WO2013150486A1 - Radiotraceurs, procedes de preparation et applications - Google Patents

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WO2013150486A1
WO2013150486A1 PCT/IB2013/052710 IB2013052710W WO2013150486A1 WO 2013150486 A1 WO2013150486 A1 WO 2013150486A1 IB 2013052710 W IB2013052710 W IB 2013052710W WO 2013150486 A1 WO2013150486 A1 WO 2013150486A1
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mmol
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equiv
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PCT/IB2013/052710
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English (en)
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Christophe DUGAVE
Olivier MARTINAGE
Loïc Le Clainche
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/04—1,2,3-Triazoles; Hydrogenated 1,2,3-triazoles

Definitions

  • the metal occupies a central position. It is complexed by a chelating agent that can improve its stability in vivo and / or confer an affinity for a particular tissue.
  • the tracers used to visualize cerebral perfusion have a more complex function because they aim to cross the blood-brain barrier without being backscattered thereafter. This is achieved by two non-directed radiotracers: Ceretec ( 99m Tc-HMPAO, Ogasawara, K. et al., AJNR Am., J. Neuroradiol., 1999. 20 (4): 626-628; , A. et al, Clin cal Nuclear Medicine, 1989. 14 (7): pp. 482-483) and Neurolite ( 99m Tc-EDC) (Scheme 5 (d) and (e)).
  • metabolic flow tracers involve a molecule intended to be metabolized by the body (peptide 3) which is labeled with a radioelement. If the metabolism of these compounds is accentuated or reduced during pathologies, they can be used to prepare tracers. This is the case of Fluorodesoxy glucose labeled with 18 F. Tumor cells metabolize much more glucose than quiescent cells to ensure their growth. [ 18 F] -FDG is therefore very often used in PET imaging for the detection of tumors. ⁇ Bifunctional complexes:
  • tracers in vivo requires the isotopic labeling of a biological molecule (peptides, proteins, liposomes, small nonpeptide molecules, etc.) having a marked affinity for the target to be imaged and which will play the role of vector.
  • This labeling may sometimes be carried out by isotopic substitution or by direct labeling using the natural ability of the molecule to complex the radioelement.
  • the complexes formed had to be usable in vivo, and therefore necessarily have a high stability in a biological medium.
  • the structures chosen should therefore be as stable as possible with regard to demetallation or oxidation.
  • the exchange reactions of chelating agents with endogenous glutathione or cysteine should be minimized.
  • circulating fluids, and especially blood contain glutathione at fairly variable concentrations (approximately 250 nM on average but 2 to 3 mM at the brain level for example (Samuelsson, M. et al., Neuropeptides, 2011. 45: pp. 287-292).
  • the structures of the chelating agents candidates had to present a maximum of sites allowing to introduce a functionalisation to guide their bioactivity.
  • unit A is chosen from groups of formula:
  • the vector V is a biologically active molecule, such as: a peptide or a peptide derivative, and in particular pseudopeptides, peptidomimetic compounds or else peptide and pseudopeptide polymers, a protein, a nucleic acid, a liposome, a DNA oligonucleotide or modified or unmodified RNA, nucleotide, nucleoside, aptamer, or modified or unmodified peptide nucleic acid (PNA), vitamin, steroid, phospholipid, central nervous system receptor, polyamine, polyester, a polythioether, a substituted or unsubstituted aliphatic, aromatic or heteroaromatic polymer.
  • a biologically active molecule such as: a peptide or a peptide derivative, and in particular pseudopeptides, peptidomimetic compounds or else peptide and pseudopeptide polymers, a protein, a nucleic acid, a liposome, a DNA oligonucle
  • the spacer arm (or linker) L is a peptide or a peptide derivative preferably having 1 to 12 amino acid residues, a polyether such as polyethylene glycol oxide (PEG) or polypropylene glycol (PPG) having preferably 1 to 40 EG or PG units, a polyamine having preferably 1 to 20 monomeric units, a mono- or polysaccharide preferably having 1 to 20 saccharide units.
  • the metal radioelement M is selected from among 94ffl Tc, 99g Tc, 99m Tc, 185 Re, 86 Re, J87 Re and 88 Re, and n and n 'are equal to 1.
  • Another object of the invention relates to a kit consisting of:
  • a final subject of the invention relates to a compound of formula (III) according to the invention for its use in vivo as a diagnostic radiotracer.
  • the invention relates more particularly to the compound of formula (III) for its use as a non-targeting radiotracer, for example as a radiotracer of circulatory and metabolic flux, or as a tissue marker, and in particular for the molecular imaging of cardiac and renal functions. , hepatic, sanguine, cerebral.
  • the compound of formula (III) according to the invention can also be used as a medicament, and more particularly:
  • Triphenylmethanol (5.2 g, 20.0 mmol) is dissolved in 60 mL of TFA and mercaptoacetic acid (1.39 mL, 20.0 mmol, 1.0 equiv) is added. After stirring for 3 hours at room temperature under an argon atmosphere, the TFA is removed under reduced pressure. Toluene was chased 3 times on the resulting orange solid resulting in 15 as a white solid (6.12 g, 18.3 mmol, 92%).
  • the reagents are removed by filtration and the resin is washed with DMF (31 minutes) and DCM (3 x 1 min). The Kaiser test is then negative.
  • Figure 5 shows the biodistribution observed in each case (Trias- 99m Tc and 99m Tc-reduced) two hours after injection.
  • ⁇ -imager is a device allowing to visualize an emission ⁇ ⁇ with an extreme sensitivity and a resolution much higher than that of a ⁇ -camera.
  • sample to be analyzed is placed in a chamber in which a gas circulates (argon 98%, triethylamine 2%) .
  • a gas circulates argon 98%, triethylamine 2%) .
  • two grids make it possible to apply a strong electric field.
  • ⁇ particles emitted by the sample ionize the gas, producing ultraviolet light detected by a CCD camera that reconstructs an image (source: biospacelab.com).
  • this second degradation product we have nevertheless been able to explain its origin, namely a degradation taking place in the blood. According to the results of the kinetic study carried out in the plasma, it is not linked to a plasma component but probably to a metabolism by the erythrocytes. However, the exact nature of the metabolite could not be determined.
  • Integrin ⁇ ⁇ 3 is one of eight integrins recognizing the structured Arg-Gly-Asp (or RGD) tripeptide motif (Scheme 16) present in many extracellular matrix proteins such as vitronectin, fibronectin, or fibrinogen. (Ruoslahti, E., Matrix Biology, 2003. 22 (6): 459-465).
  • the ligand 66 was thus to be involved in complexing the oxotechnetium core to yield c (RGDfK) -Lys- 99m Tc-TriaS-PEG ( 99m Tc-66).
  • the resin 58 (0.25 mmol) is packaged in the DC (1 x 30 min, 2 x 1 min), then a TFE / DCM 1/1 mixture (3 x 1 min). 25 mL of 0.6M HOBt solution in TFE / DCM (1/1) are added and the resin is stirred for 30 minutes at room temperature. This step is repeated twice.
  • Resin 63 (0.25 mmol) is packaged in DCM (1 x 30 min, 2 x 1 min), then DMF (3 x 1 min), and then deprotected with a 4/1 DMF / Piperidine mixture (5 x 5 min) and washed with DMF (31 min), DCM (3 x 1 min) and NMP (31 min).
  • the compound 15 (835 mg, 2.5 mmol, 10.0 equiv.) Is dissolved in 10 ml of NMP, then the HA TU (952 mg, 2.5 mmol, 10.0 equiv.), And the DIPEA (435 ⁇ l, 2.5 mmol, 30.0 equiv.) Are added. The mixture is added to the resin.
  • ⁇ v ⁇ 3 integrin (Chemicon, Temecula, CA) is diluted to 1000 ng / ml in buffer 1 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCb). An aliquot of 100 ⁇ / ⁇ is added to a 96-well plate (Millipore, Multiscreen-IP HTS) and the whole is incubated overnight at 4 ° C.

Abstract

La présente invention est relative à de nouveaux radiotraceurs de formule (III) : lesdits composés de formule (III) étant susceptibles d'être obtenus à partir de nouveaux agents complexants de formule (II), eux-mêmes susceptibles d'être obtenus à partir de nouveaux précurseurs de formule (I), ainsi que leurs procédés de préparation. L'invention concerne également un kit susceptible d'être utilisé en milieu hospitalier. Enfin, l'invention vise des composés de formule (III) pour leur utilisation comme radiotraceur diagnostique, et plus particulièrement pour leur utilisation comme radiotraceur non-ciblant pour l'imagerie médicale ou comme radiotraceur ciblant intégré, ainsi que leur utilisation comme médicament, et plus particulièrement pour des traitements radio- thérapeutiques ciblés utilisant des agents chélatants bifonctionnels.

Description

RADIOTRACEURS, PROCEDES DE PREPARATION ET APPLICATIONS
La présente invention concerne de nouveaux radiotraceurs de formule (III), susceptibles d'être obtenus à partir de nouveaux agents complexants de formule (Π), eux- mêmes susceptibles d'être obtenus à partir de nouveaux précurseurs de formule (I), ainsi que leurs procédés de préparation. L'invention concerne également un kit susceptible d'être utilisé en milieu hospitalier. Enfin, l'invention vise des composés de formule (III) pour leur utilisation comme radiotraceur diagnostique, et plus particulièrement pour leur utilisation comme radiotraceur non-ciblant pour Γ imagerie médicale ou comme radiotraceur ciblant intégré, ainsi que leur utilisation comme médicament, et plus particulièrement pour des traitements radio-thérapeutiques ciblés utilisant des agents chélatants bifonctionnels.
La connaissance du fonctionnement des organismes vivants est conditionnée par le développement de méthodes d'exploration non invasives. La radioactivité artificielle fournit des outils d'imagerie médicale qui permettent de visualiser les phénomènes chimiques et biologiques au sein même des organismes. Dès lors, le développement de radiotraceurs (ou radio-pharmaceutiques) est devenu un domame très étudié de la recherche médicale. Il s'agit d'après la définition officielle de médicaments à visée diagnostique, pronostique, voire thérapeutique qui émettent des ondes radioactives. Les radiotraceurs contiennent un ou plusieurs isotopes radioactifs (ou radio-isotopes), les radionucléides (ou radioéléments métalliques), incorporés à des fins médicales, et un vecteur (une molécule ou un ensemble supramoléculaire présentant une activité biologique sur les organismes vivants).
La médecine nucléaire est actuellement utilisés dans trois grands domaines médicaux : l'imagerie fonctionnelle (ou scintigraphie), la radiothérapie, et la radio-immunologie.
Utilisée en imagerie, elle permet de visualiser la présence ou non de la cible dans l'organisme, une cellule tumorale par exemple, ou de constater une anomalie anatomique (123I ou Tc0 " par exemple permettent de surveiller la taille de la glande thyroïdienne, Spencer R. et al, Clinical Nuclear Medicine, 1997. 22(8) : p. 519-522 ; Arnold, J. E. et al, Journal of Nuclear Medicine, 1976. 17(4) : p. 261-267). Grâce à un dispositif d'acquisition externe (β- imager, γ-camera, scanner), le rayonnement émis par le radionucléide peut être enregistré et, après traitement informatique, une image en deux ou trois dimensions permet de visualiser les niveaux de concentration en radiotraceurs. L'imagerie nucléaire est une méthode d'imagerie dite fonctionnelle ou dynamique. Elle permet, par exemple, de visualiser en temps réel les écoulements sanguins (intracérébraux, cardiaques...), permettant ainsi de prévenir l'apparition d'infarctus (lida, H. et al, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular ïmaging, 2008. 35(5) : p. 896-905) et d'étudier certaines maladies dégénératives comme la maladie d'Alzheimer (Hanyu, H., et al, Journal of the Neurological Science, 2010. 290(1) : p. 96-101) ou de Parkinson (Stoessl, A., Neurotherapeutics, 2011. 8(1) : p. 72-81). Elle est un outil précieux dans l'étude de certains métabolismes et est aussi utilisée pour évaluer la réponse à la chimiothérapie (Cachin, F. et al, Bull. Cancer, 2006. 93 : p. 1191). L'imagerie isotopique est couramment utilisée dans l'industrie pharmaceutique pour réaliser les preuves de concepts de nouveaux médicaments en phase préclinique, ou pour évaluer les posologies en phase clinique (Wong, D.F., J. Nucl. Med., 2008. 49(6) : p. 26N-28 ; Hwang, D.-R. et al, J. Nucl. Med., 2008. 49(6) : p. 24N-25). En sélectionnant un radiotraceur ayant une affinité élevée pour une cible choisie, on peut mettre en évidence cette cible sur une image 2D ou 3D du patient. L'énorme avantage des techniques d'imagerie impliquant un radiotraceur, dites internes, par rapport aux techniques d'imagerie classiques (RX...), dites externes, est leur très grande sensibilité. En effet des quantités de radiotraceurs de l'ordre du nanogramme sont détectables. Les premières scîntigraphies ont été développées à l'aide d'émetteurs γ. En effet le rayonnement émis possède les caractéristiques essentielles pour l'imagerie : TEL (Transfert d'Energie Linéique) faible qui limite l'effet destructeur du rayonnement, pouvoir pénétrant élevé afin de détecter le rayonnement hors du corps, et une énergie comprise entre 100 et 400 keV (idéalement 150 keV). Trois méthodes sont utilisées en fonction de la nature bidimensionnelle ou tridimensionnelle des images souhaitées :
Les images 2D sont obtenues à l'aide d'une γ-caméra située au-dessus du patient. Les rayonnements issus du radiotraceurs sont recueillis au travers d'un collimateur par un cristal d'iodure de sodium dopé au thallium qui présente une forte sensibilité aux rayonnements. Un dispositif informatique permet alors d'obtenir l'image 2D de la zone observée. Cette technique permet l'acquisition d'images dynamiques et peut donc être utilisée pour visualiser des écoulements ou étudier des métabolismes.
La méthode TEMP (Tomographie d'Emission Monophotonique) ou SPECT en anglais (Single Photon Emission Computed Tomography) consiste à appliquer la technique du scanner couplée à l'utilisation d'une ou plusieurs γ-caméras. Celles-ci tournent autour du patient et réalisent régulièrement une acquisition 2D, l'ensemble de ces acquisitions est ensuite traité pas un algorithme informatique de façon à obtenir une reconstruction 3D dont le spécialiste pourra extraire les coupes 2D nécessaires pour formuler son diagnostic.
La méthode TEP (Tomographie d'Emission de Positrons) ou PET en anglais (Positron Emission Tomography), analogue à la méthode TEMP permet, à l'aide d'une couronne de γ-caméras, de détecter sélectivement les photons antiparallèles d'annihilation (γ ^ 511 keV) provenant de l'interaction avec les électrons environnants de positrons émis par un radionucléide émetteur β+. Le signal tridimensionnel donne, après retraitement informatique, une image en 3D.
L'utilisation de radionucléides émettant des rayonnements plus ionisants peut également permettre de détruire les cellules situées au voisinage du radiotraceur. C'est le principe de la radiothérapie dirigée. On distingue quatre types de radiothérapie :
La radiothérapie métabolique qui utilise une molécule marquée participant au métabolisme comme dans le cas de m I. L'iode est directement assimilé au niveau de la glande thyroïdienne et va permettre le traitement du cancer de la thyroïde (Parthasarathy, . L. et al, Journal of Nuclear Medicine Technology, 2002. 30(4) : p. 165-171).
La radiothérapie locale qui consiste à injecter le radiotraceur directement au niveau de la cible pour un effet très localisé. C'est une technique préconisée pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde par injection dans l'articulation (Liepe, K. et al, Annals of Nuclear Medicine, 2011. 25(5) : p. 317-323 ; Das, B., Biomédical Imaging and Intervention Journal, 2007. 3(4) : p. 1).
La radio-immunothérapie consiste à atteindre la cible via un anticorps marqué visant un antigène particulier. Il peut s'agir par exemple d'un antigène exprimé à la surface de cellules tumorales. Cette technique présente l'avantage d'être très précise en raison de la haute spécificité des anticorps (Schubiger, P.A. et al, Bioconjugate Chemistry, 1996. 7(2) : p. 165-179 ; Perkins, A.C., Biomédical Imaging and Intervention Journal, 2005 : p. 2), mais connaît des limitations liées à la fois à la diffusion lente des anticorps vers leur cible biologique, et à l'hétérogénéité de marquage des anticorps liée à la bioconjugaison non régiospécifique des résidus lysine de surface.
La radiothérapie vectorisée est la plus répandue. Elle consiste à utiliser une structure servant de vecteur qui va assurer la spécificité du traceur pour la cible. Cette structure peut avoir de multiples formes : un composé chimique comme un peptide (Garcïa- Garayoa, E. et al, Nuclear Science and Techniques, 2007. 18(2) : p. 88-100) ou une structure résultant d'une formulation particulière connue comme un liposome (Bao, A., et al, J Nucl Med, 2003. 44(12) ; p. 1992-1999).
Enfin, la radio-immunologie consiste à utiliser des anticorps marqués par un traceur radioactif afin d'effectuer des dosages immunologiques. C'est l'extrême sensibilité de la médecine nucléaire qui est ici mise à profit. Elle rend possible le dosage de composés à des concentrations beaucoup plus faibles que par les techniques classiques.
Chaque domaine d'application requiert des radionucléides aux propriétés physicochimiques différentes. Le choix d'un radionucléide doit aussi tenir compte de ses propriétés chimiques. Le marquage doit en effet être rapide, s'effectuer en une étape, et être quantitatif. En effet, la demi-vie faible des radionucléides utilisés en imagerie interdit toute synthèse longue. Pour les applications de diagnostic et d'imagerie fonctionnelle par scintigraphie, le radionucléide le plus utilisé est le 99ïnTc (plus de 85% des examens de routine actuels) qui présente toutes les caractéristiques du radionucléide idéal en terme de coût, de disponibilité, de demi-vie et d'énergie. Le 99mTc présente en effet de nombreux avantages : c'est un émetteur y présentant des caractéristiques radiochimiques idéales pour l'imagerie (période : 6 heures, énergie γ : 155 keV), qui est disponible sous forme de générateur portable, à un coût très abordable.
Les radiotraceurs obtenus par complexation du radionucléide peuvent être classés en plusieurs catégories comme indiqué sur le Schéma 1.
Traceurs métallés
Figure imgf000005_0001
Complexes métal-essentiels Complexes bifonctionnels
Figure imgf000005_0002
Ciblants Non ciblants
(Complexes intégrés)
Figure imgf000005_0003
Traceurs de flux Traceurs de flux
anatomique métaboliques
(non spécifiques)
Schéma 1 : Les différentes catégories de radiotraceurs obtenus par complexation d'un radioélément On distingue deux grandes catégories de radiotraceurs préparés par complexation. Les complexes de type « métal-essentiels » et les complexes bifonctionnels.
> Les complexes métal-essentiels :
Dans ce premier type de radiotraceurs, le métal occupe une position centrale. Il est complexé par un agent chélatant pouvant améliorer sa stabilité in vivo et/ou lui conférer une affinité pour un tissu particulier.
Les complexes métal-essentiels ciblants :
Lorsque l'agent chélatant est fonctionnalisé par des groupements chimiques jouant un rôle dans son interaction spécifique avec une cible biologique, on parle de complexes intégrés. Dans ces structures, le métal joue le double rôle de radionucléide et d'agent structurant pour le radiotraceur. En l'absence de métal, la structure n'a habituellement que peu d'affinité pour la cible. Lorsque le métal est complexé, les groupements fonctionnels portés par l'agent chélatant adoptent une disposition spatiale adaptée à la reconnaissance par la cible. La structure chélatant le métal est donc incluse dans la structure ciblante.
Divers radiotraceurs de ce type ont été étudiés avec des résultats assez variables. L'exemple le plus visuel de cette approche se trouve dans le domaine des stéroïdes. Plusieurs études ont en effet été réalisées dans le but de développer des mimes de stéroïdes afin de visualiser les cellules tumorales qui surexpriment leurs récepteurs. Dans ces études, les mimes de stéroïdes sont obtenus sous forme de complexes mixtes de type NS/NS représentés au Schéma 2 (Hom, R.K. et al, The Journal of Organic Chemistry, 1997. 62(18) : p. 6290-6297 ; Chi, D.Y. ét al, Journal of Médicinal Chemistry, 1994. 37(7) ; p. 928-937).
Figure imgf000006_0001
Schéma 2 ; Approche intégrée : progestérone naturelle (à gauche) et mime de la
progestérone (à droite)
Le double rôle du métal peut être observé puisque, sans lui, les deux parties de la structure ne seraient pas solidaires. Si le radiotraceur obtenu présente sur le papier une structure très proche de celle de la progestérone, la réalité est toute autre. Cette molécule dont la structure diffère trop de la progestérone n'a que peu d'affinité pour le récepteur (103 fois moins active que le stéroïde naturel).
D'autres radiotraceurs intégrés sont obtenus par complexation directe du métal par la molécule biologique. Ce sont les groupes fonctionnels de la molécule utilisée qui assurent la complexation : il n'est pas nécessaire de modifier chimiquement la molécule. Par exemple, dans le cas du marquage de peptides, ce sont les groupements chélatants libres des chaînes latérales des acides aminés qui viennent complexer le radionucléide. On peut notamment citer l'exemple du marquage au 99mTc de peptides tels que l'adrénomédulline, un peptide vasodilatateur long de 52 acides aminés dont la structure comporte un enchaînement de 5 acides aminés formant un cycle grâce à un pont disulfure. Des tests d'affinité réalisés après déiétion de ce cycle montrent que ce dernier est indispensable à l'affinité du peptide pour son récepteur. Dans les conditions de marquage direct, en milieu réducteur, le pont disulfure est rompu mais pourtant, l'affinité du peptide marqué est encore élevée. Ceci s'explique par le fait que les thiols libérés par la réduction du pont agissent dans la chélation du métal, reformant ainsi le cycle en n'affectant que très peu l'affinité (Fu, Y. et al, European journal of pharmacology, 2009. 617 : p. 118-123). Un autre exemple est celui du marquage d'anticorps monoclonaux par le 99raTc (Goldenberg, D. et al, Cancer, 2000. 89(104) : p. 104- 115 ; Dias, C.R. et al, Brazilian Archives of Biology and Technology, 2005. 48 : p. 29-35). Le principal inconvénient de cette méthode est qu'il est en général impossible de connaître la structure exacte du complexe qui est formé (en général différents sites de complexation sont possibles). Dans certains cas, jusqu'à 20% du marquage est non spécifique, c'est-à-dire qu'il ne correspond pas à une insertion du métal au site souhaité et conduit à des sous-produits qui peuvent s'accumuler dans le foie ou altérer l'efficacité du traceur (John, E. et al, Journal of Nuclear Medîcine, 1994. 35(5) : p. 876-881).
De plus, l'insertion du radionucléide dans la structure du vecteur qui s'en trouve modifiée entraîne généralement une perte d'affinité. A titre d'exemple, le marquage direct de l'hormone peptidique α-MSH ( -melanocyte stimulating hormone) a entraîné une forte modification structurale en particulier au niveau de la séquence reconnue par les récepteurs biologiques (Schéma 3). Ainsi marquée, la MSH s'est avérée avoir une affinité réduite à 1% de l'affinité de l'hormone libre (Giblin, M.F. et al, Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998. 95(22) : p. 12814-12818).
Figure imgf000008_0001
Schéma 3 : Le radiomarquage entraîne de fortes modifications structurelles de Γα-MSH. A gauche : structure de Γ -MSH, à droite : Re-MSH
D'autres radiotraceurs ont donné des résultats beaucoup plus concluants. On peut citer par exemple un composé cyclique pseudopeptidique présentant le motif tripeptidique RGD (Schéma 4 (a)). Ce motif est reconnu par l'intégrine ανβ3 qui est surexprimée au niveau des cellules cancéreuses. Dans cette structure c'est le métal, ici le technétium, qui assure la cyclisation. Son rôle dans la structure tridimensionnelle obtenue est donc primordial. L'affinité de ce composé cyclique pour l'intégrine s'est avérée très intéressante (ICso = 60 nm) (Aufort, M., et al., Synthesis and biochemical évaluation of a cyclic RGD oxorhenium complex as new ligand of α,γβι integrin. European Journal of Médicinal Chemistry, 2009. 44(9): p. 3394-3401 ; Aufort, M. et al, European Journal of Médicinal Chemistry, 2011. 46(5): p. 1779-1788). Des agent chélatants de la cyclophiline hCyp-18 (Schéma 4 (b)) qui présentent une affinité pour la protéine comparable à celle préalablement observée dans le cas d'inhibiteurs non marqués ont également été développés (Clavaud, C. et ai, ChemBioChem, 2006. 7(9): p. 1352-1355 ; Clavaud, C. et al, ChemBioChem, 2008. 9(11): p. 1823-1829 ; Clavaud, C. et al, Bioconjugate Chemistry, 2006. 17(3) : p. 807-814).
Figure imgf000009_0001
(a) (b)
Schéma 4 : Exemples de complexes métal-essentiels développés au laboratoire :
(a) pseudopeptide cyclique mime de GD ; b) agent chélatant linéaire de la cyclophiline hCyp-18
Le développement de complexes de type « métal-essentiels » ciblants est une approche élégante qui se heurte pour l'heure à certaines limites liées à la chimie employée dans les synthèses, aux pertes d'affinité induites par la présence du métal qui vient déformer la structure de manière difficilement prédictible, et l'introduction du cœur métallique (Tc03+ par exemple) qui modifie l'hydrophilie du composé et donc sa biodistribution.
Les complexes métal-essentiels non-ciblants :
Dans les complexes de cette catégorie, le rôle de l'agent chélatant n'est pas de conférer des propriétés ciblantes au radiotraceur mais de lui assurer une stabilité élevée en milieu biologique. La biodistribution du complexe ainsi formé est liée à ses propriétés physicochimiques (taille, charge, Hpophilie...) plutôt qu'à une affinité structurale pour la cible. Parmi ces complexes, les traceurs de flux métaboliques vont être accumulés et permettront de visualiser certaines fonctions métaboliques dans l'organisme. D'autres sont simplement transportés par le milieu circulant et permettent de visualiser des écoulements (irrigation cérébrale, écoulements intracardiaques...) : ce sont des traceurs de flux anatomiques.
Parmi les traceurs de flux anatomiques, on peut citer le Myoview ou 99mTc- Tetrofosmin (Fragasso, G. et al, The International Journal of Cardiovascular Imaging (forraeriy Cardiac Imaging), 2002. 18(1) : p. 31-40 ; Athanasoulis, T. et al. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2003. 30(5) : p. 798-799 ; Jain, D. et al, Journal of Nuclear Cardiology, 2009. 16(4) : p. 540-548) et le Cardiolite ou 99mTc-Sestamibi (Maddahi, J. et al, The American Journal of Cardiology, 1991. 67(14) : p. 27D-34D ; Ito, Y. et al, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2003. 30(2) : p. 281- 287) qui ciblent le cœur (Schéma 5 (a) et (b)) et sont fréquemment utilisés lors d'examens cardiaques. Après injection, le patient est soumis à un exercice physique et l'imagerie permet de visualiser l'activité des deux ventricules cardiaques afin de déceler une éventuelle anomalie (Shaw, L. J. et al, Journal of Nuclear Medicine, 2003. 44(2) : p. 134-139). Le complexe [99mTcO(MAG3)]~ (Schéma 5 (c)) présente une accumulation très forte au niveau des reins et extrêmement réduite dans le foie (Vivier, P.-H. et al, Am. J. oentgenol., 2009. 193(4) : p. W361-). Il est utilisé pour la mise en évidence d'insuffisances rénales (Palmer, M. R. et al, Nuclear Medicine Communications, 2011. 32(8) : p. 738-744, 10.1097/MNM,0b013e328347e958) en se basant sur les variations locales de sa biodistribution (Taylor, A. ét al, Urology, 2010. 76(6): p. 1512-1516).
Les traceurs utilisés pour visualiser Γ irrigation cérébrale ont un fonctionnement plus complexe car ils visent à traverser la barrière hémato-encéphalique sans être rétrodiffusés à travers celle-ci par la suite. C'est ce que parviennent à faire deux radiotraceurs non dirigés : le Ceretec (99mTc-HMPAO, Ogasawara, K. et al, AJNR Am. J. Neuroradiol., 1999. 20(4): p. 626-628 ; Lee, A. et al, Clin cal Nuclear Medicine, 1989. 14(7) : p. 482-483) et le Neurolite (99mTc-EDC) (Schéma 5 (d) et (e)). Dans le cas du Neurolite, il a été montré qu'un mécanisme enzymatique provoque l'hydrolyse d'un des groupements esters de la forme L-L du complexe rendant celui-ci suffisamment hydrophile pour ne pas être rétrodiffusé au travers de la barrière hémato-encéphalique ( ilworth, J. R. et al, Chemical Society Reviews, 1998. 27(1) : p. 43- 55 ; Walovitch, R. et al, Journal of Cérébral Blood FIow Metabolism, 1994. 1994(84-1 1) : p. S4-11). Quant au Ceretec, c'est une réaction chimique avec le glutathion cérébral qui augmente son hydrophilie et bloque la rétrodiffusion (Neirinckx, R.D. et al, J. Cereb. Blood Flow Metab., 1988. 8(S1) : p. S4-S12).
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
(d) (e) (f)
Schéma 5 : Quelques exemples de radiotraceurs non dirigés : (a) Ceretec (99mTc-HMPAO), (b) Neurolite (""Tc-EDC), (c) Mioview (99mTc-Tetrofosmin), (d) Cardiolite (99n)Tc- Sestamibi), (e) [99mTcO(MAG3)]\ (f) 67Ga-Citrate.
Un dernier exemple de cette famille de radiotraceurs est le 67Ga-Citrate (Schéma 5 (f)) qui permet l'imagerie des foyers infectieux (Hughes, D. K., Journal of Nuclear Medicine Technology, 2003. 31(4) : p. 196-201 ; Ercan, M.T. et al, Nuclear Medicine and Biology, 1993. 20(7) : p. 881-887). Son mode d'action est différent puisqu'il repose sur une transchélation du gallium vers la transfemne exprimée au niveau de l'infection. Ce n'est donc pas le complexe du citrate qui est observé mais le complexe 67Ga-transferrine (Nanni, C. et al, Journal of Nuclear Medicine, 2010. 51(12) : p. 1932-1936 ; Goldsmith, S. J. et al, Seminars in nuclear medicine, 2009. 39(1): p. 2-10). Ce type de radiotraceurs représente l'essentiel des traceurs actuellement sur le marché.
Les traceurs de flux dits métaboliques mettent en jeu une molécule destinée à être métabolisée par l'organisme (peptide...) qui est marquée par un radioélément. Si le métabolisme de ces composés est accentué ou réduit lors de pathologies, ils peuvent être utilisés pour préparer des traceurs. C'est le cas du Fluorodesoxy glucose marqué au 18F. Les cellules tumorales métabolisent beaucoup plus de glucose que les cellules quiescentes afin d'assurer leur croissance. Le [18F]-FDG est donc très souvent utilisé en imagerie TEP pour la détection de tumeurs. ^ Les complexes bifonctiormels :
C'est l'approche qui est actuellement la plus répandue pour le développement de nouveaux agents d'imagerie. Elle est souvent appelée approche BFCA (BiFunctional Chelating Agent). Son principe consiste à relier une molécule ayant une affinité prouvée pour la cible choisie (molécule ciblante ou vecteur) à un motif de complexation de radionucléide, via un linker de taille et type variable (Schéma 6).
Figure imgf000012_0001
Molécule cïb tante Stru cru re complétante
Schéma 6 : Principe de l'approche bifonctionnelle
Le choix de la molécule ciblante est varié : il peut s'agir d'un anticorps ou simplement d'un fragment, d'un agent chélatant peptidique ou non-peptidique. La présence d'un linker de taille variable permet de séparer les deux parties du radiotraceur et de minimiser ainsi au maximum les interférences de la structure chélatante sur Γ affinité de la molécule ciblante pour son substrat De plus, le choix de la structure du linker (PEG, polylysine...) peut orienter le mode d'élimination du composé vers les reins ou améliorer sa solubilité et sa biodistribution, modifiant ainsi sa pharmacocinétique (Liu, S. et al, Chemical Reviews, 1999. 99(9) : p. 2235-2268). Un exemple d'utilisation de Hnker métabolisable a été décrit dans la littérature. Cette approche permet une élimination accrue du composé du milieu circulant (Smith-Jones, P. M. et al, Nuclear Medicine and Bioîogy, 1997. 24(8) : p. 761-769).
Parmi les inconvénients de cette approche, la taille importante des composés obtenus est gênante puisqu'elle augmente la probabilité de générer une réponse immunitaire de l'organisme. D'autre part, ces traceurs ne peuvent cibler que des récepteurs membranaires ou des protéines circulantes car leur taille limite fortement leur passage dans le milieu intracellulaire (Hom, R. . et al, Nuclear Medicine and Biology, 1997. 24(6) : p. 485-498). Il est également nécessaire d'identifier sur le vecteur un site où l'on puisse fixer le linker sans en altérer l'affinité. Le choix de ce site peut être guidé par la modélisation moléculaire ou des études de relation structure-activité, mais doit tenir compte de la faisabilité chimique de cette fixation et de la régiosélectivité de celle-ci. Enfin, la disponibilité des molécules vectrices peut s'avérer être un obstacle au développement de ces approches et nécessiter par exemple la mise au point de nouvelles voies de synthèse. Une autre limitation de l'utilisation de ce type de composé réside dans leur application pour la réalisation de kits utilisés en milieu hospitalier. Contrairement à un complexe « métal- essentiel » où l'agent chélatant peut être introduit en forte quantité puisqu'il ne présente aucune affinité pour la cible en l'absence de métal, un large excès d'agent chélatant fonctionnel non marqué peut entrer en compétition avec le traceur et diminuer son efficacité. Il est alors essentiel d'améliorer les conditions de marquage pour tendre vers un rendement st chiom étriqué.
Malgré la relative facilité de marquage au technétium, la conception de traceurs demeure empirique puisqu'il est relativement difficile de prévoir leur comportement in vivo. Le développement d'un traceur utilisable chez l'homme relève donc souvent d'une longue et coûteuse optimisation.
Le développement de traceurs in vivo nécessite le marquage isotopique d'une molécule biologique (peptides, protéines, liposomes, petites molécules non peptidiques...) ayant une affinité marquée pour la cible à imager et qui va jouer le rôle de vecteur. Ce marquage peut parfois être réalisé par substitution isotopique ou par marquage direct en utilisant l'aptitude naturelle de la molécule à complexer le radioélément.
L'adjonction de ces structures complexantes à une molécule biologique requiert le plus souvent une mise au point assez longue liée au caractère imprévisible du comportement de ces conjugués in vivo. L'ingénierie moléculaire visant à affiner la structure des traceurs nécessite très souvent leur resynthèse complète, induisant un coût et une durée de développement élevés.
D'autres travaux ont également montré que le meilleur ligand d'une cible biologique (meilleurs résultats in vitro) n'est pas toujours le meilleur traceur in vivo. Le passage au modèle animal nécessite en effet de prendre en compte les critères de biodistribution, d'excrétion, de métabolisation. Le développement de traceurs par chimie combinatoire nécessite de choisir des structures et une chimie compatibles avec cette approche. En pratique, il s'agira donc d'utiliser par exemple la synthèse peptidïque, qui permet de préparer de façon rapide et efficace des banques de composés sur support solide ou des réactions dites de « chimie click » (Mindt, T. L. et ai, ChemMedChem, 2009. 4(4) : p. 529-539 ; Mindt, T. L. et al, Journal of the American Chemical Society, 2006. 128(47) : p. 15096-15097) qui permettent en une seule étape de conjuguer deux molécules. Cette deuxième possibilité est actuellement en plein essor car elle présente un réel potentiel de par sa simplicité d'utilisation et ses performances (Moses, J. et al, Chemical Society Reviews, 2007. 36 : p. 1249-1262 ; Tron, G. C. et al, Médicinal Research Reviews, 2008. 28(2) : p. 278-308). Des radiotraceurs dans lesquels le radioélément est introduit via la chimie click ont déjà été décrits, notamment le 58F (Hausner, S. H. et al, Journal of Médicinal Chemistry, 2008. 51(19) : p. 5901-5904 ; Hong, V. et al, Bioconjugate Chemistry, 2010. 21(10) : p. 1912-1916 ; Ross, T. L. et al, Bioconjugate Chemistry, 2008. 19(12) : p. 2462-2470) pour le TEP.
L'objectif que se sont fixés les Inventeurs consiste en la mise au point de nouveaux radiotraceurs susceptibles d'être utilisés comme médicaments pour l'imagerie médicale ou des applications radio-thérapeutiques. Ils ont ainsi mis en évidence des structures spécifiques à base de triazole, présentant des propriétés de biodistribution particulièrement attractive et nettement améliorées par rapport aux complexes sans groupe triazole de type N2S2 et N3S. En outre, les structures identifiées présentent l'avantage d'être facilement synthétisable par une approche combinatoire directe, simple et versatile : la chimie-click. Cette technique permet ainsi une optimisation des traceurs par chimie combinatoire en vue d'applications diverses : préparation de traceurs sur support solide ou en solution, dans diverses conditions, compatible avec de nombreuses fonctions chimiques.
Les Inventeurs se sont plus particulièrement intéressés à la préparation de traceurs technétiés intégrés et bifonctionnels en utilisant une approche combinatoire. En effet, le technétium apparaît, tant sur ses propriétés radiochimiques que par sa facilité d'utilisation, comme un « radioisotope idéal » pour l'imagerie diagnostique.
Les complexes ayant vocation à être utilisés en imagerie médicale, leur préparation à partir d'un agent chélatant devait être effectuée de façon efficace (complexation quantitative), rapide (une seule étape, avec un temps de réaction faible à l'échelle de la période du 99mTc (6.02 h), si possible sans nécessiter de purification supplémentaire) et suffisamment simple pour être utilisée en milieu hospitalier par un médecin-manipulateur.
Les complexes formés devaient être utilisables in vivo, et donc impérativement présenter une stabilité élevée en milieu biologique. Les structures retenues devaient par conséquent être les plus stables possibles vis-à-vis de la démétallation ou de l'oxydation. En particulier les réactions d'échange des agents chélatants avec le glutathion ou la cystéine endogènes devraient être minimisées. En effet, les fluides circulants, et notamment le sang, contiennent du glutathion à des concentrations assez variable (environ 250 nM en moyenne mais 2 à 3 mM au niveau cérébral par exemple (Samuelsson, M. et al. Neuropeptides, 2011. 45 : p. 287-292). Les structures des agents chélatants candidats devaient présenter un maximum de sites permettant d'introduire une fonctionnaiisation permettant d'orienter leur bioactivité. C'est au niveau de ces sites qu'il sera possible de modifier chimiquement lors d'une nouvelle synthèse la plateforme de départ pour la transformer en un traceur intégré ou la relier à une molécule biologique dans le cas d'une approche bifonctionnelle, sans affecter ses propriétés de chélation. Le choix de ces sites et les méthodes de fonctionnaiisation sont souvent déterminés de façon empirique. Dans cette optique, il était souhaitable qu'un ou plusieurs de ces sites permette la mise en œuvre de chimie combinatoire afin d'envisager la préparation simple et rapide de chimiothèques des agents chélatants fonctionnalisés.
Lors de la mise au point de la structure de base utilisée pour le développement de la famille d'agents chélatants de l'invention, deux types de complexes décrits dans la littérature ont plus particulièrement été étudiés :
5 Les complexes Triazole-technétium tricarbonyle :
Depuis quelques années, des complexes de technétium tricarbonyle mettant en jeu un agent chélatant tridentate présentant au sein de sa structure un ou plusieurs noyaux 1,2,3- triazoles directement impliqués dans la complexation du technétium ont été développés (Mindt, TX. et al, Journal of the American Chemical Society, 2006. 128(47) : p. 15096- 15097 ; Struthers, H. et ai, Chemistry - A European Journal, 2008. 14(20) : p. 6173-6183 ; Mindt, T. L. et al, ChemMedChem, 2009. 4(4) : p. 529-539) (Schéma 7). Ces complexes se forment de façon quantitative et ne nécessitent aucune purification. En outre, le noyau 1,2,3- triazole est introduit par une réaction de chimie click, la cycloaddition dipolaire de Huisgen catalysée au cuivre. Cette stratégie permet d'introduire au niveau du noyau triazole une large variété de substituants via des méthodes combinatoires. Néanmoins l'obtention de ces complexes de Tc(I) nécessite des conditions délicates avec notamment la manipulation sous atmosphère de monoxyde de carbone ou de précurseurs de monoxyde de carbone libéré par chauffage (Journal of the American Chemical Society, 2001, 123 (13) : p. 3135-3136 ; Dalton Transactions 2007 (17), 1651-1660).
Figure imgf000016_0001
Schéma 7 : Complexes Tc-Tricarbonyles à agent chélatants triazoles
^ Les complexes Tc(V»½S à noyau pyridyle ou imidazolyle :
Ce second type de complexes regroupe des complexes du Tc(V) contenant des agents chélatants tétradentates de types N3S dans lesquels un des atomes d'azote chélatant le métal appartient à un cycle hétéroaromatique de type pyridyle ou imidazoyle (Schéma 8) (Rajagopalan, R. et al, Bioconjugate Chemistry, 1997. 8(3) : p. 407-415). Ces complexes sont obtenus avec d'excellents rendements (supérieurs à 90%) et sont particulièrement stables lors de tests de compétition par la cystéine (moins de 10% de dégradation après 24h). Le cœur oxotechnetium présente l'avantage par rapport au cœur technétium tricarbonyle d'être obtenu très facilement par réduction du pertechnétate de sodium en présence de l'agent chélatant. Enfin, la structure de ces complexes est plus rigide et plus variée que les complexes Tc- tricarbonyles, permettant ainsi d'envisager diverses approches de fonctionnalisation via des méthodes combinatoires.
Figure imgf000016_0002
Schéma 8 ; Complexe "Tc-NaS à noyau pyridyle ou imidazoyle Les Inventeurs ont maintenant découvert une structure de base conjuguant les propriétés de ces deux types de complexes. Il s'agit de complexes de radioéléments métalliques de type N X où X = N, O, S dans lesquels un noyau 1,2,3-triazole participe directement à la complexation via l'azote 3. L'obtention de ce noyau triazole par chimie click permet d'introduire facilement de la diversité sur cette position par chimie combinatoire lors d'étapes de fonctionnalisation ultérieures.
La Demande décrit des composés précurseurs répondant à la formule (I) suivante : R.
A—NH NH— B
(Ï)
dans laquelle :
- l'unité A est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000017_0001
ou
Figure imgf000017_0002
- l'unité B est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000017_0003
ou
Figure imgf000017_0004
n est égal à 0 ou 1 ,
- Rj, R2, R3, R4, R5, R* et R7 identiques ou différents, sont choisis parmi H, un radical alkyle, alcoxy, aryie, aralkyle, hétéroalkyle, hétéroaryle, hétéroaralkyle, un groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé, un mono- ou un polysaccharide, ou un dérivé aminé de mono- ou de polysaccharides, un polyéther tel que le poly oxyde d'éthylène glycol (PEG) ou le polypropylène glycol (PPG), un polyamide, lesdits radicaux et/ou groupes étant optionneliement substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyles, acides, aminés, aminoalkyles, aminoacides, thiols, thioalkyles, uréthanes, urées, halogènes, ou un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou linker) et V est un vecteur,
et à la condition que :
V soit l'unité A représente le groupement acétylénique suivant :
Figure imgf000018_0001
V soit l'unité B représent 'un des groupements acétyléniques suivants
Figure imgf000018_0002
L'invention a pour objet des composés répondant à la formule (I) suivante :
Figure imgf000018_0003
(I)
dans laquelle :
- l'unité A est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000018_0004
ou
Figure imgf000018_0005
l'unité B est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
- n est égal à 0 ou 1 ,
- R[, R2, R3, R4, R5, R6 et R7, identiques ou différents, sont choisis parmi H, un radical alkyle, alcoxy, aryle, aralkyîe, hétéroalkyle, hétéroaryle, étéroaralkyle, un groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé, un mono- ou un polysaccharide, ou un dérivé aminé de mono- ou de polysaccharides, un polyéther, un polyamide, lesdits radicaux et/ou groupes étant optionnellement substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyles, acides, aminés, aminoalkyles, aminoacides, thiols, tbioalkyles, uréthanes, urées, halogènes, ou un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou linker) et V est un vecteur,
et à la condition que :
soit l'unité A représente le groupement acétylénique suivant :
Figure imgf000019_0003
soit l'unité B représent 'un des groupements acétyléniques suivants :
Figure imgf000019_0004
Au sens de la présente invention, on entend par :
- Alkyle : un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, ayant de préférence 1 à 12 atomes de carbone, de préférence de 1 à 6 atomes de carbone. Le terme « ramifié » signifie qu'au moins un groupe alkyle inférieur tel qu'un méthyle ou un éthyle est porté par une chaîne alkyle 1 inaire. A titre de groupe alkyle, on peut mentionner par exemple les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-butyle, t-butyle et n-pentyle.
- Alcoxy ; un groupe O-a kyle dans lequel le groupe alkyle peut prendre la même signification que celle indiquée ci-dessus. A titre d'exemple de groupes alcoxy, on peut notamment citer les groupes méthoxy, éthoxy, n-propoxy, îso-propoxy, n-butoxy et pentoxy.
- Aryle : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique ; un cycle aromatique correspond à tout groupe mono- ou polycyclique plan comportant un système π délocalisé dans lequel chaque atome du cycle comporte une orbitale p, lesdites orbitales p se recouvrant les unes les autres. Parmi de tels groupes aryle, on peut mentionner les groupes phényle, benzyle, benzylcyclobutène, pentalène, naphthalène, benzylphényle, et anthracène. Les groupes aryles de l'invention comprennent de préférence 1 à 12 atomes de carbone, et plus préférentiellement 5 ou 6 atomes de carbone.
- Aralkyle : tout groupe dérivé d'un groupe alkyle tel que défini ci-dessus dans lequel un atome d'hydrogène est remplacé par un groupe aryle.
- Hétéroaryle : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique tel que défini ci-dessus et contenant au moins un hétéroatome choisi parmi P, S, O et N ; parmi les groupes hétéroaryle, on peut mentionner les groupes furane, pyridine, pyrrole, thiophène, imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, isothiazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, benzofurane, isobenzofurane, indole, isoindole, benzothiophène, benzo[c]thiophène, benzimidazole, indazole, benzoxazole, benzisoxazole, benzothiazole, quinoléine, isoquinoléine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, purine, et acridine.
- Groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'un cycle non aromatique comportant au moins 3 atomes de carbone, et de préférence 1 à 12 atomes de carbone, comportant éventuellement, de façon optionnelle, un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi P, S, O et N. Parmi de tels groupes, on peut notamment citer le cyclopropyle, le cyclobutyle, le cyclopentyle, le cyclohexyle ; le groupe cyclohexyle étant préféré.
Parmi les monosaccharides utilisables selon la présente invention, on peut citer : le glucose, le lactose, le fructose, le mannose, le galactose, le ribose, le maltose, le saccharose. On peut également citer les monosaccharides à chaîne ouverte. Parmi les dérivés aminés de sucres, on peut citer notamment la glucosamine, la galactosamine. Parmi les polysaccharides utilisables selon la présente invention, on peut citer les chaînes constituées de plusieurs unités monosaccharidiques comme par exemple : le saccharose, le maltose et l'acide lactobionique. Lorsque l'on parle de polyéther, tel que le polyoxyde d'éthylène glycol (PEG) ou le polypropylène glycol (PPG), celui-ci comprend avantageusement de 30 à 100 unités EG ou PG, et de préférence de 50 à 60 unités.
Lorsque l'on parle de polyamide, celle-ci comprend avantageusement 30 à 100 unités monomériques.
La Demande décrit des composés précurseurs de l'invention répondant à la formule (IA) suivante :
Figure imgf000021_0001
dans laquelle l'unité A est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000021_0002
Selon une forme de réalisation avantageuse, les composés précurseurs de l'invention répondent à la formule (IA) suivante :
Figure imgf000021_0003
dans laquelle l'unité A est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000021_0004
La Demande décrit également des composés, aussi appelés agents chélatants, susceptibles d'être obtenus à partir d'un composé de formule (I) selon l'invention, et répondant à la formule (II) suivante :
Figure imgf000022_0001
(II)
dans laquelle n, Ri, R2, R3, R4, R5, s et R7 sont tels que définis précédemment, et :
- l'unité A' est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000022_0002
ou
Figure imgf000022_0003
l'unité B' est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000022_0004
ou
Figure imgf000022_0005
- Y est choisi parmi un radical alkyle, alcoxy, aryle, aralkyle, hétéroalkyîe, hétéroaryle, hétéroaralkyle, un groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé, un mono- ou un polysaccharide, ou un dérivé aminé de mono- ou de polysaccharides, un polyéther tel que le poîyoxyde d'éthylène glycoi (PEG) ou le polypropylène glycoi (PPG), une polyamine, un polythioéther, un polyester, lesdits radicaux et/ou groupes étant optionnellement substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyîes, acides, aminés, aminoalkyles, aminoacides, thiols, thioalkyles, uréthanes, urées, halogènes, ou un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou linker) et V est un vecteur tels que définis précédemment,
et à la condition que :
V soit l'unité A' représente le groupement triazole suivant :
Figure imgf000023_0001
V" soit l'unité B' représente l'un des groupements triazoles suivants
Figure imgf000023_0002
La présente invention se rapporte également à des composés, aussi appelés agents chélatants, susceptibles d'être obtenus à partir d'un composé de formule (I) selon l'invention, et répondant à la formule (II) suivan
Figure imgf000023_0003
(II)
dans laquelle n, j, R2, R3, R4, R5, RÔ et R7 sont tels que définis précédemment, et
- l'unité A' est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000024_0001
ou
Figure imgf000024_0002
l'unité B' est choisie p
Figure imgf000024_0003
ou
Figure imgf000024_0004
~ Y est choisi parmi un radical alkyle, alcoxy, aryle, aralkyle, hétéroalkyle, hétéroaryle, hétéroaralkyle, un groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé, un mono- ou un polysaccharide, ou un dérivé aminé de mono- ou de polysaccharides, un polyéther tel que le polyoxyde d'éthylène glycol (PEG) ou le polypropylène glycol (PPG), une polyamine, un polythioéther, un polyester, lesdits radicaux et/ou groupes étant optionnellemeni substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyles, acides, aminés, aminoalkyles, aminoacides, thiols, thioalkyles, uréthanes, urées, halogènes, ou un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou linker) et V est un vecteur tels que définis précédemment,
et à la condition que :
soit l'unité A' représente le groupement triazole suivant :
Figure imgf000025_0001
V soit l'unité B' représente Pun des rou ements triazoles suivants
Figure imgf000025_0002
La Demande décrit également des agents chélatants répondant à la formule (IIA) suivante :
Figure imgf000025_0003
(IU)
dans laquelle n, R1} R2, R3, R4, R5, R« et R7 sont tels que définis précédemment, et
- l'unité A' est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000025_0004
Selon un mode de réalisation préféré, les agents chélatants de l'invention répondent à la formule (IIA) suivante :
Figure imgf000026_0001
(HA)
dans laquelle l'unité A' est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000026_0002
De manière encore plus préférée, les agents chélatants de l'invention répondent à la formule (!½) suivante :
Figure imgf000026_0003
(¾)
dans laquelle n, Rj, R2, R3, R4, R5, Ré et Y sont tels que définis précédemment.
Le procédé de préparation d'un composé de formule (II) selon l'invention par chimie click par cycloaddition 1,3-dipolaire entre Fazoture et la fonction alcyne du composé de formule (I) (cycloaddition de Huisgen) fait également partie de l'invention. Plus précisément, ce procédé consiste en la réaction d'un composé de formule (I) selon l'invention avec un azoture organique de type Y-N3, ce dernier pouvant être généré in situ à partir d'azoture de sodium et d'un halogénure de type Y-Hal dans lequel Hal représente un atome d'halogène, et Y est tel que défini précédemment, ladite réaction étant réalisée en présence de cuivre (Organic Letters 2004, 6(22) : p. 3897-3899 ; Biorganic & Médicinal Chemistry Letters 2008, 18(3) : p. î 195-1 198). De préférence, l'atome d'halogène Hal est l'atome de brome.
L'invention concerne donc un radiotraceur susceptible d'être obtenu à partir d'un composé de formule (II) selon l'invention, et répondant à la formule (III) suivante :
Figure imgf000027_0001
(III)
dans laquelle n, R1? R2, R3, R4, R5, é et Y sont tels que définis précédemment, et :
- M est un radioélément métallique,
- n' et n' identiques ou différents, sont égaux à 0 ou 1.
Lorsque l'un des radicaux Rj, R2, R3î R4, Rs, Rs ou Y est un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou linker) et V est un vecteur :
le bras espaceur (ou linker) L est de préférence choisi parmi une chaîne polycarbonée aliphatique ou aromatique substituée ou non substituée, un polyéther tel que le polyoxyde d'éthylène (PEG), une poîyamine, une polylysine, un dendrimère, un polypeptide, une plateforme peptidique linéaire ou cyclique structurée de type RAFT (Regioselective Adressable Functionalized Tempîate), un polysaccharide, un phospholipide, un acide nucléique ou un acide nucléique peptidique (PNA), et
- le vecteur V est une molécule biologiquement active, telle que : un peptide ou un dérivé peptidique, et notamment les pseudopeptides, les composés peptidomimétiques ou encore les polymères peptidiques et pseudopeptidiques, une protéine, un acide nucléique, un liposome, un oligonucléotide dADN ou dARN modifié ou non modifié, un nucléotide, un nucléoside, un aptamère, ou un acide nucléique peptidique (PNA) modifié ou non modifié, une vitamine, un stéroïde, un phospholipide, un récepteur du système nerveux central, une poîyamine, un polyester, un polythioéther, un polymère aliphatique, aromatique ou hétéroaromatique substitué ou non substitué. De manière avantageuse, le bras espaceur (ou linker) L est un peptide ou un dérivé peptidique ayant de préférence 1 à 12 résidus acides aminés, un polyéther tel que le polyoxyde d'éthylène glycol (PEG) ou le polypropylène glycol (PPG) ayant de préférence 1 à 40 unités EG ou PG, une poîyamine ayant de préférence 1 à 20 unités monomériques, un mono- ou un polysaccharide ayant de préférence 1 à 20 unités saccharidiques. De manière particulièrement avantageuse, le radioélément métallique M est choisi parmi 94fflTc, 99gTc, 99mTc, 185Re, i86Re, J87Re et i88Re, et n et n' sont égaux à 1.
Le radioélément métallique M peut également être choisi parmi 7Ga ou 68Ga, et dans ce cas n et n' sont égaux à 0.
Le procédé de préparation d'un composé de formule (III) fait également partie de l'invention, ledit procédé étant réalisé par réaction d'un composé de formule (II) selon l'invention avec un radioélément métallique sous forme d'oxyde, en présence d'une base, telle que le chlorure d'étain ou l'hydrosulfite de sodium.
Le radioélément métallique sous forme d'oxyde peut avantageusement être le pertechnétate de sodium (TcCV, Na+) ou le perrhénate de sodium (Re(V, Na ).
Un autre objet de l'invention concerne un kit constitué de :
un conteneur comprenant un composé de formule (II) selon l'invention et un agent réducteur tel que le chlorure d'étain ou l'hydrosulfite de sodium, et
un générateur portable comprenant une solution de radioélément métallique, de préférence choisi parmi 94mTc, "eTc, 99mTc, 185Re, ,86Re, 187Re et 188Re, ledit radioélément métallique étant sous forme d'oxyde, et
un conteneur comprenant une base, telle que la triéthylamine dans un solvant adéquate ou un tampon, permettant de ramener le pH du mélange final à une valeur comprise entre 7,2 et 7,6.
De manière avantageuse, le composé de formule (II) est présent dans le conteneur sous forme de poudre amorphe ou cristalline, ou éventuellement sous forme d'huile.
Un dernier objet de l'invention concerne un composé de formule (III) selon l'invention pour son utilisation in vivo comme radiotraceur diagnostique.
Le composé de formule (III) selon l'invention peut être utilisé in vivo comme agent de contraste pour le diagnostic, notamment par imagerie médicale par Tomographie d'Emission MonoPhotonique (TEMP) ou par Tomographie d'Emission de Positrons (TEP). Le composé de formule (II) peut également être utilisé comme agent radio-thérapeutique pour la radiothérapie ciblée de diverses pathologies, ou encore comme agent thérapeutique potentiel.
L'invention concerne plus particulièrement le composé de formule (III) pour son utilisation comme radiotraceur non-ciblant, comme par exemple comme radiotraceur de flux circulatoires et métaboliques, ou comme marqueur tissulaire, et notamment pour l'imagerie moléculaire des fonctions cardiaques, rénales, hépatiques, sanguines, cérébrales. Le composé de formule (III) selon l'invention peut également être utilisé comme médicament, et plus particulièrement :
comme agent radio-thérapeutique ciblant intégré, par exemple pour le traitement de cancers, de maladies neurodégénératives, de pathologies du système nerveux central, d'athérosclérose et de thrombose, de maladies cardiovasculaires, de pathologies hépatiques, rénales ou cardiaques, d'hypoxie ou d'inflammation, ou
comme agent radio-thérapeutique bi fonctionnel pour des traitements radio- thérapeutiques ciblés, tels que la radiothérapie métabolique, la radiothérapie locale, la radiothérapie vectorisée, la radio-immunothérapie et la radio-immunologie, par exemple pour le traitement de cancers, de maladies neurodégénératives, de pathologies du système nerveux central, d'athérosclérose et de thrombose, d'hypoxie, d'inflammation, de maladies cardiovasculaires, ou de pathologies hépatiques, rénales ou cardiaques.
Le radioélément métallique M est de préférence choisi parmi 94mTc et "mTc pour les applications radio-diagnostiques, 18 Re et 187Re pour les applications pharmaceutiques, et 1S6Re et 188Re pour les applications de radiothérapie.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples mettant en évidence les propriétés avantageuses des composés de l'invention, ainsi qu'aux Figures annexées dans lesquelles :
la Figure 1. représente les radiochromatogrammes montrant la stabilité de TriaS-99"*!^ (99mTc-l) en milieu acide dans les conditions de précipitations des protéines plasmatiques,
la Figure 2 montre les radiochromatogrammes de TriaS-99mTc (99mTc-l) après incubation en plasma murin à 37°C,
la Figure 3 représente les cinétiques de dégradation en plasma murin (concentration nanomolaire, 37°C, 6h) d'un radiotraceur selon l'invention (99mTc-l :♦) et des deux références (N2S2, 99mTc-13 : A et N3S, 99mTc-14 : ),
la Figure 4 montre l'évolution du pourcentage de complexe résiduel après 2h d'incubation en plasma murin lorsque la proportion initiale de complexe varie,
la Figure 5 représente la biodistribution observée pour le Trias-99raTc (■) et le 99mTc-réduit (■) 2h après injection chez la souris (n=3),
la Figure 6 est une visualisation au β-imager en utilisant la radiation β- minoritaire associée à la décroissance du 99roTc. A gauche : coupe de souris sacrifiée 2h après injection de TriaS- fflTc - A droite : coupe de souris après injection d'un traceur ayant une accumulation résiduelle importante dans les organes du tractus gastrointestinal,
la Figure 7 est une analyse par radio-HPLC des urines de souris saines recueillies 2h après injection,
le Figure 8 représente le profil en radio-HPLC du complexe TriaS-99 m+s)Tc après 2h d'incubation dans de l'urine de souris saine à 370C,
la Figure 9 est un radiochromatogramme étudiant la stabilité de TriaS-99mTc dans le sang murin (37°C, 2h),
le Figure 10 représente les chromatogrammes HPLC et radio-HPLC de : A : des composés 51a et 99mTc-51a ; B : des composés 51b et 9 niTc-51b ; C : des composés 53 et
PARTIE EXPERIMENTALE :
Divers agents chélatants contenant un motif triazole et répondant à la définition des composés de formule (Π) de l'invention ont été synthétisés à partir de précurseurs de formule (I). Parmi ces agents chélatants, un a été utilisé pour la réalisation d'un radiotraceur répondant à la définition des composés de formule (III). Ce composé a ensuite été étudié in vitro et in vivo, puis son potentiel pour îa réalisation de traceurs illustré par une application à l'imagerie de l'intégrine ανβ3.
1/ PROCEDURES DE CYCLOADDITION L3-DIPOLAIRE DE HUISGEN A PARTIR DE PRECURSEUR DE FORMULE (T>
La formation de triazoles via la cycloaddition de Huisgen peut s'effectuer dans des conditions très variées. Dans le cas présent, deux types de conditions ont été mis en œuvre.
Un protocole 1 réalisé dans un mélange DMSO/eau (9/1) en formant Fazoture de benzyîe in situ à partir de bromure de benzyie et d'azoture de sodium a été réalisé. Le catalyseur utilisé est CuS04, 5¾0 en présence d'ascorbate de sodium (Procédure 1, Schéma 9) (Feldman, A. . et al, Organic Letters, 2004. 6(22) : p. 3897-3899 ; Aufort, M. et al. Bioorganic & Médicinal Chemistry Letters, 2008. 18(3) : p. 1195-1198).
Figure imgf000031_0001
(1.0 équiv) (1.0 équiv.) 60°C
Schéma 9 ; Procédure de cycloaddition de Huisgen n°l : DMSO H20 (9/1), 60°C.
Protocole 1 :
L'alcyne (1.0 équiv.) est mis en solution dans le minimum d'un mélange EtOH/¾0 (7/3). La L-Proline (0.2 équiv.), le carbonate de sodium (0.2 équiv.), le bromure de benzyle (1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (0.2 équiv., solution aqueuse molaire), CuS04,5H20 (0.2 équiv., solution aqueuse molaire) et l'azoture de sodium (1.4 équiv.) sont ajoutés au mélange qui devient vert pâle. Le mélange est placé sous agitation au micro-onde (300W, 80°C) dans un flacon scellé durant 30 minutes. Le solvant est alors éliminé sous pression réduite et la solution brune obtenue est reprise dans l'acétate d'éthyle puis lavée par une solution saturée de NaCl. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur sulfate de sodium anhydre et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au composé désiré.
Un protocole 2 utilisant les micro-ondes en flacon scellé (300W, 80°C, 30 min) afin de réduire considérablement les temps de réaction (Klein, M. et al., Organic <& Biomolecular Chemistry, 2009. 7(17) : p. 3421-3429) a également été mis en œuvre (Schéma 10). En outre, cette réaction est effectuée dans un mélange EtOH : H20 (7 : 3) permettant une bonne solubilisation des réactifs et un traitement beaucoup plus efficace.
Figure imgf000031_0002
(1.0 équiv) (1.2 équiv.) MW, 300W, 80°C, 30 min
Schéma 10 : Procédure de cycîoaddition de Huisgen n°2 : EtOH/¾0 (7/3), MW, 300W,
80°C, 30 min. Protocole 2 :
L'alcyne (1.0 équiv.) est mis en solution dans le minimum d'un mélange EtOH H20 (7/3). La L-Proline (0.2 équiv.), le carbonate de sodium (0.2 équiv.), le bromure de benzyle (Î.O équiv.), l'ascorbate de sodium (0.2 équiv., solution aqueuse molaire), CuS04,5H20 (0.2 équiv., solution aqueuse molaire) et l'azoture de sodium (1.4 équiv.) sont ajoutés au mélange qui devient vert pâle. Le mélange est placé sous agitation au micro-onde (300W, 80°C) dans un flacon scellé durant 30 minutes. Le solvant est alors éliminé sous pression réduite et la solution brune obtenue est reprise dans l'acétate d'éthyle puis lavée par une solution saturée de NaCl. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur sulfate de sodium anhydre et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au composé désiré.
Dans les deux protocoles, la formation du triazole est toujours l'avant dernière étape de la synthèse des agents chélatants. Le composé est alors déprotégé par un mélange TFA/TIPS/eau sans purification préalable afin de dévoiler les fonctions polaires chélatantes protégées. Une fois déprotégé, le composé est alors purifié par RP-HPLC semi-préparative.
II/ SYNTHESES DES AGENTS CHELATANTS DE FORMULE (ID
Douze agents chélatants de formule (Π) (1 - 12) subdivisés en deux séries : série A et série B, et deux agent chélatants de références non triazole, respectivement de type N2S2 (13) et N3S (14), ont été synthétisés.
Tableau I :
Figure imgf000033_0001
II/ A- Synthèse des agents chélatants de la Série A
Les six agents chélatants de formule (II) de la série A peuvent être séparés en deux catégories : d'une part des agents chélatants diamide-triazole (1 et 2) ou triamide-triazole (3) obtenus par un double couplage peptidique et qui constituent la série Al, d'autre part trois agents chélatants de type amide-amine-triazole (4 - 6) formant la série A2 (Tableau I).
Série Al (agents chélatants 1 - 3) ;
Les synthèses des agents chélatants 1 et 2 sont réalisées en 4 étapes par un double couplage peptidique suivi d'une réaction de cycloaddition de Huisgen. Le composé 3 est obtenu directement à partir du composé 2 par acylation afin de pouvoir étudier l'effet d'un agent chélatant triamide sur la complexation du technétium (Schéma 11).
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0002
Schéma 1 1 : Synthèse des agents chélatants de la série Al : (a) TrtOH, TFA, rt, 3h, 92% ; (b) BocGlyOH, DCC, DIPEA, THF, rt, 24h, 64% ; (c) 1) DCM/TFA (2/1), 0°C, L5h, 2) 15, DCC, DIPEA, DCM, rt, 24hn 50% ; (d) CuAAC procédure n°l, 38% ; (e) TFA/TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2h ; (ί 1) DCM/TFA (2/1), rt, lh, 2) BocGlyOH, DCC, DIPEA, DMF, rt, 48h, 73% ; (g) CuAAC procédure n°2, 78% ; (h) (AcO)20} DIPEA, rt, 2h, 93%.
Le triphénylméthanol (5.2 g, 20.0 mmol) est dissous dans 60 mL de TFA et l'acide mercaptoacétique (1.39 mL, 20.0 mmol, 1.0 équiv.) est ajouté. Après 3h d'agitation à température ambiante sous atmosphère d'argon, le TFA est éliminé sous pression réduit. Du toluène est chassé à 3 reprises sur le solide orange obtenu conduisant à 15 sous la forme d'un solide blanc (6.12 g, 18.3 mmol, 92%). 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 731 (m, 15H, Trt), 3.05 (s, 2H, C¾); ,3C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 176.0 (CO), 143.9 (C, Ph), 129.7 (C, meta Trt), 128.2 (C, ortho Trt), 127.1 (C> Para Trt), 67.3 (C, Trt), 34.6 (CH2).
La Boc-Glycine (2.63 g, 15.0 mmol) est dissoute dans 20 mL de THF. La propargylamme (960 ; 15.0 mmol, 1.0 équiv.) est additionnée, suivie de la DIPEA (3.9 mL, 22.5 mmol, 1.5 équiv.) et du DCC (3.71 g, 18.0 mmol, 1.2 équiv.) puis l'ensemble est agité à température ambiante durant une nuit. Après filtration du précipité, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit est dissous dans le DCM et lavé par une solution d'acide citrique 10% (3 fois) et par une solution saturée de NaCl. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur sulfate de sodium anhydre, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Une purification par chromatographie-flash (éluent : hexane/AcOEt 6/4, Rf
- 0.37) conduit au composé 16 (2.04 g, 9.62 mmol, 64 %). fH RMN (CDC13, 250 MHz) : Ô 6.41 (s, 1H, N-CO), 5.30 (s, 1H, NH-COO), 4.08 (dd, J = 5.2, J' - 2.5, 2H, CH2-C), 3.82 (d, J = 5.8, 2H, CH2-CO), 2.24 (t, J - 2.5, 1H5 C≡CH), 1.46 (s, 9H, Boc) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 169.3 (CO amide), 79.3 (C, Boc), 77.4 (C≡ H), 71.9 (C≡CH), 29.2 (ÇH2-C≡CH), 28.4 (CH3, Boc).
Le composé 16 (950 mg, 4.5 mmol) est déprotégé par 30 mL d'un mélange DCM/TFA (2/1) durant lh30 à 0°C. Après évaporation du solvant, du toluène est chassé à 3 reprises. Le réactif déprotégé est séché sous pression réduite et ajouté à 20 mL de DCM contenant le composé 15 (1.503 g, 4.5 mmol ; L0 équiv.), la DIPEA (4.7 mL, 27.0 mmol, 6.0 équiv.) et le DCC (1.114 g, 5.4 mmol, 1.2 équiv.). Le mélange est agité une nuit à température ambiante. Après filtration du précipité, le filtrat est lavé par une solution d'acide citrique 10% à 3 reprises et par une solution saturée de NaCl. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre et filtrées. Le solvant est éliminé sous pression réduite et l'huile obtenue est purifiée par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 4/6) pour conduire au composé 17 sous la forme d'un solide brun (0.963 g, 2.25 mmol, 50%). *H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 7.27 (m, 15H, Trt), 3.99 (s, 2H, CH2-C≡C), 3.59 (s, 2H, N-C¾-CO), 3.17 (s, 2H, S-CH2-CO), 2.15 (s, 1H, C≡CH) ; 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 169.1, 168.0 (2 CO), 143.8 (C, Trt), 129.4, 128.2, 128.0 (CH, Trt), 77.2 (Ç≡CH), 71.8 (C≡ÇH), 43.5 (C¾~ N), 35.5 (CH2-S)} 29.1 (ÇH2-C≡ ).
Le composé 17 (214 mg5 0.5 mmol) est dissous dans 2.5 mL de DMSO/eau (9/1) et la L-proline (1 1.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), le bromure de benzyle (59.4 μΐ,, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), le carbonate de sodium (63.6 mg, 0.6 mmol, 3.2 équiv.), l'ascorbate de sodium (50 de solution 1M, 0.1 équiv.), CuS04,5H20 (25 μΕ de solution 1M, 0.1 équiv.) et l'azoture de sodium (39.0 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés suivant la procédure de cycloaddition n°l pour conduire au composé 18 sous la forme d'un solide brun (107 mg, 0.19 mmol, 38%). 1H RMN (dé-DMSO, 250 MHz) ; δ 8.34 (t, J - 5.5, 1H, NH -CO), 8.17 (t, J' = 5.7, 1H, NH- CO), 7.92 (s, 1H, CH triazole), 7.32 (m, 20H, CH Trt + Ph), 5.54 (s, 2H, CH2-Ph), 4.26 (d, J
- 5.5, 2H, N-C¾-CO), 3.58 (d, J - 5.5, 2H, N-Ofe-OC), 2.83 (s, 2H, S-CH2-CO) ; l3C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 169.01 168.0 (CO, amide), 143.7 (C, triazole), 129.4 - 127.8 (CH Ar, Trt + Ph), 127.0 (CH, triazole), 71.6 (C, Trt), 60.3 (CH2, Bn), 35.4 (CH2-C=C), 33.8 (N-ÇH2-CO), 29.0 (S-CH2-CO) ; ES (positive mode) : m/z = 562.2 (MH+, 54%), 584.2 (MNa+, 100%), 600.1 (MK+, 21%).
Le composé 18 est déprotégé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) pendant 2h à température ambiante. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le produit est repris dans un mélange eau/A CN (4/1) et purifié par RP-HPLC serai -préparât! ve (tR = 17.4 min) pour conduire au composé 1 (3.0 mg). RP-HPLC analytique : ÎR = 14.6 min (pureté = 99%) ; 1H RMN (CDCI3» 250 MHz) : δ 7.45 (s, 1H, CH-N-N=N), 7.39 (m, 2H, NH-CO), 7.25 (m, 5H, CH Ar), 5.50 (s, 2H, CH2Ph), 4.51 (d, J - 5.5 Hz, 2H, CH2-C=C), 3.95 (d, J = 5.5 Hz, 2H, N-CH2-CO), 3.27 (d, J - 9.0 Hz, 2H, S-CH2-CO). ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 168.5, 167.6 (CO), 145.1 (C, triazole), 144.0, 129.1, 128.8, 128.1 (CH Ar), 123.0 (CH triazole), 65.9 (CH2 Bn), 40.0 (C¾, Gly). MALDI/TOF : m/z - 319.9 (MH+, 100%).
Le composé 16 (424.2 mg, 2.0 mmol, 1.0 équiv.) est déprotégé par une solution de TFA DCM 1/1 (5 mL) durant lh à température ambiante. Après évaporation sous pression réduite, du toluène est chassé sur le produit pour conduire à une huile rouge. Après dissolution dans le DCM, la solution est neutralisée par ajout de triéthylamine puis le solvant est évaporé pour conduire à une huile jaune qui est utilisée sans purification. Cette huile est reprise dans 20 mL de DMF sec, la Boc-Gly-OH (350 mg, 2.0 mmol, 1.0 équiv.) est ajoutée puis le pH est ajusté à 8 par addition de DIPEA. La DIPEA (420 2.4 mmol, 1.2 équiv.), est ajoutée suivie du DCC (0.454 g, 2.2 mmol, 1.1 équiv.). Le mélange est agité durant 2 jours à température ambiante. Après filtration du précipité, le solvant est éliminé sous pression réduite. Le produit obtenu est dissout dans le DCM est lavé par une solution d'acide citrique 10% à trois reprises, et par une solution saturée de NaCl. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit est précipité dans l'hexane à 0°C et le composé 19 est obtenu par filtration sous la forme d'un solide blanc (390 mg, 1.45 mmol, 73%). 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 7.15 (s, 1H, NH-CO), 7.07 (s, 1H, NH-CO), 5.44 (s, 1H, NH Boc), 4.04 (m, 4H, C¾ Gly + C¾C≡C), 3.85 (d, J=5.7, 2H, BocN-CH2), 2.20 (t, 1 H, J - 2.5, C≡CH), 1.46 (s, 9H, Boc) ; Î3C RMN (CDC1¾ 62.5 MHz) : δ 170.5 (N-COO), 168.7 (N-CO), 71.5 (C¾H), 43.1 (CH2 Gly), 29.2 (CH2-C≡C), 28.4 (CH3 Boc). Le composé 19 (161.5 mg, 0.6 mmol) est dissous dans 4 mL d'EtOH/eau 7/3 et traité par la L-proline (11.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), Na2S04 (10.6 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), le bromure de benzyle (59.4 μί, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (39.6 mg, 0.2 mmol, 0.2 équiv), CuS04,5H20 (100 μL· de solution 1M, 0.2 équiv.), et l'azoture de sodium (45.5 mg, 0.7 mmol, 1.4 équiv.) selon la procédure de cycloaddition n°2 pour conduire à 2Θ sous la forme d'une huile jaune (45.5 mg, 0.39 mmol, 78%). Ή RMN (CD Cl*,, 250 MHz) : Ô 7.82 (s, 1H, CH triazole), 7.54 (s, 2H, NH-CO), 7.33 (m, 5H, Ph), 5.77 (s, 1H, NH-COO), 5.44 (s, 2H, CH2 Bn), 4.43 (s, 2H, CH2-C≡C), 3.94 (s, 2H, CH2 Gly), 3.78 (d, J = 4.3, 2H, CH2 Gly), 1.39 (s, 9H, Boc) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 170.3, 169.2 (CO amide), 134.3 (C, triazole), 129.0 - 128.1 (CH Ar, Bn), 80.0 (C, tBu), 54.2 (CH2, Bn), 49.1 (N-ÇH2- CO), 44.2 (CH2-C-C), 42.8 (N-ÇH2~CO), 28.2 (CH3, iBu).
Le composé 20 est traité par 10 mL d'un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) pendant 2h à température ambiante puis le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit est dissous dans 5 mL d'un mélange ACN/eau (1/4) et purifié par RP-HPLC semi-préparative (ÎR = 15.0 min) pour conduire à 9.2 mg de composé 2. RP-HPLC analytique : Î = 14.4 min, pureté = 99% ; 1H RMN (CDC13, 25Θ MHz) : 6 7.69 (s, 1H, CH triazole), 7.37 (m, 5H, Ar Bn), 5.50 (s, 2H, CH2 Bn), 4.40 (s, 2H, CH3), 3.87 (s, 2H, CH2 Gly), 3.72 (s, 2H, C¾ Gly); °C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 182.8 (CO), 155.1 (CH triazole), 128.4, 127.8, 127.4 (Ar CH), 46.6 (C¾ Gly), 40.3 (CH2-C=C) ; MALDI/TOF : m/z = 303.2 (MH+, 100%).
Le composé 2 (4.6 mg, 0.015 mmol) est dissous dans 200 L de DCM sec et traité successivement par la DIPEA (15.6 μΕ, 0.090 mmol, 6.0 équiv.) et l'anhydride acétique (4.25 μΕ, 0.045 mmol, 3.0 équiv.). Le mélange est agité durant 2h à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé 3 est obtenu sous forme d'un solide blanc (4.8 mg, 13.9 mmol, 93%). RP-HPLC analytique : tR = 17.3 min, pureté = 100% ; *H RMN (CD3CN, 250 MHz) : Ô 7.67 (s, 2H, 2 NH-CO), 7.25 (m, 5H, Ph), 6.83 (s, 1H, CH triazole), 5.48 (s, 2H, Bn), 4.58 (m, 2H, CH2-C=C), 2.02 (s, 3H, CH3) ; 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 168.9 (CO), 154.9 (C, triazole), 131.4, 128.4, 127.4 (CH Ar), 123.9 (CH triazole), 39.2 (CH2 Gly), 22.4 (CH3 Ac) ; ES MS (mode positif) : m/z = 345.3 (MH+, 100%), 367.3 (MNa+, 25%) , 383.2 (MK+, 7%). Série A2 (agents chélatants 4 -6) :
Les agents chélatants de la série A2 (4 à 6), de type aminé- amide-triazole, sont obtenus en trois étapes à partir du bromure de bromoacétyle. Après une première réaction d'acylation en présence de propargy lamine, le motif variable de ces agents chélatants est fixé par alkylation (réaction lente nécessitant un chauffage à 50°C) (Schéma 12).
Figure imgf000038_0001
Schéma 12 : Synthèse des agents chélatants 4 à 6 : (a) TrtOH, TFA, rt, 2h, 86% ; (b) Propargylamine, CS2CO3, DCM, 0°C, 30 min, quant. ; (c) 2-aminophenol, Cs2C03, DMF, 50°C, 7j, 38% ; (d) CuAAC Procédure n°l, 24%, (e) chlorhydrate de tert-butylglycine, Cs2C03, DMF, 50°C, 3j, 19% ; (f) CuAAC, Procédure n°l, 63% ; (g) TFA/TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2h ; (h) 21, Na2C03, DMF, 50°C, 24h, 48% ; (i) CuAAC, Procédure n°2,
54%.
Le chlorure de cystéamine (4.99g, 44.0 mmol, 1.1 equiv.) est traité par le triphenylméthanol (10.41 g, 40.0 mmol) dans le TFA (100 mL) à température ambiante durant 2h. Une coloration orange intense se forme. Le TFA est éliminé sous pression réduite et 100 mL d'eau puis 50 mL de DCM sont ajoutés. Une solution saturée de NaHC03 est ajoutée jusqu'à pH 7, un précipité blanc se forme. Après filtration, le solide blanc est séché sous pression réduite pour conduire au composé 21 (15.45 g, 34.5 mmol, 86%). Ή RMN (CDCI3, 250 MHz) : Ô 7.24 (m, 15H, Tri), 4.24 (s, 3H, NH3), 2.47 (d, J = 5.5, 2H, CH2-N), 2.35 (d, J - 5,5, CH2-S) ; "C RM (CD3OD, 62.5 MHz) : δ 145.4 (C, Ar Trt), 130.4 ; 128.9, 127.8 (CH, Ar Trt), 68.0 (C, Trt), 39.4 (CH2, N-C_H2-CH2-S), 30.3 (C¾, N-CH2-CH2-S).
La propargylamine (320 μL, 5.0 mmol) est dissoute dans 10 niL de DCM sec à 0°C. Le chlorure de césium (3.258 g, 10.0 mmol, 2.0 équiv.) et le bromure de bromoacétyle (436 μί, 5.0 mmol) sont ajoutés et le mélange est agité durant 30 min à 0°C. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite et le composé 22 est isolé quantitativement sans purification. 1H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 6.70 (s, 1H, NH-CO), 4.09 (dd, J - 2.5, J' = 5.0, 2H, CH2C≡C), 2.27 (t, J - 2.5, 1H, C≡CH) ; 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 167.0 (CO), 77.9 (Ç≡CH), 72.6 (C¾H), 30.2 (CH2-O ), 27.7 (C¾-CO).
Le composé 22 (5.0 mmol) est mis en solution dans 10 mL de DMF et le carbonate de césium (1.629 g, 5.0 mmol, 1.0 équiv.) puis le 2-aminophénol (0.546 g, 5.0 mmol, 1.0 équiv.) sont ajoutés. Le mélange est placé sous agitation à 50°C pendant 7 jours. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite et le produit obtenu est purifié par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 6/4, Rf = 0.12) pour conduire au composé 23 (0.387 g, 1.9 mmol, 38%) : Ή RMN (CDt¾, 250 MHz) : δ 8.0 (s, 1H, OH), 7.25 (s, 1H, NH amide), 6.81 (m, 2H, CH arom), 6.68 (m, 1H, CH arom), 6.48 (m, 1H, CH arom), 4.06 (dd, J - 5.5 Hz, J' = 2.5 Hz, 2H, CH2-C≡C), 3.83 (s, 2H, CH2CO), 2.18 (t, J = 2.5 Hz, 1H C≡CH); 13C RMN (CDCl3, 62.5 MHz) : δ 171.6 (CO) ; 143.9 (CarOH), 136.1 (C^NH), 121.0-1 11.5 (CH arom), 79.0 (Ç≡CH), 71.6 (C≡ÇH), 48.8 (C-CO), 36.7 (C¾-C≡C).
Le composé 23 (0.102 g, 0.5 mmol) est mis en solution dans 2 mL de DMSO/eau (9/1). La L-proline (11.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (63.6 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.), le bromure de benzyle (59.4 μL, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (100 μΐ. de solution 1M, 0.2 équiv.), CuS04s5¾0 (100 μL de solution 1M, 0.2 équiv), et l'azoture de sodium (39.0 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés successivement et le mélange est agité une nuit à 65°C sous argon selon la procédure de cycloaddition n°l pour conduire au composé 4 (39 mg, 0.12 mmol, 24%). RP-HPLC analytique : tR - 19.4 min, pureté = 93% ; *H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 7.81 (s, 1H amide), 7.46 (s, 1H, CH triazole), 7.28 (m, 5H, Ar Bn), 6.89 (m, 4H, CH Ar), 5.42 (s, 2H, CH2 Bn), 4.35 (s, 2H, C¾-C=C), 4.08 (s, 2H, CH2CO), 2.20 (s, 1H, NH aminé); 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 171.8 (CO), 137.9 (CH-C-C, triazole), 136.9 (COH), 136.4 (CNH), 134.4 (C, Ph), 129.2 - 125.9 (CH Bn), 123.3 (CH- C=ÇH, triazole), 122.5 - 1 16.3 (CH Phénol), 59.3 (CH2 Bn), 57.6 (ÇCO), 32.0 (CH2- triazole) ; MALDI TOF : m/z - 338.2 (MH+, 100%).
Le composé 22 (875 mg, 5.0 mmol) est mis en solution dans 20 mL de DMF et le carbonate de césium (3.258 g, 10.0 mmol, 2.0 équiv.) puis la fert-butylglycine (1.006g, 6.0 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés. L'ensemble est agité durant 3 jours à 50°C. Après filtration, le solvant est éliminé sous pression réduite. Le produit obtenu est repris dans le DCM et lavé par une solution d'acide citrique 10% à 3 reprises puis par une solution saturée de NaCl. Les phases organiques sont regroupées et séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit est repris dans le DCM et purifié par chromatographie flash (éluent hexane AcOEt 4/6) pour conduire au composé 24 (256 mg, 1.13 mmol , 19%). 1H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 3.99 (2H, dd, J = 5.75 Hz, = 3.25 Hz2H, CH2-CQ), 3.89 (d, J - 5.25 Hz, 2H, CH2-CON), 3.24 (s, 2H, C¾COO), 2.17 (t, J - 2.5 Hz, 1H, C≡CH), 1.39 (s, 9H5 iBu) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 171.2 (CO-N), 161.2 (CO-O), 81.8 (C, iBu), 79.6 (C≡CH), 71.3 (C≡CH), 52.1 (C-CON), 51.6 (C-COO), 28.6 (C-C≡C), 28.0 (CH, fBu).
Le composé 24 (113 mg, 0.5 mmol) est dissout dans 2 mL de DMSO/eau (9/1). La L- proline (11.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (63.6 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.), le bromure de benzyle (59.4 μL, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (100 de solution 1M, 0.2 équiv.), C S04,5H20 (100 μL de solution 1M, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (39.0 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°2 pour conduire au composé 25 (113 mg, 0.314 mmol, 63%). 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 8.11 (s, 1H, NH-CO), 7.44 (s, 1H, CH triazole), 7.35 (m, 5H, Ph), 5.49 (s, 2H, C¾Ph), 4.52 (d, J = 5.8, 2H,CH2-C≡ ), 3.29 (s, 2H, C¾), 2.93 (s, 2H, CH2-C02tBu), 2.02 (s, 1H, NH aminé), 1.48 (s, 9H, tBu) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 166.2, 164.8 (CO), 132.0 - 126.5 (CH Ar, Bn), 122.3 (CH, triazole), 80.2 (C, tBu), 61.7 (CH2, Bn), 36.1 (ÇH2- C=C), 28.2 (CH3î tBu).
Le composé 25 est déprotégé par une solution de TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) à température ambiante durant 2h. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le solide obtenu est dissout dans un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par P-HPLC semi-préparative (ÎR = 14.6 min) pour conduire au composé 5 (7.1 mg). RP-HPLC analytique : tR = 14.3 min {pureté - 97%) ; 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : Ô 7.35 (m, 5H, Ph), 5.48 (s, 2H, CH2Ph), 4.47 (s, 2H, C¾-C-C), 4.25 (s, 2H, C¾ Gly), 3.81 (s, 2H, CH2COO) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 163.4, 162.0 (2 CO), 129.5, 128.4, 127.3 (CH Ar), 121.5 (CH triazole), 53.2 (C¾Ph), 51.8 (CH2-CO-N), 48.9 (CH2-C02H), 42.0 (CH2-C-C) ; MALDÏ/TOF : m/z = 304.1 (MH+, 100%).
Le composé 22 (5.0 mmol, 1.0 equiv.) est mis en solution dans 20 mL de DMF et traité par NaC03 ( .06 g, 10.0 mmol, 2.0 équiv.). Après agitation durant 10 min à température ambiante, le composé 21 (2.58 g, 6.0 mmol, 1,2 équiv.) est ajouté. L'ensemble est agité durant 24h à température ambiante puis le milieu réactionnel est filtré et le DMF est évaporé sous pression réduite pour conduire à une huile incolore. Après purification par chromatographie flash, le composé 26 (0.986 g, 2.38 mmol, 48%) est obtenu. Ή RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 7.60 (s, 1H, NH-CO), 7.23 (m, 15H, Trt), 3.99 (dd, J - 5.5, J' = 2.5, 2H, CH2-C≡C), 3.10 (s, 2H, N-CH2-CO), 2.42 (m, 2H, N-Ǿ-CH2-S), 2.36 (m, 2H, N-C¾- CH S), 2.11 (t, J = 2.5, 1H, C≡C-H), 1.79 (s, 1H, NH-Trt) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 170.7 (CO), 144.7 (C, Trt), 126.8-129.6 (CH, Trt), 79.4 (C, Ç≡CH), 71.5 (CH, C≡ÇH), 66.9 (C, Trt), 51.4 (N-CH2-C≡C), 48.3 (S-CH?-CH2-N). 32.0 (CH C≡C), 28.8 (S-CH^-CHz-N).
Le composé 26 (248.7 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.) est dissout dans 2.5 mL d'un mélange EtOH/eau (7/3). La L-proline (1 1.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (10.6 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), le bromure de benzyle (59.4 uX, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (39.6 mg, 0.2 mmol, 0.2 équiv/), CuS04i 5H20 (100 μΐ de solution 1M, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (45.5 mg, 0.7 mmol, 1.4 équiv.) sont introduits successivement selon la procédure de cycloaddition n°2. L'huile brune obtenue est précipitée dans Fhexane à 0°C pour conduire au composé 27 sous la forme d'un solide brun (176 mg, 0.32 mmol, 54%). Ή RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 7.81 (s, 1H, CH triazole), 7.35 (m, 15H, Trt), 5.37 (s, 2H, Ar Bn), 4.46 (s, 2H, CH2-C-C), 3.40 (s, 2H, N-CH2-CO), 2.93 (s, 2H, N-ÇH2-CH2-S), 2.47 (s, 2H, N-CH?-CH2-S); MALDI TOF : m/z - 548.2 (MH+, 100%).
Le composé 27 est déprotégé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant 2h à température ambiante. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide est repris dans un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi-préparatïve (tu = 15.7 min) pour conduire au composé 6 (7.7 mg). RP-HPLC analytique : tj¾ = 14.1 min (pureté = 97 %) ; lU RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 1H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 7.46 (s, 1H, CH-N- N=N), 7.34 (m, 4H, Ph), 5.44 (s, 2H, CH2Ph), 4.42 (s, 2H, CH2-C=C), 3.84 (s, 2H, C¾-CO- N), 3.24 (m, 2H, C¾, N-CHrOfc-S), 2.87 (m, 2H, C¾, N-CH?-CH2-S); I3C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : 5 168.6 (CO amide), 137.3 (C, Triazole), 134.4 (C, Ar), 129.0 - 127.6 (CH Ar, Bn), 122.1 (CH, triazole), 59.1 (CH2, Bn), 57.9 (N-C¾-CO), 56.1 (S-C¾-ÇH2-N), 40.5 (ÇH2-C=C), 34.4 (S-CH2-CH2-N); MALDI/TOF : m/z = 306.2 (MH+, 100%).
11/ B- Synthèse des agents chélatants de la Série B
Les six agents chélatants de formule (II) de la série B ont également été séparés en deux catégories : ceux de la série Bl et ceux de la série B2.
Série Bl (agents chélatants 7- 9) :
Pour ces composés, le bloc fonctionnel est introduit par couplage peptidique sur la Cbz-Glycïne ou acylation par le bromure de bromoacétyle. L'alcyne précurseur du noyau triazole est introduit via une réaction d'alkylation faisant intervenir la propargyl aminé ou le bromure de propargyle (Schéma 13).
Figure imgf000042_0001
Schéma 13 : Synthèse des agents chélatants 7 à 9 : (a) 2-aminophénol, DCC, DIPEA, THF, rt, 6h, 86% ; (b) l)H2,Pd/C, MeOH, 89%, 2) Bromure de propargyle, rt, 48h, 24% ; (c) CuAAC Procédure n°l ; (d) Chlorohydrate de teri-butyîgiycine, Cs2C03, DCM, 0°C, 30 min ; (e) Propargylamine, Cs2C03, DCM , 50°C, 5j, 38% ; (f) CuAAC, Procédure n°2, 50% ; (g)
TFA TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2h ; (h) FmocGlyOH, DCC, DMF, rt, 24h ; (1) 1) DMF/Piperidine (4/1), rt, 3x5 min, 2) chlorure de propargyle, DCC, DMF, rt, 24h ; Q') TFA/TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2xlh ; (k) CuAAC, Procédure n°2, 24%.
La Cbz-Glycine (4.18 g, 20,0 mmol) est mise en solution dans 60 mL de THF anhydre. Le 2-aminophenol (2.18 g, 20.0 mmol, 1.0 équiv.), et le DCC (5.54 g, 22.0 mmol, 1.1 équiv.) sont ajoutés et le mélange est ajouté à température ambiante durant 6h. Après filtration du précipité, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est précipité dans un mélange AcOEt /huile de pétrole 2/1 (200 mL) pour conduire au composé
28 sous la forme d'un solide blanc (5.15 g, Î 7.1 mmol, 86%). 1H RMN (d6-DMSO, 250 MHz) : δ 7.87 (s, 1H, amide), 7.35 (m, 5H, Ar Cbz), 7.22 (s, 1H, carbamate), 6.90 (m, 2H, CH Ar), 6.79 (m, 1H, CH Ar), 5.05 (s, 2H, CH2 Cbz), 3.83 (s, 2H, CH2); 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 170.1 (CO amide), 148.9 (CO carbamate), 127.3 - 119.9 (CH Ar, Cbz, Ar), 56.5 (CH2, Cbz), 43.6 (CH2, Gly).
Le composé 28 (0.9 g, 3.0 mmol) est dissous partiellement dans 35 mL de méthanol. Du Pd/C 10% (135 mg, 15% w/w) est ajouté et le mélange est agité vigoureusement sous atmosphère d'hydrogène (4 bar) durant 1.5 h jusqu'à dissolution complète du composé 28. Après filtration sur célite, le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire à un solide jaune pale (447 mg, 2.68 mmol, 89%). Dissout dans 15 mL de DMF, ce solide est traité par le bromure de propargyle (0.289 mL, 2.68 mmol, 1.0 équiv.) durant 2 jours à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé obtenu est purifié par chromatographie flash (éluant : hexane/AcOEt 7/3, Rf = 0.32) pour conduire au composé
29 (0.132 g, 0.65 mmol, 24%). 1H RMN (d6-DMSO, 250 MHz) : δ 9.22 (s, 1H, NH amide), 7.0 (m, 4H, CH Ar), 3.55 (d, J = 2.5, 2H, C¾), 3.43 (s, 2H, CH2), 2.32 (t, J - 2.3, 1H, alcyne) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 171.6 (CO), 148.3 (C-OH, Ar), 126.7 - 118.8 (CH Ar), 80.5 (C¾-Ç≡C), 72.6 (CH2-C¾), 50.9 (N-ÇH2-CO), 38.3 (ÇH2-C≡C)
Le composé 29 (113 mg, 0.55 mmol) est mis en solution dans 1 mL d'un mélange DMSO/eau (9/1). La L-proline (12.6 mg, 0.1 1 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (70.1 mg, 0.66 mmol, 1.2 équiv.), le bromure de benzyle (65.4 \xL, 0.55 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (110 ί de solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.), CuS04,5H20 (1 10 μL· de solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (42.9 mg, 0.66 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°l pour conduire au composé 7 sous la forme d'un solide blanc. Ce solide est dissout dans 5 mL de mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi-préparative (Î = 21.7 min, 3.6 mg). RP-HPLC analytique : tR = 19.8, pureté = 93% ; Ή RMN (d6-DMSO, 250 MHz) : δ 8.11 (s, 1H, CH triazole), 7.25 (m, 5H, Ph), 7.18 (m, 4H, CH Ar), 5.53 (s, 2H, CH2-Ph), 3.78 (s, 2H, C¾), 3.18 (s, 2H, CH2) ; i3C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 170.2 (CO amide), 147.9 (C-OH, Ar), 137.0 (C=€-C¾), 134.2 - 127.8 (CH Ar), 125.6 (0=C-C¾), 59.1 (CH2, Bn), 49.1 (ÇH2-CO), 45.6 (C-C-ÇH2) ; MALD1/TOF : m/z = 338.2 (MH", 100%).
L'hydrochlorure de teri-butyl glycine (0.546 g, 5.0 mmol) est traité par la DIPEA (1 .39 mL, 10.0 mmol, 2.0 équiv.) dans 10 mL de DCM durant 20 min à température ambiante. Le solvant est éliminé sous pression réduite et le résidu est dissout dans le DCM sec. Le carbonate de césium (3.2 g, 10.0 mmol, 2.0 équiv.) puis le bromure de bromoacétyle (426 yiL, 5.0 mmol, 1.0 équiv.) sont ajoutés successivement et le mélange est agité à 0°C pendant 30 min. Après filtration, le solvant est éliminé sous pression réduite pour conduire quantitativement au composé 30 sous la forme d'un solide blanc utilisé directement. Ή RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 7.00 (s, 1H, NH amide), 3.93 (d, J = 5.0, 2H, CH2-N), 3.89 (s, 2H5 C¾-Br), 1.45 (s, 9H, ¾u) ; ,3C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 170.1 , 168.9 (CO), 82.6 (C, /Bu), 41.5 CH2-COO)5 30.6 (CH2Br), 28.1 (CH3, /Bu).
Le composé 30 (5.0 mmol, 1.0 équiv) est mis en solution dans 10 mL de DMF. Le carbonate de césium (3.2 g, 10.0 mmol, 2.0 équiv.) et la propargylamine (386 ί, 6.0 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés successivement et le mélange est agité pendant 5 jours à 50°C. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite et le produit obtenu est repris dans le DCM puis lavé trois fois par une solution d'acide citrique 10% et par une solution saturée de NaCÎ. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. L'huile obtenue est purifiée par chromatographie flash (éluent ; hexane/AcOEt 3/7) pour donner le composé 31 (434 mg, 1.92 mmol, 38%). 1H RMN (CDCÏ3, 250 MHz) : δ 7.49 (s, 1H, NH amide), 3.97 (d, J - 5.5, 2H,
Figure imgf000044_0001
3.46 (d, J' = 2.5, 2H, CH2-CC), 3.33 (s, 2H, CH2 Gly), 2.24 (t, J' = 2.5, 1H, alcyne), 1.82 (s, 1H, NH aminé). 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 165.8, 164.3 (CO), 84.6 (C ¾u), 79.5 (C≡€H), 78.0 (C≡ÇH), 39.0 (CH2 Gly), 29.9 (CH3 *Bu); ES/positive mode : m/z - 360.3 (MH+, 100%). Le composé 31 (135.7 mg, 0.36 mmol, 1.2 équiv.) est mis en solution dans 1.5 mL d'un mélange éthanol/eau (7/3). La L-proline (6.9 mg, 0.06 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (6.36 mg, 0.06 mmol, 0.2 équiv,), le bromure de benzyie (35.6 iL, 0.3 mmol), l'ascorbate de sodium (23.7 mg, 0.12 mmol, 0.2 équiv.), CuS04,5¾0 (60 μΐ, d'une solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (28.1 mg, 0.45 mmol, 1.5 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°2 pour conduire au composé 32 (57 mg, 0.169 mmol, 50%). Ή RM (CDCï3, 250 MHz) : δ 7.46 (s, 1H, CH triazole), 7.40 (s, 1H, NH, amide), 7.35 (m, 5H, Ar Bn), 5.53 (s, 2H, C¾ Bn), 3.96 (d, J - 5.5, 2H, CH2CON), 3.92 (s, 2H, CH2COO), 1.48 (s, 9H, ¾u) ; Î3C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 129.6, 129.2, 128.9 (CH Ar), 57.4 (CH2 Bn), 54.3 (C¾CON), 49.8 (C¾-CC), 41.5 (CH2COO), 28.5 ((Bu); ES/mode positif : m/z = 360.3 (MH+, 100%).
Le composé 32 est déprotégé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) à température ambiante pendant 2h puis le solvant est évaporé sous pression réduite et le produit obtenu est séché. Le solide obtenu est dissous dans 5 mL d'un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi-préparative (tR - 17.3 min) pour mener au composé 8 (7.6 mg). RP-HPLC analytique : tR - 15.7 min, pureté - 98% ; Ή RMN (CD3OD, 62.5 MHz) : δ 8.07 (s, 1H, CH-N-N-N), 7.37 (m, 5H, Ar, Ph), 4.26 (s, 2H, N-CH2-CO-0), 3.87 (s, 2H, CH3-C=C), 3.74 (s, N-CH2-CO-N), 2.16 (s, 1H, NH aminé); ,3C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 171.0 (CO, acide), 169.0 (CO, amide), 144.6 (C=Ç-CH2), 137.4 - 127.4 (CH Ar, Bn), 122.8 (Ç-C-CH2), 58.7 (C¾, Bn), 54.1 (CH2-CO-N), 49.2 (C=C-CH2), 41.3 (Ç_H2-COOH) ; (ES/mode positif : m/z - 304.2 (MH+, 100%).
La résine 4-méthoxytrityl cystéamine (0.7 mmol.g~'} 1.0 g, 0.7 mmol) est conditionnée dans le DCM (3 x 1 min) puis le DMF (3 x 1 min). Une solution de Fmoc-Gly-OH (2.08 g, 7.0 mmol, 1.0 équiv.) dans 15 mL de DMF puis de la DIPEA (1.2 mL, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) sont ajoutés et le mélange est agité durant 10 min. Le DCC (1.45 g, 7.0 mmol, 10 équiv.) est ajouté et le mélange est agité durant une nuit à température ambiante. Le test Kaiser est alors négatif. Les réactifs sont éliminés par filtration et la résine est lavée successivement par le DMF (3 1 min), le DCM (3 x 1 min), et le méthanol (3 1 min). La résine est ensuite conditionnée dans le DCM (3 x 1 min) puis le DMF (3 1 min) et traitée par un mélange pipéridine/DMF (1/4) (3 x 5 min) puis lavée successivement par le DMF (3 x 1 min), le DCM (3 x 1 min) et à nouveau le DMF (3 x 1 min). Le test Kaiser est alors positif. La résine est traitée par le chlorure de propargyle (774 de solution à 70% dans le toluène, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) et la DIPEA (1 ,2 raL, 10.0 équiv.) dans 10 mL de DMF à température ambiante durant une nuit. Le test Kaiser est alors négatif. Après lavage par le DMF (3 x 1 min) et le DCM (3 x 1 min), le composé est décroché de la résine par une solution de TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant 2 x Ih. Les filtrats sont réunis et le solvant est évaporé sous pression réduite pour mener au composé 35. 'il RMN (CD3OD, 62.5 MHz) : 6 4.1 1 (m, 2H, CH2- CO), 4.02 (m, 2H, C¾-C≡CH), 3.47 (m, ÎH, SH), 3.02 (s, 2H, C¾-N), 2.92 (s, 2H, CH2-S); 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : Ô 164.4 (CO), 78.1 (Ç≡CH), 72.2 (C≡CH), 56.2 (ÇH2CO), 37.6 (CH2-OC), 32.4 (£H2-N), 29.7 (CH2-S) ; MALDI/TOF : m/z - 414.2 (MH+, 100%).
Le composé 35 (103 m g, 0.6 mmol, 1.2 équiv.) est mis en solution dans 2.5 mL d'un mélange EtOH/eau (7/3). La L-proline (11.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (39.6 mg, 0.2 mmol, 0.2 équiv.), le bromure de benzyîe (59.4 μί, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (39.6 mg, 0.2 mmol, 0.2 équiv,), CuS04,5H20 (100 μί d'une solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (45.5 mg, 0.7 mmol, 1.4 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°2 pour conduire à une huile brune (36 mg) qui est purifiée par P-HPLC semi-préparative (tR = 21.2 min) pour mener au composé 9 (5.2 mg). RP-HPLC analytique : tR - 19.0 min, pureté - 94% ; 1H RMN (CD3OD, 62.5 MHz) : δ 7.89 (s, IH, CH-N-N=N), 7.34 (m, 5H, Ar Ph), 5.55 (s, 2H, C¾Ph), 4.49 (s, 2H, CH2-OC), 3.87 (s, 2H, N-CH2-CO), 3.42 (t, J - 6.75 Hz, 2H, N-ÇH2-CH2-S). 3.09 (t, J = 6.75 Hz, 2H, N-CHa-ÇHs-S) ; MALDI/TOF : m/z = 306.4 (MH+, 100%).
Série B2 (agents chélatants 10 - 12) :
Les composés 10 et 11 ont été préparés à partir de la Cbz-Glycine. Le groupement carboxybenzyle présente en effet l'avantage d'être éliminé très proprement par hydrogénation cataiytique et de conduire au produit déprotégé sans résidu de déprotection tout en fournissant une aminé libre non protonnée. Ainsi le couplage de l'acide propiolique peut être réalisé sur un intermédiaire réactionnel obtenu pur. Cette approche particulière n'a tout de fois pas pu être utilisée pour l'obtention du composé 12 puisque les protections carboxybenzyle et trityle ne sont pas toujours orthogonales, le trityle pouvant réagir au cours de l'hydrogénation. Cette dernière synthèse a donc été réalisée à partir de la Fmoc-Giycine (Schéma 14).
Figure imgf000047_0001
Schéma 14 : Synthèse des agents chélatants 10 à 12 : (a) 2-aminophénol, DCC, DIPEA, THF, rt, 6h, 86% ; (b) 1) H2, Pd/C, MeOH, 1.5h, 2) acide propiolique, DCC, DCM, 0°C, lh, puis rt, 24h, 7% ; (c) CuAAC, Procédure n°2, 58% ; (d) Chorohydrate de iert-butylglycine, DCC, DIPEA, THF, rt, 5h, 46% ; (e) 1)¾, Pd/C, MeOH, L5h, 2) acide propioliqe, DCC, DCM, 0°C, lh, puis rt, 24h, 12% ; (f) CuAAC, Procédure n°2, 56% ; (g) TFA/TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2h ; (h) TrtOH, TFA, DCM, rt, 2h, 88% ; (i) 40, DCC, THF, rt, 24h, 72% ; (j) 1) DMF/Pipéridine (4/1), 2) acide propiolique, DCC, DCM, 0°C, lh, puis rt, 24h, 28% ; (k)
CuAAC, Procédure n°l, 22% ; (1) TFA TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2h.
Le composé 28 (1.50 g, 5.0 mmol) est mis en solution dans 50 mL de méthanol et le Pd C 10% (225.0 mg, 15% w/w) est ajouté. Le mélange est agité pendant 2h sous atmosphère d'hydrogène (4 bar). Après fîltration sur célite, le solvant est évaporé sous pression réduite et le composé obtenu (833 mg, 5.0 mmol, quant.) est dissout dans 20 mL de DCM. L'anhydride symétrique est préalablement préparé par agitation durant 10 min à 0°C d'un mélange d'acide propiolique (307.5 iL, 5.0 mmol, 1.0 équiv), et de DCC (1.134 mg, 5.5 mmol, 1.1 équiv.) dans 25 mL de DCM). L'anhydride symétrique ainsi formé est ajouté au composé 36 déprotégé et agité durant lh à 0°C puis une nuit à température ambiante. Après fîltration de la DCU, le solvant est éliminé sous pression réduite et le composé obtenu est purifié par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 3/7) pour mener au composé 27 (78.5 mg, 0.36 mmol, 7%). 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 7.44 (d, J - 7.5, 1H, amide), 7.25 (s, 1H, amide), 7.07 - 6.80 (m, 4H, CH Ar), 4.19 (s, 2H, CH2), 2.90 (s, 1H, CH alcyne). Le composé 27 (78.5 mg, 0.36 mmol, 1.2 équiv.) est mis en solution dans 1.5 mL de mélange EtOH/eau (7/3). La L-proline (6.9 mg, 0.06 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (636 rag, 0.06 mmoî, 0.2 équiv.), le bromure de benzyle (35.6 μί, 0.3 mmol, 1 équiv.), l'ascorbate de sodium (23.7 mg, 0.06 mmol, 0.2 équiv), CuS04,5¾0 (60 L de solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (28.1 mg, 0.45 mmol, 1.5 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°2 pour conduire au composé 10 (73 mg, 0.21 mmol) qui est dissout dans 5 mL d'un mélange ACN/eau (4/1). La solution est purifiée par RP-HPLC semi-préparative (ÎR = 22.5 min) pour mener au composé 16 (7.6 mg). RP- HPLC analytique : tR -18.1 min, pureté - 96%); lM RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 8.92 (s, 1H, NH amide), 8.20 (s, 1H, NH amide), 7.99 (s, 1H, CH triazole), 7.40 - 6.60 (m, 9H, Bn, Ar), 5.49 (s, 2H, CH2 Bn), 4.30 (s, 2H, C¾); MALDI/TOF : m/z - 352.2 (MH+, 100%).
La Cbz-Gly-OH (2.09 g, 10.0 mmol) est mise en solution dans 20 mL de THF sec puis l 'hydrochlorure de tert-butyl glycine (1.67 g, 10.0 mmol, 1.0 équiv.) et le DCC (2.27 g, 1 1.0 mmol, 1.1 équiv.) sont successivement ajoutés. Le mélange est agité durant 5b à température ambiante sous atmosphère d'argon. Après fîltration de la DCU, le solvant est évaporé sous pression réduite et l'huile incolore obtenue est purifiée par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 5/5, Rf = 0.32) pour mener au composé 37 ( 1.48 g, 4.6 mmol, 46%). 1H RMN (CDCÏ3, 250 MHz) : δ 7.44 (s, 1H, NH amide), 7.34 (m, 5H, Ph), 6.52 (s, 1H, NH carbamate), 5.12 (s, 2H, CH2-Ph), 3.92 (m, 4H, 2 CH2-CO), 1.47 (s, 9H, tBu) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 169.7, 168.6 (CO amide), 156.5 (CO carbamate), 135.9 (C Ph), 127.9 - 127.5 (CH Ar), 81.4 (C tBu), 66.3 (C¾ Bn), 43.7 (C¾CON), 41.3 (C¾COO), 27.4 (CH3, tBu).
Le composé 37 (1.135 g, 3.0 mmol) est mis en solution dans 20 mL de méthanol et le Pd/C 10% (170 mg, 15% w/w) est ajouté. Le mélange est agité durant lh30 sous atmosphère d'hydrogène (4 bar). Après fîltration sur célite, le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est dissout dans 10 mL de DCM. L'anhydride symétrique de l'acide propîolique est préalablement préparé par action du DCC (0.742 g, 3.6 mmol, 1.2 équiv.) sur l'acide propîolique (221.4 μL, 3.0 mmol, 1.0 équiv.) dans 15 mL de DCM. L'anhydride symétrique est ajouté au composé 38 déprotégé et le mélange est agité durant une nuit à température ambiante. Après fîltration du précipité, le solvant est éliminé par pression réduite et le produit obtenu est purifié par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 3/7) pour mener au composé 38 (84 mg, 0.35 mmol, 12 %). 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 4.03 (s, 2H, CH2), 3.93 (d, J = 5, 2H, CH2), 1.45 (s, 9H, iBu) ; °C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 168.8, 168.5 (CO, amide + ester), 152.7 (OC-ÇO), 82.5 (C H), 74.8 (C≡CH), 42.8 (Ç_H2-CO-N), 42.0 (CH2-C0-O), 24.7 (CH3, tBu).
Le composé 38 (60.0 mg, 0.25 mmol) est mis en solution dans 1.5 mL d'un mélange DMSO/eau (9/1). La L-proline (5.7 mg} 0.05 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (31.8 mg, 0.3 mmol, 1.2 équiv.), le bromure de benzyle (29.7 μL, 0.25 mmol, 1.0 équiv.), Fascorbate de sodium (50 μL· de solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.), CuS04,5H20 (50 μL de solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (19.5 mg, 0.3 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°l pour mener au composé 39 (52 mg, 0.14 mmol, 56%). 1H RMN (CDCI 3, 250 MHz) : δ 7.95 (s, 1H, CH-N-N=N), 7.32 (m, 5H, Ar Ph), 5.54 (s, 2H, CH2Ph), 4.33 (s, 2H, C¾-CO-0), 3.78 (s, 2H, CH2-CO-N), 1.24 (s, 9H, tBu) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 168.9, 168.8 (CO, amide + ester), 160.8 (C-C-CO), 142.9 (C=C-CO), 133.8 (Ç=C-CO), 129.4 - 125.8 (CH Ar, Bn), 82.6 (C, tBu), 54.7 (CH2 , Bn), 43.0 (CH2-CO-N), 42.1 (ÇH2-CO-0), 28.1 (CH3, tBu).
Le composé 39 est déprotégé par 10 mL d'un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) pendant 2h à température ambiante. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le produit obtenu est repris dans 5 mL d'un mélange eau/ACN (4/1) puis purifié par RP-HPLC analytique (ÎR - 21.7 min) pour mener au composé 11 (5.1 mg). RP-HPLC analytique : ÎR = 19.1 min, pureté - 100% ; 1H RMN (CDCI 3, 62.5 MHz) : S 7.72 (s, 1H, CH-N-N=N), 7.35 (m, 5H, Ar Ph), 5.59 (s, 2H, C¾Ph), 4.18 (s, 2H, C¾-CO-0), 3.62 (s, 2H, N-CH2-CO-N) ; 13C RMN (CDCÏ3, 62.5 MHz) : δ 167.1, 166.0 (CO, amide + ester), 141.3 (C-C-CO), 128.7 (Ç-C-CO), 128.7 - 128.1 (CH, Bn), 54.6 (CH2, Bn), 33.7 (CH2-CO-N), 31.8 (C¾-CO-0). MALDI/TOF : m/z = 318.3 (MH+, 100%).
Le 2-aminothiophénol (3.756 g, 30.0 mmol) est mis en solution dans 2.5 mL de DCM et traité par le triphénylméthanol (7.8 g, 30.0 mmol, 1.0 équiv.) dans 25 mL de TFA durant 2h à température ambiante. Le solvant est évaporé sous pression réduite et l'huile obtenue est versée dans 200 mL d'une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. Le produit est extrait au DCM à 3 reprises et les phases organiques sont réunies et lavées par une solution saturée de NaCl puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé 40 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (9.64 g, 26.25 mmol, 88%). lR RMN (CDCI3, 250 MHz) ; Ô 7.25 - 7.35 (m, 15H, Trt), 7.04 (m, 2H, meta CH Ph), 6.55 (m, 1H, ortho CH Ph), 7.45 (m, 1H, para CH Ph), 3.85 (s, 2H, N¾ aminé) ; Î3C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 150.1 (C-N, Ph), 144.4, 130.0, 127.8, 126.9 (Trt), 118.9 (C-S, Ph), 117.2, 1 16.0 (CH, Ph), 71.0 (C, Trt).
La Fmoc-Gly-OH (1.485 g, 5.0 mmol, 1.0 équiv.) est dissoute dans 20 mL de THF anhydre. Le composé 40 (1.83 g, 5.0 mmol, 1.0 équiv.) puis le DCC (1.135 g, 5.5 mmol, 1.1 équiv) sont ajoutés successivement et le mélange est agité durant une nuit à température ambiante. Après filtration de la DCU, le solvant est évaporé sous pression réduite. L'huile obtenue est reprise dans le DCM et purifiée par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 7/3). Une huile incolore est alors obtenue qui précipite dans l'hexane à 0°C pour mener au composé 41 (2.334 g, 3.61 mmol, 72%) sous forme d'un sorlide brun. 1H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 7.75 (m, 2H, Fmoc), 7.59 (m, 2H, Fmoc), 7.40 (m, 2H, Fmoc), 7.27 (m, 18H, Trt + 3 CH Ar), 6.83 (m, CH Ar), 4.39 (d, J - 2.5, 2H, CH2 Fmoc), 4.10 (t, J - 2.5, 1H, Fmoc), 3.62 (d, J - 5.0, 2H, CH2) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 143.5 (C, Fmoc), 141.3 (C-N, Ph), 137.6 (C, Fmoc), 129.6 (CH meta Trt), 127.8 (CH, ortho Trt), 125.0 (CH, Ph), 123.7 (CH, Ph), 120.0 (CH, /?«ra Trt), 61.2 (CH2, Fmoc), 44.9 (CH2, Gly).
Le composé 41 (1.62 mg, 2.5 mmol) est déprotégé par 20 mL d'un mélange pipéridine/DMF (1/4). Après évaporation du solvant sous pression réduite, le produit brut obtenu est repris dans 10 mL de DCM sec. L'anhydride symétrique de l'acide propiolique est préparé par la réaction de l'acide propiolique (1.84.5 μί, 2.5 mmol, 1.0 équiv.) sur le DCC (257.9 mg, 1.25 mmol, 0.5 équiv.) dans 10 mL de DCM sec puis ajouté au composé 61 déprotégé. Le mélange est agité durant 10 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Après évaporation du solvant, le produit brut obtenu est purifié par chromatographie flash (éluent : hexane/AcOEt 3/7) pour mener au composé 42 (0.337 g, 0.71 mmol, 28%). 1H RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 8.21 (s, 1H, NH amide), 8.09 (s, 1H, NH amide), 7.25 (m, 15H, Trt), 3.68 (d, J - 5.0, 2H, C¾), 2.84 (s, 1H, alcyne) ; 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 169.3 (CO, amide), 147.2 (HC=C-ÇO), 131.7 - 123.1 (CH, Ar), 88.1 (HÇ-C), 76.2 (HOC), 62.3 (C, Trt), 47.1 (ÇH2-CO-N). Le composé 42 (0.238 g, 0.5 mmol, 1.0 équiv.) est mis en solution dans 2 mL d'un mélange DMSO/eau (9/1). La L-proline (11.5 mg, 0.1 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (63.6 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.), le bromure de benzyle (59.4 μί, 0.5 mmol, 1.0 équiv.), l'ascorbate de sodium (100 L de solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.), CuS04,5H20 (100 \\L d'une solution aqueuse molaire, 0.2 équiv.) et l'azoture de sodium (39.0 mg, 0.6 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés successivement selon la procédure de cycloaddition n°l pour mener au composé 43 (69 mg, 0.11 mmol, 22%). 1H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 8.48 (s, 1H, NH amide), 8.32 (d, J - 8.2, 1H, NH amide), 8.10 (s, 1H, CH triazole), 7.30 (m, 22H, Trt + 2 CH Ar + Ph), 6.82 (t, J - 7.4, 2H, CH Ar), 5.55 (s, 2H, CH2-Ph), 3.91 (d, J = 8.2, 2H, C¾ Gly) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 164.9 (CO, amide), 152.0 (C=C-CO), 143.4 (C Arom, Trt), 141.4 (C-Ç-CO), 137.6 (D=C-CO), 129.6 - 119.4 (CH, Ar), 59.0 (C, Trt), 53.5 (C¾, Bn), 43.3 (CH2-CO-N).
Le composé 43 est déprotégé par un mélange TFA/TÏPS/eau (95/2.5/2.5) durant 2h à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le comosé brut obtenu est repris dans 5 mL d'un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi- préparative (tR = 23.9 min) pour conduire au composé 12 (4.7 mg). RP-HPLC analytique : ÎR = 23.0 min, pureté - 98% ; *H RMN (CDCÏ3, 250 MHz) : δ 8.24 (s, 1H, NH-CO), 8.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H, NH-CO), 7.88 (s, 1H, CH-N-N-N), 7.25 (m, 7H, Ar Bn + Ar), 6.78 (m, 2H, Ar), 5.50 (s, 2H, C¾Ph), 3.41 (s, 2H, CH2-CO-N) ; 13C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 164.9 (CH2-ÇO), 162.1 (C=C-ÇO), 146.7 (C-NH, Ph), 141.1 (C= -CO), 130.8, 129.2, 127.1 (CH, Ar), 121.9 (Ç-C-CO), 52.3 (CH2-Ph),43.0 (ÇH2-CO) ; MALDI/TOF : m/z = 368.4 (MH+, 100%).
W C- Synthèse de deux agents e élatants de référence
Les deux références 13 et 14 ont été synthétisées grâce à une synthèse convergente en phase solide sur résine 4-méthoxytrityl cystéamine par un double couplage peptidique (Schéma 15).
Figure imgf000052_0001
Schéma 15 : Synthèse des agents chélatants références 13 {N2S2) et 14 (N3S) sur phase solide : (a) FmocGlyOH, DCC, rt, 3h ; (b) 1) DMF/Pipéridine (4/1), 2) BocGlyOH, DCC, DIPEA, NMP, rt, 24h ; (c) 1) DMF/Pipéridine (4/1), 2) 15, DCC, DIPEA, NMP, rt, 24h ; (d)
TFA/TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, 2x30 min.
La résine méthoxytrityle cystéamine (1.0 g, 0.7 mmol.g"1, 0.7 mmol) est conditionnée dans le DCM (3 x ï min), puis le DMF (3 x 1 min). La Fmoc-Gly-OH (2.08 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.), la DIPEA (1.2 mL, 7.0 mmol, 10.0 équiv.), puis le DCC (1.45 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) sont ajoutés successivement dans 20 mL de DMF et l'ensemble est agité durant 3h à température ambiante. La réaction est répétée une seconde fois pour assurer un couplage quantitatif (mêmes quantités de réactifs). Le test Kaiser est alors négatif. Les réactifs sont éliminés par filtration et la résine est lavée par le DMF (3 x 1 min), le DCM (3 x 1 min) puis le DMF (3 x 1 min). La résine est ensuite déprotégée par une solution de pipéridine dans la DMF (20%, 3 5 min). Le test Kaiser est alors positif. Après des lavages successifs par le DMF (3 x 1 min), le DCM (3 x 1 min), et la NMP (3 x 1 min), la Boc-Gly-OH (1.23 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) en solution dans 20 mL de NMP puis la DIPEA (1.2 mL, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) et le DCC (1.45 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) sont successivement ajouté. L'ensemble est agité durant une nuit à température ambiante. La résine est alors lavée par la NMP (3 x 1 min) et le DCM (3 x 1 min). Le test Kaiser est alors négatif. La résine est traitée à deux reprises par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant 30 min. Les solutions sont regroupées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit brut ainsi obtenu est alors repris dans 5 mL d'un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi-préparative (t = 11.5 min) pour mener au composé 14 (9.4 mg). RP-HPLC analytique : ÎR = 7,1 min, pureté = 97%) ; ¾ RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 4.33 (d, J - 6.8, N-C¾-CO), 4.01 (s, 2H, N¾-CH2-CO), 3.29 (m, 2H, CH2-N), 2.92 (s, 2H, CH2-S) I3C RMN (CDC13, 62.5 MHz) : δ 171.7, 169,4 (CO, amide), 44.2 (N-Ç_H2-CO-N), 43.4 (S-C¾-CO-N), 41.2 (N-ÇH2-CH2-S), 26.2 (N-CH2- CH2-S). ; ES/mode positif : m/z = 191.9 (MH+, 100%), 213.9 (MNa+, 24.5%), 229.9 (MK÷, 7.1%).
La résine méthoxytrityle cystéamine (1.0 g, 0.7 mmol .g"1, 0.7 mmol) est conditionnée dans le DCM (3 x 1 min), puis le DMF (3 x 1 min). La Fmoc-Gly-OH (2.08 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.), la DIPEA (1.2 mL, 7.0 mmol, 10.0 équiv.), puis le DCC (1.45 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) sont ajoutés successivement dans 20 mL de DMF et l'ensemble est agité durant 3h à température ambiante. La réaction est répétée une seconde fois pour assurer un couplage quantitatif (mêmes quantités de réactifs). Le test Kaiser est alors négatif. Les réactifs sont éliminés par fîltration et la résine est lavée par le DMF (3 x 1 min), le DCM (3 x 1 min) puis le DMF (3 x 1 min). La résine est ensuite déprotégée par une solution de pipéridine dans la DMF (20%, 3 x 5 min). Le test Kaiser est alors positif. Après des lavages successifs par le DMF (3 x 1 min), le DCM (3 x 1 min), et le DMF (3 x 1 min), le composé 52 (2.08 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) dans 15 mL de DMF, la DIPEA (1.2 mL, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) et le DCC (1,45 g, 7.0 mmol, 10.0 équiv.) sont successivement ajoutés et l'ensemble est agité durant une nuit à température ambiante. Les réactifs sont éliminés par fîltration et la résine est lavée par le DMF (3 1 min) et le DCM (3 x 1 min). Le test Kaiser est alors négatif. La résine est alors traitée par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5), les filtrats sont regroupés et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire à un produit brut qui est repris dans 5 mL d'un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi-préparative (ÎR = 11.5 min) pour conduire au composé 13 (12.0 mg). RP-HPLC analytique : Î = 11.5 min, pureté = 95% ; 1H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 4.38 (s, 2H, N-C¾-CO), 3.88 (t, J = 7.0, 2H, C¾-N), 3.80 (s, 2H, S-CH2-CO), 3.14 (t, J = 7.0, CH2-S) ; MALD TOF : m/z - 209.2 (MH+, 100%) ; 13C RMN (CDCI3, 62.5 MHz) : δ 172.4, 170.1 (2 x CO, amide), 43.4 (N-Ç_H2-CO-N), 41.8 (N-ÇH2-CH2-S), 27.9 (S-CH2-CO-N), 24.0 (N-CH2-ÇH2-S). Les caractéristiques des composés synthétisés sont récapitulées dans le Tableau II ci- après :
Tableau II :
Figure imgf000054_0001
III/ SYNTHESES DES RADIOTRACEURS DE FORMULE (UTi
L'agent chélatant 1 précédemment préparé a été utilisé comme base de départ pour la réalisation de traceurs technétiés pour Fimagerie médicale utilisable aussi bien pour des traceurs BFCA que pour des traceurs ciblants intégrés (Tc-essentiels).
Les traceurs technétiés issus des composés de référence 13 et 14 ont également été étudiés comparativement. III/ A- Synthèse de radiotraceurs technétiés
III/ A- 1. Préparation des radiotraceurs V9mTc-l (TriaS- mTc), 99mTc~13 et nmTc~U
Dans un tube Eppendorf®, sont ajoutés dans cet ordre : 20 μΐ, de l'agent chélatant à 1 mg/mL (20 μ , 62.6 nmol), 80
Figure imgf000055_0001
de SnCl2 à 1 mg/mL préparée extemporanément (35 μg, 184.2 nmol, 3.0 équiv.), 70 μL de soude 0.1 , et 75 iL de solution de Na99inTc04 fraîchement éluée du générateur. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, la solution est neutralisée par ajout de 7.1 μΐ. de solution de HCl 1M et analysée par RP-HPLC analytique (gradient : 0-100%B en 30 min, A = ¾0 + 0.1% TFA, B = ACN + % TFA).
III/ A- 2. Préparation et caractérisation du radiotraceur 99mTc-l (TriaS-99mTc)
La solution de Na99g Tc04 est dosée par UV : ε = 6220 M"1. cm"1 à 245 nm. Le ligand TriaS (5 mgs 15.6 μηιοΐ) est dissous dans 25 mL d'eau. SnC^ (46.0 μιηοΐ, 3.0 équiv., 8.75 mL d'une solution aqueuse à 0.1 mg/mL), la soude (17.5 mL de solution aqueuse molaire) puis Na99gTc04 (2.1 mL d' une solution à 7.5 mM) sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante pendant 5 minutes. On observe une légère coloration jaune. Après purification par RP-HPLC semi-préparative (Î = 19.8 min), et lyophilisation, le complexe Trias-99 Tc est obtenu. 1.9 mg (4.4 μπιοΐ, 28.2%). *H RMN (CDCI3, 250 MHz) : δ 7.72 (s, 1H, CH-N-N= ), 7.49 (m, 5H, Ph), 5.78 (dd, J - 26 Hz, J' = 14 Hz, 2H), 5.35 (d, J - 18 Hz, 2H), 4.75 (m, 3H), 4.10 (dd, J = 50 Hz, J' - 17 Hz, 1H).; 13C RMN (CDC13, 250 MHz) : δ 174.6 (CH2-C=C), 135.9 - 128.9 (CH Ar + C¾-OC), 62.1 (CH2, Bn), 50.8 (N-CH2-CO), 47.4 (ÇH2-C=C), 25.1 (S-Ç_H2-CO) ; ES MS (mode positif) : m z = 431.9 (MH+, 100%), 453,9 (MNa , 7.2%), 469.9 (MK+, 1.8%).
III/ B- Synthèse de radiotraceurs rhéniés
Une solution de chorure d'étain (63 mg, 1.05 équiv.) dans HCl 0.05 M (1.5 mL) soigneusement dégazé est ajoutée sous argon à une suspension de perrhénate de sodium (92 mg, 0.318 mmol) et de gluconate de sodium (8503 mg, 8.8 équiv.) dans de l'eau soigneusement dégazée (4.8 mL). La solution (concentration finale théorique en oxorhénium 50 mmol) est agitée 1 heure à température ambiante sous argon (changement de couleur d'incolore à bleu de prusse). La solution de gluconate de rhénium obtenue doit être exempte de tout précipité noir pour être utilisée.
Le ligan (50 μιηοΐ) en solution dans du méthanol soigneusement dégazé (100-500 μυ) est ensuite traité par la solution de gluconate de sodium (3 mL, 1.0 équiv) sous argon pendant 15 min à température ambiante. Le pH est ajusté à 10 par ajout de triéthyiamine et le mélange est agité pendant 1 heure à température ambiante sous argon. Le précipité vert formé est alors isolé par centrifugation puis purifié par trois cycles successifs de lavage au méthanol et centrifugation. Le produit est alors séché sous vide et conservé à -18 °C.
IV/ ETUDE IN VITRO DES RADIOTRACEURS TECHNÉTIÉS DE FORMULE iffi)
Le sang utilisé a été prélevé sur des souris Balb-C femelles de 20 à 25 g et utilisé dans l'heure. Le plasma utilisé a été obtenu à partir de prélèvements sanguins de souris BalbC femelles de 20 à 25g. Ces échantillons sont d'abord centrifugés pendant 15 minutes à 1600 tr.min"1 et le surnageant est à son tour centrifugé pendant 15 min à 1500 tr.min"1. Le plasma ainsi obtenu est conservé à -20°C pour une utilisation sous 3 jours ou -80°C dans une limite de 1 mois.
IV/ A- Etude cinétique
Le plasma est préalablement placé à 37°C. A t - 0 min, une solution test est réalisée en ajoutant 50 L de solution de complexe préparée d'après le protocole décrit ci-dessus (4.92 MBq dans le cas de TriaS- 9mTc ("mTc-l) à 450 μL de plasma. Le mélange est homogénéisé et un premier échantillon de 50 μL est prélevé (t = 0 min). Cet échantillon est versé dans 150 μL de solution de TFA 10%. On observe la précipitation des protéines du plasma. Après centrifugation durant 5 minutes, le surnageant est séparé du précipité et l'activité de chacun d'eux est mesurée. 50 μΐ. de surnageant sont dilués dans 150 μΐ, d'eau et injectés en radio- RP-HPLC analytique (gradient : 0~100%B en 30 min, A = H20 + 0.1% TFA, B - ACN + 0.1 % TFA). La même procédure est répétée pour t = 30 min, Ih, 2h, 4h et 6h et l'aire du pic correspondant au complexe est évaluée. Le rapport de cette aire avec celle mesurée à t - 0 min permet d'obtenir les courbes de stabilité. Cette étude est réalisée en duplicate.
Afin de s'assurer qu'aucune dissociation des complexes n'a lieu, une étude de stabilité dans les conditions de précipitation en l'absence de plasma (remplacé par un volume équivalent d'eau) a été réalisée. Les radiochromatogrammes obtenus avec le composé TriaS- 99mTc sont représentés sur la Figure 1.
On constate qu'après 2h, les échantillons prélevés ne contiennent aucun produit de dégradation, le complexe est toujours présent et intact (Figure 1).
L'étude cinétique a ensuite été réalisée en utilisant du plasma murin frais de souris Baîb-C, obtenu par centrifugation de prélèvements sanguins. Une solution fraîchement préparée de complexe (nanomolaire) est ajoutée au plasma (complexe/plasma 1/9) et incubée à 37°C pendant 6h. A intervalles de temps réguliers, un échantillon de la solution est prélevé et les protéines sont séparées par précipitation et centrifugation. L'échantillon est alors analysé par radio-HPLC. La Figure 2 montre l'allure des chromatogrammes obtenus, ici dans le cas du TriaS-99mTc en tenant compte de la décroissance du technétium entre les deux injections.
Les courbes reflétant l'évolution en fonction du temps d'incubation à 37°C du pourcentage de complexe résiduel dans les échantillons prélevés est également représenté à la Figure 3.
Les complexes étudiés présentent une stabilité supérieure à 60% après 6h d'incubation en plasma murin à 37°C.
Pour le composé TrïaS-99mTc, on observe plus de 90% de complexe résiduel après 6h d'incubation. Compte tenu des difficultés techniques inhérentes à la mesure effectuée à t = 0 min et de l'allure de pallier observée par la suite, on peut penser que cette variation soudaine dans la première demi-heure d'incubation est le résultat d'un artefact lié à l'expérience. Cette analyse est d'autant plus légitime que les radiochromatogrammes obtenus lors de l'étude cinétique n'indiquent aucune formation de produit de dégradation, toute l'activité mesurée dans le surnageant correspondant au composé TriaS-99mTc. IV/ B- Effet de la concentration en Tria S- mTc sur le pallier cinétique
Le plasma est préalablement conditionné à 37°C. Une gamme d'échantillons de plasma dans laquelle la concentration en complexe varie est préparée en mélangeant dans des tubes Eppendorf® « low bind » respectivement 30μ1,, 20μ1,, 1 Ομί, 5μΕ, et
Figure imgf000058_0001
de solution de complexe préparée dans les conditions décrites au Ille. î à 70μΙ·, 80 L, 90μΙ_,, 95μί, et 98μί de plasma.
Tableau III :
Plasma (μΐ ) Solution de complexe (μΐ,) Facteur de dilution
70 30 0.3
80 20 0.2
90 10 0.1
95 5 0.05
98 2 0.02
A t = 0 min, 50 μL· de mélange sont prélevés et versés dans 150 μΐ, de solution de TFA (10%). Les protéines du plasma précipitent. Après 5 minutes de centrifugation, surnageant et précipité sont séparés et leurs activités sont mesurées. 50 L de surnageant sont alors dilués dans 150 μL d'eau et injectés en P-HPLC analytique (gradient : 0 - 100%B en 30 min, A - H20 + 0.1% TFA, B = ACN + 0.1 % TFA). La même procédure est répétée à t = 2h pour chacun des échantillons.
Pour chaque échantillon, le pourcentage résiduel de complexe après 2h en plasma murin à 37°C est évalué par le rapport des aires des pics complexe à t— 0 min et t = 2h. Cette étude est réalisée en duplicate.
La Figure 4 montre l'évolution du pourcentage résiduel de complexe TriaS-99raTc après 2h d'incubation en plasma murin à 37°C. On constate que ce pourcentage résiduel n'évolue pas et reste égal à la valeur obtenue dans le cas de l'étude cinétique (10% de solution de complexe dans le plasma) malgré les dilutions successives qui correspondent à une augmentation du ratio [Protéines plasmatiques] / [Complexe]. V/ ETUDE IN VIVO DU RADIOTRACEUR TriaS-99mTc DE FORMULE (IIP
L'évaluation du complexe TriaS-99mTc a été complétée par une étude in vivo chez la souris saine dans le but d'évaluer le comportement du traceur et sa biodistribution. En effet, les études précédemment réalisées sur des complexes du cœur oxotechnétiums comportant un noyau pyridyle à la place du triazole ont révélé une rétention élevée du complexe dans les tissus, et une élimination lente du sang. En outre ces complexes étaient éliminés essentiellement par voie hépatobilliaire. Dans le cas de ligands à noyau imidazoyle, cette rétention dans les tissus s'est avérée être bien moindre et le complexe était éliminé beaucoup plus rapidement du sang (Rajagopalan, R. et al, Bioconjugate Chemistry, 1997. 8(3) : p. 407- 415).
Les études animales ont été réalisées sur des souris BalbC femelles de 20 à 25g dans le respect du Décret sur Expérimentation Animale (Décret 87-848, 19 octobre 1987). Les manipulations ont été réalisées par une personne habilitée pour l'expérimentation animale.
Les solutions de complexes sont injectées par voie intra veineuse au niveau de la veine caudale de la souris. Ces solutions sont à pH physiologique sans solvant organique. Pour les analyses de biodistribution, les souris sont anesthésiées au bout de 2h à l'isoflurane 2% puis sacrifiées par exsanguination. Les liquides biologiques sang/urine sont recueillis puis l'ensemble des organes sont prélevés. Pour l'acquisition au β-imager, la souris a été anesthésiée à l'isoflurane 2% puis sacrifiée par congélation à -80°C. Des coupes « full body » sont réalisées au microtome et visualisées au β-imager (Biospace β-imager 2000) en utilisant l'émission minoritaire β~ du 99mTc (E = 2 keV) permettant une meilleure résolution que l'imagerie γ.
V/ A- Biodistribution
L'étude de biodistribution du complexe Tria$-99mTc a été réalisée sur un lot de 3 souris Balb-C femelles, lignée régulièrement utilisée lors d'études en modèle tumoral (tumeur xénogreffée sur des souris athymiques Balb-C Nu/Nu). Afin d'évaluer précisément l'influence de la complexation par le ligand TriaS par rapport à du technétium libre réduit, la même étude a été réalisée après injection de 9 mTc-réduit (99tnTc03+) dans les mêmes conditions en l'absence de ligand. Deux heures après injection par voie intraveineuse caudale, les animaux sont sacrifiés par exsanguination et les différents organes sont prélevés, pesés et la radioactivité associée est mesurée par comptage γ.
La Figure 5 représente la biodistribution observée dans chaque cas (Trias-99mTc et 99mTc-réduit) deux heures après injection.
On constate que le technétium libre (réduit en l'absence du ligand TriaS) s'accumule essentiellement dans le foie (60%) et l'estomac (5%), ce qui suggère une métabolisation hépatique de 99mxco3+ et de ses éventuels produits de réoxydation. En revanche, dans le cas de Trias-95,niTe, l'activité mesurée dans le foie ne correspond qu'à environ 2% de l'activité injectée. L'essentiel de la dose injectée est récupérée dans les urines et les reins (80% au total). Le complexe semble donc être éliminé essentiellement par voie rénale et ne pas se répartir significativement dans les autres organes fixant habituellement les composés technétiés. Ce résultat est très intéressant car dans de nombreux cas, une part importante de l'activité est observée, quelques heures après injection, dans les organes du tractus gastrointestinal, réduisant ainsi le contraste en imagerie et rendant même difficile voire impossible la visualisation d'une cible située dans la cavité abdominale.
Il convient également de comparer ces résultats à ceux observés dans le cas de complexes mettant en jeu des ligands à noyau pyridyles et imidazoyle. Le Tableau IV présente une comparaison entre les biodistributions de TriaS-99raTc et des complexes de ces deux types (comparaison des biodistributions à 2h de complexes à ligands triazoyle, pyridyle, et imidazoyle en pourcentage de la dose injectée).
Tableau IV :
Figure imgf000061_0001
Organe TriaS-yvmTc A : Pyr-OH A' : Pyr-COOH B : Imi-OH
Sang 1.2 17.5 20.5 0.3
Foie 2.7 25.5 10.1 5.0
Reins 4.5 7.9 8.5 0.3
Rate 0.3 0.5 NA NA
Muscle 0.0 8.6 10.2 0.3
Urine 74.4 24.5^ 35.2(*} 44.4<*}
Fèces NA 16.9(i) 51.5<*> 46.3(*>
Total excrété 74.4 86.8<*> 90.6(S)
Les valeurs d'excrétions marquées par ) correspondent à une mesure effectuée 24h après injection
On constate que deux heures après injection, les complexes à motifs pyridyles A et A' sont très présents dans le sang, le foie et les muscles. A l'inverse, dans les cas de complexes à ligands imidazoyles B, aucune accumulation dans ces organes n'est observée : les complexes à ligands pyridyles ont donc une élimination lente. Ces complexes sont donc moins intéressants car après deux heures, ils conduiront à une visualisation moins efficace de la cible du fait d'un contraste plus faible.
Le complexe TriaS-99mTc donne des résultats comparables aux complexes à ligands imidazoles du point de vue de la rétention dans les tissus et les organes du tractus gastrointestinal. Nous pouvons aussi remarquer que les complexes à ligands pyridyle sont éliminés beaucoup moins efficacement de l'organisme que les complexes à ligand imidazole ou triazole (TriaS-99mTc) : après 24h, seule 41% de l'activité injectée a été éliminée de l'organisme. Cette valeur monte à 87% lorsqu'une fonction acide carboxylique est ajoutée à sa structure (Α'). Cette donnée confirme qu'il sera possible d'améliorer rélimination des complexes par l'ajout de groupements hydrophiles par exemple. TriaS-99mTc se démarque néanmoins de ces analogues puisque près de 75% de l'activité injectée a été éliminée après seulement deux heures. Enfin, dans le cas de TriaS-"mTc, le complexe est essentiellement éliminé par voie rénale. Ceci contraste avec les résultats des trois autres complexes présentés pour lesquels 40 à 60 % de l'activité est détectée dans les fèces, indiquant une élimination par la voie hépatobilliaire. TriaS-99n,Tc apparaît donc comme une structure de complexes très intéressante en comparaison à ses analogues pirydyle et imidazoyle car il bénéficie d'une faible accumulation dans les tissus et le sang et d'une élimination rénale rapide.
Afin de confirmer cette observation, une 4<ane souris ayant reçu le complexe TriaS- "mTc a été sacrifiée puis congelée afin de réaliser des coupes au microtome. Ces coupes ont ensuite été visualisées après une nuit d'acquisition au β-imager en utilisant le faible caractère émetteur β de 99mTc (E - 2 keV). Le β-imager est un dispositif permettant de visualiser une émission β~ avec une extrême sensibilité et une résolution largement supérieure à celle d'une γ-caméra. L'échantillon à analyser est placé dans une chambre dans laquelle circule un gaz (argon 98%, triéthylamine 2%). Dans la chambre d'analyse, deux grilles permettent d'appliquer un fort champ électrique. Les particules β" émises par l'échantillon ionisent le gaz, produisant une lumière ultraviolette détectée par une caméra CCD qui reconstitue une image (source : biospacelab.com).
La Figure 6 à gauche montre l'un des clichés obtenu lors de la visualisation d'une coupe de souris sacrifiée deux heures après injection de TriaS~99mTc. On y distingue très nettement la forme d'un rein plus lumineuse qui contraste avec le reste du corps. Pour cette mesure, la sensibilité choisie était très élevée, pourtant aucune radioactivité résiduelle significative n'est observée en dehors des reins. Ceux-ci sont donc visibles de façon très nette. A titre de comparaison, la Figure 6 à droite montre le cas d'un traceur présentant une forte accumulation dans les organes du tractus gastrointestinaî : le contraste est moins bon et une cible située à proximité d'un de ces organes pourrait ne pas être visible. L'élimination rapide du complexe du milieu circulant est donc un résultat très positif.
Cette observation confirme les résultats de l'étude de biodistribution : le complexe TriaS-99niTc est donc éliminé très efficacement par voie rénale sans accumulation significative dans d'autres tissus. V/ B- Etude de stabilité
V/B- 1. Analyse des urines
Analyse des urines recueillies deux heures après injection :
Après avoir montré que le complexe TriaS-^Tc était éliminé chez la souris par voie rénale, il restait à déterminer si ce complexe était excrété intact ou sous une forme métabolisée. Pour cela, la composition des urines recueillies chez la souris 2h après injection de TriaS-99mTc a été analysée. Les échantillons d'urine ont été neutralisés et injectés en radio-HPLC analytique (Figure 7).
Il s'avère que plus de 60% de la dose recueillie dans les urines correspond au complexe Trias-99mTc excrété intact bien que trois autres pics moins importants correspondant à des composés plus hydrophiles soient observés. La majorité du complexe ne semble donc pas subir une quelconque dégradation métabolique. Le pic à environ 5 min (6% environ de la dose recueillie) peut être attribué au technétium libre réduit.
Etude de la stabilité de TriaS-99mTc et TriaS-99(m+e)Tc en urine de souris saine :
L'étude est réalisée sur deux souris Balb-C femelles (20 à 25g) de la même lignée que celles utilisées lors du test de biodistribution. TriaS-99mTc est préparé dans les conditions décrites précédemment puis la solution est filtrée sur Sep-Pak Light QMA (Waters). Un volume V = 100 L est injecté à chacune des deux souris et celles-ci sont placées dans des cages métaboliques afin de récupérer leurs excrétions durant les deux heures de l'étude. Deux heures après injection, les urines sont prélevées. Un échantillon de 200 iL d'urine est neutralisé par ajout de HCL (1M) puis injecté en RP-HPLC analytique (gradient : 0 - 100% B en 30 min, A = H20 + 0.1% TFA, B - ACN + % TFA).
En parallèle, une solution de TriaS-"(m+¾)Tc est préparée en ajoutant successivement dans un tube Eppendorf® : 20 L de TriaS à 1 mg/mL (20 μ , 62.6 nmol), 80 L d'eau mQ, 35 iL de SnCl2 à 1 mg mL préparée extemporanément (35 g, 184,2 nmol, 3,0 équiv.), 70 L de soude 0.ΙΜ, 75 μΐ, de solution Na99mTc04 fraîchement éluée et 8.4 μL Na99gTc04 (1.0 équiv.). De l'urine de souris Balb-C femelle saine (même lignée que celles utilisées précédemment) est placée à 37°C. La solution test est préparée en ajoutant 10 μί de solution de complexe à 90 μL· d'urine puis placée à 37°C. Après 2h d'incubation, le mélange est neutralisé par ajout d'une solution de HC1 1M puis dilué dans 100 d'eau avant d'être injecté en radio-RP-HPLC analytique (gradient : 0 - 100% B en 30 min, A = ¾0 + 0.1% TFA, B = ACN + % TFA). Cette étude est réalisée en dupîicate.
L'utilisation d'un mélange 99mTc + 99gTc a permis de visualiser nettement par radio- HPLC les pics correspondants aux produits de raétabolisation grâce à 99mTc tout en rendant possible leur caractérisation par MALDI-TOF après décroissance des fractions prélevées. Dans ces conditions, on parle de ligand marqué intégralement, Trias-99mTc étant en concentration namolaire et TriaS-99fiTc en concentration micromolaire.
La Figure 8 montre le radiochromatogramme obtenu dans ces conditions. Les quatre pics sont toujours présents dans des proportions différentes. Le composé identifié à 17.7 min s'est avéré avoir une masse m/z = 432.1 : il s'agit de TriaS-Tc excrété intact. Les masses des deux autres composés ont pu être déterminées : m/z = 534.0 pour le composé observé à 9 min, et deux masses m/z = 713.3 et m/z = 743.3 pour le composé observé à 11.8 min.
V/B- 2. Etude de la stabilité de TriaS-"'"Tc dans le sang de souris saine
Le sang de souris Balb-C utilisé est fraîchement prélevé (une demi-heure avant utilisation). Un volume de 50 L de solution de complexe est ajouté à 450 μϋ de sang. Le mélange est homogénéisé et mis à incubation à 37°C. Après 2h d'mcubation, le mélange est centrifugé durant 15 minutes à 1600 tr.rmV1 puis le surnageant est prélevé délicatement Un volume de 50 μΐ. de ce plasma est alors ajouté à 150 μΐ, de solution de TFA à 10% afin d'entraîner la précipitation des protéines plasmatiques. Après centrifugation pendant 5 min, le surnageant est prélevé. 50 μL de surnageant sont dilués dans 150 L d'eau puis injectés en radio-RP-HPLC analytique (gradient : 0 - 100% B en 30 min, A = H20 + 0.1% TFA, B = ACN + % TFA).
Après précipitation des protéines plasmatiques, l'échantillon a été analysé par radio- HPLC et les radiochromatogrammes de la Figure 9 ont été obtenus.
On observe la formation d'un produit de dégradation ayant un temps de rétention de 1.4 min qui semble correspondre au dernier pic visible dans l'urine excrétée. D'après la Figure 9, la dégradation dans le sang semble très importante, le produit de dégradation étant très largement majoritaire après 2h d'incubation. Cependant, dans cette expérience, l'ensemble du complexe reste au contact du sang durant les deux heures d'incubation, il est donc normal d'observer une dégradation bien supérieure. Cette dégradation dans le sang, pourra être mise à profit dans le cas d'une cible protéique extracellulaire, le traceur non lié à la cible étant dégradé et éliminé par voie rénale.
Sans avoir précisément identifié la structure de ce second produit de dégradation, nous avons néanmoins pu en expliquer l'origine, à savoir une dégradation ayant lieu dans le sang. D'après les résultats de l'étude cinétique menée dans le plasma, celle-ci n'est pas liée à un composant du plasma mais sans doute à une métabolisation par les érythrocytes. Cependant, la nature exacte du métabolite n'a pu être déterminée.
A la lumière de tous ces résultats, et en particulier de l'analyse de la composition des urines recueillies après injection chez la souris saine, il semble que cette dégradation n'ait que peu d'incidence sur l'utilisation de TriaS pour la réalisation de traceurs in vivo. En effet, plus de 60% de l'activité recueillie dans les urines correspond à 99mTc-TriaS intact. En outre, la visualisation au β-imager d'une coupe de souris après injection du composé montre un excellent rapport signal/bruit, les reins apparaissent très nets par rapport au reste de la coupe où très peu d'activité résiduelle apparaît. Ceci montre bien que le ou les complexes de dégradation ne se sont pas accumulés dans un tissu ou au niveau hépatique mais ont été éliminés dans les urines.
VI/ APPLICATION DU TriaS DE FORMULE (H) POUR LE DEVELOPPEMENT DE RADIOTRACEURS IN VIVO DE L'INTEGRINE ανβ^
VI/ A- Généralités sur les intégriues et leurs ligands
Les intégrines sont des récepteurs membranaires impliqués dans les processus d'adhésion cellulaires. Elles régissent les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire. Ces glycoprotéines hétérodimériques intégrales sont constituées de deux sous- unités a et β. Chaque sous-unité se compose d'un domaine cytoplasmique court sans activité catalytique et d'un long domaine extracellulaire responsable de la liaison aux ligands endogènes (J. Xiong et al, Science 2001, 294(5541), p. 339-345 ; J. Xiong et al, Science 2002, 296(6656), p. 151-155 ; T. Xiao et al, Nature 2004, 432(7013), p. 59-97). Chez les mammifères, on dénombre 18 sous-unités a et 8 sous-unités β conduisant à 24 combinaisons distinctes. Celles-ci peuvent être classées en familles selon la nature des Hgands. La plus importante famille est celle des récepteurs se liant au tripeptide RGD qui comprend notamment les intégrines ανβ3, ανβ5, et αί¾β3.
Les intégrines sont des protéines d'adhésion qui interviennent dans un grand nombre de mécanismes biologiques de l'individu sain. Leur structure transmembranaire leur permet de participer à la transmission de signaux entre le cytoplasme et la matrice extracellulaire (inside-out) (F. Ye et al, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2011. 9: p. 20-25) et inversement (outside-in) (F. G. Giancotti et al, Science, 1999. 285(5430): p. 1028-1033). A l'inverse, la liaison de l'extrémité extracellulaire conduit à un phénomène de clusterisation (rassemblement local d'intégrines qui forment un oligomère) permettant la transmission de signaux intracellulaires qui conditionnent entre autres la survie, la mobilité et la polarité cellulaire. Les intégrines jouent donc un rôle clé dans les phénomènes d'adhésion, de polarisation et de motilité cellulaire.
Les intégrines participent également aux processus angiogéniques (J. T. Yang et al, Development, 1995, 121(2), p. 549-560), notamment la néoangiogénèse tumorale qui conditionne le développement des tumeurs en formation, et sont impliquées dans diverses autres pathologies (Wehrle-Haller et al, Journal of Pathology, 2003, 200, p. 481-487), Certaines études ont également montré que la présence d'intégrines, en particulier ανβ , peut être associée à la formation active de métastases (B. Felding-Habermann et al, CHnical and Expérimental Metastasis, 2002. 19(5): p. 427-436 ; P. Clezardin, Cellular and Molecuiar Life Sciences, 1998. 54(6): p. 541-548).
Le Tableau V ci-dessous indique les profils d'expression en intégrines de diverses tumeurs et des métastases associés (G. Mizejewski, Proceedings of the society for expérimental biology and medicine, 1999. 222(2): p. 124-138).
Tableau V :
Cancer Foyer tumoral principal Métastases
Figure imgf000067_0001
Colon NA α5βι / 6β4
Rein α5βι
Poumon NA (* 3βΐ 1I PiHa
Mélanome α3βι / θ4βι / ανβ3 ί 1 α2βι / α5βι / αι¾βπιβ / νβ3 / α6β4
Ovaire α3βι
Peau νβ3 <¼>βι α3βι / α6βι / α6β4
Cerveau ανβ3 ανβ3
Les intégrines ανβ3 jouent un rôle essentiel dans la néoangiogenèse tumorale, en particulier. Cette dernière étant surexprimée au niveau de la tumeur et très peu dans les cellules saines, elle constitue donc une cible privilégiée pour la détection précoce des tumeurs primaires, des récidives tumorales et des métastases (W. L. Rust et al, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2002. 2(3): p. 124-130 ; H. Jin et al, Br J Cancer, 2004. 90(3): p. 561-565 ; R. Haubner, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2006. 33(0): p. 54-63 ; A. Matter, Drug Discovery Today, 2001. 6(19): p. 1005- 1024).
L'intégrine ανβ3 fait partie des huit intégrines reconnaissant le motif tripeptidique Arg- Gly-Asp (ou RGD) structuré (Schéma 16) présent dans de nombreuses protéines de la matrice extracellulaire telles que la vitronectine, la fïbronectine, ou le fibrinogène (E. Ruoslahti, Matrix Biology, 2003. 22(6): p. 459-465).
Figure imgf000067_0002
Schéma 16 : Tripeptide RGD « Arg-Gly-Asp » Les ligands de l'intégrine ανβ3 développés actuellement sont de différents types : Les anticorps monoclonaux tels que la Vitaxine (Phase I et II) qui sont très sélectifs et peuvent être marqué par divers radioéléments pour une utilisation en imagerie.
Les ligands peptidiques ou pseudopeptidiques présentant la séquence RGD linéaire ou cyclique sont utilisés in vivo.
Les ligands non peptidiques mimant le motif RGD. Ces composés sont souvent obtenus par criblage de chimiothèques.
Les disintégrines comme la Leberagine-C ou l'Acurhagine-C sont des toxines également étudiées actuellement (I. Limam et al., Matrix Biology, 2010. 29(2): p. 117-126 ; W. J. Wang, British Journal of Pharmacology, 2010. 160(6): p. 1338-1351).
Afin de démontrer les potentialités de la plateforme TriaS de formule (II) pour la préparation de radiotraceurs in vivo, deux types de radiotraceurs technétiés ciblant l'intégrine ανβ3, marqueur couramment utilisé pour l'imagerie moléculaire du cancer, ont été développés.
Deux approches distinctes ont été étudiées :
une première approche qui met à profit le concept de traceurs Tc-essentieîs, et qui consiste en la réalisation de traceurs intégrés mimes de RGD construits à partir de la structure TriaS de formule (II) par introduction d'un motif guanidium et d'un mime aspartate via la chimïe-click, et
une seconde approche qui aborde la conception de composés bifonctionnels modulaires, et qui consiste à développer des traceurs bifonctionnels construits à partir du cyclopentapeptide c(RGDf ).
VI/ B- Développement de traceurs intégrés de l'intégrine ανβ3
Plusieurs complexes intégrés (« Tc-essentiels ») mimant le tripeptide RGD dans lesquels la chélation du métal apporte sa rigidité à la structure ont été synthétisés. Le résidu arginine est conservé tandis qu'un mime d'aspartate est introduit au niveau du noyau triazole par chimie-click. Trois complexes ont ainsi été préparés parmi lesquels 99mTc-51a (Schéma 17).
Figure imgf000069_0001
Schéma 17 : "raTc-51a
Le complexe fonctionnalisé mTc~51a a également été évalué en plasma murin. Cette étude a mis en évidence une stabilité supérieure à 50% après 6h d'incubation à 37°C. En outre, aucun produit de dégradation n'a été observé. Bien que la stabilité des complexes TriaS fonctionnalisés semble inférieure à celle de TriaS, ce résultat suggère que l'incorporation de fonctions guanidinium et carboxylate ne perturbe pas le processus de chélation du technétium et déstabilise peu le complexe obtenu.
VI/ B- 1. Stratégie de synthèse
Le composé 49, précurseur acétylè ique a été préparé en deux étapes à partir de la Fmoc-Arg(Pbf)-OH par couplages successifs de la propargylamine et de l'acide mercaptoacétique tritylé 15 (Schéma 18).
NHPbf
FmocHN OH
Figure imgf000069_0002
Schéma 18 : Préparation du précurseur acétylènique des traceurs intégrés, a) Propargylamine, DCC, DIPEA, DCM, rt, 24h, 82% ; b) DMF/Pipéridine (4/1), rt, 2h ; c) 15, DCC, DIPEA, rt,
24h, 88% Ce composé a ensuite été engagé dans la synthèse de la série de ligands alkylcarboxylates 51a~c et du ligand benzoïque substitué en position para 53 (Schéma 19).
Figure imgf000070_0001
Schéma 19 : Fixation du mime d'aspartate par chimie combïnatoire via la chimie-click : a) Cycloaddition de Huisgen (procédure n°2) : Bromoacéiate de teri-butyle (resp. bromopropionate de tert-butyle et acide 4-bromobutyrique), NaN3, Cu(II), EtOH/H20 (9/1), MW, 80°C, 30 min ; b) Cycloaddition de Huisgen (procédure n°2) ; Bromoacéiate de fe/t-butyle (resp.
bromopropionate de tert-butyle et acide 4-bromobutyrique), NaN3, Cu(II), EtOH H20 (9/1), MW, 80°C, 30 min ; c) TFA/TIPS/H20 (95/2.5/2.5), rt, Ih ; d) NaTc04, SnCl2, NaOH, rt, 5 min.
Enfin, le complexe 99mTc-51 ainsi que les deux complexes 99gTc~51b et " Tc-53 ont ;té préparés dans les mêmes conditions que pour TriaS-Tc (Schéma 19).
VU B- 2. Méthodes de synthèses
Synthèse du précurseur acétylénique 49 :
La FmocArg(Pbf)OH (8.11 g, 12.5 mmol, 1.0 équiv.) est dissoute dans 50 mL de DCM sec. La propargylamine (0.8 mL, 12.5 mmol, 1.0 équiv.) et HOBt (2.025 g, 15.0 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés puis le pH est ajusté à 8 par ajout de DIPEA. Après addition de la DIPEA (8.7 mL, 15.0 mmol, 1.2 équiv.), le DCC (3.1 g, 15.0 mmol, 1.2 équiv.) est introduit et l'ensemble est agité sous atmosphère d'argon à température ambiante pendant 24 h. On observe la formation d'un précipité blanc de DCU. La DCU est éliminée par filtration puis le DCM est évaporé et l'huile obtenue est reprise dans AcOEt puis lavée par une solution saturée de chlorure de sodium, et par une solution d'acide citrique à 10%. Les fractions organiques sont réunies et séchées au sulfate de sodium anhydre puis évaporées. Le composé (huile) obtenu est repris dans le DCM et purifiée par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane / AcOEt 20/80, révélation UV, Rf = 0.3). Le produit est séché une nuit sous pression réduite pour conduire à 48 sous forme d'un solide blanc. 7.04g, 10.3 mmol, Rdt - 82%. 1H RMN (CDC13) : δ 7.72 (d, 2H, J - 6.8 Hz, CH Ar, Fmoc), 7.54 (d, 2H, J - 6.8 Hz, CH Ar, Fmoc), 7.352 (t, 2H, J = 6.5 Hz, CH Ar, Fmoc), 7.25 (d, 2H, J - 7.8 Hz, CH Ar, Fmoc), 4.27 (m, 3H, C¾ Fmoc + Glycyl), 3.97 (s, 2H, CH2-C≡CH), 3.26 (m, 2H, C¾ Arg (e)), 2.89 (s, 2H, CH2 Pbf), 2.57 (s, 3H, CH3 Pbf (a)), 2.50 (s, 3H, CH3 Pbf (c))s 2.12 (s, 1H, C¾-C≡CH) ; 2.05 (s, 3H, C¾ Pbf (b)), 1.7 - 1.5 (m, 4H, C¾ Arg (f,g)), 1.41 (s, 3H, CH3 Pbf (d)) ; 13C RMN (CDC13) : δ 158.8 (CO amîde), 156.5 (CO carbamate), 143.6 - 117.6 (C Arom, Pbf + Fmoc), 86.4 (C, Pbf), 79.5 (-C≡CH), 71.3 (-C≡ÇH)S 67.0 (CH2 Fmoc), 49.9 (CH2 Arg(e)), 46.9 (C, Fmoc), 43.0 (C¾, Pbf), 28.7 (C¾, Arg(g))} 28.5 (CH2 Pbf(d)), 24.6 (CH2, Arg(f)), 19.3 (CH3, Pbf(a)), 18.0 (CH3, Pbf(b)), 12.4 (CH3, Pbf(c)) ; ( MALDI/TOF : m/z - 419.3 [MH+].
Le composé 48 (4.19 g, 10.0 mmol, 1.0 équiv.) est dissout dans 20 mL de DMF/Pipéridine (4/1) et agité durant 2h à température ambiante. Le suivi de cette déprotection est assuré par CCM (éluant : hexane/ AcOEt 20/80, Rf = 0.3). Le DMF est évaporé sous pression réduite. L'huile obtenue (10.0 mmol, 1.0 équiv.) est reprise dans 25 mL de DCM sec et 15 (3.34 g, 10.0 mmol, 1.0 équiv.) puis HOBt (1.62 g, 12.0 mmol, 1.2 équiv.) sont ajoutés. Le pH est ajusté à 8 par ajout de DIPEA puis la DIPEA (5.8 mL, 10.0 mmol, 1.0 équiv.) est ajoutée et enfin le DCC (2.48 g, 12.0 mmol, 1.2 équiv.). Le mélange est agité durant 24 h à température ambiante sous atmosphère d'argon. On observe la formation d'un précipité blanc de DCU. La DCU est éliminée par filtration puis le DCM est évaporé sous pression réduite. L'huile obtenue est reprise dans i'AcOEt et lavée par une solution saturée de chlorure de sodium puis par une solution d'acide citrique 10%. Les fractions organiques sont regroupées, séchées et évaporées. Le produit obtenu est repris dans le DCM est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : AcOEt / hexane 80/20, révélation UV). Après évaporation et séchage, le composé 49 est obtenu sous la forme d'un solide blanc. 4.48 g, 8.75 mmol, Rdt = 88%. 1H RMN (CDC13) : δ 7.89 (t, 1H, J = 2.5 Hz, NH amide (i)), 7.4 - 7.1 (m, 15H, CH Ar, Trt), 7.07 (d, 1H, J = 7.5 Hz, NH amide (h), 4.33 (d, 1H, J - 5 Hz, CH, Glycyl) , 3.90 (s, 1H, CH2-C≡CH). 3.10 (m, 2H, CH2, Arg 3.03 (s, 2H, CH2S), 2.92 (s, 2H, CH2, Pbf), 2.54, 2.47 (s, 3H, CH3 Pbf x2), 2.07 (s, 4H, CH3 Pbf (b) + CH2C≡CH), 1.44 (s, 6H, 2 CH3 Pbf (d)). 13C RMN (CDCï3) : δ 171.3 (CO amide (i)), 168.9 (CO amide (h)), 158.8 (C Ar, Pbf), 143.9 (C Arom, Trt), 132.2 (C Ar Pbf), 129.5-126.8 (CH Ar, Trt), 124.7 (C Ar, Pbf), 1 7.6 (C Ar Pbf), 86.4 (C, Pbf), 79.5 (C≡CH), 71.3 (C¾H), 67.7 (C, Trt), 53.5 (CH2, Pbf), 36.17 (CH2, Arg (e)), 30.4 (CH2, Arg (g)), 28.6 (CH3, 2 x Pbf (d)), 25.3 (CH2, Arg (f)), 19.39 (CH3, Pbf (a)), 18.0 (CH3, Pbf (b)), 12.4 -CH3, Pbf (c)) ; MALDI TOF : m/z - 513.2 [MH*].
Synthèse des agents chélatants 51a, SI b et 53 :
Le composé 49 (93.6 mg, 0.12 mmol, 1.2 équiv.) est mis en solution dans l'éfhanol (750 μί). La procédure n°2 de cycloaddition dipolaire de Huisgen est appliquée avec les composés halogénés respectifs (0.1 mmol, 1.0 équiv.) pour conduire au ligand protégé 50a (resp 50b, et 52) puis aux agents chélatants déprotégés 51a, 51b et 53.
Le composé halogéné utilisé est le bromoacétate de iert-butyle (5.4 μL, 0.1 mmol, 1.0 équiv.). 50a est obtenu sous forme d'une huile marron (46 mg, 48.9 μιηοΐ, Rdt = 49 %). Après lh sous agitation dans un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5), le solvant est évaporé. Le solide est repris dans un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi-préparative. Le produit est lyophilisé pour conduire à 51a sous forme d'une poudre blanche (10.4 mg). RP- HPLC analytique : tR - 8.5 min ; 1H RMN (MeOD) : δ 7.99 (s, 1H, NH amide), 7.81 (s, ÎH, CH triazole), 5.34 (s, 2H, CH?~COO , 4.58 (m, 1H, CHrCC . 4.05 -m, 1H, CH Arg), 3.31 (s, 2H, C¾S), 1.95-1.75 (m, 6H, 3 x C¾ Arg) ; l3C RMN (MeOD) : δ 173.8, 171.8 (CO amides), 158.6 (CN, Arg), 146.1 (CH2-C=C), 125.8 (CH2-C-Ç), 54.5 (Ç_H2-COO), 52.0 (CH, Arg), 41.9 (ÇH2-C=C), 35.3 (CH2, Arg), 30.2 (CH2S), 26.3, 26.1 (2 x C¾, Arg) MALDI/TOF : m/z - 387.1 [MHf ].
Le composé halogéné utilisé est le broraopropionate de fcr/-butyle (12.8 μL, 0.1 mmol, 1.0 équiv.). 50b est obtenu sous forme d'une huile marron (32 mg, 34.0 μηαοΐ, Rdt = 34 %). Après lh sous agitation dans un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5), le solvant est évaporé. Le solide est repris dans un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi- préparative. Le produit est lyophilisé pour conduire à 51b sous forme d'une poudre blanche (3.1 mg). RP-HPLC analytique : tR = 9.8 min ; δ M ALDI TOF : m/z - 401.1 [MH+],
Le composé halogéné utilisé est l'acide ^ara-bromométhylbenzoïque (21.4 mg, 0.1 mmol, 1.0 équiv.). 52 est obtenu sous forme d'un solide brun (22.1 mg, 23.0 μιηοΐ, Rdt = 23%). Après lh sous agitation dans un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5), le solvant est évaporé. Le solide est repris dans un mélange eau/ACN (4/1) et purifié par RP-HPLC semi- préparative. Le produit est lyophilisé pour conduire à 53 sous forme d'une poudre blanche (1.3 mg). RP-HPLC analytique : tR = 16.3 min ; M ALDI/TOF : m/z = 462.1 [MH+],
Synthèse des radiotraceurs 99gTc-51a, "ëTc-51b. "ËTe-53 et 99mTc-51a :
Le composé 51a (20 μg, 52 nraol, 20μΙ, de solution à 1 mg/mL) est mis en solution dans 60 ih d'eau distillée. Après ajout de 27 Τ de solution de SnCl2 à 1 mg/ml, et 54 iL de solution de NaOH 0.1 M, une solution de Na99gTcC>4 est ajoutée (1.0 équiv.) et la solution est placée 5 minutes à incubation à 37°C. Après ajout de 5.4 xL de solution d'HCL 1M, le complexe est analysé par RP-HPLC. RP-HPLC analytique : = 11,4 min ; MALDI TOF : m/z - 499.0 [MH+].
Le composé 51b (20 μg, 50 nmol, 20μL de solution à 1 mg/mL) est mis en solution dans 64 μΐ d'eau distillée. Après ajout de 28 μΐ. de solution de SnCl2 à 1 mg/ml, et 56 μL· de solution de NaOH 0.1 M, une solution de Na9 gTc04 est ajoutée (1,0 équiv.) et la solution est placée 5 minutes à incubation à 37°C. Après ajout de 5.6 aL de solution d'HCL 1M, le complexe est analysé par RP-HPLC. RP-HPLC analytique : tR - 11.6 min ; MALDI/TOF : m/z - 513.0 [MH+j\
Le composé 53 (20 gî 43,2 nmol, 20μί de solution à 1 mg/mL) est mis en solution dans 64 L d'eau distillée. Après ajout de 24 iL de solution de SnCl2 à 1 mg/ml, et 48 \iL de solution de NaOH 0.1 M, une solution de Na"eTc04 est ajoutée (1.0 équiv.) et la solution est placée 5 minutes à incubation à 37°C. Après ajout de 4.8 μΐ. de solution d'HCL 1M, le complexe est analysé par RP-HPLC. RP-HPLC analytique : tR - 17.0 min ; MALDI/TOF : m/z - 575.0 [MH4].
Le composé 51a (20 g, 52 nmol, 20 L de solution à 1 mg/mL) est mis en solution dans 60 d'eau distillée. Après ajout de 27 L de solution de SnCl2 à î mg/ml, et 54 L de solution de NaOH 0.1 M, 75 μΐ, d'une solution de Na 9mTc04 est ajoutée et la solution est placée 5 minutes à incubation à 37°C. Après ajout de 5.4 μί^ de solution d'HCL 1M, le complexe est analysé par RP-HPLC. RP-HPLC analytique : Î = 1 1.2 min et Î - 11.6 min.
VI/ B- 3. Résultats
Les complexes 99mTc-51a, 99gTc-51b et "8Tc-53 ont été étudiés par RP-HPLC analytique. Les chromatogrammes obtenus sont représentés à la Figure 10. Les trois complexes ont été caractérisé en masse (MALDI-TOF).
On constate que dans le cas de la complexation des deux ligands 51a et 51b, aucun signal n'est présent à 4-5 min, et ce même signal est très faible dans le cas de la complexation de 53. Il n'y a donc plus de technétium réduit résiduel : le marquage est quantitatif. L'adjonction de groupements fonctionnels à la structure de TriaS, susceptibles d'interférer dans la chélation du métal, n'a donc pas d'influence négative sur celle-ci.
VI/ C- Développement de traceurs bifonctionnels de l'intégrine ανβ3
VU C- 1. Stratégie de synthèse
De nombreux ligands de l'intégrine ανβ3 ont été identifiés présentant de bonnes affinités et une sélectivité intéressante pour cette intégrine par rapport à l'intégrine αι¾β3. Le choix de la molécule ciblante est très large, et c'est le cyclopentapeptide c(RGDfV) qu'il a été choisi d'exemplifier. VU C- 2. Méthodes de synthèse
Synthèse sur support des cyclopentapeptides c(RGDf ) et c(RGDffN-Me)K) :
Les cyclopentapeptides utilisés ont été préparés sur support solide en stratég d'après le schéma de synthèse indiqué au Schéma 20 ci-dessous :
T OH
FmocHN~Asp-OAil 54 b, c, b, d, b, e
j Φ
X = H 55
FmocH -Lys (Mmt)- Arg (Pbf)-Gly-Asp-OA!! i, j. k d X = Me 55b
Me M
X = H 56
FmocHN-(D)-Phe~Lys {Mmt)- Arg (Pbf)-Gly-Asp-OAIl X = Me 56b
g
FmocHN
Figure imgf000075_0001
Schéma 20 : Synthèse sur support des peptides c(RGDf ) et c(RGDf(N-Me)K) : a) FmocAsp(OAll)OH, DIC, DMAP, DCM/DMF (1/2), rt, 24h ; b) DMF/Pipéridine (4/1), rt, 5 min, 5x ; c) FmocGlyOH, DIC, DIPEA, MP, rt, 24h ; d) FmocArg(Pbf)OH} DIC, DIPEA, NMP, rt, 24h ; e) FmocLys(Mmt)OH, DIC, DIPEA, NMP, rt, 24h ; i) Fmoc-(D)-PheOH, DIC, DIPEA, NMP, rt, 24h ; g) tetrakis-triphenylphosphine paladium, AcOH, NMM, CHCI3, rt, 24h ; h) HAUT, DIPEA, NMP, rt, 24h ; i) o-NBS-Cl, collidine, NMP, rt, 15 min, 3x ; j) 1)DBU, NMP ~ 2}(CH3)2S04, NMP x2 ; k) mercaptoéthanol, DBU, NMP, rt, 5 min, 2x
La résine Wang (1.14g} 0,5 mmol) est conditionnée dans le DCM (1 15 min, 2 x 1 min), puis lavée pas le DMF (3 x 1 min). La DMAP (6.1 mg, 0.05 mmol, 0.1 équiv.) est ajoutée en solution dans 10 mL de DMF et la résine est agitée durant 20 min. Le FmocAsp(OAll)OH (1.98g, 5.0 mmol, 10 équiv.) est mis en solution dans 10 mL de DCM et 4 à 5 gouttes de DMF. Le mélange est placé à 0°C pendant 5 min le DIC (390μί, 2.5 mmol, 5.0 équiv.) est ajouté sous atmosphère d'argon. Le mélange est agité à température ambiante pendant 20 min puis versé sur la résine. La résine est agitée durant 24h à température ambiante puis lavée par DMF (3 x 1 min) et DCM (3 1 min). La substitution de la résine est évaluée par dosage UV à 290 nm. S - 0.412 mmol.g \ Rdt = 94%.
La résine est conditionnée dans le DCM (3 1 min) puis DMF (3 xl min). Le bromure de benzyle (297 μΕ, 2.5 mmol, 5.0 équiv.) puis la DIPEA (870 μί, 5.0 mmol, 10 équiv.) sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante pendant lh. Après lavage par DMF (3 x 1 min), DCM (3 1 min) la résine est conditionnée dans le DMF (3 x 1 min) et déprotégée par un mélange DMF/Pipéridine (4/1) (5 x 5 min). Après lavages au DMF (3 x 1 min), DCM (3 x 1 min), un test Kaiser est réalisé et donne une coloration bleue (positif). La FmocGlyOH (1.486g5 5.0 mmol, 10.0 équiv.) est ajoutée en solution dans la NMP, puis la DIPEA (870 \ih, 5.0 mmol, 10 équiv.), ClHOBt (848 mg, 5.0 mmol, 10 équiv.) et DIC (775μΕ, 5.0 mmol, 10.0 équiv.) sont ajoutés successivement. Après 24h d'agitation, la résine est lavée par la NMP (3 x 1 min) puis DCM (3 1 min). Le test Kaiser est alors négatif. Cette opération déprotection/couplage est répétée successivement avec les acides aminés suivants : FmocArg(Pbf)OH (3.24g, 5.0 mmol, 10.0 équiv.) et FmocLys(Mmt)OH (1.60g, 2.5 mmol, 5.0 équiv.) pour conduire à la résine 53. Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant lh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse. MALDI/TOF : m/z = 737.3 [MH+]. La résine (0.25 mmol) est conditionnée dans le DCM (1 x 30 min, 2 1 min) puis le DMF (3 x 1 min). La déprotection est réalisée par un mélange DMF/Pipéridine (4/1) (5 x 5 min) puis la résine est lavée par DMF (3 x 1 min), DCM (3 x 1 min) et NMP (3 1 min). Test Kaiser positif. O-NBSCl (222 mg, 1.0 mmol, 4.0 équiv.) et la coilidine (162.5 μL ; 2.5 mmol, 10.0 équiv.) sont mis en solution dans la NMP (5 mL) et ajoutés à la résine. Après 2 x 15 min d'agitation à température ambiante, le solvant est éliminé par filtration. Test Kaiser négatif. La résine est ensuite lavée par la NMP (3 x 1 min) et du DBU (115 L, 0.75 mmol, 3 équiv.) est ajouté dans 5 mL de NMP. Après 3 min d'agitation, Me2S04 (240 μL) 2.5 mmol, 10.0 équiv.) est ajouté puis la résine est agitée durant 2 x 2 min. Enfin, une solution de DBU (190 L, 1,25 mmol, 5.0 équiv.) et de mercaptoéthanol (175 μL, 2.5 mmol, 10.0 équiv.) est ajoutée dans la NMP et la résine est agitée durant 2 5 min. La résine 55b obtenue est lavée par la NMP (3 1 min), le DCM (3 x 1 min). Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant lh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse. ESI : m z - 265.2 [M+ 2H+] et 529.3 [M+H+].
La résine 55 (resp. 55b) (0.25 mmol) est conditionnée dans le DCM (1 x 30 min, 2 1 min) puis la NMP (3 x 1 min). La Fmoc-(D)-PheOH (0.49 g, 2.5 mmol, 10.0 équiv.) est ajoutée en solution dans la NMP, puis la DIPEA (218 μί, 2.5 mmol, 10 équiv.), ClHOBt (212 mg, 2.5 mmol, 10 équiv.) et DIC (194 Ε, 2.5 mmol, 10.0 équiv.) sont ajoutés successivement. Après 24h d'agitation, la résine est lavée par la NMP (3 x 1 min) puis DCM (3 x 1 min). Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant lh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse.
- 56 X - H : ESI : m/z = 884,5 [M+ H+]
- 56b X - Me : ESI : m/z - 449.9 [M+ 2H+], 898.5 [M+H+]
La résine 56 (resp. 56b) est conditionnée dans le DCM (1 x 30 1 min) puis
CHCI3 (3 x 1 min). Le Pd(PPh3)4 (174 mg, 0.15 mmol, 3.0 équiv.) est dissous dans 8 mL d'un mélange CHCI3 / NMM / AcOH (92.5% / 2.5% / 5.0%) et ajouté à la résine. La résine est agitée durant 24h à température ambiante et à l'abri de la lumière. Après lavages successifs par une solution de DIPEA à 0.5% dans le DMF (3 x 1 min), une solution de diéthyldithiocarbamate de sodium à 0.5% dans le DMF (3 x 1 min), le DMF (3 x 1 min), une solution de DIPEA à 8% dans le DMF (3 x 1 min), le DMF (3 x 1 min), et le DCM (3 x 1 min), un aliquot est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant lh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse.
- 57 X = H : ESI : m/z = 844.5 [M+ H+]
- 57b X - Me : ESI : m/z - 429.7 [M+ 2H+], 858.4 [M+H+]
La résine 57 (resp. 57b) est conditionnée dans le DCM (1 x 30 min, 2 x 1 min) puis le DMF (3 x 1 min). La déprotection est réalisée par un mélange DMF/Pipéridine (4/1) (5 x 5 min) puis la résine est lavée par DMF (3 x 1 min), DCM (3 x 1 min) et NMP (3 x 1 min). La DIPEA (35 μL, 0.2 mmol, 4 équiv.) puis HATU (38 mg, 0.1 mmol, 2 équiv.) sont ajoutés en solution dans la NMP. Après 24h d'agitation, la résine est lavée par la NMP (3 x 1 min) puis DCM (3 x 1 min). Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant lh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse.
- 58 X - H : ESI : m/z = 604.2 [M+ H+]
- 58b X - Me : ESI : m/z - 309.2 [M+ 2H+], 618.3 [M+H+]
Les deux cyclopentapeptides 58 et 58b ont ainsi pu être obtenus et caractérisés en masse (MALDI-TOF) : m/z - 604.2 [MFf] et 618,3 [MH+] respectivement (Schéma 21).
Figure imgf000078_0001
58 - m/z - 604.2 [MH+] 58b - m/z - 618.3 [MH+]
Schéma 21 : Cyclopentapeptide c(RGDfK) (58) et sa forme N-méthylée (58b) Synthèse du traceur bifonctionnel cfRGDf VLvs- TcTriaS-PEG :
Un traceur bifonctionnel à partir du cyclopeptide non méthylé 58 a ensuite été synthétisé. Dans cet exemple, le traceur présentera un motif polyéthylèneglycol permettant d'orienter sa biodistribution. Nous avons choisi le O-(2-Aminoethyl)-O'-(2~azidoethyî)- pentaéthylène glycol ou azido-PEG-N¾ (n = 6) qui est un polyéthylèneglicol présentant déjà la fonction azoture et pourra donc être introduit par chimie-click. Il a été désigné PEG-N3 par la suite (Schéma 22).
Figure imgf000079_0001
Schéma 22 : Structure de PEG-N3
Dans le complexe synthétisé, la structure TriaS comporte un motif acide glutamique à la place de la lysine. La fonction acide carboxylique libre ainsi ajoutée permet de relier la structure au cyclopentapeptide par couplage peptidique. Le composé 60 qui sera couplé à la résine est préparé au préalable en solution par couplage de la propargy lamine sur l'acide glutamique (Schéma 23).
Figure imgf000079_0002
Schéma 23 : Préparation du synthon 60 a) Propargyîamine, DCC, Cl-HOBt, DIPEA, DCM, rt,
24h ; b) TFA/DCM, rt, 30 min
La synthèse du complexe c(RGD f ) -Lys- TcTriaS -PEG est décrite au Schéma 24
Figure imgf000080_0001
Schéma 24 : Synthèse de c(RGDfK)-Lys- TcTriaS-PEG : a) Cl-HOBt (0.6 M), DCM/TFE, rt, 2x 30 min; b) BocLysOH, DIC, HOBt, NMP, DIPEA, rt, 24h ; c) DMF/Pipéridine (4/1), rt,
5x 5 min ; d) 60, DIC, DIPEA, NMP, rt, 24h ; e) 15, HATU, DIPEA, NMP, rt, 24h ; f) Cycloaddition de Huisgen (Procédure n°2) : PEG-N3 (Fig. IV.37.), Cu(ll), MW, NMP, 80°C,
30 min ; g) TFA/TIPS/¾0 (95/2.5/2.5) ; h) Na99mTc04, SnCl2, NaOH, ¾0, rt, 5 min
Dans un premier temps, la résine 58 a été déprotégée dans des conditions douces (ClHOBt (0.6M), AcOH, NMM, rt, 2 x 30 min) de façon à retirer le groupement protecteur Mrat sans cliver la résine ou supprimer en partie la protection Pbf de l'arginine. La chaîne est alors allongée par couplage de la Boc-Lys(Fmoc)-OH. La fonction acide carboxylique permet de greffer 60 sur la résine conduisant au composé 63. La structure TriaS est ensuite constituée par couplage peptidique de l'acide mercaptoacétique tritylé 15. La réaction de Huisgen avec le PEG-N3 permet de conduire au composé 65. Après déprotection et clivage par acidolyse, le ligand 66 devait ainsi être engagé dans la complexation du cœur oxotechnétium pour conduire à c(RGDfK)-Lys-99mTc-TriaS-PEG (99mTc-66). La résine 58 (0.25 mmol) est conditionnée dans le DC (1 x 30 min, 2 x 1 min), puis un mélange TFE/DCM 1/1 (3 x 1 min). 25 mL de solution de HOBt à 0.6M dans le TFE/DCM (1/1) sont ajoutés et la résine est agitée durant 30 minutes à température ambiante. Cette étape est répétée à deux reprises. La résine est rincée par un mélange DCM/TFE 1/1 (3 x 1 min), le DCM (3 x 1 min), et la NMP (3 x 1 min). La Boc-Lys(Fmoc)OH (1.17 g, 2.5 mmol, 10 équiv.) est dissoute dans 20 mL de NMP, puis Cl-HOBt (0.43 g, 2.5 mmol , 10 équiv.), la DIPEA (435 μΙ_, 2.5 mmol, 10 équiv.) et le DIC (390 μΐ,, 2.5 mmol, 10 équiv.) et ce mélange est ajouté à la résine. Après agitation à température ambiante durant 24h, la résine est lavée par la NMP (3 1 min), le DCM (3 1 min), et le DMF (3 x 1 min), puis déprotégée par un mélange DMF/Pipéridine 4/1 (5 5 min). Le composé 60 (1.20 g, 2.5 mmol, 10 équiv.) est mis en solution dans 20 mL de NMP avec le DIC (390 μί, 2.5 mmol, 10 équiv.) et la DIPEA (435 μί, 2.5 mmol, 10 équiv.) puis ajouté à la résine. Après 24h d'agitation à température ambiante, la résine est lavée par la NMP (3 1 min) puis DCM (3 x 1 min). Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant Ih à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse. MALDI/TOF : 1 120.5 [M+H+].
La résine 63 est (0.25 mmol) est conditionnée dans le DCM (1 x 30 min, 2 x 1 min), puis le DMF (3 x 1 min), puis déprotégée par un mélange DMF/Pipéridine 4/1 (5 x 5 min) et lavée par le DMF (3 1 min), le DCM (3 x 1 min) et la NMP (3 1 min). Le composé 15 (835 mg, 2.5 mmol, 10.0 équiv.) est mis en solution dans 10 mL de NMP, puis le HA TU (952 mg, 2.5 mmol, 10.0 équiv.), et la DIPEA (435 μί, 2.5 mmol, 30.0 équiv.) sont ajoutés. Le mélange est ajouté à la résine. Après 24h d'agitation à température ambiante, la résine est lavée par la NMP (3 1 min) puis DCM (3 x 1 min). Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant lh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse. MALDI/TOF : 972.0 [M+H+].
La résine 64 (0.125 mmol) est conditionnée dans le DCM (1 x 30 min, 2 x 1 min) puis la NMP (3 x 1 min). La résine est mise en solution dans 2.3 mL de NMP puis la L-proline (25 μί de solution 1M, 0.025 mmol, 0.2 équiv.), Na2C03 (25 μL· de solution 1M, 0.025 mmol, 0.2 équiv.), l'ascorbate de sodium (50 μΐ, de solution 1M, 0.05 mmol, 0.4 équiv.), CuS04.5¾0 (25 μΐ de solution 1M, 0.025 mmol, 0.2 équiv.), le 0-(2-aminoethyl)-0'-(2- azidoethyl) pentaet ylène glycol (45.8 mg, 0.125 mmol, 1.0 équiv.) et 130 μί, d'eau sont ajoutés. La résine est alors placée au micro-onde (80°C, 300W, 30 min) puis lavée par la NMP (3 x 1 min), et le DCM (3 x 1 min). Un aliquot de résine est clivé par un mélange TFA/TIPS/eau (95/2.5/2.5) durant îh à température ambiante. Après évaporation du solvant sous pression réduite, le composé est repris dans un mélange ACN/eau et analysé en masse. MALDI TOF : 1322.6 [M+H+]. D- Tests d'évaluation
V/D- 1. Test de liaison des intégrines
Les tests in vitro ont été réalisés selon un protocole adapté tel que décrit ci-après.
L'intégrine ανβ3 (Chemicon, Temecula, CA) est diluée à 1000 ng/mL dans du tampon 1 (20 mM Tris HC1 pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCÎ2, 1 mM MgCh, 1 mM MnCb). Un aliquot de 100 ί/ ηίίβ est ajouté sur une plaque à 96-puits (Millipore, Multiscreen-IP HTS) et l'ensemble est incubé une nuit à 4°C. La plaque est lavée avec un tampon 2 (50 mM Tris HC1 pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCh, 1 mM MgCh, 1 mM MnCb et 1 % d'albumine bovine sérique puis incubée pendant 2 h à température ambiante. La plaque est ensuite incubée pendant 3 h en présence de différentes quantités de ligands (de 0,1 nM à 10 μΜ) et avec 0,06 nM de [ I]-iodoéchistatine. Après incubation, les puits sont lavés deux fois avec du tampon 2 et comptés en présence de liquide à scintillation (appareil Top count XT, PerkinElmer).
V/ D- 1. Test in vivo sur soucis xénogreffées ayant développés une tumeur de type U87MG
Culture cellulaire :
La lignée cellulaire U87MG a été fournie par l'European Collection of Cell Culture (SIGMA) et a été conservée dans de l'azote liquide avant d'être mise en culture. Le milieu de culture contient les éléments suivants (pour 500 mL) :
- EMEM (Eagle's minimum essential médium) : 500 mL;
- 2 mM de L-glutamine : 5 mL d'une solution 200 mM; - 1% d'acides aminés non-essentiels : 5 ml de solution commerciale ;
- 1 mM de pyruvate de sodium : 5 mL d'une solution 100 mM;
- 10% de SVF (Sérum de Veau Foetal) : 50 mL ;
- pénicilline (100 U/mL) et streptomycine (100 μ mL) : 5 mL d'une solution à 10 000 U/mL de pénicilline et à 10 mg/mL de streptomycine dans NaCl 0,9%.
Le milieu est filtré et peut se conserver 15 jours à +4°C. Les cellules sont adhérentes, et sont donc cultivées dans des flacons. Elles sont maintenues à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de C02.
Mise en culture :
L'ampoule de cellules est sortie de l'azote liquide et placée immédiatement dans de la glace. Elle est décongelée sous l'eau, et son contenu est transvasé dans un flacon de 15 mL et l'ampoule est rincée avec un peu de milieu de culture. Le volume est complété à 10 mL avec du milieu de culture. Le mélange est centrifugé (5 min à 1500 tr/min) pour éliminer le DMSO qui était présent pour la congélation. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension. 5 mL de milieu de culture sont ajouté et l'ensemble est homogénéisé avant d'être transféré dans un flacon de 50 mL. Celui-ci est placé à l'étuve et son bouchon dévissé. Le premier passage doit être effectué après 24 h.
Passages : pour un flacon de 275 mL (75 cm3).
La trypsine, le milieu et la solution saline de Hank's doivent être utilisés à température ambiante.
(1) Le flacon est sorti de l'étuve en conditions stériles et les cellules sont observées au microscope pour vérifier qu'elles sont arrivées à confluence.
(2) Le flacon est vidé dans un bêcher d'eau de Javel et rincé précautionneusement avec 5 mL de solution saline de Hank's.
(3) 5 mL de trypsine sont ajoutés et le flacon est placé 5 min à l'étuve pour favoriser le décollement des cellules. Les cellules encore adhérentes sont ensuite décollées en tapotant la boîte sur la paillasse.
(4) 5 mL de milieu sont ajoutés et le mélange est homogénéisé en essayant de briser le maximum d'amas cellulaires (Vtot = 10 mL).
(5) Pour un passage au 1/10, 3 mL du mélange précédent est introduit dans un nouveau flacon de 275 mL contenant 19 mL de milieu. Après homogénisation, le flacon est placé à Pétuve.
Suivant les besoins, le passage peut être fait dans différentes proportions à partir de Vtot = 10 mL ;
passage 1/2 : 5 mL cellules + 15 mL de milieu
passage 1/3 : 3 mL cellules + 17 mL de milieu
passage 1/5 : 2 mL cellules + 18 mL de milieu
passage 1/10 : 1 mL cellules + 1 mL de milieu
Lors de la mise en culture, le premier passage se fait à partir d'un flacon de 50 mL. Le rinçage est alors réalisé avec 3 mL de solution saline de Hank's, les cellules sont décollées avec 2 mL de trypsine, puis 2 mL de milieu sont ajoutés (Vtot = 4 mL). Dans le nouveau flacon de 275 mL, les 4 mL précédents sont introduits dans 16 mL de milieu.
Différents comptages ont été réalisés pour des boîtes passées au 1/10 une fois par semaine. Il y a de l0.106 à l2.106 cellules par boîtes (cellule de comptage de Malassez).
Préparation des cellules pour les xénogreffes :
Les tumeurs sont obtenues par injection sous-cutanée d'environ 5.106 cellules U87MG suspendues dans 150 μL· d'EMEM. Le nombre de boîtes nécessaires est déterminé en fonction du nombre de tumeurs à former. En général, on prévoit deux tumeurs surnuméraires par sécurité.
Le nombre de boîtes approprié est traité comme décrit ci-dessus jusqu'à l'étape (4). Les suspensions de cellules sont alors rassemblées dans des falcons de 50 mL (à adapter selon le volume total). Après centrifugation (5 min à 1500 tr/min), le surnageant est éliminé et les culots sont rassemblés par mise en suspension dans du milieu de culture, avec un volume total de 50 mL. Le nombre de cellules est évalué par comptage sur une cellule de Malassez. Le volume correspondant au nombre de cellules nécessaire pour les injections est prélevé. La suspension est centrifugée et le surnageant éliminé. Les cellules sont remises en suspension dans un volume d'EMEM pour qu'il y ait 150 par injection.
Implantation des tumeurs et études in vivo :
Les études animales ont été réalisées conformément au Décret sur l'Expérimentation Animale (Décret 87-848, 19 octobre 1987). Les tumeurs ont été développées sur des souris femelles athymiques (BalbC nu/nu) obtenues auprès des Laboratoires Charles River. Les souris sont livrées âgées de 6 semaines (s 20 g). Elles sont utilisées 1 semaine après leur arrivée.
Pour les études in vivo, une injection sous-cutanée d'environ 5.106 cellules U87MG, suspendues dans 150 d'EMEM est réalisée sur l'épaule avant droite des souris. Lorsque des tumeurs doivent être prélevées pour des études in vitro, 2 à 3 tumeurs peuvent être implantées sur chaque animal : une sur chaque épaule et une au milieu du dos. Dans tous les cas, les animaux sont utilisés 15 jours après l'injection des cellules. Les tumeurs formées ont un diamètre allant de 2 à 4 mm, les plus grosses étant les plus vascularisées.
Etude de biodistribution :
Les ligands sont marqués au 99mTc selon le protocole décrit à la partie III/A-2 ci- dessus. Pour chaque traceur, une injection de 100 μΕ est réalisée dans la veine de la queue d'une souris vigile ayant développé une tumeur U87MG. Après 1,5 h, les 4 souris ont été anesthésiées à risoflurane (2%). Les urines puis le sang (400 à 800 μί) sont tout d'abord prélevés, suivis du pancréas, de la rate, des reins, du cœur, des poumons, de la bile et du foie. Les organes sont comptés puis congelés et conservés à -20°C. Ils ont été pesés après décroissance radioactive. La tumeur est également prélevée et comptée. Elle est ensuite introduite dans un porter contenant 150 x de tampon PBS et 1,5 Ε d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Elle est broyée, puis 600 \L de MeOH sont ajoutés (MeOH/PBS 8/2). Après un nouveau broyage, l'homogénat de tumeur est transvasé dans un tube ependorf, compté puis centrifugé. Le surnageant est prélevé, compté, de même que le culot. Le surnageant est ensuite analysé par radio-HPLC (HPLC Varian) avec un gradient 0-100% B en 30 min. Les traceurs sont analysés dans les mêmes conditions.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé répondant à la formule (I) suivante :
Figure imgf000086_0001
(I)
dans laquelle :
- l'unité A est choisie parmi le de formule
Figure imgf000086_0002
ou
Figure imgf000086_0003
l'unité B est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000086_0004
ou
Figure imgf000086_0005
n est égal à 0 ou 1 ,
Ri, R2, R3, R4, R5, R6 et R7, identiques ou différents, sont choisis parmi H, un radical alkyle, alcoxy, aryle, aralkyle, hétéroalkyle, hétéroaryle, hétéroaralkyle, un groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé, un mono- ou un polysaccharide, ou un dérivé aminé de mono- ou de polysaccharides, un polyéther, un polyamide, lesdits radicaux et/ou groupes étant optionnellement substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyles, acides, aminés, aminoalkyles, aminoacides, thiols, thioalkyles, uréthanes, urées, halogènes, ou un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou Hnker) et V est un vecteur,
et à la condition que ;
soit l'unité A représente le groupement acétylénique suivant :
Figure imgf000087_0001
soit l'unité B représent 'un des groupements acétyléniques suivants :
Figure imgf000087_0002
2. Composé selon la revendication 1 répondant à la formule (IA) suivante :
Figure imgf000087_0003
(IA)
dans laquelle l'unité A est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000087_0004
3. Composé susceptible d'être obtenu à partir d'un composé de formule (I) selon la revendication 1 ou la revendication 2, répondant à la formule (II) suivante :
Figure imgf000087_0005
(II)
dans laquelle n, Ri, R2, R3, R4, R5, R$ et R7, sont tels que définis à la revendication 1, et
- l'unité A' est choisie parmi les groupements de formule :
Figure imgf000088_0001
ou
Figure imgf000088_0002
l'unité B' est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000088_0003
ou
Figure imgf000088_0004
- Y est choisi parmi un radical alkyle, alcoxy, aryle, aralkyîe, hétéroalkyle, hétéroaryle, hétéroaralkyle, un groupe hydrocarboné ou hétérocarboné mono- ou polycyclique saturé ou insaturé, un mono- ou un polysacchande, ou un dérivé aminé de mono- ou de polysaccharides, un polyéther, une polyamine, un polythioéther, un polyester, lesdits radicaux et/ou groupes étant optionnelîement substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyîes, acides, aminés, aminoalkyles, aminoacides, thiols, thioalkyles, uréthanes, urées, halogènes, ou un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur (ou linker) et V est un vecteur,
et à la condition que :
V soit l'unité A' représente le groupem t triazole suivant :
Figure imgf000089_0001
soit l'unité B' représente 'un des groupements triazoles suivants ;
Figure imgf000089_0002
4. Composé selon la revendication 3, répondant à la formule (IIA) suivante :
Figure imgf000089_0003
(ΠΑ)
dans laquelle l'unité A' est choisie parmi les groupements de formule
Figure imgf000089_0004
5. Composé selon la revendication 3 ou la revendication 4, répondant à la fonnule (I½) suivante :
Figure imgf000090_0001
6. Procédé de préparation d'un composé de formule (II) selon l'une des revendications 3 à 5 par réaction d'un composé de formule (I) selon la revendication 1 ou la revendication 2 avec un azoture organique de type Y-N3 dans lequel Y est tel que défini à la revendication 3, ladite réaction étant réalisée en présence de cuivre.
7. Composé susceptible d'être obtenu à partir d'un composé de formule (II) selon l'une des revendications 3 à 5, répondant à la formule (III) suivante :
Figure imgf000090_0002
(III)
dans laquelle n, Ri, R2, R3) R*, R5, RÔ et Y sont tels que définis aux revendications 1 et 3, et
- M est un radioélément métallique,
- n* et n" , identiques ou différents, sont égaux à 0 ou 1.
8. Composé selon la revendication 7 dans lequel Y est un groupement L-V dans le bras espaceur L est choisi parmi une chaîne polycarbonée aliphatique ou aromatique substituée ou non substituée, un polyéther, une poîyamine, une polyîysine, un dendrimère, un polypeptide, une plateforme peptidique linéaire ou cyclique de type RAFT, un polysaccharide, un phospholipide, un acide nucléique ou un acide nucléique peptidique, et
- le vecteur V est une molécule biologiquement active choisie parmi un peptide ou un dérivé peptidique, une protéine, un acide nucléique, un liposome, un oligonucléotide d'ADN ou d'ARN modifié ou non modifié, un nucléotide, un nucléoside, un aptamère, ou un acide nucléique peptidique modifié ou non modifié, une vitamine, un stéroïde, un phospholipide, un récepteur du système nerveux central, une polyamine, un polyester, un polyt ioéther, un polymère aliphatique, aromatique ou hétéro aromatique substitué ou non substitué.
9. Composé selon la revendication 8 dans lequel le bras espaceur L est choisi parmi un peptide ou un dérivé peptidique comprenant 1 à 12 résidus acides aminés, le polyoxyde d'éthylène glycol (PEG) ou le polypropylène glycol (PPG) comprenant 1 à 40 unités EG ou PG, une polyamine comprenant 1 à 20 unités monomériques, un mono- ou un polysaccharide comprenant 1 à 20 unités saccharidïques.
10. Composé selon l'une des revendications 7 à 9 dans lequel M est choisi parmi 94mTc, 99gTc, 99mTc; 185Re, ,86Re, 187Re et 188Re, et n et n' sont égaux à 1.
11. Composé selon l'une des revendications 7 à 10 dans lequel Y est un groupement L-V dans lequel L est un bras espaceur et V est un vecteur choisi parmi les molécules biologiquement actives,
12. Kit constitué de :
- un conteneur comprenant un composé de formule (II) tel que défini selon les revendications 3 à 5 et un agent réducteur, et
- un générateur portable comprenant une solution de radioélément métallique, de préférence choisi parmi 94mTc, 99 Tc, 99mTc, l 85Re, 186Re, 1 7Re, et i88Re, ledit radioélément métallique étant sous forme d'oxyde, et
- un conteneur comprenant une base dans un solvant ou un tampon.
13. Composé de formule (III) selon l'une des revendications 7 à 11 pour son utilisation in vivo comme radiotraceur diagnostique.
14. Composé de formule (III) pour son utilisation selon la revendication 13, comme agent de contraste pour le diagnostic, comme agent thérapeutique potentiel, ou comme agent radio-thérapeutique pour la radiothérapie ciblée de pathologies.
15. Composé de formule (III) pour son utilisation selon la revendication 14, comme agent de contraste pour le diagnostic par Tomographie d'Emission MonoPhotonique (TEMP) ou Tomographie d'Emission de Positrons (TEP), et de préférence comme radiotraceur de flux circulatoires et métaboliques, ou comme marqueur tissulaire.
16. Composé de formule (III) selon l'une des revendications 7 à 11 pour son utilisation comme médicament.
17. Composé de formule (III) pour son utilisation selon la revendication 16, comme agent radio-thérapeutique ciblant intégré pour le traitement de cancers, de maladies neurodégénératives, de pathologies du système nerveux central, d'athérosclérose et de thrombose, de maladies cardiovasculaires, de pathologies hépatiques, rénales ou cardiaques, d'hypoxie ou d'inflammation.
18. Composé de formule (III) pour son utilisation selon la revendication 16, comme agent radio-thérapeutique bifonctionnel pour des traitements radio-thérapeutiques ciblés choisis parmi la radiothérapie métabolique, la radiothérapie locale, la radiothérapie vectorisée, la radio-immunothérapie et la radio-immunologie.
19. Composé de formule (III) pour son utilisation selon la revendication 18, pour le traitement de cancers, de maladies neurodégénératives, de pathologies du système nerveux central, d'athérosclérose et de thrombose, d'hypoxie, d'inflammation, de maladies cardiovasculaires, de pathologies hépatiques, rénales ou cardiaques.
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