expresada en forma de porcentaje.
Figura 6. Factor de conversión alimenticia (gramos de alimento por gramo de biomasa cosechada) de Litopenaeus vannamei de aproximadamente 7.0 g de peso, al final de los 60 días del cultivo, alimentados con su dieta estándar más los aditivos descritos en la invención, a la concentración de 2g/Kg de dieta estándar: ECOBIOL que contiene el probiotico CECT 5940, o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+BP70 o ECOBIOL SUPER que contiene la combinación de los probioticos CECT 5940+CECT 953+BP70 o exclusivamente la dieta estándar (grupo control).
Figura 7. Respuesta de la actividad enzimática digestiva en los hepatopáncreas del camarón Litopenaeus vannamei, ante el estímulo de dietas conteniendo los diferentes tipos de probioticos: ECOBIOL que contiene el probiotico CECT 5940 (línea discontinua con rombo), o ECOBIOL PLUS que contiene el probiotico CECT 5940+BP70 (línea continua con círculo), o ECOBIOL SUPER que contiene la combinación de los probióticos CECT 5940+CECT 953+BP70 (línea discontinua con triángulo) o exclusivamente la dieta estándar (grupo control) (línea continua con cuadrado). A tiempo 0 los camarones aún no recibían el ali mento; 1 , 2, 3, 4 y 5h corresponden al tiempo después de que los camarones recibieron el alimento. (a)= Lipasas, (b)= Proteasas, (c) Amilasas y (d)= Quimiotripsinas. En el eje X se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y se muestra la actividad enzimática específica expresada como U/mg proteína. Figura 8. Estudio del crecimiento de la Tilapia del Nilo Oreochromis niloticus (media±DE) alimentada con diferentes concentraciones del aditivo de la invención ECOBIOL que comprende el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940. G1 : grupo control alimentado con una dieta basal. G2 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x109 u.f.c/kg. G3 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x107 u.f.c/kg. (A) Las barras indican el peso corporal inicial (IBW), el peso corporal final después de 30 días (FBW1), el peso corporal final después de 60 días (FBW2), aumento de peso después de 30 días (WG1), y el aumento de peso después de 60 días (WG2 ). (B) La figura muestra la tasa de crecimiento específico (SGR) de cada uno de los grupos de estudio en los dos meses del estudio. (C) La figura muestra la relación de eficacia proteica (PER) para cada uno de los grupos de estudio.
Figura 9. Morfología intestinal de la Tilapia del Nilo O. niloticus después de 2 meses alimentados con el probiotico de la invención ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940).
(A) Fotografía de una sección transversal de la parte proximal del intestino teñidas con hematoxilina&Eosina (H&E) donde se muestra la altura de plegado (flechas dobles), las células secretoras de moco (cabezas de flecha) y los linfocitos intraepiteliales (I EL) (flechas). Barra de escala: 50 μηι. (B) La figura muestra la altura de las vellosidades (media ± DE) en las partes proximal, medio y distal del intestino. El asterisco (*) indica una altura de la vellosidad significativamente mayor en la parte proximal del intestino grueso respecto a otras partes del intestino, dentro del mismo grupo. G1 : grupo control alimentado con una dieta basal. G2 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x109 u.f.c/kg. G3 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x107 u.f.c/kg. Una sección transversal de la parte distal del intestino manchado por la tinción de azul alcián mostró pocas células secretoras de moco (flecha) en el grupo de control (C) y numerosas células secretoras de moco en el grupo suplementado con el probiotico ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) (D). Barra de escala: 50 μηι. (E) La figura muestra el número de células secretoras de moco (media ± DE) en las partes proximal, media y distal del intestino. (F) Las barras indican el número de IEL (media ± DE) en las partes proximal, media y distal del intestino. Figura 10. Parámetros hematológicos de la Tilapia del Nilo O. niloticus alimentados con el aditivo de la invención ECOBIOL que contiene el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940), durante 2 meses.
(A) recuento de glóbulos rojos. (B) Contenido de Hemoglobina. (C) %PCV (Packed Cell Volume en sus siglas en inglés, Hematocrito). (D) Recuento de glóbulos blancos. (E) Nivel de glucosa. (F) Concentración de proteínas séricas (proteínas totales, albúmina y globulina). G1 : grupo control alimentado con una dieta basal. G2 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x109 u.f.c/kg. G3 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x107 u.f.c/kg.
Figura 11. Constituyentes del cuerpo de la Tilapia del Nilo O. niloticus alimentados con diferentes concentraciones del aditivo ECOBIOL que contiene el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940, durante 2 meses. Las barras indican el % de proteína cruda (A), % de lípidos crudos (B), contenido de ceniza (polvo o impurezas) (C) y % de humedad (D). G1 : grupo control alimentado con una dieta basal. G2 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x109 u.f.c/kg. G3 grupo alimentado con una dieta basal suplementada con el probiotico B. amyloliquefaciens CECT 5940 a una concentración de esporas de 1x107 u.f.c/kg.
Figura 12. Biomasa (expresada en Kg) de la trucha arco iris Oncorhynchus mykiss analizada a los 60 días de comenzar el tratamiento. El diseño experimental se explica en el Ejemplo 6. Cada uno de los tratamientos analizados comprende:
T1 : 43% de harina de pescado (HP) y 25 % de torta de soya (TS)
T2: 29 % de HP y 50% de TS T3: HP+ECOBIOL
T4: TS+ECOBIOL
T5: HP+BP-70
T6: TS+BP-70
T7: HP+ECOBIOL+BP-70
T8: TS+ ECOBIOL+BP-70
Figura 13. Longitud (expresada en cm) de la trucha arco iris O.mykiss analizada a los 60 días de comenzar el tratamiento. El diseño experimental se explica en el Ejemplo 6. Cada uno de los tratamientos analizados comprende:
T1 : 43% de harina de pescado (HP) y 25 % de torta de soya (TS)
T2: 29 % de HP y 50% de TS
T3: HP+ECOBIOL
T4: TS+ECOBIOL
T5: HP+BP-70
T6: TS+BP-70
T7: HP+ECOBIOL+BP-70
T8: TS+ ECOBIOL+BP-70 Figura 14. Consumo de alimento (expresado en Kg) de la trucha arco iris O.mykiss analizada a los 60 días de comenzar el tratamiento. El diseño experimental se explica en el Ejemplo 6. Cada uno de los tratamientos analizados comprende:
T1 : 43% de harina de pescado (HP) y 25 % de torta de soya (TS)
T2: 29 % de HP y 50% de TS
T3: HP+ECOBIOL
T4: TS+ECOBIOL
T5: HP+BP-70
T6: TS+BP-70
T7: HP+ECOBIOL+BP-70
T8: TS+ ECOBIOL+BP-70
Figura 15. Conversión del alimento (C.A.) de la trucha arco iris O.mykiss analizada a los 60 días de comenzar el tratamiento. El diseño experimental se explica en el Ejemplo 6. Cada uno de los tratamientos analizados comprende:
T1 : 43% de harina de pescado (HP) y 25 % de torta de soya (TS)
T2: 29 % de HP y 50% de TS T3: HP+ECOBIOL
T4: TS+ECOBIOL
T5: HP+BP-70
T6: TS+BP-70
T7: HP+ECOBIOL+BP-70
T8: TS+ ECOBIOL+BP-70
Figura 16. Supervivencia (expresada en forma de %) de la trucha arco iris O.mykiss analizada a los 60 días de comenzar el tratamiento. El diseño experimental se explica en el Ejemplo 6. Cada uno de los tratamientos analizados comprende:
T1 : 43% de harina de pescado (HP) y 25 % de torta de soya (TS)
T2: 29 % de HP y 50% de TS
T3: HP+ECOBIOL
T4: TS+ECOBIOL
T5: HP+BP-70
T6: TS+BP-70
T7: HP+ECOBIOL+BP-70
T8: TS+ ECOBIOL+BP-70 Descripción detallada de la invención
Un aspecto de la presente invención se refiere a un aditivo para alimentación de animales acuáticos que comprende la combinación de, al menos, dos especies pertenecientes al género Bacillus, seleccionadas de entre B. amyloliquefaciens y Bacillus cereus.
En una realización preferida, el aditivo de la invención comprende las cepas CECT 5940 de Bacillus amyloliquefaciens y la cepa CECT 953 de Bacillus cereus.
En otra realización preferida de la invención, el aditivo para alimentación de animales acuáticos puede comprender además otros probióticos seleccionados de entre cualquiera de los siguientes géneros: Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus y Lactobacillus. En realizaciones preferidas, los probioticos comprenden al menos una cepa adecuada o subespecie de entre: Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium y Pediococcus y/o combinaciones de las mismas. En una realización más preferida de la invención la cepa se seleccionan del género Pediococcus, preferentemente de la especie Pediococcus acidilactici, y en una real ización más preferida, el probiótico más preferido es Pediococcus acidilactici cepa CNCM MA 18/5 M, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur de París. Los aditivos descritos en la presente invención incluyen probioticos en una cantidad adecuada para mejorar el sistema inmunológico, para aumentar los efectos beneficiosos de los probioticos y/o para incrementar la biomasa de los animales y/o extender la vida de los mismos. En general, los aditivos alimenticios comprenden aproximadamente de 105 a 1010 UFC/g de pienso para cada uno de los probioticos utilizados, siendo preferida una concentración de aproximadamente 106 UFC/g de pienso, de cada uno de los probioticos utilizados.
El experto en la técnica puede determinar la cantidad apropiada de los probioticos que se añade al aditivo de la invención. Dichos factores que pueden tenerse en cuenta son el promedio de consumo de determinados tipos de composiciones de diferentes animales, si el animal que tiene la intención de ingerir los suplementos dietéticos tiene algún problema de salud en particular, el bienestar o las necesidades nutricionales, o sufre de una enfermedad o trastorno, la edad, sexo, tamaño o especie del animal. Las concentraciones de los probioticos para ser añadidos al aditivo de la invención pueden calcularse sobre la base de los requerimientos de energía y nutrientes del animal.
En otra realización preferida de la invención el aditivo comprende además al menos una sal de un ácido orgánico. En otra realización preferida, los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: butírico, propiónico, fórmico, láctico, cítrico, láurico, cúprico, caprílico, caproico o acético.
En otra realización más preferida de la invención, las sales de los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: sódica, cálcica, cúprica o potásica. Las proporciones en las que se encuentra la sal del ácido orgánico en el aditivo para alimentación animal descrito en la presente invención, suele variar entre un 30 y un 70% en peso del aditivo final húmedo, siendo la proporción preferida de un 60%.
En otra realización aún más preferida, la sal del ácido orgánico que comprende el aditivo de la invención es la sal sódica del ácido butírico (butirato sódico), aunque puede ser utilizada cualquiera de las sales de los ácidos descritos previamente.
En otra realización preferida el aditivo de la invención se caracteriza por que comprende una combinación de los probióticos CECT 5940 de B. amyloliquefaciens y CECT 953 de B. cereus junto con sal sódica del ácido butírico.
Los aditivos de la invención, pueden comprender adicionalmente también sustancias tales como: minerales, vitaminas, proteínas, aminoácidos, colorantes, conservantes, etc. Ejemplos no limitantes de minerales incluyen por ejemplo: calcio, fósforo, potasio, sodio, hierro, cloro, cobre, zinc, magnesio, manganeso, selenio, etc. Ejemplos no limitantes de vitaminas incluyen por ejemplo: Vitamina A, diferentes tipos de Vitamina B (niacina, acido pantoténico, ácido fólico, biotina) Vitamina D y Vitamina K.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de los aditivos descritos en el presente documento en la cría de animales acuáticos, como promotores del crecimiento de dichos animales, siendo capaces de favorecer el factor de conversión del alimento, así como la actividad específica de enzimas digestivas, preferentemente de lipasas, proteasas, amilasas y quimiotripsinas.
En una realización preferida de la invención, los aditivos descritos aquí se usan para promover la salud y el bienestar de los animales acuáticos.
En otra real ización preferida de la i nvención , los probióticos descritos aquí, preferentemente los probióticos seleccionados entre B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. subtilis y B. licheniformis y/o combinaciones de los mismos, se utilizan en la cría de animales acuáticos.
En otra realización más preferida, los probióticos utilizados para la cría de animales acuáticos son preferentemente el probiótico CECT 5940 de B. amyloliquefaciens y el probiótico CECT 953 de B. cereus. En otra realización más preferida, los probióticos utilizados para la cría de animales acuáticos se caracterizan por que además puede incluir un probiótico adicional del género Pediococcus, preferentemente la especie Pediococcus acidilactici y más preferentemente la cepa CNCM MA 18/5 M, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur de París.
En otra realización más preferida de la invención, los probióticos utilizados para la cría de animales acuáticos se caracterizan por que además comprenden al menos una sal de un ácido orgánico, encontrándose dicha sal del ácido orgánico preferentemente en una proporción de entre un 30-70% en peso húmedo, siendo más preferible una proporción del 60%.
En otra realización más preferida de la invención, los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: butírico, propiónico, fórmico, láctico, cítrico, láurico, cúprico, caprílico, caproico o acético.
En otra realización más preferida de la invención, las sales de ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: sódica, cálcica, cúprica o potásica. En otra realización más preferida aún de la invención, los probióticos utilizados para la cría de animales acuáticos se caracterizan por que la sal del ácido orgánico es la sal sódica del ácido butírico.
En otra realización más preferida de la invención, los probióticos utilizados para la cría de animales acuáticos comprenden una combinación de los probióticos CECT 5940 de B. amyloliquefaciens y CECT 953 de B. cereus junto con sal sódica del ácido butírico.
En otra realización preferida de la presente invención, los probióticos utilizados para la cría de animales acuáticos, además también presentan la capacidad de modular la respuesta inmune y ejercer un efecto bactericida frente a microorganismos patógenos. Por otro lado, tal y como se demuestra en la presente invención, los probióticos descritos aquí presentan además, la capacidad de ejercer una acción biorremediadora, ayudando por tanto al mantenimiento del ambiente de las superficies en las que se localizan, preferentemente gracias a la secreción de exo-enzimas que descomponen la materia orgánica y disminuyen la DQO (demanda química de oxígeno) parámetro aceptado como indicador de calidad de agua. En otra realización preferida de la invención, los animales acuáticos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: moluscos, crustáceos, tilapia, dorada, lubina y salmónidos, siendo preferidos los crustáceos, preferentemente los camarones. Todos los porcentajes expresados aquí son en peso de la composición de aditivo en base a materia seca a menos que específicamente se indique lo contrario.
La invención no se limita a la metodología en particular, los protocolos y reactivos descritos en este documento, ya que pueden variar. Además, la terminología usada aquí es para el propósito de describir las realizaciones particulares solamente y no está destinado a limitar el alcance de la presente invención.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos, científicos y cualquier acrónimo utilizado aquí tiene el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto medio en la técnica dentro del campo de la invención.
Los ejemplos que se describen a continuación tienen como objetivo ilustrar la presente invención, pero sin limitar el alcance de la misma. Ejemplo 1. Respuesta del crecim iento y supervivencia del camarón blanco Litopenaeus vannamei ali mentado con dieta estándar suplementada con los aditivos de la invención.
Se utilizaron camarones de la especie Litopenaeus vannamei, seleccionados al azar, con un peso promedio de 0.85 g. Dichos camarones fueron previamente aclimatados durante 72 horas en un tanque de 2500 litros de agua marina con 36.0 UPS (unidades prácticas de salinidad), aireación constante (>4.0 mg/l de oxígeno), temperatura controlada (30 a 34°C) y pH de 7.5 a 8.0. Los camarones se cultivaron en acuarios de 10 L, con agua marina y conservando las variables de calidad mencionadas anteriormente. Los ensayos se llevaron a cabo con un total de 8 camarones por acuario con seis replicaciones para cada uno de los aditivos alimenticios utilizados en la presente invención. El experimento tuvo una duración de 60 días, con biometrías cada 10 diez días con el fin de evaluar las tasas de crecimiento, supervivencia y biomasa. La biomasa se refiere a la suma de los pesos individuales de los camarones presentes en cada uno de los tratamientos con los diferentes aditivos dietéticos. Para la elaboración de las dietas se utilizó un alimento/pienso comercial utilizado comúnmente para la alimentación de los camarones con un 35% de proteína el cual fue molido y tamizado a 200 mieras. Los diferentes probióticos fueron agregados en forma de aditivo a la dieta estándar a razón de 2g/Kg de alimento. Una vez incorporado el aditivo a la dieta estándar, la mezcla fue homogenizada y pasada por un molino para carnes y finalmente por un horno de secado a 40°C durante 12 horas. El alimento fue colocado en comederos; el alimento no consumido posterior a las dos horas fue retirado y posteriormente pesado para su análisis. Las cuatro dietas analizadas que contenían los suplementos dietéticos o aditivos descritos en la presente invención se describen en la Tabla l .
Tabla 1. Los camarones se alimentaron tres veces al día ad limitum de acuerdo con el siguiente programa de alimentación.
Figure imgf000020_0001
Por consiguiente, cuando en la presente descripción se habla de alimento en los ensayos llevados a cabo, este término comprende tanto la dieta estándar suministrada a los controles, formada por el alimento comercial arriba indicado, como la mezcla de éste con los diferentes aditivos de la invención.
Como se ha indicado previamente a lo largo del presente documento, el probiotico ECOBIOL comprende la bacteria B. amyloliquefaciens cepa CECT 5940, el probiotico ECOBIOL PLUS que contiene la bacteria B. amyloliquefaciens cepa CECT 5940 junto con la sal sódica del ácido butírico BP70. Como se ha mencionado previamente, la sal sódica del ácido butírico, específicamente la composición de Norel, S.A. llamada BP-70 está formada, por un 70% en peso húmedo de butirato sódico y un 30% en peso húmedo de grasas vegetales. El 30% de la grasa vegetal protege aproximadamente el 43% del butirato sódico total, así por tanto, el producto BP-70 se puede decir que está formado por un 30% de butirato sódico protegido y por un 40% de butirato sódico sin proteger. El probiótico ECOBIOL SUPER contiene la combinación de las bacterias B. amyloliquefaciens cepa CECT 5940, junto B. cereus cepa 953 y junto con BP-70.
El alimento fue agregado a saciedad tres veces al día utilizando comederos. El factor de conversión alimenticia (FCA) , fue calculado en gramos de alimento por gramo de biomasa extraída; utilizando los valores del alimento agregado diariamente, el no consumido y la biomasa de camarón obtenida al final de los 60 días del experimento. El crecimiento y la supervivencia de los camarones fueron evaluadas cada 10 días registrando el peso promedio y el número de camarones respectivamente.
Los resultados de crecimiento y supervivencia muestran, como se puede observar en las Figuras 1 y 2 respectivamente, que los camarones ali mentados con la dieta suplementada con el aditivo ECOBIOL SUPER generó diferencias significativas (p<0.05) de peso y supervivencia ya a partir de los 40 días del experimento, con respecto a la dieta control. Como además se puede observar en la Figura 1 , los camarones alimentados con los aditivos ECOBIOL, ECOBIOL PLUS y ECOBIOS SUPER, a los 60 días de tratamiento, muestran un incremento significativo (p<0.05) en su biomasa respecto al grupo control.
Para demostrar si el peso inicial del animal influye en la respuesta al crecimiento y la supervivencia de los camarones alimentados con los diferentes aditivos dietéticos descritos en la invención, se diseñó un experimento con camarones, seleccionados al azar, con un peso promedio de 7.0 g. Como se puede observar en la Figura 4, ya a partir del día 30 de tratamiento, los camarones alimentados con la dieta ECOBIOL SUPER presentaron un incremento significativo en su biomasa con respecto a los camarones alimentados con la dieta control (p<0.05). Por otro lado, tal y como puede observarse en la Figura 5 los camarones alimentados con las dietas conteniendo los aditivos de la invención, mostraron un mayor porcentaje de supervivencia respecto a los animales alimentados exclusivamente con la dieta estándar, grupo control y un mejor factor de conversión del alimento (Figura 6).
El aprovechamiento del alimento, analizado como factor de conversión alimenticia, fue mejor en las dietas que contenían los aditivos de la invención (Figuras 3 y 6), lo que indica que los animales tienen mayor disponibilidad de nutrientes para el crecimiento y para la obtención de energía. Esto a largo plazo, se refleja en lograr animales más sanos y con tallas más adecuadas para la comercialización, en un menor tiempo. Por lo tanto, los datos mostrados en la presente invención, ponen de manifiesto que los aditivos descritos funcionan como promotores del crecimiento en animales acuáticos, preferentemente crustáceos, con resultados superiores a los obtenidos con la dieta estándar, sin incluir aditivos.
Ejemplo 2. Actividad enzimática digestiva del camarón blanco L. vannamei alimentado con los diferentes aditivos descritos en la invención.
La expresión y actividad de enzimas digestivas es afectada por una serie de factores limitantes como por ejemplo: parámetros físico-químicos del agua (pH, oxígeno, salinidad y temperatura), edad y tamaño del camarón, cambios ontogénicos, ayuno, ingredientes de la dieta, nivel y fuente proteica, nivel y tipo de aglutinantes, aditivos promotores de crecimiento, cantidad y frecuencia de alimentación, ciclos circadianos, ciclo de muda e incluso el agua de cultivo.
Para determinar la respuesta de actividad enzimática digestiva ante el estímulo de los diferentes aditivos dietéticos utilizados en la presente invención: ECOBIOL, ECOBIOL PLUS y ECOBIOL SÚPER, se utilizaron camarones juveniles de L vannamei, con un peso promedio de 6 g, los cuales fueron mantenidos en ayuno por 12 horas y previamente seleccionados en estadios de intermuda. La intermuda se conoce como la secuencia de transformaciones comprendidas entre dos mudas (eliminación del antiguo exoesqueleto y la formación de un tegumento nuevo y generalmente de mayor tamaño), en cuyo período se cumple un ciclo completo de modificaciones morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, responsables del crecimiento. Las mediciones de dicha actividad enzimática se realizaron en intervalos de una hora, durante un tiempo de 5 horas.
La actividad y producción de enzimas digestivas en el hepatopáncreas de los crustáceos se encuentra controlada principalmente por hormonas. El hepatopáncreas, a diferencia del intestino y estómago, presenta una mayor actividad enzimática, sugiriendo la importancia de dicho órgano en la síntesis y secreción de enzimas digestivas.
Para el análisis de la actividad enzimática digestiva se determinó la actividad proteasa, lipasa, amilasa y quimiotripsinasa, en los extractos enzimáticos preparados mediante la metodología propuesta por Galgani F. (Galgani, F. PhD. Thesis Université dÁix-Marseille //. Etude des proteases digestives de crevettes peneides (Crustácea Decapada) France. 1983) en los hepatopáncreas extraídos de los camarones, a los intervalos indicados previamente y que estaban almacenados, para dicho análisis, a una temperatura de - 48°C. Además se determinó, mediante el método de Bradford la concentración de proteínas presentes en dichos extractos enzimáticos. Para obtener los datos de actividad proteasa presente en los extractos enzimáticos se siguió el método descrito por Hernández C.M. (Hernández, C.M. Crustacean protease characterization biochemical and molecular consideration. Comprehensive summary Ph D Thesis. 1983. Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La Paz, B.C.S. México.), usando como sustrato la azocaseína. La actividad lipasa presente en los extractos se determinó de acuerdo a Versaw W.K. et al. (Versaw, W.K. et al. Journal of Food Science. 1989; 54: 1557-1558), usando como sustrato el R-naftil caprilato. La determinación de la actividad amilasa se realizó de acuerdo a Vega-Villasante et al. , (Vega-Villasante, F. et al. Bulletin of Marine Science, 1999; 65: 1-9), usando como sustrato almidón al 1 % en TRIS-HCL (50 mM, pH 8.0). La actividad quimiotripsina fue evaluada de acuerdo a Delmar E.G. et al. (Delmar E.G. et ai. Anal Biochem. 1979; 99:318-320. La actividad específica de cada enzima está representada en unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg).
Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que, la adición de los aditivos descritos en la invención a la dieta del camarón L. vannamei, incrementaron la actividad enzimática digestiva, presentando una mayor expresión de las enzimas digestivas analizadas (Figura 7) respecto a los camarones alimentados con la dieta control. Los camarones que recibieron el aditivo ECOBIOL SÚPER mostraron una mayor evidencia en la actividad específica de las enzimas lipasas y quimiotripsina (lípidos y proteínas).
Se concluye que los aditivos descritos en la presente invención utilizados en las dietas para animales acuáticos, preferentemente crustáceos y particularmente, la combinación de los probióticos CECT 5940+CECT 953+butirato sódico (BP-70), favorecen la actividad específica de las enzimas digestivas y el factor de conversión en el alimento de los crustáceos lo cual sugiere un mayor aprovechamiento del alimento, así como un incremento en su biomasa y supervivencia, respecto a animales alimentados con una dieta control, no suplementada con los aditivos de la invención. Ejemplo 3. Estudio in vitro de la capacidad de liberación de bacteriocinas del aditivo de la invención B. amyloliquefaciens CECT 5940 y análisis de su actividad biocida frente a organismos patógenos. Las bacteriocinas son péptidos microbianos de reducido tamaño y que son liberadas extracelularmente. Dichos péptidos tienen un efecto bactericida o bacteriostático sobre otras especies bacterianas. El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de producción de bacteriocinas del aditivo de la invención, B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL).
Para analizar la capacidad de producción de bacteriocinas por parte del aditivo de la invención B. amyloliquefaciens CECT 5940, dichas cepas son crecidas en un matraz con 50 mi de medio TSB (Bioser) durante 24 horas y con él se inoculan 2 matraces con 50 mi de medio TSB en proporción 1 : 100 que se mantienen en agitación a 200 rpm y 30°C durante 48 horas.
De estos matraces se toman muestras a las 7, 24 y 48 horas de cultivo. Se eliminan las células de los cultivos por centrifugación durante 20 minutos a 4000 rpm . De los sobrenadantes de las distintas muestras recogidas una parte fue neutralizada a pH 6.2 con HCI 5M y la otra se mantuvo con el pH original de la muestra tomada y que se muestra en la Tabla 2, con el fin de simular las condiciones fisiológicas en el intestino proximal y distal. Ambas fracciones fueron esterilizadas a través de un filtro de 0.22 μηι. Estas preparaciones fueron almacenadas a -20°C hasta su uso. La actividad biocida de los sobrenadantes previamente mencionados, se determinó por el método de difusión en placas (Cintas, L.M. et al. (1995). Applied & Environmental Microbiology. 61 : 2643-2648), sembradas con microorganismos patógenos de diferentes géneros. Cabe mencionar que todos los microorganismos utilizados en la presente invención, bien se disponía de muestras de los mismos o se han obtenidos de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), sita en el Parque Científico de la Universidad de Valencia. Calle Catedrático Agustín Escardino, 9 de Paterna (Valencia). 3.1 Actividad biocida del aditivo de la invención ECOBIOL (B. amyloliciuefaciens CECT 5940) frente a organismos del género Clostridium Spp.
Todas las cepas de Clostridia se cultivaron en medio de agar-clostridium a una concentración aproximada de 106 UFC/placa. A excepción de B. amyloliquefaciens CECT 5940, que se cultivó a 30 °C, el resto de las cepas se incubaron a 37 °C en ausencia de oxígeno, en el interior de frascos de anaerobiosis.
Las siguientes cepas de Clostridium se utilizaron como indicadores de la existencia de bacteriocinas.
Clostridium butyricum CECT 361 T
Clostridium perfringens CECT 376T
Clostridium perfringens CECT 486
Clostridium perfringens CECT 820
Clostridium perfringens C ECT 821
Clostridium perfringens CECT 822
Clostridium histolyticum CECT 4109T
50 μΙ de cada sobrenadante del cultivo de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL) se depositaron en los pocilios (6mm de diámetro) de placas de Nutrient Agar (BioKar, pH 7± 0.2) suplementado con 3% v/v de NaCI, previamente sembradas con 200 de un cultivo que se había mantenido en crecimiento toda la noche de los microorganismos patógenos a ensayar frente a los que se pretende probar la producción de bacteriocinas. Como control se emplea el medio TSB.
Tras 2 horas a 4°C para permitir la difusión del producto en el medio, las placas se incuban a las temperaturas correspondientes para cada uno de los microorganismos patógenos, para permitir el crecimiento del organismo diana. Tras 24 horas, se determina la presencia o ausencia de un halo de inhibición del crecimiento. Todos los muéstreos se realizaron por duplicado, tanto en la recogida de sobrenadantes, como en la siembra de placas.
La actividad biocida de los sobrenadantes de cultivos de B. amyloliquefaciens CECT 5940 contra diferentes cepas bacterianas del género Clostridium patógenas, se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Efecto biocida in vitro de los sobrenadantes aislados de cultivos de B. amyloliquefaciens CECT 5940 frente a diferentes cepas bacterianas del género Clostridium.
Figure imgf000026_0001
+: Inhibición del crecimiento; -: no inhibición del crecimiento;
Los datos mostrados en la Tabla 2 se explican como sigue: (cm de halo de inhibición) +: 1 cm de halo de inhibición
+ +: 1 ,5 cm de halo de inhibición
+ + +: 1 ,8 cm de halo de inhibición
+ + + +: 2,2 cm de halo de inhibición
-: Ausencia de halo de inhibición
Los sobrenadantes aislados de cultivos de B. amyloliquefaciens CECT 5940 inhibieron el crecimiento de la mayoría de cepas del género Clostridium analizadas (Tabla 2). En este sentido, los resultados mostrados en la Tabla 2 ponen de manifiesto que B. amyloliquefaciens CECT 5940 muestra una gran capacidad para liberar bacteriocinas durante las primeras 24 horas. Es conveniente comentar que, las cepas de la especie Clostridium butyricum CECT 361 T presentan un crecimiento poco homogéneo en relación al resto de las cepas, por lo que resulta difícil la determinación de su halo de inhibición. 3.2. Actividad biocida del aditivo de la invención ECOBIOL (B. amyloliciuefaciens CECT 5940) frente a organismos patógenos hemolíticos y enterotóxicos.
La concentración de bacterias patógenas 106 U FC/placa se inoculó con el medio adecuado. Varias muescas de un tamaño de 6 mm de diámetro se hicieron en las placas de cultivos de los microorganismos patógenos y el sobrenadante de B. amyloliquefaciens CECT 5940 se introdujo en cada uno (50 μΙ). Las placas se incubaron a 4 °C durante 2 horas para dejar que los diferentes componentes del sobrenadante difundan hacia el medio de cultivo de la placa. Después de eso, todas las placas se incubaron a 37 °C durante 24 horas y se procedió a determinar el halo de inhibición para así poner de manifiesto el efecto bactericida.
Las cepas patógenas evaluadas fueron:
Enterococcus faecalis CECT 4176
Enterococcus gallinarum CECT 970
Escherichia coli CECT 352
Escherichia coli CECT 434
Escherichia coli CECT 504
Escherichia coli CECT 728
Escherichia coli CECT 735
Escherichia coli CECT 742
Escherichia coli CECT 816
Escherichia coli CECT 4076
Escherichia coli CECT 4267
Escherichia coli CECT 4782
Escherichia coli CECT 4783
Staphylococcus aureus CECT 957
Yersinia enterocolitica CECT 754 Todas las cepas de E. coli se seleccionaron de acuerdo con el fenotipo (0:147 H:7). El resto son cepas patógenas conocidas según la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo), excepto Enterococcus, las cuales fueron seleccionadas como cepas bacterianas ácido lácticas (LAB).
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Efecto bactericida in vitro del aditivo de la invención ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) frente a diferentes bacterias patógenas.
Figure imgf000028_0001
Los resultados ponen de manifiesto que las cepas de E. coli patógenas, además de Yersinia, se inhiben con el sobrenadante del aditivo ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940).
Está plenamente demostrado que las cepas patógenas ven inhibido su crecimiento por las bacteriocinas incluso a pH elevado, teniendo por tanto las bacteriocinas un amplio espectro de acción. Las bacteriocinas no mostraron interacciones positivas con LAB, los efectos sólo son acusados por las bacterias patógenas.
3.3 Actividad biocida del aditivo de la invención ECOBIOL (B. amyloliciuefaciens CECT 5940) frente a organismos patógenos del género Vibrio.
Las bacterias del género Vibrio son bacterias Gram-negativas encontradas comúnmente en estuarios y aguas marinas, por lo general en climas templados y tropicales. Algunas especies, como por ejemplo, la especie V. parahaemolyticus, pueden causar gastroenteritis en humanos. Huéspedes naturales de V. parahemolyticus incluyen cangrejos, camarones, tortugas, ostras, langostas y peces. La especie V. gastroenteritis es a menudo asociada con la infección en camarones.
Estudio recientes han relacionado al patógeno V. parahemolyticus con la EMS también conocida como AHPNS (acute hepatopancreatic necrosis síndrome) patología causante de altas mortalidades de los camarones que ha producido ya pérdidas del orden de 1.000 millones de dólares en el sudeste de Asia. Un estudio realizado por Donald Lightner (Universidad de Arizona) ha encontrado que esta bacteria infectada por un fago produce una toxina que afecta al órgano digestivo del camarón, el hepatopáncreas produciendo la muerte de la práctica totalidad de los animales cultivados a edades muy tempranas.
Para demostrar el efecto bactericida del aditivo de la invención ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) sobre las bacterias del género Vibrio, particularmente sobre las especies V. parahaemolyticus CECT 51 1 y V. harveyi CECT 525, se utilizó la técnica del halo de inhibición. Brevemente, después del cultivo del aditivo que comprende B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL), extractos libres de células de B. amyloliquefaciens se obtuvieron por centrifugación y se usaron para probar el efecto bactericida de dicho sobrenadante sobre las cepas de Vibrio arriba mencionadas, mediante la técnica de halo de inhibición.
Las dos cepas fueron crecidas en medio Nutrient Broth (Biokar) suplementado con un 3% v/v de NaCI, e incubadas en agitador orbital a las temperaturas recomendadas en cada caso por la CECT durante 16 horas. Los resultados ponen de manifiesto que los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940), según se ha descrito previamente, mostraron halos de inhibición alrededor de las trazas realizadas sobre cultivos de la especie patógena V. parahemolyticus CECT 511, pero no, frente a los cultivos de V. harveyi CECT 525. Además, los resultados indican que la cepa V. parahaemolyticus CECT 511 , que presenta halo para todos los sobrenadantes recogidos, dichos halos de inhibición son más evidentes tras 24 horas de incubación. Por lo tanto, el sobrenadante de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL) contiene algún compuesto, tipo bacteriocina, que inhibe el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus CECT 511. Los números que aparecen en la Tabla 4 indican el diámetro del halo de inhibición en milímetros correspondientes a cada uno de los sobrenadantes ensayados (ha de tenerse en cuenta que el pocilio en el que se aplica la muestra tiene un diámetro de 6 mm que se incluye también en el tamaño del halo).
La capacidad demostrada de B. amyloliquefaciens CECT 5940 para inhibir el crecimiento de este patógeno, podría ayudar frente al control de la EMS.
Tabla 4. Efecto bactericida in vitro de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL) frente a las bacterias patógenas V. parahaemolyticus
Figure imgf000030_0001
3.4 Actividad biocida del aditivo ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) frente a organismos patógenos de las especies Aeromonas salmonicida y Yersinia ruckeri.
B. amyloliquefaciens CECT 5940 se incubó en medio TSA, que se ajustó a los pH de 5 y 8, con el fin de simular las condiciones fisiológicas en el intestino proximal y distal. Además, se evaluaron dos diferentes condiciones de salinidad (0,5 y 3%). Los ensayos de actividad (halo de inhibición) se llevaron a cabo en MHA-1 (Mueller-Hilton agar a 1 % de NaCI), en el que se inocularon los agentes patógenos y se colocaron los discos empapados con el probiótico. Los resultados se expresaron como inhibición (+) o falta de inhibición (-).
Los resultados se muestran a continuación:
Tabla 5. Efecto bactericida in vitro de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL) frente a las bacterias patógenas A.salmonicida y Y.ruckeri.
Figure imgf000031_0001
Los resultados (Tabla 5) ponen de manifiesto que a pH 5 y 8, así como en condiciones de alta salinidad, B. amyloliquefaciens CECT 5940 (ECOBIOL) presenta actividad inhibidora frente a bacterias patógenas que afectan al salmón y la trucha (A. salmonicida y Y. ruckeri).
Ejemplo 4. Capacidad de producción de ácidos orgánicos por B. amyloliquefaciens CECT 5940 en condiciones de anaerobiosis.
El objetivo del presente ejemplo es evaluar la capacidad de producción de ácido láctico del aditivo de la invención ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) en condiciones de anaerobiosis autogeneradas. Una vez que B. amyloliquefaciens CECT 5940 llega al intestino y comienza a crecer, la producción de ácido láctico excretado al lumen del intestino provoca una acidificación del medio que resulta en un crecimiento preferencial de la flora acidófila, teniendo ésta un efecto beneficioso sobre la salud intestinal. El crecimiento preferencial de este tipo de microorganismos desplaza a las bacterias patógenas mediante el conocido mecanismo de exclusión competitiva. Por todo lo anterior el estado sanitario del animal experimenta un fortalecimiento. Las condiciones de crecimiento y de cultivo de las cepas de B. amyloliquefaciens CECT 5940 ya se han descrito a lo largo del presente documento. La composición del medio experimental es la siguiente:
Semillas de soja micronizada 4%
Jarabe de glucosa 1 % (equivalente a 5, 1 g/L de azúcares reductores)
Extracto de levadura 1 %
La composición del medio descrito arriba imita la proporción de proteínas y carbohidratos en el lumen intestinal de los animales.
Cultivos experimentales se llevaron a cabo en botellas de 200 mi cerradas, para evitar la transferencia de oxígeno al medio de cultivo. El oxígeno disuelto inicialmente en el medio de cultivo, medido por sonda, era de aproximadamente un 0%, ya que fue eliminado en el proceso de esterilización anterior a la inoculación. Trazas de oxígeno disponible también se eliminaron en las primeras fases de crecimiento de microorganismos, por lo tanto, se crearon las condiciones de anaerobiosis autogenerados (igual que el lumen intestinal de los animales). Las condiciones de cultivo fueron: cultivos estáticos a 37 °C durante 24 horas. Los siguientes parámetros fueron evaluados en las muestras obtenidas a lo largo de la fermentación:
1. CFU/ml: De acuerdo con la técnica de dilución de suero y posterior recuento de colonias en el medio de cultivo adecuado de B. amyloliquefaciens CECT 5940. 2. La producción de ácido láctico: Los m étod os uti l i zad o s f u e ro n espectofotométricos, y la determinación de la presencia de NADH a una absorbancia de A340 en muestras de extracto de fermentación centrifugados y libre de células, con los sistemas enzimáticos Boehringer Mannheim.
3. Producción de ácido acético: El método utilizado fue espectofotométrico y la determinación de la presencia de NADH a A340 en muestras de extractos de fermentación centrifugados y libre de células, con sistemas enzimáticos Boehringer Mannheim.
4. Reductor de consumo de azúcares: El método utilizado fue colorimétrico, con el DNS reactiva, para establecer la cantidad residual de azúcares reductores en medios de cultivo de fermentación centrifugados. Para el cálculo de la tasa de producción de ácido se utilizaron fórmulas apropiadas:
Rendimiento (Y) = gramos de ácido/gramos de azúcar reductor consumido Tasa de producción de ácido (R) = gramos de ácido/109 UFC biomasa x hora
Los resultados pusieron de manifiesto la producción de ácido por parte de las cepas de B. amyloliquefaciens CECT 5940 en las condiciones de anaerobiosis autogenerados.
Tabla 6. Producción de ácido por parte de cultivos de B. amyloliquefaciens CECT 5940 en condiciones de anaerobiosis.
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La mayor parte de la producción de ácido por el metabolismo fermentativo de B. amyloliquefaciens CECT 5940 da lugar a ácido L-láctico, pero también es capaz de producir ácido acético. La capacidad de conversión de ácidos regulados por el pH intestinal es muy alta. Se puede lograr la misma masa de ácidos que las bacterias asimiladoras de azúcares. Tales ácidos se pueden utilizar como controladores de pH en el intestino (bio-control de patógenos) y/o como fuente de carbono y energía disponible. Además, el azúcar no convertido en ácido es utilizado como biomasa para el crecimiento de los microorganismos. Esta demostrada capacidad de producción de ácido láctico, ejerce un efecto de modulación de la flora bacteriana intestinal, beneficiando el crecimiento de las especies favorables e inhibiendo el crecimiento de patógenos que pudieran crecer produciendo infecciones.
Ejemplo 5. Respuesta del crecimiento, morfología intestinal, hematología y composición corporal de la Tilapia de Nilo (Oreochromis niloticus (L.)) alimentada con dieta estándar suplementada con los aditivos de la invención. En el presente ejemplo se evalúa el uso del aditivo de la invención ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) como probiótico en la tilapia del Nilo. Un total de 120 O. niloticus (L.) alevines (peso promedio de 9.4 ± 0.3 g) se dividieron en 3 grupos (20 peces/grupo) por duplicado. El grupo denominado G1 fue alimentado con una dieta basal como el grupo de control; mientras que los grupos denominados G2 y G3 fueron alimentados con la dieta basal a la que se le añadió el aditivo ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) en los niveles finales a una concentración de esporas del mismo de 1x109 y 1x107 u.f.c./kg, respectivamente.
Después de 30 días de alimentación, el grupo G2 mostró aumentos significativos en el peso corporal final (FBW, final body weight en sus siglas en inglés) (Figura 8), en el aumento de peso (WG, weight gain, en sus siglas en inglés) (Figura 8) y la tasa de crecimiento específico (SGR, specific growth rate, en sus siglas en inglés) (Figura 8) en comparación con los grupos G1 y G3. Al final del período de alimentación, los grupos G2 y G3 tuvieron aumentos significativos en FBW, WG, SGR (Figura 8A y B) y en la relación de eficacia proteínica (PER, protein efficacy ratio, en sus siglas en inglés) e n comparación con el grupo control (G1) (Figura 8C).
Además, el uso de una mayor concentración de probiótico en la dieta de los animales aumentó la altura de las vellosidades intestinales, especialmente en la parte proximal del intestino. Así, el grupo G2, presentó un número significativamente mayor de células secretoras de moco (células caliciformes), en las partes proximal y distal del intestino, que los grupos G3 o G1 (Figura 9A-E).
Los resultados obtenidos, también pusieron de manifiesto que los animales del grupo G2 presentaban una mayor concentración significativa de linfocitos intra-epiteliales (IEL, intra-epithelial lymphocytes, en sus siglas en inglés) en el intestino en comparación con el grupo control G1 , en todas las partes de los intestinos, mientras que el grupo G3 presentaba significativamente más lELs que el grupo control G1 , pero sólo en la parte distal del intestino (Figura 9F).
La adición a la dieta de la tilapia del Nilo del aditivo ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) no tuvo efectos nocivos sobre el recuento total de eritrocitos ni sobre los niveles de glucosa, pero sí que incrementó el contenido de hemoglobina, los valores del hematocrito y el recuento total de leucocitos (Figura 10).
La adición de alta concentración de B. amyloliquefaciens CECT 5940 en la dieta de la tilapia del Nilo (grupo G2) produjo mejores efectos que una menor concentración de dicho aditivo (grupo G3) sobre la concentración total de proteínas en suero y sobre los niveles de globulina. El contenido de proteínas en todo el cuerpo de los animales incluidos en los grupos G2 y G3 fueron superiores a los niveles de proteínas encontrados en el grupo control (G1). La mayor concentración de grasa se registró en el grupo G2, seguido del grupo G3 y a continuación el grupo G1 (Figura 11).
En otros experimentos realizados en tilapias cultivadas en presencia de la cepa patógena A. hydrofila, se observó que los animales que recibieron el aditivo de la invención ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) en la dieta presentaron mayor actividad lisozima (enzima con actividad antibacteriana) en sangre (p<0.05) y un incremento numérico en el recuento de glóbulos blancos. Estos parámetros indican una mejor predisposición a resistir infecciones.
Estos resultados ponen de manifiesto, por tanto, que la adición del aditivo ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) a la dieta de la tilapia del Nilo (O. niloticus), muestra un efecto beneficioso sobre dichos animales, tanto en la potenciación de su crecimiento, como de su sistema inmune (inmunoestimulador).
Ejemplo 6. Evaluación del aditivo de la invención ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) y de Gustor BP-70 como promotores de crecimiento en dietas con harina de pescado o torta de soya para alevines de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss).
El objetivo del presente ejemplo es evaluar la adición a una dieta de alevines de trucha arco iris (O. mykiss), dos promotores de crecimiento, ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) y Gustor BP-70, solos o combinados, en el nivel de 0.1 %, en dietas a base de harina de pescado o de torta de soya, sobre el comportamiento productivo, tomando en cuenta los parámetros de crecimiento (ganancia de peso y talla), conversión de alimento y supervivencia de dichos animales. Se utilizaron las facilidades de las instalaciones del Centro de Producción Piscícola de Vinchos, situado en el distrito de Canchayllo, perteneciente a la SAIS "Tupac Amaru", en el departamento de Junín (Perú). La elaboración de las dietas experimentales se realizó en la Planta de Alimentos Balanceados del Programa de Investigación y Proyección Social en Alimentos, Facultad de Zootecnia, de la Universidad Nacional Agraria La Molina (Lima, Perú), durante los meses de marzo, abril y mayo del 2012, con una duración de 60 días.
Se instalaron 170000 alevines de trucha arco iris en 30 estanques de 5 x 0.60 metros (unidades experimentales), con capacidad para 5000 peces cada uno. Se realizaron tres ingresos, en periodos de 15 días (réplicas); el primero con peces con peso promedio de 2.2 g y 6.0 cm de talla; a los 15 días se instalaron peces con un peso promedio 0.15 g y 2.25 cm de talla y a los siguientes 15 días, peces con un peso promedio de 0.08 g y 1.90 cm de talla. Se formularon dos dietas comerciales, una de ellas a base a harina de pescado (43%) y otra a base a torta de soya (50%), se utilizó la programación lineal a mínimo coste, según las recomendaciones del NRC (1993). A cada dieta experimental se le añadieron 0.1 % de
ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) o BP-70 o la mezcla de ambos, dando lugar a 8 tratamientos. Cada uno de los tratamientos comprende:
T1 : 43% de harina de pescado (HP) y 25 % de torta de soya (TS)
T2: 29 % de HP y 50% de TS
T3: HP+ECOBIOL
T4: TS+ECOBIOL
T5: HP+BP-70
T6: TS+BP-70
T7: HP+ECOBIOL+BP-70
T8: TS+ ECOBIOL+BP-70
Los datos de los resultados fueron sometidos a un análisis estadístico, considerando el Diseño de Bloques Completamente al Azar (DBCA), con la finalidad de expresar las diferencias entre los tratamientos, mediante el análisis de variancia (ANVA) y diferencias de los promedios en los parámetros evaluados utilizando la prueba estadística de DUNCAN . En la Tabla 7 se muestra la composición del alimento utilizado y su valor nutritivo. Tabla 7. Fórmulas usadas en las dietas experimentales y su valor nutritivo.
Dieta Basal Harina Dieta Basal Torta
Ingredientes (%) de Pescado de Soya
Harina de pecado prime 43.00 29.00
Harinilla de trigo 30.10 15.10
Torta de soya, 47 25.00 50.00
Aceite vegetal 1.00 3.00
Aceite semi refinado de pescado 1.92
Sal 0.58 0.66
Premezcla de vitaminas y minerales 0.30 0.30
Antioxidante 0.02 0.02
Total 100.00 100.00
Valor Nutricional Calculado
Proteína total, % 45.27 45.00
Fibra, % 2.81 2.78
Grasa, % 7.84 9.60
ED. Truchas, Mcal/kg 3.70 3.70
Lisina, % 3.20 3.15
Metionina, % 1.08 0.95
Cistina, % 0.51 0.59
Arginina, % 2.87 3.11
Histidina, % 1.12 1.14
Leucina, % 3.40 3.45
Isoleucina, % 2.10 2.10
Fenialanina, % 2.02 2.14
Tirosina, % 1.53 1.60
Treonina, % 1.85 1.85
Triptófano, % 0.55 0.59
Valina, % 2.37 2.41
Met+Cist, % 1.59 1.53
Fen-tir, % 3.53 3.72
Ac Gr n-3, % 1.79 1.97 Dieta Basal Harina Dieta Basal Torta
Ingredientes (%) de Pescado de Soya
Ac Gr n-6, % 0.62 1.61
Fósforo total, % 1.49 1.17
Calcio, % 1.71 1.24
Sodio, % 0.70 0.60
Potasio, % 1.26 1.50
Cloro, % 0.75 0.72
Colina, ppm 2957.75 2846.29
Prot Dig, % 41.80 42.43
6.1 Resultados del peso y de la talla de O. mykiss alimentados con las dietas descritas en la Tabla 7 ¡unto con los aditivos de la invención.
Los resultados de los parámetros de comportamiento productivo, cuyos valores corresponden al promedio de tres replicas, se muestra en las Figuras 12 a 16. Los peces alimentados con las dietas conteniendo mayor porcentaje de harina de pescado como fuente principal de proteína, mostraron mayor crecimiento en peso y talla comparado con aquellos que recibieron las dietas conteniendo torta de soya, en un 5.34 y 4.77%, respectivamente; experimentando mayor diferencia los peces de menor tamaño.
La adición de los aditivos ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) o BP-70 o la mezcla de ambos a las dietas con harina de pescado o torta de soya, no mejoraron estadísticamente la ganancia de peso y la talla (Figuras 12 y 13). Sin embargo, se observa una tendencia numérica a un mayor incremento de la talla con las dietas basadas en torta de soya con la adición de ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) o BP-70. Por otro lado, la adición de ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) a la dieta con torta de soya generó mayor crecimiento del peso y de la talla en los peces más pequeños, un 10 y un 16% respectivamente en relación a la dieta control sin ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) (Figuras 12 y 13). 6.2. Resultados del consumo de alimento y de la conversión alimenticia de O.mykiss alimentados con las dietas descritas en la Tabla 7 ¡unto con los aditivos de la invención.
Los resultados indican que no existen diferencias estadísticas en el consumo de alimentos. Sin embargo, los peces alimentados con las dietas conteniendo harina de pescado, mostraron tendencia a mayor consumo de alimento (Figura 14).
En relación a la conversión alimenticia, los peces que recibieron las dietas conteniendo harina de pescado, mostraron mejor conversión del alimento por unidad de ganancia de peso, siendo estadísticamente diferente a los peces que recibieron las dietas con torta de soya. La adición de ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) a la dieta a base de torta de soya, mejoró significativamente la utilización del alimento en el crecimiento de los peces, siendo más eficientes en un 4%, comparado con los peces que recibieron la dieta control de torta de soya (Figura 15). Similar comportamiento se observa en los peces de diferentes tamaños (réplicas).
6.3. Resultados de supervivencia de O.mykiss alimentados con las dietas descritas en la Tabla 7 ¡unto con los aditivos de la invención. Los peces que recibieron BP-70 en la dieta a base de torta de soya, lograron menor mortalidad (2.6%), estadísticamente significativa comparado con aquellos que recibieron las dietas con harina de pescado (4 %), con o sin la adición de BP-70 o ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) a la dieta con torta de soya (3.6%). La supervivencia de los peces fue muy similar en todos los tratamientos (Figura 16).
Los resultados obtenidos en el presente ejemplo, ponen de manifiesto que las dietas conteniendo harina de pescado produjeron mayor crecimiento en peso y talla de los alevines de truchas en relación a la dieta con torta de soya. Además, la adición de ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) o BP-70 a las dietas conteniendo harina de pescado o torta de soya no mejoraron el crecimiento en relación al peso, aunque si se muestra una tendencia a un mayor crecimiento en talla en dietas con torta de soya.
La adición del aditivo ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) a la dieta conteniendo torta de soya mejoró estadísticamente la conversión alimenticia, mientras que la adición de BP-70 a la dieta conteniendo torta de soya, redujo significativamente la mortalidad, logrando mayor supervivencia de los animales. Con los resultados mostrados, parece evidente la utilización de dietas a base a torta de soya como fuente de proteína más la adición de ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) para reducir el coste de alimentación debido a un ahorro económico por la mayor eficiencia en las dietas para truchas.
Ejemplo 7. Uso de ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) como agente de biorremediación.
La calidad del agua y la gestión de la calidad del suelo es considerado como uno de los aspectos más importantes de la acuicultura en estanques. Si bien los parámetros de calidad del agua, tales como oxígeno disuelto, pH, o las concentraciones de amoníaco afectan a funciones esenciales del cuerpo, el estado del fondo de los estanques y el intercambio de sustancias entre el suelo y el agua afecta en gran medida la calidad del agua. La acumulación de residuos aumentará la demanda de oxígeno por parte de las bacterias con el fin de realizar su metabolismo y degradar la materia orgánica, favoreciendo el desarrollo de zonas anaeróbicas. Estos sedimentos anóxicos se pondrán en contacto con la columna de agua rica en oxígeno, produciendo una alteración de las condiciones ambientales adecuadas para un desarrollo saludable de los organismos que habitan en dichos estanques. Además, el amoníaco puede difundirse en la columna de agua no sólo como resultado de las excreciones de los peces, sino también después de la descomposición microbiana de la materia orgánica. En condiciones de alta temperatura y pH, la acumulación de amoníaco puede causar efectos sub-letales como retraso del crecimiento o la propensión a las enfermedades. Por lo tanto, es de importancia clave para mantener el fondo del estanque en condiciones aeróbicas y evitar que la materia orgánica y los limos se acumulen. En este sentido, Bacillus spp. son considerados como agentes de biorremediación, concepto que se refiere a la utilización de microorganismos que ayudan en el mantenimiento del ambiente del estanque adecuado gracias a la secreción de exo-enzimas que descomponen la materia orgánica. La finalidad del presente ejemplo es evaluar la capacidad in vitro de ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) como agente de biorremediación.
En primer lugar se evaluó la demanda química de oxígeno (DQO), que se define como una medida de la capacidad del agua para consumir oxígeno durante la descomposición de la materia orgánica y la oxidación de los productos químicos inorgánicos, tales como el amoníaco y el nitrito. El agua se obtiene de un criadero de peces y se añadió en bandejas (300 cm2). La profundidad alcanzada por la capa de agua y lodo fue de 5 cm. ECOBIOL (β. amyloliquefaciens) y otras bacterias probióticas se añadieron en las bandejas de tratamiento y se evaluaron por duplicado de la siguiente manera:
Figure imgf000041_0001
Dos valores de DQO se determinaron: 1) soluble y 2) total.
Las medidas de DQO solubles en el sobrenadante se realizaron después de transcurridos 15 min de sedimentación tras la homogeneización de los medios, mientras que las medidas de DQO totales se realizaron inmediatamente después de la homogeneización. Las mediciones se llevaron a cabo en el día 0 (inicial), el día 3 y el día 7. La temperatura se mantuvo a 25 °C. Los resultados revelaron que la DQO total se redujo progresivamente en los grupos de tratamiento, sobre todo en los tratados con ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940). Además, la capa de agua y lodo se redujo a 4 cm de profundidad. Esto indica unos niveles más bajos de residuos, y por consiguiente, mejores condiciones ambientales, debido a la acción biorremediadora del tratamiento con ECOBIOL (β. amyloliquefaciens CECT 5940) (Ver Tabla 8).
De acuerdo con los resultados mostrados, el uso de ECOBIOL (B. amyloliquefaciens CECT 5940) como agente de biorremediación puede ayudar a mantener el ambiente del estanque adecuado favoreciendo así el crecimiento saludable de los organismos que viven en él. Tabla 8. Resultados de la demanda química de oxígeno (DQO) analizados a lo largo del tratamiento.
DQO mg02/L Inicial 3 días 7 días
Variación
Soluble Total Soluble Total Soluble Total
Control 89.0 1677.5 <30 1848.5 <30 1873.5 +10.43%
ECOBIOL 89.5 2145.5 <30 1602.0 <30 1559.0 -37.25%
B. cereus 86 2694.0 <30 2143.5 <30 2057.5 -30.85%
B. licheniformis 95.5 1692.5 <30 1678.5 <30 1653.5 -2.35%

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de Bacillus amyloliquefaciens, en la cría de animales acuáticos. 2. Uso según la reivindicación 1 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza la cepa CECT 5940 de B. amyloliquefaciens.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza además al menos la especie Bacillus cereus.
4. Uso según la reivindicación 3 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza la cepa CECT 953 de B. cereus.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza además al menos la especie Pediococcus acidilactici.
6. Uso según la reivindicación 5 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza la cepa CNCM MA 18/5 M de P. acidilactici.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza además al menos otras especies seleccionadas de entre cualquiera de las siguientes: B. subtilis y B. licheniformis. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza además al menos una sal de un ácido orgánico.
9. Uso según la reivindicación 8 caracterizado por que la sal del ácido orgánico se encuentra preferentemente en una proporción de entre un 30-70% en peso húmedo, siendo más preferible una proporción del 60%.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 caracterizado por que los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: butírico, propiónico, fórmico, láctico, cítrico, láurico, cúprico, caprílico, caproico o acético.
1 1. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 caracterizado por que las sales de ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: sódica, cálcica, cúprica o potásica.
12. Uso según las reivindicaciones 8 a 11 caracterizado por que la sal del ácido orgánico es la sal sódica del ácido butírico.
13. Uso según las reivindicaciones 8 a 12 caracterizado por que en la cría de animales acuáticos se utiliza una combinación de las cepas CECT 5940 de B. amyloliquefaciens y CECT 953 de B. cereus junto con sal sódica del ácido butírico.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 caracterizado por que además, es capaz de modular la respuesta inmune y ejercer un efecto bactericida frente a microorganismos patógenos.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde los animales acuáticos son preferentemente moluscos, crustáceos, tilapia, dorada, lubina y salmónidos.
16. Aditivo para alimentación de animales acuáticos que comprende la combinación de, al menos, dos especies pertenecientes al género Bacillus, seleccionadas de entre: B. amyloliquefaciens y B. cereus.
17. Aditivo según la reivindicación 16 caracterizado por que comprende la combinación de, al menos, la cepa CECT 5940 de B. amyloliquefaciens y la cepa CECT 953 de B. cereus.
18. Aditivo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17 caracterizado por que además puede comprender la especie, P. acidilactici.
Aditivo según la reivindicación 18 caracterizado por que comprende la cepa CNCM MA 18/5 M de P. acidilactici.
20. Aditivo según las reivindicaciones 16 a 19 caracterizado por que además comprende al menos una sal de un ácido orgánico.
21. Aditivo según la reivindicación 20 caracterizado porque la sal del ácido orgánico se encuentra preferentemente en una proporción de entre un 30-70% en peso húmedo, siendo más preferible una proporción del 60%.
Aditivo según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 caracterizado por que los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: butírico, propiónico, fórmico, láctico, cítrico, láurico, cúprico, caprílico, caproico o acético.
Aditivo según las reivindicaciones 20 a 22 caracterizado por que las sales de ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: sódica, cálcica, cúprica o potásica.
24. Aditivo según las reivindicaciones 20 a 23 caracterizado por que la sal del ácido orgánico es la sal sódica del ácido butírico.
25. Aditivo según las reivindicaciones 16 a 24 caracterizado por que comprende una combinación de las cepas CECT 5940 de B. amyloliquefaciens y CECT 953 de B. cereus junto con sal sódica del ácido butírico. 26. Aditivo según las reivindicaciones 16 a 25 caracterizado por que los animales acuáticos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: moluscos, crustáceos, tilapia, dorada, lubina y salmónidos.
Uso de los aditivos de las reivindicaciones 16 a 26 en la cría de animales acuáticos.
28. Uso de los aditivos según la reivindicación 27 caracterizados por que además actúan como moduladores de la respuesta inmune. 29. Uso de los aditivos según la reivindicación 27 caracterizados por que además presentan acción bactericidas frente a microorganismos patógenos.
30. Uso de los aditivos según la reivindicación 27 caracterizados por que además presentan acción biorremediadora. Uso de los aditivos según las reivindicaciones 27 a 30 caracterizado por que los animales acuáticos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: moluscos, crustáceos, tilapia, dorada, lubina y salmónidos.
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