WO2013134839A1 - Método e kit para diagnóstico diferencial de doenças infecto-parasitárias utilizando citometria de fluxo - Google Patents
Método e kit para diagnóstico diferencial de doenças infecto-parasitárias utilizando citometria de fluxo Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method of diagnosing infectious parasitic diseases by flow cytometry for simultaneously diagnosing pathologies using differential fluorescent labeling of biological agents, such as cells and pathogens of interest, with fluorescent substances.
- the diagnostic method consists of fluorescently labeling biological agents with gradual concentrations of fluorescent substances, and analyzing the reactivity profile of IgG1 antibodies present in patient serum against said biological agents.
- the present invention further provides a diagnostic kit containing preparations of biological agents labeled with gradual fluorescent substance concentrations; preparation of biotinylated human anti-IgG1 antibody; fluorescent reagent for developing human anti-IgG1 antibody; serum samples from negative control subjects; serum samples from positive control subjects; a solution for . plate washing and sample dilution; a fixative solution for readability in the flow cytometer; 96-well plates and sealing adhesives.
- Luminex methodology no assays with the Luminex methodology are observed using fluorescent microspheres linked to pathogen-derived antigenic constituents, specifically secreted or secreted antigens (ES-Antigens) as well as pathogen plasma membrane selective antigens free from contamination with antigens derived from other pathogens. cellular compartments, which can be achieved with the Triplex methodology. Furthermore, in the invention described herein, labeling can be done directly using the complete parasite, so that the antigenic diversity available to contribute for detection is higher.
- ES-Antigens pathogen-derived antigenic constituents
- pathogen plasma membrane selective antigens free from contamination with antigens derived from other pathogens.
- cellular compartments which can be achieved with the Triplex methodology.
- labeling can be done directly using the complete parasite, so that the antigenic diversity available to contribute for detection is higher.
- the triplex methodology also has the potential to incorporate the "multiplex" modality with the insertion of new antigenic targets, thus allowing simultaneous detection of IgG1 antibody reactivity against other pathogens such as Toxoplasma gondii tachyzoites, Treponema pallidum spirochete and even cells. infected with HTLV virus. These represent a practical application of the triplex methodology in blood bank screening assays.
- the present invention relates to a flow cytometric diagnostic method for simultaneously diagnosing infectious parasitic diseases using differential fluorescent labeling of biological agents, such as cells and morphologically similar pathogens of interest, capable of being discriminated by differential labeling with fluorescent substances.
- the diagnostic method consists of fluorescently labeling agents with gradual concentrations of fluorescent substances, and analyzing the reactivity profile of IgG1 antibodies present in patient sera against said biological agents.
- the disclosure is performed by anti-IgG1 antibodies conjugated to a fluorochrome which is detected by a flow cytometer fluorescence channel distinct from that applied to discriminate the target biological agents from the antibodies.
- the samples are analyzed in a flow cytometer.
- Biological agents will be discriminated because they are labeled with gradual concentrations of fluorescent substance, thus being differentially identified even exhibiting similar morphometric patterns.
- Antibody reactivity analysis is initially made by selecting the population of interest through the size, granularity and fluorescence parameters. Subsequently, antibodies bound to each specific population of interest are detected by reading the fluorescence emitted by the IgG1 antibody development system on a distinct fluorescence channel, which reveals the percentage of positive fluorescent targets. The percentage of positive fluorescent targets should not exceed 2% in the negative control, so the percentage shift determines the positive sera for each pathology.
- the results are evaluated using a desynchronized algorithm that allows us to conclude about the serological reactivity of the samples.
- the concomitant search for specific IgGl antibodies for different biological agents in the same serum sample is performed.
- the method proposed by the present invention utilizes Biological agents that, once labeled with different fluorochrome concentrations, are combined in a single platform, allowing simultaneous analysis of different antibodies in patient sera in a single immunofluorescence test, employing flow cytometry as a method of sample segregation and amplification of the signals of fluorescence in the reading steps.
- Fluorescent substances according to the present invention include fluorescent dyes or fluorochromes selected from Alexa-fluor, Fluorescein Isothiocyanate, Chicago Sky Blue, Rhodamine, Phycoerythrin, Allophyllocyanine.
- the method of the present invention can be used for differentiating a variety of pathogens, including a Multiplex modality, incorporating the diagnosis of other infectious parasitic diseases such as toxoplasmosis, syphilis, HIV, HTLV-1 and HTLV-2 in the same kit. where the user can select which agents will be tested in a given reaction, according to the sample in question and the type of screening to be performed.
- a Multiplex modality incorporating the diagnosis of other infectious parasitic diseases such as toxoplasmosis, syphilis, HIV, HTLV-1 and HTLV-2 in the same kit.
- the present invention further provides a diagnostic kit containing the preparations of biological agents (in this case exemplified parasites labeled with gradual fluorescent substance concentrations), preparation of biotinylated human anti-IgG1 antibody, fluorescent reagent for development of human anti-IgG1 antibody, serum samples from negative control subjects, serum samples from positive pool control subjects, a solution for washing the plates and diluting the samples, a fixative solution for preparation for reading on the flow cytometer, 96-well plates and sealing adhesives.
- biological agents in this case exemplified parasites labeled with gradual fluorescent substance concentrations
- biotinylated human anti-IgG1 antibody preparation of biotinylated human anti-IgG1 antibody
- fluorescent reagent for development of human anti-IgG1 antibody serum samples from negative control subjects
- serum samples from positive pool control subjects serum samples from positive pool control subjects
- a solution for washing the plates and diluting the samples a fixative solution for preparation for reading on the flow cytometer
- the invention provides a method for diagnosing Chagas and Leishmaniasis Disease. More particularly, the present invention relates to a method for serological diagnosis of Chagas Disease, Cutaneous Leishmaniasis and Visceral Leishmaniasis employing flow cytometric immunofluorescence.
- the method of the present invention is the simultaneous screening of IgG1 anti-Leishmania chagasi, anti-Trypanosoma cruzi and anti-Leishmania amazonensis or Leishmania braziliensis antibodies.
- FC-Triplex-IgG1 The flow cytometric diagnostic method of the present invention is referred to herein as FC-Triplex-IgG1.
- the method of the present invention allows positioning of a marker over the region corresponding to the mixed trypanosomatid population and analysis of the IgG1 reactivity profile by determining PPFP (percentage of positive fluorescent parasites) relative to the fluorescence of the marker employed in the anti-antibody. -IgGl.
- PPFP percentage of positive fluorescent parasites
- One of the advantages of the present invention is that from From the method proposed here it is possible to exclude individuals with Visceral Leishmaniasis and Cutaneous Leishmaniasis in the serological screening for Chagas Disease in blood and tissue banks, given the high frequency of non-negative or undetermined reactions.
- Figure 1A is a schematic representation of the indirect flow cytometry immunofluorescence reaction in which parasites are labeled with Fluoroscein Isothiocyanate (FITC) and biotinylated anti-IgG antibodies are conjugated to Alexa Fl ⁇ or647.
- FITC Fluoroscein Isothiocyanate
- FIG. 1A is a schematic representation of the indirect flow cytometry immunofluorescence reaction in which parasites are labeled with Fluoroscein Isothiocyanate (FITC) and biotinylated anti-IgG antibodies are conjugated to Alexa Fl ⁇ or647.
- FITC Fluoroscein Isothiocyanate
- Figure 1B is a schematic representation of the analysis sequence of the data obtained by reaction flow cytometry shown in Figure IA.
- Figure 2A is a schematic representation of the indirect flow cytometry immunofluorescence reaction in which parasites are labeled with Fluoroscein Isothiocyanate (FITC) and biotinylated anti-IgG antibodies are conjugated to SAPE.
- FITC Fluoroscein Isothiocyanate
- SAPE Biotinylated anti-IgG antibodies
- Figure 2B is a schematic representation of the sequence analysis of data obtained by reaction flow cytometry shown in Figure 2A.
- Figure 3 shows the CF-Triplex-IgGl serological test algorithm for the detection of anti-Z IgG1 antibodies. chagasi, anti-T. cruzi and anti-L. amazonens ⁇ s or L. braziliensis, simultaneously.
- Figures 4A and 4B show the reactivity of FITC-labeled anti-trypanosomatid IgG1 and revealed with SAPE-conjugated anti-IgG antibodies in individual sera from patients with Visceral Leishmaniasis (VL), Chagas disease (CH), American Cutaneous Leishmaniasis ( LTA) and uninfected individuals.
- VL Visceral Leishmaniasis
- CH Chagas disease
- LTA American Cutaneous Leishmaniasis
- Figures 5A and 5B show the reactivity of Alexa Fl ⁇ or647-labeled anti-trypanosomatid IgG1 and revealed with SAPE-conjugated anti-IgG antibodies in individual sera from patients with Visceral Leishmaniasis (LV), Chagas disease (CH), American Cutaneous Leishmaniasis (LTA) and uninfected individuals.
- LV Visceral Leishmaniasis
- CH Chagas disease
- LTA American Cutaneous Leishmaniasis
- Figures 6A and 6B show the fluorimetric stability of FITC-labeled trypanosomatid preparations ((T. cruzi, L. chagasi, L. amazonensis (or L. brasiliensis)) and stored for 1 year at room temperature, 4 ° C and -20 ° C alone or as a mixture of parasites.
- Figures 7A and 7B show the fluorometric stability of trypanosomatid preparations ((T. cruzi, L. chagasi, L. amazonensis (or L. brasiliensis)) labeled with ALEXA FLUOR 647 and stored for 1 year at room temperature, 4 ° C. C and -20 ° C alone or as a mixture of parasites.
- the present invention relates to a diagnostic method for the simultaneous screening of IgG1 anti-Trypanosoma cruzi, anti-Leishmania chagasi and anti-Leishmania amazonensis (or Leishmania braziliensis) antibodies in single platform by flow cytometry, here called Triplex Methodology (FC-Triplex-IgGl).
- step (b) preparing a mixed suspension of the labeled biological agents in step (a)
- step (d) incubating the suspension obtained in step (c) with biotin-conjugated anti-human IgG1 antibody in the presence of fluorescent-conjugated streptoavidin;
- step (e) incubation of the biological agents obtained in step (d) with fixative solution for cytometry;
- the method of the invention consists of an indirect immunofluorescence reaction by flow cytometry performed in a liquid suspension employing single platform T. cruzi epimastigotes, L. chagasi promastigotes and L. promastigotes forms. amazonensis or L. braziliensis, previously fixed and labeled with gradual concentrations of the fluorescein fluorothrome isothiocyanate - FITC (FL-1) or Alexa fluorine 647 (FL-4), for simultaneous screening for IgG1 anti-T antibodies. cruzi, anti-L. chagasi and anti-L. amazonensis or L. braziliensis.
- Serum samples were inactivated at 56 ° C for 30 min and centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C for 5 min for particulate removal. After After centrifugation, the supernatant was aliquoted and stored at - 20 ° C until use in flow cytometry assays. At the time of use, samples were thawed, diluted in phosphate-buffered saline-PBS supplemented with 3% fetal bovine serum (SBF - Sigma Co. USA) centrifuged at 4 ° C, 14,000 rpm for 5 min and the supernatants used. flow cytometry (Cordeiro et al., 2001).
- the epimastigote forms of T. cruzi were obtained from culture in liquid liver infusion tryptose (LIT) complex and incubated in a BOD oven (model 347) at 28 ⁇ 1 ° C. Every seven days of cultivation a peak of 1.0 x 106 parasites / mL was performed and the culture maintained in successive passes in LIT medium.
- LIT liquid liver infusion tryptose
- the suspensions were then subjected to differential centrifugation (25 ° C, 200rpm for 10 minutes) to remove erythrocytes and parasites killed in the sediment. To recover the parasites in the supernatant, they were left to stand for 30 minutes at room temperature. The supernatants were transferred to another 50mL polypropylene tube and the pellet discarded. Then the parasites were washed in PBS twice, centrifugation at 4 ° C, 2500 rpm for 10 minutes. Supernatants were discarded and the pellets formed were carefully homogenized and resuspended in PBS. The suspensions of T. cruzi epimastigote forms and the promastigote forms of L. amazonensis (or L.
- brasiliensis promastigotes in PBS were incubated with different concentrations of fluorescein isothiocyanate. - FITC (100 ⁇ g / mL at 0.4 ⁇ g / mL) for 30 minutes at 37 ° C when shelter from the light. After incubation the parasites were washed PBS by centrifugation (4 ° C, 2,500rpm, 10min) and incubated with PBS 10% SFB for 30 minutes at room temperature to fix the fluorochrome to trypanosomatid proteins. After incubation the parasites were washed PBS by centrifugation (4 ° C, 2500rpm, 10min).
- a mixed suspension prepared according to Example 1 with 50 L trypanosomatids consisting of promastigote L. chagasi forms, T. cruzi epimastigote forms and L. amazonensis promastigote forms ( or L. braziliensis) are incubated with 50 L inactivated human serum at 1: 250 to 1: 32,000 dilutions in 3% SFB PBS for 30 minutes at 37 ° C, protected from light. Following incubation with the serum, the parasites were washed twice with 150 L of 3% SFB PBS by centrifugation at 18 ° C, 2,200rpm, 10min and the supernatant discarded.
- the maximum time for data acquisition is a maximum of 24 hours - Figures IA and 2A.
- the first challenge was the establishment of a system of selective analysis of the epimastigote forms of T. cruzi and the promastigote forms of Leishmania spp.
- the similarity of the morphometric aspects of trypanosomatids prevented their adequate selection, using flow cytometry only size and granularity parameters.
- the proposed solution consisted of the use of a gradual marking system of each fluorescent 1 (FL-1) parasite population using fluorescein isothiocyanate - FITC or fluorescence 4 (FL-4) employing Alexa Fl ⁇ or647, which allowed the discrimination of each trypanosomatid population, which was distinct from the fluorescence system used to reveal IgG1 serological reactivity after incubation of the parasites with human serum.
- FL-1 fluorescent 1
- FL-4 fluorescein isothiocyanate - FITC
- fluorescence 4 FL-4
- Alexa Fl ⁇ or647 As already described, for serological reactivity evaluation of anti-trypanosomatid IgG1, streptoavidin development systems conjugated with Alexa Fl ⁇ or647 (FL-4) or SAPE (FL-2), respectively - Figure 1 A and 2A, respectively.
- Trypanosomatids marked with gradual concentrations of fluorochromes when combined on a single platform, have a characteristic and homogeneous distribution in size versus granularity graphs, allowing the positioning of a marker over the region corresponding to the mixed population of trypanosomatids of interest (Rl). - Figures 1B and 2B.
- non-FL-1 emitting parasites correspond to the promastigote forms of L. chagasi, which allows the positioning of a marker over the region corresponding to this population (R2).
- Parasites with low fluorescence intensity correspond to the epimastigote forms of T. cruzi, which allows the positioning of a marker over the region corresponding to this population (R3).
- the parasites with high fluorescence intensity corresponded to the promastigote forms of L. amazonensis, allowing the positioning of a marker over the region corresponding to this population (R4) - Figure 1B.
- parasites that do not emit FL-4 correspond to the promastigote forms of L. chagasi, allowing the positioning of a marker over the region corresponding to this population (R2).
- Parasites with low fluorescence intensity 4 correspond to the epimastigote forms of T. cruzi, allowing the positioning of a marker over the corresponding region. population (R3).
- the parasites with high fluorescence intensity 4 correspond to the promastigote forms of L. amazonensis (or L. braziliensis), allowing the positioning of a marker over the region corresponding to this population (R4) - Figure 2B.
- results of FL-2 analyzes presented by trypanosomatids after incubation with sera were expressed as percent positive fluorescent parasites (PPFP) observed for each individual test with each trypanosomatid species - L. chagasi, T. cruzi and L amazonensis (or L. braziliensis) - in relation to conjugate control.
- PPFP was determined for each sample by establishing a negativity threshold as a function of the fluorescence curve obtained for the control of conjugate nonspecific binding (M1) for each selected parasite population.
- M1 conjugate nonspecific binding
- a maximum reactivity threshold of 2% PPFP was established for internal reaction control (conjugate control) - Figure 2B.
- FC-Triplex-IgGl proposes the use of a desynchronized algorithm for the serological reactivity analysis of the tested samples in order to eliminate cross reactivity in the differential diagnosis of Chagas disease, cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis.
- the concomitant search for anti-L IgG1 antibodies is performed. chagasi, anti-T.cruzi and anti-L. amazonensis or L. braziliensis in the same serum sample. The interpretation follows some criteria which are described below:
- the third evaluation is the analysis of anti-L IgG1 reactivity.
- amazonensis or L. braziliensis
- 1 1,000 serum dilution.
- PPFP 60%
- PPFP value> 60% the result is considered positive for cutaneous leishmaniasis.
- PPFP value ⁇ 60% the result is considered negative, the serum is classified as nonreactive for trypanosomatids and, therefore, the individual is not infected (Figure 3).
- Table 1 Possible results of anti-trypanosomatid IgG1 reactivity in sera from patients with VL (Visceral Leishmaniasis), DC (Chagas Disease), LTA (Leishmaniasis)
- (+) represents positive IgGl reactivity result
- (-) represents negative IgGl reactivity result
- (+/-) represents positive or negative IgG1 reactivity result
- Example 3 The purpose of Example 3 was to confirm the stability of the parasite labeling with AlexaFlour-647 and FITC over a period of 12 months and under three storage conditions (room temperature, 4 ° C, -20 ° C). To perform these tests, the parasites previously labeled with the fluorochromes AlexaFlour-647 and FITC were stored at the three temperatures described above for a period of 12 months. Each month after storage began, the parasites were taken to the flow cytometer for fluorescence verification. In addition, serology was performed every three months with the parasites stored at each temperature.
- the fluorimetric profile is not stable when the parasite preparations are stored in a pre-established mixture under any of the 3 storage conditions tested (RT, 4 ° C and -20 ° C) as shown in Figure 6B.
- Labeling with ALEXA FLUOR 647 was stable under the 3 storage conditions tested (RT, 4 ° C and -20 ° C, with the best profile obtained with parasites stored at -20 ° C as shown in Figure 7A.)
- the fluorometric profile has good stability. , when the parasite preparations are stored in a predetermined mixture only at -20 ° C storage, large overlap in the storage condition at RT as shown in Figure 7B.
- FC-Triplex-IgG1 is a new complementary tool applicable for differential serological diagnosis of Chagas disease, visceral leishmaniasis and cutaneous leishmaniasis.
- the inventors have observed improved stability of the parasite suspension stored alone under storage at -20 ° C.
- the present invention has achieved one of its main objectives which is the differential serological diagnosis of samples from patients with different infectious diseases.
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Abstract
A presente invenção se refere a um método para diagnóstico diferencial utilizando citometria de fluxo, dito método de diagnóstico realizado através de marcação fluorescente diferencial de agentes biológicos, tais como células e patógenos de interesse, com substâncias fluorescentes. De uma forma geral, o método de diagnóstico consiste em realizar a marcação fluorescente de agentes biológicos com concentrações gradativas de substâncias fluorescentes, e analisar o perfil de reatividade de IgGl com os agentes biológicos. A presente invenção contempla ainda um kit de diagnóstico.
Description
MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE DOENÇAS INFECTO-PARASITÁRIAS UTILIZANDO CITOMETRIA DE FLUXO
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um método de diagnóstico de doenças infecto-parasitárias por citometria de fluxo para diagnóstico simultâneo de patologias utilizando marcação fluorescente diferencial de agentes biológicos, tais como células e patógenos de interesse, com substâncias fluorescentes. De uma forma geral, o método de diagnóstico consiste em realizar a marcação fluorescente dos agentes biológicos com concentrações gradativas de substâncias fluorescentes, e analisar o perfil de reatividade de anticorpos IgGl presentes em soro de pacientes contra os referidos agentes biológicos.
A presente invenção proporciona ainda um kit de diagnóstico contendo as preparações dos agentes biológicos marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente; preparação de anticorpo anti-IgGl humano biotinilado; reagente fluorescente para revelação do anticorpo anti-IgGl humano; amostras de soro de indivíduos controle negativo; amostras de soro de indivíduos controle positivo; uma solução para. lavagem das placas e diluição das amostras; uma solução fixadora para preparação para leitura no citômetro de fluxo; placas de 96 poços e adesivos de vedação.
Fundamentos da Invenção
A reatividade laboratorial de amostras de soros de pacientes portadores de algumas doenças pode muitas vezes ser muito semelhante. Isto é devido, principalmente, ao
compartilhamento antigênico entre os agentes relacionados à etiologia dessas doenças. Nestes casos, métodos de diagnóstico sorológicos convencionais apresentam como principal desvantagem a baixa especificidade, contribuindo para resultados falso-positivos e dificuldades no diagnóstico sorológico diferencial e confirmatório da doença .
Por exemplo, o diagnóstico laboratorial da doença de Chagas, sobretudo na fase crónica da infecção, baseia-se na utilização de métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-T. cruzi. Segundo o Consenso Brasileiro em Doença de Chagas (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas - Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. VOL. 38: SUPLEMENTO III, 2005), os testes sorológicos de escolha para o diagnóstico da doença são: Hemaglutinação Indireta (HAI) , a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) . Estes testes, conhecidos como convencionais, são comumente utilizados no diagnóstico da doença de Chagas em laboratórios clínicos e na triagem sorológica em bancos de sangue. Quando aplicados em conjunto apresentam alta sensibilidade, entretanto, devido ao grande compartilhamento antigênico entre parasitos pertencentes à família Tripanosomatidae, como é o caso da Leishmania spp., os métodos sorológicos convencionais apresentam como principal desvantagem a baixa especificidade, contribuindo para resultados falso- positivos e dificuldades no diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas e das leishmanioses (Marchi
et al, 2007). Este problema assume proporções ainda maiores quando projetado na realidade de regiões co-endêmicas para doença de Chagas e leishmanioses, que vem alcançando dimensões globais em decorrência dos processos de migração populacional e mudanças ambientais.
A aplicação de dois testes de princípios distintos para diagnóstico da infecção pelo T. cruzi em Bancos de Sangue, conforme preconizado pelo Ministério da Saúde Brasileiro permitiu a almejada diminuição da transmissão da doença de Chagas por transfusão sanguínea, por outro lado surgiu um novo problema, relacionado com o aumento do número de pacientes com resultados sorológicos inconclusivos ou não-negativos . Sendo assim, um dos maiores problemas na triagem sorológica para doença de Chagas em doadores de sangue é a alta frequência de reações não- negativas ou indeterminadas, o que faz com que muitos indivíduos sadios sejam rotulados como portadores de uma doença grave, além de promover um significativo descarte desnecessário de unidades de sangue nos hemocentros e importantes perdas financeiras para o sistema de saúde.
Em busca na literatura científica, pode-se observar a dificuldade em se eliminar reações cruzadas em análises de imunofluorescência por citometria de fluxo entre tripanosomatídeos quando esta técnica é aplicada para o diagnóstico da infecção por T. cruzi ou para o diagnóstico de alguma espécie de Leishmania sp., não existindo qualquer descrição de diagnóstico das três patologias simultaneamente pela metodologia de imunofluorescência por citometria de fluxo.
Desta forma, fica clara a necessidade de uma solução técnica que possibilite a utilização da citometria de fluxo, técnica de alta sensibilidade e especificidade, para o diagnóstico simultâneo de patologias nas quais os anticorpos específicos que devem ser detectados são direcionados a alvos, ou agentes biológicos, morfologicamente semelhantes.
A literatura aponta a tecnologia "Luminex" (Bonetta, L., Flow Cytometry smaller and better. Nature Methods 2(10): 785-795, 2005) que também utiliza um sistema de marcação gradativa com fluorocromos como facilitador para realização de análises múltiplas em uma plataforma única de reação de imunofluorescência por citometria de fluxo. Entretanto, o sistema LUMINEX se diferencia da metodologia triplex por utilizar microesferas marcadas gradativamente com fluorocromos ligadas a anticorpos ou antígenos, não preconizando a marcação gradativa diretamente no agente biológico alvo da reatividade dos anticorpos, como é o caso da metodologia Triplex. Além disso, não se observa ensaios com a metodologia Luminex, utilizando microesferas fluorescentes ligadas a constituintes antigênicos derivados de patógenos, especificamente antígenos excretados ou secretados (ES-Antígenos ) bem como antígenos seletivos da membrana plasmática de patógenos livre de contaminação com antígenos derivados de outros compartimentos celulares, o que pode ser alcançado com a metodologia Triplex. Além disto, na invenção aqui descrita a marcação pode ser feita de forma direta utilizando o parasita completo, de forma que a diversidade antigênica disponível para contribuir
para a detecção é maior.
A metodologia triplex possui ainda o potencial de incorporar a modalidade "multiplex" com a inserção de novos alvos antigênicos, permitindo assim a detecção simultânea da reatividade de anticorpos IgGl contra outros patógenos como por exemplo Taquizoitos de Toxoplasma gondii, espiroqueta de Treponema pallidum e mesmo células alvo infectadas com vírus HTLV. Estas representam uma aplicação prática da metodologia triplex em ensaios de triagem em bancos de sangue.
O elevado número de reações não conclusivas reforça a necessidade real e urgente do desenvolvimento de testes sorológicos mais específicos ou de exames confirmatórios práticos e rápidos, passíveis de serem introduzidos nas rotinas dos laboratórios clínicos e nos serviços de hemoterapia, reduzindo o descarte desnecessário de bolsas de sangue e a dificuldade na condução de doadores com reações indeterminadas.
Sumário da Invenção
A presente invenção se refere a um método de diagnóstico por citometria de fluxo para diagnóstico simultâneo de doenças infecto-parasitáriasutilizando marcação fluorescente diferencial de agentes biológicos, tais como células e patógenos de interesse morfologicamente semelhantes, capazes de serem discriminados por marcação diferencial com substâncias fluorescentes. De uma forma geral, o método de diagnóstico consiste em realizar a marcação fluorescente dos agentes com concentrações gradativas de substâncias fluorescentes, e analisar o
perfil de reatividade de anticorpos IgGl presentes em soros de pacientes contra os referidos agentes biológicos. A revelação é realizada por anticorpos anti-IgGl conjugados a um fluorocromo que é detectado por canal de fluorescência do citômetro de fluxo distinto daquele aplicado para discriminação dos agentes biológicos alvo dos anticorpos.
Após a marcação dos agentes biológicos, as amostras são analisadas em um citômetro de fluxo. Os agentes biológicos serão discriminados por serem marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente, pois assim são identificados diferencialmente mesmo exibindo padrões morfométricos semelhantes. A análise da reatividade de anticorpos é feita inicialmente pela seleção da população de interesse através dos parâmetros tamanho, granulosidade e fluorescência. Posteriormente, é feita a detecção dos anticorpos ligados a cada população de interesse especifica pela leitura da fluorescência emitida pelo sistema de revelação de anticorpos IgGl em canal de fluorescência distinto, o que revela o percentual de alvos fluorescentes positivos. 0 percentual de alvos fluorescentes positivos não deve ultrapassar 2% no controle negativo, de forma que o deslocamento do percentual determina os soros positivos para cada patologia.
Os resultados são avaliados a partir de um algoritmo dessincronizado que permite concluir sobre a reatividade sorológica das amostras. No algoritmo adotado é realizada a pesquisa concomitante de anticorpos IgGl específicos para diferentes agentes biológicos em uma mesma amostra de soro.
0 método proposto pela presente invenção utiliza
agentes biológicos que uma vez marcados com diferentes concentrações de fluorocromo, são combinados em plataforma única, possibilitando análise simultânea de diferentes anticorpos em soros de pacientes em um único teste de imunofluorescência, empregando citometria de fluxo como método de segregação da amostra e amplificação dos sinais de fluorescência nas etapas de leitura.
Substâncias fluorescentes de acordo com a presente invenção incluem corantes fluorescentes ou fluorocromos selecionados dentre Alexa-fluor, Isotiocianato de Fluoresceina, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina .
O método da presente invenção pode ser usado para a diferenciação de uma série de patógenos, assumindo, inclusive uma modalidade Multiplex, incorporando o diagnóstico de outras doenças infecto-parasitárias como toxoplasmose, sífilis, HIV, HTLV-1 e HTLV-2 no mesmo kit onde o usuário poderá selecionar quais agentes serão testados em uma determinada reação, de acordo com a amostra em questão e o tipo de triagem a ser feita.
A presente invenção proporciona ainda um kit de diagnóstico contendo as preparações dos agentes biológicos (no caso exemplificado os parasitos marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente) , preparação de anticorpo anti-IgGl humano biotinilado, reagente fluorescente para revelação do anticorpo anti-IgGl humano, amostras de soro de indivíduos controle negativo, amostras de soro de indivíduos controle pool positivo, , uma solução para lavagem das placas e diluição das
amostras, uma solução fixadora para preparação para leitura no citômetro de fluxo, placas de 96 poços e adesivos de vedação. [
Em uma modalidade preferida, a invenção apresenta um método para diagnóstico da Doença de Chagas e Leishmanioses . Mais particularmente, a presente invenção se refere a um método para diagnóstico sorológico de Doença de Chagas, Leishmaniose Tegumentar e Leishmaniose Visceral empregando a imunofluorescência por citometria de fluxo. O método da presente invenção consiste na pesquisa simultânea de anticorpos IgGl anti-Leishmania chagasi, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Leishmania amazonensis ou Leishmania braziliensis.
O método de diagnóstico por citometria de fluxo da presente invenção é aqui denominado de FC-Triplex-IgGl .
Com o método da presente invenção é possível diagnosticar simultaneamente três patologias através da marcação gradativa dos alvos (patógenos) com corantes fluorescentes. O método da invenção permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente à população mista de tripanosomatídeos e análise do perfil de reatividade de IgGl, através da determinação do PPFP (percentual de parasitas fluorescentes positivos) em relação à fluorescência do marcador empregado no anticorpo anti-IgGl. Para a interpretação dos resultados o método FC- Triplex-IgGl propõe a utilização de um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica das amostras .
Uma das vantagens da presente invenção é que a partir
do método aqui proposto é possível excluir indivíduos portadores de Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar na triagem sorológica para Doença de Chagas em bancos de sangue e tecidos, em vista da alta frequência de reações não-negativas ou indeterminadas.
Breve Descrição das Figuras
Os aspectos da presente invenção serão agora descritos a título de exemplo com referência aos desenhos que a acompanham, nos quais:
A Figura IA é uma representação esquemática da reação de imunofluorescência indireta por citometria de fluxo, na qual os parasitos são marcados com Isotiocianato de Fluorosceína (FITC) e os anticorpos anti-IgG biotinilados são conjugados ao Alexa Flúor647.
A Figura 1B é uma representação esquemática da sequência de análises dos dados obtidos por citometria de fluxo da reação representada na Figura IA.
A Figura 2A é uma representação esquemática da reação de imunofluorescência indireta por citometria de fluxo, na qual os parasitos são marcados com Isotiocianato de Fluorosceína (FITC) e os anticorpos anti-IgG biotinilados são conjugados ao SAPE.
A Figura 2B é uma representação esquemática da sequência de análises dos dados obtidos por citometria de fluxo da reação representada na Figura 2A.
A Figura 3 mostra o algoritmo do teste sorológico CF- Triplex-IgGl para a detecção de anticorpos IgGl anti-Z. chagasi, anti-T. cruzi e anti-L. amazonensís ou L. braziliensis, simultaneamente.
As Figuras 4A e 4B mostram a reatividade de IgGl anti- tripanosomatideos marcados com FITC e revelados com anticorpos anti-IgG conjugados ao SAPE em soros individuais de pacientes portadores de Leishmaniose Visceral (LV) , doença de Chagas (CH) , Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e indivíduos não infectados.
As Figuras 5A e 5B mostram a reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos marcados com Alexa Flúor647 e revelados com anticorpos anti-IgG conjugados ao SAPE em soros individuais de pacientes portadores de Leishmaniose Visceral (LV) , doença de Chagas (CH) , Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e indivíduos não infectados.
As Figuras 6A e 6B mostram a estabilidade fluorimétrica das preparações de tripanosomatídeos ((T. cruzi, L. chagasi, L. amazonensis (ou L. brasiliensis ) ) marcados com sistema FITC e armazenados durante 1 ano em temperatura ambiente, 4°C e -20°C isoladamente ou em forma de mistura de parasitos.
As Figuras 7A e 7B mostram a estabilidade fluorimétrica das preparações de tripanosomatídeos ((T. cruzi, L. chagasi, L. amazonensis (ou L. brasiliensis) ) marcados com sistema ALEXA FLUOR 647 e armazenados durante 1 ano em temperatura ambiente, 4°C e -20°C isoladamente ou em forma de mistura de parasitos.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção se refere a um método de diagnóstico para a pesquisa simultânea de anticorpos IgGl anti-Trypanosoma cruzi, anti-Leishmania chagasi e anti- Leishmania amazonensis (ou Leishmania braziliensis) em
plataforma única, por citometria de fluxo, aqui denominado Metodologia Triplex (FC-Triplex-IgGl) .
O método para diagnóstico diferencial da presente invenção consiste em método de imunofluorescência por citometria de fluxo empregando marcação gradativa e diferencial de agentes biológicos com substâncias fluorescentes compreendendo as seguintes etapas:
(a) marcação diferencial dos agentes biológicos com concentrações gradativas de substância fluorescente;
(b) preparo de uma suspensão mista dos agentes biológicos marcados na etapa anterior (a)
(c) incubação da suspensão mista dos agentes biológicos com diluições seriadas de soro humano inativado;
(d) incubação da suspensão obtida na etapa (c) com anticorpo anti-IgGl humano conjugado com biotina, na presença de estreptoavidina conjugada com substância fluorescente;
(e) incubação dos agentes biológicos obtidos na etapa (d) com solução fixadora para citometria;
(f) obtenção dos parâmetros tamanho, granulosidade e fluorescências durante análise das amostras dos agentes biológicos em equipamento de citometria de fluxo;
(g) análise do perfil de reatividade de IgGl, pela determinação do percentual de agentes biológicos fluorescentes positivos (PPFP) em relação à fluorescência do marcador empregado no anticorpo anti-IgGl; e,
(h) análise dos resultados empregando um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica dos soros em relação aos agentes biológicos.
Em uma modalidade especifica, o método da invenção consiste numa reação de imunofluorescência indireta, por citometria de fluxo, realizada em uma suspensão líquida, que emprega em plataforma única formas epimastigotas do T. cruzi, formas promastigotas de L. chagasi e formas promastigotas L. amazonensis ou L. braziliensis, previamente fixadas e marcadas com concentrações gradativas do fluorocromo isotiocianato de fluoresceína - FITC (FL-1) ou do fluorocromo Alexa flúor647 (FL-4), para pesquisa simultânea de anticorpos IgGl anti-T. cruzi, anti- L. chagasi e anti- L. amazonensis ou L. braziliensis.
A invenção será agora descrita a partir de exemplos, os quais não devem ser considerados limitativos do seu escopo .
Exemplo 1 - Preparação das Amostras
População do estudo. Para o estabelecimento e padronização da metodologia CF-Triplex-IgGl foram utilizadas 80 amostras de soros pertencentes à soroteca do CPqRR/FIOCRUZ . As amostras de soros foram organizadas em quatro grupos: o grupo Pool NI foi constituído por uma mistura de 20 amostras de soros de indivíduos saudáveis, o grupo Pool CH por uma mistura de 20 soros de portadores de doença de Chagas, o grupo Pool LTA por uma mistura de 20 soros de portadores de Leishmaniose Tegumentar Americana e o grupo Pool LV constituído por uma mistura de 20 portadores de Leishmaniose Visceral.
Coleta e processamento das amostras. As amostras de soros foram inativadas a 56°C por 30 min e centrifugadas a 14.000 rpm, a 4°C durante 5 min para a remoção de partículas. Após
centrifugação, o sobrenadante foi aliquotado e estocado a - 20°C até sua utilização nos ensaios de citometria de fluxo. No momento do uso, as amostras foram descongeladas, diluídas em solução salina tamponada com fosfato-PBS suplementado com 3% de soro fetal bovino (SBF - Sigma Co. USA) centrifugadas a 4°C, 14.000 rpm por 5 min e os sobrenadantes utilizados na citometria de fluxo (Cordeiro et al. , 2001) .
Cultivo das formas epimastigo as de Trypanosoma cruzi. As formas epimastigotas do T. cruzi foram obtidas a partir de cultura em meio liquido complexo liver infusion tryptose (LIT) e incubadas em estufa BOD (modelo 347) a temperatura de 28° C ± 1°C. A cada sete dias de cultivo foi realizado um repique de 1,0 x 106 parasitos/mL, e a cultura mantida em sucessivas passagens em meio LIT.
Cultivo das formas promastigotas de Leishmanla. amazonensis (ou Leishmanla brasiliensis) e Leishmanla chagas! . As formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi foram obtidas a partir de cultura em meio ágar sangue, Novy-MacNeal-Nicolle associado ao meio LIT (NNN- LIT) e incubadas em estufa BOD (modelo 347) ± 1°C. A cada dois dias de cultivo foi realizado um repique de 5,0 x 106 parasitos/mL para o meio NNN-LIT ou para o meio NNN associado ao meio M199 (NNN- M199) . A cultura foi mantida em sucessivas passagens em meio NNN-LIT ou NNN-M199.
Preparo das formas epimastigotas de T. cruzi e das formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi para os ensaios de imunofluorescência por citometria de fluxo. As formas epimastigotas de T.cruzi com
sete dias de cultivo em meio LIT (Vitelli, 2007) e as formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi com dois dias de cultivo em meio NNN-M199 foram transferidas separadamente para três tubos de polipropileno de 50mL (Falcon®) e homogeneizados em vórtex a baixa rotação (rotação 3) para desfazer os grumos. Em seguida, as suspensões foram submetidas a uma centrifugação diferencial (25°C, 200rpm por 10 minutos) para remoção de eritrócitos e parasitos mortos no sedimento. Para recuperação dos parasitos no sobrenadante, estes foram deixados em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram transferidos para outros tubo de polipropileno de 50mL e o sedimento foi desprezado. Em seguida, os parasitos foram lavados em PBS, por duas vezes, centrifugação a 4°C, 2500 rpm por 10 minutos. Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos formados foram homogeneizados cuidadosamente e ressuspendidos em PBS. As suspensões de formas epimastigotas de T. cruzi e as formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi foram ajustadas para 1,0 x 107 parasitos/mL em PBS e fixados em uma solução fixadora Macs Facs Fix (MFF) . Marcação diferencial das formas epimastigotas de T. cruzi e das formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) com isotiocianato de fluoresceina (FITC) . As suspensões de 1,0 x 107 parasitos/mL de epimastigotas de T. cruzi e de 1,0 x 107 parasitos/mL de promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) em PBS foram incubadas com diferentes concentrações de isotiocianato de fluoresceina- FITC (100μg/mL a 0,^g/mL) por 30 minutos, a 37°C, ao
abrigo da luz. Após incubação os parasitos foram lavados PBS por centrifugação (4°C, 2.500rpm, lOmin) e incubados com PBS 10%SFB, por 30 minutos, a temperatura ambiente, para fixação do fluorocromo às proteínas dos tripanosomatídeos . Após incubação os parasitos foram lavados PBS por centrifugação (4°C, 2.500rpm, lOmin) . Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos formados foram homogeneizados cuidadosamente e ressuspendidos em PBS. Ao final das etapas de lavagem, as formas epimastigotas e as formas promastigotas foram ajustadas para uma suspensão 5,0 x 10b parasitos/mL em PBS 3% SFB para ensaios no citomêtro de fluxo.
Exemplo 2- Estudos de anticorpos IgGl anti-suspensão mista de tripanosomatídeos fluorescentes pela Citometria de Fluxo
Para realização da reação de imunofluorescência indireta, por citometria de fluxo, uma suspensão mista, preparada conforme o Exemplo 1, com 50 L tripanosomatídeos constituída por formas promastigotas de L. chagasi, formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. braziliensis ) são incubadas com 50 L soro humano inativado, nas diluições 1:250 a 1:32.000 em PBS 3%SFB, por 30 minutos, a 37°C, ao abrigo da luz. Após incubação com o soro, os parasitos foram lavados duas vezes com 150 L de PBS 3% de SFB por centrifugação a 18 °C, 2.200rpm, lOmin, e o sobrenadante desprezado. Para revelação da ligação de IgGl na superfície dos parasitos, procede-se a incubação, por 30 minutos, 37°C, ao abrigo da luz, na presença de 50\iL de anticorpo monoclonal anti-IgGl humano conjugado com biotina, na diluição 1:6.400 em PBS-3%
SFB na presença de 20 L de estreptoavidina conjugada ao Alexa flúor647, na diluição 1:1000 em PBS 3% SFB ou estreptoavidina conjugada a ficoeritrina (SAPE) , na diluição 1:400 em PBS 3% SFB - Figuras IA e 2A, respectivamente. Após a incubação os parasitos são novamente lavados duas vezes com 150μΙ de PBS-3% SBF por centrifugação a 18 °C, 2.200rpm, lOmin, e o sobrenadante desprezado. Os parasitos são então ressuspendidos com 200pL de solução fixadora para citometria - MFF e as amostras são mantidas a 4°C, ao abrigo da luz, até o momento da leitura no citômetro de fluxo (FACScalibur-Becton Dickinson) . O tempo máximo para a aquisição dos dados é de no máximo de 24 horas - Figura IA e 2A.
Para a análise dos dados, o primeiro desafio foi o estabelecimento de um sistema de análise seletiva das formas epimastigotas de T. cruzi e das formas promastigotas de Leishmania spp. A similaridade dos aspectos morfométricos dos tripanosomatideos, impediam sua seleção adequada, empregando por citometria de fluxo, apenas parâmetros de tamanho e granulosidade. Diante deste desafio, a solução proposta consistiu na utilização de um sistema de marcação gradativa de cada população de parasitos com fluorescência 1 (FL- 1) empregando isotiocianato de fluoresceina - FITC ou fluorescência 4 (FL- 4) empregando Alexa Flúor647, o que permitiu a discriminação de cada população de tripanosomatideos, que era distinta do sistema de fluorescência empregada para revelação da reatividade sorológica de IgGl após incubação dos parasitos com o soro humano. Conforme já descrito, para
a avaliação da reatividade sorológica de IgGl anti- tripanosomatídeos, foram empregados os sistemas de revelação com estreptoavidina conjugada com Alexa Flúor647 (FL-4) ou com SAPE (FL-2), respectivamente - Figura 1 A e 2A.
Os tripanosomatídeos marcados com concentrações gradativas de fluorocromos , quando combinados em plataforma única apresentam em gráficos de tamanho versus granulosidade, uma distribuição característica e homogénea, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente à população mista de tripanosomatídeos de interesse (Rl) - Figura 1B e 2B.
Para avaliação dos parasitos marcados com FITC (FL-1) , utilizando gráficos dot plot de FL1 versus FL-4, os parasitos que não emitem FL-1 correspondem às formas promastigotas de L. chagasi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R2). Os parasitos que apresentam baixa intensidade de fluorescência correspondem às formas epimastigotas de T. cruzi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R3) . Por fim, os parasitos que apresentam alta intensidade de fluorescência corresponderam às formas promastigotas de L. amazonensis, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R4) - Figura 1B.
Os resultados das análises de FL-4 apresentados pelos tripanosomatídeos após incubação com os soros foram expressos sob a forma de percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP) observados para cada teste individual com cada espécie de tripanosomatideos - L. chagasi, T. cruzi e L. amazonensis (ou L. brasiliensis) - em relação ao controle do conjugado. O PPFP foi determinado para cada amostra através do estabelecimento de um limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o controle da ligação inespecifica do conjugado (Ml) para cada população de parasito selecionado. Para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 2% de PPFP para o controle interno da reação (controle do conjugado) - Figura 1B.
Em seguida, empregando o mesmo marcador foram obtidos os valores de PPFP para amostra de soro avaliada. Para cada conjunto de ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando o controle do conjugado daquele experimento. Esse tipo de parâmetro oferece algumas vantagens, como facilidade e rapidez para obtenção dos resultados e sua reprodutibilidade no que se referem a dados obtidos em análises inter laboratoriais ou em análises realizadas repetidas vezes - Figura 1B.
Para avaliação dos parasitos marcados com Alexa Flúor647 (FL-4), utilizando gráficos dot plot de FL-4 versus FL-2, os parasitos que não emitem FL-4 correspondem às formas promastigotas de L. chagasi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R2). Os parasitos que apresentam baixa intensidade de fluorescência 4 correspondem às formas epimastigotas de T. cruzi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta
população (R3) . Por fim, os parasitos que apresentam alta intensidade de fluorescência 4 correspondem às formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. braziliensis ) , o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R4) - Figura 2B.
Os resultados das análises de FL-2 apresentados pelos tripanosomatideos após incubação com os soros foram expressos sob a forma de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) observados para cada teste individual com cada espécie de tripanosomatideos - L. chagasi, T. cruzi e L. amazonensis (ou L. braziliensis) - em relação ao controle do conjugado. O PPFP foi determinado para cada amostra através do estabelecimento de um limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o controle da ligação inespecifica do conjugado (Ml) para cada população de parasito selecionado. Para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 2% de PPFP para o controle interno da reação (controle do conjugado) - Figura 2B.
Em seguida, empregando o mesmo marcador foram obtidos os valores de PPFP para amostra de soro avaliada. Para cada conjunto de ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando o controle do conjugado daquele experimento. Esse tipo de parâmetro oferece algumas vantagens, como facilidade e rapidez para obtenção dos resultados e sua reprodutibilidade no que se referem a dados obtidos em análises inter laboratoriais ou em análises realizadas repetidas vezes - Figura 2B.
Para a interpretação dos resultados a FC-Triplex-IgGl
propõe a utilização de um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica das amostras testadas com o objetivo de eliminar a reatividade cruzada no diagnóstico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral. No algoritmo adotado é realizada a pesquisa concomitante de anticorpos IgGl anti-L. chagasi, anti-T.cruzi e anti- L. amazonensis ou L. braziliensis em uma mesma amostra de soro. A interpretação segue alguns critérios que são descritos a seguir:
A primeira avaliação consiste na análise da reatividade de IgGl anti-L. chagasi na diluição do soro 1:32.000. Considerando o ponto de corte de PPFP=60%, dado um valor de PPFP≥60%, o resultado é considerado positivo para leishmaniose visceral. Dado um valor de PPFP<60%, o resultado é considerado negativo e segue-se para o próximo passo .
A segunda avaliação consiste na análise da reatividade de IgGl anti-T. cruzi na diluição do soro 1:2.000. Considerando o ponto de corte de PPFP=50%, dado um valor de PPFP≥50%, o resultado é considerado positivo para doença de chagas. Dado um valor de PPFP<50%, o resultado é considerado negativo e segue-se para o próximo passo.
A terceira avaliação consiste na análise da reatividade de IgGl anti-L. amazonensis (ou L. braziliensis) na diluição do soro 1:1.000. Considerando o ponto de corte de PPFP=60%, dado um valor de PPFP>60%, o resultado é considerado positivo para leishmaniose tegumentar. Dado um valor de PPFP<60%, o resultado é considerado negativo, o soro é classificado como não reativo para os tripanosomatideos e,
portanto, o indivíduo não está infectado (Figura 3) .
A Tabela 1 apresenta os possíveis resultados das análises de fluorescência, expressos em PPFP, apresentados pelos tripanosomatídeos ( (L. chagasi, T. cruzi e L. amazonensis (ou L. braziliensis) ) considerando os pontos de corte de PPFP=60%, PPFP=50% e PPFP=60%, respectivamente, após incubação com o soro de paciente portador de LV, de paciente portador de DC, portador de LTA e indivíduo NI.
Tabela 1: Resultados possíveis da reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos em soros de pacientes LV (Leishmaniose Visceral), DC (Doença de Chagas), LTA (Leishmaniose
Tegumentar Americana) e NI (Não-Infectado) .
onde :
(+) representa resultado positivo da reatividade de IgGl (-) representa resultado negativo da reatividade de IgGl
(+/-) representa resultado positivo ou negativo da reatividade de IgGl
Os resultados, repetidos e confirmados, aplicando-se um sistema Triplex realizado com tripanossomatídeos marcados com concentrações gradativas de FITC (FL-1) e um sistema de revelação da reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos com Alexa Fúor647 (FL-4), mostraram um excelente desempenho para o diagnóstico sorológico
diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar. Utilizando-se 77 amostras de soros incluídas amostras de indivíduos controles negativo e de pacientes portadores de doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar, foi possível identificar o alto desempenho da metodologia, com 96,1% (74/77) e 94,7% (73/76) resultados corretos . No primeiro lote de parasitos de um total de 77 amostras testadas foram observados três resultados falso-negativos para leishmaniose tegumentar - Figura 4A. No segundo lote de parasitos de um total de 76 amostras testadas foram observados três resultados falso-negativos para leishmaniose tegumentar e um resultado falso-negativo de um indivíduo não infectado- Figura 4B.
Os resultados, repetidos e confirmados, aplicando-se um sistema Triplex realizado com tripanossomatídeos marcados com concentrações gradativas de Alexa Fúor647 (FL- 4) e um sistema de revelação da reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos com SAPE (FL-2), também mostraram um excelente desempenho para o diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar. Utilizando-se 77 amostras de soros incluídas amostras de indivíduos controles negativo e de pacientes portadores de doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar, foi possível identificar o alto desempenho da metodologia, com 98,7% (75/76) de resultados corretos, no primeiro e no segundo lote de parasitos -Figuras 5A e BDe um total de 77 amostras testadas foi observado um resultado falso-negativo para
doença de Chagas- Figuras 5A e B.
Exemplo 3- Estabilidade dos reagentes
A finalidade do Exemplo 3 foi confirmar a estabilidade da marcação dos parasitos com AlexaFlour-647 e com FITC durante um período de 12 meses e em três condições de armazenamento (temperatura ambiente, 4°C, -20°C) . Para a realização desses testes, os parasitos previamente marcados com os fluorocromos AlexaFlour-647 e FITC foram armazenados nas três temperaturas acima descritas por um período de 12 meses. A cada mês após o início do armazenamento, os parasitos foram levados ao citômetro de fluxo para a verificação da fluorescência. Além disso, a cada três meses foram realizadas sorologias com os parasitos armazenados em cada temperatura. Os resultados mostram que o perfil fluorimétrico de marcação com FITC foi estável nas 3 condições de armazenamento testadas (TA, 4°C e -20°C, sendo o melhor perfil obtido com parasitos armazenados a -20°C como mostrado na Figura 6A. O perfil fluorimétrico não possui estabilidade quando as preparações de parasitos são armazenadas em mistura preestabelecida em nenhuma das 3 condições de armazenamento testadas (TA, 4°C e -20°C) como mostrado na Figura 6B. Os resultados mostram que o perfil fluorimétrico de marcação com ALEXA FLUOR 647 foi estável nas 3 condições de armazenamento testadas (TA, 4°C e -20°C, sendo o melhor perfil obtido com parasitos armazenados a -20°C como mostrado na Figura 7A. O perfil fluorimétrico possui boa estabilidade, quando as preparações de parasitos são armazenadas em mistura pré- estabelecida apenas na condição de armazenamento a -20°C,
havendo grande sobreposição na condição de armazenamento a TA como mostrado na Figura 7B.
Desta forma, a análise dos resultados da presente invenção mostra que o método da presente invenção (FC- Triplex-IgGl é uma nova ferramenta complementar aplicável ao diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar.
Os inventores observaram uma melhor estabilidade da suspensão de parasitos armazenados isoladamente sob armazenamento a -20°C.
Desta forma, a presente invenção alcançou um de seus objetivos principais que é o diagnóstico sorológico diferencial de amostras de pacientes portadores de diferentes doenças infecciosas.
Claims
1. Método para diagnóstico diferencial de doenças infecto-parasitárias caracterizado por consistir em método de imunofluorescência por citometria de fluxo empregando marcação gradativa e diferencial de agentes biológicos com substâncias fluorescentes compreendendo as seguintes etapas :
(a) marcação diferencial dos agentes biológicos com concentrações gradativas de substância fluorescente;
(b) preparo de uma suspensão mista dos agentes biológicos marcados na etapa anterior (a)
(c) incubação da suspensão mista dos agentes biológicos com diluições seriadas de soro humano inativado;
(d) incubação da suspensão obtida na etapa (c) com anticorpo anti-IgGl humano conjugado com biotina, na presença de estreptoavidina conjugada com substância fluorescente;
(e) incubação dos agentes biológicos obtidos na etapa (d) com solução fixadora para citometria;
(f) obtenção dos parâmetros tamanho, granulosidade e fluorescências durante análise das amostras dos agentes biológicos em equipamento de citometria de fluxo;
(g) análise do perfil de reatividade de IgGl, pela determinação do percentual de agentes biológicos fluorescentes positivos (PPFP) em relação à fluorescência do marcador empregado no anticorpo anti-IgGl; e,
(h) análise dos resultados empregando um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica dos soros em relação aos agentes biológicos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as substâncias fluorescentes serem selecionadas dentre Alexa-fluor, Isotiocianato de Fluoresceína, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina .
3. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a marcação fluorescente conjugada ao anticorpo anti-IgGl ser detectada em canal de fluorescência do citômetro de fluxo diverso daquele sensível à fluorescência utilizada para a marcação dos agentes biológicos .
4. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o algoritmo da etapa (h) consistir de etapas para a pesquisa concomitante de anticorpos IgGl presentes em uma mesma amostra de soro contra os agentes biológicos .
5. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as etapas do algoritmo consistirem na detecção do percentual de agentes biológicos fluorescentes positivos em uma série de diluições pré-estabelecidas do soro.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser para diagnóstico diferencial de Doença de Chagas e Leishmanioses .
7. Método para diagnóstico diferencial de Doença de Chagas e Leishmaniose Tegumentar e Leishmaniose Visceral por meio de imunofluorescência por citometria de fluxo caracterizado por compreender as seguintes etapas:
(a) marcação diferencial dos tripanossomatídeos alvo com concentrações gradativas de substância fluorescente;
(b) preparo de uma suspensão mista dos tripanosomatideos marcados na etapa anterior (a)
(c) incubação da suspensão mista dos tripanosomatideos com diluições seriadas de soro humano inativado;
(d) incubação com anticorpo anti-IgGl humano conjugado com biotina, na presença de estreptoavidina conjugada com substância fluorescente;
(e) incubação das amostras com solução fixadora para citometria;
(f) obtenção dos parâmetros tamanho, granulosidade e fluorescências durante análise das amostras em equipamento de citometria de fluxo;
(g) análise do perfil de reatividade de IgGl, pela determinação do percentual de parasitas fluorescentes positivos (PPFP) em relação à fluorescência do marcador empregado no anticorpo anti-IgGl; e,
(h) análise dos resultados empregando um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica dos soros em relação aos agentes biológicos.
8. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por as substâncias fluorescentes serem selecionadas dentre Alexa-fluor, Isotiocianato de Fluoresceina, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoe.ritrina, Alloficocianina .
9. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por a marcação fluorescente conjugada ao anticorpo anti-IgGl ser detectada em canal de fluorescência do citômetro de fluxo diverso daquele sensível à fluorescência utilizada para a marcação dos agentes biológicos .
10. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o algoritmo da etapa (h) consistir de etapas para a pesquisa concomitante de anticorpos IgGl anti-L. chagasi, anti-T.cruzi e anti- L. amazonensis ou L. braziliensis em uma mesma amostra de soro.
11. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por as etapas do algoritmo consistirem na detecção do percentual de parasitas fluorescentes positivos em uma série de diluições pré-estabelecidas do soro.
12. Kit de diagnóstico caracterizado por conter as preparações de agentes biológicos marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente; uma preparação de anticorpo anti-IgGl humano biotinilado; reagente fluorescente para revelação do anticorpo anti-IgGl humano; amostras de soro de indivíduos controle negativo; amostras de soro de indivíduos controle positivo; uma solução para lavagem das placas e diluição das amostras; uma solução fixadora para preparação para leitura no citômetro de fluxo; placas de 96 poços e adesivos de vedação .
13. Kit de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por os agentes biológicos serem parasitos marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente.
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