WO2013133450A1 - Pharmaceutical composition for treating cancer - Google Patents

Pharmaceutical composition for treating cancer Download PDF

Info

Publication number
WO2013133450A1
WO2013133450A1 PCT/JP2013/056884 JP2013056884W WO2013133450A1 WO 2013133450 A1 WO2013133450 A1 WO 2013133450A1 JP 2013056884 W JP2013056884 W JP 2013056884W WO 2013133450 A1 WO2013133450 A1 WO 2013133450A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
slc6a6
antibody
cancer
cells
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/056884
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
里深博幸
大瀬賢介
向畑成紀
加藤由美子
岡部洋子
松村保広
安永正浩
Original Assignee
株式会社バイオマトリックス研究所
独立行政法人国立がん研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社バイオマトリックス研究所, 独立行政法人国立がん研究センター filed Critical 株式会社バイオマトリックス研究所
Priority to JP2014503575A priority Critical patent/JP5747283B2/en
Priority to US14/382,745 priority patent/US20160009799A1/en
Priority to AU2013228317A priority patent/AU2013228317A1/en
Priority to CA2866252A priority patent/CA2866252A1/en
Priority to EP13758041.1A priority patent/EP2823825A4/en
Publication of WO2013133450A1 publication Critical patent/WO2013133450A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Abstract

The purpose of the present invention is to produce a therapeutic agent for cancer and a substance capable of inhibiting the expression of SLC6A6 using a novel monoclonal antibody capable of binding to SLC6A6 or an extracellular domain thereof. The present invention provides a pharmaceutical composition containing a monoclonal antibody capable of recognizing native SLC6A6 or a polypeptide for an extracellular domain of SLC6A6.

Description

がん治療用医薬組成物Pharmaceutical composition for cancer treatment
　本発明は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞を処置するための組成物に関する。具体的には、本発明は、ＳＬＣ６Ａ６若しくはその細胞外領域に結合するモノクローナル抗体若しくは抗体断片、又はＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する物質を用いたがんを処置するための新規組成物に関する。 The present invention relates to a composition for treating cancer cells expressing SLC6A6. Specifically, the present invention relates to a novel composition for treating cancer using a monoclonal antibody or antibody fragment that binds to SLC6A6 or its extracellular region, or a substance that suppresses the expression of SLC6A6.
　がんは世界的にも死因の上位を占めており、中でも大腸がんは、がんの死亡率において上位に位置する疾患である。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加しており、年間約６万人が大腸がんに罹患し、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さとなっている。大腸がんは、大腸のみにとどまる場合には５年生存率は約９０％以上であり、早期発見が治癒率の高さに繋がるがんとして知られている。にもかかわらず死亡数の多いがんである理由は、高い罹患率に加え、リンパ節への転移が起きると５年生存率が７０％、肺や肝臓へ遠隔転移すると２５％以下と、がんの進行に伴って急激に死亡率が悪化する点が挙げられる。これら大腸がんに対しては、外科治療と化学療法が一般的であるが、近年の分子標的薬の出現によって、がん特異的な新たな治療法が模索されるようになった。がんに対する分子標的治療薬としては、乳がんに対するハーセプチン、非ホジキンリンパ腫に対するリツキサン等の抗体医薬品が優れた治療効果を示している。これら抗体医薬品は、細胞膜に存在するタンパク質（それぞれＨｅｒ２とＣＤ２０）と結合し、薬効を示すことが知られている。
　大腸がんに対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、ＶＥＧＦやＥＧＦという増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸がんでの使用が承認されており、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で働く。
　アービタックスは、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることでがん細胞の増殖を停止させるのが狙いである。また、抗体ががん細胞の表面に結合することで、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ—Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によりがん細胞を死滅させる作用機序も働いていると言われている。
　さらに、抗体医薬品が効果を発揮する機序としては、抗体分子が腫瘍に蓄積するというＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果が挙げられる。腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため、高分子や微粒子が血管より流出しやすく、また、リンパ系が発達していないため、腫瘍組織に到達した物質は蓄積する。腫瘍組織ではこのような特性を持つために、抗体を含めた４０ｋＤａ以上の分子は腫瘍に蓄積しやすく、効果を発揮しやすいことが知られており、ＥＰＲ効果と呼ばれている（非特許文献１）。この作用は、腫瘍に効果的に薬剤を運搬させるドラッグデリバリー開発の基本となっている。
　抗体医薬品に加え、近年では細胞に二本鎖ＲＮＡを導入し、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を破壊することで発現を抑制するというＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を用いた治療薬の開発も進められている。ＲＮＡ干渉は、がん細胞の増殖や転移に関与するターゲットの発現を抑制して、がんを治療する方法の一つであり、実用化を目指した開発が進められている。
　一方で、分子標的薬は、正常細胞にも影響を及ぼすため致命的な副作用を示す場合がある。例えば、乳がん治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている（非特許文献２）。さらに、ハーセプチンはＨｅｒ２を標的とした抗体医薬品であるため、Ｈｅｒ２を発現している患者にしか奏効性を示さない。
　大腸がん治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である（非特許文献３）。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する（非特許文献４）。また、ＥＧＦＲ下流のシグナル変化（例えばＫ−ｒａｓ変異）によるがん化には作用を示さないという問題も存在している。
　以上のようにがんに対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、副作用が少なく、がん特異的な分子標的及び医薬品の新たな開発が求められていた。
　そこで、本発明者らは、大腸がん細胞において特異的に発現が亢進している遺伝子を絞り込み、がん細胞に特異的に発現している膜タンパク質分子として、ＳＬＣ６Ａ６（Ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　６　（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ　６）に着目した。
　ＳＬＣ６Ａ６は、６２０アミノ酸からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）にＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　［ＲｅｆＳｅｑ］　ＩＤ：ＮＭ＿００３０４３、ＮＰ＿００３０３４．２として登録されている（配列番号１：塩基配列、配列番号２：アミノ酸配列）。ＳＬＣ６Ａ６はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。
　ＳＬＣ６Ａ６遺伝子は、正常組織に対し結腸がん組織において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている（特許文献１）。特許文献１では、１０種類の原発結腸腫瘍と、１０種類の正常結腸を用いて、ＤＮＡマイクロアレイにより、ｓｌｃ６ａ６を含む、結腸がん組織と正常組織との間で発現に差がある３０個以上の遺伝子が同定さており、開示された全ての遺伝子について、抗体、抗体によるポリペプチドの検出方法、がんの診断方法、抗体を含む医薬組成物への適用が示唆されている。しかしながら、ｓｌｃ６ａ６に対する抗体の作製例はなく、診断または治療目的における、タンパク質レベルでの適正、実用性又は実施可能性についても実証されていない。また、特許文献１では、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質のがん細胞における増殖や転移への関与について何も検証されていない。さらに、特許文献１には、定量ＰＣＲ法による詳細な発現パターンの解析結果が記載されているが、発現比にばらつきがあり、正常組織において結腸がん組織よりも高い発現を示す場合がある（表７）。また、定量ＰＣＲに使用されたプライマー（表６）はタンパク質のコード領域外である。治療薬として用いるには、タンパク質を検出する抗体が必要であり、かつ生きたがん細胞に抗体が結合するためには細胞膜領域に結合する抗体が必要である。抗体医薬品としての利用を行う場合には、特異的なアミノ酸配列と立体構造を認識するモノクローナル抗体が不可欠であり、治療薬への有用性を詳細に検討しなければならない。また、ＲＮＡ干渉による医薬品を開発する際には、ＳＬＣ６Ａ６発現を抑制しうる配列を明らかにし、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することにより、がん細胞の増殖や転移への影響について有用性を詳細に検討しなければならない。
　ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体として、ＨＰＡ０１５０２８（ＡＴＬＡＳ社）、ｓｃ−１６６６４０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）等複数の抗体が公知である。抗体医薬品として開発するためには、キメラ化やヒト化を行う必要があるため、モノクローナル抗体でなければならならない。ＨＰＡ０１５０２８はアミノ酸残基１４３~２１６（配列番号３（塩基配列）、配列番号４（アミノ酸配列））を含む細胞外領域を認識する抗体であるがポリクローナル抗体である。公知の抗体の中ではｓｃ−１６６６４０のみがモノクローナル抗体である。しかしこの抗体は、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基３９７~４２４の領域に結合する。この領域は膜貫通領域から細胞内にわたっているため、この抗体は生きたがん細胞と結合することが出来ず、治療薬として利用することができない。
　以上の理由から、これらの従来の抗体は、抗体医薬品として利用できる抗体として十分ではなかった。また、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することが、がん細胞にどのような影響を与えるか、解析されていなかった。
特表２００６−５１５３１８号公報 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２１１５−２１２１，１９８４ Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４５９３−４５９９，１９９７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４ Cancer is the leading cause of death worldwide, and colorectal cancer is a disease that ranks high in cancer mortality. In Japan, the number of patients with colorectal cancer has increased rapidly in recent years, and about 60,000 people suffer from colorectal cancer annually, and the number of deaths by organ is the third largest after gastric cancer and lung cancer. . Colorectal cancer has a 5-year survival rate of about 90% or more when it stays only in the large intestine, and is known as a cancer whose early detection leads to a high cure rate. Nevertheless, the reason for the high number of deaths is that in addition to the high morbidity, the 5-year survival rate is 70% when metastasis to lymph nodes occurs, and 25% or less when distant metastasis to the lung or liver. As mortality progresses, the mortality rate suddenly deteriorates. For these colorectal cancers, surgical treatment and chemotherapy are common, but with the advent of molecular targeting drugs in recent years, new cancer-specific treatment methods have been sought. As molecular target therapeutics for cancer, antibody drugs such as Herceptin for breast cancer and Rituxan for non-Hodgkin lymphoma have shown excellent therapeutic effects. These antibody pharmaceuticals are known to bind to proteins (Her2 and CD20, respectively) present in the cell membrane and exhibit drug efficacy.
Avastin and Erbitux are known as antibody drugs approved in Japan as molecular target drugs for colorectal cancer. These are antibody drugs targeting growth factors such as VEGF and EGF. Avastin has been approved for use in advanced and recurrent colorectal cancer that cannot be curatively excised. It binds to VEGF, suppresses angiogenesis by inhibiting binding to VEGF receptors, It works by the action mechanism of eliminating nutrition.
Erbitux aims to stop the growth of cancer cells by binding to the EGF receptor and preventing the cell growth signal from being activated by EGF. In addition, by binding an antibody to the surface of a cancer cell, an action mechanism of killing the cancer cell by an antibody-dependent cytotoxicity (ADCC, Anti-Dependent Cellular Cytotoxicity) caused by natural killer cells (NK cells) or macrophages. Is also said to be working.
Furthermore, as a mechanism by which an antibody drug exerts its effect, there is an EPR (Enhanced Permeability and Retention) effect in which antibody molecules accumulate in a tumor. In tumor tissue, vascular permeability is remarkably enhanced compared to normal tissue, so macromolecules and microparticles are more likely to flow out of blood vessels, and because the lymphatic system is not developed, substances that have reached tumor tissue accumulate. . Since it has such characteristics in tumor tissue, it is known that molecules of 40 kDa or more including antibodies are likely to accumulate in the tumor and easily exert an effect, which is called the EPR effect (non-patent document) 1). This action is the basis of drug delivery development that effectively transports drugs to tumors.
In addition to antibody drugs, in recent years, the development of therapeutic drugs using RNA interference (RNA interference) that suppresses expression by introducing double-stranded RNA into cells and destroying the target gene (mRNA) is also underway. . RNA interference is one of the methods for treating cancer by suppressing the expression of targets involved in the growth and metastasis of cancer cells, and development aimed at practical use is being promoted.
On the other hand, molecular target drugs may have fatal side effects because they affect normal cells. For example, Herceptin, a breast cancer drug, may cause not only headache, asthenia, nausea / vomiting, but also interstitial pneumonia, bone marrow suppression, liver disorder, kidney disorder, and cerebrovascular disorder. Further, it is known that tissue staining strongly reacts with normal cardiomyocytes and causes severe heart damage (Non-patent Document 2). Furthermore, since Herceptin is an antibody drug targeting Her2, it has a response only to patients expressing Her2.
Avastin, a colorectal cancer drug, includes bleeding, thrombosis, gastrointestinal perforation, delayed wound treatment, increased blood pressure, etc. Among them, thrombosis and gastrointestinal perforation are life-threatening side effects (non- Patent Document 3). In Arbitux, skin disorders and the like are known as side effects, and although it does not threaten life, itching and white pustules occur, and there is a mental and physical burden on the patient (Non-patent Document 4). ). There is also a problem that it does not show an effect on canceration due to a signal change (for example, K-ras mutation) downstream of EGFR.
As described above, antibody drugs against cancer still have problems such as the occurrence of serious side effects and limited response to patients. In addition, new development of pharmaceuticals has been demanded.
Therefore, the present inventors narrowed down the genes whose expression is specifically enhanced in colorectal cancer cells, and as a membrane protein molecule specifically expressed in the cancer cells, SLC6A6 (Solution carrier family 6 (neurotransmitter) We paid attention to transporter, taurine), member 6).
SLC6A6 is a twelve-transmembrane membrane protein consisting of 620 amino acids, and is registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information) as Reference Sequences [RefSeq] ID: NM_003043, NP_003034.2 (SEQ ID NO: 1: Base) Sequence, SEQ ID NO: 2: amino acid sequence). SLC6A6 is involved in the uptake of taurine into cells and co-transports taurine together with sodium ion and chloride ion.
The SLC6A6 gene is disclosed as one of genes whose expression is increased in colon cancer tissues compared to normal tissues (Patent Document 1). In Patent Document 1, using 10 types of primary colon tumors and 10 types of normal colon, 30 or more different in expression between colon cancer tissue and normal tissue including slc6a6 by DNA microarray Genes have been identified, and all disclosed genes have been suggested to be applied to antibodies, methods for detecting polypeptides with antibodies, methods for diagnosing cancer, and pharmaceutical compositions containing antibodies. However, there is no production example of an antibody against slc6a6, and the appropriateness, practicality or feasibility at the protein level for diagnostic or therapeutic purposes has not been demonstrated. Patent Document 1 does not verify anything about the involvement of SLC6A6 protein in proliferation and metastasis in cancer cells. Furthermore, Patent Document 1 describes a detailed expression pattern analysis result by a quantitative PCR method, but there are variations in expression ratios, and there are cases in which normal tissues show higher expression than colon cancer tissues ( Table 7). In addition, the primers (Table 6) used for quantitative PCR are outside the coding region of the protein. In order to use as a therapeutic agent, an antibody that detects a protein is required, and in order for an antibody to bind to a living cancer cell, an antibody that binds to a cell membrane region is required. When used as an antibody drug, a monoclonal antibody that recognizes a specific amino acid sequence and a three-dimensional structure is indispensable, and its usefulness as a therapeutic drug must be examined in detail. Moreover, when developing pharmaceuticals by RNA interference, clarifying the sequences that can suppress SLC6A6 expression, and suppressing the expression of SLC6A6, the usefulness is detailed regarding the effects on cancer cell growth and metastasis. Must be considered.
As antibodies against SLC6A6, a plurality of antibodies such as HPA015028 (ATLAS), sc-166640 (SantaCruz) are known. In order to develop as an antibody drug, it is necessary to carry out chimerization or humanization, so it must be a monoclonal antibody. HPA015028 is an antibody that recognizes an extracellular region containing amino acid residues 143 to 216 (SEQ ID NO: 3 (base sequence), SEQ ID NO: 4 (amino acid sequence)), but is a polyclonal antibody. Of the known antibodies, only sc-166640 is a monoclonal antibody. However, this antibody binds to the region of amino acid residues 397 to 424 of SLC6A6. Since this region extends from the transmembrane region into the cell, this antibody cannot bind to live cancer cells and cannot be used as a therapeutic agent.
For these reasons, these conventional antibodies have not been sufficient as antibodies that can be used as antibody drugs. In addition, it has not been analyzed how the suppression of SLC6A6 expression affects cancer cells.
JP-T-2006-515318 Cancer Research, 44, 2115-2121, 1984 British Journal of Cancer, 94, 1016-1020, 2006 Cancer Research, 57, 4593-4599, 1997 Journal of Clinical Oncology, 22, 1201-1208, 2004
　一般的にがんの手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが問題である。また、化学療法や放射線治療は副作用が問題となっている。さらに、従来の抗体医薬品は副作用の発生に加えて、奏効性を全く示さないがんが存在する。そこで、がんに対する新たな医薬品の開発が求められていた。
　本発明は、膜タンパク質であるＳＬＣ６Ａ６が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、診断及び処置の対象として有用なマーカーであるという発見に基づいている。本発明は、大腸がん特異的に発現するＳＬＣ６Ａ６と結合し、がんの治療薬として安定して供給し得るモノクローナル抗体及びその断片を有効成分として含む抗がん剤を提供することが目的である。また、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制できる物質として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはこれらを発現出来る発現ベクターを有効成分として含む抗がん剤を提供することが目的である。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域であるアミノ酸残基１４３~２１６を認識するモノクローナル抗体を作製し、当該モノクローナル抗体を用いたがんの治療用抗体を開発することに成功し、本発明を完成させた。また、ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現する細胞を用い、発現を抑制できるＲＮＡｉ用の核酸配列を複数同定することで、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体若しくはその断片、又はＲＮＡ干渉によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質を含む医薬組成物。
（２）ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（３）細胞外領域のポリペプチドが、以下の（ａ）~（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるものである前記（２）に記載の医薬組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（４）受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（５）前記（４）に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合する、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（６）モノクローナル抗体がヒト型化又はヒト化されたものである、前記（１）~（５）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（７）モノクローナル抗体が融合されたものである、前記（１）~（５）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（８）大腸癌を治療するための、前記（１）~（７）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
　本発明により、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体並びにそのフラグメント、並びに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを含む医薬組成物、特に大腸癌治療用医薬組成物が提供される。本発明の抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントは、単独、あるいは少なくとも１種類の治療薬に結合させる、あるいは他の治療様式と組み合わせて用いることができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することが出来る物質は、既存のドラッグデリバリーシステムを用いて標的の臓器へ輸送し、がん細胞の増殖、浸潤、移動を抑制することで、治療薬として利用することが出来る。 In general, cancer surgery is not only difficult to treat metastases, but also involves a combination of invasion and complications. In addition, side effects are a problem in chemotherapy and radiotherapy. Furthermore, in addition to the occurrence of side effects, conventional antibody drugs have cancers that do not show any response. Therefore, the development of new drugs for cancer has been demanded.
The present invention is based on the discovery that SLC6A6, a membrane protein, is a protein that is overexpressed in cancer tissues and is a useful marker for diagnosis and treatment. An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that binds to SLC6A6 expressed specifically in colorectal cancer and can be stably supplied as a therapeutic agent for cancer, and an anticancer agent containing a fragment thereof as an active ingredient. is there. It is another object of the present invention to provide an anticancer agent containing, as an active ingredient, siRNA, shRNA or an expression vector capable of expressing these as a substance capable of suppressing the expression of SLC6A6.
As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have produced a monoclonal antibody that recognizes amino acid residues 143 to 216, which is the extracellular region of SLC6A6, and treated cancer using the monoclonal antibody. The present invention was completed by developing an antibody for use. In addition, the present invention was completed by identifying a plurality of RNAi nucleic acid sequences capable of suppressing expression using cells overexpressing SLC6A6. That is, the present invention is as follows.
(1) A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody that recognizes native SLC6A6 or a fragment thereof, or a substance that can suppress the expression of SLC6A6 by RNA interference.
(2) A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody that recognizes a polypeptide in the extracellular region of SLC6A6 or a fragment thereof.
(3) The pharmaceutical composition according to the above (2), wherein the polypeptide in the extracellular region is at least one selected from the following (a) to (c).
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, And a polypeptide functioning as an extracellular region of SLC6A6 (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and functioning as an extracellular region of SLC6A6 ( 4) A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody against SLC6A6 or a fragment thereof produced by a hybridoma whose accession number is FERM BP-11413 or FERM BP-11414.
(5) A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody against SLC6A6 or a fragment thereof which binds to an epitope recognized by the monoclonal antibody or fragment thereof according to (4).
(6) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (5) above, wherein the monoclonal antibody is humanized or humanized.
(7) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (5) above, wherein the monoclonal antibody is fused.
(8) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (7) for treating colorectal cancer.
The present invention provides humanized, chimeric and human anti-SLC6A6 monoclonal antibodies and fragments thereof, and pharmaceutical compositions comprising antibody fusion proteins and fragments thereof, particularly pharmaceutical compositions for the treatment of colorectal cancer. The antibodies, fusion proteins and fragments thereof of the present invention can be used alone, coupled to at least one therapeutic agent, or in combination with other therapeutic modalities. In addition, a substance capable of suppressing the expression of SLC6A6 is used as a therapeutic agent by transporting it to a target organ using an existing drug delivery system and suppressing the growth, invasion, and migration of cancer cells. I can do it.
ＳＬＣ６Ａ６タンパク質の細胞外領域に対応する塩基配列を有する核酸をプローブとし、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより組織を染色した写真である。It is the photograph which dye | stained the structure | tissue by in situ hybridization using the nucleic acid which has a base sequence corresponding to the extracellular region of SLC6A6 protein as a probe. ＳＬＣ６Ａ６発現細胞の解析結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result of a SLC6A6 expression cell. ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域であるアミノ酸残基１４５~２１３のペプチドに反応するモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡを用いて解析した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having analyzed the monoclonal antibody which reacts with the peptide of the amino acid residues 145-213 which is the extracellular region of SLC6A6 using ELISA. ＳＬＣ６Ａ６抗体である４Ｂ９ｂを用いて大腸がん組織を染色した結果を示す図である。がん部のみが特異的に染色された。It is a figure which shows the result of having dye | stained colon cancer tissue using 4B9b which is SLC6A6 antibody. Only the cancer area was stained specifically. ＳＬＣ６Ａ６抗体である４Ｂ９ｂを用いて正常組織を染色した結果を示す図である。大腸がんのみが特異的に染色された。It is a figure which shows the result of having dye | stained normal tissue using 4B9b which is SLC6A6 antibody. Only colorectal cancer was specifically stained. １０種類の大腸癌細胞に関して、ＳＬＣ６Ａ６の発現をリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。発現量に差はあるものの、全ての細胞で発現が検出された。It is a figure which shows the result of having analyzed the expression of SLC6A6 by real-time quantitative RT-PCR regarding 10 types of colon cancer cells. Although there was a difference in expression level, expression was detected in all cells. １０種類の大腸がん細胞を４Ｂ９ｂ抗体及び５Ｈ１２ｄ抗体を用いて解析した結果を示す図である。大腸がん細胞全てに関して、反応していることが示された。It is a figure which shows the result of having analyzed 10 types of colon cancer cells using 4B9b antibody and 5H12d antibody. All colorectal cancer cells were shown to react. マウスＩｇＧをキメラ化した抗体の活性をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having analyzed the activity of the antibody which chimerized mouse IgG by ELISA. マウスＩｇＧをキメラ化した４Ｂ９ｂ抗体でがん組織、正常組織を染色した結果を示す図である。がんが浸潤している先端部分（ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｆｒｏｎｔ）がより強く染色されることが示された。It is a figure which shows the result of having dye | stained a cancer tissue and a normal tissue with 4B9b antibody which chimerized mouse IgG. It was shown that the tip part (invasion front) infiltrated with cancer is more strongly stained. ヒトＩｇＧをキメラ化した抗体の活性をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having analyzed the activity of the antibody which chimerized human IgG by ELISA. サブクラスＩｇＧの抗体について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。１９Ｂ１０、７Ｃ１１及び１２Ｅ８が細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６を認識していることが示された。It is a figure which shows the result of having performed FACS analysis about the antibody of subclass IgG. 19B10, 7C11 and 12E8 were shown to recognize SLC6A6 on the cell membrane. ＳＬＣ６Ａ６をマウス乳癌細胞４Ｔ１で過剰発現させた細胞の形態を示す図である。It is a figure which shows the form of the cell which overexpressed SLC6A6 in the mouse | mouth breast cancer cell 4T1. ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株させた細胞のＥカドヘリン、Ｎカドヘリン、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの変化を観察した結果を示す図である。β−Ａｃｔｉｎは電気泳動に用いたタンパク質量の差を確認するために用いた。ＥＭＴで見られる表現型の変化が観察された。It is a figure which shows the result of having observed the change of E cadherin, N cadherin, and Vimentin of the cell made SLC6A6 overexpression strain. β-Actin was used to confirm the difference in the amount of protein used for electrophoresis. The phenotypic changes seen with EMT were observed. ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた株（Ｌ３１及びＬ３５）と発現させていない株（４Ｔ１）をＢａｌｂ／ｃマウスへ移植し、抗体添加による腫瘍サイズの増加を観察した結果を示す図である。発現させた株のみ抗体によって増殖が抑制されていることが示された。It is a figure which shows the result of having transplanted the strain | stump | stock (L31 and L35) which overexpressed SLC6A6, and the strain | stump | stock (4T1) which is not not expressed to the Balb / c mouse | mouth, and observed the increase in the tumor size by antibody addition. It was shown that the growth was suppressed by the antibody only in the expressed strain.
　以下、本発明を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１２年３月６日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１２−０４９１９２号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　本発明は、ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ　６）と呼ばれる分子またはその細胞外領域を認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物に関する。この抗体は、特に大腸がん細胞に特異的に結合する。また、本発明はＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むベクターを用いる。このｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは大腸がん細胞の増殖、転移を特異的に抑制する。従って、本発明の医薬組成物はがん、特に大腸癌の治療に有用である。
　本発明のモノクローナル抗体を取得するには、免疫原として、本来の立体構造を有する状態にある、ヒトＳＬＣ６Ａ６の全長タンパク質（配列番号１（塩基配列）、配列番号２（アミノ酸配列））、あるいは細胞外領域であるアミノ酸残基１４３~２１６（配列番号３（塩基配列）、配列番号４（アミノ酸配列））を含む部分タンパク質（以下、総称してタンパク質と表現する場合がある）を用いる。生きた細胞を認識するため、膜タンパク質本来の立体構造を認識できる抗体を取得する。
　本発明の医薬組成物に使用されるモノクローナル抗体（以下「本発明のモノクローナル抗体」ともいう）は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有する立体構造の状態にあることをいう。
　また、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識することができる。特に、細胞外領域として、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３~２１６の領域（配列番号４）を認識することができる。
　本発明のモノクローナル抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列の１個もしくは数個（例えば２~２０個、好ましくは２~１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号４に示すアミノ酸配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上の相同性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
　ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、タウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測される。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ（Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ，７６，１−１５，１９８３）で解析することにより確認することができると考えられる。
　あるいは、本発明のモノクローナル抗体はＳＬＣ６Ａ６に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明のモノクローナル抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
　変異型ポリペプチドと本発明のモノクローナル抗体との結合は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
　また、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳなどで比較することにより確認することができる。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６に対し、従来の抗体よりも高い親和性を有している。
　従来の抗体は、細胞外領域を認識しないために、生きた細胞に結合できず治療薬として用いることが出来ない点に問題があった。これに対し、本発明のモノクローナル抗体は、従来の抗体と異なり細胞外領域を認識するとともに、従来の抗体よりも高い親和性を有するため、がん細胞表面に存在するＳＬＣ６Ａ６と高い親和性で結合し、生体内でＳＣＬ６Ａ６の機能を直接的に抑制するほか、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性によりがん細胞を死滅に導くことが可能になる。
　本発明のモノクローナル抗体は、ｓｌｃ６ａ６のｍＲＮＡバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のＳＬＣ６Ａ６だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と広範に結合することが可能である。
　本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、あるいはモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、（ｓｃＦｖ）２、ＤｉＡｂｏｄｙ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、標識抗体などが挙げられる。いずれも、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。
　本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４Ｂ９ｂ」（以下「４Ｂ９ｂ」という）及び「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　５Ｈ１２ｄ」（以下「５Ｈ１２ｄ」という）と称し、どちらも、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１　千葉県流山市東深井１０５番地）が、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託した。その受託番号は、「４Ｂ９ｂ」については「ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１３」であり、５Ｈ１２ｄについては「ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１４」である。さらに細胞株として、「３Ａ３」、「１９Ｂ１０」、「２３Ｇ１２」、「７Ｃ１１」、「１２Ｅ８」、「６Ｇ３」、「１８Ａ１０」、「２２Ａ４」、「２３Ｈ６」。「２６Ｆ３」、「２Ｆ２」、「７Ｈ８」、及び「１９Ｃ２ｊ」を取得した。「３Ａ３」、「１９Ｂ１０」、「２３Ｇ１２」、「７Ｃ１１」、「１２Ｅ８」はサブクラスＩｇＧであり、残りの抗体はＩｇＭであった。本発明は、当該ハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
　これらの特徴を有する本発明のモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なり、ＷＯ／２０１０／０９８４７１に開示されるように、膜タンパク質を発現させた細胞を生着させる免疫法を用いて得られるものである。当業者において一般的に実施されている製法では作製が困難である。それは、
（１）抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する、
（２）細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない、
などの理由による。
　本発明のモノクローナル抗体は、本発明者らが抗体の製法（特に免疫方法）に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
　本発明のモノクローナル抗体は、以下の特徴を有する。
　本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６が本来有する立体構造をもとに作製された故に、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体（ＨＰＡ０１５０２８）と比較して結合力が非常に高く、従来の抗体では困難であった細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６と十分に結合することができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体（ｓｃ−１６６６４０）に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができ、治療薬として利用することが可能である。
　加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体はがんの治療に利用することにより、がんによる死亡率を減少させることが出来る。
　また、本発明は、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明のＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ（ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列のうち、第１４５番目から第２１３番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。）を指す。
　ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であってもよい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＧのＨ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳＬＣ６Ａ６タンパク質をＷＯ／２０１０／０９８４７１に開示される方法を用いて免疫することにより調製することが可能である。モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。
　本発明のがん治療剤には、ＳＬＣ６Ａ６抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される抗がん剤や担体を適宜結合させることができる。
　本発明においては、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することで、がん細胞の増殖や転移を抑えることによって、がんの進行や転移を抑制することが出来る。つまり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ））と呼ばれる方法によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する物質を提供することが出来る。これらはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）やｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）またはこれらを発現出来る発現ベクターを有効成分とし、既存のドラッグデリバリーシステムを用いてがんの治療薬（がんの進展または転移の抑制剤）として利用できる。
　ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質の具体例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はこれらを発現できる発現ベクターなどが挙げられる。これらが細胞に導入されると、ＲＮＡｉ現象が生じ、相同な配列を有するＲＮＡが分解される。このようなＲＮＡｉ現象は、線虫，昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
　本発明においてはｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基（例えば、約２１~２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においては、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の発現を抑制することができる。
　本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたもの、あるいは生物体内で合成されたものか、もしくは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡを言い、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
　ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＳＬＣ６Ａ６遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡが効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくはＳＬＣ６Ａ６遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の３’末端付近の配列でもよい。さらに、ｍＲＮＡとして転写される場合、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のタンパク質をコードする領域の終止コドンより下流のｍＲＮＡ領域（３’−ＵＴＲ）に配列を作製しても良い。
　本発明ではｓｉＲＮＡを、ＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができ、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。例えば、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の核酸配列（配列番号１又は３）の一部に対して少なくとも約７０％、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも約１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約１９ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも約２１ヌクレオチド長である。
　本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる因子として、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
　ｓｈＲＮＡは、好ましくは３’突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２~４ヌクレオチドのＤＮＡである。
　本発明で用いるＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質（即ち、上記したようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）は、人工的に化学合成してもよく、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、ＳＬＣ６Ａ６の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
　さらに本発明においては、ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質（好ましくは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。
　本発明のがん治療剤は、がんの治療のために広く使用することができるが、好ましくは発がん及びがんの浸潤・転移を抑制するための薬剤として使用することができる。
　本発明のがん治療剤の投与対象のがんの種類は特に限定されず、ＳＬＣ６Ａ６を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん（肝臓がん）、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、子宮がんである。
　本発明のがん治療剤の投与方法は、非経口投与（例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分（本発明のモノクローナル抗体、又はＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質）の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
　本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
　非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
　非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分（抗体の場合）は、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり１ｍｇ~１５ｍｇ／日であることが好ましく、より好ましくは２−１２ｍｇ／日である。
　経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。本発明のがん治療剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを投与する場合は、その有効量は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、被験者に投与すべき有効量を、被験者の身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの要素を考慮して容易に決定することができる。一般に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非経口投与（例えば静注）の場合約０．１~１．５ｍｇ／ｋｇである。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. Note that. The present invention is not limited to the following embodiments, and can be implemented with appropriate modifications within the scope of the gist of the present invention.
It should be noted that all documents cited in the present specification, as well as published publications, patent gazettes, and other patent documents are incorporated herein by reference. Further, this specification includes the contents described in the specification and drawings of the Japanese patent application (Japanese Patent Application No. 2012-040992), which is the basis of the priority claim of the present application filed on March 6, 2012.
The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody recognizing a molecule called SLC6A6 (solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6) or its extracellular region. This antibody specifically binds to colorectal cancer cells. The present invention also uses a vector containing shRNA or siRNA that suppresses the expression of SLC6A6. This shRNA or siRNA specifically suppresses proliferation and metastasis of colon cancer cells. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the treatment of cancer, particularly colon cancer.
In order to obtain the monoclonal antibody of the present invention, the full-length protein of human SLC6A6 (SEQ ID NO: 1 (base sequence), SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence)), or cell, which has an original three-dimensional structure as an immunogen, or a cell A partial protein containing amino acid residues 143 to 216 (SEQ ID NO: 3 (base sequence), SEQ ID NO: 4 (amino acid sequence)), which is the outer region, (hereinafter sometimes collectively referred to as protein) is used. In order to recognize living cells, an antibody capable of recognizing the original three-dimensional structure of the membrane protein is obtained.
The monoclonal antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention (hereinafter also referred to as “monoclonal antibody of the present invention”) can recognize native SLC6A6. “Native” means that the protein is in a three-dimensional structure in the environment in the living body.
Moreover, the monoclonal antibody of the present invention can recognize the extracellular region of SLC6A6. In particular, as the extracellular region, the region of amino acid residues 143 to 216 (SEQ ID NO: 4) of SLC6A6 can be recognized.
The monoclonal antibody of the present invention has SEQ ID NO: as long as the binding activity to the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is maintained, that is, as long as the polypeptide to be bound has a function as an extracellular region of SLC6A6. Substitution, deletion or insertion of one or several amino acids (for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2, 3, 4 or 5) of the amino acid sequence shown in FIG. Which recognizes a mutant polypeptide having homology of 70% or more, preferably 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. There may be.
It is speculated that the extracellular region of SLC6A6 is responsible for binding to taurine and transporting taurine into the cell. Whether or not the mutant polypeptide has a function as an extracellular domain of SLC6A6 is determined by forcibly expressing the mutant polypeptide in animal cells and the like, and taking up taurine activation method (J. Membr. Biol, 76, 1). -15, 1983).
Alternatively, since the monoclonal antibody of the present invention binds to SLC6A6, the above-mentioned mutant polypeptide can be bound by the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 of the antibody. That is, it is included in a polypeptide having a function as an extracellular region of SLC6A6.
The binding between the mutant polypeptide and the monoclonal antibody of the present invention can be confirmed by ELISA, immunoprecipitation, Western blotting or the like.
The extracellular region of SLC6A6 is a cell surface site of a marker protein whose expression is increased in cancer cells. Whether or not the mutant polypeptide has a function as an extracellular domain of SLC6A6 is determined by immunostaining, ELISA, immunoprecipitation, Western blotting, FACS, etc. This can be confirmed by comparison.
The monoclonal antibody of the present invention has a higher affinity for SLC6A6 than conventional antibodies.
Conventional antibodies have a problem in that they do not recognize extracellular regions and cannot bind to living cells and cannot be used as therapeutic agents. In contrast, the monoclonal antibody of the present invention recognizes an extracellular region unlike conventional antibodies and has higher affinity than conventional antibodies, and therefore binds with high affinity to SLC6A6 present on the surface of cancer cells. In addition to directly suppressing the function of SCL6A6 in vivo, cancer cells can be killed by ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) activity.
The monoclonal antibody of the present invention also recognizes the protein encoded by the mRNA variant of slc6a6. Since it can bind not only to the full-length SLC6A6 but also to a mutant lacking a part thereof, it can bind to cancer cells expressing SLC6A6 extensively.
In the present invention, antibody-like molecules such as antibody fragments, low molecular weight antibodies, gene recombinant antibodies, antibody modifications, or monoclonal antibodies that are part of monoclonal antibodies, by various genetic engineering and protein engineering techniques. Can be produced. Specifically, for example, H chain, L chain, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, scFv, sdFv, sc (Fv) 2, (scFv) 2, DiAbody, chimeric antibody, humanized antibody And multispecific antibodies such as human antibodies, single chain antibodies, bispecific antibodies, and labeled antibodies. Any molecule that has the ability to bind to the extracellular region of SLC6A6 is included in the monoclonal antibody of the present invention.
The cell lines (hybridomas) producing the monoclonal antibody of the present invention are referred to as “Mouse-Mouse hybridoma 4B9b” (hereinafter referred to as “4B9b”) and “mouse-mouse hybridoma 5H12d” (hereinafter referred to as “5H12d”), Biomatrix Research Laboratories Co., Ltd. (105 Higashifui, Nagareyama-shi, Chiba Prefecture 270-0101, Japan) was established on July 21, 2010 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited at 1-1-1 middle 6). The accession number is “FERM BP-11413” for “4B9b” and “FERM BP-11414” for 5H12d. Furthermore, as cell lines, “3A3”, “19B10”, “23G12”, “7C11”, “12E8”, “6G3”, “18A10”, “22A4”, “23H6”. “26F3”, “2F2”, “7H8”, and “19C2j” were obtained. “3A3”, “19B10”, “23G12”, “7C11”, “12E8” were subclass IgG, and the remaining antibody was IgM. The present invention provides the hybridomas and the antibodies they produce. A homogeneous monoclonal antibody can be produced by culturing the hybridoma.
The monoclonal antibody of the present invention having these characteristics is different from a conventional method for producing a monoclonal antibody, as disclosed in WO / 2010/098471, using an immunization method in which cells expressing a membrane protein are engrafted. It is obtained. It is difficult to manufacture by a manufacturing method generally performed by those skilled in the art. that is,
(1) When preparing a membrane protein as an antigen, if a surfactant is used, the three-dimensional structure of the membrane protein is disrupted. On the other hand, if a surfactant is not used, the membrane protein aggregates between hydrophobic regions.
(2) An immune response does not occur because the expression level on the cell surface is low or the extracellular region is small.
For reasons such as
The monoclonal antibody of the present invention has acquired characteristics superior to those of conventional antibodies as a result of the inventors of the present invention having devised the antibody production method (particularly the immunization method).
The monoclonal antibody of the present invention has the following characteristics.
Since the antibody of the present invention was produced based on the three-dimensional structure inherent to SLC6A6, it can recognize native SLC6A6. Therefore, the binding force is very high compared to a conventional antibody (HPA015028) that recognizes the same epitope, and it can sufficiently bind to SLC6A6 on the cell membrane, which was difficult with the conventional antibody. In addition, compared to the conventional monoclonal antibody (sc-166640) that recognizes the SLC6A6 membrane and intracellular regions, the recognition site of the antibody of the present invention is extracellular, so it can bind to living cells. It can be used as a therapeutic agent.
In addition, the conventional antibody is a polyclonal antibody, and it has been difficult to continuously produce a homogeneous antibody. However, since the antibody of the present invention is a monoclonal antibody, it can be mass-produced with high reproducibility. . From these characteristics, the antibody of the present invention can be used for cancer treatment to reduce the mortality due to cancer.
The present invention is not limited to the monoclonal antibody itself against SLC6A6 produced by a hybridoma whose accession number is FERM BP-11413 or FERM BP-11414, and binds to an epitope recognized by the monoclonal antibody produced by these hybridomas. As long as it is included in the monoclonal antibody against SLC6A6 of the present invention. The term “epitope” as used herein refers to an epitope recognized by the monoclonal antibody produced by the hybridoma (amino acid residues from the 145th to the 213rd in the amino acid sequence of SLC6A6, as well as a part of these regions). May be).
The antibody against SLC6A6 may be a human antibody or a human antibody. If the human antibody is, for example, a mouse-human chimeric antibody, an antibody gene is isolated from a mouse cell that produces an antibody against the SLC6A6 protein, and its H chain constant region is recombined with the H chain constant region gene of human IgG. It can be prepared by introducing into myeloma cells. In addition, human antibodies can be prepared by immunizing mice in which the immune system is replaced with humans using the method disclosed in WO / 2010/098471 with SLC6A6 protein. A protein in which a monoclonal antibody is fused can be prepared by using an existing gene recombination technique for an antibody variable region that binds to an antigen and other proteins. Alternatively, it can be produced by crosslinking a monoclonal antibody and a protein using a crosslinker.
In addition to the SLC6A6 antibody, a pharmaceutically acceptable anticancer agent or carrier can be appropriately bound to the cancer therapeutic agent of the present invention as necessary.
In the present invention, by suppressing the expression of SLC6A6, the progression and metastasis of cancer can be suppressed by suppressing the proliferation and metastasis of cancer cells. That is, a substance that suppresses the expression of SLC6A6 can be provided by a method called RNA interference (RNAi). These contain siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), or an expression vector capable of expressing these as active ingredients, and an existing drug delivery system (cancer growth or metastasis inhibitor). ).
Specific examples of the substance capable of suppressing the expression of SLC6A6 by RNAi include siRNA, shRNA, or an expression vector capable of expressing these. When these are introduced into cells, an RNAi phenomenon occurs and RNA having a homologous sequence is degraded. Such RNAi phenomenon is a phenomenon observed in nematodes, insects, protozoa, hydra, plants, vertebrates (including mammals).
In the present invention, double-stranded RNA called siRNA having a length of about 20 bases (for example, about 21 to 23 bases) or less can be used. Such siRNA suppresses gene expression by being expressed in a cell, and can suppress the expression of a gene that is a target of the siRNA (in the present invention, SLC6A6 gene).
The siRNA used in the present invention may be in any form as long as it can cause RNAi. Here, “siRNA” is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially chemically synthesized or biochemically synthesized, synthesized in an organism, or about 40 bases or more. This is a short double-stranded RNA of 10 base pairs or more formed by degradation of the double-stranded RNA in the body, usually having a 5′-phosphate, 3′-OH structure, and a 3 ′ end. Protrudes about 2 bases. A protein specific to the siRNA binds to form RISC (RNA-induced-silencing-complex). This complex recognizes and binds to mRNA having the same sequence as siRNA, and cleaves mRNA at the center of siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. It is preferable that the sequence of siRNA and the sequence of mRNA that is cleaved as a target coincide 100%. However, in the case where the bases at positions deviating from the center of the siRNA do not match, the cleavage activity by RNAi often remains partially, so it does not necessarily have to match 100%.
The region having homology between the base sequence of siRNA and the base sequence of SLC6A6 gene whose expression should be suppressed preferably does not include the translation initiation region of SLC6A6 gene. This is because various transcription factors and translation factors are expected to bind to the translation initiation region, so that siRNA cannot effectively bind to mRNA, and the effect is expected to be reduced. Therefore, the sequence having homology is preferably 20 bases away from the translation start region of the SLC6A6 gene, more preferably 70 bases away from the translation start region of the SLC6A6 gene. The sequence having homology may be, for example, a sequence near the 3 ′ end of the SLC6A6 gene. Furthermore, when transcribed as mRNA, a sequence may be prepared in the mRNA region (3′-UTR) downstream from the stop codon of the region encoding the protein of the SLC6A6 gene.
In the present invention, siRNA can be used as a factor causing RNAi, and a factor that generates siRNA (for example, dsRNA having about 40 bases or more) can be used as such a factor. For example, at least about 70%, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% with respect to a part of the nucleic acid sequence of the SLC6A6 gene (SEQ ID NO: 1 or 3). As described above, RNA containing a double-stranded portion or a variant thereof containing a sequence having homology of 95% or more, most preferably 100%, can be used. The sequence portion having homology is usually at least about 15 nucleotides or more, preferably at least about 19 nucleotides, more preferably at least about 20 nucleotides in length, and even more preferably at least about 21 nucleotides in length.
According to another aspect of the present invention, shRNA (short hairpin RNA) having a short hairpin structure having a protruding portion at the 3 ′ end can be used as a factor capable of suppressing the expression of SLC6A6 by RNAi. shRNA refers to a molecule of about 20 base pairs or more that has a double-stranded structure in a molecule and a hairpin-like structure by including a partially palindromic base sequence in a single-stranded RNA. To tell. Such shRNA, after being introduced into the cell, is degraded into a length of about 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, 23 bases) in the cell, and causes RNAi similarly to siRNA. be able to. As described above, shRNA causes RNAi similarly to siRNA, and thus can be used effectively in the present invention.
The shRNA preferably has a 3 ′ protruding end. The length of the double-stranded part is not particularly limited, but is preferably about 10 nucleotides or more, more preferably about 20 nucleotides or more. Here, the 3 ′ protruding end is preferably DNA, more preferably DNA of at least 2 nucleotides, and further preferably DNA of 2 to 4 nucleotides.
Substances capable of suppressing the expression of SLC6A6 by RNAi used in the present invention (ie, siRNA or shRNA as described above) may be artificially chemically synthesized, and the DNA sequences of the sense strand and the antisense strand are determined. A DNA having a hairpin structure linked in the reverse direction can also be prepared by synthesizing RNA in vitro with T7 RNA polymerase. For synthesis in vitro, antisense and sense RNAs can be synthesized from template DNA using T7 RNA polymerase and T7 promoter. When these are annealed in vitro and then introduced into cells, RNAi is triggered and SLC6A6 expression is suppressed. Here, such RNA can be introduced into cells using, for example, the calcium phosphate method or various transfection reagents (for example, oligofectamine, lipofectamine, and lipofection).
Furthermore, in the present invention, an expression vector containing a nucleic acid sequence encoding a substance (preferably siRNA or shRNA) capable of suppressing the expression of SLC6A6 by RNAi may be used.
The cancer therapeutic agent of the present invention can be widely used for cancer treatment, but preferably can be used as a drug for suppressing carcinogenesis and cancer invasion / metastasis.
The type of cancer to which the cancer therapeutic agent of the present invention is administered is not particularly limited as long as it expresses SLC6A6. For example, malignant melanoma, malignant lymphoma, digestive organ cancer, lung cancer, esophageal cancer, Stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, ureteral tumor, gallbladder cancer, bile duct cancer, biliary tract cancer, breast cancer, liver cancer (liver cancer), pancreatic cancer, testicular tumor, maxilla Cancer, tongue cancer, lip cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, kidney cancer, ovarian cancer, uterine cancer, prostate cancer, thyroid cancer, brain tumor, Kaposi sarcoma, hemangioma, Leukemia, polycythemia vera, neuroblastoma, retinoblastoma, myeloma, cystoma, sarcoma, osteosarcoma, myoma, skin cancer, basal cell cancer, skin appendage cancer, skin metastasis cancer, skin Examples include melanoma. Colorectal cancer, stomach cancer, bladder cancer, kidney cancer, uterine cancer, and breast cancer are preferred, and colorectal cancer and uterine cancer are more preferred.
The method for administering the cancer therapeutic agent of the present invention includes parenteral administration (for example, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, intravaginal administration, topical administration to the affected area, skin administration, etc.), administration to the affected area. Direct administration and the like can be mentioned.
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is generally determined in consideration of the blending ratio of the active ingredient (the monoclonal antibody of the present invention or a substance capable of suppressing the expression of SLC6A6 by RNAi) in the preparation. It can be set as appropriate in consideration of the age, weight, type and progress of disease, administration route, number of administrations, administration period, etc. of the subject (patient).
The case where the pharmaceutical composition of the present invention is used as a parenteral preparation will be specifically described below.
When used as a parenteral preparation, its form is not generally limited. For example, any of intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, etc. There may be. In the case of various injections, for example, it can be provided in the state of a unit dose ampoule or a multi-dose container, or in the form of a lyophilized powder that is re-dissolved in a solution at the time of use. In addition to the above-mentioned active ingredient, the parenteral preparation can contain various known shaping materials and additives according to various forms as long as the effects of the active ingredient are not impaired. For example, in the case of various injections, water, glycerol, propylene glycol, aliphatic polyalcohols such as polyethylene glycol, and the like can be mentioned.
The dose (per day) of the parenteral agent is not limited. For example, in the case of various injections, generally, the above-mentioned active ingredient (in the case of an antibody) is 1 mg per kg body weight of the application subject (patient). It is preferably ˜15 mg / day, more preferably 2-12 mg / day.
When used as an oral preparation, its form is generally not limited, and for example, any of tablets, capsules, granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc. Alternatively, it may be a dry product which is redissolved when used. When the cancer therapeutic agent of the present invention is used as a pharmaceutical composition, a pharmaceutically acceptable additive can be blended as necessary. Specific examples of pharmaceutically acceptable additives include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery vehicles. , Diluents, carriers, excipients and / or pharmaceutical adjuvants and the like.
When siRNA or shRNA is administered, the effective amount is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to cause RNAi-mediated degradation of the target mRNA. One skilled in the art can readily determine the effective amount to be administered to a subject taking into account factors such as the subject's height and weight, age, sex, route of administration, or local or systemic administration. Generally, siRNA or shRNA is about 0.1 to 1.5 mg / kg for parenteral administration (for example, intravenous injection).
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の発現解析
　本実施例では、新たながん細胞特異的な膜タンパク質を同定し、診断や治療目的の抗体を作製する目的で、新たな膜タンパク質マーカーの同定を行った。５種類の大腸がん培養細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０）で共通して発現し、２種類の正常細胞（大腸内視鏡検査を受けた健常者２名由来の正常大腸剥離細胞）では発現していない遺伝子をＤＮＡマイクロアレイによって同定した。
　１８０個得られた候補遺伝子の中から、定量性ＰＣＲ法により５症例のがん患部と健常部とで、２倍以上の差のみられる遺伝子２５個を絞り込んだ。さらにその遺伝子群の中から、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により、がん部特異的に転写がみられる遺伝子を複数同定した。その中で、東京大学システム生物医学ラボラトリーのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｍ．ｏｒｇ／）上で公開されている３９種類の正常組織すべてで発現が見られない遺伝子を調べたところ、ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　６　（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ，ＳＬＣ６Ａ６）遺伝子を同定した。
　ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のがん部、健常部での発現を確認するために、ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３０４３）の５４６１−５８７８（４１８　ｂｐ）に位置する配列に対してプローブを作製し、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｙｚａｔｉｏｎ法により組織を分析した。
　大腸がん組織パラフィン切片（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．）をキシレン処理後、エタノール、ＰＢＳの順で水和を行い、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。７μｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｒｅｉｎａｓｅ　Ｋ　（Ｒｏｃｈｅ）で３０分間処理し、４％パラホルムアルデヒド溶液で再固定した。０．２５％無水酢酸０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０で１０分間アセチル化し、エタノールで脱水した。３００ｎｇ／ｍｌプローブ（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を含むｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に６０℃で１６時間反応させた後、５×洗浄液（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で６０℃２０分間、５０％ホルムアミド・２×洗浄液で６０℃２０分間洗浄し、ＲＮａｓｅＡで３７℃３０分間処理した。
　２×洗浄液、ＴＢＳＴで洗浄した後、０．５％ブロッキング反応液（Ｒｏｃｈｅ）、２０％熱処理羊血清（Ｓｉｇｍａ）と順次反応させた。ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）と２時間の反応を行い、ＰＢＳで洗浄後にＮＢＴ／ＢＣＩＰ液（Ｒｏｃｈｅ）中で発色させた。ケルネヒトロート液（Ｍｕｔｏｈ）で対比染色後、脱水処理し、マリノール（Ｍｕｔｏｈ）で封入した後に顕微鏡で観察を行った。図１に結果を示した。図１に示されるように、大腸がんのがん部は、健常部と比べ特異的に染色された。 Expression analysis of SLC6A6 gene In this example, new membrane protein markers were identified for the purpose of identifying new cancer cell-specific membrane proteins and preparing antibodies for diagnostic and therapeutic purposes. Commonly expressed in 5 types of colon cancer cell lines (HT29, HCT116, DLD1, LOVO, SW480), and 2 types of normal cells (normal colon exfoliation from 2 healthy subjects undergoing colonoscopy) In cells, genes not expressed were identified by DNA microarray.
Of the 180 candidate genes, 25 genes that were more than twice as large as the difference between the cancer affected area and the healthy area in 5 cases were narrowed down by quantitative PCR. Further, from the gene group, a plurality of genes whose transcription was specifically observed in the cancerous part were identified by the in situ hybridization method. Among them, when a gene in which expression was not observed in all 39 normal tissues published on the database of the University of Tokyo System Biomedical Laboratory ( http://www.lsbm.org/ ) was examined, a single carrier was examined. The family 6 (neurotransmitter transporter, taurine, SLC6A6) gene was identified.
In order to confirm the expression of the SLC6A6 gene in the cancerous part and the healthy part, a probe was prepared for the sequence located at 5461-5878 (418 bp) of mRNA (NM_003043), and the tissue was analyzed by in situ hybridization. did.
A colon cancer tissue paraffin section (Genostaff Co. Ltd.) was treated with xylene, hydrated in the order of ethanol and PBS, and fixed with paraformaldehyde for 15 minutes. The cells were treated with 7 μg / ml Proteinase K (Roche) for 30 minutes and re-fixed with 4% paraformaldehyde solution. Acetylated with 0.25% acetic anhydride 0.1M Tris-HCl pH 8.0 for 10 min and dehydrated with ethanol. The mixture was reacted with a hybridization reaction solution (Genostqaff Co. Ltd.) containing a 300 ng / ml probe (Genostqaff Co. Ltd.) for 16 hours at 60 ° C., and then washed with a 5 × washing solution (Genostqaff Co. Ltd.) at 60 ° C. for 20 minutes. The plate was washed with 50% formamide · 2 × washing solution at 60 ° C. for 20 minutes and treated with RNase A at 37 ° C. for 30 minutes.
After washing with 2 × washing solution and TBST, the mixture was reacted with 0.5% blocking reaction solution (Roche) and 20% heat-treated sheep serum (Sigma) sequentially. The reaction was carried out with an AP-labeled anti-DIG antibody (Roche) for 2 hours, washed with PBS, and developed in NBT / BCIP solution (Roche). After counterstaining with a Kernecht funnel solution (Mutoh), it was dehydrated and sealed with marinol (Mutoh), followed by observation with a microscope. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, the colorectal cancer part was stained more specifically than the healthy part.
モノクローナル抗体の作製
（１）細胞
　ＭＣＦ７−１４は、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０９４４を継代したものを用いた。Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＷｉＤｒ、２９３Ｔは、国立がん研究センター東病院より入手した。Ｃｏｓ７細胞は東京理科大より入手した。
　ＭＣＦ７−１４、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ２０１を、１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）で、ＷｉＤｒはＥ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）、ＨＣＴ１１６はＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ社）、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８０、２９３Ｔ及び残りの細胞はＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）で、それぞれ８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ２下で４８~７２時間培養および継代を行った。
（２）ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のクローニング
　ＭＣＦ７−１４を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応を行なった。
プライマー配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および６０℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。　得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）を用いて、ｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。増幅断片をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ　ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。
（３）ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株の作製
　上記（２）で作製したプラスミドを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ社製）を用いてＭＣＦ７−１４細胞へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。
　ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう添加した実施例２（１）記載の培地で細胞を培養し、３~５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＳＬＣ６Ａ６を過剰発現している細胞を選び出すため、培養したＭＣＦ７−１４及び遺伝子導入した細胞それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。
　培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
　抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社、クローン９Ｅ１０）をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ　７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
　二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
　最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ　５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、シグナルを観察し、ＭＣＦ７−１４よりもシグナルの高い株を３種類選択した。
（４）Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
　上記（３）で得られた３種類の細胞を１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、ｐＨ　７．４）で２回洗浄した。細胞に２×ＲＩＰＡ　Ｂｕｆｆｅｒ　（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ　ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２％（ｗ／ｖ）Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．２％（ｗ／ｖ）　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）を２００μＬ添加し１分間氷上に放置した後、スクレーパーで細胞溶液を回収した。超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）で３０秒間細胞を破砕し、抽出液を得た。それぞれの細胞について抽出液を作製し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定後、同じタンパク質量となるよう調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、トランスブロットＳＤセル（バイオラッド社）を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いＰＶＤＦメンブレン（ＰＩＥＲＣＥ社）にタンパク質を転写した。ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄を行った。ｃ−ｍｙｃ抗体をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで１万倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）でシグナルを検出した。
　図２に結果を示した。ＳＬＣ６Ａ６遺伝子を導入した細胞の中で最も発現が顕著であったクローンを免疫用の細胞として用いた。
（５）細胞の移植
　１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社）を用いて回収し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、ｐＨ　７．４）で２回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍＬとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
　生理食塩水に３．５％（ｗ／ｖ）となるよう抱水クロラール（Ｓｉｇｍａ社製）を溶解して、３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。６~８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ−ｎｕ／ｎｕ系統（日本クレア社製））の腹腔内に３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を０．２ｍＬ投与して麻酔した。マウスの第４乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を１乳腺あたり１×１０６個、２４Ｇの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。１匹のマウスに対して、２箇所の移植となるように、胴体左右両方の第４乳腺にそれぞれ移植を行った。
（６）スクリーニング用ＳＬＣ６Ａ６部分タンパク質の発現と精製
　実施例２（３）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基１４３~２１６の領域（配列番号４）をコードするＤＮＡ（配列番号３）をｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングした。以下のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行なった。
プライマー配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　ＰＣＲ反応は、９４℃、２分間のプレインキュベーションを行なった後、９８℃、１０秒間のデナチュレーション、５８℃、３０秒間のアニーリング、および６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
　得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて、ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ組み込んだ。
　増幅断片の塩基配列をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にＨｉｓ　ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。このベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）　トリプトン（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）　ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社））で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ　ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＳＬＣ６Ａ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
　約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ　Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ　ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。１ＬのＢｕｆｆｅｒ　Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ　酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｃ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ　Ｃに透析して、精製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を得た。
（７）抗血清の解析
　上記（６）で得た組換えタンパク質を１０μｇ／ｍｌを１００μＬずつ、ＭａｘｉＳｏｒｐ　９６　ｗｅｌｌプレート（ヌンク社）に入れ、室温で１時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ　７．４）で洗浄した後、５％となるようＴＢＳ−Ｔで希釈したスキムミルク（ＧＩＢＣＯ社）を入れ、３０分室温でブロッキングを行った。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をＴＢＳ−Ｔで１／２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
　二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。　最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して抗体の力価を解析し、細胞融合に用いるマウスの選択に利用した。
（８）細胞融合
　マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号　ＣＲＬ−１５８０）と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０８個の脾臓細胞と０．２５×１０８個の骨髄腫株とを混合し、ＥＰ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に細胞密度が０．２５×１０８個／ｍＬとなるよう懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
　融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう３０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１~１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり５~１２個のコロニーが形成された。
（９）モノクローナル抗体の取得
　移植７ヶ月後に脾臓細胞を取り出し、上記（８）に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。ＳＬＣ６Ａ６を認識する抗体を選択するために、上記（３）及び（７）記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識を用いた。
　図３は、得られたクローンを上記（７）と同様の方法で解析した結果である。「３Ａ３」、「１９Ｂ１０」、「２３Ｇ１２」、「７Ｃ１１」、「１２Ｅ８」、「６Ｇ３」、「１８Ａ１０」、「２２Ａ４」、「２３Ｈ６」、「２６Ｆ３」、「２Ｆ２」、「７Ｈ８」、及び「１９Ｃ２ｊ」はクローン番号を示す。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
（１０）組織染色
　４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体を用いて免疫染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）をキシレンで脱パラフィン処理、エタノールで親水化した。０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、加圧水蒸気下（１２０度）で１０分間処理し、抗原賦活化を行った。３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで処理した後、４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体それぞれと４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ社）で室温１時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＤＡＢ試薬（ＤＡＫＯ社）で５分間発色させた。蒸留水で水洗後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＷＡＫＯ）を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。
　図４に、大腸癌患者の癌部及び正常部に対して免疫染色を行った結果を示した。がん部が特異的に染色されていることが示された。
（１１）正常組織の組織染色
　４Ｂ９ｂ及び５Ｈ１２ｄを用いて、ヒト正常組織の免疫染色を行った（図５）。方法は（１０）に記載されている方法と同様である。
　図５において、パネルＡ~Ｈは、それぞれＡ：大腸、Ｂ：胃、Ｃ：回腸、Ｄ：肝臓、Ｅ：膵臓、Ｆ：心筋、Ｇ：肺、Ｈ：胎盤を示している。抗体がＩｇＭであるため多少のバックグラウンドは観察されているが、細胞膜が染色されるのは大腸癌のみであった。
（１２）リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
　培養した細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。ｃＤＮＡはｔｏｔａｌ　ＲＮＡから１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用いて合成した（Ｒｏｃｈｅ社）。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＳＬＣ６Ａ６　ｃＤＮＡのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒキャピラリー中のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒｅ　ＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ　Ｉ　（ＦａｓｔＳｔａｒｔ　ＴａｑＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ）、３．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び０．５μＭの各プライマー配列を含有する反応液（２０μｌ）で行った。使用したｐｒｉｍｅｒはＳＬＣ６Ａ６　ＴａｇＭａｎプローブＨｓ００１６１７７８（アプライドバイオシステム社）を用いた。
　鋳型ｃＤＮＡの段階的希釈によりＰＣＲ産物を直線領域で最適化した。定量的ＰＣＲの分析はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア３．３版を用いて行った。結果を図６に示す。
（１３）ＦＡＣＳ解析
　１０種類の大腸癌細胞をそれぞれ９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、１．５ｍＬチューブに回収した。４Ｂ９ｂ、５Ｈ１２ｄ抗体をそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるよう添加し、６０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで１／１０００希釈して添加し、３０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＰＢＳで２回洗浄後、Ｇｕａｖａ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で解析を行った。結果を図７に示す。
　図７より、全ての大腸癌細胞に対し本発明の抗体が反応することが明らかになった。 Production of Monoclonal Antibody (1) Cells MCF7-14 used the passage of accession number: FERM BP-10944. Caco-2, COLO201, DLD-1, HCT15, HCT116, HT-29, LOVO, SW480, SW620, WiDr, and 293T were obtained from National Cancer Center East Hospital. Cos7 cells were obtained from Tokyo University of Science.
MCF7-14, SW620, DLD-1, Colo201 is RPMI1640 medium (Sigma) containing 10% (v / v) serum (manufactured by Hyclone), WiDr is E-MEM medium (Sigma), HCT116 is McCoy's 5A medium (Sigma), HT-29, LoVo, SW480, 293T and the remaining cells were DMEM medium (Sigma), 48-72 at 37 ° C., 5% CO 2 so as not to exceed 80% confluence. Time culture and passage were performed.
(2) Cloning of SLC6A6 gene MCF7-14 was cultured, and total RNA was extracted using RNeasy Mini kit of Qiagen. From 2 μg of the extracted total RNA, using SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen), reverse transcription (RT) reaction was performed at 50 ° C. for 1 hour to synthesize cDNA, and the reaction was stopped by heating at 85 ° C. for 5 minutes. It was. Using the obtained cDNA as a template, PCR reaction was carried out using the following primer.
Primer sequence
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
The PCR reaction was pre-incubated at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C., 15 seconds of denaturation, and 60 ° C. for 1 minute of annealing / elongation to amplify the gene fragment. . The obtained amplified fragment was incorporated into a pEF6 vector (Invitrogen) using restriction enzymes (BamHI and XbaI) arranged on Primer. When the amplified fragment was confirmed by DNA sequencing, it was confirmed that the same gene sequence as that in the database was incorporated and that the c-myc tag sequence was added to the C-terminus.
(3) Production of SLC6A6 overexpression strain The plasmid produced in (2) above was introduced into MCF7-14 cells using FUGENE6 (Roche). The operation was performed based on the description in the instructions attached to the kit.
Cells were cultured in the medium described in Example 2 (1) to which blasticidin S hydrochloride was added to 10 μg / mL, and cells having drug resistance were selected by changing the medium every 3 to 5 days. In order to select cells overexpressing SLC6A6 from the obtained resistant strains, the cultured MCF7-14 and the gene-introduced cells were each planted in a 96-well plate so as to be 80% confluent, and cultured at 37 ° C., 5% CO2. 2 and cultured for 16 hours.
After removing the culture supernatant, 100 μL of 10% (v / v) neutral buffered formalin solution (manufactured by WAKO) was added and allowed to react at room temperature for 10 minutes. After removing the formalin solution, the plate was washed three times with PBS (−) and air-dried to prepare a plate on which each cell was immobilized.
Anti-c-myc antibody (santa cruz, clone 9E10) was diluted to 1 μg / mL with TBS-T (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Tween 20, pH 7.4), and the primary antibody Was added to the immobilized plate at 100 μL per well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Each well was washed 3 times with 200 μL TBS-T.
As a secondary antibody, anti-mouse IgG polyclonal antibody-HRP label (BETHYL) was diluted 5000 times with TBS-T. 100 μL of the diluted antibody solution was added per well and reacted at room temperature for 30 minutes. Each well was washed 3 times with 200 μL TBS-T.
Orthophenylenediamine (manufactured by Sigma) is diluted with 50 mM carbonate-citrate buffer (pH 5.0) to a final concentration of 0.5 mg / mL, and 35% (w / 10,000) w) 100 μL of the mixed solution to which hydrogen peroxide solution (manufactured by WAKO) was added as a substrate solution was allowed to react at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 25 μL of 3N sulfuric acid (manufactured by WAKO). Absorption at 492 nm was measured with a plate reader (SpectraMaxPure 384, manufactured by Molecular Devices), the signal was observed, and three strains having a signal higher than that of MCF7-14 were selected.
(4) Western blot
The three types of cells obtained in (3) above were cultured in a 10 cm dish until they became 90% confluent, and PBS (−) (0.01 M sodium-phosphate buffer, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7 4) and washed twice. 2 × RIPA Buffer (0.1 M Tris, 0.3 M EDTA, 1% (v / v) Triton X-100, 2% (w / v) Sodium Deoxycholate, 0.2% (w / v) sodium dodecyl 200 μL of sulfate) was added and left on ice for 1 minute, and then the cell solution was recovered with a scraper. The cells were crushed with an ultrasonic crusher (Branson) for 30 seconds to obtain an extract. An extract was prepared for each cell, and after measuring the protein concentration by the Bradford method, it was prepared to have the same protein amount and subjected to SDS-PAGE. After electrophoresis, the protein was transferred to a PVDF membrane (PIERCE) using a transblot SD cell (BioRad) according to the manufacturer's recommended protocol. Using skim milk dissolved to 5% (w / v) in TBS-T, blocking was performed for 30 minutes at room temperature, and washing was performed twice with TBS-T. The c-myc antibody was diluted to 1 μg / mL with TBS-T and reacted with the membrane for 1 hour at room temperature. After washing 3 times with TBS-T, anti-mouse IgG polyclonal antibody-HRP label (manufactured by BETHYL) was diluted 10,000 times with TBS-T as a secondary antibody. After reacting with the membrane at room temperature for 30 minutes, the membrane was washed 3 times with TBS-T. After immersing the membrane in Immobilon (Millipore), the membrane was wrapped and a signal was detected with LAS-3000 (Fuji Film).
The results are shown in FIG. The clone with the most significant expression among the cells into which the SLC6A6 gene was introduced was used as a cell for immunization.
(5) Cell transplantation Cells cultured in a 10 cm petri dish until they become 90% confluent are collected using trypsin (GIBCO), and PBS (−) (0.01 M sodium-phosphate buffer, 0.138 M NaCl, 0 Washed twice with .0027M KCl, pH 7.4). The washed cells were suspended in growth factor reduced Matrigel (manufactured by Becton Dickinson) to a final concentration of 8.6 × 10 7 cells / mL, and stored on ice until transplantation.
Chloral hydrate (manufactured by Sigma) was dissolved in physiological saline to 3.5% (w / v) to prepare a 3.5% chloral hydrate physiological saline solution. Anesthesia was performed by administering 0.2 mL of a 3.5% chloral hydrate physiological saline solution into the abdominal cavity of a 6-8 week old nude mouse (BALB / cALcl-nu / nu strain (manufactured by CLEA Japan)). The cells suspended in Matrigel were transplanted into the 4th mammary gland of the mouse using a 24G injection needle at 1 × 10 6 cells per mammary gland so as not to protrude from the mammary gland. A single mouse was transplanted into the 4th mammary glands on both the left and right sides of the torso so as to have 2 transplants.
(6) Expression and purification of SLC6A6 partial protein for screening From the full-length gene of SLC6A6 introduced into the pEF6 vector described in Example 2 (3), the region of amino acid residues 143 to 216 (SEQ ID NO: 4), which is an extracellular region, was obtained. The encoding DNA (SEQ ID NO: 3) was subcloned into the pET32 vector. PCR was performed using the following primers.
Primer sequence
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
The PCR reaction was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 98 ° C., 10 seconds of denaturation, 58 ° C., 30 seconds of annealing, and 68 ° C., 30 seconds of elongation. The gene fragment was amplified.
The obtained amplified fragment was incorporated into a pET32 vector (Novagen) using restriction enzymes (EcoRI and BamHI) arranged on Primer.
When the base sequence of the amplified fragment was confirmed by DNA sequencing, it was confirmed that the gene sequence of the same extracellular region as that of the database was incorporated and that the His tag sequence was added to the C-terminus. BL21 (DE3) (Invitrogen) was transformed with this vector, and LB medium (1% (w / v) tryptone (Sigma), 0.5% (w / v) containing 1% (w / v) glucose) was obtained. v) Yeast extract (Sigma), 0.5% (w / v) NaCl (Sigma)). After the turbidity of the medium reached 0.6 at a wavelength of 600 nm, 1 mM IPTG (WAKO) was added and cultured for 16 hours. The bacterial cells were collected by centrifugation and then subjected to ultrasonic disruption to obtain a fraction containing the SLC6A6 extracellular region as an insoluble protein.
About 10 mg of the sample was dissolved in Buffer A (1M guanidine hydrochloride (Sigma), 10 mM DTT (Sigma), 10 mM EDTA (Sigma)) and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Gently added to 1 L Buffer B (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.4 mM oxidized glutathione (Sigma), pH 8.5), and stirred at 4 ° C. for 18 hours. The dissolved sample was applied to a Ni sepharose column (GE) and eluted with Buffer C (50 mM potassium phosphate buffer, 150 mM NaCl, 200 mM imidazole, pH 8.0). Dialyzed against Buffer C without imidazole, the purified extracellular region partial protein of SLC6A6 was obtained.
(7) Analysis of antiserum 10 μg / ml of the recombinant protein obtained in (6) above was placed in a MaxiSorp 96 well plate (Nunk) and adsorbed on the plate at room temperature for 1 hour. After adsorption, the wells were washed with TBS-T (TBS-T (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Tween 20, pH 7.4) and then diluted with TBS-T to 5%. Skim milk (GIBCO) was added, and blocking was performed at room temperature for 30 minutes After washing each well 3 times with 200 μL of TBS-T, plasma collected from the tail vein of the mouse was multiplied by 1/2000 times with TBS-T. The plate was diluted to 100 μL per well to the ELISA plate and allowed to react for 1 hour at room temperature, and each well was washed 3 times with 200 μL TBS-T.
As a secondary antibody, anti-mouse IgG polyclonal antibody-HRP label (BETHYL) was diluted 5000 times with TBS-T. 100 μL of the diluted antibody solution was added per well and reacted at room temperature for 30 minutes. Each well was washed 3 times with 200 μL TBS-T. Orthophenylenediamine (manufactured by Sigma) is diluted with 50 mM carbonic acid-citrate buffer (pH 5.0) to a final concentration of 0.5 mg / mL, and 35% (w / w) of 10,000 parts of this solution. ) 100 μL of a mixed solution to which hydrogen peroxide solution (manufactured by WAKO) was added as a substrate solution was allowed to react at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 25 μL of 3N sulfuric acid (manufactured by WAKO). Absorption at 492 nm was measured with a plate reader (SpectraMaxPure 384, manufactured by Molecular Devices) to analyze the antibody titer and used for selection of mice used for cell fusion.
(8) Cell fusion Lymphocytes derived from mouse spleen were electrically fused with mouse myeloma strain P3X63-Ag8 (ATCC accession number CRL-1580). For cell fusion, 1 × 10 8 spleen cells and 0.25 × 10 8 myeloma lines were mixed and EP Buffer (0.3 M Mannitol, 0.1 mM CaCl 2 , 0.1 mM MgCl 2 ) was mixed. The cell density was suspended at 0.25 × 10 8 cells / mL, and fusion was performed with an electrofusion apparatus LF201 (manufactured by Nepagene). The fusion conditions followed the manufacturer's recommended method.
The fused cells were suspended in HAT medium (manufactured by Invitrogen) and spread on 30 96-well plates so that each well would be 100 μL. On the way, 200 μL of HAT medium was added, and when observed under a microscope after culturing for 11 to 16 days, 5 to 12 colonies were formed per well.
(9) Acquisition of monoclonal antibody Spleen cells were taken out 7 months after transplantation, and hybridoma cells were prepared by the method described in (8) above. In order to select an antibody that recognizes SLC6A6, clones were selected using the methods described in (3) and (7) above. Cell culture supernatant was used as the primary antibody, and anti-mouse IgG polyclonal antibody-HRP label was used as the secondary antibody.
FIG. 3 shows the result of analyzing the obtained clone by the same method as in (7) above. “3A3”, “19B10”, “23G12”, “7C11”, “12E8”, “6G3”, “18A10”, “22A4”, “23H6”, “26F3”, “2F2”, “7H8”, and “7H8” “19C2j” indicates a clone number. Hereinafter, the antibody produced by the hybridoma cell may be described by its clone number.
(10) Tissue staining Immunostaining was performed using 4B9b antibody and 5H12d antibody. After paraffin fixation, sliced human colon cancer tissue (Biochain) was deparaffinized with xylene and hydrophilized with ethanol. After treatment with 0.3% (v / v) hydrogen peroxide solution for 20 minutes, the plate was washed 3 times with TBST, and treated with pressurized steam (120 degrees) for 10 minutes to activate the antigen. After treatment with PBS containing 3% (w / v) BSA, each was reacted with 4B9b antibody and 5H12d antibody at 4 ° C. for 16 hours. After washing with TBST three times, the reaction was performed with a peroxidase-labeled anti-mouse secondary antibody (DAKO) for 1 hour at room temperature. After washing 3 times with TBST, color was developed with DAB reagent (DAKO) for 5 minutes. After washing with distilled water, the nucleus was stained with Hematoxylin (WAKO), washed with running water, treated with ethanol and xylene in this order, and sealed.
FIG. 4 shows the result of immunostaining on the cancerous part and normal part of a colon cancer patient. It was shown that the cancer area was specifically stained.
(11) Tissue staining of normal tissue Immunostaining of human normal tissue was performed using 4B9b and 5H12d (FIG. 5). The method is the same as the method described in (10).
In FIG. 5, panels A to H show A: large intestine, B: stomach, C: ileum, D: liver, E: pancreas, F: myocardium, G: lung, and H: placenta, respectively. Some background is observed because the antibody is IgM, but the cell membrane is stained only in colorectal cancer.
(12) Real-time quantitative RT-PCR
Total RNA was extracted from the cultured cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA was synthesized from total RNA using 1st strand cDNA Synthesis Kit (Roche). LightCycler (Roche) SLC6A6 cDNA of Real-time quantitative PCR using the, LightCyclere DNA Master SYBRGreen I in LightCycler capillaries (FastStart TaqDNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate buffer , SYBR Green I), 3.0mM MgCl 2, and 0.5μM The reaction solution (20 μl) containing each primer sequence was used. The primer used was SLC6A6 TagMan probe Hs00161778 (Applied Biosystems).
PCR products were optimized in the linear region by serial dilution of template cDNA. Quantitative PCR analysis was performed using the LightCycler software version 3.3. The results are shown in FIG.
(13) FACS analysis Ten types of colon cancer cells were cultured to be 90% confluent. The cells were washed twice with PBS, then peeled off with a scraper and collected in a 1.5 mL tube. 4B9b and 5H12d antibodies were added to a final concentration of 1 μg / mL, and reacted for 60 minutes. After washing twice with PBS + 2% FBS, AlexaFluor 488-labeled Goat-Anti-mouse IgG (Invitrogen) was added at 1/1000 dilution in PBS + 2% FBS and allowed to react for 30 minutes. After washing twice with PBS + 2% PBS, analysis was performed with Guava Flow Cytometry (Millipore). The results are shown in FIG.
FIG. 7 shows that the antibody of the present invention reacts with all colorectal cancer cells.
（１）マウスＩｇＧ化遺伝子の構築
　４Ｂ９ｂ抗体を発現するハイブリドーマ細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いて抽出し、１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ用の酵素としてはＫＯＤＰｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、特に記載がない限りメーカー推奨のプロトコールで実験を行った。抗体のＨ鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号９と配列番号１０のＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、３０℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　抗体のＬ鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号１１と配列番号１２のＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、３０℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　精製したＰＣＲ増幅断片を１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（インビトロジェン社）及び２×ＧｏＴａｑ　Ｍａｘｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と混合し、７０℃、１５分間反応後、４℃、２分間氷冷することで、３’末端へｄＡを付加した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、いわゆるＴＡクローニング法によりＨ鎖断片及びＬ鎖断片をクローニングした。
（ｉ）Ｈ鎖の構築
　続いて、シグナル配列を付加するため、ヒト−マウスキメラＩｇＧ１抗体を発現するＣＨＯ細胞（国立がん研究センターがん治療対策部門より入手）から上記と同様の方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、配列番号１３と配列番号１４のＰｒｉｍｅｒでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、１５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行って断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
並行してマウスＩｇＧ１を発現するハイブリドーマ細胞（すでに作製済みの抗マウスアルブミンモノクローナル抗体Ｃ、クローンＡＬＢ１）から同様にｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、配列番号１５と配列番号１６のＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、１５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
［００７２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　上記のように調製した抗体Ｈ鎖のシグナル配列、可変部、定常部を、ＰＣＲ反応により連結した。シグナル配列と可変部、定常部を混合し、配列番号１３と配列番号１６を用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、３０秒間のアニーリング、６８℃、１分間のエロンゲーションのサイクルを３２サイクル）を行い、連結された断片を得た。
　これらを、上記ＴＡクローニングと同じ方法でｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒへクローニングした後、シグナル配列の５’側及び定常部の３’側にある制限酵素（ＮｏｔＩ）を利用して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡ（インビトロジェン社）へクローニングした。
（ｉｉ）Ｌ鎖の構築
　Ｌ鎖についてもＨ鎖と同様に、シグナル配列、可変部、定常部をそれぞれクローニングし、結合させることで断片を得た。
　シグナル配列を付加するために、配列番号１７と配列番号１８のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　定常部のクローニングには、配列番号１９と配列番号２０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　Ｈ鎖と同様に、シグナル配列と可変部、定常部を混合し、配列番号１７と配列番号２０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結した。これらの断片をｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ）を用いてｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へクローニングした。マウスＩｇＧ１化したＳＬＣ６Ａ６抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号２１、アミノ酸配列は配列番号２２で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号２３、アミノ酸配列は配列番号２４で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
（２）マウスＩｇＧ化抗体の発現と精製
　１０ｃｍ　ｄｉｓｈ　４枚に９０％コンフルエントとなるようＣｏｓ７細胞を培養し、（１）で作製したＨ鎖及びＬ鎖発現用ベクターをＣｏｓ７細胞へＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて導入し、タンパク質の一過性発現を行った。導入条件はメーカー推奨の方法で行った。２４時間後に１０ｃｍ　ｄｉｓｈ　２０枚に継代し、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライ社）とを添加した培地で６日間培養を行った。培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを用いて精製した。遺伝子導入したＣｏｓ７の培養上清２００ｍＬに対し、１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対し、培養液を１~３ｍｌ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＫＣｌ）で洗浄した。次に１ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　（ｐＨ２．５））で抗体タンパク質を溶出させ、３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０~７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳに置換した。
（３）ＥＬＩＳＡによる活性測定
　実施例２．（７）と同様の方法で活性測定を行った。この際、抗体濃度を０~４０μｇ／ｍＬとした。活性測定の結果を図８に示した。マウスＩｇＧ化した抗体でも活性のあることが確認された。
（４）免疫組織染色
　実施例２．（１１）に記載の方法で面積組織染色を行った。３症例の大腸がん患者の組織サンプルについて、それぞれ正常部（ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｃｏｓａ）、がん部（Ｃａｎｃｅｒ）、がん浸潤部（ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｆｒｏｎｔ）を染色した２つの症例（Ａ及びＢ）結果を図９に示した。正常部から腫瘍先端部に行くにしたがって、明確に染色されることが示されている。つまり、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体は、大腸癌に結合する、特に大腸癌が広がっている浸潤部分に強く結合する、ということが示された。これは、治療用抗体を開発する上で、癌が広がりつつある部分に結合し、がんを抑制できるという点として非常に優れていることを示している。また、抗体だけではなく、ターゲットであるＳＬＣ６Ａ６も大腸癌治療のターゲットとして優れていると考えている。 (1) Construction of mouse IgG gene Total RNA was extracted from hybridoma cells expressing the 4B9b antibody using RNeasy Mini Kit, and cDNA was synthesized using 1st strand cDNA Synthesis Kit. As an enzyme for PCR, KODPlus (TOYOBO) was used, and experiments were conducted according to the manufacturer's recommended protocol unless otherwise specified. In order to amplify the heavy chain variable region fragment of the antibody, PCR reaction (94 ° C., 2 minutes denaturation followed by annealing at 30 ° C., 15 seconds) using the primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 The fragment was obtained by 30 cycles of elongation at 45 ° C. for 45 seconds at 68 ° C.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
In order to amplify the antibody L chain variable region fragment, PCR reaction (94 ° C., 2 minutes denaturation followed by annealing at 30 ° C., 15 seconds) using the primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 , 68 ° C., 30 seconds elongation cycle for 30 cycles).
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
The purified PCR amplified fragment was mixed with 10 mM dNTP Mix (Invitrogen) and 2 × GoTaq Maxter Mix (Promega), reacted at 70 ° C. for 15 minutes, and then ice-cooled at 4 ° C. for 2 minutes to the 3 ′ end. dA was added. Thereafter, the H chain fragment and the L chain fragment were cloned by a so-called TA cloning method using pGEM-T-Easy Vector System (Promega).
(I) Construction of H chain Subsequently, in order to add a signal sequence, a total sequence was added in the same manner as described above from a CHO cell expressing human-mouse chimeric IgG1 antibody (obtained from National Cancer Center). RNA was extracted and reverse transcribed into cDNA, followed by PCR reaction with primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, followed by denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, followed by annealing at 58 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. The fragment was obtained by 30 cycles of 15 seconds elongation.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
In parallel, total RNA was similarly extracted from hybridoma cells expressing mouse IgG1 (already prepared anti-mouse albumin monoclonal antibody C, clone ALB1), reverse transcribed into cDNA, and then primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. The fragment was obtained by PCR reaction (94 ° C., 2 minutes of denaturation followed by 58 ° C., 15 seconds of annealing, 68 ° C., 15 seconds of elongation 30 cycles).
[0072]
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
The signal sequence, variable region, and constant region of the antibody heavy chain prepared as described above were linked by PCR reaction. The signal sequence, the variable region, and the constant region were mixed, and PCR reaction (94 ° C., 2 minutes denaturation was performed using SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 16, followed by 58 ° C., 30 second annealing, 68 ° C. 1 minute elongation cycle (32 cycles) was performed to obtain ligated fragments.
These were cloned into pGEM-T-Easy Vector by the same method as in the above TA cloning, and then pcDNA3.1- was used using a restriction enzyme (NotI) on the 5 ′ side of the signal sequence and 3 ′ side of the constant region. Cloning into myc / HisA (Invitrogen).
(Ii) Construction of L chain As with the H chain, a signal sequence, a variable region, and a constant region were each cloned and combined to obtain a fragment.
In order to add a signal sequence, a PCR reaction (94 ° C., pre-incubation for 2 minutes, 94 ° C., 15 seconds of denaturation was performed using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, followed by 58 ° C., Fragments were obtained by 15 cycles of annealing and 68 cycles at 30 ° C for 30 seconds.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
For cloning of the constant region, PCR reaction (94 ° C., pre-incubation for 2 minutes, 94 ° C., 15 seconds of denaturation was performed using primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, followed by 58 ° C., 15 Fragments were obtained by annealing for 30 seconds and elongation cycle of 68 ° C. for 30 seconds for 30 cycles.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Similar to the H chain, the signal sequence, the variable region, and the constant region were mixed and ligated by PCR reaction using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 20. These fragments were cloned into a pEF6 vector (Invitrogen) using restriction enzymes (KpnI and EcoRI) designed on the primer. The DNA sequence of the H chain of the mouse IgG1-modified SLC6A6 antibody is represented by SEQ ID NO: 21, and the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 22. The same applies to the L chain. The DNA sequence is represented by SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 24.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
(2) Expression and purification of mouse IgG antibody The Cos7 cells were cultured on four 10 cm dishes so as to be 90% confluent, and the H chain and L chain expression vectors prepared in (1) were transferred to the Cos7 cells with Fugene 6 (Roche). ) To transiently express the protein. The introduction conditions were the method recommended by the manufacturer. After 24 hours, the cells were subcultured to 20 10 cm dishes and cultured for 6 days in a medium supplemented with 10 μg / mL blasticidin (Invitrogen) and 800 μg / mL G418 (Nacalai). The culture supernatant was collected and purified using a Protein G column. A 1 mL Protein G column (GE Healthcare) was used for 200 mL of the Cos7 culture supernatant into which the gene had been introduced. The culture solution was passed through a Protein G column equilibrated with PBS at a flow rate of 1 to 3 ml / min, and then washed with 6 mL of a washing buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 140 mM NaCl, 10 mM KCl). . Next, the antibody protein is eluted with 1 mL of elution buffer (0.1 M Glycine (pH 2.5)), and neutralized with 3 M Tris-HCl (pH 7.4) to a pH of 7.0 to 7.4. did. The antibody was concentrated using Amicon Ultra 30 (Millipore) and the buffer was replaced with PBS.
(3) Activity measurement by ELISA Example 2. Activity was measured by the same method as in (7). At this time, the antibody concentration was 0 to 40 μg / mL. The results of activity measurement are shown in FIG. It was confirmed that even mouse IgG antibody was active.
(4) Immunohistochemical staining Example 2. Area tissue staining was performed by the method described in (11). FIG. 9 shows the results of two cases (A and B) in which three normal colorectal cancer patient tissue samples were stained for a normal part (normal mucosa), a cancer part (Cancer), and a cancer invasion part (invasion front), respectively. It was shown to. It is shown that it is clearly stained from the normal part to the tumor tip part. That is, it was shown that the SLC6A6 antibody of the present invention binds to colorectal cancer, and particularly strongly binds to an infiltrating portion where colorectal cancer spreads. This indicates that, in developing a therapeutic antibody, it is extremely excellent in that it can bind to a part where cancer is spreading and suppress cancer. In addition, not only antibodies but also the target SLC6A6 is considered excellent as a target for the treatment of colorectal cancer.
（１）ヒトＩｇＧ化
　実施例３．（１）に示される方法と同様の方法で、シグナル配列、可変部、及び定常部をそれぞれクローニングした後、連結することで発現ベクターを作製した。ヒトＩｇＧ１定常部及びシグナル配列のクローニングには、ヒト—マウスキメラＩｇＧ１抗体を発現するＣＨＯ細胞（国立がん研究センターがん治療対策部門より入手）から増幅を行った。
（ｉ）Ｈ鎖の構築
Ｈ鎖可変部のクローニングには配列番号２５と配列番号２６のｐｒｉｍｅｒを、定常部では配列番号２７と配列番号２８のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、１分間のエロンゲーションのサイクルを３２サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　Ｈ鎖シグナル配列は、配列番号２９と配列番号３０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、２０秒間のエロンゲーションのサイクルを３２サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　マウス抗体の場合と同様に、シグナル配列、可変部、定常部を配列番号２５と配列番号３０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結し、これらの断片をｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＮｏｔＩ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクターへクローニングした。
（ｉｉ）Ｌ鎖の構築
　Ｌ鎖についてもマウスＩｇＧ１のＬ鎖構築と同様に、シグナル配列、可変部、定常部をそれぞれクローニングし、結合させることで断片を得た。
　可変部のクローニングには、配列番号３１と配列番号３２のｐｒｉｍｅｒを、定常部のクローニングには配列番号３３と配列番号３４を、シグナル配列部分は配列番号３５と配列番号３６を用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　Ｌ鎖についてもシグナル配列、可変部、定常部を列番号３１と配列番号３６のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結した後、定常部と配列番号３６と配列番号３７のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結した。これらの断片をｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ）を用いてｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へクローニングした。マウスＩｇＧ１化したＳＬＣ６Ａ６抗体のＨ鎖は配列番号３７：塩基配列、配列番号３８：アミノ酸配列、Ｌ鎖は配列番号３９：塩基配列、配列番号４０：アミノ酸配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
（２）ＥＬＩＳＡによる活性測定
　実施例４で作製したプラスミドを実施例３．（２）及び（３）に記載の方法で細胞への遺伝子導入、及び精製を行うことで調製したヒトＩｇＧ化抗体の活性測定を行った。この際、抗体濃度を０~４０μｇ／ｍＬとした。活性測定の結果を図１０に示した。ヒトＩｇＧ化した抗体でも活性のあることが確認された。 (1) Conversion to human IgG Example 3. In the same manner as shown in (1), the signal sequence, the variable region, and the constant region were each cloned and then ligated to prepare an expression vector. For cloning of human IgG1 constant region and signal sequence, amplification was performed from CHO cells expressing human-mouse chimeric IgG1 antibody (obtained from National Cancer Center).
(I) Construction of H chain PCR reaction using the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for cloning of the heavy chain variable region and the primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the constant region (94 ° C, 2 minutes) A fragment was obtained by preincubation, denaturation at 94 ° C. for 15 seconds, followed by 58 ° C., 15 second annealing, and 68 ° C., 1 minute elongation cycle for 32 cycles).
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
The H chain signal sequence was subjected to PCR reaction using the primers of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 (94 ° C., 2 minutes pre-incubation, 94 ° C., 15 seconds denaturation, followed by 58 ° C., 15 seconds). And 32 cycles of annealing at 68 ° C. and 20 seconds for 20 seconds).
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
As in the case of the mouse antibody, the signal sequence, variable region, and constant region were ligated by PCR reaction using the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 30, and the restriction enzyme (NotI) designed on the primer was ligated. And cloned into the pcDNA3.1-myc / HisA vector.
(Ii) Construction of L chain As with the construction of the L chain of mouse IgG1, the signal sequence, the variable region, and the constant region were cloned and combined to obtain a fragment.
PCR of the variable region using the primers of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32, cloning of the constant region using SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34, and the signal sequence portion using SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 The fragments were subjected to pre-incubation at 94 ° C for 2 minutes, denaturation at 94 ° C for 15 seconds, followed by 30 cycles of 58 ° C, 15 seconds of annealing, and 68 ° C, 30 seconds of elongation). Obtained.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
For the L chain, the signal sequence, the variable region, and the constant region were ligated by PCR using the primers of column number 31 and SEQ ID NO: 36, and then the PCR was performed using the primer of constant region, SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37. Connected. These fragments were cloned into a pEF6 vector (Invitrogen) using restriction enzymes (KpnI and EcoRI) designed on the primer. The H chain of the mouse IgG1-modified SLC6A6 antibody is SEQ ID NO: 37: base sequence, SEQ ID NO: 38: amino acid sequence, and the L chain is SEQ ID NO: 39: base sequence, SEQ ID NO: 40: amino acid sequence.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
(2) Activity measurement by ELISA The plasmid prepared in Example 4 was used in Example 3. The activity of the human IgG antibody prepared by gene introduction and purification into cells by the method described in (2) and (3) was measured. At this time, the antibody concentration was 0 to 40 μg / mL. The results of activity measurement are shown in FIG. It was confirmed that even human IgG antibody was active.
　上記記載の抗体以外に新たに作製したサブクラスＩｇＧのモノクローナル抗体それぞれについて、ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ細胞を用いた免疫染色、及びＦＡＣＳ解析を行った。２９３Ｔ細胞に実施例２（３）と同様の方法でＳＬＣ６Ａ６遺伝子を導入し、一過性発現株を作製した。遺伝子導入３日後に細胞を回収し、実施例２．（１３）と同様の方法で細胞を染色して解析を行った。
　実験結果を図１１に示した。取得されたサブクラスＩｇＧ抗体の中で少なくとも３種類のクローン（１９Ｂ１０、７Ｃ１１、１２Ｅ８）は、ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた細胞と反応することが示された。 In addition to the antibodies described above, each newly produced monoclonal antibody of subclass IgG was subjected to immunostaining and FACS analysis using HT-29 and LoVo cells. SLC6A6 gene was introduced into 293T cells in the same manner as in Example 2 (3) to produce a transient expression strain. Cells were collected 3 days after gene transfer, and Example 2. Cells were stained and analyzed by the same method as in (13).
The experimental results are shown in FIG. At least three clones (19B10, 7C11, 12E8) among the obtained subclass IgG antibodies were shown to react with cells overexpressing SLC6A6.
（１）抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）
　ヒトＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２で処理したヒト末梢血単核球を作用細胞として、下記の標的細胞を作用細胞：標的細胞＝２５：１、１２．５：１、６．２５：１、３．１３：１の比率で混合し、０．１μｇ／ｍＬのヒト化抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を添加し、４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。抗体及び作用細胞を添加し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により、ＡＤＣＣを測定した。細胞の死滅に伴って培養液中に遊離したＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）がテトラゾリウムをホルマザンへ変化させることを利用しており、吸光度５００ｎｍの変化で検出することが出来る。
ヒト大腸癌細胞Ｃａｃｏ２株
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１５株
ヒト大腸癌細胞ＤＬＤ−１株
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６株
ヒト大腸癌細胞ＬｏＶｏ株
ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０株
ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０株
ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒ株 (1) Antibody-dependent cytotoxicity (ADCC)
Using human peripheral blood mononuclear cells treated with human Interleukin-2 as working cells, the following target cells are working cells: target cells = 25: 1, 12.5: 1, 6.25: 1, 3.13: 1. Were mixed at a ratio of 0.1 μg / mL of humanized anti-SLC6A6 antibody and cultured for 4 hours (37 ° C., 5% CO 2 ). Antibodies and working cells were added, and ADCC was measured with CytoTox96 (Promega). LDH (lactate dehydrogenase) liberated in the culture medium with the death of the cells utilizes the fact that tetrazolium is changed to formazan, and can be detected by a change in absorbance at 500 nm.
Human colon cancer cells Caco2 strain Human colon cancer cells HCT15 strain Human colon cancer cells DLD-1 strain Human colon cancer cells HCT116 strain Human colon cancer cells LoVo human colon cancer cells SW480 strain Human colon cancer cells SW620 strain Human colon cancer cells WiDr strain
（１）補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）
　ＨＣＴ１５細胞（ヒト大腸癌由来ＳＬＣ６Ａ６陽性細胞）に、２５μｇ／ｍＬのＳＬＣ６Ａ６抗体又はキメラ化ＳＬＣ６Ａ６抗体のいずれかを添加した。これにフルオレセイン標識ヒト補体Ｃ１ｑを１０μｇ／ｍＬ添加。標識Ｃ１ｑによる蛍光染色性をフローサイトメトリーにより測定した。次に、ＨＣＴ１５細胞又はＨＴ−２９（ＳＬＣ６Ａ６陽性細胞）、及びＣＯＬＯ２０１細胞（ＳＬＣ６Ａ６弱陽性細胞）に、２．２μｇ／ｍＬの抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を添加した。これにヒト補体を添加し培養した。細胞外に放出されたＬＤＨ量をＣｙｔｏＴｏｘ９６を用いて測定し、補体による細胞溶解率を算出した。 (1) Complement dependent cytotoxicity (CDC)
To HCT15 cells (human colon cancer-derived SLC6A6-positive cells), either 25 μg / mL SLC6A6 antibody or chimerized SLC6A6 antibody was added. To this was added 10 μg / mL of fluorescein-labeled human complement C1q. The fluorescence staining property with the labeled C1q was measured by flow cytometry. Next, 2.2 μg / mL anti-SLC6A6 antibody was added to HCT15 cells or HT-29 (SLC6A6 positive cells) and COLO201 cells (SLC6A6 weak positive cells). Human complement was added to this and cultured. The amount of LDH released outside the cells was measured using CytoTox96, and the cell lysis rate by complement was calculated.
（１）ＳＬＣ６Ａ６数の抑制作用（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）
　ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）及びＣＯＬＯ２０１（ＳＬＣ６Ａ６低レベル発現株）を、抗ＳＬＣ６Ａ６抗体１５０μｇ／ｍＬの存在、非存在下で１日あるいは５日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した後、細胞のＳＬＣ６Ａ６数を求めた。細胞あたりのＳＬＣ６Ａ６数は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８でラベルした、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体４Ｂ９ｂを用い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８のモル吸光係数を用いて細胞あたりのＳＬＣ６Ａ６数を算出した。 (1) SLC6A6 number suppression action (Internalization)
Human colon cancer cells HCT15 (SLC6A6 high level expression strain) and COLO201 (SLC6A6 low level expression strain) were cultured for 1 day or 5 days in the presence or absence of anti-SLC6A6 antibody 150 μg / mL (37 ° C., 5% CO 2). ), The number of SLC6A6 of the cells was determined. The number of SLC6A6 per cell was calculated by using the monoclonal antibody 4B9b against SLC6A6 labeled with AlexaFluor488 and using the molar extinction coefficient of AlexaFluor488.
（１）細胞株の作製
　実施例２（３）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６の下流にＩＲＥＳ及びＧＦＰ遺伝子を導入した。ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片は、ｐＭＸｓ−ＩＧベクター（東京大学　北村俊雄氏より購入）から制限酵素（ＸｈｏＩとＳａｌＩ）を用いてＩＲＥＳ−ＧＦＰ部分を切り出し、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｌａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社）を用いて末端を平滑化した。また、実施例２．（２）で作製したｐＥＦ６−ＳＬＣ６Ａ６ベクターのＳＬＣ６Ａ６下流部分を制限酵素（ＰｍｅＩ）で処理し、同様にＫｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片を平滑化したｐＥＦ６−ＳＬＣ６Ａ６ベクターでクローニングし、ｐＥＦ６−ＳＬＣ６Ａ６−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを構築した。このＰｌａｓｍｉｄをマウス乳癌細胞４Ｔ１へＦｕｇｅｎｅ６を用い導入した。導入方法は、実施例２．（３）と同様の方法で行った。ＧＦＰの蛍光を示す細胞を複数クローニングし、形態を観察した所、遺伝子導入を行っていない細胞に比べ細胞が浮遊しやすい形態を示した（図１２）。
（２）表現型の解析
　ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株させた細胞を培養し、実施例２．（４）に示される方法でＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析を行った。この際、Ｅカドヘリン抗体、Ｎカドヘリン抗体、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（ＢＤ社）はそれぞれ１μｇ／ｍＬで用いた。実験結果を図１３に示す。上皮間葉移行（ＥＭＴ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）で見られる表現型の変化が観察された。つまり、ＳＬＣ６Ａ６はタウリンを輸送するだけでなく、過剰発現により癌細胞をよりがん幹細胞に近づける機能を果たしている可能性が示唆された。 (1) Production of cell line IRES and GFP genes were introduced downstream of SLC6A6 introduced into the pEF6 vector described in Example 2 (3). The IRES-GFP fragment was excised from the pMXs-IG vector (purchased from Toshio Kitamura, the University of Tokyo) using restriction enzymes (XhoI and SalI), and the ends were blunted using Klenow Fragment (Takara Bio). Turned into. In addition, Example 2. The downstream part of SLC6A6 of the pEF6-SLC6A6 vector prepared in (2) was treated with a restriction enzyme (PmeI) and similarly smoothed using Klenow Fragment. The IRES-GFP fragment was cloned with a blunted pEF6-SLC6A6 vector to construct a pEF6-SLC6A6-IRES-GFP vector. This plasmid was introduced into mouse breast cancer cell 4T1 using Fugene6. The introduction method is described in Example 2. The same method as in (3) was performed. When a plurality of cells exhibiting GFP fluorescence were cloned and the morphology was observed, the cells were more likely to float than the cells without gene transfer (FIG. 12).
(2) Phenotypic analysis The cells in which SLC6A6 overexpression strain was cultured were cultured in Example 2. Western blot analysis was performed by the method shown in (4). At this time, E-cadherin antibody, N-cadherin antibody, and Vimentin antibody (BD) were each used at 1 μg / mL. The experimental results are shown in FIG. The phenotypic changes observed in epithelial-mesenchymal transition (EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition) were observed. That is, it was suggested that SLC6A6 not only transports taurine but also has a function of bringing cancer cells closer to cancer stem cells by overexpression.
（１）Ｂａｌｂ／ｃマウス可移植性ＳＬＣ６Ａ６細胞４Ｔ１−ＳＬＣ６Ａ６に対する効果　実施例９で作製したＳＬＣ６Ａ６を過剰発現する４Ｔ１細胞に対し、実施例３で作製したマウスＩｇＧ化抗体のｉｎ　ｖｉｖｏにおける作用を解析した。遺伝子導入後に樹立した細胞Ｌ３１及びＬ３５を５×１０５個を実施例２．（５）に記載の方法と同様に乳腺へ移植した。移植後１３日目にマウスＩｇＧ化抗体５０μｇ／ｋｇを投与し、０、７、１２、１５日目に腫瘍のサイズ（直径）を測定した。
　結果を図１４に示した。ＳＬＣ６Ａ６を発現する細胞の増殖が添加した抗体によって妨げられている結果を得た。 (1) Effect on Balb / c mouse transplantable SLC6A6 cells 4T1-SLC6A6 Analysis of in vivo action of mouse IgG antibody prepared in Example 3 on 4T1 cells overexpressing SLC6A6 prepared in Example 9 did. Example 2 5 × 10 5 cells L31 and L35 established after gene introduction Transplanted into the mammary gland in the same manner as described in (5). On day 13 after transplantation, 50 μg / kg of mouse IgG antibody was administered, and tumor size (diameter) was measured on days 0, 7, 12, and 15.
The results are shown in FIG. Results were obtained in which the growth of cells expressing SLC6A6 was hindered by the added antibody.
　実施例１０の結果をさらに詳細に解析するため、マウス乳癌４Ｔ１−ＳＬＣ６Ａ６（ＳＬＣ６Ａ６遺伝子導入株）細胞をヌードマウス（１群５~７匹、雌）の第四乳腺に移植し、７日目より投与を開始した。ＳＬＣ６Ａ６抗体（総投与量０．３~１００ｍｇ／ｋｇ）は、１日１回、ｄａｙ１、５、９（投与開始日＝ｄａｙ１）の計３回尾静脈投与した。対照群はマウスＩｇＧ１（総投与量１００ｍｇ／ｋｇ）を同様のスケジュールで尾静脈投与した。
（２）ヌードマウス可移植性ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１５に対する効果
ＳＬＣ６Ａ６抗体単剤
　ヒト大腸癌ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）細胞をヌードマウス（１群５~１０、雌）の背部皮下に移植し、腫瘍体積が２００~３００ｍｍ３に達した時点より投与を開始した。ＳＬＣ６Ａ６抗体（０．１~３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）は、１日１回、週２回、４~５週間腹腔内投与した。対照群はヒトＩｇＧ１を同様のスケジュールで腹腔内投与した。
（３）ＳＬＣ６Ａ６抗体＋タキソール
　ヒト大腸癌ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）細胞をヌードマウス（１群７~１３匹）の背部皮下に移植し、腫瘍体積が２００~３００ｍｍ３に達した時点より投与し、腫瘍体積を測定することにより抗腫瘍効果を検討した。 In order to analyze the results of Example 10 in more detail, mouse breast cancer 4T1-SLC6A6 (SLC6A6 gene-introduced strain) cells were transplanted into the fourth mammary gland of nude mice (5-7 mice per group, female) and from day 7 Administration was started. SLC6A6 antibody (total dose: 0.3 to 100 mg / kg) was administered once per day for three times, day 1, 5, 9 (administration start date = day 1) for a total of 3 times. In the control group, mouse IgG1 (total dose 100 mg / kg) was administered via the tail vein according to the same schedule.
(2) Effect on transplantable human colon cancer cells HCT15 in nude mice SLC6A6 antibody single agent Human colon cancer HCT15 (SLC6A6 high-level expression strain) cells were transplanted subcutaneously in the back of nude mice (1 group 5-10, female), Administration was started when the tumor volume reached 200 to 300 mm 3 . SLC6A6 antibody (0.1-30 mg / kg / day) was intraperitoneally administered once a day, twice a week, for 4-5 weeks. In the control group, human IgG1 was intraperitoneally administered according to the same schedule.
(3) SLC6A6 antibody + taxol Human colon cancer HCT15 (SLC6A6 high-level expression strain) cells were implanted subcutaneously in the back of nude mice (7-13 mice per group) and administered from the time when the tumor volume reached 200-300 mm 3 Then, the antitumor effect was examined by measuring the tumor volume.
（１）細胞増殖試験
　ヒト大腸癌ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）細胞を用い、ＳＬＣ６Ａ６抗体の存在下、細胞を３日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。 (1) Cell proliferation test Using human colon cancer HCT15 (SLC6A6 high-level expression strain) cells, the cells were cultured for 3 days (37 ° C, 5% CO 2 ) in the presence of SLC6A6 antibody.
（１）ヒト大腸癌細胞でのＳＬＣ６Ａ６過剰発現株の作製
　実施例１０．（１）で作製したｐＥＦ６−ＩＲＥＳ−ＧＦＰをＣＯＬＯ２０１、ＳＷ６
２０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ細胞へ導入し、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンで薬剤選択を行い、安定発現株を得た。 (1) Production of SLC6A6 overexpressing strain in human colon cancer cells Example 10. The pEF6-IRES-GFP produced in (1) is replaced with COLO201, SW6.
20, introduced into HT-29, LoVo cells, and drug selection was performed with 10 μg / mL blasticidin to obtain a stable expression strain.
（１）ＲＮＡｉ用ベクターの作製
　ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制できるような配列を設計した。配列を設計するソフトウエアｓｉＤｉｒｅｃｔｖｅｒｓｉｏｎ　２．０（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｄｉｒｅｃｔ２．ｒｎａｉ．ｊｐ／）を用いた。安定的に発現が抑制される細胞を取得するために、４種類の配列を設計し、ｓｈＲＮＡの構築を行った。合成オリゴＤＮＡ２本を相補的な配列が含まれるよう設計し、アニーニングさせて（９４℃、１０分間のデナチュレーション後、１２時間かけて温度を室温まで下げる）Ｐｌａｓｍｉｄベクターへ挿入する断片を作製した。そして、ｐＣＡＧベクター（東京理科大学村上研究室より入手）へｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ）を用いてクローニングした。
　作製した４種類のｓｈＲＮＡ配列としては、配列番号４１、４４、４７、５０で示される。それぞれの配列を作製するために用いたｐｒｉｍｅｒ配列は、配列番号４１に示す配列の作製には配列番号４２と４３に示すプライマーを、配列番号４４に示す配列の作製には配列番号４５と４６に示すプライマーを、配列番号４７に示す配列の作製には配列番号４８と４９に示すプライマーを、配列番号５０に示す配列の作製には配列番号５１と５２に示すプライマーを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
（２）大腸癌細胞でのＳＬＣ６Ａ６発現抑制
　大腸癌細胞ＨＣＴ１５及びＨＴ−２９に、実施例１０．（１）で構築したベクターを実施例２．（３）と同様の方法で導入を行った。遺伝子導入試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを含む培地で薬剤選択し、細胞株を得た。ＳＬＣ６Ａ６の発現が抑制されていることを実施例２．（４）と同様の方法でＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔで解析した。
（３）抗体による移動能抑制試験（メンブレン移動試験）
　実施例９．で作製した細胞を無血清培地に懸濁後、コントロールカルチャーインサート（ＢＤ社）のトランスウエル（フィルター上部：上室）に１×１０５個となるよう入れ、さらにＳＬＣ６Ａ６抗体あるいはマウスＩｇＧ１抗体を５０μｇ／ウエルとなるよう添加し、３７℃で３日間培養した。トランスウエルのメンブレン（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅは８μｍ）を移動した細胞（フィルター下部：下室）を０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ＭｉｌｌｉＱを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。 (1) Preparation of RNAi vector A sequence capable of suppressing the expression of SLC6A6 by RNAi was designed. The software siDirectversion 2.0 (http://direct2.rnai.jp/) was used to design the sequence. In order to obtain cells in which expression is stably suppressed, four types of sequences were designed and shRNA was constructed. Two synthetic oligo DNAs were designed to contain complementary sequences, annealed (94 ° C, 10 minutes denaturation, then cool down to room temperature over 12 hours) to create a fragment to be inserted into the Plasmid vector did. And it cloned using the restriction enzyme (EcoRI and BamHI) designed on primer to pCAG vector (available from Tokyo University of Science Murakami laboratory).
The prepared four types of shRNA sequences are represented by SEQ ID NOs: 41, 44, 47, and 50. The primer sequences used to prepare the respective sequences are the primers shown in SEQ ID NOs: 42 and 43 for the preparation of the sequence shown in SEQ ID NO: 41, and SEQ ID NOS: 45 and 46 for the preparation of the sequence shown in SEQ ID NO: 44. For the preparation of the sequence shown in SEQ ID NO: 47, the primers shown in SEQ ID NOS: 48 and 49 were used, and in the preparation of the sequence shown in SEQ ID NO: 50, the primers shown in SEQ ID NOs: 51 and 52 were used.
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
Forward primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
Reverse primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
Forward primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
Reverse primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
Forward primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
Reverse primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
Forward primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
Reverse primer:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
(2) Inhibition of SLC6A6 expression in colon cancer cells Example 10 was performed on colon cancer cells HCT15 and HT-29. The vector constructed in (1) was used in Example 2. The introduction was performed in the same manner as (3). The gene introduction reagent was selected with a medium containing 10 μg / mL blasticidin of Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) to obtain a cell line. Example 2 shows that the expression of SLC6A6 is suppressed. Analysis by Western blot was performed in the same manner as in (4).
(3) Migrating ability inhibition test with antibodies (membrane movement test)
Example 9 The cells prepared in step 1 were suspended in a serum-free medium, and placed in a control culture insert (BD) transwell (upper filter: upper chamber) at 1 × 10 5 cells, and further 50 μg of SLC6A6 antibody or mouse IgG1 antibody. / Well was added and cultured at 37 ° C. for 3 days. Cells that migrated the transwell membrane (pore size is 8 μm) (bottom of the filter: lower chamber) were stained with a 0.1% crystal violet solution, the excess dye was removed using MilliQ, and the number of cells was observed. .
（１）抗体による浸潤能抑制試験（マトリゲル透過性試験）
　実施例１１．で作製した細胞を無血清培地に懸濁後、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤ社）のトランスウエル（フィルター上部：上室）に１×１０５個となるよう入れ、さらにＳＬＣ６Ａ６抗体あるいはマウスＩｇＧ１抗体を５０μｇ／ウエルとなるよう添加し、３７℃で３日間培養した。トランスウエルのメンブレン（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅは８μｍ）を移動した細胞（フィルター下部：下室）を０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ＭｉｌｌｉＱを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。 (1) Invasion ability suppression test using antibodies (Matrigel permeability test)
Example 11 After suspending the cells prepared in step 1 in a serum-free medium, 1 × 10 5 cells were placed in the transwell (upper filter: upper chamber) of the Matrigel invasion chamber (BD), and further SLC6A6 antibody or mouse IgG1 antibody Was added at 50 μg / well and cultured at 37 ° C. for 3 days. Cells that migrated the transwell membrane (pore size is 8 μm) (bottom of the filter: lower chamber) were stained with a 0.1% crystal violet solution, the excess dye was removed using MilliQ, and the number of cells was observed. .
（１）抗体による移動能抑制試験（スクラッチアッセイ）
　実施例１１．で作製した細胞をプラスチックプレートで培養し、その培養面をスクラッチした。ＳＬＣ６Ａ６抗体を添加及び非添加した培地で１２時間培養を行い、スクラッチ部分の面積変化の割合を測定することで、それぞれの細胞の運動能を測定した。 (1) Migrating ability inhibition test with antibodies (scratch assay)
Example 11 The cells prepared in (1) were cultured on a plastic plate, and the culture surface was scratched. Culturing was performed for 12 hours in a medium with and without the addition of SLC6A6 antibody, and the motility of each cell was measured by measuring the area change rate of the scratch portion.
（１）コロニー形成試験
　実施例１１．で作製した細胞をＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔｏ　Ｃｅｌｌ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて解析した。ソフトアガー中に１×１０２個／ｗｅｌｌとなるよう細胞を入れ、２週間培養した後に形成されたコロニーを測定した。 (1) Colony formation test Example 11. The cells prepared in (1) were analyzed using the CytoSelect Cell Transformation Assay Kit (CELL BIOLABS). Cells were put in soft agar at 1 × 10 2 cells / well and colonies formed after culturing for 2 weeks were measured.
　本発明により、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する核酸が提供される。本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と特異的に結合することでがん治療に利用することができる。発現を抑制する核酸は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞の増殖及び転移の進行を抑制することが出来る。 The present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to the extracellular region of SLC6A6. The present invention also provides a nucleic acid that suppresses the expression of SLC6A6. The antibody of the present invention can be used for cancer treatment by specifically binding to a cancer cell expressing SLC6A6. A nucleic acid that suppresses expression can suppress the growth of cancer cells that express SLC6A6 and the progression of metastasis.
　（１）微生物の表示：「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４Ｂ９ｂ」
　受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１３
　原寄託日：２０１０年７月２１日
　国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター
　　　　　　　　〒３０５−８５６６　茨城県つくば市東１−１−１　中央第６
　（２）微生物の表示：「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　５Ｈ１２ｄ」
　受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１４
　原寄託日：２０１０年７月２１日
　国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター
　　　　　　　　〒３０５−８５６６　茨城県つくば市東１−１−１　中央第６ (1) Display of microorganisms: “Mouse-Mouse hybridoma 4B9b”
Accession Number: FERM BP-11413
Original Deposit Date: July 21, 2010 International Depositary Authority: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-8565
(2) Display of microorganism: “mouse-mouse hybridoma 5H12d”
Accession Number: FERM BP-11414
Original Deposit Date: July 21, 2010 International Depositary Authority: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-8565
　配列番号５~２０、２５~３６、４１~５２：合成ＤＮＡ
SEQ ID NOs: 5-20, 25-36, 41-52: synthetic DNA

Claims (8)

  1. 　ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体若しくはその断片、又はＲＮＡ干渉によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody that recognizes native SLC6A6 or a fragment thereof, or a substance that can suppress the expression of SLC6A6 by RNA interference.
  2. 　ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody that recognizes a polypeptide in the extracellular region of SLC6A6 or a fragment thereof.
  3. 　細胞外領域のポリペプチドが、以下の（ａ）~（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるものである請求項２に記載の医薬組成物。
    （ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
    （ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド     The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the polypeptide in the extracellular region is at least one selected from the following (a) to (c).
    (A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, And a polypeptide functioning as an extracellular region of SLC6A6 (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and functioning as an extracellular region of SLC6A6
  4. 　受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody against SLC6A6 or a fragment thereof produced by a hybridoma having a deposit number of FERM BP-11413 or FERM BP-11414.
  5. 　請求項４に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合する、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody against SLC6A6 or a fragment thereof, which binds to an epitope recognized by the monoclonal antibody or a fragment thereof according to claim 4.
  6. 　モノクローナル抗体がヒト型化又はヒト化されたものである、請求項１~５のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the monoclonal antibody is humanized or humanized.
  7. 　モノクローナル抗体が融合されたものである、請求項１~５のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the monoclonal antibody is fused.
  8. 　大腸癌を治療するための、請求項１~７のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, for treating colorectal cancer.
PCT/JP2013/056884 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for treating cancer WO2013133450A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014503575A JP5747283B2 (en) 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for cancer treatment
US14/382,745 US20160009799A1 (en) 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for treating cancer
AU2013228317A AU2013228317A1 (en) 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for treating cancer
CA2866252A CA2866252A1 (en) 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for treating cancer
EP13758041.1A EP2823825A4 (en) 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for treating cancer

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012049192 2012-03-06
JP2012-049192 2012-03-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013133450A1 true WO2013133450A1 (en) 2013-09-12

Family

ID=49116915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/056884 WO2013133450A1 (en) 2012-03-06 2013-03-06 Pharmaceutical composition for treating cancer

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20160009799A1 (en)
EP (1) EP2823825A4 (en)
JP (1) JP5747283B2 (en)
AU (1) AU2013228317A1 (en)
CA (1) CA2866252A1 (en)
WO (1) WO2013133450A1 (en)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015108203A1 (en) * 2014-01-15 2015-07-23 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Therapeutic pharmaceutical composition employing anti-slc6a6 antibody
WO2015129919A1 (en) * 2014-02-25 2015-09-03 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Anti-slc6a6 antibody and pharmaceutical composition for cancer treatment including said antibody
WO2016039321A1 (en) * 2014-09-08 2016-03-17 国立研究開発法人国立がん研究センター Cancer-cell-specific antibody, anticancer agent, and cancer testing method
WO2016052756A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Reagent for detecting or diagnosing cancer cells having high invasive capacity
WO2017041001A3 (en) * 2015-09-04 2017-05-04 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
WO2017175874A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-12 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Cancer treatment pharmaceutical composition using anti-mct5 antibody

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006515318A (en) 2002-10-29 2006-05-25 ファルマシア・コーポレーション Specifically associated cancer-related gene, polypeptide encoded thereby and method of use thereof
WO2010098471A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 株式会社バイオマトリックス研究所 Immunization method using cancer cell
WO2010110346A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 独立行政法人理化学研究所 Leukemia stem cell markers
WO2012029990A1 (en) * 2010-09-01 2012-03-08 株式会社バイオマトリックス研究所 Antibody against colorectal cancer marker

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006515318A (en) 2002-10-29 2006-05-25 ファルマシア・コーポレーション Specifically associated cancer-related gene, polypeptide encoded thereby and method of use thereof
WO2010098471A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 株式会社バイオマトリックス研究所 Immunization method using cancer cell
WO2010110346A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 独立行政法人理化学研究所 Leukemia stem cell markers
WO2012029990A1 (en) * 2010-09-01 2012-03-08 株式会社バイオマトリックス研究所 Antibody against colorectal cancer marker

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 94, 2006, pages 1016 - 1020
CANCER RESEARCH, vol. 44, 1984, pages 2115 - 2121
CANCER RESEARCH, vol. 57, 1997, pages 4593 - 4599
CHEN NH ET AL.: "Synaptic uptake and beyond: the sodium- and chloride-dependent neurotransmitter transporter family SLC6", EUR J PHYSIOL, vol. 447, 2004, pages 519 - 531, XP055136227 *
J. MEMBR. BIOL, vol. 76, 1983, pages 1 - 15
JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, vol. 22, 2004, pages 1201 - 1208
See also references of EP2823825A4 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015108203A1 (en) * 2014-01-15 2015-07-23 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Therapeutic pharmaceutical composition employing anti-slc6a6 antibody
JPWO2015108203A1 (en) * 2014-01-15 2017-03-23 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Pharmaceutical composition for cancer treatment using anti-SLC6A6 antibody
EP3095462A4 (en) * 2014-01-15 2017-12-06 Order-Made Medical Research Inc. Therapeutic pharmaceutical composition employing anti-slc6a6 antibody
US10214584B2 (en) 2014-01-15 2019-02-26 Order-Made Medical Research Inc. Therapeutic pharmaceutical composition employing anti-SLC6A6 antibody
WO2015129919A1 (en) * 2014-02-25 2015-09-03 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Anti-slc6a6 antibody and pharmaceutical composition for cancer treatment including said antibody
WO2016039321A1 (en) * 2014-09-08 2016-03-17 国立研究開発法人国立がん研究センター Cancer-cell-specific antibody, anticancer agent, and cancer testing method
US11524074B2 (en) 2014-09-08 2022-12-13 National Cancer Center Cancer-cell-specific anti-TMEM-180 monoclonal antibody, anticancer drug, and cancer testing method
JPWO2016039321A1 (en) * 2014-09-08 2017-06-22 国立研究開発法人国立がん研究センター Cancer cell-specific antibodies, anticancer agents, and cancer testing methods
JP2021019616A (en) * 2014-09-08 2021-02-18 国立研究開発法人国立がん研究センター Cancer cell-specific antibody, anticancer agent, and cancer testing method
US10471146B2 (en) 2014-09-08 2019-11-12 National Cancer Center Cancer-cell-specific anti-transmembrane protein 180 antibody, anticancer drug, and cancer testing method
WO2016052756A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Reagent for detecting or diagnosing cancer cells having high invasive capacity
JPWO2016052756A1 (en) * 2014-10-01 2017-08-03 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Reagent for detecting or diagnosing cancer cells with high invasive potential
US10501546B2 (en) 2015-09-04 2019-12-10 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
US11421033B2 (en) 2015-09-04 2022-08-23 The Scripps Research Institute Insulin immunoglobulin fusion proteins
WO2017041001A3 (en) * 2015-09-04 2017-05-04 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
WO2017175874A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-12 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Cancer treatment pharmaceutical composition using anti-mct5 antibody

Also Published As

Publication number Publication date
JP5747283B2 (en) 2015-07-15
EP2823825A4 (en) 2015-10-14
US20160009799A1 (en) 2016-01-14
JPWO2013133450A1 (en) 2015-07-30
EP2823825A1 (en) 2015-01-14
CA2866252A1 (en) 2013-09-12
AU2013228317A1 (en) 2014-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012341450B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having antitumor activity in vivo
AU2011255870B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having antitumor activity in vivo
JP5747283B2 (en) Pharmaceutical composition for cancer treatment
KR101512203B1 (en) ANTI-HUMAN Dlk-1 ANTIBODY SHOWING ANTI-TUMOR ACTIVITY IN VIVO
JP5788384B2 (en) Antibody binding to transforming growth factor alpha and having growth inhibitory activity against Ras gene mutation cancer
EP2682475B1 (en) Antibody and antigen recognizing tumor-initiating cells and use thereof
CA2960466C (en) Cancer cell-specific antibody, anticancer drug and cancer testing method
JP6633029B2 (en) Treatment of angiogenic disorders
KR20180127966A (en) Cardiacin-17-specific antibodies and cytotoxic cells for cancer treatment
AU2013325443B2 (en) Anti-hDlk-1 antibody having an anti-tumor activity in vivo
US10738127B2 (en) Monoclonal antibodies prevent cell surface protein shedding and block tumor growth
WO2015108203A1 (en) Therapeutic pharmaceutical composition employing anti-slc6a6 antibody
WO2015129919A1 (en) Anti-slc6a6 antibody and pharmaceutical composition for cancer treatment including said antibody
JPWO2017175874A1 (en) Pharmaceutical composition for cancer treatment using anti-MCT5 antibody

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13758041

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014503575

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2866252

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14382745

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013758041

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013758041

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013228317

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20130306

Kind code of ref document: A